NL8105758A - Werkwijze en inrichting voor het scheiden van mengsels. - Google Patents

Description

f * TO 2524

Titelί Werkwijze en inrichting voor het scheiden van mengsels.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het scheiden van mengsels waarbij de mengsels onder toepassing van radiale dunnelaag-chromatografie worden gescheiden.

Tevens heeft de uitvinding betrekking op een inrichting voor het 5 scheiden van mengsels, waarmee de mengsels onder toepassing van radiale dunnelaagchramatografie kunnen worden gescheiden.

Een dergelijke werkwijze en inrichting zijn bekend uit A. Zlatkis en R.E. Kaiser, "high performance thin-layer chromatography", Journal of chromatography Library 9, Elsevier Scientific Publishing Company, 1977.

10 Hierin wordt de circulaire dunnelaagchromatografie beschreven, die een variant is van de normale lineaire dunnelaagchromatografie. In de circulaire dunnelaagchromatografie wordt een horizontaal opgestelde dunnelaagchromatografieplaat toegepast, waardoor het centraal toegevoerde eluens in radiale richting diffundeert, daarbij de componenten van het 15 mengsel selectief vertragend met zich mee voerend. Het te scheiden mengsel kan een mengsel van vloeistoffen zijn, maar ook een mengsel van vaste stoffen, die in de vorm van een oplossing in een oplosmiddel worden aangebracht, waarna het oplosmiddel verdampt. Hoewel de dunnelaagchromatografie gebruikt kan worden voor het winnen van een of meer van de com-20 ponenten van het mengsel (preparatieve dunnelaagchromatografie) wordt hij hoofdzakelijk gebruikt in de kwalitatieve en/of kwantitatieve analyse van mengsels.

Dunnelaagchromatografie (DLC) is een scheidingsmethode waarbij de analysekosten laag zijn terwijl de methode uitermate flexibel is: 25 stationaire en mobiele fase zijn eenvoudig te veranderen. Een verder voordeel van deze methode boven kolom-chromatografische scheidingen is dat alle per plaat opgebrachte monsters gelijktijdig eenzelfde bewerking ondergaan zodat onderlinge vergelijking goed mogelijk is, zowel in kwalitatieve (Rf waarden} als kwantitatieve zin (densitometrie). Aan de 30 klassieke dunnelaagchromatografie kleven ook enige nadelen: \ - De snelheid van de mobiele fase kan niet of slechts in verwaarloos- bare mate (door vermindering van de invloed van de zwaartekracht) 1 worden gevarieerd en wordt door de capillaire werking bepaald. Daarom 1 is geen optimalisering van de scheiding mogelijk (vgl. snelheid van 35 de mobiele fase in kolomchromatografie en het schotelgetal).

8105758 * - Γ -- - —— — ; 1 7 ‘ ' ' ' 7 ’· “ > ; . -2- ; - Rf waarden zijn alleen reproduceerbaar bij een goed gedefinieerd fasesysteem, inclusief heb dampevenwicht in de chromatografiekamer.

- De migratiesnelheid van het eluens neemt af met j/t (t * tijd) , waardoor ten gevolge van diffusie vlekvergroting optreedt (in het bijzon— 5 der bij hoge Rf-waarden). Dili effekt speelt vooral een grote rol bij viskeuze (meestal polaire) loopmiddelen, zoals vaak gebruikt worden bij metabolietenonderzoek (looptijden tot 1 1/2 uur gebruikelijk).

- Het scheidend vermogen blijkt vaak. onvoldoende, vooral bij analyses in biologisch materiaal. .

10 - Tijdrovende kwantificering.

Om een aantal van deze nadelen te ondervangen is de high r performance thin-layer chromatography (HPTLC) ontwikkeld (zie bovengenoemd boek).

Door stringente standaardisering van het gehele proces zijn 15 reproduceerbare resultaten mogelijk in korte analysetijden (3 S. 4 maal, zo snel als bij klassieke dunnelaagchromatografie) omdat de loopafstand ergr klein wordt gehouden (tot 4 cm) . Om binnen deze afstand voldoende scheidend vermogen te verkrijgen wordt het sorbens aangepast en worden zeer kleine volumina (kleine vlekgrootte) opgebracht.

20 Naast significante voordelen heeft deze HPTLC-techniek enkele belangrijke nadelen:· - Beperkt lineair dynamisch bereik om te kwantificeren.

