DE102010021312B4

DE102010021312B4 - Transfer of a sample carrier in correlative electron microscopy

Info

Publication number: DE102010021312B4
Application number: DE102010021312A
Authority: DE
Inventors: Dr. Lihl Reinhard; Dr. Resch Günter
Original assignee: Leica Mikrosysteme GmbH
Current assignee: Leica Mikrosysteme GmbH
Priority date: 2009-07-22
Filing date: 2010-05-22
Publication date: 2013-10-24
Anticipated expiration: 2030-05-23
Also published as: NL2005116A; DE102010021312A1; AT508017A4; AT508017B1; NL2005116C2

Abstract

Verfahren zum Kryo-Präparieren von Proben für ein Elektronenmikroskop in einer Kryopräparationsvorrichtung (200) mit vorhergehender lichtmikroskopischer Untersuchung in einem Lichtmikroskop, gekennzeichnet durch die Schritte: – Befestigen eines elektronenmikroskopischen Probenträgers (101) in einer Halteeinrichtung (103), – lösbares Einrasten der Halteeinrichtung (103) mit dem darin gehaltenen Probenträger (101) mittels eines auf der Halteeinrichtung (103) angeordneten Rastelements (103b) in einer ersten Rasteinrichtung (104) des Lichtmikroskops und lichtmikroskopische Untersuchung einer auf dem Probenträger (101) befindlichen Probe, – Lösen der Halteeinrichtung (103) mit dem darin gehaltenen Probenträger (101) von der Rasteinrichtung (104) des Lichtmikroskops und Transfer der Halteeinrichtung (103) in die Kryopräparationsvorrichtung (200), – lösbares Einrasten der Halteeinrichtung (103) mit dem darin gehaltenen Probenträger (101) mittels des auf der Halteeinrichtung (103) angeordneten Rastelements (103b) in einer zweiten Rasteinrichtung (204) der Kryopräparationsvorrichtung (200) und Kryopräparieren der Probe.Method for cryo-preparation of samples for an electron microscope in a cryopreparation apparatus (200) with a preceding light microscopic examination in a light microscope, characterized by the steps: - fixing an electron microscope sample holder (101) in a holding device (103), - detachable latching of the holding device ( 103) with the sample carrier (101) held therein by means of a latching element (103b) arranged on the holding device (103b) in a first latching device (104) of the light microscope and light microscopic examination of a sample located on the sample carrier (101), - detaching the holding device ( 103) with the sample carrier (101) held therein by the latching device (104) of the light microscope and transfer of the holding device (103) into the cryopreparation device (200), releasably engaging the holding device (103) with the sample carrier (101) held therein by means of the on the holding device g (103) arranged in a second latching means (204) of the cryopreparation device (200) and cryoproparating the sample.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Kryo-Präparieren von Proben für ein Elektronenmikroskop in einer Kryopräparationsvorrichtung mit vorhergehender lichtmikroskopischer Untersuchung in einem Lichtmikroskop.The invention relates to a method for the cryo-preparation of samples for an electron microscope in a cryopreparation apparatus with previous light microscopic examination in a light microscope.

Die Kryo-Elektronenmikroskopie hat sich als besonders geeignet für strukturbiologische Untersuchungen erwiesen. Bei dieser Technologie wird eine wasserhältige Probe kryofixiert, d. h. sie wird sehr schnell und unter Vermeidung der Bildung von Eiskristallen abgekühlt. Die zu untersuchenden Objekte, beispielsweise Zellen, Enzyme, Viren oder Lipidschichten, werden dadurch in einer dünnen vitrifizierten Eisschicht eingebettet. Der große Vorteil der Kryo-Fixierung liegt darin, dass die biologischen Strukturen in ihrem nativen Zustand erhalten und in ihrer physiologischen Umgebung untersucht werden können. Unter anderem kann ein biologischer Vorgang zu jedem beliebigen Zeitpunkt durch Kryofixierung angehalten und in diesem vitrifizierten Zustand im Elektronenmikroskop untersucht werden.Cryo-electron microscopy has proven to be particularly suitable for structural biological investigations. In this technology, a water-containing sample is cryofixed, i. H. it is cooled very quickly, avoiding the formation of ice crystals. The objects to be examined, for example cells, enzymes, viruses or lipid layers, are thereby embedded in a thin vitrified ice layer. The big advantage of cryo-fixation is that the biological structures can be kept in their native state and examined in their physiological environment. Among other things, a biological process can be stopped at any time by cryofixation and examined in this vitrifiziert state in the electron microscope.

Um den richtigen Zeitpunkt der Kryo-Fixierung genau festzulegen, ist die korrelative Methode zwischen Lichtmikroskop und Elektronenmikroskop, auch als CLEM (”correlative light-electron microscopy”) bezeichnet, von großem Vorteil. Die korrelative Methode zwischen Lichtmikroskop und Elektronenmikroskop gestattet die biologische Probe zuerst im Lichtmikroskop so lange zu beobachten, bis der gewünschte Zustand erreicht wird. Sodann wird die Probe in eine Kryopräparationsvorrichtung transferiert und für die elektronenmikroskopische Beobachtung kryofixiert.To pinpoint the right time for cryo-fixation, the correlative method between light microscopy and electron microscopy, also known as correlative light-electron microscopy (CLEM), is of great advantage. The correlative method between light microscope and electron microscope allows the biological sample to be observed first in the light microscope until the desired state is reached. The sample is then transferred to a cryopreparation apparatus and cryofixed for electron microscopic observation.

Als Proben werden häufig Zellkulturen verwendet. Häufig wachsen diese direkt auf dem Probenträger. CLEM ermöglicht es, die Zellen im lebenden Zustand zuerst im Lichtmikroskop zu untersuchen, bestimmte Zellen auszuwählen bzw. einen Zustand einer Zelle abzuwarten und diesen Zustand durch rasches Einfrieren festzuhalten.Cell cultures are often used as samples. Often these grow directly on the sample carrier. CLEM makes it possible to examine the cells in the living state first by light microscopy, to select specific cells or to wait for a state of a cell and to hold on to this state by rapid freezing.

Bei einer anderen korrelativen Methode erfolgt die lichtmikroskopische Untersuchung an der bereits kryofixierten Probe. Diese Methode hat im Vergleich zur zuvor beschriebenen CLEM-Methode jedoch den Nachteil, dass die biologische Probe bzw. die Zellen nicht im lebenden Zustand untersucht werden können.In another correlative method, the light microscopic examination is carried out on the already cryofixed sample. However, this method has the disadvantage in comparison to the previously described CLEM method that the biological sample or the cells can not be examined in the living state.

