NL8402017A

NL8402017A - Nieuwe peptiden.

Info

Publication number: NL8402017A
Application number: NL8402017A
Authority: NL
Original assignee: Ciba Geigy
Priority date: 1983-06-27
Filing date: 1984-06-26
Publication date: 1985-01-16
Also published as: IT8448461A0; BE900012A; IL72219A; LU85422A1; IT1199150B; ZA844857B; FR2549070B1; DK311884A; GB8415884D0; DK311884D0; NZ208669A; DE3423370A1; IL72219A0; AU2990784A; FR2549070A1; GB2142335A; US4845080A; AU578897B2; SE8403377D0; JPS6019721A

Description

NO 32592 1

Nieuwe peptiden

De uitvinding heeft betrekking op een stof uit de groep van de calcitoninen en zouten ervan, op werkwijzen voor de bereiding ervan, de 5 toepassing ervan als geneesmiddel en farmaceutische preparaten, die deze stof samen met een farmaceutisch dragermateriaal bevatten.

De uitvinding betreft in het bijzonder een stof uit de groep van de calcitoninen, in het onderstaande ook aangeduid als menselijk calci-tonine 2, afgekort hCT 2, dat uit het menselijk lichaam geïsoleerd kan 10 worden of op andere wijze kan worden verkregen, met de volgende eigenschappen: a) reactievermogen met antilichamen, die het tot de stand van de techniek behorende humane calcitonine-(l-32), afgekort hCT, niet herkennen, daarbij echter met het zalm-calcitonine-(l-32), afgekort sCT, nog bij 15 een tot maximaal 10^ voudig geringere concentratie kunnen reageren, b) retentietijd niet te onderscheiden van die van het synthetisch bereide sCT in het volgende hoge-druk-vloeistof-chromatografiesysteem (HPLG-systeem): adsorbens: Nucleosil 10 of een ander adsorbens met verge- 20 lijkbare eigenschappen, een kolom met een lengte van 250-mm en een diameter van 4,6 mm, belading met 1 ng tot 20 yg, bij voorkeur 1-10 ng hCT, lineaire gradiënt, bestaande uit de oplossingen A (0,1 mo-lair heptafluorboterzuuroplossing in water) en 25-73 volumeprocent B (20 volumeprocent van de oplossing A en 80 volumeprocent acetonitril), 25 overeenkomend met 20-58 volumeprocent acetonitril gedurende 90 minuten bij een doorstroomsnelheid van 1,5 ml/uur, c) in humaan serum niet het teweegbrengen van de vorming van aantoonbare hoeveelheden antilichamen, die in staat zijn met sCT te reageren, waarbij voor de proef van dit aantonen van de binding aan 30 [125x] sqX met <je specifieke activitiet van 500 Ci/m mol gebruikt wordt, en zouten ervan.

Het als nucleosil 10 C]_g aangeduide adsorbens in het HPLG-systeem bestaat uit kiezelgel, waaraan via Si-C-bindingen octadecylgroe-pen gebonden zijn. Het kiezelgel is aanwezig in de vorm van door-en-35 door poreuze, bolletjesvormige deeltjes met een korrelgrootte van 10 + 1,5 ym, een gemiddelde poriëndiameter van 100 1, een poriënvolume van 1,0 ml/g en een specifiek oppervlak (BET) van 300 m^/g, die tot een druk van 600 bar stabiel zijn. Nucleosil 10 C]_g wordt geleverd door de firma Macherey Nagel, Werkstrasse 6-8, Postfach 307, 40 D-5160 Düren* 84 02 0 1 7 2 , i'· t

De uitvinding heeft in het bijzonder betrekking op het bovengenoemde materiaal, waarvan elutievolume in het volgende gelpermeatie-chromatografie-systeem (gelsysteem) niet kan worden onderscheiden van dat van het synthetisch bereide SCT: 5 Gel: Bio-gel P-15C$^ (100-200 mesh) of een andere gel met vergelijkbare eigenschappen, kolom met een lengte van 100 cm en een diameter van 1,6 cm, belading met 1 ng tot 10 ng hCT 2, elueermiddel bestaande uit ammoniumacetaat (0,2 mol/1, pH 4,6) en runderserumalbumine (0,5 mg/ml), gedurende 48 uren bij een doorstroomsnelheid van 5 ml/uur.

10 Het als Bio-gel P-15C@ aangeduide adsorbens in het gelsysteem bestaat uit poreuze polyacrylamidedeeltjes met een diameter in gehydro-geniseerde toestand van 80-150 ym. Bio-gel P-150R wordt geleverd door de firma Bio-Rad, Chemical Division, 2200 Wright Avenue, Richmond, CA 94804, USA.

15 Het materiaal volgens de uitvinding, hCT 2, komt in geringe con centratie voor in bijv. de menselijke hersenen, in de menselijke schildklier, de menselijke hypofyse en in het menselijke bloedplasma en -serum.

