NL2005116A

NL2005116A - TRANSMISSION OF A SAMPLE CARRIER IN CORRELATIVE ELECTRON MICROSCOPY.

Info

Publication number: NL2005116A
Application number: NL2005116A
Authority: NL
Inventors: Reinhard Lihl; Guenter Resch
Original assignee: Leica Mikrosysteme Gmbh
Priority date: 2009-07-22
Filing date: 2010-07-20
Publication date: 2011-01-25
Also published as: DE102010021312B4; AT508017B1; NL2005116C2; DE102010021312A1; AT508017A4

Description

Titel: Overbrenging van een monsterdrager in de correlatieve elektronenmicroscopieTitle: Transfer of a sample carrier in the correlative electron microscopy

De uitvinding heeft betrekking op een vasthoudinrichting voor het vasthouden van een monsterdrager voor elektronenmicroscopie en voor de overbrenging van de monsterdrager van een lichtmicroscoop naar een cryopreparatie-inrichting voor het cryoprepareren van monsters voor elektronenmicroscopie.The invention relates to a holding device for holding a sample carrier for electron microscopy and for transferring the sample carrier from a light microscope to a cryopreparator for the cryopreparation of samples for electron microscopy.

Verder heeft de uitvinding betrekking op een werkwijze voor het overbrengen van een monsterdrager voor elektronenmicroscopie van een lichtmicroscoop naar een cryopreparatie-inrichting voor het cryoprepareren van monsters voor elektronenmicroscopie.The invention further relates to a method for transferring a sample carrier for electron microscopy from a light microscope to a cryopreparator for cryopreparation of samples for electron microscopy.

De cryo-elektronenmicroscopie heeft aangetoond bijzonder geschikt te zijn voor structuurbiologische onderzoeken. Bij deze technologie wordt een waterhoudend monster gecryofixeerd, dat wil zeggen dat deze zeer snel en onder vermijding van de vorming van ijskristallen wordt afgekoeld. De te onderzoeken objecten, bijvoorbeeld cellen, enzymen, virussen of lipide lagen, worden daardoor in een dunne verglaasde ijslaag ingebed. Het grote voordeel van de cryofixatie is dat de biologische structuren in hun natuurlijke toestand bewaard kunnen worden en in hun fysiologische omgeving onderzocht kunnen worden. Onder andere kan een biologisch proces op elk gewenst moment door cryofixatie gestopt worden en in deze verglaasde toestand in een elektronenmicroscoop onderzocht worden.Cryo-electron microscopy has shown to be particularly suitable for structural biological investigations. With this technology a water-containing sample is cryofixed, that is, it is cooled very quickly and avoiding the formation of ice crystals. The objects to be examined, for example cells, enzymes, viruses or lipid layers, are thereby embedded in a thin glazed ice layer. The major advantage of cryofixation is that the biological structures can be preserved in their natural state and can be examined in their physiological environment. Among other things, a biological process can be stopped at any desired moment by cryofixation and examined in this glazed state in an electron microscope.

Om het goede moment van de cryofixatie precies te bepalen, is de correlatieve methode tussen lichtmicroscoop en elektronenmicroscoop, ook aangeduid met CLEM (“correlative light-electron microscopy”), van groot voordeel. De correlatieve methode tussen lichtmicroscoop en elektronenmicroscoop staat toe om het biologisch monster eerst net zo lang in een lichtmicrsoscoop te observeren, tot de gewenste toestand wordt bereikt. Vervolgens wordt het monster naar een cryopreparatie-inrichting overgebracht en gecryofixeerd voor de observatie met een electro nenmicroscoop.To precisely determine the right moment of cryofixation, the correlative method between light microscope and electron microscope, also referred to as CLEM ("correlative light-electron microscopy"), is of great advantage. The correlative method between light microscope and electron microscope allows the biological sample to be first observed in a light microscope until the desired state is reached. The sample is then transferred to a cryopreparator and cryofixed for observation with an electron microscope.

Als monsters worden dikwijls celculturen gebruikt. Dikwijls groeien deze direct op de monsterdrager. CLEM maakt het mogelijk om de cellen in de levende toestand eerst in een lichtmicroscoop te onderzoeken, bepaalde cellen te selecteren respectievelijk een toestand van een cel af te wachten en deze toestand door snel invriezen vast te houden.Cell cultures are often used as samples. These often grow directly on the sample carrier. CLEM makes it possible to first examine the cells in the living state in a light microscope, to select certain cells or to await a state of a cell and to retain this state by rapid freezing.

Bij een andere correlatieve methode vindt het onderzoek met een lichtmicroscoop plaats op het reeds gecryofixeerde monster. Deze methode heeft in vergelijking met de hiervoor beschreven CLEM-methode echter het nadeel, dat het biologische monster respectievelijk de cellen niet in de levende toestand onderzocht kunnen worden.In another correlative method, the light microscope examines the sample that has already been cryofixed. However, compared to the CLEM method described above, this method has the disadvantage that the biological sample or cells cannot be examined in the living state.

