NL9001052A

NL9001052A - METHOD FOR DETERMINING A SPECIFIC LIGAND IN A LIQUID SAMPLE USING AN EVANESCENT FIELD, AND AN APPROPRIATE PART OF THE MEASURING DEVICE REQUIRED.

Info

Publication number: NL9001052A
Application number: NL9001052A
Authority: NL
Original assignee: Tno
Priority date: 1990-05-02
Filing date: 1990-05-02
Publication date: 1991-12-02
Also published as: EP0600862A1; JPH06502717A; WO1991017427A1; AU7871491A

Description

Werkwijze voor het bepalen van een specifiek ligand in een vloeibaar monster met behulp van een evanescent veld, alsook een daarvoor geschikt onderdeel van de benodigde meetinrichting.Method for determining a specific ligand in a liquid sample using an evanescent field, as well as an appropriate part of the required measuring device.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het bepalen van een ligand in een vloeibaar monster door - het in kontakt brengen van het monster met een oppervlak van een optisch orgaan, dat in staat is een evanescent veld op te wekken en welk oppervlak voorzien is van een specifieke bindingspartner voor het te bepalen ligand; - bestralen van het tegenover het bovengenoemde oppervlak gelegen oppervlak van het optische orgaan met licht met een voor het teweegbrengen van het evanescent veld geschikte golflengte; en - analyseren van het gereflecteerde licht ter bepaling van de mogelijk gewijzigde evanescent veld-karakteristieken van het optische orgaan ten gevolge van de vorming van een complex tussen het ligand en de specifieke bindingspartner. Voor het opwekken van een evanescent veld kan gebruik worden gemaakt van "surface plasmon interferentie" (SPR-effekt) of van een planaire lichtgeleider.The invention relates to a method for determining a ligand in a liquid sample by - contacting the sample with a surface of an optical member capable of generating an evanescent field and which surface is provided with a specific binding partner for the ligand to be determined; irradiating the surface of the optical member opposite the above-mentioned surface with light with a wavelength suitable for producing the evanescent field; and - analyzing the reflected light to determine the potentially altered evanescent field characteristics of the optical member due to the formation of a complex between the ligand and the specific binding partner. To generate an evanescent field, use can be made of "surface plasmon interference" (SPR effect) or of a planar light guide.