Unabhängig von der Art der Probenpräparation ist es für eine hochauflösende transmissionselektronenmikroskopische Abbildung zwingend notwendig, dass die Probe ausreichend dünn ist. Proben für das Transmissioneelektronenmikroskop sind üblicherweise 30–100 nm, vorzugsweise 50–80 nm, dick. Bei anderen transmissionselektronenmikroskopischen Methoden (z. B. Intermediate Voltage Transmission Electron Microscopy (IVEM)) können die Proben aber auch deutlich dicker sein. Proben mit definierter Dicke können durch Schneiden mittels Ultramikrotom erhalten werden, wobei eine kryofixierte Probe (Kryoschnitt) in sehr dünne Scheiben geschnitten wird. Eine andere Präparationsmethode bezieht sich auf das Aufbringen von dünnen Flüssigkeitsfilmen auf einen elektronenmikroskopischen Träger. Hier wird ein dünner Flüssigkeitsfilm sehr schnell, unter Vermeidung von Eiskristallbildung eingefroren. Dafür wird ein elektronenmikroskopischer Träger (”Netzchen”, ”Grid”) in eine die Probe enthaltende Flüssigkeit getaucht bzw. die Probenflüssigkeit wird mittels einer Pipette auf dem Träger appliziert, die überschüssige Flüssigkeit beispielsweise mittels eines Filterpapiers entfernt, und der auf dem Träger zurückbleibende Flüssigkeitsfilm durch Eintauchen in ein Bad aus beispielsweise flüssigem Ethan kryofixiert. Kryofixierte Proben können direkt im gefrorenen Zustand in einem Kryoelektronenmikroskop untersucht werden, da sie dem im Elektronenmikroskop herrschenden Hochvakuum standhalten. Bei der Gefriersubstitution, die z. B. in der EP 1 267 164 B1 beschrieben ist, wird das Wasser in einer kryofixierten Probe gegen ein Polymer ausgetauscht und die Probe nach dem Aushärten des Polymers am Ultramikrotom bei Raumtemperatur in Scheiben geschnitten; die elektronenmikroskopische Untersuchung erfolgt ebenfalls bei Raumtemperatur.Regardless of the type of sample preparation, it is imperative for a high-resolution transmission electron micrograph that the sample is sufficiently thin. Samples for the transmission electron microscope are usually 30-100 nm, preferably 50-80 nm, thick. In other transmission electron microscopy methods (eg Intermediate Voltage Transmission Electron Microscopy (IVEM)), however, the samples can also be significantly thicker. Specimens of defined thickness can be obtained by ultramicrotome cutting, whereby a cryofixed sample (cryosection) is cut into very thin slices. Another preparation method refers to the application of thin liquid films to an electron microscope carrier. Here, a thin film of liquid is frozen very quickly, avoiding the formation of ice crystals. For this purpose, an electron microscopic carrier ("grid", "grid") is immersed in a liquid containing the sample or the sample liquid is applied by means of a pipette on the carrier, the excess liquid removed, for example by means of a filter paper, and the liquid film remaining on the carrier cryofixed by immersion in a bath of, for example, liquid ethane. Cryofixed samples can be examined directly in the frozen state in a cryo-electron microscope, since they withstand the high vacuum prevailing in the electron microscope. In the freezing substitution, the z. B. in the EP 1 267 164 B1 the water is exchanged for a polymer in a cryofixed sample and the sample is sliced after the polymer has cured on the ultramicrotome at room temperature; the electron microscopic examination is also carried out at room temperature.

Automatisierte und semi-automatisierte Kryopräparationsvorrichtungen zum Kryofixieren sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die WO 02/077612 A1 (siehe auch EP 1 370 846 B1 und US 020040157284 ) offenbart eine solche Vorrichtung, mit welcher die Kryopräparation nahezu automatisiert durchgeführt werden kann. Diese Vorrichtung ist unter der Handelsbezeichnung Vitrobot^TM auf dem Markt. Bei diesem Gerät wird der Probenträger in einer Halteeinrichtung fixiert. Überschüssige Probenflüssigkeit auf dem Träger wird gegebenenfalls mit Hilfe von Filterpapier abgeleitet (”Blotting”-Vorgang). Anschließend wird die Probe durch rasches Eintauchen des Trägers in ein Kühlmittel (Ethan) vitrifiziert. Ein weiteres Gerät von der Firma Gatan (www.gatan.at) mit der Handelsbezeichnung Cryoplunge^TM ist einfacher gebaut und nicht voll automatisiert.Automated and semi-automated cryopreparation devices for cryofixing are known in the art. The WO 02/077612 A1 (see also EP 1 370 846 B1 and US 020040157284 ) discloses such a device with which the cryopreparation can be carried out almost automatically. This device is marketed under the trade name Vitrobot ^™ . In this device, the sample carrier is fixed in a holding device. Excess sample liquid on the support is optionally derived with the aid of filter paper ("blotting" process). Subsequently, the sample is vitrified by rapid immersion of the carrier in a coolant (ethane). Another device from the company Gatan (www.gatan.at) with the trade name Cryoplunge ^TM is simpler built and not fully automated.

Da biologische Vorgänge oft sehr schnell ablaufen, ist bei der oben genannten korrelativen Methode zwischen Lichtmikroskop und Elektronenmikroskop (CLEM) ein rascher Transfer des Probenträgers vom Lichtmikroskop in eine Kryopräparationsvorrichtung anzustreben.Since biological processes often take place very quickly, in the above-mentioned correlative method between light microscope and electron microscope (CLEM) a rapid transfer of the sample carrier from the light microscope into a cryopreparation device is to be aimed for.

Der Transfer eines Probenträgers von einem Lichtmikroskop in eine der oben genannten Kryopräparationsvorrichtungen ist jedoch mit erheblichem Zeitaufwand verbunden. Zu diesen Geräten gibt es auch keinen speziellen Transfer des Probenträgers vom Lichtmikroskop zur Kryopräparationsvorrichtung. Deshalb ist die Transferzeit bedingt durch das manuelle Aufnehmen des Probenträgers vom Lichtmikroskop, z. B. mittels einer Pinzette, für viele Untersuchungen zu lang.However, the transfer of a sample carrier from a light microscope into one of the above cryopreparation devices is known associated with considerable time expenditure. There is also no special transfer of the sample carrier from the light microscope to the cryopreparation device for these devices. Therefore, the transfer time is due to the manual recording of the sample carrier from the light microscope, z. B. by means of tweezers, too long for many studies.