Onafhankelijk van de aard van de mónsterpreparatie is het voor een met een transmissie-elektronenmicroscoop verkregen afbeelding met een hoge resolutie volstrekt noodzakelijk, dat het monster dun genoeg is. Monsters voor transmissie-elektronenmicroscopie zijn gewoonlijk 30-100 nm dik en bij voorkeur 50-80 nm dik. Bij andere methoden met een transmissie-elektronenmicroscoop (bijvoorbeeld Intermediate Voltage Transmission Electron Microscopy (IVEM)) kunnen de monsters daarentegen ook beduidend dikker zijn. Monsters met een bepaalde dikte kunnen verkregen worden door te snijden met behulp van een ultramicrotoom, waarbij een gecryofixeerd monster (cryosnede) in zeer dunne schijven wordt gesneden. Een andere preparatiemethode heeft betrekking op het aanbrengen van dunne vloeistoffilms op een drager voor elektronenmicroscopie. Hierbij wordt een dunne vloeistoffilm zeer snel ingevroren, waarbij ijskristalvorming wordt vermeden. Daarvoor wordt een drager voor elektronenmicroscopie (“netwerk”, “grid”) in een het monster bevattende vloeistof gedompeld respectievelijk wordt de monstervloeistof door middel van een pipet op de dager aangebracht, de overvloedige vloeistof wordt bijvoorbeeld met behulp van een filtreerpapier verwijderd, en de op de drager achterblijvende vloeistoffüm wordt gecryofixeerd door onderdompeling in een bad van bijvoorbeeld vloeibaar ethaan. Gecryofixeerde monsters kunnen direct in bevroren toestand in een cryo-elektronenmicroscoop onderzocht worden, doordat zij bestand zijn tegen het in de elektronenmicroscoop heersende hoogvacuüm. Bij de vriessubstitutie, welke bijvoorbeeld in octrooischrift EP 1 267 164 BI beschreven is, wordt het water in een gecryofixeerd monster uitgewisseld met een polymeer en wordt het monster, na het uitharden van de polimeer, met de ultramicrotoom op kamertemperatuur in schijven gesneden; het onderzoek met een elektronenmicroscoop vindt eveneens plaats op kamertemperatuur.Regardless of the nature of the sample preparation, a high-resolution image obtained with a transmission electron microscope requires that the sample be thin enough. Samples for transmission electron microscopy are usually 30-100 nm thick and preferably 50-80 nm thick. In other methods with a transmission electron microscope (for example, Intermediate Voltage Transmission Electron Microscopy (IVEM)), the samples can also be considerably thicker. Samples with a certain thickness can be obtained by cutting with the aid of an ultra-microtome, whereby a cryofixed sample (cryo-cut) is cut into very thin disks. Another preparation method relates to the application of thin liquid films to an electron microscopy carrier. A thin liquid film is herein frozen very quickly, whereby ice crystal formation is avoided. For this purpose, a carrier for electron microscopy ("network", "grid") is immersed in a liquid containing the sample, or the sample liquid is applied to the dawner by means of a pipette, the excess liquid is removed, for example, with the aid of a filter paper, and liquid fluid remaining on the support is cryofixed by immersion in a bath of, for example, liquid ethane. Cryofixed samples can be examined directly in a frozen state in a cryo-electron microscope because they are resistant to the high vacuum prevailing in the electron microscope. In the freeze substitution, which is described, for example, in patent EP 1 267 164 B1, the water in a cryofixed sample is exchanged with a polymer and after curing the polymer, the sample is sliced with the ultra-microtome at room temperature; the examination with an electron microscope also takes place at room temperature.

Automatische en semiautomatische cryopreparatie-inrichtingen voor het cryofixeren zijn uit de stand van de techniek bekend. Octrooischrift WO 02/077612 Al (zie ook EP 1 370 846 BI en US 020040157284) beschrijft een dergelijk inrichting, waarmee de cryopreparatie nagenoeg automatisch uitgevoerd kan worden. Deze inrichting is onder de handelsnaam Vitrobot™ op de markt. Bij dit apparaat wordt de monsterdrager in een vasthoudinrichting gefixeerd. Overtollige monstervloeistof op de drager wordt, indien nodig, met behulp van filtreerpapier afgeleid (“blotting”-proces). Aansluitend wordt het monster verglaasd door de drager snel in een koelmiddel (ethaan) onder te dompelen. Een ander apparaat van de firma Gatan (www.gatan.at) met de handelsnaam Cryoplunge™ is simpeler geconstrueerd en niet volautomatisch.Automatic and semi-automatic cryopreparators for cryofixing are known in the art. Patent WO 02/077612 A1 (see also EP 1 370 846 B1 and US 020040157284) describes such a device with which the cryopreparation can be carried out almost automatically. This device is on the market under the trade name Vitrobot ™. With this device, the sample carrier is fixed in a holding device. Excess sample liquid on the carrier is, if necessary, derived with the help of filter paper ("blotting" process). The sample is then vitrified by rapidly immersing the support in a coolant (ethane). Another device from the Gatan company (www.gatan.at) with the trade name Cryoplunge ™ is more simply constructed and not fully automatic.

Omdat biologische processen vaak zeer snel aflopen, is het bij de hierboven beschreven correlatieve methode tussen lichtmicroscoop en elektronenmicroscoop (CLEM) gewenst een snelle overbrenging van de monsterdrager van de lichtmicroscoop naar een elektronenmicroscoop te realiseren.Because biological processes often end very quickly, it is desirable in the above-described correlative method between light microscope and electron microscope (CLEM) to achieve rapid transfer of the sample carrier from the light microscope to an electron microscope.

De overbrenging van een monsterdrager van een lichtmicroscoop naar een hierboven genoemde cryopreparatie-inrichting is echter verbonden met een aanzienlijke investering van tijd. Voor deze apparaten is er ook geen speciale overbrenging van de monsterdrager van de lichtmicroscoop naar de cryopreparatie-inrichting beschikbaar. Derhalve is de overbrengtijd, welke veroorzaakt wordt door het handmatig oppakken van de monsterdrager van een lichtmicroscoop, bijvoorbeeld door middel van een pincet, voor vele onderzoeken te lang.However, the transfer of a sample carrier from a light microscope to an above-mentioned cryopreparator is associated with a considerable investment of time. For these devices, there is also no special transfer from the sample carrier from the light microscope to the cryopreparator. Therefore, the transfer time caused by manually picking up the sample carrier of a light microscope, for example by means of tweezers, is too long for many examinations.

Het is daarom een doel van de uitvinding, de nadelen uit de stand van de techniek tegen te gaan en een snelle overbrenging van de monsterdrager van de lichtmicroscoop naar de cryopreparatie-inrichting met inbegrip van het invriezen van het monster mogelijk te maken.It is therefore an object of the invention to obviate the drawbacks of the prior art and to enable rapid transfer of the sample carrier from the light microscope to the cryopreparator including the freezing of the sample.

Dit doel wordt bereikt met een hierboven genoemde vasthoudinrichting, welke overeenkomstig de uitvinding een insluitelement omvat, waarbij het insluitelement in een aan de lichtmicroscoop en een aan de cryopreparatie-inrichting gerangschikte insluitinrichting losneembaar insluitbaar is.This object is achieved with a retaining device mentioned above, which according to the invention comprises an enclosing element, the enclosing element being detachably enclosable in an enclosing device arranged on the light microscope and on the cryopreparating device.