Een dergelijke werkwijze is bekend uit de internationale octrooiaanvrage WO 88/O7202. Meer in het bijzonder wordt de in deze octrooiaanvrage beschreven methode uitgevoerd met een in fig. 1 weergegeven inrichting. In deze fig. 1 stelt (1) een ondiepe uitsparing voor in een helder kunststof materiaal, waarvan de vlakke bodem (2) aan het oppervlak voorzien is van een diffraktierooster (3). Het bovengelegen oppervlak van het rooster (3) is bekleed met een semi-reflekterend materiaal of een metaalfilm zoals bijvoorbeeld van zilver, aluminium, koper of goud. Daarop is het rooster bekleed met een dunne film van specifieke bindingspartners voor het te bepalen ligand. Bijvoorbeeld kunnen als ligand antigenen en als specifieke bindingspartners antilichamen voor het betreffende antigeen worden toegepast (zie fig. 2). De bepaling als zodanig vindt plaats in een in fig. 1 weergegeven huis (4), welke voorzien is van een laserlichtbron (5), waaruit laserlicht onder een geschikte hoek op de onderzijde van de bodem (2) wordt gericht voor het opwekken van het "surface plasmon resonantie" (SPR)-effekt in het rooster (3). Het weerkaatste licht wordt via een lichtdetector (6), welke eveneens in het huis (4) is aangebracht, opgevangen en het van detector (6) afkomstige elektrische signaal wordt verwerkt in een meet-inrichting (7), welke al dan niet in het huis (4) is aangebracht. Het van detector (6) afkomstige signaal wijzigt zich, wanneer in het monster (8), dat in de uitsparing (1) wordt gebracht, het betreffende ligand aanwezig is, dat zich aan de aan de metaallaag gebonden specifieke bindingspartners bindt. Alhoewel de in deze internationale octrooiaanvrage WO 88/O7202 beschreven SPR-methode blijkbaar geen hinder ondervindt van lichtverstrooiende deeltjes in het opgebrachte monster (8) is echter gebleken, dat de reproduceerbaarheid van deze SPR-methodiek ongewenst laag is. In het geval van antilichamen is dit bijvoorbeeld te wijten aan desorptie of aan het verlies aan aktiviteit bij de immobili-satie van deze antilichamen aan de metaalfilm. Voorts laat ook de gevoeligheid (detectielimiet) van de bovenbeschreven methode te wensen over.Such a method is known from international patent application WO 88 / O7202. More specifically, the method described in this patent application is performed with an apparatus shown in Fig. 1. In this fig. 1 (1) represents a shallow recess in a clear plastic material, the flat bottom (2) of which is provided on the surface with a diffraction grating (3). The top surface of the grid (3) is coated with a semi-reflective material or a metal film such as, for example, silver, aluminum, copper or gold. The grid is then coated with a thin film of specific binding partners for the ligand to be determined. For example, as ligand antigens and as specific binding partners, antibodies to the particular antigen can be used (see Figure 2). The determination as such takes place in a housing (4) shown in Fig. 1, which is provided with a laser light source (5), from which laser light is directed at an appropriate angle to the bottom of the bottom (2) for generating the surface plasmon resonance (SPR) effect in the grid (3). The reflected light is received via a light detector (6), which is also arranged in the housing (4), and the electrical signal from detector (6) is processed in a measuring device (7), which may or may not be in the housing (4) is fitted. The signal from detector (6) changes when the sample (8), which is introduced into the recess (1), contains the respective ligand which binds to the specific binding partners bound to the metal layer. Although the SPR method described in this international patent application WO 88 / O7202 apparently does not suffer from light-scattering particles in the applied sample (8), it has been found that the reproducibility of this SPR method is undesirably low. In the case of antibodies, this is due, for example, to desorption or the loss of activity in the immobilization of these antibodies to the metal film. Furthermore, the sensitivity (limit of detection) of the method described above also leaves much to be desired.

Een soortgelijke inrichting, zoals weergegeven in de internationale aanvrage WO 88/07202 wordt eveneens in de Europese octrooiaanvrage 0.346.016 beschreven; ook de in deze Europese octrooiaanvrage beschreven inrichting is behept met de bovenstaande nadelen.A similar device as shown in international application WO 88/07202 is also described in European patent application 0.346.016; the device described in this European patent application also suffers from the above drawbacks.

Gevonden werd, dat de bovengeschetste nadelen van de in de aanhef genoemde werkwijze kunnen worden opgeheven, wanneer men een optisch orgaan toepast, waarvan het vloeistof-vaste stof-grensvlak voorzien is van een veelheid aan deeltjesvormige dragers, welke voor het ligand specifieke bindingspartners bevatten. In het geval van de SPR-methode wordt een optisch orgaan toegepast, waarvan het vloeistof-metaalgrens-vlak voorzien is van de bovenaangeduide beladen deeltjesvormige dragers.It has been found that the above-outlined drawbacks of the method mentioned in the preamble can be overcome when using an optical member whose liquid-solid interface is provided with a plurality of particulate carriers containing ligand-specific binding partners. In the case of the SPR method, an optical member is used, the liquid-metal interface of which is provided with the above-mentioned loaded particulate carriers.

Met behulp van de toepassing van de met specifieke bindingspartners beladen deeltjesvormige dragers op het vloeistof-metaalgrensvlak van het optische orgaan is het namelijk mogelijk zowel de gevoeligheid van de SPR-methodiek door vergroting van het specifieke oppervlak (zie fig. 3) als de reproduceerbaarheid ervan door het mogelijkerwijs chemisch koppelen van de specifieke bindingspartners aan de dragers in aanzienlijke mate te vergroten.Indeed, by using the particulate carriers loaded with specific binding partners on the liquid-metal interface of the optical member, it is possible to achieve both the sensitivity of the SPR method by increasing the specific surface area (see Fig. 3) and its reproducibility. by substantially increasing possible chemical coupling of the specific binding partners to the supports.

