NL7900217A - Deoxynarasinantibiotica, werkwijze voor de bereiding daarvan en hun toepassing. - Google Patents

Description

N/28. 909-Kp/vdM * 1 f *

Eli Lilly and Company te Indianapolis, Indiana, Verenigde Staten van Amerika.

Deoxynarasinantibiotica, werkwijze voor de bereiding daarvan en hun toepassing.

De uitvinding heeft betrekking op cc-deoxynara-sinantibiotica, op hun toepassing als antibacterie- en anticoccidemiddel en op het verbeteren van de benutting van voer bij herkauwers.

5 Er bestaat steeds behoefte aan nieuwe verbeterde antibiotica bij de veterinaire geneeskunde. Zo is bijv. coccidiosis steeds een groot probleem bij de gevogeltefokke-rijen. Coccidiosis is het gevolg van infectie door één of meer species van Eimeria of Isospora (voor een samenvatting 10 zie Lund en Farr in "Diseases of Poultry", vijfde druk,

Biester en Schwarte, Eds., Iowa State University Press,

Ames, Iowa, 1965, blz. 1056-1096). De aan coccidiosis te wijten economische verliezen zijn groot, waardoor er een grote vraag is naar betere anticoccidemiddelen.

15 De bevordering van de groei van herkauwers, zo als runderen en schapen, is een ander economisch wenselijk doel van de veterinaire wetenschap. Van bijzonder belang is de groeibevordering, welke verkregen wordt door verbetering van de benutting van het voer. Het mechanisme van de benut-20 ting van het belangrijkste voedingsgedeelte (koolwaterstoffen) van veevoeder is bekend. De in de pens van het dier aanwezige micro-organismen breken de koolwaterstoffen af tot monosacchariden, die dan worden omgezet in pyruvaatderiva-ten. De pyruvaten worden door microbiologische processen ge-25 metaboliseerd en omgezet in acetaten, butyraten of propiona-ten, algemeen aangeduid als vluchtige vetzuren (WZ). Voor een nadere bespreking zie Leng in "Physiology of Digestion and Metabolism in the Ruminant", Phillipson en medew., Eds., 30 Oriel Press, Newcastle-upon-Tyne, Engeland, 1970, blz. 408- 790 02 1 7 410.

2

De benutting van WZ is besproken in McCullough/ Feedstuffs, 19 juni 1971, blz. 19? Eskeland en medew., in J. An. Sci. 33., 282 (1971)? en Church en medew., in "Digestive 5 Physiology and Nutrition of Ruminants", deel 2, 1971, blz.

622 en 625. Ofschoon acetaten en butyraten worden benut, is gebleken, dat de benutting van propionaten beter is. Bovendie is gebleken, dat wanneer een te geringe hoeveelheid propionaat beschikbaar is, de dieren ketosis ontwikkelen.

10 Dientengevolge is een gunstige verbinding een verbinding, die de dieren stimuleert tot de vorming van een grotere hoeveelheid propionaten uit de koolwaterstoffen, met het gevolg dat de benutting van de koolwaterstoffen verbeterd wordt en te gelijkertijd de vorming van ketosis teruggedrongen wordt. 15 Het 20-deoxynarasin en het 20-deoxy-epi-17- narasin zijn nieuwe polyetherantibiotica. Ze zijn het meest verwant aan het bekende polyetherantibioticum narasin (antibioticum A-28086 factor A; Amerikaanse octrooischriften 4.035.481 en 4.038.384). De in deze octrooischriften en 20 door Occolowitz en medew. /Biomed. Mass Spectrometry 3, 272-277 (1976)J voorgestelde structuur voor narasin werd recentelijk bevestigd door H. Seto en medew. /J. Antibiotics 30 (6) 530-532 (1977) _J, welke structuur overeen blijkt te komen met formule 3 van het formuleblad.

25 Volgens Seto en medew. is narasin nauw verwant aan salinomycin (salinomycin = 4-dimethylnarasin). Meer recent heeft J.W. Westley en medew. de aandacht gevestigd op C-17 epimeren van deoxy-(0-8)-salinomycin /J. Antibiotics 30 (7) 610-612 (1977)_/. Ofschoon de epimeren van deoxy-30 salinomycin analoog zijn aan de epimeren van deoxynarasin volgens de uitvinding, bestaat er geen bekende chemische methode, waarlangs de deoxynarasinepimeren kunnen worden bereid uit de deoxysalinomycinepimeren.

De uitvinding omvat het deoxynarasinantibioti-35 cumcomplex, bestaande uit tenminste 2 afzonderlijke factoren 790 02 1 7 «Γ 3 te weten 20-deoxynarasin en 20-deoxy-epi-17-narasin. Het complex wordt bereid door het kweken van een stam van het organisme Streptomyces aureofaciens Duggar, NRRL 11181.

De uitdrukking "antibioticumcomplex", zoals ge-5 bruikt in de fermentatiepraktijk en in deze beschrijving, heeft geen betrekking op een chemisch complex, doch op een mengsel van gezamenlijk gevormde afzonderlijke antibiotische factoren. Zoals de deskundigen op het gebied van de bereiding van antibiotica door fermentatie algmeen bekend is, kan 10 de verhouding van de afzonderlijke factoren in een antibioticumcomplex variëren, afhankelijk van de toegepaste fermen-tatie-omstandigheden.

De farmaceutisch aanvaardbare zouten van 20-deoxynarasin en 20-deoxy-epi-l7-narasin maken eveneens een 15 deel van de uitvinding uit. Teneinde de discussies over benutting te vereenvoudigen, wordt de uitdrukking "deoxynara-sinantibioticum" gebruikt, welke term betrekking heeft op een vertegenwoordiger uit de groep van deoxynarasinantibio-ticumcomplex, 20-deoxynarasin, 20-deoxy-epi-l7-narasin en de 20 farmaceutisch aanvaardbare zouten van 20-deoxynarasin en 20-deoxy-epi-17-narasin.

De onderhavige deoxynarasinantibiotica belemmeren de groei van de pathogene organismen bij dier en plant. Volgens één aspect van deze activiteit kunnen de onderhavige 25 deoxynarasinantibiotica gebruikt worden als anticoccidemid-delen. Bovendien blijken de deoxynarasinantibiotica de benutting van het toegediende voer bij herkauwers te verbeteren.

Het deoxynarasinantibioticumcomplex omvat 20-30 deoxynarasin en 20-deoxy-epi-17-narasin, die verkregen worden uit de fermentatie in de vorm van een mengsel. De verbindingen 20-deoxynarasin en 20-deoxy-epi-l7-narasin worden van het deoxynarasincomplex afgezonderd en geïsoleerd als afzonderlijke verbindingen, zoals hierna beschreven. Het 35 deoxynarasincomplex bevat bovendien geringe factoren, die 790 02 1 7 * 4 verwijderd worden door de beschreven procedures. Het deoxy-narasinantibioticumcomplex is oplosbaar in de meeste organische oplosmiddelen, maar niet in water.

20-deoxynarasin.

5 20-deoxynarasin, één van de factoren van het on derhavige complex, heeft dezelfde absolute configuratie als narasin. De structuur van 20-deoxynarasin komt overeen met die van formule 1 van het formuleblad.

20-deoxy-epi-17-narasin.

10 De structuur van 20-deoxy-epi-l7-narasin, de andere factor van het onderhavige complex, heeft formule 2 van het formuleblad.

Eén van de beste methoden voor het differentiëren van narasin (A-28086 factor A), 20-deoxynarasin en 20- 13 15 deoxy-epi-17-narasin omvat de toepassing van C kernspm- 13 resonantie (nmrj spectrometrie. Tabel A omvat de C nmr-spectrale gegevens van deze verbindingen, elk in de vorm van zijn vrije zuur, uitgevoerd in deuteriumchloroform (gegevens in dpm).

20 TABEL A

narasin 20-deoxynarasin 20-deoxy-epi-l7-narasin 216,5 216,8 218,0 178.4 177,9 177,6 132,0 125,2 ' 129,2 25 122,0 121,9 125,8 106.5 105,0 107,0 99,6 99,3 99,4 88,5 88,1 85,6 78,4 78,1 78,2 30 77,1 76,6 77,7 75,1 75,0 77,0 73.8 73,7 73,3 72,0 72,3 72,6 70.8 71,1 71,1 35 68,5 68,3 69,1 790 02 1 7 5 TABEL· A (vervolg) narasln 20-deoxynarasin 20-deoxy-epi-17-narasin 67.6 56,2 57,7 56.1 49,9 49,3 5 49,9 49,3 48,7 49.3 41,0 38,9 41.1 40,0 36,6 38.7 38,8 36,4 36.6 36,3 36,2 10 36,2 35,6 35,7 35.5 32,8 33,9 32.9 31,7 33,7 30.9 31,7 32,8 39.5 30,3 30,5 15 29,4 29,6 29,3 29.0 29,0 29,0 28.0 28,1 28,2 26.1 25,8 24,7 24.0 23,7 23,3 20 21,5 21,8 21,8 19.0 18,8 21,1 18.0 17,5 18,4 16.4 16,3 18,2 15.7 15,7 15,8 25 14,3 14,1 14,3 13.2 13,3 13,7 13.0 13,2 13,5 12.1 12,5 12,5 12.1 12,1 12,1 30 7,0 7,3 7,7 6,3 6,5 6,4

Andere goede methoden voor het differentiëren van 20-deoxynarasin van 20-deoxy-epi-17-narasin en van de bekende A-28086 factoren omvatten papier- en dunne-laagchro-35 matografie. De R^-waarde van narasin (A-28086 factor A), 790 02 1 7 6 A-28086 factor D, 20-deoxynarasin en 20-deoxy-epi-l7-narasin bij diverse papier-chromatografische systemen, onder gebruikmaking van Bacillus subtilis ATCC 6633 als detectie-organisme zijn in tabel B opgenomen.

