NL8120166A - - Google Patents

Claims (7)

1. Werkwijze voor het bereiden van een bloedpreparaat op een substraat voor een microscoop, met het kenmerk, dat een bedekkende vióei- 5 stof wordt aangebracht op het substraat, het substraat wordt geroteerd zodat de bedekkende vloeistof zich verspreidt tot een relatief dunne laag over ten minste een deel van hèt substraat, waarna een hoeveelheid bloed wordt aangebracht op het met vloeistof bedekte substraat en het substraat voor de tweede keer wordt geroteerd, zodat het bloed zich over ten minste 10 een deel van het met vloeistof bedekte substraat verspreidt.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het aanbrengen van de vloeistof als deklaag bestaat uit het aanbrengen van een verdunningsmiddel voor bloed.

3. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het aan- 15 brengen van een hoeveelheid bloed bestaat uit het aanbrengen van volledig bloed.

4. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het aanbrengen van een hoeveelheid bloed bestaat uit het aanbrengen van verdund bloed,

5. Werkwijze voor het preconditioneren van een substraat voor een bloedpreparaat, met het kenmerk, dat een vloeistof wordt aangebracht die vrij is van bloedcellen op het substraat en het substraat vervolgens wordt geroteerd zodat de vloeistof wordt verspreid in een relatief dunne laag over ten minste een deel van het substraat.