Het bij de werkwijze volgens de uitvinding toegepaste optische orgaan bestaat uit een kunststofmateriaal of glas met geschikte brekingsindex, dat bij voorkeur met een metaallaag van zilver of goud bekleed is en waarbij op de metaallaag de met specifieke bindingspartners beladen dragersdeeltjes zijn aangebracht. De dikte van de metaallaag bedraagt normaliter 10-100 nm en kan op bekende wijze zoals opdampen e.d. worden opgebracht. Het optische orgaan bezit normaliter de vorm van een plaatje met een bepaalde dikte.The optical element used in the method according to the invention consists of a plastic material or glass with a suitable refractive index, which is preferably coated with a metal layer of silver or gold and in which the carrier particles loaded with specific binding partners are arranged on the metal layer. The thickness of the metal layer is normally 10-100 nm and can be applied in a known manner, such as evaporation and the like. The optical member normally has the shape of a plate of a certain thickness.

Behalve het bovengedefinieerde optische orgaan kunnen ook optische vezels en planaire lichtgeleiders als optisch orgaan worden toegepast.In addition to the above-defined optical member, optical fibers and planar light guides can also be used as the optical member.

Als deeltjesvormige dragers kunnen in het kader van de uitvinding velerlei typen dragerdeeltjes worden gebruikt. Met voordeel worden als drager latex-bolletjes toegepast, welke een diameter in het trajekt van bijvoorbeeld IO-5OO nm, bij voorkeur 50"150 nm bezitten. Voorbeelden van geschikte materialen zijn o.a. (monodispers) polystyreenlatex, poly-methylmethacrylaat-latex of een silica-latex. Specifieke voorbeelden van latices zijn Unisphere latexdeeltjes met een diameter van 50 nm (type 10) of 100 nm (type 11) (Fa. Brunschwig Chemie B.V., Nederland) en "Polybead" polystyreenmicrospheres met een diameter van 50, 100 resp. 200 nm (Polysciences Corp. Niles/Illinois, USA). Ook kunnen metaal-solen (sol-deeltjes) zoals goud-solen, zilver-solen e.d. als deeltjesvormige drager worden toegepast.In the context of the invention, many types of carrier particles can be used as particulate carriers. Advantageously, latex spheres are used as carrier, which have a diameter in the range of, for example, 100-500 nm, preferably 50-150 nm. Examples of suitable materials are, inter alia (monodisperse), polystyrene latex, poly-methyl methacrylate latex or a silica Latex Specific examples of latices are Unisphere latex particles with a diameter of 50 nm (type 10) or 100 nm (type 11) (Fa. Brunschwig Chemie BV, The Netherlands) and "Polybead" polystyrene microspheres with a diameter of 50, 100 resp. 200 nm (Polysciences Corp. Niles / Illinois, USA) Also metal sols (sol particles) such as gold sols, silver sols, etc. can be used as a particulate carrier.

De "bedekkingsgraad" van het oppervlak van het optische orgaan, dat van de beladen deeltjesvormige dragers is voorzien, kan sterk variëren. Bijvoorbeeld hangt de bedekkingsgraad af van de grootte van de dragerdeeltjes of van het type specifieke bindingspartner zoals anti-lichamen en DNA-strengen. In zijn algemeenheid kan worden gesteld, dat de bedekkingsgraad 50-99.5% bedraagt. Volledigheidshalve wordt opgemerkt, dat onder "bedekkingsgraad" van de bolletjes de verhouding van de som van het oppervlak van de dwarsdoorsnede van de "bolvormige" dragers maal een faktor 100, gedeeld door het bedekte oppervlak van het optische orgaan wordt verstaan.The "degree of coverage" of the surface of the optical member provided with the charged particulate carriers can vary widely. For example, the degree of coverage depends on the size of the carrier particles or on the type of specific binding partner such as antibodies and DNA strands. In general, it can be stated that the degree of coverage is 50-99.5%. For the sake of completeness, it is noted that "coverage" of the spheres means the ratio of the sum of the cross-sectional area of the "spherical" carriers times a factor 100 divided by the covered area of the optical member.