De uitvinding heeft in hoofdzaak betrekking op het bovengenoemde 20 materiaal volgens de uitvinding en zouten ervan buiten een levend organisme en in een ten opzichte van de aanwezigheid in de natuur verhoogde concentratie, op de eerste plaats hCT 2 in in hoofdzaak zuivere vorm of samen met daarmee gemengde farmaceutische dragermaterialen.

hCT 2 verschilt van het bekende hCT in het bovengenoemde HPLC-sy-25 steem door een duidelijk andere retentietijd, daarentegen bezit hCT 2 nagenoeg dezelfde retentietijd als sCT. In het bovengenoemde gelsysteem is het elutievolume van hCT 2 verschillend van hCT maar nagenoeg identiek aan sCT. Deze feiten wijzen erop, dat hCT 2 wat betreft de amino-zuursamenstelling, zij het niet noodzakelijkerwijs de aminozuursequen-30 tie, meer met sCT dan met hCT verwant is. In Immunologisch opzicht verschilt hCT 2 daarentegen wezenlijk van sCT. Terwijl sCT als soort-vreemd peptide in het menselijk serum een antilichaam-reactie veroorzaakt, worden geen voor sCT specifieke antilichamen als reactie op de aanwezigheid van hCT 2 in het menselijk serum gevormd, hetgeen met de 35 bovengenoemde RIA kan worden aangetoond.

Aangenomen mag worden, dat in het algemeen geen antilichamen, die specifiek zijn voor sCT, nog andere tegen hCT 2 in het menselijk serum worden gevormd, omdat hCT 2 als niet-lichaamsvreemd materiaal niet als immunologisch vreemd herkend zou mogen worden.

40 Volgens hetgeen tot nu toe gevonden is, gaat het bij hCT 2 om 8402017 3 slechts êên chemische verbinding. Theoretisch bestaat echter de mogelijkheid, dat het bij hCT 2 ook om een mengsel van nieuwe calcitonlnen gaat, waarvan de afzonderlijke componenten in de bovengenoemde HPLC- en gelsystemen niet zichtbaar worden gescheiden. In het laatste géval be-5 treft de uitvinding zowel het mengsel als ook alle afzonderlijke componenten van het mengsel. De afzonderlijke componenten kunnen op gebruikelijke wijze, bijv. door chromatografie in geschikte andere HPLC- of gelsystemen worden gescheiden afzonderlijk volgens op zich zelf bekende methoden van de peptidechemie sythetisch of gentechniseh worden bereid. 10 De voor de synthese voorlopig noodzakelijke structuuropheldering van de afzonderlijke componenten kan ook met het mengsel worden uitgevoerd.

De uitvinding betreft ook de zouten, in het bijzonder de zuuraddi-tiezouten van hCT 2, op de eerste plaats farmaceutisch toepasbare, niet giftige zouten met zuren, bijv. met anorganische zuren, in het bijzon-15 der bijv. zoutzuur, zwavelzuur of fosforzuur, of zouten met organische carbon-, sulfon- of sulfonzuren, bijv. azijnzuur, propionzuur, glycol-zuur, barnsteenzuur, maleïnezuur, hydroxymaleïnezuur, methylmaleïne-zuur, fumaarzuur, appelzuur, wijnsteenzuur, citroenzuur, benzoëzuur, kaneelzuur, amandelzuur, salicylzuur, 4-aminosalicylzuur, 2-fenoxyben-20 zoëzuur, 2-acetoxybenzoëzuur, embonzuur, nicotinezuur of isonicotine-zuur, verder aminozuren alsmede methaansulfonzuur, ethaansulfonzuur, 2-hydroxyethaansulfonzuur, ethaan-l,2-disulfonzuur, benzeensulfonzuur, 4-methyl-benzeensulfonzuur of naftaleen-2-sulfonzuur, of met andere zure organische verbindingen zoals ascorbinezuur.

25 Voor het isoleren of zuiveren kunnen ook farmaceutisch ongeschikte zouten worden toegepast. Voor de therapeutische toepassing komen echter alleen de farmaceutisch toepasbare, niet-giftige zouten in aanmerking, die daarom de voorkeur verdienen.

hCT 2 heeft een hypocalcemische werking, d.w.z. het verlaagde cal-30 cium- en fosfaatspiegel in het bloed en beschermt de botten tegen verlies van mineralen en kan derhalve als geneesmiddel worden gebruikt, in het bijzonder voor dezelfde indicaties als hCT, bijv. het zich op de markt bevindende Cibacalcin^, bijv. bij botstofwisselingsstoringen, zoals osteoporose of Morbus Paget.

35 De aan de mens of een warmbloedig dier, in het bijzonder de mens, met een lichaamsgewicht van ongeveer 70 kg toe te dienen dosis van hCT 2 bedraagt ongeveer 5 pg tot ongeveer 50 pg, in het bijzonder ongeveer 20 pg per dag. De toediening geschiedt bij voorkeur parenteraal, bijv. op 5 dagen per week gedurende ongeveer 3 maanden.

40 hCT 2 heeft ook effecten op het centrale zenuwstelsel. Zoals door 8402017 J ï' w 4 middel van receptor-autoradiografie kan worden vastgesteld, bevinden zich bindingsplaatsen voor hCT 2 in de menselijke hersenen. Omdat bovendien de concentratie van hCT 2 in de hersenen gelijk is aan die van hCT, terwijl in de schildklier hCT in een ongeveer 200 voudig hogere 5 concentratie dan hCT 2 aanwezig is, heeft de werking van hCT 2 op het centrale zenuwstelsel een grotere betekenis dan de bekende functies van hCT in zenuwstelsel.