5 TABEL B

R^-waarden A- deoxy- epideoxy- oplosmiddelsysteem narasin 28086D narasin narasin water:methanol:aceton 10 (12:3:1)ingesteld op pH 10,5 met NH4OH en vervolgens verlaagd tot pH 7,5 met H3P04 0,20 0,11 0,08 0,21 water:methanol:aceton 15 (12:3:1), ingesteld op pH 10,5 met NH4OH en vervolgens verlaagd tot pH 7,5 met HC1 0,42 0,25 0,21 0,44 1 % methylisobutyl-20 keton (MIBK), 0,5 % NH4OH in water 0,56 0,38 0,33 0,66 benzeen verzadigd met water 0,51 0,51 0,74 0,55 water:MIBK:ethylace- 25 taat (98:1:1) 0,77 0,61 0,51 0,68

De R^-waarden van deze antibiotica in een typisch dunne-laagchromatografie(DLC)systeem, onder gebruikmaking van silicagel zijn in tabel C opgenomen.

30 790 02 1 7 7

TABEL C

R^-waarden A- deoxy- epideoxy- oplosmiddelsysteem narasin 28086D naracin narasin 5 ethylacetaat 0,29 0,35 0,42 0,74

De deoxynarasinantibiotica (20-deoxynarasin en 20-deoxy-epi-17-narasin) zijn oplosbaar in een groot aantal organische oplosmiddelen, zoals methanol, ethanol, dimethyl-formamide, dimethylsulfoxide, ethylacetaat, chloroform, aceton en benzeen. Ze zijn echter slechts weinig oplosbaar in niet-polaire organische oplosmiddelen, zoals hexaan, terwijl ze onoplosbaar zijn in water. Opgemerkt dient te worden dat 20-deoxynarasin als vrij zuur onstabiel is in alcoholen ^ en overgaat in 20-deoxy-epi-17-narasin vrij zuur. Er werd bijv. 20-deoxynarasinzuur (435,1 mg) opgelost in methanol (40 ml), welke oplossing gedurende 4 uur bij kamertemperatuur werd bewaard. De oplossing werd vervolgens onder vacuum tot droog ingedampt. Het residu werd opnieuw opgelost in 2q dioxan en gevriesdroogd, onder oplevering van 417,8 mg 20-deoxy-epi-17-narasinzuur.

Een andere stof, die volgens chromatografische analyse samen voorkomt met A-28086-I, wordt beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 4.038.384, en wordt samen met het deoxynarasincomplex gevormd. Ofschoon deze stof aanvankelijk met de deoxynarasinantibiotica neerslaat, kan deze gemakkelijk worden verwijderd via silicagel-chromatografie. Op silicagel-dunne-laagchromatografie blijkt deze stof minder plolair te zijn dan 20-deoxynarasin of 20-deoxy-epi-17-3Q narasin bij toepassing van ethylacetaat als ontwikkeloplos-middel. Voor de detectie wordt bij voorkeur vanilline-sproeireagens (3 % vanilline in methanol + 0,5 ml geconcentreerd H2S04 op 100 ml oplossing) gebruikt. Na besproeien met vanilline en verwarmen blijkt deze stof, evenals A-22 28086-1, een blauwe vlek te geven, terwijl de deoxynarasin- 790 02 1 7 8 antibiotica helder gele vlekken geven, welke later donkerder worden.

De verbindingen 20-deoxynarasin en 20-deoxy-epi- 17-narasin kunnen in hun zouten worden omgezet. De farmaceu-5 tisch aanvaardbare alkalimetaal-, aardalkalimetaal- en aminezouten van 20-deoxynarasin en 20-deoxy-epi-17-narasin maken eveneens deel van de uitvinding uit. "Farmaceutisch aanvaardbare zouten" zijn zouten, waarin de toxiciteit van de verbinding als geheel ten opzichte van warmbloedige die-10 ren niet is toegenomen, ten opzichte van de niet-zoutvorm.

Voorbeelden van geschikte alkalimetaal- en aardalkalimetaal-zouten van 20-deoxynarasin en 20-deoxy-epi-17-narasin zijn die van natrium, kalium, lithium, cesium, rubidium, barium, calcium en magnesium. Geschikte aminezouten van 20-deoxy-15 narasin en 20-deoxy-epi-l7-narasin zijn de ammoniumzouten, alsmede de primaire, secundaire en tertiaire C^-C^-alkyl-ammonium- en hydroxy-C2-C^-alkylammoniumzouten. Voorbeelden van aminezouten zijn die zouten, welke gevormd zijn door omzetting van 20-deoxynarasin en 20-deoxy-epi-l7-narasin met 20 ammoniumhydroxide, methylamine, sec-butylamine, isopropyl-amine, diethylamine, diisopropylamine, ethanolamine, tri-ethylamine, 3-amino-l-propanol e.d.

De alkalimetaal- en aardalkalimetaal- kationoge-ne zouten van 20-deoxynarasin en 20-deoxy-epi-17-narasin 25 worden bereid onder toepassing van procedures, welke algemeen worden toegepast voor de bereiding van kationogene zouten. Zo wordt bijv. de vrije zuurvorm van het antibioticum opgelost in een geschikt oplosmiddel, zoals aceton of dioxan-water, aan welke oplossing vervolgens een oplossing 30 van de stoechiometrische hoeveelheid van de gewenste anorganische base wordt toegevoegd. Het aldus gevormde zout kan geïsoleerd worden via routinemethoden, zoals filtratie of indamping van het oplosmiddel.

De zouten, gevormd met organische aminen, kunnen 35 op soortgelijke wijze worden bereid. Het gasvormige of 7900217 9 vloeibare amine kan bijv. worden toegevoegd aan een oplossing van de antibioticumfactor in een geschikte oplossing van bijv. aceton, waarna het oplosmiddel en de overmaat amine door afdampen kunnen worden verwijderd.

5 Een voorkeursmethode voor de bereiding van een gewenst zout van één van de deoxynarasinantibiotica is een geschikte keuze van isolatiemethode, zoals bijv. instelling van de pH van het mengsel met een geschikte base of toevoeging van een geschikt kationogeen zout aan het oplosmiddel, 10 dat voor de extractie wordt gebruikt.

In de veterinaire farmacie is het bekend, dat de gedaante van een antibioticum niet significant is bij de behandeling van een dier met het antibioticum. In de meeste gevallen is'gebleken, dat door de in het dier aanwezige con-15 dities het geneesmiddel in een andere vorm overgaat dan de vorm waarin het is toegediend. De zoutvorm, waarin het geneesmiddel wordt toegediend, is derhalve niet significant voor de behandelingsmethode. De zoutvorm kan echter worden gekozen om redenen van economie, gemak en toxiciteit.

20 De onderhavige nieuwe antibiotica worden bereid door kweken van een deoxynarasin-producerende stam van Streptomyces aureofaciens onder ondergedompelde aerobe omstandigheden in een geschikt kweekmedium, zo lang, totdat er een aanzienlijke antibiotische activiteit is verkregen. De 25 antibiotica worden gewonnen door gebruikmaking van diverse algemeen bekende isolatie- en zuiveringsprocedures.

Het voor de bereiding van deoxynarasinantibiotica te gebruiken organisme werd verkregen door N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine-geïnduceerde mutatie van Strepto-30 myces aureofaciens NRRL 8092. De taxonomische basis, waarop S. aureofaciens NRRL 8092 werd geklassificeerd als de stam van Streptomyces aureofaciens Duggar is beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 4.038.384.

De Streptomyces aureofaciens-kweek, die geschikt 35 is voor de bereiding van de deoxynarasinantibiotica, is ge- 790 02 1 7 * 10 deponeerd en maakt deel uit van de cultuurcollectie van het Northern Regional Research Center, Ü.S. Dept. of Agriculture, Agricultural Research Service, Peoria, Illinois, 61604 en is beschikbaar voor het publiek onder nr. NRRL 11181. Het depot 5 werd verricht op 6 oktober 1977. Een -17-depot van dezelfde culture vond plaats bij the American Type Culture Collection op 26 oktober 1978, onder nr. ATCC 31445.

De culture, die geïdentificeerd is als NRRL 11181 werd geïsoleerd en gemuteerd uit een culture van 10 Streptomyces aureofaciens, die oorspronkelijk geïsoleerd werd uit een grondmonster, afkomstig van Mount Ararat in Turkije. Het oorspronkelijke grondisolaat werd gekweekt op agarplaten, waarna subcultures werden verkregen door verwijdering van de individuele kolonies van het micro-organisme 15 van het oppervlak van de agarplaat. Eén van de isolaten, af komstig van een culture van het oorspronkelijke grondisolaat was de culture, die geïdentificeerd is als NRRL 5758.