Verder wordt dit doel bereikt met een hierboven genoemde werkwijze, welke overeenkomstig de uitvinding de volgende stappen omvat: - het bevestigen van de monsterdrager in een vasthoudinrichting, - het losneembaar insluiten van de vasthoudinrichting met de daarin vastgehouden monsterdrager door middel van een op de vasthoudinrichting gerangschikt insluitelement in een eerste insluitinrichting van de lichtmicroscoop en het met een lichtmicroscoop onderzoeken van een zich op de monsterdrager bevindend monster, - het losnemen van de vasthoudinrichting met de daarin vastgehouden monsterdrager van de insluitinrichting van de lichtmicroscoop en het overbrengen van de vasthoudinrichting naar de cryopreparatie-inrichting, en - het losneembaar insluiten van de vasthoudinrichting met de daarin vastgehouden monsterdrager door middel van het op de vasthoudinrichting gerangschikte insluitelement in een tweede insluitinrichting van de cryopreparatie-inrichting en het cryoprepareren van het monster.Furthermore, this object is achieved with an above-mentioned method, which according to the invention comprises the following steps: - attaching the sample carrier to a holding device, - releasably enclosing the holding device with the sample carrier held therein by means of a sample device arranged on the holding device. containment element in a first containment device of the light microscope and the examination with a light microscope of a sample present on the sample carrier, device, and - detachably enclosing the holding device with the sample carrier held therein by means of the containment element arranged on the holding device in a second containment device of the cryopreparator and cryopreparation of the sample.

Doordat de monsterdrager reeds gedurende het onderzoek met de lichtmicroscoop in de vasthoudinrichting is bevestigd en daarmee het oppakken van de monsterdrager tussen de beide observatiemethoden vervalt, kan de overbrengtijd dankzij de uitvinding aanzienlijk verkort worden. Na het onderzoek met de lichtmicroscoop kan de in de vasthoudinrichting bevestigde monsterdrager met het monster snel worden weggenomen door het losnemen van de insluitverbinding tussen het insluitelement en de insluitinrichting van de lichtmicroscoop, snel worden overgebracht, gefixeerd worden in de insluitinrichting van de cryopreparatie-inrichting door insluiten van de vasthoudinrichting, en ten slotte gecryofixeerd worden. De monsterdrager met het monster blijft dus de hele tijd in de vasthoudinrichting bevestigd, beginnende met het onderzoek met de lichtmicroscoop, gedurende de overbrenging van de lichtmicroscoop naar de cryopreparatie-inrichting, tot en met het invriezen in cryogeen. Dankzij de uitvinding is het mogelijk, reproduceerbaar in de lichtmicroscoop en in de cryopreparatie-inrichting te positioneren.Because the sample carrier is already mounted in the holding device during the examination with the light microscope and the picking up of the sample carrier between the two observation methods is thus eliminated, the transfer time can be considerably shortened thanks to the invention. After examination with the light microscope, the sample carrier attached to the holding device with the sample can be quickly removed by detaching the inclusion connection between the inclusion element and the inclusion device of the light microscope, quickly transferred, fixed in the inclusion device of the cryopreparation device by embedding the retaining device, and finally being cryofixed. The sample carrier with the sample thus remains attached to the retaining device all the time, starting with the examination with the light microscope, during the transfer from the light microscope to the cryopreparator, until freezing in cryogen. Thanks to the invention, it is possible to position reproducibly in the light microscope and in the cryopreparator.

De overbrengtijd zelf kan zeer kort worden gehouden en kan -afhankelijk van de afstand van de lichtmicroscoop tot de cryopreparatie-inrichting - slechts een paar seconden bedragen.The transfer time itself can be kept very short and, depending on the distance from the light microscope to the cryopreparator, can only be a few seconds.

Het begrip “monsterdrager” heeft betrekking op alle voor de elektronenmicroscopie en voor de monsterpreparatie voor elektronenmicroscopie geschikte dragers. In het bijzonder heeft het begrip “monsterdrager” betrekking op de reeds boven vermelde grids (“netdrager”, “netwerk”, “net”), waarbij de grids verschillend gevormde gaten (raten, spleten, etc.) of door een raster bepaald aantal mazen omvatten en/of van een laag film zijn voorzien (bijvoorbeeld van een laag voorziene grids van de firma Quantifoil) en/of opgedampt zijn met koolstof. Andere dragers, welke evenwel bij de cryopreparatie van monsters voor elektronenmicroscopie ingezet kunnen worden, zijn bijvoorbeeld saffierschijven zoals in octrooischrift EP 1 267 164 BI beschreven.The term "sample carrier" refers to all carriers suitable for electron microscopy and for sample preparation for electron microscopy. In particular, the term "sample carrier" refers to the grids already mentioned above ("grid carrier", "network", "net"), whereby the grids have differently shaped holes (holes, slits, etc.) or a number determined by a grid meshes and / or are film-coated (e.g., Quantifoil-coated grids) and / or are vapor-deposited with carbon. Other carriers which, however, can be used in the cryopreparation of samples for electron microscopy are, for example, sapphire discs as described in patent EP 1 267 164 B1.

De vasthoudinrichting is zo uitgevoerd, dat de gewoonlijk zeer verfijnde en kleine monsterdrager, in het bijzonder een grid (diameter 2-3 mm), zeker gefixeerd wordt. Gewoonlijk wordt een grid in zijn randgebied door een pincetgreep gefixeerd. Zeer voordelig zijn ook grids met lippen.The holding device is designed in such a way that the usually very refined and small sample carrier, in particular a grid (diameter 2-3 mm), is certainly fixed. Usually a grid is fixed in its peripheral area by a pair of tweezers. Grids with lips are also very beneficial.

Deze speciale soort monsterdragers (ook met “grid with tab”, “tabbed grid” of “handle grid” aangeduid) heeft aanvullend op de buitenste rand naast de standaard gridradius een lip, waaraan men bijvoorbeeld met een pincet kan aangrijpen.This special type of sample carriers (also referred to as "grid with tab", "tabbed grid" or "handle grid") has, in addition to the outer edge next to the standard grid radius, a lip, which can be gripped, for example, with tweezers.