hCT 2 wordt bijv. verkregen, doordat men menselijk bloedserum bij 4eC en 48.000 g gedurende 30 minuten centrifugeert, het heldere super-10 natans met octadecasilyl-kiezelgel-patronen, bij voorkeur octodecasi-lyl-kiezelgel-Sep-Pak-G^g—patronen (Waters Assoc., Milford, Massachussetts), in 0,1 gew.Z's trifluorazijnzuuroplossing in water adsorbeert, hCT 2 uit de patronen met 60 vol.% acetonitril in water, dat 0,1 gew.% trifluorazijnzuur bevat, elueert, het geëlueerde materiaal 15 lyofiliseert, het gelyofiliseerde materiaal met 0,1 molair azijnzuur behandelt, het opgeloste deel bij 4°C en 48.000 g gedurende 30 minuten centrifugeert, het heldere residu in het bovengenoemde HPLC-systeem chromatografeert en hCT 2 uit de geschikte fracties isoleert.

hCT 2 wordt ook verkregen, doordat men in chronologische volgorde 20 eerst aan bevroren menselijke hypofysen het 10-20 voudige volume ijskoud, water bevattend 2 molair azijnzuur toevoegt, gedurende 5 minuten in een kokend waterbad verwarmt, de hypofysen met een ultra-turrax (18K homogenisator, Ika-Werke, Staufen, Duitsland) of met een wat betreft de beoogde werking vergelijkbare inrichting fijn maakt, het gehomogeni-25 seerde materiaal gedurende ongeveer 12 uren bij -20°C invriest, bij omgevingstemperatuur ontdooit, opnieuw invriest, weer ontdooit, bij 48.000 g en 4°C gedurende 30 minuten centrifugeert, het heldere super-natans op de bovenbeschreven wijze met octadecasilyl-kiezelgel-patronen adsorbeert, in het bovengenoemde HPLC- en/of gelsysteem chromatogra-30 feert en hCT 2 uit geschikte fracties isoleert.

Voor het vinden van de hCT 2 bevattende fracties gebruikt men een radio-immuno-assay ([]sCT met een specifiek activiteit van 500 Ci/mmol, antilichaam tegen synthetisch sCT, als standaard synthetisch sCT).

35 De uitvinding betreft in het bijzonder volgens de bovenbeschreven methode en in de voorbeelden beschreven werkwijzen voor het isoleren verkrijgbaar hCT 2 of een zout daarvan.

De zouten van hCT 2 kunnen op op zich zelf bekende wijze worden bereid. Zuuradditiezouten verkrijgt men bijv. door behandelen met een 40 geschikt zuur, bijv. één van de bovengenoemde zuren, of een geschikt 84 02 0 < ♦ * 5 anionen uitwisseld reagens.

Zouten kunnen op gebruikelijke wijze in de vrije verbindingen worden omgezet^ zuuradditiezouten bijv. door behandelen met een geschikt basisch middel.

5 De uitvinding betreft ook farmaceutische preparaten, die als werk zame stof een effectieve dosis hCT 2 of een zout daarvan samen met een significante hoeveelheid van een farmaceutisch dragermateriaal bevatten, in het bijzonder dergelijke preparaten voor intranasale of paren-· terale, zoals intramusculaire of intraveneuze toediening bij de mens en 10 warmbloedige dieren, op de eerste plaats bij de mens.

De dosering van de werkzame stof is afhankelijk van de soort van het warmbloedige dier, het lichaamsgewicht, de leeftijd en de individuele toestand, van de te behandelen ziekte alsmede van de toedienings-wijze.

15 De nieuwe farmaceutische preparaten voor de parenterale toediening bevatten in voor gebruik gerede vorm ongeveer 0,001 gew.pro mille tot ongeveer 1 gew.%, bij voorkeur ongeveer 0,005 gew.pro mille tot ongeveer 0,1 gew.pro mille, bijv. 0,01 gew.pro mille van de werkzame stof.

De farmaceutische preparaten volgens de uitvinding kunnen bijvoorbeeld 20 in de vorm van doseringseenheden, zoals ampullen, verkeren.

Bij voorkeur gebruikt men oplossingen van de werkzame stof, daarnaast ook suspensies, en wel in het bijzonder isotonische water bevattende oplossingen of suspensies, waarbij deze bijv. bij gelyofiliseerde preparaten, welke de werkzame stof als zodanig of samen met een drager-25 materiaal, bijv. mannitol, bevatten, voor het gebruik kunnen worden bereid. In het bijzonder voor de intranasale toepassing zijn suspensies in olie bijzonder geschikt. De farmaceutische preparaten kunnen geste-raliseerd zijn en/of hulpstoffen, bijv. conserveer-, stabiliseer-, be-vochtigings- en/of emulgeermiddelen, middelen voor het verbeteren van 30 de oplosbaarheid, zouten voor het regelen van de osmotische druk en/of buffers bevatten en worden op op zich zelf bekende wijze, bijv. door middel van gebruikelijke oplos- of lyofiliseringsmethoden, bereid. De genoemde oplossingen of suspensies kunnen viscositeit verhogende stoffen, zoals natrium-carboxymethylcellulose, carboxymethylcellulose, dex-35 traan, polyvinylpyrroiidon en bij voorkeur gelatine bevatten.