De boven vermelde natuurlijk geselecteerde culture werd in plaatvorm gebracht, waaruit een bepaalde kolo-20 nie werd gekozen. Deze methode van natuurlijke selectie werd 8 keer herhaald, waarna een negende generatie kolonie-iso-laat werd gekozen, voor verdere selectie.

Het negende generatie-isolaat werd gekweekt in een chemisch gedefiniëerd agarmedium met 1 % galactose als 25 enige koolstofbron. Er werd een sporesuspënsie bereid door ultrasonisch roeren van het agarmedium, waarbij de sporen werden losgemaakt, terwijl de hyfale fragmenten tot een minimum werden beperkt door filtratie van de suspensie via een Whatman nr. 1 filterpapier.

30 De sporesuspensie werd gekweekt in een complex vloeistofmedium, waarvan de pH werd ingesteld op 8,8, welk medium 2 mg/ml N-methyl-N1-nitro-N-nitrosoguanidine bevatte, gedurende 72 uur bij 30°C. De op het medium gekweekte cultures werden vervolgens gewonnen en tot homogeen gemalen.

35 De gehomogeniseerde culture werd verdund en uit- 790 02 1 7 11 * gespreid op agarplaten en gelncubeerd bij 30°C totdat er individuele kolonies konden worden onderscheiden. Eén van de individueel geselecteerde kolonies werd gebruikt als uitgangsmateriaal voor een nieuwe culture, die hier geïdenti-5 ficeerd is als NRRL 8092.

De als NRRL 8092 geïdentificeerde culture werd gekweekt in een chemisch gedefiniëerd agarmedium met glucose als enige koolstofbron. Er werd een suspensie bereid van zowel sporen als hyfale fragmenten door ultrasonisch roeren 10 . van het agarmedium. De gemengde spore- en hyfale suspensie werd vervolgens behandeld met -2 mg/ml N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine in een complex vloeistofmedium bij een pH van 8,8 gedurende 96 uur op een schudder van 30°C, waarna de culture werd gewonnen, gehomogeniseerd en op een plaat aan-15 gebracht zoals boven beschreven. Eén van de afzonderlijke kolonies, afkomstig uit deze agarplaten, werd gekweekt, onder oplevering van een culture, die geïdentificeerd is als NRRL 11181.

Het zal de deskundige duidelijk zijn, dat het op 20 grond van de onderhavige uitvinding thans mogelijk is extra stammen te ontwikkelen, welke praktisch dezelfde biosynthe-tische eigenschappen hebben als S. aureofaciens NRRL 11181 (d.w.z. het vermogen om 20-deoxynarasin en 20-deoxy-epi-17-narasin te vormen) door onderwerping van S. aureofaciens 25 NRRL 5758, NRRL 8092 of NRRL 11181 aan een mutagene behandeling. Ofschoon voor het verkrijgen van S. aureofaciens NRRL 11181 N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine werd gebruikt kunnen ook andere mutagens worden toegepast, zoals UV-stra-len, röntgenstralen, hoge-frequentiegolven, radioactieve 30 stralen en andere chemische stoffen, onder het teweeg brengen van een dergelijke mutagenesis. Een deel van de uitvinding is derhalve gericht op een werkwijze voor de produk-tie van deoxynarasinantibioticumcomplex, waartoe een Strep-tomyces aureofaciens met praktisch dezelfde biosynthetische 35 eigenschappen van NRRL 11181 wordt gekweekt.

. 790 02 1 7 12

Het voor het kweken van Streptomyces aureofaclens NRRL 11181 toegepaste cultuurmedium kan een van een groot aantal media zijn. Ten behoeve van een economische produktie, optimale opbrengst en gemak van produktisolatie verdienen echter be-5 paalde cultuurmedia de voorkeur. Zo zijn bijv. voorkeurs- koolhydraatbronnen bij fermentatie op grote schaal tapioca, dextrine en sucrose, ofschoon glucose, maïszetmeel, fructose, mannose, maltose, lactose e.d. eveneens kunnen worden gebruikt. Maïsolie, pinda-olie, sojabonenolie en visolie 10 zijn andere geschikte koolstofbronnen. Een voorkeursstik-. stofbron is enzym-gehydrolyseerd caseïne, ofschoon peptonen, sojabonenmeel, katoenzaadmeel, aminozuren, zoals glutamine-zuur e.d. eveneens geschikt zijn. Onder de voedings-anorga-nische zouten, die opgenomen kunnen worden in het cultuur-15 medium, zijn te noemen de gewoonlijk oplosbare zouten, die in staat zijn natriumionen, magnesiumionen, calciumionen, ammoniumionen, chloride-ionen, carbonaationen, sulfaationen, nitraationen, e.d. ionen te leveren.

In het cultuurmedium dienen bovendien essentiële 20 sporenelementen, nodig voor de groei en ontwikkeling van het organisme, te worden opgenomen. Deze sporenelementen komen gewoonlijk als verontreinigingen in andere bestanddelen van het medium voor en wel in een zodanige hoeveelheid, dat aan de groeivereisten van het organisme voldaan wordt.

25 · Het kan noodzakelijk zijn kleine hoeveelheden (d.w.z. 0,2 ml/1) van een antischuimmiddel, zoals polypropy-leenglycol toe te voegen aan fermentatiemedia bij grote schaalfermentatie, teneinde opschuiming tegen te gaan.

Hoewel het niet essentiëel is, wordt de produk-30 tie van antibiotica bevorderd door de toevoeging van een geringe hoeveelheid van een olie, zoals sojabonenolie.

Voor de produktie van aanzienlijke hoeveelheden van de deoxynarasinantibiotica verdient een ondergedompelde aerobe fermentatie in tanks de voorkeur. Kleinere hoeveel-35 heden kunnen verkregen worden door toepassing van schud- 7S0 02 1 7 13 s kolfcultures. Ten gevolge van achterstand in de antibioti-cumproduktie, gewoonlijk vergezeld met inoculatie van grote tanks met de sporen van het organisme, verdient het de voorkeur een vegetatief inoculum te gebruiken. Het vegetatieve 5 inoculum wordt bereid door inoculering van een klein volume cultuurmedium met sporen of myceliële fragmenten van het organisme, onder oplevering van een verse, actief groeiende culture van het organisme. Het vegetatieve inoculum wordt dan overgebracht in een grotere tank. Het voor de groei van 10 het vegetatieve inoculum toegepaste medium kan hetzelfde zijn als het medium, dat gebruikt wordt voor grotere fermentaties, waarbij echter ook andere media kunnen worden toegepast.

Het deoxynarasin-producerende organisme kan ge-15 kweekt worden bij temperaturen van 20-40°C. Een optimale deoxynarasin-produktie vindt plaats bij temperaturen van 27-30°C.

Als gebruikelijk bij aerobe ondergedompelde cultuurprocessen, wordt door het cultuurmedium steriele lucht 20 heen geblazen. Voor een efficiënte groei van het organisme dient het toegepaste volume lucht bij tankproduktie bij voorkeur boven 0,1 volume lucht per volume cultuurmedium per minuut te bedragen. Voor efficiënte antibioticumproduk-tie is het toegepaste volume lucht bij de tankproduktie bij 25 voorkeur boven 0,25 volume lucht per volume cultuurmedium per minuut. Grote hoeveelheden opgeloste zuurstof hebben geen nadelige invloed op de produktie van de antibiotica.

De produktie van de antibiotica kan gevolgd worden tijdens de fermentatie door monsters te nemen van de 30 kweekmengsels of extracten van de myceliële vaste stof en deze te onderzoeken op antibiotische activiteit in vergelijking met bekende organismen, die gevoelig zijn voor de antibiotica. Een geschikt organisme voor het onderzoeken van de onderhavige antibiotica is Bacillus subtilis ATCC 35 6633. De bioproef wordt gemakshalve uitgevoerd onder ge- 790 02 1 7 14 bruikmaking van een papier-schijfproef op agarplaten.

Een andere geschikte methode is de turbidome-trische proef bij een semi-automatisch systeem (Autoturb^ microbiological assay system, Elanco), beschreven door N.R.

5 Kuzel en F.W. Kavanaugh in J. Pharmaceut. Sci. 60 (5), 764 en 767 (1971). Bij het onderzoeken van de deoxynarasinanti-biotica wordt gebruik gemaakt van de volgende proefparame-ters: Staphylococcus aureus (H-Heatley) NRRL B-314 in een voedingskweekmedium (pH 7), geïncubeerd gedurende 4 uur bij 10 37°C. De te onderzoeken monsters en de standaard worden op gelost in methanol-water (1 : 1). De standaard, A-28086 factor A, wordt gepresenteerd aan de Autoturb carrousel bij concentraties van 1, 2, 3, 4 en 5 mcg/ml.