5 De werkwijze volgens de uitvinding maakt het mogelijk om een kleine hoeveelheid bloed te verspreiden over een bepaald substraat met de gewenste dichtheid en andere parameters van een standaardpreparaat, maar vereist aanzienlijk minder, te weten een grootte-orde, bloed dan normaal wordt toegepast bij standaard geroteerde preparaten. Het voordeel 10 wordt bewerkstelligd door het feit dat zeer weinig van het bloed wordt verwijderd door roteren tijdens het roteren bij de werkwijze volgens de uitvinding. Deze methode is zeer geschikt bij de bovenbeschreven omstandigheden waarbij slechts een kleine hoeveelheid bloedmonster aanwezig is voor het onderzoek of waarbij het gewenst is om slechts kleine monsters 15 te verkrijgen. Korte beschrijving van de tekening. Andere doelstellingen en voordelen volgens de uitvinding zullen duidelijk worden aan de hand van de volgende beschrijving, waarbij wordt verwezen naar de bijgevoegde tekening waarbij: 20 de enkelvoudige figuur grafisch de rotatievolgorde weergeeft die wordt toegepast om de werkwijze volgens de uitvinding te bewerkstelligen. Werkwijze volgens de uitvinding met het beste resultaat. Een microscoopplaatje wordt aangebracht in een houder voor plaatjes van rotatie-apparatuur voor het bereiden van een bloedfilm, het-25 geen een onderdeel is van een differentieel analysesysteem, zoals bijvoorbeeld beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 4.016.828 van Maher, Jr. et al. De plaatjes zijn met name 2,5 cm bij 8 cm. Nadat het plaatje is geplaatst in de houder wordt bij voorkeur 200 tot 300 ^ul van bijvoorbeeld een verdunningsmiddel aangebracht op het centrale gedeelte van het 30 plaatje. Tijdens een rotatiecyclus voor het bevochtigen wordt het plaatje vervolgens geroteerd, hetgeen resulteert in een dunne-vloeistoflaag van verdunningsmiddel die achterblijft op het plaatje. Bij voorkeur wordt zo snel mogelijk een te voren bepaalde hoeveelheid bloed en verdunningsmiddel aangebracht op het plaatje. Tijdens een tweede rotatiecyclus wordt 35 het plaatje opnieuw geroteerd. Het plaatje wordt op een bekende wijze uit de apparatuur genomen, gedroogd, gefixeerd, gekleurd en bepaald. Met betrekking tot de enkelvoudige figuur blijkt dat daarin een grafiek is weergegeven van de rotatiesnelheid ten opzichte van de tijd 8120166 ft ft -4- 22277/Vk/mb waarbij de voortgang van de rotatie wordt aangegeven voor het uitvoeren van de bovenbeschreven werkwijze met de rotatie-apparatuur, zoals de eerde vermelde apparatuur voor de vervaardiging van een bloedfilm volgens het Amerikaanse octrooischrift 4.016.828. Het verdunningsmiddel voor het vormen 5 van de dunne .laag wordt aangebracht op het plaatje op het tijdstip aangegeven met nummer 10. Het verdunningsmiddel kan bijvoorbeeld een zoutoplossing zijn. Een geschikte zoutoplossing wordt in de handel gebracht onder de merkaanduiding DIFF3 verdunningsmiddel,en bevat 9,9 g NaCl per liter ter bewerkstelliging van een geschikte osmotische balans voor de 10 cellen. Hoewel het gebruik van een verdunningsmiddel de voorkeur verdient kunnen ook andere deklaagvloeistoffen worden toegepast. Tijdens de be-vochtigings- rotatiecyclus, in het algemeen aangegeven met nummer 12, wordt het verdunningsmiddel verspreid over het grootste gedeelte of over het totale oppervlak van het plaatje zodat het plaatje de eerste dunne 15 vloeistoffilm bevat. Tijdens de rotatiecyclus werkt de rotatie-apparatuur bijvoorbeeld bij 3500 omwentelingen per minuut, zoals aangegeven met nummer 14. Op het tijdstip aangegeven met nummer 16 wordt bloed of bloed en verdunningsmiddel aangebracht. Twee voorbeelden voor het prepareren van 20 het plaatje voor deze trap van de werkwijze zijn de direkte aanbrenging van totaal bloed, ongeveer 20yul en het aanbrengen van een mengsel van bloed/verdunningsmiddel (1:1) met een kapillaire pipet. Er is gevonden dat het verkregen