Voor een lichte hantering van de vasthoudinrichting, in het bijzonder gedurende de overbrenging, welke gewoonlijk handmatig plaatsvindt, is het voordelig, wanneer de vasthoudinrichting in hoofdzaak langwerpig is uitgevoerd. Bij voorkeur is de vasthoudinrichting pincetvormig uitgevoerd.For a light handling of the retaining device, in particular during the transfer, which usually takes place manually, it is advantageous if the retaining device is substantially elongated. The retaining device is preferably made of tweezers.

Bij een voorkeursuitvoering heeft het insluitelement een eerste gebied voor het fixeren van de vasthoudinrichting in de desbetreffende insluitinrichting van de lichtmicroscoop respectievelijk de cryop reparatie -inrichting en een tweede gebied voor het inspannen bijvoorbeeld van een pincet met een zeer fijne punt. De monsterdrager wordt door middel van het pincet vastgehouden. Het pincet kan indien nodig, bijvoorbeeld bij slijtage van de pincetpunt, eenvoudig worden omgewisseld. Hoewel de hiervoor genoemde uitvoeringsvorm de voorkeur heeft, kan de vasthoudinrichting ook eendelig zijn uitgevoerd.In a preferred embodiment the containment element has a first area for fixing the retaining device in the respective containment device of the light microscope or the cryop repair device, respectively, and a second area for clamping, for example, a tweezers with a very fine tip. The sample carrier is held by means of the tweezers. The tweezers can be easily exchanged if necessary, for example when the tweezers tip is worn. Although the aforementioned embodiment is preferred, the retaining device can also be made in one piece.

De uitvinding is in het bijzonder geschikt voor de overbrenging en voor de cryop reparatie van monsters met cellen, in het bijzonder een celcultuur.The invention is particularly suitable for the transfer and for the cryop repair of samples with cells, in particular a cell culture.

Voor monsters, welke celculturen omvatten, worden meestal inverse microscopen gebruikt. De monsterdrager bevindt zich gewoonlijk in een doorzichtige cultuurhouder, bijvoorbeeld een celcultuurschaal of een petrischaal, met een dekglas als bodem. Het objectief is onder het dekglas respectievelijk de cultuurhouder gerangschikt. De rand van de cultuurhouder brengt met zich mee dat de vasthoudinrichting zich niet horizontaal uitstrekt, maar zich in een hoek tot in de cultuurhouder uitstrekt. Dit veroorzaakt problemen bij een gebruikelijke monsterdrager, doordat het oppervlak van de monsterdrager parallel en in contact met het dekglas gerangschikt moet zijn. Het is daarom bijzonder voordelig, wanneer het oppervlak van de monsterdrager in een hoek met de in hoofdzaak langwerpige vasthoudinrichting richtbaar is. Als bijzonder doelmatig voor deze uitvoeringsvorm heeft zich het gebruik van een monsterdrager met lip, in het bijzonder een grid met lip zoals boven beschreven, bewezen. Deze lip kan ofwel elastisch ofwel plastisch worden gebogen, zodat een parallelle positie van nagenoeg het gehele gridoppervlak tot het dekglas bereikt kan worden. Na het onderzoek met de lichtmicroscoop kan de vasthoudinrichting snel van de lichtmicroscoop verwijderd worden en naar de cryopreparatie-inrichting overgebracht worden. Na het invriezen kan de lip bijvoorbeeld door middel van een scalpel, scheermes of microschaar van het grid verwijderd worden en kan het grid in bevroren toestand in een monsterdrager voor de elektronenmicroscopie worden gemonteerd.For samples, which include cell cultures, inverse microscopes are usually used. The sample carrier is usually located in a transparent culture container, for example a cell culture dish or a petri dish, with a cover glass as bottom. The objective is arranged under the cover glass or the culture holder. The edge of the culture container means that the retaining device does not extend horizontally, but extends into the culture container at an angle. This causes problems with a conventional sample carrier, in that the surface of the sample carrier must be arranged in parallel and in contact with the cover glass. It is therefore particularly advantageous if the surface of the sample carrier is orientable at an angle with the substantially elongated holding device. The use of a sample carrier with lip, in particular a grid with lip as described above, has proved to be particularly effective for this embodiment. This lip can be bent either elastically or plastically, so that a parallel position can be achieved from virtually the entire grid surface to the cover glass. After the examination with the light microscope, the holding device can be quickly removed from the light microscope and transferred to the cryopreparator. After freezing, the lip can, for example, be removed from the grid by means of a scalpel, razor or micro-scissors and the grid can be mounted in a frozen state in a sample carrier for electron microscopy.

Om de monsterdrager in de lichtmicroscoop gericht en gecontroleerd het dekglas te laten benaderen, is het voordelig, wanneer de vasthoudinrichting voor het positioneren van de monsterdrager door middel van een aan de insluitinrichting van de lichtmicroscoop gerangschikte afstelinrichting in de gewenste positie bewogen wordt.In order for the sample carrier in the light microscope to approach the cover glass in a focused and controlled manner, it is advantageous if the retaining device for positioning the sample carrier is moved into the desired position by means of an adjusting device arranged on the containment device of the light microscope.

Wanneer de vasthoudinrichting in de cryopreparatie-inrichting gefixeerd is, is het gunstig als de vasthoudinrichting draaibaar is gelagerd om zijn lengteas, om het “blotten” van de gewenste kant van het net mogelijk te maken.When the retaining device is fixed in the cryopreparator, it is advantageous if the retaining device is rotatably mounted about its longitudinal axis to allow "blotting" of the desired side of the net.