Haltevorrichtungen für elektronenmikroskopische Probenträger sind aus der EP 2 211 163 A2 , der DE 602 20 648 T2 und der DE 10 2008 059 284 A1 bekannt. Die DE 1 886 714 U offenbart eine magnetische Pinzettenhaltevorrichtung für mikroskopische Proben. In der DE 197 31 454 A1 ist eine chirurgische Faß- und Haltezange mit einer Kugelraste beschrieben. Aus der DE 35 32 606 C1 ist eine Vorrichtung zur Metallspiegel-Kryofixation von insbesondere biologischen Objekten bekannt, wobei die Vorrichtung einen Injektor aufweist, an dem ein Objektträger befestigbar ist. Die DE 33 32 741 A1 beschreibt eine Beleuchtungsanordnung für eine Vorrichtung zur Immersions-Kryofixation, insbesondere zur Beleuchtung der Probenhalterung.Holding devices for electron microscope sample carriers are from EP 2 211 163 A2 , of the DE 602 20 648 T2 and the DE 10 2008 059 284 A1 known. The DE 1 886 714 U discloses a magnetic forceps holder for microscopic samples. In the DE 197 31 454 A1 a surgical grasping and holding forceps with a ball catch is described. From the DE 35 32 606 C1 a device for metal mirror cryofixation of particular biological objects is known, wherein the device comprises an injector, on which a slide can be fastened. The DE 33 32 741 A1 describes a lighting arrangement for a device for immersion cryofixation, in particular for illuminating the sample holder.

Es ist daher eine Aufgabe der Erfindung, die Nachteile aus dem Stand der Technik zu beseitigen und einen schnellen Transfer des Probenträgers vom Lichtmikroskop zur Kryopräparationsvorrichtung einschließlich des Einfrierens der Probe zu ermöglichen.It is therefore an object of the invention to overcome the drawbacks of the prior art and to enable a rapid transfer of the sample carrier from the light microscope to the cryopreparation device, including the freezing of the sample.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren wie eingangs genannt gelöst, welches erfindungsgemäß die folgenden Schritte umfasst:

– Befestigen eines elektronenmikroskopischen Probenträgers in einer Halteeinrichtung,
– lösbares Einrasten der Halteeinrichtung mit dem darin gehaltenen Probenträger mittels eines auf der Halteeinrichtung angeordneten Rastelements in einer ersten Rasteinrichtung des Lichtmikroskops und lichtmikroskopische Untersuchung einer auf dem Probenträger befindlichen Probe,
– Lösen der Halteeinrichtung mit dem darin gehaltenen Probenträger von der Rasteinrichtung des Lichtmikroskops und Transfer der Halteeinrichtung in die Kryopräparationsvorrichtung,
– lösbares Einrasten der Halteeinrichtung mit dem darin gehaltenen Probenträger mittels des auf der Halteeinrichtung angeordneten Rastelements in einer zweiten Rasteinrichtung der Kryopräparationsvorrichtung und Kryopräparieren der Probe.

This object is achieved by a method as mentioned at the outset, which according to the invention comprises the following steps:

Fixing an electron microscopic sample carrier in a holding device,
Detachable locking of the holding device with the sample carrier held therein by means of a latching element arranged on the holding device in a first latching device of the light microscope and light microscopic examination of a sample located on the sample carrier,
Detaching the holding device with the sample carrier held therein from the latching device of the light microscope and transferring the holding device into the cryopreparation device,
- releasable engagement of the holding device with the sample carrier held therein by means of the latching element arranged on the holding device in a second latching device of the Kryopräparationsvorrichtung and cryoproparating the sample.

Die Halteeinrichtung weist ein Rastelement auf, das in eine jeweils am Lichtmikroskop und an der Kryopräparationsvorrichtung angeordnete Rasteinrichtung lösbar einrastbar ist. Dadurch, dass der Probenträger bereits während der lichtmikroskopischen Untersuchung in der Halteeinrichtung befestigt ist und damit das Aufnehmen des Probenträgers zwischen den beiden Beobachtungsmethoden entfällt, kann die Transferzeit dank der Erfindung deutlich verkürzt werden. Nach der lichtmikroskopischen Untersuchung kann der in der Halteeinrichtung befestigte Probenträger mit der Probe durch Lösen der Rastverbindung zwischen dem Rastelement und der Rasteinrichtung des Lichtmikroskops rasch entnommen, zügig transferiert, in der Rasteinrichtung der Kryopräparationsvorrichtung durch Einrasten der Halteeinrichtung fixiert und schließlich kryofixiert werden. Der Probenträger mit der Probe bleibt also die ganze Zeit in der Halteeinrichtung befestigt, beginnend mit der lichtmikroskopischen Untersuchung, während des Transfers vom Lichtmikroskop in die Kryopräparationsvorrichtung, bis hin zum Einfrieren im Kryogen. Dank der Erfindung ist es möglich, reproduzierbar im Lichtmikroskop und in der Kryopräparationsvorrichtung zu positionieren.The holding device has a latching element which can be releasably latched into a latching device arranged in each case on the light microscope and on the cryopreparation device. Due to the fact that the sample carrier is already fastened in the holding device during the light microscopic examination and thus the picking up of the sample carrier between the two observation methods is eliminated, the transfer time can be significantly shortened thanks to the invention. After the light microscopic examination, the sample carrier fastened in the holding device can be quickly removed with the sample by releasing the latching connection between the latching element and the latching device of the light microscope, transferred quickly, fixed in the latching device of the cryopreparation device by latching the holding device and finally cryofixed. The sample carrier with the sample thus remains fixed in the holding device all the time, beginning with the light microscopic examination, during the transfer from the light microscope into the cryopreparation device, up to the freezing in the cryogen. Thanks to the invention, it is possible to reproducibly position in the light microscope and in the Kryopräparationsvorrichtung.

Die Transferzeit selbst kann sehr kurz gehalten werden und kann – in Abhängigkeit der Distanz des Lichtmikroskops von der Kryopräparationsvorrichtung – lediglich ein paar Sekunden betragen.The transfer time itself can be kept very short and can be only a few seconds, depending on the distance of the light microscope from the cryopreparation device.