De oorspronkelijke pH -van het niet geïnoculeerde 15 cultuurmedium variëert met het toegepaste medium. In het algemeen dient de pH te liggen tussen 6,0 en 7,5. De pH waarbij het organisme wordt gewonnen, aan het eind van de fermentatie, is enigszins hoger en wel tussen 6,5 en 8,0.

In het algemeen is een antibiotische activiteit 20 waarneembaar na de tweede dag fermentatie. Maximale produk-tie van antibiotische activiteit vindt in het algemeen plaats tussen ongeveer de vierde en de tiende dag.

Na hun produktie onder ondergedompelde aerobe fermentatie-omstandigheden kunnen de eerder beschreven deoxy-25 narasinantibiotica gewonnen worden uit het fermentatiemedium onder toepassing van methoden, die in de fermentatietechniek algemeen worden gebruikt. De tijdens de fermentatie geproduceerde antibiotica komen voor in zowel de myceliële massa als in het gefiltreerde medium. De maximale winning van de 30 deoxynarasinantibiotica wordt derhalve verkregen door een combinatie van methoden, zoals filtratie, extractie en ad-sorptiechromatografie. Een voorkeursoplosmiddel voor het afzonderen van de deoxynarasinantibiotica uit het gehele of gefiltreerde fermentatiemedium is ethylacetaat, ofschoon 35 andere algemeen gebruikelijke oplosmiddelen eveneens bevre- 7 0 0 0 2 17 15 digend zijn.

Een bijzonder voordelige methode voor de afzondering van de deoxynarasinantibiotica is het verlagen van de pH van het gehele fermentatiemedium tot ca. 3/0. Bij deze pH 5 kunnen de deoxynarasinantibiotica gemakkelijk worden afgezonderd met de myceliële massa door filtratie. Deze methode is beschreven voor de winning van de verwante antibiotica A-28086 factoren A, B en D en salinomycin, door Boeck en Berg in het Amerikaanse octrooischrift 4.009.262. Een ander 10 voordelig aspect van deze methode omvat de toevoeging van een bicarbonaat, zoals bijv. natriumbicarbonaat/ aan het ge-hele medium in een hoeveelheid van 1 g/1. Onder toepassing van deze methode kunnen de deoxynarasinantibiotica gemakkelijk worden afgezonderd met de myceliële massa in zoutvorm. 15 Er wordt bij voorkeur methanol gebruikt als oplosmiddel voor de afzondering van de antibiotica uit de myceliële massa/ maar er kunnen ook andere lagere alcoholen en ketonen worden gebruikt.

Azeotropische destillatie kan eveneens voordelig 20 zijn bij de winning van de deoxynarasinantibiotica. Bij deze methode wordt een organisch oplosmiddel, dat een geschikte azeotroop met water vormt, toegevoegd aan het waterige fermentatiemedium. Dit oplosmiddel-kweekmengsel wordt onderworpen aan azeotropische destillatie ter verwijdering van ten-25 minste de helft van het water uit het mengsel, onder achterlating van een water-oplosmiddelmengsel, waarin de deoxynarasinantibiotica opgelost zijn in het organische oplosmiddel. Onoplosbare bijprodukten kunnen worden afgezonderd door geschikte technieken, zoals filtratie of centrifugeren. Dan 30 kunnen de deoxynarasinantibiotica uit de organische oplossing worden gewonnen door toepassing van bekende procedures, zoals indamping van het oplosmiddel, neerslaan door toevoeging van een niet-oplosmiddel of extractie.

Organische oplosmiddelen, die geschikte azeotro-35 pen met water vormen, zijn butylalcohol, amylalcohol, hexyl- 780 02 1 7 16 alcohol, benzylalcohol, butylacetaat, amylacetaat, 1,2-di-chloorethaan, 3-pentanon, 2-hexanon, benzeen, cyclohexanon, tulueen, de xylenen e.d.

Er is een speciaal voordeel bij de winning door 5 azeotropische destillatie bij fermentatieprocessen op grote schaal. Zowel water als oplosmiddel, die tijdens de azeotropische destillatie worden afgevoerd, kunnen worden gescheiden onder toepassing van bekende technieken en daarna opnieuw worden gebruikt. Het aldus verwijderde water is vrij 10 van verontreinigingen.

Een verdere zuivering van de deoxynarasinanti-biotica omvat extra extractie- en adsorptieprocedures. Er kunnen met voordeel adsorptiematerialen, zoals silicagel, Ό koolstof, Florisil (magnesiumsilicaat, Floridin Co., P.O.

15 Box 989, Tallahassee, Fla.) e.d. worden gebruikt.

Alternatief kunnen de cultuur-vaste-stoffen, waaronder mediumbestanddelen en mycelium, gebruikt worden zonder extractie of scheiding, doch bij voorkeur na verwijdering van water, als bron voor het deoxynarasinantibioti-20 cumcomplex. Na de produktie van deoxynarasinantibiotische activiteit kan bijv. het cultuurmedium worden gedroogd door vriesdrogen of trommeldrogen en vervolgens direct worden vermengd met het voederpremix.

Volgens een ander aspect kan het mycelium na de 25 produktie van deoxynarasinactiviteit in het cultuurmedium, worden afgezonderd en gedroogd onder oplevering van een pro-dukt, dat direct kan worden gebruikt in een voederpremix. Wanneer het mycelium voor dergelijke doeleinden wordt afgezonderd, blijkt de toevoeging van calciumcarbonaat (ca. 10 30 g/1) de filtratie te bevorderen en een verbeterd droog pro- dukt op te leveren.

Onder de tot nu toe toegepaste omstandigheden worden 20-deoxynarasin en 20-deoxy-epi-17-narasin gewonnen als de voornaamste factoren uit de Streptomyces aureofaciens 35 stam, zoals boven beschreven en aangeduid als NRRL 11181.

780 02 17 17

Er kunnen echter sommige kleine factoren uit S. aureofaciens NRKL 11181 worden gewonnen, in hoeveelheden, die te klein zijn om te karakteriseren. Ofschoon de verhouding van de factoren variëert afhankelijk van de toegepaste fermentatie-5 en isolatie-omstandigheden, wordt er in het algemeen meer 20-deoxy-epi-17-narasin dan 20 deoxynarasin gewonnen.

De verbindingen 20-deoxynarasin en 20-deoxy-epi-17-narasin worden van elkaar gescheiden en geïsoleerd als afzonderlijke verbindingen door toepassing van bekende 10 methoden, zoals kolomchromatografie, dunne-laagchromatogra-fie, tegenstroomdistributie e.d. Zo wordt bijv. kolomchromatograf ie boven silicagel gebruikt voor het scheiden van 20-deoxynarasin en 20-deoxy-epi-17-narasin, waarbij de kolom geëlueerd wordt met diverse oplosmiddelmengsels. Zo wordt 15 bijv. door gebruikmaking van benzeen-ethylacetaat bij een silicagelkolom eerst 20-deoxy-epi-17-narasin geëlueerd en dan 20-deoxynarasin. Dunne-laagchromatografie op silicagel, onder gebruikmaking van 100 % ethylacetaatoplosmiddel, is een goede methode voor het volgen van de mate van eluëren.

20 De onderhavige deoxynarasinantibiotica zijn antibacteriemiddelen. De relatieve microbiologische activiteit van 20-deoxy-epi-17-narasin (vrij zuur) is beschreven in tabel D. Hierbij werd gebruik gemaakt van de conventionele schijf-diffusiemethode.

25 TABEL D

inhibitiezone _testorganisme_ 300 mcg/schijf 30 mcg/schijf

Staphylococcus aureus 3055 16,9 13,8 ” ” 30741 19,5 15,4 30 " " 31302 19,0 17,2

Streptococcus pyogenes(groep A) 12,0 10,0 " s£;_ ( " D) 17,0 14,6

Diplococcus pneumoniae 16,0 13,0 penicilline G resistent 2 35 methicilline resistent 790 02 1 7 » 18

Gebleken is, dat de deoxynarasinantibiotica de groei van anaerobe bacteriën remmen. De minimale remmende cocnentraties (MRC), waarbij 20-deoxy-epi-17-narasin (vrij zuur) de groei van diverse anaerobe bacteriën remt, bepaald 5 volgens standaard-agar-verdunningsmethoden, zijn opgesomd in tabel E. De eindpunten werden afgelezen na 24 uur incubatieperiode .

TABEL E

_anaerobe bacteriën _ MRC (mcg/ml) 10 Actinomyces israelii W855 8

Clostridium perfringens 81 16

Clostridium septicum 1128 16

Eubacterium aerofaciens 1235 16

Peptococcus asaccharolyticus 1302 8 15 Peptococcus prevoti 1281 4

Peptostreptococcus anaerobius 1428 4

Peptostreptococcus intermedius 1264 4

Propionibacterium acnes 79 2

Bacteroides fragilis 111 128 20 De activiteit tegen mycoplasma is een ander ge schikt aspect van de antimicrobische activiteit van de deoxynarasinantibiotica. Mycoplasma-species, ook bekend als pleuropneumonia-achtige (PPLO)-organismen, zijn pathogeen bij de mens en diverse dieren. Er bestaat grote behoefte aan 25 middelen tegen PPLO-organismen, in het bijzonder bij de pluimveefokkerijen. De minimale remmende concentraties (MRC) van 20-deoxy-epi-17-narasin (vrij zuur) tegen mycoplasma-species, als bepaald door in vitro verdunningskweek, zijn vermeld in tabel F.