Onder "beladingsgraad" van de specifieke bindingspartners op de bolletjes wordt de verhouding van het beladen, d.w.z. met de specifieke bindingspartners afgedekte oppervlak van de bolletjes maal een faktor 100, gedeeld door het totale oppervlak van de bolletjes in de monolaag of submonolaag verstaan. In zijn algemeenheid bedraagt de beladingsgraad 10-90#By "degree of loading" of the specific binding partners on the beads is meant the ratio of the loaded, i.e., the area of the beads covered with the specific binding partners times a factor of 100 divided by the total area of the beads in the monolayer or submonolayer. In general, the load factor is 10-90 #

Als in een monster te bepalen liganden resp. de daarmee complementaire specifieke bindingspartners kunnen velerlei typen verbindingen worden toegepast. In het bovenstaande zijn reeds het antigeen als ligand en het voor het antigeen specifieke antilichaam als specifieke bindingspartner genoemd. Voor een niet-volledige opsomming van toepasbare liganden resp. specifieke bindingspartners wordt verwezen naar de onderstaande Tabel A.If ligands to be determined in a sample are resp. the complementary specific binding partners can be used in many types of compounds. The antigen as ligand and the antigen-specific antibody have already been mentioned as specific binding partner in the above. For a non-exhaustive list of applicable ligands resp. specific binding partners, see Table A below.

TABEL ATABLE A

Ligand Specifieke bindingspartner antigeen antilichaam antilichaam antigeen hormoon hormoonreceptor hormoonreceptor hormoon polynucleotide-streng complementaire polynucleotide-streng avidine biotine biotine avidine proteine A immunoglobulineLigand Specific binding partner antigen antibody antibody antigen hormone hormone receptor hormone receptor hormone polynucleotide strand complementary polynucleotide strand avidin biotin biotin avidin protein A immunoglobulin

immunoglobuline proteine Aimmunoglobulin protein A

enzym enzym-cofaktor (substraat) of inhibitor enzym-cofactor(substraat) enzym of inhibitor lectines specifiek carbohydraat specifiek carbohydraat lectineenzyme enzyme cofactor (substrate) or inhibitor enzyme cofactor (substrate) enzyme or inhibitor lectins specific carbohydrate specific carbohydrate lectin

Het immobiliseren van de specifieke bindingspartners aan de latex-bolletjes is een op zichzelf bekend fenomeen. Bijvoorbeeld wordt in "Microparticle Immunoassay Techniques (Seradyn Inc., ed. Galloway and Hicks, Particle Technology Division, P.O.Box 1210, Indianapolis, IN 46206, USA) een algemene beschrijving van de techniek gegeven.Immobilizing the specific binding partners to the latex spheres is a known phenomenon. For example, "Microparticle Immunoassay Techniques (Seradyn Inc., ed. Galloway and Hicks, Particle Technology Division, P.O.Box 1210, Indianapolis, IN 46206, USA) provides a general description of the technique.

Vervolgens kunnen de met specifieke bindingspartners beladen dragers aan de metaallaag van het optische orgaan worden gebonden door middel van absorptie of door middel van het aanbrengen van een dunne lijmlaag of andersoortige plaklaag via een diptechniek, spincoating of andere, algemeen bekende depositietechnieken.Subsequently, the carriers loaded with specific binding partners can be bonded to the metal layer of the optical member by absorption or by applying a thin adhesive layer or other adhesive layer via a dip technique, spin coating or other well known deposition techniques.