Der Begriff ”Probenträger” bezieht sich auf alle für die Elektronenmikroskopie und für die elektronenmikroskopische Probenpräparation geeigneten Träger. Insbesondere bezieht sich der Begriff ”Probenträger” auf die bereits oben erwähnten Grids (”Netzträger”, ”Netzchen”, ”Netz”), wobei die Grids verschiedenartig geformte Löcher (Waben, Schlitze etc.) oder ein Gitter definierter mesh-Zahl aufweisen und/oder mit einem Film beschichtet (z. B. beschichtete Grids der Firma Quantifoil) und/oder kohlebedampft sein können. Andere Träger, die ebenfalls bei der Kryo-Präparation elektronenmikroskopischer Proben eingesetzt werden, sind z. B. Saphirscheiben wie in der EP 1 267 164 B1 beschrieben.The term "sample carrier" refers to all carriers suitable for electron microscopy and for electron microscopic sample preparation. In particular, the term "sample carrier" refers to the grids already mentioned above ("net carriers", "nets", "net"), wherein the grids have differently shaped holes (honeycombs, slits etc.) or a mesh of defined mesh numbers and or coated with a film (eg Coated Grids from Quantifoil) and / or may be carbon-coated. Other carriers that are also used in the cryo-preparation of electron microscopic samples are, for. B. sapphire discs as in the EP 1 267 164 B1 described.

Die Halteeinrichtung ist so ausgebildet, dass der üblicherweise sehr filigrane und kleine Probenträger, insbesondere ein Grid (Durchmesser 2–3 mm), sicher fixiert wird. Üblicherweise wird ein Grid in seinem Randbereich durch einen Pinzettengriff fixiert. Sehr vorteilhaft sind auch Grids mit Lasche. Diese spezielle Art von Probenträgern (auch als ”Grid with Tab”, ”Tabbed Grid” oder ”Handle Grid” bezeichnet) hat zusätzlich am äußeren Rand außerhalb des standardmäßigen Gridradius eine Lasche, an der man beispielsweise mit einer Pinzette angreifen kann.The holding device is designed so that the usually very filigree and small sample carrier, in particular a grid (diameter 2-3 mm), is securely fixed. Usually, a grid is fixed in its edge region by a pincer handle. Very advantageous are also grids with tab. This special type of sample carrier (also called "Grid with Tab", "Tabbed Grid" or "Handle Grid") has in addition to the outer edge outside the standard grid radius a tab on which you can attack, for example, with tweezers.

Für eine leichte Handhabung der Halteeinrichtung, insbesondere während des Transfers, der üblicherweise manuell erfolgt, ist es von Vorteil, wenn die Halteeinrichtung im Wesentlichen länglich ausgebildet ist. Zweckmäßigerweise ist die Halteeinrichtung pinzettenförmig ausgebildet.For easy handling of the holding device, in particular during the transfer, which is usually done manually, it is advantageous if the holding device is formed substantially elongated. Conveniently, the holding device is tweezer-shaped.

Bei einer bevorzugten Variante hat das Rastelement einen ersten Bereich zum Fixieren der Halteeinrichtung in der jeweiligen Rasteinrichtung des Lichtmikroskops bzw. der Kryopräparationsvorrichtung und einen zweiten Bereich zum Einspannen z. B. einer Pinzette mit einer sehr feinen Spitze. Der Probenträger wird mittels der Pinzette gehalten. Die Pinzette kann bei Bedarf, z. B. bei Abnutzung der Pinzettenspitze, einfach getauscht werden. Obwohl die zuvorgenannte Variante bevorzugt wird, kann die Halteeinrichtung auch einstückig ausgeführt sein.In a preferred variant, the latching element has a first region for fixing the holding device in the respective latching device of the light microscope or the Kryopräparationsvorrichtung and a second area for clamping z. As a pair of tweezers with a very fine tip. The sample carrier is held by means of tweezers. The tweezers can, if necessary, z. B. when wearing the tweezer tip, are easily replaced. Although the aforementioned variant is preferred, the holding device can also be made in one piece.

Die Erfindung ist besonders zum Transfer und zur Kryopräparation von Proben mit Zellen, insbesondere einer Zellkultur, geeignet.The invention is particularly suitable for the transfer and cryopreparation of samples with cells, in particular a cell culture.

Für Proben, welche Zellkulturen umfassen, werden meist inverse Mikroskope verwendet. Der Probenträger befindet sich üblicherweise in einem durchsichtigen Kulturgefäß, z. B. einer Zellkulturschale oder Petrischale, mit einem Deckglas als Boden. Das Objektiv ist unterhalb des Deckglases bzw. des Kulturgefäßes angeordnet. Bedingt durch den Rand des Kulturgefäßes ragt die Halteeinrichtung nicht horizontal, sondern in einem Winkel in das Kulturgefäß hinein. Dies verursacht bei einem herkömmlichen Probenträger Probleme, da die Oberfläche des Probenträgers parallel und in Berührung zum Deckglas angeordnet sein soll. Es ist daher von besonderem Vorteil, wenn die Oberfläche des Probenträgers in einem Winkel zur im Wesentlich länglichen Halteeinrichtung ausrichtbar ist. Als besonders zweckmäßig für diese Ausführungsform hat sich die Verwendung eines Probenträgers mit Lasche, insbesondere eines Grids mit Lasche wie oben beschrieben, erwiesen. Diese Lasche kann entweder elastisch oder plastisch gebogen werden, so dass eine parallele Position nahezu der gesamten Gridoberfläche zum Deckglas erreicht werden kann. Nach der lichtmikroskopischen Untersuchung kann die Halteeinrichtung rasch vom Lichtmikroskop entfernt und in die Kryopräparationsvorrichtung transferiert werden. Nach dem Einfrieren kann die Lasche z. B. mittels Skalpell, Rasierklinge oder Mikroschere vom Grid entfernt und das Grid im gefrorenen Zustand in einem Probenhalter für die Elektronenmikroskopie montiert werden.For samples comprising cell cultures, mostly inverted microscopes are used. The sample carrier is usually located in a transparent culture vessel, eg. As a cell culture dish or Petri dish, with a coverslip as the bottom. The objective is arranged below the cover glass or the culture vessel. Due to the edge of the culture vessel, the holding device does not protrude horizontally but at an angle into the culture vessel. This causes problems in a conventional sample carrier, since the surface of the sample carrier should be arranged in parallel and in contact with the cover glass. It is therefore of particular advantage if the surface of the sample carrier can be aligned at an angle to the substantially elongated holding device. As particularly useful for this embodiment, the use of a sample carrier with tab, in particular a grid with tab as described above, has been found. This tab can be bent either elastically or plastically, so that a parallel position of almost the entire grid surface can be achieved to the cover glass. After the light microscopic examination, the holding device can be quickly removed from the light microscope and transferred to the cryopreparation device. After freezing, the tab z. B. removed by means of a scalpel, razor blade or micro scissors from the grid and the grid are mounted in the frozen state in a sample holder for electron microscopy.