plaatje nog tamelijk dicht is bij het eerste voorbeeld, zodat de ondergrens van de methode lager kan zijn dan 10 yül 25 bloed voor een plaatje met een gemiddelde celdichtheid die nog vergelijkbaar is met die van een standaard plaatje waarbij ongeveer 200 yul bloed per plaatje wordt toegepast, waarbij een gedeelte hiervan achterblijft bij de verdunningsbewerking en vervolgens wordt weggespoeld. Ook de toegepaste pipet kan worden bedekt met een anti-coagulatiemiddel,of een anti-coagu-30 latiemiddel kan worden toegevoegd aan het verdunningsmiddel voor het bloed. Bloed en verdunningsmiddel moeten in dit geval worden gemengd, bijvoorbeeld 10yul verdunningsmiddel met anti-coagulatiemiddel in een pipet van 20yul. Kleine draadvormige magneten zijn beschikbaar of een menger van het zuiger-type kan worden toegepast voor het mengen van de stoffen op een conventio-35 nele wijze. Het plaatje wordt opnieuw geroteerd tijdens een rotatiecyclus, in het algemeen aangegeven met nummer 18, waarbij de rotatie-apparatuur zodanig wordt geregeld dat een snelheid wordt verkregen van 3200 tot 3500 8120166 P -5- 22277/Vk/mb omwentelingen per minuut voor verdund bloed zoals aangegeven met nummer 20. De rotatie-apparatuur wordt tegen het einde van de rotatiecyclus 18 bewerkt met bijvoorbeeld 1000 tot 1500 omwentelingen per minuut zoals aangegeven met nummer 22. Op het tijdstip, aangegeven met nummer 24, wordt 5 het plaatje verwijderd en is de rotatiebewerking beëindigd. Het is bepaald dat het mogelijk is om met ongeveer 10^1 of minder bloed een verdeling te verkrijgen op het plaatje die vergelijkbaar is met betrekking tot de dichtheid en andere parameters met een standaard geroteerd preparaat, doch waarbij aanzienlijk minder, een grootte-orde, 10 bloed is vereist. Geroteerde preparaten van een goede kwaliteit kunnen worden bereid volgens de werkwijze van de uitvinding met minder bloed dan vereist volgens conventionele opgebrachte preparaten. Het is ook gebleken dat een differentiële telling kan worden uitgevoerd met een kleine hoeveelheid bloedmonster zoals van 3 wanneer het niet is vereist dat nage-15 noeg het totale oppervlak van het plaatje wordt bedekt. Een in het algemeen cirkelvormige oppervlak rond het centrum van het plaatje kan worden bedekt en moet in dit geval worden onderzocht. De werkwijze kan ook worden uitgebreid zodat deze de reticulocyt-bewerking omvat. Voor de retische bereiding zou bloed niet worden gemengd 20 met verdunningsmiddel maar met reticulocyt-preparaat. De incubatietijd kan bijvoorbeeld 10 (+ 1) minuten bedragen en vervolgens wordt de bloedfilm bereid op een zelfde wijze als hierboven is beschreven. Hoewel bepaalde uitvoeringsvormen volgens de uitvinding zijn aangegeven en beschreven, moet de uitvinding niet worden beschouwd als 25 zijnde beperkt tot deze details van de uitvoeringsvormen. De uitvinding omvat hierentegen alle modificaties, alternatieven, uitvoeringsvormen, toepassingen en equivalenten van de onderhavige uitvinding, zoals gelezen kan worden binnen het kader van de beschrijving en toegevoegde conclusies. Samengevat kan dan ook worden gesteld dat een werkwijze is ver-30 kregen om een bloedpreparaat op een plaatje voor een microscoop te bereiden waarbij een verdunningsmiddel wordt aangebracht op het plaatje, het plaatje wordt geroteerd zodat het wordt bedekt met een dunne laag verdunningsmiddel, waarna een bloedmonster wordt aangebracht op het plaatje en het plaatje vervolgens een tweede keer wordt geroteerd zodat het bloedmonster over 35 hét plaatje wordt verspreid. De doelstelling van de uitvinding is om het plaatje te onderwerpen aan een preconditionering voor het aanbrengen van het bloed met een vloeistof als deklaag zodat slechts een relatief kleine hoeveelheid volledig bloed of verdund bloed kan worden verspreid over een deel van het plaatje. 8120166 -6- 22277/Vk/mb ι» -v · *