Suspensies in olie bevatten als olie-achtige componenten de voor injecties gebruikelijke plantaardige, synthetische of half-synthetische oliën. Als zodanig kunnen in het bijzonder vloeibare vetzuuresters worden genoemd, die als zuurcomponent een vetzuur met een keten van 8-22, 40 in het bijzonder 12-22 koolstofatomen bevatten, zoals bijv. laurine- 8402017 6 . ♦ ψ zuur, trideeylzuur, myristinezuur, pentadecylzuur, palmitinezuur, mar-garinezuur, stearinezuur, arachinezuur, behenzuur of geschikte onverzadigde zuren, zoals bijv» oliezuur, elaïdinezuur, erucazuur, brasidine-zuur of linolzuur. De alcoholcomponent bevat maximaal 6 koolstofatomen 5 en is een één- of meerwaardige,, bijv. één-, twee- of driewaardige alcohol, bijv. methanol, ethanol, propanol, butanol of pentanol of een iso-meer ervan, op de eerste plaats echter glycol of glycerol. Als vetzuur-esters kunnen derhalve bijvoorbeeld worden genoemd: ethyloleaat, iso-propylmyristaat, isopropylpalmitaat, "Labrafil M 2735" (polyoxyethy-10 leenglyceryltri-oleaat van de firma Gattefossé, Parijs), "Miglyol 812" (triglyceride van verzadigde vetzuren met een ketenlengte van 8-12 koolstofatomen van de firma Chemische Werke Witten/Ruhr, Duitsland), in het bijzonder echter plantaardige oliën, zoals katoen-zaadolie, amandelolie, olijfolie, ricinusolie, sesamolie, sojabonen-15 olie, op de eerste plaats pinda-olie.

De bereiding van de injecteerbare preparaten geschiedt op gebruikelijke wijze onder antimicrobiële omstandigheden, evenzo het afvullen in ampullen of flesjes alsmede het afsluiten van de houders.

In de volgende voorbeelden wordt de uitvinding nader toegelicht.

20 Voorbeeld I

Extractie van hCT 2 uit inenseli-jk plasma en zuivering met hoge-druk-vloeistof-chromatografie

Veneuse bloed van normale personen wordt in heparine bevattende vacutainers (Becton Dickinson France SA, Grenoble, Frankrijk) afgeno-25 men, vervolgens tweemaal gedurende 10 minuten bij 4°C en 1700 x g gecentrifugeerd (centrifuge: Superspeed RC-2B, Sorvall, Du Pont Instuments, Newton, Connecticut, USA), de supernantia worden verenigd en bij -20°C ingevróren. Het plasma wordt binnen 2 weken ontdooid en gedurende 30 minuten bij 4°C en 48.000 x g gecentrifugeerd (rotor met 30 een vaste hoek: Sorvall SS-34, polyetheen buisjes: Du Pont Instruments, Newton, Connecticut, USA). De verenigde supernatantia (minimaal 20 ml) worden bij 4°C in porties (3-5 ml) volgens de volgende methode door adsorptie· aan octadecasilyl-kiezelgel (Sep-Pak C^g-patronen, Waters Assoc., Milford, Massachusetts, USA) geëxtraheerd.

35 Extractie

Voor het opbrengen van het plasmamonster worden de Sep-Pak-patro-nen op een wegwerpspuit van 10 ml (Henke-Sass Wolf GmbH, Bondsrepublike Duitsland) met "Luer-Lock" aansluiting gestoken en met 5 ml methanol (Merck AG, Darmstadt, Bondsrepubliek Duitsland), gevolgd door 10 ml 40 0,1 vol.% trifluorazijnzuur (TFA, sequencer grade, Rahburn Chemicals, 8402017 ♦ -* 7

Walkerburn, Groot Brittannië) in tweemaal gedestilleerd water bevochtigd. Vervolgens wordt een tweede wegwerpspuit van 10 ml met een erop geplaatste kolf op de patronen gestoken 3-5 ml plasma worden in de eerste spuit gebracht en langzaam in de tweede spuit geperst zonder dat 5 lucht in de patronen geraakt. Na vijfmaal heen en weer persen van het plasma wordt een spuit verwijderd, het plasma voor de laatste maal doorgeperst en weggedaan. Daarna wordt het patroon met 10 ml 0,1%’s TFA gewassen en vervolgens met 3 ml 60 vol.%Ts acetonitril/0,1 vol.%’s TFA druppelsgewijs in een kunststof scintilatie-flesje (Packard Inst.

10 Company, Downers Grove, Illiois, USA) geëlueerd. In een houder worden 5 eluaten verenigd, in vloeibare stikstof wordt schuin ingevroren en gelyofiliseerd. Na het vriesdrogen wordt het verkregen extract in telkens 1 ml 60¾ acetonitril/0,1% TFA opgelost. Bij extracties van meer dan 25 ml plasma worden verscheidene extracten in een scintilatie-fles-15 je verenigd. De lege flesjes worden met dezelfde hoeveelheid oplosmiddel gespoeld en de spoelvloeistof wordt aan de verenigde extracten toegevoegd, ingevroren en nogmaals gelyofiliseerd. Dit gelyofiliseerde materiaal wordt opgelost in 2 ml 0,1 M azijnzuur (Merck), bij 48.000 x g en 4QC gedurende 20 minuten in een polycarbonaatbuisje gecentrifugeerd 20 en het supernatans wordt door middel van omkeerfase-hoge-druk-vloei-stofchromatografie (HPLC) gescheiden.