Um den Probenträger im Lichtmikroskop gezielt und kontrolliert an das Deckglas anzunähern, ist es von Vorteil, wenn die Halteeinrichtung zum Positionieren des Probenträgers mittels einer an der Rasteinrichtung des Lichtmikroskops angeordneten Justiereinrichtung in die gewünschte Position bewegt wird.In order to approach the sample carrier in a targeted and controlled manner to the cover glass in the light microscope, it is advantageous if the holding device for positioning the sample carrier is moved into the desired position by means of an adjusting device arranged on the latching device of the light microscope.

Wenn die Halteeinrichtung in der Kryopräparationsvorrichtung fixiert ist, dann ist es günstig, wenn die Halteeinrichtung drehbar um ihre Längsachse gelagert ist, um das Blotten von der gewünschten Seite des Netzes zu gestatten.If the holding device is fixed in the cryopreparation device, then it is favorable if the holding device is mounted rotatably about its longitudinal axis in order to allow blotting from the desired side of the net.

Damit die Halteeinrichtung rasch und mit wiederholbarer Genauigkeit mittels des Rastelements in der jeweiligen Rasteinrichtung befestigt und wieder entfernt werden kann, haben sich folgende Verschlussmechanismen in der Praxis als günstig erwiesen:
Bei einer ersten bevorzugten Variante wird das Rastelement mittels eines Kugelrast-Verschlusses in der Rasteinrichtung eingerastet. Bei einer Untervariante weist das Rastelement eine Rastnut auf, in welche ein in der jeweiligen Rasteinrichtung des Lichtmikroskops bzw. der Kryopräparationsvorrichtung angeordnetes, gefedertes Verschlussstück (Kugelrast) einrasten kann. Für die Ausgestaltung der Aufnahme gibt es viele Möglichkeiten, wie beispielsweise Schwalbenschwanz- oder T-Form. Als besonders vorteilhaft hat sich eine L-Form erwiesen, weil damit eine Montage in zwei Positionen (180°-Symmetrie) vermieden werden kann und eine eindeutige Positionierung des Probenträgers ermöglicht wird. Die L-Form gestattet die Montage nur in einer Position. Dies hat den Vorteil, dass immer die richtige Position des Probenträgers eingehalten werden kann, da der Probenträger sowohl bei der lichtmikroskopischen Untersuchung als auch beim Blotten eine bestimmte Position einnehmen muss und nicht um 180° verdreht werden soll. Fehler können auf diesem Weg vermieden werden.So that the holding device can be fastened and removed again quickly and with repeatable accuracy by means of the latching element in the respective latching device, the following latching mechanisms have proven to be favorable in practice:
In a first preferred variant, the latching element is latched by means of a ball catch in the latching device. In a sub-variant, the latching element has a latching groove, into which a spring-loaded closure piece (ball catch) arranged in the respective latching device of the light microscope or the cryopreparation device can engage. For the design of the recording, there are many possibilities, such as dovetail or T-shape. An L-shape has proven to be particularly advantageous, because assembly in two positions (180 ° symmetry) can thus be avoided and a clear positioning of the sample carrier is made possible. The L-shape allows mounting in only one position. This has the advantage that always the correct position of the sample carrier can be adhered to, since the sample carrier must occupy a certain position both during the light microscopic examination and during blotting and should not be rotated by 180 °. Errors can be avoided in this way.

Bei einer weiteren vorteilhaften Variante kann das Rastelement mittels eines magnetischen Verschlusses in der Rasteinrichtung befestigt sein. Die Variante mit dem Kugelrast-Verschluss wird jedoch aufgrund der noch höheren Genauigkeit bevorzugt.In a further advantageous variant, the latching element can be fastened by means of a magnetic closure in the latching device. However, the variant with the ball detent closure is preferred because of the even higher accuracy.

Im Folgenden wird die Erfindung samt weiteren Vorzügen anhand eines nicht einschränkenden Ausführungsbeispiels erläutert, das in den beigefügten Zeichnungen dargestellt ist. Die Zeichnungen zeigen:In the following, the invention, together with further advantages, will be explained by way of non-limiting example, which is illustrated in the accompanying drawings. The drawings show:

1 eine perspektivische Ansicht einer Halteeinrichtung für einen elektronenmikroskopischen Probenträger, welche am Tisch eines Lichtmikroskops fixiert ist, 1 a perspective view of a holding device for an electron microscope sample carrier, which is fixed to the table of a light microscope,

2 eine Kryopräparationsvorrichtung in perspektivischer Ansicht mit in der Kryopräparationsvorrichtung fixierter Halteeinrichtung der 1, 2 a cryopreparation device in perspective view with fixed in the cryopreparation device holding the 1 .

3A eine perspektivische Ansicht einer Halteeinrichtung zur Anwendung im erfindungsgemäßen Verfahren, 3A a perspective view of a holding device for use in the method according to the invention,

3B eine perspektivische Ansicht der Rasteinrichtung, in welche die Halteeinrichtung der 3A nach dem Kugelrast-Prinzip einrastbar ist, und 3B a perspective view of the locking device, in which the holding device of 3A can be latched according to the ball catch principle, and

4 einen Schnitt durch die Halteeinrichtung der 3A und die Rasteinrichtung der 3B im eingerasteten Zustand. 4 a section through the holding device of 3A and the latching device of 3B in the locked state.