30 TABEL F

organisme MRC (mcg/ml) M. gallisepticum 25,0 M. hyorhinis 50,0 M. synoviae 50,0 35 De deoxynarasinantibiotica zijn bovendien anti- 7900217 4 19 virale middelen. Zo is bijv. 20-deoxy-epi-17-narasin actief tegen rhinovirus type 3, vaccinia-virus, herpesvirus en influenza A-virus, zoals aangetoond door in vitro plak-onder-drukkingsproeven, zoals beschreven door Siminoff, Applied 5 Microbiology 9 £ 1_/, 66-72 (1961).

Volgens de uitvinding kan derhalve een deoxyna-rasinantibioticum oraal, topisch of parenteraal worden toegediend aan mens en dier voor de bestrijding van virussen. Geschikte doseringshoeveelheden voor de voorkoming of behan-10 deling van virale ziekten variëren van 1-5 mg/kg lichaamsgewicht van mens of dier, afhankelijk van het type virus en van het feit of het geneesmiddel profylactisch of therapeu-•tisch wordt gebruikt.

Bovendien kunnen oplossingen van een deoxynara-15 sinantibioticum, bij voorkeur samen met een oppervlakte-actieve stof, worden gebruikt voor het reinigen van de in vitro gastheer waarop virussen, zoals polio of herpes, voorkomen. Oplossingen met 1-1500 mcg/ml van een deoxynarasin-antibioticum zijn geschikt voor de bestrijding van virussen.

20 De acute toxiciteiten van 20-deoxy-epi-17- narasin (vrij zuur) en 20-deoxynarasin (Na-zout) bij intra-peritoneale toediening bij de muis en uitgedrukt als LD^q, bedragen resp. 201 mg/kg en 5 mg/kg.

De anticoccide-activiteit is een belangrijke 25 eigenschap van de onderhavige deoxynarasinantibiotica. Bijv.

blijken 20-deoxynarasin (Na-zout) en 20-epi-l7-narasin (vrij zuur) bij in vitro proeven actief te zijn tegen Eimeria tenella, het protozoanorganisme, dat coccidiosis meestal begeleidt, bij concentraties van slechts 0,2 dpm.

30 Bij een voederexperiment bij jonge kuikens werd aangetoond, dat de deoxynarasinantibiotica in vivo anticoccide- activiteit hebben. Bij dit experiment werd 20-deoxynarasin (Na-zout) toegediend in hoeveelheden van 100 dpm aan het voer van kuikens, die besmet waren met Eimeria tenella, 35 met het resultaat, dat de kuikens niet stierven, een grotere 790 02 1 7 20 gewichtstoename vertoonden en het aantal beschadigingen bij de kuikens afnam. De resultaten van dit experiment worden vermeld in tabel G.

TABEL· G

5 % morta- gewichts- beschadi- 1) 2) behandeling_ liteit toename (g) gingen geïnfecteerde controles 37,5 114 4,00 20-deoxynarasin (100 dpm) 0 185 0,13 1) twee hokken met vier kuikens elk per behandeling.

10 2) maximaal mogelijke score = 4,00.

Voor het voorkomen of behandelen van coccidiosis bij pluimvee dient een effectieve anticoccidehoeveelheid deoxynarasinantibioticum te worden toegediend aan vogels, bij voorkeur oraal, en wel dagelijks. Het deoxynarasinanti-15 bioticum kan in verschillende vormen worden toegediend, waarbij de toediening met een fysiologisch aanvaardbare drager, bij voorkeur het door de vogels genuttigde vo r, de voorkeur verdient. Ofschoon bij de bepaling van een geschikte concentratie deoxynarasinantibioticum met een aantal fac-20 toren rekening dient te worden gehouden, bedraagt deze concentratie in het algemeen 0,003 - 0,03 gew.% van het genees-middelvrije voer en bij voorkeur 0,004-0,02 gew.%.

De uitvinding omvat tevens de anticoccidiale voedermengsels voor pluimvee, bestaande uit pluimveevoer en 25 35-180 g van een deoxynarasinantibioticum per ton.

Het vermogen om de voederbenutting bij dieren te verbeteren vormt een andere belangrijke eigenschap van de deoxynarasinantibiotica. Deoxynarasinantibiotica verbeteren bijv. de voederbenutting bij herkauwers met een ontwikkelde 30 pensfunctie. Zoals boven uiteengezet, wordt de efficiëntie van de benutting van koolhydraten bij herkauwers door de onderhavige behandeling, waarbij de pensflora van de dieren wordt gestimuleerd, verbeterd onder vorming van propionaat-derivaten in de plaats van acetaten of butyraten. De doelma- 730 02 1:: 21 tigheid van de voederbenutting kan gevolgd worden door het in de gaten houden van de produktie en concentratie van pro-pionaatverbindingen in de pensvloeistof, waarbij de in het Amerikaanse octrooischrift 4.038.384 beschreven methoden 5 worden gebruikt.

De resultaten van in-vitro-proeven met 20-deoxy-narasin (Na-zout) en 20-deoxy-epi-17-narasin (vrij zuur), die de verhouding van vluchtig vetzuur (WZ) concentraties in behandelde kolven tot concentraties in controlekolven, 10 tonen, zijn aangegeven in tabel H.

TABEL H

verhouding van behandeld tot controle dosis molair % molair % molair % totaal

verbinding_ mcg/ml acetaat propionaat butyraat WZ

15 20-deoxy-epi-17-narasin 10 0,9093 1,2665* 0,6560 1,0325 " 5 0,9237 1,1836* 0,8201 1,0487 " 2 0,9581 1,0858 0,9414 1,0717 2 0-deoxynarasin 1 0,8727 1.4597* 0,3942 1,2096 " 0,3 0,9084 1,3799* 0,4582 1,1829 20 " 0,1 0,9504 1,2148* 0,6870 1,1892

Statistisch significant (P ^0,01) door de tweezijdige LSD-proef (R.G.D. Steel en J.H. Torrie, "Principles and Procedures of Statistics", McGraw-Hill, New York, N.Y., 1960, biz. 106).

De onderhavige deoxynarasinantibiotica zijn bij-25 zonder geschikt voor het verhogen van de hoeveelheid propio-naten en bovendien voor de verbetering van de voederbenutting bij orale toediening aan herkauwers, in een hoeveelheid van 0,05-5,0 mg/kg/dag. De gunstigste resultaten worden verkregen bij een hoeveelheid van 0,1-2,5 mg/kg/dag. Een voor-30 keursmethode van toediening van een antibioticum volgens de uitvinding, omvat het vermengen daarvan met het voeder. Het antibioticum kan echter ook langs andere weg worden toegediend, bijv. in de vorm van tabletten, dranken, grote pillen of kapsules. De samenstelling van deze doseringsvormen kan 7S0 0 2 1 7 22 gerealiseerd worden onder toepassing van methoden, die in de veterinaire farmacie bekend zijn. Elke individuele doserings-eenheid dient een hoeveelheid van een verbinding volgens de uitvinding te bevatten, welke hoeveelheid rechtstreeks in 5 verband staat met de juiste dagelijkse dosis.voor het te behandelen dier.

De uitvinding heeft verder betrekking op voeder-mengsels, die geschikt zijn voor het mesten van herkauwers, zoals runderen en schapen. Deze voedermengsels bevatten 10 voeder en 1-30 g deoxynarasinantibioticum per ton.

Varkensdysenterie is een veel voorkomende ziekte in de Verenigde Staten en andere landen, welke ziekte jaarlijkse grote verliezen aan de varkensstapel in de wereld betekent. Uit het Amerikaanse octrooischrift 3.947.586 volgt, 15 dat polyetherantibiotica geschikt zijn voor het voorkomen en -behandelen van varkensdysenterie. Aangezien de deoxynarasin-antibiotica nieuwe vertegenwoordigers van de groep polyetherantibiotica zijn, moeten ze ook effectief zijn bij het voorkomen en behandelen van varkensdysenterie.

20 Voor het voorkomen of behandelen van dysenterie bij varkens wordt bij voorkeur een effectieve hoeveelheid van een deoxynarasinantibioticum opgenomen in het voer. De onderhavige deoxynarasinantibiotica zijn doelmatig voor het voorkomen of behandelen van varkensdysenterie bij orale toe-25 diening aan varkens, in een hoeveelheid van 35-150 g per ton van de werkzame verbinding. Een hoeveelheid van ca. 100 g werkzame verbinding per ton verdient in het bijzonder de voorkeur. Ofschoon de voorkeursmethode van toediening het vermengen van de verbinding met het voer omvat, kan de ver-30 binding ook anders worden toegediend, bijv. in de vorm van tabletten, drank, grote pillen of kapsules. Elke individuele eenheidsdosis dient een hoeveelheid van het onderhavige antibioticum te bevatten, welke rechtstreeks gerelateerd is aan de juiste dagelijkse dosis voor het te behandelen dier.