HFIC

De HPLC-analyses worden uitgevoerd bij kamertemperatuur. De inrichting bestaat uit twee pompen (model 110A, Altex, Berkeley, 25 Californië, USA), een hoge-druk-gradiënfmengkamer (Altex model 400) alsmede een microprocessor/programmeerinrichting (Altex model 420) als regeleenheid. De monsters worden met de hand door een septumlose, van een monsteropbrengslang van 2 ml voorziene injector (model RE 7125,

Rheodyne Inc., Berkeley, Californië USA) opgebracht. Als kolommen die-30 nen volgens de slurry-techniek van boven naar beneden met nucleosil met 10 μ C^g (Macherey Nagel, Düren, Bondsrepubliek Duitsland) gevulde kolommen uit roestvrij staal (lengte 25 cm, inwendige diameter 4,6 mm,

Altex). Oplossing A bestaat uit 0,1 M heptafluorboterzuur in water (sequencer grade, Rathburn Chemicals), die bovendien door een bevoch-35 tigde Sep-Pak-C^g-patrooon geperst is. Oplossing B bestaat uit 20 vol.% oplossing A en 80 vol.% acetonitril (HPLC-grade S, Rathburn Chemicals). De oplossingen worden voor de analyse gedurende 2 minuten met helium begast en de kolom wordt gedurende ongeveer één uur met 25¾ oplossing B bij een stroming van 1,5 ml/minuut geëquilibreerd. Na 40 een laadfase van 2,5 minuten onder beginomstandigheden (25¾ oplos- 8402017 / ' / 8 sing B, bevat 20% acetonitril) worden de peptiden met een lineaire gradiënt van 25% tot 73% van de oplossing B (20-58% acetonitril) gedurende 90 minuten en met een stroming van 1,5 ml/minuut geëlueerd. Eluensfrac-ties van ongeveer 1,5 ml (95 fracties in 100 minuten) worden na het 5 passeren van een ÜV-détector (Uvikon LCD 725, met variabele golflengte, ingesteld op 250 nm, volledige uitslag bij 0,05 tot 0,1 absorptie-een-heden, registratie door middel van W+W Schreiber Tarkan 600, beide Kontron AG, Zürich, Zwitserland) en een door de microprocessor geregelde motorklep (Altex model 402, met omschakelmogelijk voor wegdoen of 10 verzameling van fracties) in een gesynchroniseerde fractieverzamelin-richting (Buchler Alpha 200, Kontron AG) in gesiliconiseerde glasbuisjes verzameld. Voor het verminderen van een mogelijke adsorptie van de peptiden aan de glaswand worden voor de analyse in elk buisje 300 μΐ van een oplossing van 1% runderserumalbumine (Behring Werke, 15 Marburg-Lahn, Bondsrepubliek Duitsland) en 0,05% natriumazide (Fluka AG, Buchs, Zwitserland) (gew./vol.) in 0,1 M azijnzuur gebracht, De fracties worden met een Vortex-menger (Scientific Industries Ine., Springfield, Massachusetts, USA) gemengd, bij -20°C ingevroren en ge-lyofiliseerd. Voor de in het onderstaande beschreven radio-immunologi-20 sche bepaling van de calcitonine-concentratle worden telekens 0,5 ml 0,01 M azijnzuur in de buisjes gebracht en gemengd»

De waarde van de teruggevonden hoeveelheid synthetisch humaan cal-citonine-(l-32), dat voor de extractie aan het plasma is toegevoegd, bedraagt na de HPLC nog 40-70%.

25 Na elke HPLC-behandeling worden de kolommen en de monsterslang achtereenvolgens met telkens 15 ml oplossing B, 150 ml 90% methanol-/1% TFA, 40 ml butanol-1 en 140 ml methanol, waaronder de kolom ook bewaard wordt, geregenereerd.

Meetmethode 30 (radio-immunologische bepaling van de calcitonine-concentratie)

De concentratie van het hCT 2 wordt radio-immunologisch in een concentratiereeks bepaald, 10, 20, 50 en 100 yl van de HPLC-fracties, die op de boven beschreven wijze zijn nabehandeld, worden gedurende 3 dagen bij 4eC samen met 100 pl antilichaamserum tot synthetisch sCT 35 (Sandoz AG, Basel, Zwitserland) in een immuno-assaybuffer bij een totaal volume van 300 yl tevoren geïncubeerd (immuno-assaybuffer: 0,05 M fosfaat, pH 7,5, 10% humaan serum, dat geen aantoonbare hoeveelheden immuun-reactief sCT bevat), en vervolgens na toevoeging van 200 yl as-saybuffer met 15.000 dpm [^-^^1]sCT (specifieke activiteit 40 600 Ci/mmol) gedurende een verdere periode van 3 dagen bij 4°C geïncu- 84 0 2 0 1 7 9 beerd. Het merken van sCT met wordt met chlooramine-T (Eastman Kodak, Rochester, USA) in hoofdzaak volgens de methode van W.M. Hunter en F.C. Greenwood (Nature [London] 194, 495-496 [1962]) uitgevoerd. Bij de eindverdunning van de antilichamen (1:25.000) worden 5 30-402 van de antilichamen gebonden aan het [-^IJsCT d.w.z. de specifieke binding bedraagt 30-40%. Als standaard dient hetzelfde synthetische sCT; een half-maximale remming van de binding van [125j]sc£ aan de antilichamen geschiedt met ongeveer 100 pg sCT (»0,03 pmol). Een vergelijkbare remming van de binding wordt door 10 pg 10 hCT niet bereikt.