Die 1 zeigt eine perspektivische Ansicht einer Halteanordnung 100 zum Halten und Untersuchen von für die Kryoelektronenmikroskopie bestimmten Proben in einem Lichtmikroskop. Im gezeigten Beispiel handelt es sich um eine Zellkulturprobe. Hierfür werden die Zellen in Gewebekulturbehältnissen auf elektronenmikroskopischen Probenträgern unter sterilen Bedingungen kultiviert. Die Zellen wachsen als Monolayer auf den Probenträgern. Für die lichtmikroskopische Untersuchung wird ein Probenträger, im gezeigten Beispiel ein Grid 101, entnommen und in einer am Lichtmikroskop befestigbaren Halteeinrichtung 103 fixiert. Mit Hilfe der Halteeinrichtung 103 wird ein schneller Transfer des Grids 101 von dem Lichtmikroskop in eine Kryopräparationsvorrichtung (siehe 2) ermöglicht. Beim gezeigten Beispiel handelt es sich um ein inverses Lichtmikroskop. The 1 shows a perspective view of a holding arrangement 100 for holding and examining specimens for cryo-electron microscopy in a light microscope. The example shown is a cell culture sample. For this purpose, the cells are cultured in tissue culture containers on electron microscopic slides under sterile conditions. The cells grow as monolayers on the slides. For the light microscopic examination, a sample carrier, in the example shown a grid 101 , taken and in a fastened to the light microscope holding device 103 fixed. With the help of the holding device 103 will be a quick transfer of the grid 101 from the light microscope into a cryopreparation device (see 2 ). The example shown is an inverted light microscope.

Zur leichteren Handhabung ist die Halteeinrichtung 103 im Wesentlichen länglich ausgebildet. Die Halteeinrichtung 103 in diesem Ausführungsbeispiel ist zweiteilig ausgeführt und umfasst eine Pinzette 103a zum Fixieren des Grids 101 sowie ein Rastelement 103b, das einerseits die Pinzette 103a aufnimmt und andererseits die Halteeinrichtung 103 an einer Rasteinrichtung 104, welche am Tisch 108 des Lichtmikroskops angeordnet ist, fixiert. Ein Verschlussmechanismus zwischen dem Rastelement 103 und der Rasteinrichtung 104 nach dem Kugelrast-Prinzip ist weiter unten in den 3A, 3B und 4 näher dargestellt.For easier handling, the holding device 103 essentially elongated. The holding device 103 in this embodiment is made in two parts and includes tweezers 103a for fixing the grid 101 and a locking element 103b on the one hand the tweezers 103a on the other hand, the holding device 103 on a latching device 104 , which at the table 108 of the light microscope is fixed. A locking mechanism between the locking element 103 and the latching device 104 after the ball catch principle is further down in the 3A . 3B and 4 shown in more detail.

Wie in der 1 gezeigt, weist das Grid 101 auf seinem äußeren Rand außerhalb des standardmäßigen Gridradius eine Lasche 107 auf, an der die Pinzette 103a angreifen kann. Die Halteeinrichtung 103 wird nun so im Lichtmikroskop befestigt, dass die Pinzette 103a mit dem Grid 101 in eine auf dem Tisch 108 befindliche Zellkulturschale 102 hineinragt. Bedingt durch den Rand 106 der Zellkulturschale 102 ragt die Halteeinrichtung 103 nicht horizontal, sondern in einem Winkel α (griechischer Buchstabe alpha) in die Zellkulturschale 102 hinein. Das Grid 101 liegt für die Untersuchung auf einem Deckglas 102a auf. Das Deckglas 102a bildet den Boden der Zellkulturschale 102. Zellkulturschalen dieser Art sind im Handel erhältlich (z. B. Fluorodish Cell Culture Dish 35 mm, Glas 23 mm Durchmesser, 0.17 mm Dicke von der Firma World Precision Instruments Inc.). Die Zellen auf dem Grid 101 sind dabei dem Deckglas zugewandt. Das Objektiv (nicht gezeigt) ist unterhalb des Deckglases 102a bzw. der Zellkulturschale 102 angeordnet. Um die für die lichtmikroskopische Untersuchung erforderliche parallele Position nahezu der gesamten Gridoberfläche zum Deckglas 102a zu erreichen, wird die von der Pinzette 103a gehaltene Lasche 107 vorzugsweise elastisch in Bezug auf die Gridoberfläche verbogen. Für die lichtmikroskopische Untersuchung ist die Gridoberfläche folglich in einem Winkel zur Längsachse (L) der Halteeinrichtung 103 orientiert. Ein plastisches Verbiegen der Lasche 107 ist ebenso denkbar, allerdings wird ein elastisches Verbiegen bevorzugt, da die Oberfläche des Grids 101 für die anschließende Kryopräparation wieder im Wesentlichen parallel zur Längsachse (L) der Halteeinrichtung 103 orientiert sein sollte.Like in the 1 shown points the grid 101 a tab on its outer edge outside the default grid radius 107 on, on the tweezers 103a can attack. The holding device 103 is now attached to the light microscope so that the tweezers 103a with the grid 101 in one on the table 108 cell culture dish 102 protrudes. Due to the edge 106 the cell culture dish 102 protrudes the holding device 103 not horizontal, but at an angle α (Greek letter alpha) in the cell culture dish 102 into it. The grid 101 lies on a coverslip for examination 102 on. The cover glass 102 forms the bottom of the cell culture dish 102 , Cell culture dishes of this type are commercially available (eg Fluorodish Cell Culture Dish 35 mm, glass 23 mm diameter, 0.17 mm thickness from World Precision Instruments Inc.). The cells on the grid 101 are facing the cover glass. The lens (not shown) is below the coverslip 102 or the cell culture dish 102 arranged. To the required for the light microscopic examination parallel position of almost the entire grid surface to the cover glass 102 To reach, the tweezers 103a held tab 107 preferably elastically bent with respect to the grid surface. For the light microscopic examination, the grid surface is therefore at an angle to the longitudinal axis (L) of the holding device 103 oriented. A plastic bending of the tab 107 is also conceivable, however, an elastic bending is preferred because the surface of the grid 101 for the subsequent cryopreparation again substantially parallel to the longitudinal axis (L) of the holding device 103 should be oriented.

Um das Grid 101 im Lichtmikroskop gezielt und kontrolliert an das Deckglas 102a anzunähern und zu positionieren, können die Halteeinrichtung 103 und das darin befestigte Grid 101 mittels einer an der Rasteinrichtung 104 des Lichtmikroskops angeordneten Justiereinrichtung 105 bewegt und in die gewünschte Position gebracht werden.To the grid 101 targeted and controlled to the cover glass in a light microscope 102 approach and position, the holding device 103 and the grid attached to it 101 by means of a on the locking device 104 of the light microscope arranged adjusting device 105 moved and placed in the desired position.