Volledigheidshalve wordt naar voren gebracht, dat de bovenstaande procedure desgewenst omgekeerd kan worden door eerst de hechting van de bolletjes aan de metaallaag van het optische orgaan en vervolgens de immobilisatie van de specifieke bindingspartners aan de als dragers fungerende bolletjes uit te voeren. Tevens kunnen de deeltjesvormige dragers via een vlakke coating, zoals een polystyreencoating, op het metaaloppervlak worden aangebracht, d.w.z. de deeltjesvormige dragers worden op indirekte wijze op het metaaloppervlak geïmmobiliseerd.For the sake of completeness, it is suggested that the above procedure can be reversed, if desired, by first performing the adhesion of the beads to the metal layer of the optical member and then the immobilization of the specific binding partners to the beads acting as carriers. Also, the particulate carriers can be applied to the metal surface via a flat coating, such as a polystyrene coating, i.e. the particulate carriers are immobilized indirectly on the metal surface.

Als lichtbronnen kunnen de uit de stand der techniek bekende lichtbronnen zoals de helium-neon-laserlichtbron en de infrarood-diode laserlichtbron worden toegepast.As light sources, the light sources known from the prior art, such as the helium-neon laser light source and the infrared diode laser light source, can be used.

De uitvinding heeft voorts betrekking op een optisch orgaan, geschikt voor gebruik in een SPR-meetinrichting en bestaande uit een transparant plaatje of vezel van kunststof of glas, waarvan een enkel oppervlak bekleed is met een metaallaag van goud of zilver, welke metaallaag voorzien is van een hoeveelheid aan daarop aangebrachte deeltjesvormige dragers, welke specifieke bindingspartners bevatten; details hieromtrent worden in het bovenstaande verstrekt.The invention further relates to an optical element suitable for use in an SPR measuring device and consisting of a transparent plate or fiber of plastic or glass, a single surface of which is coated with a metal layer of gold or silver, which metal layer is provided with an amount of particulate carriers deposited thereon containing specific binding partners; details in this regard are provided above.

LEGENDALEGEND

Fig. 1 is een diagram van een opstelling voor het waarnemen van het surface plasmon resonantie-effekt (stand van de techniek);Fig. 1 is a diagram of an arrangement for sensing the surface plasmon resonance effect (prior art);

Fig. 2 is een weergave van een direkte binding van antilichamen aan een metaaloppervlak (stand van de techniek); hierin stellen (9) een metaallaag, (10) antilichamen en (11) een glasplaat voor; Fig. 3 is een weergave van de binding van met antilichamen beladen bolletjes aan het metaaloppervlak (uitvinding); hierin stellen (9) een metaallaag, (10) antilichamen, (11) een glasplaat en (12) latexbolletjes voor.Fig. 2 depicts a direct binding of antibodies to a metal surface (prior art); herein (9) represent a metal layer, (10) antibodies and (11) a glass plate; Fig. 3 depicts the binding of antibody-loaded spheres to the metal surface (invention); herein (9) represent a metal layer, (10) antibodies, (11) a glass plate and (12) latex spheres.

Fig. 4 geeft een optisch systeem weer dat gebruikt wordt voor het opwekken van surface plasmon resonantie-effekten, zoals weergegeven in fig.5· In deze fig. 4 stellen (13) een prisma, (l4) een inkomende straal gepolariseerd licht, (15) de gereflekteer-de lichtstraal, (16) een substraat van glas, (17) een op het substraat aangebrachte goudlaag, (18) een op de goudlaag aangebrachte laag van met specifieke bindingspartners beladen latexbolletjes volgens de uitvinding en (19) het te onderzoeken vloeistofmonster voor.Fig. 4 depicts an optical system used to generate surface plasmon resonance effects, as shown in FIG. 5 · In this FIG. 4, (13) sets a prism, (14) an incoming beam of polarized light, (15) the reflected light beam, (16) a glass substrate, (17) a gold layer applied to the substrate, (18) a layer of latex spheres according to the invention applied to the gold layer and loaded with specific binding partners, and (19) the liquid sample to be examined in front of.