35 De uitvinding omvat voorts een voedermengsel 790 02 1 7 23 voor varkens, bestaande uit varkensvoer en een effectieve hoeveelheid van een deoxynarasinantibioticum. Zoals boven besproken, komt een effectieve hoeveelheid overeen met 35-150 g deoxynarasinantibioticum per ton voer.

5 De deoxynarasinantibiotica zijn antivirale mid delen en zijn bovendien actief tegen anaerobe bacteriën, zoals Clostridium perfringens. De deoxynarasinantibiotica kunnen derhalve met voordeel worden gebruikt voor de behandeling of voorkoming van enteritis bij kuikens, varkens, 10 runderen en schapen en bij de behandeling van enterotoxemia bij herkauwers.

Sommige deoxynarasinverbindingen (20-deoxynara-sin en zijn zouten) bezitten ionen-bindende en ionen-trans-porterende eigenschappen en zijn derhalve ionoforen (ionen-15 dragers) (zie B.C. Pressman, Alkali Metal Chelators - The Ionophores, in "Inorganic Biochemistry", deel 1, G.L. Eichhorn, Elsevier, 1973). Deze verbindingen kunnen gebruikt worden, wanneer de selectieve verwijdering van een bepaald kation gewenst is. Voorbeelden van dergelijke toepassings-20 doeleinden omvatten de verwijdering en terugwinning van zilverionen uit oplossingen bij fotografie, de verwijdering van toxische kationen uit industriële afvalvloeistoffen, voordat dergelijke vloeistoffen geloosd worden in het milieu en voor het ontzilten van zeewater. Een deoxynarasinverbin-25 ding kan gebruikt worden als een component van een ion- specifieke electrode (zie O. Kedem en medew., Amerikaanse octrooischrift 3.753.887). Deze verbindingen wijzigen de kationpermeabiliteit van zowel natuurlijke als kunstmatige membranen. Derhalve kan een deoxynarasinverbinding gebruikt 30 worden als een component in een membraan, dat gebruikt wordt voor het selectieve transport van kationen tegen een concentratiegradient. Een potentiële toepassing van deze eigenschap ligt bij het winnen van zwaarmetalen en edelmetalen op commerciële basis. (Zie E. L. Cussler, D.F. Evans en 35 Sister M.A. Matesick, Science 172, 377 (1971)).

790 02 1 7 24

Bovendien zijn 20-deoxynarasin en zijn zouten actief als inhibitoren van het enzym ATPase. ATPase, een alkalimetaal-gevoelig enzym, aanwezig in celmembranen, is betrokken in de energie die nodig is voor actief transport.

5 "Actief transport" heeft betrekking op de energie-benodigde reeks bewerkingen, waarbij intracellulaire en extracellulai-re vloeistoffen hun composities behouden. Inhibitoren van ATPase verlagen de energie die nodig is voor het actieve transport. In vitro proeven hebben aangetoond, dat 20-10 deoxynarasin (Na-zout) het kationtransport-ATPase remt in levermitochondria bij een halfeffectieve concentratie van 0,065 mcg/ml.

Het 20-deoxynarasin en de zouten daarvan zijn potentiële cardiotonische middelen. In proeven, uitgevoerd 15 onder gebruikmaking van geïsoleerde guineese biggetjes atria, bleek bijv. 20-deoxynarasin de cardiale contractiliteit te verhogen. Respons op deze proef wordt uitgedrukt als percentage van de maximale contractische tensie, die aan het licht -4 komt bij een dosis aan norepinefrine (10 M). De verbinding -5 20 20-deoxynarasin (Na-zout) bleek bij een 10 molaire concentratie een gemiddelde toename (+ standaardfout) in contractische tensie teweeg te brengen van 43,8+1,4 (n = 4) %. Voor een uitvoerige beschrijving van deze proef wordt verwezen naar het Amerikaanse octrooischrift 3.985.893.

25 De uitvinding omvat derhalve de methode voor het opvoeren van de contractische kracht van de hartspieren van warmbloedige zoogdieren, waartoe een effectieve niet-toxi-sche dosis van 20-deoxynarasin of een farmacologisch aanvaardbaar zout daarvan wordt toegedient. Een effectieve 30 niet-toxische dosis is een dosis van 30-500 mcg/kg lichaamsgewicht. Een voorkeursdosis bedraag 30-100 mcg/kg lichaamsgewicht. Bij deze methode wordt het antibioticum parenteraal toegediend, bijv. via intraveneuze infusie. Een geschikte wijze van toediening is de druppelmethode, waarbij het anti-35 bioticum is ingecorporeerd in een standaard i.v.-oplossing, 7 9 0 C 2 'i 25 zoals een dextrose-oplossing.

De verbinding 20-deoxynarasin wordt bij voorkeur toegediend in een dosis van minder dan 100 mcg/kg, totdat de gewenste toename van de contractische kracht wordt waargeno-5 men. Daarna kan de hoeveelheid 20-deoxynarasin worden toegediend, gereguleerd door de infusiesnelheid, die nodig is voor het handhaven van de gewenste respons. Zoals bij de klinische toediening van andere inotropische middelen, kan de toegediende dosis van 20-deoxynarasin variëren in een ge-10 geven klinisch geval, overeenkomstig factoren zoals de individuele 20-deoxynarasintolerantie, de aard van de hartafwijking, bijv. de mate van beschadiging van de hartspier en de leeftijd en algemene fysieke conditie van de patient.

De methode van de uitvinding, waarbij gebruik 15 wordt gemaakt van het positieve inotropische middel 20- deoxynarasin, kan worden toegepast in een groot aantal klinische situaties, die geklassificeerd kunnen worden als cardiogene shock. Dergelijke condities omvatten bijv. myo-cardiaal infarct, congestieve hartafwijking en post-opera-20 tieve cardiogene shock.

Teneinde de werking van de uitvinding nader te illustreren volgen thans een aantal voorbeelden.

VOORBEELD I

a. Schud - kolffermentatie.

25 Er werd een culture van Streptomyces aureo- faciens NRRL 11181 bereid en op een agarplaat bewaard, welke de volgende samenstelling had: ingredient hoeveelheid K2HP04 2 g 30 MgS04-7H20 0,25 g NH4N03 2 g

CaCOg 2,5 g

FeS04-7H20 0,001 g

MnCl2-7H20 0,001 g 35 ZnS04-7H20 0,001 g 790 02 1 7 26 ingredient hoeveelheid glucose 10 g agar 20 g gedeioniseerd water tot 1 liter 5 pH (niet ingesteld) 7,7

De plaat werd geïnoculeerd met Streptomyces aureofaciens NRRL 11181, waarna de geïnoculeerde plaat bij 30°C gedurende 7 dagen werd geïncubeerd. De rijpe culture werd bedekt met steriel runderserum, waarna geschraapt werd 10 met een steriele spatel voor het losmaken van de sporen. De verkregen runderserumsuspensie van sporen en myceliële fragmenten werd gevriesdroogd tot maximaal 6 tabletten.

Een van de aldus gevriesdroogde tabletten werd gebruikt voor het inoculeren van 50 ml van een vegetatief 15 medium met de volgende samenstelling: ingredient hoeveelheid glucose 20 g sojabonenmeel 15 g maisvloeistof 10 g 20 CaCOg 2 g leidingwater 1 liter pH, ingesteld op 6,5 door toevoeging van 5N NaOH. Het geïnoculeerde vegetatieve medium werd in een 250 ml Erlenmeyer-kolf geïncubeerd bij 30°C gedurende 24-48 25 uur op een roterende schudmachine, die roteerde om een boog met een diameter van 5 cm bij 250 omw./min.

Het boven beschreven geïncubeerde vegetatieve medium (50 ml) werd gebruikt voor het inoculeren van 250 ml van één van de volgende fermentatiemedia: 30 Medium 1: ingredient hoeveelheid tapiocadextrin 60 g enzym-gehydrolyseerd caseïne 6 g enzymatisch hydrolysaat van 35 caseïne 2 g 790 02 17 27 ingredient hoeveelheid

CaCo^ 2 g

MgS04·7H20 0,5 g melasse 15 g 5 gezuiverde sojabonenolie 5,0 ml/1 leidingwater 1 liter pH (niet ingesteld) 6,6 *Stadex 11, A.E. Staley, Decatur, Illinois Amber EHC, Amber Laboratories, Juneau, Vise.

^ Amine A, Sheffield Chemical Co., Norwich,

New York.

Medium 2: ingredient hoeveelheid it tapiocadextrin 30 g 15 glucose 15 g enzym-gehydrolyseerd caseïne 3 g enzymatisch hydrolysaat van caseïne 1 g gistextract 2,5 g 20 CaC03 2 g

MgS04*7H20 1 g melasse 15 g gezuiverde sojabonenolie 5,0 ml/1 leidingwater 1 liter 25 pH (niet ingesteld) 6,4 %

Stadex 11, A.E. Staley, Decatur, Illinois Ü

Amber EHC, Amber Laboratories, Juneau, Vise. Amine A, Sheffield Chemical Co., Norwicht,

New York.