Het bovengenoemde antilichaamserum verkrijgt men op de volgende wijze: Be antilichamen worden in een geit met een gewicht van 25 kg geproduceerd na primaire immunisatie met 200 pg sCT (zie boven) als antigen en reïmmunisatie met 100 pg van hetzelfde antigen 30 dagen na de 15 primaire immunisatie. Voor de immunisatie wordt sCT in 0,01 M azijnzuur (1 mg/ml) opgelost, met 2 gewichtsprocent vast aluminiumhydroxide (Alhydrogel, Superfos Export Co., a/s Kopenhagen, Denemarken) gemengd en in een gelijk volume volledig adjuvans volgens Freund (Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA) in suspensie gebracht. Deze sus-20 pensie wordt in een Omnimixer (Sorvall) in de hoogste stand bij 4°C gevormd. 0,5-1,0 ml suspensie worden in wegwerpspuiten (Primo 1 ml, A$ik I/S, Denemarken) opgezogen en bij elke poot in het gebied van de sub-axilaire lypfeknobbels subcutaan toegediend. 10 dagen na de bovengenoemde reïmmunisatie worden 50-80 ml bloed, dat de gewenste antilicha-25 men tegen sCT bevat, uit de vena jugularis in met gehepariniseerde behandelde buisjes afgenomen en het verkregen plasma wordt in porties van 3-5 ml bij -20°C bewaard.

De antilichamen worden door meting van de binding van het afgenomen plasma aan [ ]SCT aangetoond. Aan antilichaam verbonden en 30 vrij [^^I]sCT scheidt men door middel van met dextraan bekleed houtskool, in hoofdzaak volgens de methode van V. Herbert, K.S. Lau, C.W. Gottlieb en S.J. Bleicher [J. Clin. Endocrinol. Metab. 25, 1375-1384 (1965)]. Dezelfde methode dient voor het aantonen van antilichamen in humaan serum.

35 Chromatografie-profiel

Het chromatografie-profiel van de bovenbeschreven HPLC-scheiding is in fig. 1 weergegeven. Op de ordinaat is de concentratie uitgezet, aangegeven in picogramequivalenten, waarbij voor de met * en A enerzijds alsmede voor de met 0 anderzijds gekarakteriseerde krommen 40 verschillende maatstaven gelden.

8402017 - ' ' / 10

Op de abscis is de sedert het .begin van het elueren verstreken tijd afgezet. De rechte stippellijn geeft de samenstelling van de voor de elutie gebruikte lineaire gradiënt aan doordat het acetonitrilgehal-te wordt aangegeven. De met a of b aangeduide pijlen geven de plaats 5 van de elutie van hCT resp. van sCT aan.

Voor de bepaling van de in fig. 1 aangegeven concentratiewaarden wordt voor elk van de drie met stippen "·", driehoekjes of cirkeltjes "°" aangeduide krommen een andere radio-immuno-assay (verschillende antilichamen) gebruikt en wel voor de met stippen aangeduide 10 concentratiewaarden een RIA tegen synthetisch hCT (vgl. F.M. Dietrich, W.H. Hunziker en J.A. Fischer, Acta Edocrinologica 80 [1975] 465-486), voor de met driehoekjes aangeduide concentratiewaarden van de bovenbeschreven RIA tegen synthetisch sCT en voor de in het kader van de onderhavige aanvrage minder belangrijke, met cirkeltjes aangeduide con-15 centratiewaarden een RIA tegen menselijk PDN-21. Synthetisch bereid PDN-21, een peptide met 21 aminozuren, is beschreven door MacIntyre c.s., Nature (London) 300, 460-462.

Voorbeeld II Gelatine-oplossing 20 Een steriel gefiltreerde oplossing van hCT 2 in water wordt onder verwarmen en onder aseptische omstandigheden gemengd met een steriele gelatine-oplossing, die als concentreermiddel fenol bevat, zodat 1,0 ml oplossing de samenstelling bezit: 25 hCT 2 10 yg gelatine 150,0 mg fenol 4,7 mg gedestilleerd water tot 1,0 ml 30 Het mengsel wordt aseptisch in flesjes tot 1,0 ml afgevuld.

Voorbeeld III

Voor injectie geschikt steriel droog materiaal

Men lost 5 yg hCT 2 op in 1 ml van een oplossing van 20 mg mannitol in water. De oplossing wordt steriel gefiltreerd en onder asepti-35 sche omstandigheden in een ampul van 2 ml gebracht, diepgevroren en ge-lyofiliseerd. Voor het gebruik wordt het gelyofiliseerde materiaal opgelost in 1 ml gedestilleerd water of 1 ml fysiologische zoutoplossing. De oplossing wordt intramusculair of intraveneus toegepast. Deze formulering kan ook in injectie geschikte ampullen met een dubbele kamer 40 worden afgevuld.

84 02 0 1 7 / < / η

Voorbeeld IV Neusspray

In een mengsel van 3,5 ml "Miglyol 812" en 0,08 g bezylalcohol worden 200 yg fijngemalen (< 5,0 ym) hCT 2 gesuspendeerd. Deze suspen-5 sie wordt in een houder met een doseerventlel gebracht. Dan worden 5,0 ml "Freon 12“ onder druk door het ventiel in de houder gebracht.

Door schudden wordt het "Freon" opgelost in het Miglyol-benzylalcohol-mengsel. Deze sprayhouder bevat ongeveer 100 afzonderlijke doses, die afzonderlijk kunnen worden toegediend.

10 Voorbeeld V

Extractie van hCT 2 uit menselijke hypofysen en zuivering door middel van gelfiltratie 5-10 hypofysen (3-5 g) van patiënten zonder aandoeningen van endocriene klieren of van het skelet worden door autopsie niet later dan 15 20 uren na het intreden van de dood verwijderd en bij -80 °C gedurende niet langer dan 3 weken bewaard.