Nach der lichtmikroskopischen Untersuchung, z. B. wenn ein gewünschter biologischer Zustand der Probe erreicht ist, kann die Halteeinrichtung rasch durch Lösen des Rastelements 103 von der Rasteinrichtung 104 vom Lichtmikroskop entfernt und in die Kryopräparationsvorrichtung transferiert und kryofixiert werden (detaillierte Beschreibung siehe 2). Nach dem Einfrieren wird die Lasche 107 mittels Skalpell, Rasierklinge oder Mikroschere vom Grid 101 entfernt und das Grid 101 samt der darauf befindlichen Probe im gefrorenen Zustand in einem Probenhalter für die Elektronenmikroskopie montiert.After light microscopic examination, z. B. when a desired biological state of the sample is reached, the holding device can quickly by releasing the locking element 103 from the latching device 104 removed from the light microscope and transferred to the cryopreparation apparatus and cryofixed (for a detailed description see 2 ). After freezing, the tab becomes 107 using a scalpel, razor blade or micro scissors from the grid 101 removed and the grid 101 together with the sample thereon in the frozen state mounted in a sample holder for electron microscopy.

Damit der Bediener das Grid 101 bequem außerhalb der Präparationskammer mit der Pinzette 103a erfassen kann, kann die Halteeinrichtung 103 manuell rasch und mit wiederholbarer Genauigkeit sowohl am Tisch 108 des Lichtmikroskops als auch in der Kryopräparationsvorrichtung befestigt und wieder entfernt werden. Ein geeigneter Verschlussmechanismus nach dem Kugelrast-Prinzip ist weiter unten in den 3A, 3B und 4 näher dargestellt. Die Pinzette 103a kann bei Bedarf ebenfalls einfach getauscht werden.So that the operator the grid 101 conveniently outside the preparation chamber with tweezers 103a can capture, the holding device 103 manually quickly and with repeatable accuracy both at the table 108 attached to the light microscope and in the cryopreparation and removed again. A suitable locking mechanism according to the ball catch principle is further down in the 3A . 3B and 4 shown in more detail. The tweezers 103a can also be easily replaced if necessary.

Die 2 zeigt eine perspektivische Ansicht einer automatisierten Kryopräparationsvorrichtung 200 zum Präparieren von Proben für ein Elektronenmikroskop. Die Vorrichtung 200 weist als wesentliche Komponenten eine klimatisierbare Präparationskammer 201 und eine Kühleinrichtung 202, in welcher sich ein Behältnis mit einem Kryogen befindet, auf. Im verschalten Rückenteil 203 der Vorrichtung 200 sind diverse Schrittmotoren sowie eine Steuerung untergebracht, die hier nicht näher dargestellt sind. In der 2 befindet sich die Präparationskammer 201 in ihrer oberen Position, in welcher die Halteeinrichtung 103 mit dem darin befestigten Grid 101 mittels des Rastelements 103b in einer Rasteinrichtung 204 in der Kryopräparationsvorrichtung 200 fixiert werden kann. Der Mechanismus des Einrastens des Rastelements 103 in die Rasteinrichtung 204 ist derselbe wie jener für das Lichtmikroskop (siehe 1). Nach dem Fixieren des Halteelements 103 wird die Präparationskammer 201 mit Hilfe eines Schrittmotors nach unten zur Kühleinrichtung 202 bewegt. Die Halteeinrichtung 103 mit der Probe befindet sich nunmehr in der Präparationskammer 201. Überschüssige Probenflüssigkeit kann – wie zuvor bereits beschrieben – durch Blotten mit Filterpapier von der Gridoberfläche entfernt werden. Die Halteeinrichtung 103 ist um 180° in beide Richtungen um ihre Längsachse L' drehbar, um das Blotten von beiden Seiten zu gestatten. Nach dem Blotting-Vorgang wird das Grid 101 sehr schnell durch vertikales Bewegen der Halteeinrichtung 103 nach unten in den unter der Präparationskammer 201 befindlichen Kryogenbehälter (nicht dargestellt) der Kühleinrichtung 202 abgesenkt, wodurch die auf dem Grid 101 befindliche biologische Probe (Zellen) vitrifiziert wird.The 2 shows a perspective view of an automated cryopreparation device 200 for preparing samples for an electron microscope. The device 200 has as essential components an air-conditioned preparation chamber 201 and a cooling device 202 in which there is a container with a cryogen on. In the interconnected back section 203 the device 200 are various stepper motors and a controller housed, which are not shown here. In the 2 there is the preparation chamber 201 in its upper position, in which the holding device 103 with the grid attached to it 101 by means of the latching element 103b in a latching device 204 in the cryopreparation device 200 can be fixed. The mechanism of engagement of the locking element 103 in the locking device 204 is the same as that for the light microscope (see 1 ). After fixing the retaining element 103 becomes the preparation chamber 201 with the help of a stepper motor down to the cooling device 202 emotional. The holding device 103 with the sample is now in the preparation chamber 201 , Excess sample liquid can - as previously described - be removed by blotting with filter paper from the grid surface. The holding device 103 is rotatable 180 ° in both directions about its longitudinal axis L 'to permit blotting from both sides. After blotting, the grid becomes 101 very quickly by moving the holding device vertically 103 down into the under the preparation chamber 201 located cryogenic container (not shown) of the cooling device 202 lowered, causing the on the grid 101 located biological sample (cells) is vitrifiziert.

Nach dem Einfrieren wird das Grid mit der gefrorenen Probe zum Mikroskopieren im Elektronenmikroskop aus der Halteeinrichtung 103 gelöst. Das Behältnis mit dem Kryogen ist aus der Vorrichtung 200 entfernbar, um die vitrifizierte Probe in eine Probenhalterung für ein Kryo-Elektronenmikroskop einsetzen zu können. Nach dem Einfrieren wird die Halteeinrichtung bis knapp oberhalb des Kryogenbehälters angehoben. In diesem Bereich beträgt die Gastemperatur etwa –160°C. Manuell wird die Haltevorrichtung 103 aus dem Rastmechanismus entfernt und das Grid 101 in einen Transferbehälter, der sich, mittels flüssigem Stickstoff gekühlt, vorzugsweise neben dem Kryogenbehälter befindet, abgelegt. Dieser Tranferbehälter wiederum wird zu einer Ladestation für Kryoelektronenmikroskophalter (Firma Gatan: www.gatan.com) transportiert.After freezing, the grid with the frozen sample for microscopy in the electron microscope from the holding device 103 solved. The container with the cryogen is out of the device 200 Removable to use the vitrified sample in a sample holder for a cryo-electron microscope. After freezing, the holding device is raised to just above the cryogenic container. In this area, the gas temperature is about -160 ° C. Manually the holding device 103 removed from the latching mechanism and the grid 101 in a transfer container, which is cooled by means of liquid nitrogen, preferably located next to the cryogenic container stored. This transfer container, in turn, is transported to a charging station for cryoelectron microscope holders (Gatan: www.gatan.com).