- Door korte migratieafstanden wordt het scheidend vermogen niet altijd optimaal benut.

25 - De snelheid van de mobiele fase is niet te variëren.

- Doof geringe hoeveelheden stof wordt signaal/ruisverhouding slechter in de. kwantitatieve bepaling, hetgeen slechts ten dele door ruiscorrecties met behulp van de densitometer kan worden ondervangen.

Door anderen is een andere benadering voorgesteld om de nadelen 30 van. de.klassieke dunnelaagchromatografie-te ondervangen. De bedoelde benadering kan worden aangeuid als de overpressurized thin-layer chromatography (OPTLC). Gewezen kan worden op de volgende publikaties: ^ E.. Mincsovics et al42nd Danube Symposium, Karlsbad , (Tsjechoslowakije), \ . april 1979; E. Tyiak et al, 2nd Danube Symposium, Karlsbad, (Tsjecho- 1 35 Slowakije), april 1979; E. Mincsovics et al, Symposium on the Analysis of $ Steroids, Eger (Hongarije), mei 1981; en K. Dudas et al, Symposium on the 8105758 • ,73- ^ 4

Analysis of Steroids,-Eger (Hongarije), mei 1981.

Het sorbens wordt volgens deze techniek in ontwikkeling met een membraan afgesloten met een druk die groter is dan de druk waarmee het eluens in de sorbenslaag wordt gepompt. Dit leidt tot kortere analyse-. ^ tijden,, korter dan bij HPTLC onder vergelijkbare omstandigheden.

Deze in ontwikkeling zijnde techniek heeft als belangrijkste nadeel, dat hij mechanisch moeilijk, te realiseren is. Momenteel is pas een overdruk tot ongeveer 0,5 MPa gerealiseerd, terwijl voor de nagestreefde verbetering een overdruk in de orde van grootte vein ten minste 5 MPa nodig is.

* >

De uitvinding verschaft nu een werkwijze en een inrichting weiarmee de bovenstaand vermelde nadelen worden opgeheven en enkele bijzondere voordelen worden verkregen.

De werkwijze volgens de uitvinding wordt gekenmerkt doordat de A dunnelaagchromatografieplaat na of bij. het centraal toevoeren van het eluens aan de sorbenslaag wordt geroteerd.

Volgens het. wezen van de uitvinding wordt bij de scheiding van niet vluchtige mengsels door middel van dunnelaagchromatografie gebruik gemaakt van de centrifugaalkracht als drijvende kracht voor het eluens.

20

Belangrijke voordelen hiervan zijn,, dat door hogere toerentallen te gebruiken een aanzienlijk kortere analysetijd wordt bereikt, terwijl door geschikte keuze van het toerental de scheidingskwaliteit kan worden. geoptimaliseerd. Ook maakt de uitvinding, het mogelijk om zonder verlenging van de analysetijd kleinere sorbensdeeltjes te gebruiken, 25 waardoor het. scheidend vermogen wordt opgevoerd. Een verder voordeel is dat de kleurtechnieken. homogener uitgevoerd kunnen worden dan zonder rotatie van de plaat, wanneer gebruikelijke sproeitechnieken worden toegepast. Verder biedt.de uitvinding de mogelijkheid om grote hoeveelheden van het te onderzoeken mengsel, waarin een of meerdere componenten 30 in zeer lage concentraties aanwezig zijn, bijvoorbeeld onder vacuum via een injectiespuit op de roterende dunnelaagchromatografieplaat aan te brengen, waardoor ook voor dergelijke componenten een goede analyse mogelijk wordt. De uitvinding zal vooral bij metabolietenonder-

Dzoek een uiterst belangrijke vooruitgang betekenen.

35 λ Hoewel het de voorkeur heeft om een horizontale opstelling van 1 8105758 de dunnelaagchromatografieplaat te gebruiken, waarbij de plaat om zijn * ' ·. .: -4- - - ; " middelpunt wordt geroteerd, is ook rotatie aan een arm van een rotatie-as of een vertikale opstelling· mogelijk. bergelijke uitvoeringsvormen zijn echter praktisch moeilijker uitvoerbaar..