Opdat de vasthoudinrichting snel en met herhaalbare precisie door middel van het insluitelement in de desbetreffende insluitinrichting bevestigd kan worden en er weer uit verwijderd kan worden, hebben de volgende koppelingsmechanismen zich in de praktijk als gunstig bewezen: Bij een eerste voordelige uitvoeringsvorm wordt het insluitelement door middel van een kogelinsluitkoppeling in de insluitinrichting ingesloten. Bij een subuitvoeringsvorm omvat het insluitelement een insluitgroef, waarin een in de betreffende insluitinrichting van de lichtmicroscoop respectievelijk de cryopreparatie-inrichting gerangschikt, geveerd koppelingsdeel (kogelinsluiting) ingesloten kan worden. Er zijn veel mogelijkheden voor de uitvoering van de opname, zoals bijvoorbeeld een zwaluwstaart- of T-vorm. Een L-vorm heeft bewezen bijzonder voordelig te zijn, omdat daarmee een montage in twee posities (180°-symmetrie) vermeden kan worden en een eenduidige positionering van de monsterdrager mogelijk wordt gemaakt. De L-vorm laat de montage maar in één positie toe. Dit heeft het voordeel, dat altijd de goede positie van de monsterdrager in acht kan worden genomen, omdat de monsterdrager zowel bij het onderzoek met de lichtmicroscoop als ook bij het “blotten” een bepaalde positie moet innemen en niet over 180° verdraaid zal worden. Fouten kunnen op deze manier worden vermeden.In order for the retaining device to be fast and repeatable with precision by means of the containment element in the respective containment device and to be removed therefrom, the following coupling mechanisms have proved themselves to be advantageous in practice: In a first advantageous embodiment the containment element is of a ball containment coupling enclosed in the containment device. In a sub-embodiment, the enclosing element comprises an enclosing groove into which a spring-mounted coupling part (ball enclosure) arranged in the relevant enclosing device of the light microscope or the cryopreparating device can be enclosed. There are many options for carrying out the recording, such as a dovetail or T-shape. An L-shape has proven to be particularly advantageous, because it can thereby prevent installation in two positions (180 ° symmetry) and enable a clear positioning of the sample carrier. The L-shape allows installation in only one position. This has the advantage that the correct position of the sample carrier can always be taken into account, because the sample carrier must take a certain position both during the examination with the light microscope and when "blotting" and will not be rotated through 180 °. Errors can be avoided in this way.

Bij een andere voordelige uitvoeringsvorm kan het insluitelement door middel van een magnetische koppeling in de insluitinrichting bevestigd worden. De uitvoeringsvorm met de kogelinsluitkoppeling wordt echter op grond van de nog hogere precisie geprefereerd.In another advantageous embodiment, the containment element can be fixed in the containment device by means of a magnetic coupling. However, the embodiment with the ball lock coupling is preferred on the basis of the even higher precision.

Hieronder wordt de uitvinding met inbegrip van andere voordelen aan de hand van een niet beperkend uitvoeringsvoorbeeld, dat in de bijgevoegde tekening is weergegeven, nader toegelicht. In de tekening toont: Fig. 1 een perspectivisch aanzicht van een vasthoudinrichting voor een monsterdrager voor elektronenmicroscopie, welke op een tafel van een lichtmicroscoop gefixeerd is,The invention, including other advantages, will be explained in more detail below with reference to a non-limiting exemplary embodiment, which is shown in the accompanying drawing. In the drawing: FIG. 1 is a perspective view of a holding device for a sample carrier for electron microscopy, which is fixed on a table of a light microscope,

Fig. 2 een cryopreparatie-inrichting in perspectivisch aanzicht met de in de cryopreparatie-inrichting gefixeerde vasthoudinrichting van Fig. 1,FIG. 2 shows a cryopreparator in perspective view with the retaining device of FIG. 1 fixed in the cryopreparator. 1

Fig. 3A een perspectivisch aanzicht van een vasthoudinrichting overeenkomstig de uitvinding,FIG. 3A is a perspective view of a holding device according to the invention,

Fig. 3B een perspectivisch aanzicht van de insluitinrichting, waarin de vasthoudinrichting van Fig. 3A volgens het kogelinsluitprincipe insluitbaar is, enFIG. 3B is a perspective view of the containment device, wherein the retaining device of FIG. 3A can be embedded in accordance with the bullet containment principle, and

Fig. 4 een doorsnee van de vasthoudinrichting van Fig. 3A en de insluitinrichting van Fig. 3B in een ineengesloten toestand.FIG. 4 is a sectional view of the holding device of FIG. 3A and the containment device of FIG. 3B in an enclosed state.

Fig. 1 toont een perspectivisch aanzicht van een vasthoudinrichting 100 voor het vasthouden en onderzoeken van een voor de cryoelektronenmicroscopie bestemd monster in een lichtmicroscoop. In het getoonde voorbeeld betreft het een celcultuurmonster. Hiervoor worden de cellen onder steriele condities in weefselcultuurhouders op monsterdragers voor elektronenmicroscopen gecultiveerd. De cellen groeien als monolaag op de monsterdragers. Voor het onderzoek met een lichtmicroscoop wordt een monsterdrager, in het getoonde voorbeeld een grid 101, weggenomen en in een op de lichtmicroscoop bevestigbare vasthoudinrichting 103 gefixeerd. Met behulp van de vasthoudinrichting 103 wordt een snellere overbrenging van het grid 101 van de lichtmicroscoop naar een cryopreparatie-inrichting (zie Fig. 2) mogelijk gemaakt. Bij het getoonde voorbeeld betreft het een inverse lichtmicroscoop.FIG. 1 shows a perspective view of a holding device 100 for holding and examining a sample intended for cryoelectron microscopy in a light microscope. In the example shown, it is a cell culture sample. For this, the cells are cultivated under sterile conditions in tissue culture containers on sample carriers for electron microscopes. The cells grow as a monolayer on the sample carriers. For the examination with a light microscope, a sample carrier, in the example shown, a grid 101, is removed and fixed in a holding device 103 that can be attached to the light microscope. With the aid of the retaining device 103 a faster transfer of the grid 101 from the light microscope to a cryopreparator (see Fig. 2) is made possible. The example shown is an inverse light microscope.