30 Medium 3? ingredient hoeveelheid sojabonenmeel 25 g glucose 20 g

CaC03 2,0 g 790 02 1 7 28 ingredient hoeveelheid

Na2SO4‘10H2O 1,0 g gezuiverde sojabonenolie 20 ml methyloleaat 20 ml 5 FeS04*7H20 0,6 g

MnCl2-4H20 0,3 g ascorbinezuur 0,018 g gede'ioniseerd water 1 liter pH (niet ingesteld) 6,5 10 De fermentatie werd geïncubeerd gedurende 10 da gen bij 30°C op een roterende schudmachine met een boog van 5 cm bij een omwentelingssnelheid van 250 omw./min.

b. Tankfermentatie.

De tankfermentatie werd uitgevoerd onder ge-15 bruikmaking van vegetatieve en fermenterende media, zoals beschreven onder a.voor de schud-kolffermentatie. Voor tankfermentatie werd 10 ml van het vegetatieve medium gebruikt voor het ino uieren van 400 ml van een tweede-trapsvegeta-tief medium :.n een 2-liter Erlenmeyer-kolf. Na 24 uur incu-20 batie bij 30°C werd 800 ml van het tweede-trapsvegetatieve medium gebruikt voor het inoculeren van 100 liter fermenta-tiemedium in een 165 liter fermentatietank. De pH van het medium bleek na sterilisatie bij 12l°C gedurende 45 min. ca.

6,8 + 0,1 te zijn. Men liet de fermentatie doorgaan geduren-25 de 10 dagen bij 30 + 1°C. De tank werd belucht met steriele lucht bij een snelheid van 0,5 volume lucht per volume cul-tuurmedium per minuut, terwijl onder gebruikmaking van conventionele roerders werd geroerd bij een snelheid van 300 omw./min.

30 VOORBEELD II

Scheiding van het deoxynarasincomplex.

De pH van het gehele fermentatiemedium (4 liter), verkregen door de in voorbeeld I beschreven methode, onder gebruikmaking van medium 2, werd verlaagd tot een pH van 3,0 35 door toevoeging van geconcentreerd HC1 tijdens roeren gedu- 790 02 1 7 29 rende een uur. De verkregen oplossing werd afgefiltreerd met behulp van een filter (125 g Hyflo Super-Cel, een diatomeeën-aarde, Johns-Manville Corp.). De afgescheiden myceliumkoek werd chargegewijs geëxtraheerd, onder gebruikmaking van een 5 menger met in totaal 2 liter methanol, die 50 g NaHCO^ per liter bevatte. Het methanolfiltraat werd onder vacuum ingedampt tot een volume van ca. 450 ml. De pH van deze oplossing werd ingesteld op 7,5 door toevoeging van geconcentreerd HC1. De verkregen oplossing werd geëxtraheerd en wel 2 keer met 10 CHClg (500 ml). De CHCl^-extracten werden gecombineerd, boven Na2S0^ gedroogd en gefiltreerd. Het filtraat werd onder vacuum ingedampt, onder oplevering van 2,0 g ruw deoxy-narasincomplex.

VOORBEELD III

15 Isolatie van deoxynarasin en epi-deoxynarasin.

Ruw deoxynarasincomplex (2 g), verkregen zoals in voorbeeld II beschreven, werd opgelost in een minimale hoeveelheid benzeen en vervolgens aangebracht op een 1,5- x 22 cm kolom van silicage (Merck 7729). De geïsoleerde frac-20 ties, gebruikte oplosmiddelen en hoeveelheden, die hierbij werden verkregen, zijn vermeld in de volgende tabel.

ver- opbrengst fractie volume _oplosmiddel houding (mg)_ 1 3,0 1 benzeen 100 % 24 25 2 2,0 1 benzeen:ethylacetaat 9:1 20 3 600 ml " " 4:1 85 4 300 ml " " 4:1 5 5 300 ml " 4:1 7 6 900 ml " " 4:1 18 30 7 2,0 1 " " 4:1 22 8 300 ml " 4:1 7 9 450 ml " " 4:1 22 10 450 ml M 4:1 9 11 1,2 1 ” " 4:1 7 35 12 1,2 1 " " 4:1 5 790 02 1 7 30 jj* (vervolg tabel) ver- opbrengst fractie volume oplosmiddel_ houding (mg)_ 13 1,0 1 benzeen:ethylacetaat 4:1 12 14 1,0 1 " " 3:1 14 5 15 1,5 1 " " 3:1 28 16 1,5 1 " " 3:1 100 17 450 ml " " 3:1 26 18 900 ml " " 3:1 70 19 1,0 1 " " 3:1 54 10 20 300 ml ethylacetaat 100 % 12 21 150 ml " 100 % 180 22 150 ml " 100 % 125 23 450 ml " 100 % 170 24 300 ml methanol 100 % 40 15 25 450 ml " 100 % 1100 verkregen na drogen boven Na2SO^, filtreren en indampen van het filtraat tot droog onder vacuum.

De fracties werden gevolgd door dunne-laagchro-2Q matografie, onder gebruikmaking van een ethylacetaat-oplos-middelsysteem. De fracties 16-17 (126 mg) bevatten 20-deoxy-epi-17-narasin. De fracties 18-23 bevatten een mengsel van 20-deoxynarasin en 20-deoxy-epi-17-narasin.

Een mengsel van 20-deoxynarasin en 20-deoxy-epi-2^ 17-narasin, verkregen zoals boven beschreven voor fracties 18-23, werd chromatografisch behandeld via preparatieve dunne-laagchromatografie, onder gebruikmaking van een ethyl-acetaatoplosmiddelsysteem. Het mengsel (105 mg op één plaat en 130 mg op een andere plaat) werd opgelost in een geringe 30 hoeveelheid en vervolgens overgebracht op een silica- gel (Merck) preparatieve plaat. Na ontwikkeling van de plaat werden 2 afzonderlijke materialen waargenomen met behulp van UV-licht. Elk van de gebieden, die de 2 materialen voorstellen, werd verwijderd van de plaat en geëxtraheerd met C^C^^H^OH (4 : 1) . In dit systeem beweegt deoxynarasin 35 langzamer dan de andere component. Van de plaat met 105 mg 79 0 0 2 1 7 31 van het materiaal daarop werd 7,5 mg 20-deoxy-epi-l7-narasin en 27 mg deoxynarasin verkregen. Van de plaat met 130 mg van het mengsel daarop, werd 4,0 mg 20-deoxy-epi-17-narasin en 56 mg 20-deoxynarasin gewonnen.

5 VOORBEELD IV

Afwisselende isolatie van 20-deoxynarasin.

De pH van het gehele fermentatiemedium (95 1) werd ingesteld op 3 door toevoeging van HC1, waarna het geheel gedurende 1 uur werd geroerd. Dan werd een filterhulp-10 stof (Hyflo Supercel, 3 %) toegevoegd, waarna het medium werd gefiltreerd. De afgescheiden myceliumkoek werd twee keer geëxtraheerd met ca. 45 1 aceton met 50 g NaHCO^ per liter daarin. De acetonextracten werden gecombineerd en onder vacuum geconcentreerd, onder oplevering van ca. 10 liter 15 waterige oplossing. De pH van deze oplossing werd ingesteld op 8,0 door toevoeging van 5N HCl, waarna de verkregen oplossing 3 keer werd geëxtraheerd met halve volumina CH2C12.

De CH2Cl2-extracten werden verenigd en vervolgens onder vacuum ingedampt, onder achterlating van een olie-achtig re-20 sidu. Dit residu werd opgenomen in 500 ml bovenfase van het oplosmiddelsysteem hexaan : methanol : water (10 : 7 : 1) .

De bovenfase werd 6 keer geëxtraheerd met 300 ml van de onderfase. Deze extracten werden verenigd en vervolgens onder vacuum geconcentreerd tot een residu. Dit residu werd opge-25 lost in dioxan. De dioxan oplossing werd gevriesdroogd, onder oplevering van 19,4 g deoxynarasincomplex.

Diverse monsters, op die manier verkregen, werden verenigd (40 g), en vervolgens opgelost in tolueen en tenslotte overgebracht op een silicagelkolom in een vloei-30 stofchromatograaf (Waters' Associates Prep. LC/System 500).

De kolom werd geëlueerd met een tolueen : ethylacetaat (9 : 1)-oplosmiddelsysteem bij een stromingssnelheid van 250 ml/ min., waarbij fracties met een volume van 250 ml werden opgevangen. Het fractiegehalte werd gevolgd door dunne-laag-35 chromatografie. Fracties 37-52 werden verenigd en onder 790 02 1 7 32 vacuum geconcentreerd, onder oplevering van een residu, dat opnieuw werd opgelost in dioxan en gevriesdroogd, onder oplevering van 7,8 g zuiver materiaal, rijk aan 20-deoxynara-sin. Dit materiaal werd opnieuw gechromatografeerd op het 5 Waters' Prep. LC/system 500, zoals boven beschreven. Na elueren van 50 fracties met het tolueen : ethylacetaat (9 : 1)-oplosmiddelsysteem, werd het elutie-oplosmiddel veranderd in 100 % ethylacetaat. Fracties 51-53 werden verenigd en onder vacuum verdampt, onder oplevering van een residu, dat 10 vervolgens werd opgelost in dioxan en gevriesdroogd, onder oplevering van 1,12 g 20-deoxynarasin in de vorm van zijn natriumzout.