........ . . ... ...... <· .„

De ideale rotatiesnelheid van de dunnelaagchramatografieplaat is . . 5 van verschillende faktoren afhankelijk- Daartoe behoren de samenstelling van het te onderzoeken mengsel, het gekozen eluens, de gekozen dunnelaagchromatografieplaat, en de resultaten die worden nagestreefd. Een hogere rotatiesnelheid leidt tot een kortere analysetijd, maar onder • omstandigheden zal toch een lagere rotatiesnelheid worden gebruikt, 10 bijvoorbeeld om een optimale scheidingskwaliteit te verzekeren-' Heel algemeen zal de rotatiesnelheid van 1Ó0 tot 6000 omwentelingen per minuut bedragen.' Een rotatiesnelheid. van. 1500 tot 3000 omwentelingen per minuut zal meestal de voorkeur hebben..

Volgens een voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding wordt het 15 eluens onder overdruk toegevoerd teneinde een adequate eluenstöevoer en een verdere verhoging van de loopsnelheid van het eluens te verzekeren.

Dit zou bijvoorbeeld kunnen worden gerealiseerd door toepassing van een zodanige zuigerconstructie in de eluensdoseerapparatuur,. dat de door de zuiger uitgeoef ende druk toeneemt met toenemend toerental van de plaat- · 20 Teneinde te bewerken, dat het eluens door de centrifugaalkracht effectief door het sorbens van de dunnelaagchromatografieplaat wordt geperst en niet over of onder de dunnelaagchromatografieplaat vloeit, wordt . de dunnelaagchromatografieplaat bij voorkeur ingeklemd tussen een drager— plaat en een van een laag afdichtingsmateriaal voorziene afdekplaat.

25 Door de afdekking wordt bovendien verdamping van het eluens tegengegaan.

De dragerplaat en de afdekplaat kunnen van velerlei, materialen zijn vervaardigd- Liefst zijn beide uit een aluminiumlegering, bijvoorbeeld aluminium 51 ST gemaakt.

Het afdichtingsmateriaal.is bij voorkeur een soepele, inerte 30 kunststof, die een goede aanpassing aan de oneffenheden van het oppervlak van de dunnelaagchromatografieplaat en een goede afdichting mogelijk maakt. Liefst wordt hiervoor polytetrafluoretheen (teflon) toegepast, dat chemisch inert is voor de gebruikelijke oplosmiddelen, het dampig evenwicht niet verstoort (teflon neemt in het bijzonder geen water of 1 35 waterdamp op) en een gunstige adhesie in verband met het stromingsprofiel 1 voor alle voorkomende loopmiddelen aan het grensoppervlak heeft. Goede alternatieven zijn polyfenyleenoxyde, noryl en diverse fluorpolymeren.

8105758 ·,. -5- ' ·

Volgens een. voorkeursuitvoeringsvorm van de werkwijze volgens .de uitvinding wordt een., densitometrische. kwantitatieve analyse uitgevoerd door de dunnelaagchromatografieplaat. te roteren, terwijl het detectiesysteem een lineaire scanbeweging over. de plaat maakt. De 5 mogelijkheid hiertoe is een verder voordeel van de uitvinding.

Volgens.een geschikte methode wordt de plaat eerst voorat gescand om de blanco ruis te bepalen, en na de. scheiding nogmaals met licht van dezelfde golflengte gescand. Dankzij de rotatie van de plaat kan de detectie in veel kortere tijd worden uitgevoerd.

IQ Alle gemeten absorpties worden uitgelezen uit een PSOM die volgens; de theorie van Kubelka en Munk (zie Z. Tech. Physik 12,(1931), • * - * blz. 593 getabelleerd is. De tijd, nodig voor complexe berekeningen' volgens die theorie verdwijnt dan.

De uitvinding verschaft tevens een inrichting van de in de 15 aanhef vermelde soort, welke gekenmerkt wordt doordat de inrichting een roteerbaar deel heeft, dat een dragexplaat voor een dunnelaagchro-. matografieplakt en een afdekplaat voor de dunnelaagchromatografieplaat alsmede middelen voor het centraal toevoeren van eluens omvat.

Teneinde te verzekeren dat het eluens daadwerkelijk in de dunne-20 laagchrcmatografieplaat wordt geperst heeft het de voorkeur dat de dragexplaat en de af dekplaat een weinig kegelvormig zijn met een stompe tophoek van iets beneden 180° en met de kegelpunten afgekeerd van de toevoermiddelen voor het eluens.