Voor een lichtere hantering is de vasthoudinrichting 103 in hoofdzaak langwerpig is uitgevoerd. De vasthoudinrichting 103 in dit uitvoeringsvoorbeeld is tweedelig uitgevoerd en omvat zowel een pincet 103a voor het fixeren van het grid 101 als een insluitelement 103b, welk enerzijds het pincet 103a opneemt en anderzijds de vasthoudinrichting 103 fixeert aan een insluitinrichting 104, welke op een tafel 108 van de lichtmicroscoop is gerangschikt. Een koppelingsmechanisme tussen het insluitelement 103 en de insluitinrichting 104 volgens het kogelinsluitprincipe is hieronder voorts weergegeven in Fig. 3A, 3B en 4.For a lighter handling, the retaining device 103 is substantially elongated. The retaining device 103 in this exemplary embodiment is of two parts and comprises both tweezers 103a for fixing the grid 101 and an enclosing element 103b, which on the one hand receives the tweezers 103a and on the other hand fixes the retaining device 103 to an enclosing device 104, which is mounted on a table 108 of the light microscope is arranged. A coupling mechanism between the containment element 103 and the containment device 104 according to the bullet containment principle is further shown below in FIG. 3A, 3B and 4.

Zoals in Fig. 1 getoond, omvat het grid 101 op zijn buitenste rand naast de standaard gridradius een lip 107, waaraan het pincet 103a kan aangrijpen. De vasthoudinrichting 103 wordt nu zodanig in de lichtmicroscoop bevestigd, dat het pincet 103a met het grid 101 zich in een zich op de tafel 108 bevindende celcultuurschaal 102 naar binnen toe uitstrekt. De rand 106 van de celcultuurschaal 102 brengt met zich mee dat de vasthoudinrichting 103 zich niet horizontaal uitstrekt, maar zich onder een hoek α (Griekse letter alfa) uitstrekt tot in de cultuurschaal 102. Het grid 101 ligt voor het onderzoek op een dekglas 102a. Het dekglas 102a vormt de bodem van de celcultuurschaal 102. Celcultuurschalen van deze soort zijn in de handel verkrijgbaar (bijvoorbeeld Fluorodish Cell Culture Dish 35 mm, glas 23 mm doorsnede, 0,17 mm dikte van de firma World Precision Instruments Ine.). De cellen op het grid 101 zijn daarbij naar het dekglas gekeerd. Het objectief (niet getoond) is onder het dekglas 102a respectievelijk de celcultuurschaal 102 gerangschikt. Om de voor het onderzoek met een lichtmicroscoop noodzakelijke parallelle positie nagenoeg van het gehele gridoppervlak tot het dekglas 102a te bereiken, wordt de door het pincet 103a vastgehouden lip 107 bijvoorkeur elastisch ten opzichte van het gridoppervlak verbogen. Voor het onderzoek met de lichtmicroscoop is het gridoppervlak dientengevolge onder een hoek ten opzichte van de lengteas (L) van de vasthoudinrichting 103 georiënteerd. Een plastische verbuiging van de lip 107 is ook denkbaar, echter wordt een elastische verbuiging geprefereerd, omdat het oppervlak van het grid 101 voor de aansluitende cryopreparatie weer in hoofdzaak parallel aan de lengteas (L) van de vasthoudinrichting 103 georiënteerd moet zijn.As in FIG. 1, the grid 101 comprises a lip 107 on its outer edge next to the standard grid radius, to which the tweezers 103a can engage. The retaining device 103 is now mounted in the light microscope such that the tweezers 103a with the grid 101 extend inwards into a cell culture dish 102 located on the table 108. The edge 106 of the cell culture dish 102 implies that the retaining device 103 does not extend horizontally, but extends at an angle α (Greek letter alpha) into the culture dish 102. The grid 101 lies on a cover glass 102a for examination. The cover glass 102a forms the bottom of the cell culture dish 102. Cell culture dishes of this kind are commercially available (e.g. Fluorodish Cell Culture Dish 35 mm, glass 23 mm diameter, 0.17 mm thickness from the company World Precision Instruments Ine.). The cells on the grid 101 are thereby facing the cover glass. The objective (not shown) is arranged below the cover glass 102a or the cell culture dish 102. In order to achieve the parallel position required for examination with a light microscope virtually from the entire grid surface to the cover glass 102a, the lip 107 held by the tweezers 103a is preferably bent elastically with respect to the grid surface. For examination with the light microscope, the grid surface is consequently oriented at an angle with respect to the longitudinal axis (L) of the holding device 103. A plastic bending of the lip 107 is also conceivable, however, an elastic bending is preferred because the surface of the grid 101 for the subsequent cryopreparation must again be oriented substantially parallel to the longitudinal axis (L) of the retaining device 103.

Om het grid 101 in de lichtmicroscoop gericht en gecontroleerd het dekglas 102a te laten benaderen en te positioneren, kunnen de vasthoudinrichting 103 en het daarin bevestigde grid 101 door middel van een op de insluitinrichting 104 van de lichtmicroscoop gerangschikte afstelinrichting 105 worden bewogen en in de gewenste positie worden gebracht.In order for the grid 101 in the light microscope to be directed and controlled to approach and position the cover glass 102a, the holding device 103 and the grid 101 mounted therein can be moved by means of an adjusting device 105 arranged on the containment device 104 of the light microscope and into the desired position.

Na het onderzoek met de lichtmicroscoop, bijvoorbeeld wanneer een gewenste biologische toestand van het monster is bereikt, kan de vasthoudinrichting snel van de lichtmicroscoop worden verwijderd door het losnemen van het insluitelement 103 van de insluitinrichting 104 en naar de cryopreparatie-inrichting overgebracht worden en gecryofixeerd worden (zie voor een gedetailleerde beschrijving Fig. 2). Na het invriezen wordt de lip 107 door middel van een scalpel, scheermes of microschaar van het grid 101 verwijderd en het grid 101 met inbegrip van het zich daarop bevindende monster in bevroren toestand in een monsterhouder voor de elektronenmicroscopie gemonteerd.After examination with the light microscope, for example when a desired biological condition of the sample has been reached, the retaining device can be quickly removed from the light microscope by detaching the containment element 103 from the containment device 104 and transferred to the cryopreparation device and being cryofixed (for a detailed description, see Fig. 2). After freezing, the lip 107 is removed from the grid 101 by means of a scalpel, razor or micro scissors and the grid 101 including the sample thereon is mounted in a frozen state in a sample holder for the electron microscopy.

