NL1023602C2

NL1023602C2 - Process for the preparation of an amino acid-containing solution and the use of such a solution.

Info

Publication number: NL1023602C2
Application number: NL1023602A
Authority: NL
Inventors: Sanjay Rastogi
Original assignee: Univ Eindhoven Tech
Priority date: 2003-06-05
Filing date: 2003-06-05
Publication date: 2004-12-07
Also published as: WO2004107874A1

Description

m mm m

Korte aanduiding: Werkwijze voor het bereiden van een aminozuren bevattende oplossing en de toepassing van een dergelijke oplossing.Brief description: Process for the preparation of an amino acid-containing solution and the use of such a solution.

5 De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het bereiden van een aminozuren bevattende oplossing, alsmede op een door middel van een dergelijke werkwijze verkregen oplossing. Verder heeft de onderhavige uitvinding betrekking op de bijzondere toepassing van de aminozuren bevattende oplossing.The present invention relates to a method for preparing an amino acid-containing solution, as well as to a solution obtained by such a method. Furthermore, the present invention relates to the particular use of the amino acid-containing solution.

10 Een dergelijke werkwijze is op zich bekend uit het Britse octrooi 828.978 waarbij esters van aminozuren en van peptiden worden bereid, omvattende het verwarmen van een mengsel dat proteïnen, een organisch sulfonzuur en een alcohol met ten minste een waterstofatoom gebonden aan een hydroxyl groep dragend koolstofatoom bevat, waarbij ten 15 gevolge van een dergelijke behandeling zelfs onoplosbare proteïnen, zoals veren, in alcohol oplosbaar worden gemaakt. Door het verwarmen van het hiervoor beschreven mengsel worden de proteïnemoleculen in kleinere fragmenten opgesplitst en op hetzelfde moment worden de carboxylgroepen veresterd. Het aldus veresterde hydrolysemengsel kan van het voor de 20 hydrolyse toegepaste zuur worden ontdaan, en de aminozuuresters en peptidenesters worden met organische oplosmiddelen afgescheiden. Een nadeel van een dergelijke werkwijze is de toepassing van aanvullende chemicaliën.Such a method is known per se from British patent 828,978 in which esters of amino acids and of peptides are prepared, comprising of heating a mixture comprising proteins, an organic sulfonic acid and an alcohol with at least one hydrogen atom bonded to a hydroxyl group-bearing carbon atom wherein, as a result of such a treatment, even insoluble proteins, such as feathers, are made alcohol-soluble. By heating the above-described mixture, the protein molecules are split into smaller fragments and at the same time the carboxyl groups are esterified. The thus-esterified hydrolysis mixture can be stripped of the acid used for the hydrolysis, and the amino acid esters and peptide esters are separated with organic solvents. A drawback of such a method is the use of additional chemicals.

In de pluimveesector zijn veren belangrijke afvalproducten, 25 waarbij kan worden opgemerkt dat in de periode 1997/1998 wereldwijd meer dan 4 miljoen ton veren beschikbaar waren. Deze veren bestaan voor 99% uit structurele eiwitten, keratines. Na hydrolyse van deze eiwitten wordt verenmeel verkregen dat als additief in veevoeder kan worden toegepast.In the poultry sector, feathers are important waste products, 25 and it can be noted that in the period 1997/1998 more than 4 million tonnes of feathers were available worldwide. These springs consist for 99% of structural proteins, keratins. After hydrolysis of these proteins, feather flour is obtained which can be used as an additive in animal feed.

Aldus is uit de Japanse octrooi publicatie JP 61040753 een 30 methode voor de bereiding van verenmeel bekend, waarbij veren met een watergehalte van ongeveer 70 gew.% van de intensieve pluimvee-industrie 1023602 Η Η I worden verzameld en vervolgens ondergedompeld in heet water. Na het I onderdompelen wordt het aldus verkregen mengsel bij normale druk aan eenThus, Japanese patent publication JP 61040753 discloses a method for the preparation of feather flour in which feathers with a water content of approximately 70% by weight of the intensive poultry industry 1023602 onder Η I are collected and subsequently immersed in hot water. After the immersion, the mixture thus obtained is subjected to a normal pressure at a pressure

warmtebehandeling bij een temperatuur van ongeveer 100-110 ‘Cheat treatment at a temperature of approximately 100-110 "C

I onderworpen. Ten gevolge van een dergelijke behandeling worden de veren I 5 zacht gemaakt en gelijktijdig gekneed en van water ontdaan door I samenpersing tot een watergehalte kleiner dan 40 gew.% wordt bereikt.I subject. As a result of such a treatment, the springs are softened and simultaneously kneaded and de-watered by compression until a water content of less than 40% by weight is achieved.