Extractie

Aan de bevroren hypofysen voegt men het 10 voudige volume ijskoud water bevattend 2 molair azijnzuur toe en brengt het monster gedurende 20 5 minuten in een kokend waterbad. De hypofysen worden met een ultra-turrax (18K Homogenisator van Ika-Werke, Staufen, Bondsrepubliek Duitsland) fijngemaakt. Het gehomogeniseerde materiaal wordt gedurende ongeveer 12 uren bij -20PC bevroren, dan bij kamertemperatuur ontdooid, weer bevroren en weer ontdooid en tenslotte bij 48.000 g bij 4°C gedu-25 rende 30 minuten gecentrifugeerd. Het heldere supernatans wordt gelyo-filiseerd en bij -20°C bewaard.

Het supernatans wordt opgezogen in een wegwerpspuit van 10 ml en op de in voorbeeld I beschreven wijze met behulp van een Sep-Pak-pa-troon geëxtraheerd.

30 Gelfiltratie (gelsysteem)

De gelfiltratie-analyse wordt uitgevoerd bij 4-6°C. De inrichting bestaat uit een pomp (iiodell PMP-10, Ismatec SA, Zurich, Zwitserland) en een chromatografiekolom bestaande uit kunststof (lengte 100 cm, inwendige diameter 1,6 cm, Pharmacia Fine Chemicals AB, Box 175, S-751 04 35 Uppsala 1, Zweden). De elutie-oplossing bestaat uit 0,2 mol/1 ammonium-acetaat (E. Merck, Darmstadt, Bondsrepubliek Duitsland) met een pH van 4,6 en 0,05 gew.% runderserumalbumine (Behring Werke, Marburg [Lahn],

Bondsrepubliek Duitsland). Het zuur wordt gedurende ongeveer 72 uren in de oplossing geëquilibreerd. De oplossing (2 ml) wordt via een drieweg-40 kraan in verloop van ongeveer 30 minuten aangezogen. De peptiden worden 84 02 0 1 7 '4 * 12 gedurende 48 uren en met een stromingssnelheid van 5,0 ml/uur ge-elueerd. De geëlueerde fracties van ongeveer 2,5 ml (100 fracties in 48 uren) worden in een fractieverzamelinrichting (LKB 7000 Ultrorac, Bromma, Zweden) verzameld. De fracties worden bij -20°G ingevroren en 5 gelyofiliseerd. Voor de in voorbeeld I beschreven radio-immunologische bepaling van de calcitonine-concentratie worden telkens 0,5 ml 0,01 mo-lair azijnzuur in water in de buisjes gebracht en met de inhoud daarvan gemengd. De waarde van de teruggevonden hoeveelheid synthetisch hCT, dat voor de extractie aan het hypofyse-extract is toegevoegd, bedraagt 10 na gelfiltratie nog 40-80%.

8402017

Claims

1. Materiaal uit de groep van. de calcitoninen, in het onderstaande ook aangeduid als menselijk calcitonine 2, afgekort hCT 2, dat uit het menselijk lichaam kan worden geïsoleerd of op andere wijze kan worden 5 verkregen, met de volgende eigenschappen: a) reactievermogen met antilichamen, die het tot de stand van de techniek behorende humane calcitonine-(l-32), afgekort hCT, niet herkennen, daarbij echter met het zalm-calcitonine-(l-32), afgekort sCT, nog bij een tot maximaal 10^ voudig geringere concentratie kunnen reageren, 10 b) retentietijd niet te onderscheiden van die van het synthetisch bereide sCT in het volgende hoge-druk-vloeistof-chromatografiesysteem (HPLC-systeem): adsorbens: Nucleosil 10 C^g® of een ander adsorbens met vergelijkbare eigenschappen, een kolom met een lengte van 250 mm en een dia-15 meter van 4,6 mm, belading met 1 ng tot 20 pg hCT, lineaire gradiënt, bestaande uit de oplossingen A (0,1 molair heptafluorboterzuuroplossing in water) en 25-73 volumeprocent B (20 volumeprocent van de oplossing A en 80 volumeprocent acetonitril), overeenkomend met 20-58 volumeprocent acetonitril gedurende 90 minuten bij een doorstroomsnelheid van 20 1,5 ml/uur, c) in humaan serum niet het teweegbrengen van de vorming van aantoonbare hoeveelheden antilichamen, die in staat zijn met sCT te reageren, waarbij voor de proef van dit aantonen van de binding aan [125χ] sCT met de specifieke activitiet van 500 Ci/mmol gebruikt 25 wordt, en zouten ervan*

2. Materiaal Volgens conclusie 1, dat de in conclusie 1 genoemde eigenschappen bij een belading van het adsorbens met 1-10 ng hCT 2 bezit, en zouten ervan.

3. Materiaal volgens conclusie 1 of 2, waarvan het elutie-volume 30 ia het volgende gelpermeatiechromatografie-systeem (gelsysteem) niet kan worden onderscheiden van dat van het synthetisch bereide sCT; Gel: Bio-gel P-15G® (100-200 mesh) of een andere gel met vergelijkbare eigenschappen, kolom met een lengte van 100 cm en een diameter van 1,6 cm, belading met 1 ng tot 10 ng hCT 2, elueermiddel bestaande uit 35 ammoniumacetaat (0,2 mol/1, pH 4,6) en runderserumalbumine (0,5 mg/ml), gedurende 48 uren bij een doorstroomsnelheid van 5 ml/uur.