Doordat de gebruiker het grid 101 makkelijk buiten de preparatiekamer met het pincet 103 kan aangrijpen, kan de vasthoudinrichting 103 handmatig snel en met herhaalbare precisie zowel op de tafel 108 van de lichtmicroscoop als ook in de cryopreparatie-inrichting bevestigd en weer verwijderd worden. Een geschikt koppelingsmechanisme volgens het kogelinsluitprincipe is hieronder uitvoeriger weergegeven in Fig. 3A, 3B en 4. Het pincet 103a kan indien nodig eveneens eenvoudig verwisseld worden.Because the user can easily grasp the grid 101 outside the preparation room with the tweezers 103, the holding device 103 can be manually and quickly and with repeatable precision attached to and removed from the light microscope table 108 as well as in the cryopreparator. A suitable coupling mechanism according to the ball enclosure principle is shown in more detail below in FIG. 3A, 3B and 4. The tweezers 103a can also be easily changed if necessary.

Fig. 2 toont een perspectivisch aanzicht van een geautomatiseerde cryopreparatie-inrichting 200 voor het prepareren van monsters voor een elektronenmicroscoop. De inrichting 200 omvat als wezenlijke componenten een klimatiseerbare preparatiekamer 201 en een koelinrichting 202, waarin zich een houder met een cryogeen bevindt. In het behuisde rugdeel 203 van de inrichting 200 zijn diverse stappenmotoren alsook een sturing ondergebracht, welke hier niet nader zijn weergegeven. In Fig. 2 bevindt zich de preparatiekamer 201 in zijn bovenste positie, waarin de vasthoudinrichting 103 met het daarin bevestigde grid 101 door middel van het insluitelement 103b in een insluitinrichting 204 in de cryopreparatie- inrichting 200 gefixeerd kan worden. Het mechanisme van het insluiten van het insluitelement 103 in de insluitinrichting 204 is dezelfde als die voor de lichtmicroscoop (zie Fig. 1). Na het fixeren van de vasthoudinrichting 103 wordt de preparatiekamer 201 met behulp van een stappenmotor naar beneden bewogen in de richting van de koelinrichting 202. De vasthoudinrichting 103 met het monster bevindt zich nu in de preparatiekamer 201. Overvloedige monstervloeistof kan - zoals hiervoor reeds beschreven - van het gridoppervlak worden verwijderd door middel van “blotten” met filtreerpapier. De vasthoudinrichting 103 is in beide richtingen 180° draaibaar om zijn lengteas L’, om het “blotten” van beide kanten toe te staan. Na het “blotting”-proces wordt het grid 101 door middel van het verticaal bewegen van de vasthoudinrichting 103 zeer snel naar beneden verplaatst in de zich onder de preparatiekamer 201 bevindende cryogeenhouder (niet weergegeven) van de koelinrichting 202, waardoor het zich op het grid lOlbevindende biologische monster (cellen) verglaasd wordt.FIG. 2 shows a perspective view of an automated cryopreparator 200 for specimen preparation for an electron microscope. The device 200 comprises as essential components a climate-controlled preparation chamber 201 and a cooling device 202, in which a container with a cryogen is located. Various stepper motors as well as a control are accommodated in the housing back part 203 of the device 200, which are not further shown here. In FIG. 2, the preparation chamber 201 is in its upper position, in which the holding device 103 with the grid 101 secured therein can be fixed by means of the containment element 103b in an containment device 204 in the cryopreparator 200. The mechanism for enclosing the enclosure element 103 in the enclosure device 204 is the same as that for the light microscope (see Fig. 1). After fixing of the holding device 103, the preparation chamber 201 is moved downwards in the direction of the cooling device 202 by means of a stepper motor. The holding device 103 with the sample is now located in the preparation chamber 201. Abundant sample liquid can - as already described above - be removed from the grid surface by means of "blotting" with filter paper. The retaining device 103 is rotatable 180 ° in both directions about its longitudinal axis L ", to allow" blotting "of both sides. After the blotting process, the grid 101 is moved very rapidly downwards by means of the vertical movement of the retaining device 103 in the cryogen container (not shown) of the cooling device 202 located below the preparation chamber 201, so that it is located on the grid 10 biological sample (cells) is vitrified.

Na het invriezen wordt het grid met het bevroren monster voor microscopie in een elektronenmicroscoop uit de vasthoudinrichting 103 losgenomen. De houder met het cryogeen is uit de inrichting 200 verwijderbaar, om het verglaasde monster in een monsterhouder voor een cryo-elektronenmicroscoop te kunnen plaatsen. Na het invriezen wordt de vasthoudinrichting opgehesen tot net boven de cryogeenhouder. In dit gebied bedraagt de gastemperatuur ongeveer -160°C. Handmatig wordt de vasthoudinrichting 103 uit het insluitmechanisme verwijderd en het grid 101 in een overbrenghouder, welke door middel van vloeibare stikstof is gekoeld en zich bij voorkeur naast de cryogeenhouder bevindt, afgelegd.After freezing, the grid with the frozen sample is removed from the holding device 103 for microscopy in an electron microscope. The cryogenic container is removable from the device 200 in order to be able to place the glazed sample in a sample container for a cryo-electron microscope. After freezing, the holding device is hoisted up to just above the cryogen container. The gas temperature in this area is approximately -160 ° C. The retaining device 103 is manually removed from the containment mechanism and the grid 101 is deposited in a transfer container which is cooled by means of liquid nitrogen and is preferably located next to the cryogen container.

Deze overbrenghouder wordt weer naar een laadstation voor cryo-elektronenmicroscoophouders (firma Gatan: www.gatan.com) getransporteerd.This transfer holder is again transported to a charging station for cryo-electron microscope holders (Gatan company: www.gatan.com).

Fig. 3A toont een perspectivisch aanzicht van de vasthoudinrichting 103. De vasthoudinrichting 103 is, zoals boven reeds uiteengezet, tweedelig geconstrueerd en omvat een pincet 103a voor het fixeren van het grid 101 (met lip 107) en ook een insluitelement 103b, welk enerzijds het pincet 103a opneemt en anderzijds in een insluitinrichting 104 van de lichtmicroscoop en ook in een insluitinrichting 204 van de cryopreparatie-inrichting 200 is in te sluiten. De insluitinrichting 104 is in Fig. 3B weergegven; de insluitinrichting 204 van de cryopreparatie-inrichting is gelijksoortig vormgegeven.FIG. 3A shows a perspective view of the retaining device 103. The retaining device 103 is, as already explained above, constructed in two parts and comprises a pair of tweezers 103a for fixing the grid 101 (with lip 107) and also an enclosing element 103b, which on the one hand the tweezers 103a and, on the other hand, can be enclosed in an enclosing device 104 of the light microscope and also in an enclosing device 204 of the cryopreparating device 200. The containment device 104 is shown in FIG. 3B; the enclosure device 204 of the cryopreparator device is similarly shaped.