Die 3A zeigt eine perspektivische Ansicht der Halteeinrichtung 103. Die Halteeinrichtung 103 ist, wie oben bereits ausgeführt, zweiteilig aufgebaut und umfasst eine Pinzette 103a zum Fixieren des Grids 101 (mit Lasche 107) sowie ein Rastelement 103b, das einerseits die Pinzette 103a aufnimmt und andererseits in einer Rasteinrichtung 104 des Lichtmikroskops sowie in einer Rasteinrichtung 204 der Kryopräparationsvorrichtung 200 einrastbar ist. Die Rasteinrichtung 104 ist in der 3B dargestellt; die Rasteinrichtung 204 der Kryopräparationseinrichtung ist gleichartig gestaltet.The 3A shows a perspective view of the holding device 103 , The holding device 103 is, as stated above, constructed in two parts and includes tweezers 103a for fixing the grid 101 (with tab 107 ) and a locking element 103b on the one hand the tweezers 103a receives and on the other hand in a locking device 104 the light microscope and in a locking device 204 the cryopreparation device 200 is latched. The locking device 104 is in the 3B shown; the latching device 204 The cryopreparation device is designed identically.

Die Montage der Halteeinrichtung 103 in die Rasteinrichtung erfolgt durch horizontales Einschieben des Rastelements 103b der Halteeinrichtung 103 in die Rasteinrichtung 104 (Montagerichtung durch den Pfeil 109 dargestellt). In der 3A ist an der Oberseite des Rastelements 103b eine geneigte Ebene 110 (z. B. um 45° abgeschrägt) zu sehen, welche eine V-förmige Rastnut 111 aufweist. Die Rastnut 111 dient als Rastung für ein in der Rasteinrichtung 104 angeordnetes, gefedertes Verschlussstück 112 (Kugelrast 112). Dies ist in der 4 veranschaulicht, welche die Halteeinrichtung 103 der 3A und die Rasteinrichtung 104 im eingerasteten Zustand zeigt. Die Kugelrast 112 befindet sich in der Rastnut 111.The mounting of the holding device 103 in the locking device is carried out by horizontal insertion of the locking element 103b the holding device 103 in the locking device 104 (Mounting direction by the arrow 109 shown). In the 3A is at the top of the locking element 103b a sloping plane 110 (For example, beveled at 45 °) to see what a V-shaped locking groove 111 having. The locking groove 111 serves as a detent for a in the locking device 104 arranged, spring-loaded closure piece 112 (Ball locking 112 ). This is in the 4 illustrates which the holding device 103 of the 3A and the latching device 104 in the locked state shows. The ball catch 112 is located in the locking groove 111 ,

Für die Ausgestaltung der Aufnahme 113 gibt es viele Möglichkeiten, wie beispielsweise Schwalbenschwanz- oder T-Form. Im gezeigten Beispiel wurde eine L-Form 114 gewählt, um eine Montage in zwei Positionen (180°-Symmetrie) zu vermeiden und eine eindeutige Positionierung des Grids 101 zu ermöglichen. Die L-Form 114 gestattet die Montage nur in einer Position. Die L-Form 114 hat den Vorteil, dass immer die richtige Position des Grids 101 eingehalten werden kann, da das Grid 101 sowohl bei der lichtmikroskopischen Untersuchung als auch beim Blotten eine bestimmte Position einnehmen muss und nicht um 180° verdreht werden soll. Fehler können auf diesem Weg vermieden werden.For the design of the recording 113 There are many possibilities, such as dovetail or T-shape. In the example shown became an L-shape 114 chosen to avoid mounting in two positions (180 ° symmetry) and a clear positioning of the grid 101 to enable. The L shape 114 allows mounting only in one position. The L shape 114 has the advantage of getting the right position of the grid 101 can be met, since the grid 101 both in the light microscopic examination and in blotting a certain position must take and should not be rotated by 180 °. Errors can be avoided in this way.

Anstelle der gefederten Kugelrast kann als Verschlussstück 112 auch ein magnetischer Verschluss verwendet werden.Instead of the sprung ball catch can as a closure piece 112 also a magnetic closure can be used.

Die oben beschriebene Verwirklichung ist nur ein Beispiel unter vielen und folglich nicht als einschränkend zu betrachten.The realization described above is just one example among many, and therefore not restrictive.

Claims

Method for cryo-preparing samples for an electron microscope in a cryopreparation device ( 200 ) with a previous light microscopic examination in a light microscope, characterized by the steps: - fixing an electron microscope sample carrier ( 101 ) in a holding device ( 103 ), - releasable engagement of the holding device ( 103 ) with the sample carrier held therein ( 101 ) by means of a holding device ( 103 ) arranged locking element ( 103b ) in a first latching device ( 104 ) of the light microscope and light microscopic examination of one on the sample carrier ( 101 ), - releasing the holding device ( 103 ) with the sample carrier held therein ( 101 ) of the latching device ( 104 ) of the light microscope and transfer of the holding device ( 103 ) into the cryopreparation device ( 200 ), - releasable engagement of the holding device ( 103 ) with the sample carrier held therein ( 101 ) by means of the on the holding device ( 103 ) arranged locking element ( 103b ) in a second latching device ( 204 ) of the cryopreparation device ( 200 ) and cryoproparating the sample.

Method according to claim 1, characterized in that as a sample carrier ( 101 ) a sample carrier with tab ( 107 ) is used.

Method according to claim 1 or 2, characterized in that the holding device ( 103 ) to the Positioning the sample carrier ( 101 ) by means of a on the locking device ( 104 ) of the light microscope arranged adjusting device ( 105 ) is moved.

Method according to one of claims 1 to 3, characterized in that the holding device ( 103 ) is formed substantially elongated, wherein the surface of the sample carrier ( 101 ) at an angle to the substantially elongated holding device ( 103 ) is aligned.

Method according to one of claims 1 to 4, characterized in that the latching element ( 103b ) by means of a ball catch ( 111 . 112 ) in the latching device ( 104 . 204 ) is engaged.

Method according to one of claims 1 to 4, characterized in that the latching element is latched by means of a magnetic closure in the latching device.