Fig. 5 stelt een grafische voorstelling van de met SPR verkregen meetresultaten (zie onderstaand voorbeeld) voor, waarbij kromme (a) het resultaat van de goudlaag met daarop aangebracht HSA (human serum albumine); kromme (b) het resultaat van de goudlaag met daarop aangebracht HSA, dat gereageerd heeft met het anti-HSA; kromme (c) het resultaat van de goudlaag, bekleed met carboxylated polystyreen microspheres (100 nm), beladen met HSA; en kromme (d) het resultaat van de goudlaag, bekleed met carboxylated polystyreen microspheres (100 nm), beladen met HSA, dat gereageerd heeft met het anti-HSA, weergegeven.Fig. 5 represents a graphical representation of the measurement results obtained with SPR (see example below), curve (a) showing the result of the gold layer with HSA (human serum albumin) applied thereon; curve (b) the result of the gold layer with applied HSA reacted with the anti-HSA; curve (c) the result of the gold layer coated with carboxylated polystyrene microspheres (100 nm) loaded with HSA; and curve (d) shows the result of the gold layer coated with carboxylated polystyrene microspheres (100 nm) loaded with HSA reacted with the anti-HSA.

De uitvinding wordt aan de hand van het onderstaande voorbeeld nader toegelicht.The invention is further elucidated by means of the example below.

VOORBEELDEXAMPLE

A) Bereiding van optisch orgaan met van beladen latex-bollet.jes voorziene goudlaag.A) Preparation of optical member with gold layer provided with loaded latex spheres.

In dit voorbeeld werd de in fig. 4 weergegeven meetopstelling toegepast. Hierbij werd de goudlaag eerst van een coating voorzien. Deze coating bestond uit humane serum albumine (HSA; Sigma A 3782); concentratie 1 mg/ml; met dit produkt werd het oppervlak van de goudlaag bedekt, waarbij na een half uur het gecoate metaaloppervlak werd gespoeld met PBS (Phosphor buffered saline solution).In this example, the measuring arrangement shown in Fig. 4 was used. The gold layer was first coated with this. This coating consisted of human serum albumin (HSA; Sigma A 3782); concentration 1 mg / ml; the surface of the gold layer was covered with this product, after which the coated metal surface was rinsed with PBS (Phosphor buffered saline solution) after half an hour.

Vervolgens werden Polybead polystyreen (2,5# solids) carboxylated microspheres (100 nm) (Polysciences Corp. Niles/Ill. USA) op de bovenvermelde gecoate goudlaag gebracht. Na 10 min. werd het metaaloppervlak met PBS gespoeld.Polybead polystyrene (2.5 # solids) carboxylated microspheres (100 nm) (Polysciences Corp. Niles / Ill. USA) were then applied to the above coated gold layer. After 10 min. The metal surface was rinsed with PBS.

Bij de volgende trap werd 2 ml van een 2# ' s oplossing van carbodiimide, bereid door het oplossen van 45 mg carbodiimide in 2 ml PBS, op de verkregen van bolletjes voorziene metaallaag gedruppeld, waarna er een incubatie gedurende 6 uur bij kamertemperatuur (20 C) en bij een relatieve vochtigheid van 100# werd uitgevoerd.In the next step, 2 ml of a 2 # 's solution of carbodiimide, prepared by dissolving 45 mg of carbodiimide in 2 ml of PBS, was dripped onto the resulting beaded metal layer and incubated for 6 hours at room temperature (20 C) and carried out at a relative humidity of 100 #.

Vervolgens werd het verkregen produkt gespoeld met een boraat-buffer (Polysciences Corp., Niles/Ill., USA).The resulting product was then rinsed with a borate buffer (Polysciences Corp., Niles / Ill., USA).

In de daaropvolgende trap werd eiwit (HSA; Sigma A 3782) opgebracht (1 mg/ml; het oppervlak van de met bolletjes beklede goudlaag werd volledig bedekt) waarna het een nacht bij 100# relatieve luchtvochtigheid werd opgeslagen. Na deze periode werd het produkt weer gespoeld met PBS.In the subsequent step, protein (HSA; Sigma A 3782) was applied (1 mg / ml; the surface of the beaded gold layer was completely covered) and stored overnight at 100 # relative humidity. After this period, the product was rinsed again with PBS.