4 Materiaal volgens conclusie 1-3 of een zout ervan in een ten opzichte van het voorkomen in de natuur verhoogde concentratie.

5. Materiaal volgens conclusie 1-3 of een zout ervan in in hoofd-40 zaak zuivere vorm. 8402017 3 ^ V

6. Farmaceutische preparaten, die een effectieve dosering van een verbinding volgens conclusie 1-5 of een een farmaceutisch toepasbaar zout daarvan samen met een significante hoeveelheid van een farmaceutisch dragermateriaal bevatten.

7. Toepassing van een materiaal volgens conclusie 1-5 of een far maceutisch toepasbaar zout ervan voor het behandelen van ziekten.

8. Materiaal volgens conclusie 1-5 of een farmaceutisch toepasbaar zout ervan voor de toepassing bij een werkwijze voor de therapeutische behandeling van het menselijk en dierlijk lichaam.

9. Toepassing van een materiaal volgens conclusie 1-5 of een far maceutisch toepasbaar zout ervan voor de behandeling bij botstofwisse-lingsstoringen.

10. Werkwijze voor de bereiding van een materiaal volgens conclusie 1-3 of een zout ervan, met het kenmerk, dat men menselijk bloedserum 15 bij 4eC en 48.000 g gedurende 30 minuten centrifugeert, het heldere supernatans met octadecasilyl-kiezelgel-patronen, bij voorkeur octadeca-silyl-kiezelgel-Sep-Pak-C^g-patronen (Waters Assoc., Milford, Massachussets), in 0,1%'s trifluorazijnzuuroplossing in water adsorbeert, hCT 2 uit de patronen elueert met 60 vol.% acetonitril in water, 20 dat 0,1% trifluorazijnzuur bevat, het geëlueerde materiaal lyofili-seert, het gelyofiliseerde materiaal met 0,1 molair azijnzuur behandelt, het opgeloste deel bij 4°C en 48.000 g gedurende 30 minuten centrifugeert, het heldere supernatans in het bovengenoemde HPLC-systemen chromatografeert en hCT 2 uit de geschikte fracties isoleert, en, des-25 gewenst, het verkregen materiaal in een zout omzet.

11. Werkwijze voor de bereiding van een materiaal volgens conclusie 1-3 of een zout ervan, met het kenmerk, dat men in chronologische volgorde eerst aan bevroren menselijke hypofysen het 10-20 voudige volume ijskoud, water bevattende 2 molair azijnzuur toevoegt, gedurende 5 mi- 30 nuten in een kokend waterbad verwarmt, de hypofysen met een Ültra-Turrax (18K Homogenisator, Ika-Werke, Staufen, Bondsrepubliek Duitsland) of een wat betreft de beoogde werking vergelijkbare inrichting fijn maakt, het gehomogeniseerde materiaal gedurende ongeveer 12 uren bij -20°C invriest, bij kamertemepratuur ontdooit, opnieuw in-35 vriest, weer ontdooit, bij 48.000 g en 4°C gedurende 30 minuten centrifugeert, het heldere supernatans op de bovenbeschreven wijze op octade-casilyl-kiezelgel-patronen adsorbeert, in het volgende HPLC-systeem: Adsorbens: Nucleosil 10 of een ander adsorbens met verge lijkbare eigenschappen, een kolom met een lengte van 250 mm en een dia-40 meter van 4,6 mm, belading met 1-10 ng hCT 2, lineaire gradiënt, be- 84 02 0 1 7 u staande utt de oplossingen A (0,1 molair heptafluorboterzuuroplossing in water) en 25-73 volumeprocent B (20 volumeprocent van de oplossing A en 80 volumeprocent acetonitril), overeenkomend met 20-58 volumeprocent acetonitril over 90 minuten bij een doorstroomsnelheid van 1,5 ml/uur, 5 en/of in het volgende gelsysteem: gel: Bio-gel P-150®· (100-200 mesh) of een andere gel met vergelijkbare eigenschappen, kolom met een lengte van 100 cm en een diameter van 1,6 cm, belading met 1 ng tot 10 ng hCT 2, elueermiddel bestaande uit ammoniumacetaat (0,2 mol/1, pH 4,6) en runderserumalbumine (0,5 mg/ml), 10 gedurende 48 uren bij een doorstroomsnelheid van 5 ml/uur, chromatogra-feert en hCT 2 uit de geschikte fracties isoleert en, indien gewenst, het verkregen materiaal in een zout omzet*

12. Het volgens de werkwijze van conclusie 10 of 11 verkrijgbare materiaal en zouten ervan. mum H I I t-H-H-H· 8402017 w >W r · - OA 8402017 —fé~ » Verbetering van errata in de beschrijving, behorende bij de Octrooiaanvrage No. NO 32592 voorgesteld door aanvraagster, onder datum 24 juli 1984. blz. 1, regel 16: "1,5 ml/uur" wijzigen in ”1,5 ml/minuut” blz. 1, regel 30: "500 wijzigen in "600" blz. 7, regel 39: vóór ”25% oplossing B" inlassen: "een mengsel van 75% oplossing A en” 5 blz. 11, regel 38: "Het zuur" wijzigen in "De kolom" blz.

13, regel 20: "1,5 ml/uur wijzigen in "1,5 ml/minuut" blz. 13, regel 24: "activitiet van 500 Ci/mmol" wijzigen in "activiteit van 600 Ci/mmol". • '-·, -TTil i 2.4 JUL1984 1 84 02 0 1 7