Zoals boven reeds uiteengezet heeft het verder de voorkeur dat 25 de afdekplaat aan de naar de dragerplaat gekeerde zijde voorzien is van een laag van een afdichtingsmateriaal.

Dit afdichtingsmateriaal is bij voorkeur polytetraf luoretheen.

Volgens een voorkeursuitvoeringsvorm van de inrichting volgens de uitvinding omvatten de eluenstoevoermiddelen een centraal gelegen 3Q toevoer leiding en een centraal gelegen, in hoofdzaak kegelvormige doseerkamer met de kegelpunt gekeerd naar de toevoerleiding. Met O "in hoofdzaak" wordt o.a. gedoeld op de bij voorkeur iets van een plat vlak afwijkende vorm van het kegelbasisvlak: dit basisvlak is bij voor-1 keur in geringe mate kegelvormig met de punt van de eluenstoevoerleiding I -35 afgekeerd.

* Een en ander zal duidelijk worden gemaakt aan de hand van de tekening, waarin in fig. 1 een voorkeursuitvoeringsvorm van de inrich- 8105758 • ......1 Γ·π_π “ . j ,» I · I .

" ·...; ·'!,' . ·. '·.. -6- ting- volgens de uitvinding deels in doorsnede,, deels in aanzicht; is : weergegeven» Figuren 2 en 3 tonen details, fig. 4 toont een met de inrichting verkregen chromatogram .

Γη fig» 1" worden een dragerplaat 1, een dunnelaagchromatografie-5 plaat 2, een afdichtingslaag 3, een af dekplaat 4', een centrale doserings— as 5, een moer 6, een drukplaat 7, een eluens toevoer leiding 8, een eluens-^doorgang 9, een eluensdoseerkamer 10 , een aandrukbusje 11, een 0-ring 12, een buitenste drukring 13 en een binnenste drukring 14, een losse ring 15, een on tluch tings doorgang 16 en een. centrifuge-as 17 , 10 getoond» '

De plaats- waar. het te scheiden materiaal wordt aangebracht, is aangeduid met verwijzingscijfer 18.

m fig» 2 wordt het aandrukbusje 11 getoond, in fig. 2a in bovenaanzicht, in fig. 2b in doorsnede langs de lijn Ilb-IIb. Dit is 15 'zodanig uitgevoerd dat het geen belemmering vormt voor het doorlaten van eluens vanuit de eluenstoevoerleiding 8 naar de eluensdoseerkamer 10» Daartoe is het volgens de weergegeven uitvoeringsvorm voorzien’van drie. eluensdoorgangen 9 en drie on tluch tingsdoorgangen 16. Zowel de eluensdoorgangen als de ontluchtingsdoorgangen maken onderling een hoek.

20 van 120°» ' .

In fig. 3 wordt de doseringsas 5 getoond, in fig. 3a in bovenaanzicht, in fig. 3b in doorsnede langs de lijn IlIb-IIIb. Ook hieruit is zichtbaar hoe de eluensdoorgangen 9 en de ontluchtingsdoorgangen 16 onder hoeken van 120° door de doseringsas 5 lopen. Dankzij rondgaande 25 uitsparingen aan de binnenzijde van het aandrukbusje 11 wordt verzekerd dat het eluens vanuit de eluensdoorgangen in de doseringsas in de eluensdoorgangen in’het aandrukbusje kan komen. Hetzelfde geldt voor de aansluiting van de ontluchtingsdoorgangen in aandrukbusje en doseringsas.

30 De dragerplaat 1 is bij voorkeur van aluminium 51 ST uitgevoerd .¾ "en gedraaid onder een hoek van een 1/2°. De DLC-plaat 2 is een normale DLC-plaat, die is aangepast voor de onderhavige centrifugale “β . « Ά circulaire DLC-methode. De af dekplaat 4 is bij voorkeur van aluminium S51 ST uitgevoerd met een PTFE (teflon) laag 3. Ook deze plaat 4 is 35 onder een hoek van een 1/2° afgedraaid. De centrale^doseeras 5 is bij voorkeur vervaardigd uit roestvrij staal.