Tenslotte werden de van carbodiimide afkomstige ongereageerde groepen met behulp van een overmaat van 0,1 M ethanolamine-oplossing 30 min. bij kamertemperatuur geblokkeerd.Finally, the unreacted groups from carbodiimide were blocked with an excess of 0.1 M ethanolamine solution at room temperature for 30 min.

B) Reaktie met anti-HSAB) Reaction with anti-HSA

Een oplossing met anti-HSA (Sigma, nr. A II5I) werd op de beklede goudlaag gedruppeld. Daarna werd 1 uur geïncubeerd. Vervol- gens werd met PBS gespoeld. De betreffende metingen werden in een meetinrichting, zoals weergegeven in fig. 4, uitgevoerd.A solution with anti-HSA (Sigma, No. A II5I) was dripped onto the coated gold layer. Incubation was then made for 1 hour. Then rinse with PBS. The measurements in question were carried out in a measuring device as shown in Fig. 4.

De resultaten zijn in fig. 5 weergegeven. In deze fig. 5 geeft kromme (a) het meetresultaat weer van direkt op de met polystyreen gecoate goudlaag aangebracht HSA; deze laag werd op de bovenstaande wijze bereid onder weglating van de aan de latexbolletjes gewijde trappen. Uit deze figuur blijkt dat de gevoeligheid van de met latexbolletjes beklede goudlaag aanzienlijk is vergroot.The results are shown in Figure 5. In this Figure 5, curve (a) shows the measurement result of HSA applied directly to the polystyrene coated gold layer; this layer was prepared in the above manner, leaving out the steps dedicated to the latex spheres. This figure shows that the sensitivity of the gold ball coated with latex spheres is considerably increased.

Claims

A method for determining a ligand in a liquid sample by - contacting the sample with a surface of an optical member capable of generating an evanescent field and which surface is provided with a specific binding partner for the ligand to be determined; irradiating the surface of the optical member opposite the above-mentioned surface with light with a wavelength suitable for producing the evanescent field; and - analyzing the reflected light to determine the possibly altered evanescent field characteristics of the optical member due to the formation of a complex between the ligand and the specific binding partner, characterized in that an optical member is used, of which the liquid-solid interface is provided with a plurality of particulate carriers containing ligand specific binding partners.

Method according to claim 1, characterized in that the evanescent field is generated by means of surface plasmon resonance (SPR effect) and the optical element at the liquid-metal interface is provided with the respective particulate carriers.

Method according to claim 2, characterized in that an optical element is used, which is coated with a metal layer of gold or silver and on which metal layer the particulate carriers with the binding partners specific for the ligand are applied.

4. A method according to claim 2 or 3, characterized in that the particulate carriers are applied to the metal surface via a flat coating, such as a polystyrene coating.

Process according to one or more of Claims 1 to 4, characterized in that latex spheres are used as particulate carriers.

6. Process according to claim 5, characterized in that latex spheres with a diameter in the range of 100-500 nm are used.

Process according to claim 6, characterized in that latex spheres with a diameter in the range of 50-150 nm are used.

8. Process according to one or more of claims 5-7, characterized in that a polystyrene latex or a polymethyl methacrylate latex is used.

Process according to one or more of claims 5 "7", characterized in that a silica-latex is used.

10. Method according to one or more of claims 1-9. characterized in that the "coverage" of the surface of the optical member with the particulate carriers is 50 "99" 5 #.

Method according to one or more of claims 1-10, characterized in that the "degree of loading" of the surface of the particulate carriers with the specific binding partners is 10-90 #.

12. Optical device, suitable for use in an SPR measuring device and consisting of a transparent plate or fiber of plastic or glass, a single surface of which is coated with a metal layer of gold or silver, which metal layer is provided with an amount of particulate carriers provided thereon, which contain specific binding partners as defined in one or more of claims 1-11. ****