5 Gebied van de techniek. De uitvinding heeft betrekking op de bereiding van een bloedfilm of preparaat op een plaatje voor een microscoop of een hiermee vergelijkbaar substraat. Hoewel toepasbaar voor alle technieken voor het bepalen van de verkregen preparatren is de werkwijze met name geschikt om te 10 worden toegepast in samenhang met geautomatiseerde bloedcelanalyses onder toepassing van een met een computer herkenbaar patronensysteem, in het algemeen bekend als geautomatiseerde differentiaalanalyse-inrichting. Bekende stand van de techniek. Monolagen van cellen zijn bereid door een aantal technieken, 15 bijvoorbeeld door verdringing,te weten "push smears", door een techniek waarbij een deklaag wordt aangebracht en meer recent door roteren. Het grootste voordeel van de roteertechniek is de gelijkmatige bedekking van ten minste een groot gedeelte van 2,5 cm bij 8 cm oppervlak van het microscoopplaatje en de goede analyse van de celmorfologie die daarmee kan 20 worden bewerkstelligd. Met name voor geautomatiseerde differentiaalanalyse-inrichtingen zijn deze voordelen die zijn verkregen met geroteerde preparaten of uitstrijkjes zeer gunstig. De hoeveelheid van het bloed dat is vereist voor deze geroteerde preparaten ligt tussen 100 en 200 /ul per preparaat of uitstrijkje, in afhankelijkheid van de dichtheid van de cellen 25 per hoeveelheid bloedmonster dat als voldoende wordt beschouwd, waarbij de hoeveelheid van het totale bloed of van het verdunde bloed en ook de hoeveelheid bloed die verloren gaat, bijvoorbeeld het bloed dat achterblijft op de wand van de reageerbuizen, in de houders en in verdunnings-organen. Wanneer minder vloeistof wordt aangebracht wordt slechts een 30 onregelmatig, stervormig patroon verkregen, dat slechts een deel van het oppervlak van het plaatje bedekt. Het meest voorkomende gebruik van deze bloedfilms is voor de differentiële telling van witte cellen en voor de bepaling van de morfologie van rode cellen. In normale bloedmonsters zijn ongeveer 600 erythro-35 cyten (rode cellen) aanwezig op elke leukocyt (witte cel). Daarom geldt dat ten einde een minimum van 100 leukocyten te hebben voor een differentiële telling, voldoende oppervlak van het plaatje moet worden onderzocht met een gemiddelde van 6 x 10 erythrocyten. Om deze witte cellen binnen 81201 H • t I m -2- 22277/Vk/mb een redelijke tijd te vinden, van totaal ongeveer 2 minuten, kan men er onder ideale omstandigheden de voorkeur aan geven dat de bloedfilm op een kleine afstand was verspreid, maar dat geen cellen elkaar raken of overlappen, met goed gedefinieerde plaatjes, weinig beschadigde cellen, 5 een gelijkmatige en reproduceerbare celgrootte voor het bepalen van de graad van microcytosis en macrocytosis, goed ontwikkelde kleur van normale rode cellen en vrij van artifacts en gruis. Uitgaande van een plaatjesoppervlak van 2,5 cm bij 8 cm, normaal bloed en een verdeling waarbij gemiddeld twee rode cellen aanwezig zijn 10 op een oppervlak van 16 /am tot 16 /am zou een hoeveelheid bloed met voldoende cellen om de bovenbeschreven monolaagte vormen makkelijk kunnen worden berekend. Ongeveer 1,5/ul aan totaal bloed is hiervoor vereist. Indien anderzijds een bloedfilm met 1000 witte cellen afkomstig van normaal bloed gewenst is zou een oppervlak van slechts 76,8 mm nodig zijn 15 bijvoorbeeld bestaande uit een cirkel van minder dan 1 cm diameter op het plaatje. Het totale bloedvolume dat hiervoor vereist is bedraagt slechts ongeveer 1,5/25 = 0,06 /ul. Zelfs wanneer het hele plaatje is bedekt wordt slechts ongeveer 1$ van het bloed dat wordt gebruikt toegepast voor de monolaag terwijl ongeveer 99% wordt afgecentrifugeerd of 20 geroteerd te weten 150/ui tegen 1,5/ui. Indien een geschikte methode kan worden gevonden voor het prepareren van het plaatje is het duidelijk uit de bovenbeschreven verspilling dat geroteerde plaatjes kunnen worden vervaardigd met een aanzienlijk kleinere hoeveelheid bloed. De hoeveelheid bloedmonster, vereist 25 ter bereiding van een film wordt van belang, met name bij de volgende toepassingen: vingerprik, pediatrische prik, voor het vervaardigen van meerdere plaatjes van dezelfde donor, voor research doeleinden onder toepassing van bloed afkomstig van bijvoorbeeld kleine dieren en het gebruik van geroteerde lagen buiten hematologie waarbij slechts kleine 30 monsters zijn vereist. Beschrijving van de uitvinding. De uitvinding is gericht op een werkwijze voor het bereiden van een geroteerd bloedpreparaat op een plaatje voor een microscoop of een dergelijk substraat, waarbij een relatief kleine hoeveelheid geheel of ver-35 dund bloed kan worden verspreid over ten minste het grootste deel van het substraat. Een vloeistof als deklaag, bijvoorbeeld een verdunningsmiddel, wordt aangebracht op het substraat en vervolgens wordt het substraat geroteerd zodat de bedekkende vloeistof zich uitspreidt tot een dunne 812016$ m -3- 22277/Vk/mb vloeibare film over het substraat. Daarna wordt het totale of verdunde bloed aangebracht op het substraat en het substraat wordt een tweede keer geroteerd om het bloed te verspreiden over het substraat en over de dunne· vloeistoffilm.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat de vloeistof die vrij is van bloedcellen een verdunningsmiddel is voor bloed.

7. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat het roteren wordt bewerkstelligd gedurende ongeveer 1 seconde bij ongeveer 3500 omwentelingen per minuut. Eindhoven, december 1g81 8120186