8105758 - Het eluens kan worden toegevoerd via een toevoerleiding 8, een doorgang 9 en een kegelvormige doseerkamer 10. De kegelvorm is gekozen voor het efficient doseren van de loopvloeistof naar en in de dunnelaag-cfaromatografieplaat. Bij het centraal doseren wordt vooraf chroma-5 tografie voorkomen, het circulair opbrengpatroon wordt niet verstoord.

Het is mogelijk in ruststand en roterend te doseren.

De moer 6 moet met een voorafbepaald koppel aangedraaid worden, bijvoorbeeld met een torsiesleutel. De drukplaat 7 is zo uitgevoerd dat bij klemming eerst de buitenring 13 aangrijpt en vervolgens de -10 binnenring 14. KageIklemming wordt zoveel mogelijk voorkomen.

In de dragerplaat 1 is een 0-ring 12 aangebracht, die door middel van een aandrukbuisje 11 in de eluensdoseerkamer 10 tegen de DLC-plaat gedrukt wordt tijdens het bedrijfsklaarmaken van de inrichting. Bij montage zal de O-ring doorgaans ongeveer 0,2 mm boven de onderplaat 15 uitsteken.

. Vooraf ondergaan essentiële onderdelen van de inrichting bij voorkeur een behandeling zoals warmtebehandeling en etsbehandeling.

In fig. 4 wordt een chromatogram getoond,- verkregen met de werkwijze en inrichting volgens de uitvinding door een mengsel van fuchsine, ZQ rhodamine, kristalviolet en methyleen-blauw met n-butanol/azijnzuur/water (50/10/20} als eluens te scheiden bij een toerental van 2800 omwentelingen per minuut. De scheiding duurde ca 6 minuten. Wanneer de scheiding langs klassieke weg, dat wil zeggen zonder rotatie van de dunnelaag-chromatografieplaat werd uitgevoerd, bleek de scheiding 90 minuten 25 te vergen.

'

- J

Λ t ï 8105758

Claims (5)

1. 4. Werkwijze volgens een of'meer van de conclusies 1-3, met het kenmerk, dat het eluens onder overdruk wordt toegevoerd.
2. 5. Werkwijze volgens één of meer van. de conclusies 1-4,. met het • kenmerk, dat de dunneiaagchromatografieplaat wordt ingeklemd tussen een "dragerplaat en een van een laag uit afdichtingsmateriaal voorziene ' _ : '.15 af dekplaat. -- - . . ·- ·· . 6. Werkwijze volgens conclusie'5, met het kenmerk, dat een van een laag polytetraf luoretheen voorziene af dekplaat wordt, toegepast. 7». · Werkwijze volgens één of meer van de conclusies 1-6, met het kenmerk, dat densitometrische kwantitatieve analyse wordt uitgevoerd 20 door de dunneiaagchromatografieplaat te roteren terwijl het detectie-. systeem een. lineaire scanbeweging over de plaat maakt.
3. 8. Inrichting voor het scheiden van mengsels, waarmee de mengsels onder toepassing van radiale dunnelaagchromatografie kunnen worden . gescheiden, met het kenmerk, dat de inrichting een roteerbaar deel . 25 heeft, dat een dragerplaat voor een. dunneiaagchromatografieplaat en een ' afdekplaat voor de dunneiaagchromatografieplaat alsmede middelen voor het. centraal toevoeren van eluens omvat.
4. 9. Inrichting volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat de dragerplaat en de afdekplaat een weinig kegelvormig zijn met een stompe tophoek 30 van iets neneden 180° en met de kegelpunten afgekeerd van de toevoer-middelen voor het eluens. \10. Inrichting volgens conclusie 8 of 9, met het kenmerk, dat de afdekplaat aan de naar de dragerplaat gekeerde zijde voorzien is van een laag van een afdichtingsmateriaal. 8105758 *> - - * ' . * > ^ - » * - ';4 ' 'ƒ . ' ‘-9- * I ! \ II. Inrichting volgens conclusie 10,- met het kenmerk, dat het afdichtingsmateriaal polytetrafluoretheen is*
5. 12. Inrichting volgens één of meer van de conclusies 8-11, met het kenmerk, dat de eluenstoevoermiddelen een centraal gelegen toevoer-5 leiding en een centraal gelegen, in hoofdzaak kegelvormige doseerkamer met de kegelpunt gekeerd naar de toevoerleiding omvatten* Λ. : • . -¾ - ' - - 3 8105758