VOORBEELD V

Bereiding van 20-deoxynarasin, vrij zuur.

15 Er werd 20-deoxynarasin-natriumzout (200 mg), opgelost in ethylacetaat (10 ml). Deze oplossing werd gewassen met 0,1 N HC1 (10 ml) en vervolgens 2 keer met water (5 ml). De verkregen organische laag werd tot droog ingedampt, onder oplevering van een residu, dat vervolgens werd 20 opgelost in dioxan en dat gevriesdroogd werd, onder oplevering van 139,6 mg 20-deoxynarasin, vrij zuur, in de vorm van een witte vaste stof.

VOORBEELD VI

Kippevoer voor coccidiosebehandeling.

25 Er werd een uitgebalanceerd voer met hoge ener gie voor kippen bereid, bestemd voor een snelle gewichtstoe-name, welk voer de volgende samenstelling had: bestanddeel_ % kg -- gemalen gele mais 50 450 30 sojabonenmeel, oplosmiddel-geëxtraheerd, fijn gemalen, 50 % proteïne 30,9 278 dierlijk vet (rundervet) 6,5 58,5 gedroogd vismeel met oplosbare bestanddelen (60 % proteïne) 5,0 45 35 oplosbare bestanddelen uit mais 4,0 36 790 02 1 7 33 bestanddeel_ % kg dicalciumfosfaat, voederkwaliteit 1,8 16,2 calciumcarbonaat 0,8 7,2 vitaminepremix (bestaande uit de vitaminen 5 A, D, E, K en B^/ cil°l:i-ne/ niacin, pan- totheenzuur, riboflavine, biotine, met glucosebulkmiddel) 0,5 4,5 zout (NaCl) 0,3 2,7 spore mineraal premix, (bestaande uit MnSO^, 10 ZnO, KI, FeS04, CaCC>3) 0,1 0,9 2-amino-4-hydroxyboterz uur (hydroxy-analoog van methionine) 0,1 0,9

Deoxynarasinantibioticumcomplex, 2 0-deoxynarasin of 20-deoxy-epi-17-narasin (ca. 0,01 gew.%) werd gemengd met 15 dit voeder overeenkomstig de standaard-voedermengtechnieken.

Kippevoer met water ad libitum, is beschermd tegen inwerking van coccidiosis.

VOORBEELD VII Verbeterd rundervoer.

20 Er werd een uitgebalanceerd rundervoer van hoge kwaliteit als volgt bereid: ingredient_ % kg fijn gemalen mais 67,8 610,2 gemalen maïskolf 10 90 25 gedehydrateerd luzernemeel, 17 % proteïne 5 45 soj abonenmeel, oplosmiddel-geëxtraheerd, 50 % proteïne 10 90 melasse 5 45 ureum 0,6 5,4 30 dicalciumfosfaat, voederkwaliteit 0,5 4,5 calciumcarbonaat 0,5 4,5 natriumchloride 0,3 2,7 spore mineraal premix 0,03 0,27 vitamine A en D_ premix 0,07 0,63 φφ 35 vitamine E premix 0,05 0,45 790 02 1 7 34 ingredient__ % kg calciumpropionaat 0,15 1,35 *0,45 kg bevat: 2.000.000 I.U. vitamine A; 227.200 I.U. vitamine D9 en 385,7 g sojabonenvoer met 1 % olie erin.

5 maisbestanddelen, droge korrels, met oplosbare bestand delen met 20.000 I.U. d-a-tocoferylacetaat per 0,45 kg.

Deoxynarasinantibioticumcomplex, 20-deoxynarasin of 20-deoxy-epi-17-narasin (ca. 0,004 gew.%) werd gemengd met dit voeder overeenkomstig standaardtechnieken. Het ge-10 mengde voeder werd samengeperst tot tabletten. Bij een gemiddeld dagelijks voer van ca. 7 kg per dier kwam dit overeen met ca. 300 mg antibioticum per dier per dag.

VOORBEELD VIII Verbeterd varkensvoer.

15 Er werd een premix bereid overeenkomstig stan- daardmethoden, onder gebruikmaking van de volgende ingrediënten: ingredient g/kg actieve verbinding 150,0 20 calciumsilicaat 20,0 calciumcarbonaat (oester- schelpmeel) 830,0 totaal gewicht: 1000 g

Dit premix werd toegevoegd aan een commerciëel 25 varkensvoer, onder gebruikmaking van standaard-voedermeng- technieken, onder oplevering van een eindconcentratie van de werkzame verbinding van 100 g/ton.

30 790 02 1 7

Claims (14)

1. Deoxynarasinantibioticumcomplex, bestaande uit 20-deoxynarasin en 20-deoxy-epi-l7-narasin of een farmacologisch aanvaardbaar zout daarvan. 5 2. 20-deoxynarasin met formule 1 van het formu leblad en de farmaceutisch aanvaardbare zouten daarvan. 3. 20-deoxy-epi-17-narasin met formule 2 van het formuleblad en de farmaceutisch aanvaardbare zouten daarvan.

4. Werkwijze voor de bereiding van het deoxy-10 narasinantibioticumcomplex, zoals gedefinieerd in conclusie 1, m e t het kenmerk, dat een Streptomyces aureofaciens wordt gekweekt met praktisch dezelfde bio-synthetische eigenschappen als NRRL 11181 in een cultuur-medium, waarin aanwezig zijn assimileerbare bronnen van 15 koolhydraat, stikstof en anorganische zouten, onder onderge dompelde aerobe fermentatie-omstandigheden, totdat er een aanzienlijke hoeveelheid antibiotische activiteit is verkregen, gevolgd door winning van het antibioticumcomplex in de vorm van de zuren of in de vorm van hun farmaceutisch aan-20 vaardbare zouten.

5. Werkwijze volgens conclusie 4,' met het kenmerk , dat Streptomyces aureofaciens het organisme is, dat is aangegeven als NRRL 11181.

6. Werkwijze volgens conclusie 4 of 5, met 25 het kenmerk, dat het deoxynarasinantibioticum- complex, of de farmaceutisch aanvaardbare zouten daarvan, worden geïsoleerd uit het cultuurmedium.

7. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk , dat 20-deoxynarasin, 20-deoxy-epi-17-nara- 30 sin of een farmaceutisch aanvaardbaar zout daarvan, wordt geïsoleerd uit het deoxynarasinantibioticumcomplex.

8. Werkwijze voor het verbeteren van de voeder-benutting bij herkauwers, met het kenmerk, dat aan dergelijke dieren een effectieve propionaat-verho- 35 gende hoeveelheid deoxynarasinantibioticumcomplex, 20-deoxy- 790 02 1 7 narasin, 20-deoxy-epi-l7-narasin of een farmaceutisch aanvaardbaar zout daarvan, wordt toegediend.

9. Voeder voor runderen, bestaande uit veevoeder en 20-deoxynarasin, 20-deoxy-epi-l7-narasin, deoxynara- 5 sinantibioticumcomplex of een farmaceutisch aanvaardbaar zout daarvan.

10. Werkwijze voor het voorkomen of behandelen van coccidiosis bij pluimvee, met het kenmerk , dat aan pluimvee een effectieve anticocci- 10 dehoeveelheid van 20-deoxynarasin, 20-deoxy-epi-17-narasin, deoxynarasinantibioticumcomplex of een farmaceutisch aanvaardbaar zout daarvan, wordt toegediend.

11. Voeder voor pluimvee, bestaande uit pluimveevoeder en een anticoccidehoeveelheid van 20-deoxynarasin, 15 20-deoxy-epi-17-narasin, deoxynarasinantibioticumcomplex of een farmaceutisch aanvaardbaar zout daarvan.

12. Werkwijze voor het voorkomen of behandelen van varkensdysenterie, met het kenmerk, dat aan varkens een effectieve hoeveelheid 20-deoxynarasin, 20- 20 deoxy-epi-17-narasin, deoxynarasinantibioticumcomplex of een farmaceutisch aanvaardbaar zout daarvan, wordt toegediend.

13. Varkensvoeder, bestaande uit varkensvoeder en een effectieve hoeveelheid voor de bestrijding van varkensdysenterie van 20-deoxynarasin, 20-deoxy-epi-l7-narasin, 25 deoxynarasinantibioticumcomplex of een farmaceutisch aan vaardbaar zout daarvan.

14. Werkwijze voor het verhogen van de contrac-tische kracht van de hartspier in een warmbloedig zoogdier, met het kenmerk, dat parenteraal een effec- 30 tieve niet-toxische dosis van 20-deoxynarasin of een farmaceutisch aanvaardbaar zout daarvan wordt toegediend.

15. Een biologisch zuivere culture van het micro-organisme Streptomyces aureofaciens, dat geïdentificeerd is als NRRL 11181, welke culture het vermogen heeft 20-deoxy- 35 narasin of 20-deoxy-epi-17-narasin te vormen na fermentatie 7. ft O 2 1 7 t V V V tm ‘ * in een waterig voedingsmedium, waarin aanwezig zijn assimileerbare bronnen van koolhydraat/ stikstof en anorganische zouten.

16. NRRL 11181. 5 79 0 0 2 17