De montage van de vasthoudinrichting 103 in de insluitinrichting vindt plaats door het horizontaal inschuiven van het insluitelement 103b van de vasthoudinrichting 103 in de insluitinrichting 104 (montagerichting weergegeven door middel van de peil 109). In Fig. 3A is aan de onderkant van het insluitelement 103b een hellend vlak 110 (bijvoorbeeld onder 45° afgeschuind) te zien, welk een V-vormige insluitgroef 111 omvat. De insluit groef 111 dient als insluiting voor een in de insluitinrichting 104 gerangschikt, geveerd koppelingsdeel 112 (kogelinsluiting 112). Deze is aanschouwelijk gemaakt in Fig. 4, welke de vasthoudinrichting 103 van Fig 3A en de insluitinrichting 104 in een ineengesloten toestand toont. De kogelinsluiting 112 bevindt zich in de insluitgroef 111.The mounting of the retaining device 103 in the containment device takes place by horizontally sliding the containment element 103b of the holding device 103 into the containment device 104 (mounting direction represented by the level 109). In FIG. 3A, on the underside of the containment element 103b, an inclined surface 110 (for example slanted at 45 °) can be seen, which comprises a V-shaped containment groove 111. The containment groove 111 serves as an enclosure for a spring-mounted coupling part 112 (ball enclosure 112) arranged in the enclosure device 104. This is illustrated in FIG. 4, which shows the holding device 103 of Fig. 3A and the containment device 104 in an enclosed state. The ball enclosure 112 is located in the enclosure groove 111.

Er zijn veel mogelijkheden voor de uitvoering van de opname, zoals bijvoorbeeld een zwaluwstaart- of T-vorm. In het getoonde voorbeeld is voor een L-vorm 114 gekozen, om een montage in twee posities (180°-symmetrie) te vermijden en een eenduidige positionering van het grid 101 mogelijk te maken. De L-vorm 114 laat de montage maar in één positie plaatsvinden.There are many options for carrying out the recording, such as a dovetail or T-shape. In the example shown, an L-shape 114 has been chosen in order to avoid mounting in two positions (180 ° symmetry) and to allow for unambiguous positioning of the grid 101. The L-shape 114 allows the assembly to take place in only one position.

De L-vorm 114 heeft het voordeel, dat altijd de goede positie van het grid 101 in acht kan worden genomen, omdat het grid 101 zowel bij het onderzoek met de lichtmicroscoop als ook bij het “blotten” een bepaalde positie moet innemen en niet over 180° zal worden verdraaid. Fouten kunnen op deze manier worden vermeden.The L-shape 114 has the advantage that the correct position of the grid 101 can always be taken into account, because the grid 101 must assume a certain position both during the examination with the light microscope and when "blotting" and not over Will be rotated 180 °. Errors can be avoided in this way.

In plaats van de geveerde kogelinsluiting kan als koppelingsstuk 112 ook een magnetische koppeling worden toegepast.Instead of the spring-loaded ball enclosure, a magnetic coupling can also be used as coupling piece 112.

De hierboven beschreven uitvoeringsvorm is slechts één van de vele voorbeelden en bijgevolg niet als beperkend te beschouwen.The embodiment described above is only one of many examples and, therefore, not to be regarded as limiting.

Claims

A holding device (103) for holding a sample carrier for electron microscopy (101) and for transferring the sample carrier (101) from a light microscope to a cryopreparator (200) for cryopreparating samples for an electron microscope, characterized in that the holding device (103) comprises an enclosing element (103b), the enclosing element (103b) being detachably enclosable in an enclosing device (104, 204) arranged on the light microscope and on the cryopreparator (200).

Holding device according to claim 1, characterized in that the holding device (103) is made substantially elongated.

Holding device according to claim 2, characterized in that the surface of the sample carrier (101) is orientable at an angle with respect to the substantially elongated holding device (103).

Holding device according to one of claims 1 to 3, characterized in that the holding device (103) is adapted to hold a sample carrier with a lip (107).

Holding device according to one of claims 1 to 4, characterized in that the holding device (103) is rotatably mounted in the cryopreparator (200) about a longitudinal axis (L ').

Holding device according to one of Claims 1 to 5, characterized in that the containment element (103b) can be enclosed in the containment device (104, 204) by means of a ball containment coupling (111, 112).

Holding device according to one of Claims 1 to 5, characterized in that the containment element can be enclosed in the containment device by means of a magnetic coupling.

Method for transferring from a sample microscope for electron microscopy (101) a light microscope to a cryopreparator (200) for cryopreparating samples for an electron microscope, characterized by the steps of: - mounting the sample carrier (101) in a retaining device (103); - releasably enclosing the holding device (103) with the sample carrier (101) held therein by means of an enclosing element (103b) arranged on the holding device (103) in a first enclosing device (104) of the light microscope and examining with a light microscope a sample located on the sample carrier; - detaching the holding device (103) with the sample carrier (101) retained therein from the light microscope containment device (104) and transferring the holding device (103) to the cryopreparator (200); and - releasably enclosing the holding device (103) with the sample carrier (101) held therein by means of the containment element (103b) arranged on the holding device (103) in a second containment device (204) of the cryopreparator (200) and cryopreparation of the sample.

Method according to claim 8, characterized in that a sample carrier with connecting pieces (107) is used as the sample carrier (101).

Method according to claim 8 or 9, characterized in that the holding device (103) for positioning the sample carrier (101) is moved by means of an adjustment device (105) arranged on the containment device (104) of the light microscope.

Use of a retaining device according to any of claims 1 to 7 for transferring and cryopreparating samples with cells, in particular a cell culture.