I Aansluitend worden de gedehydrateerde veren onder een druk van 3-4 kg/cm2 I bij een temperatuur van 140-150 *C verwarmd waardoor hydrolyse van proteïnen plaatsvindt. Aansluitend wordt het eindproduct gedroogd en I 10 gemalen.The dehydrated springs are then heated under a pressure of 3-4 kg / cm 2 at a temperature of 140-150 ° C, whereby hydrolysis of proteins takes place. The final product is then dried and milled.

Tevens is uit de Japanse octrooi publicatie JP 60083542 een I methode voor het verkrijgen van een hoge kwaliteit verenmeel bekend, I waarbij de veren naar een gesloten autoclaaf worden toegevoerd, welke I autoclaaf is voorzien van een mantel waaraan hete stoom wordt toegediend.Japanese patent publication JP 60083542 also discloses a method for obtaining a high-quality feather flour, wherein the springs are supplied to a closed autoclave, which autoclave is provided with a jacket to which hot steam is applied.

I 15 Het in de veren aanwezige water ontwijkt als stoom, en de veren worden I door middel van stoom gehydrolyseerd. In deze toestand wordt een I dierlijke of plantaardige olie bij normale temperatuur als mist aan de I autoclaaf toegevoerd, waarna de hoge temperatuur stoom in de autoclaaf I wordt afgekoeld, gecondenseerd, vloeibaar gemaakt, en de druk in de 20 autoclaaf wordt teruggebracht. De door uitwisseling met stoom verwarmde I olie zal in het verenweefsel binnendringen en het in het verenweefsel I resterende water vervangen, waardoor de veren worden gedroogd ter I verkrijging van het gewenste verenmeel. Een nadeel van een dergelijke I methode is dat aanvullende chemicaliën zijn vereist, hetgeen in de 25 praktijk ongewenst is.The water present in the springs escapes as steam, and the springs are hydrolyzed by means of steam. In this state, an animal or vegetable oil is supplied to the autoclave as a mist at normal temperature, after which the high-temperature steam in the autoclave is cooled, condensed, liquefied, and the pressure in the autoclave is reduced. The oil heated by steam exchange will penetrate into the feather tissue and replace the water remaining in the feather tissue, whereby the feathers are dried to obtain the desired feather meal. A drawback of such a method is that additional chemicals are required, which is undesirable in practice.

I Een algemeen bekende methode om keratines vrij te maken uit I veren is de veren te behandelen in een licht alkalisch milieu, door I middel van 2-mercapto-ethanol om de disulfidebindingen te reduceren en I geconcentreerde waterige ureumoplossingen om de keratines te denatureren.A well-known method of releasing keratin from feathers is to treat the feathers in a slightly alkaline medium, by means of 2-mercaptoethanol to reduce the disulfide bonds and concentrated aqueous urea solutions to denature the keratin.

I 30 Condities om tot 75% van de keratines uit de veren te extraheren omvatten I een reactietijd van 30 minuten bij een temperatuur van 40 eC, een pH- I 1023602 3 * -1 «b waarde tussen 7,0 en 9,0, een ureumgehalte van 5 M of hoger en een tienvoudige overmaat 2-mercapto-ethanol ten opzichte van het aantal disulfidebindingen in de keratines. Als nadeel van een dergelijke methode kan de aanvullende behandelingsstap met chemicaliën worden genoemd.Conditions to extract up to 75% of the keratins from the feathers include a reaction time of 30 minutes at a temperature of 40 ° C, a pH value between 7.0 and 9.0, a urea content of 5 M or higher and a ten-fold excess of 2-mercaptoethanol relative to the number of disulfide bonds in the keratins. The additional treatment step with chemicals can be mentioned as a disadvantage of such a method.

5 Het doel van de onderhavige uitvinding is het verschaffen van een werkwijze ter bereiding van een aminozuren bevattende oplossing, welke werkwijze de hiervoor genoemde nadelen volgens de stand van de techniek ontbeert.The object of the present invention is to provide a method for preparing an amino acid-containing solution, which method lacks the aforementioned disadvantages according to the prior art.

Nog een ander doel van de onderhavige uitvinding is het 10 verschaffen van een werkwijze ter bereiding van een aminozuren bevattende oplossing, welke werkwijze onder relatief milde omstandigheden kan worden uitgevoerd waarbij korte, oplosbare peptiden worden verkregen.Yet another object of the present invention is to provide a method for preparing an amino acid-containing solution, which method can be carried out under relatively mild conditions to obtain short, soluble peptides.

Nog een ander doel van de onderhavige uitvinding is het verschaffen van een werkwijze ter bereiding van een aminozuren bevattende 15 oplossing, welke werkwijze het optreden van nevenreacties, in het bijzonder het ontleden van aminozuren, in beperkte mate toelaat.Still another object of the present invention is to provide a method for preparing an amino acid-containing solution, which method allows the occurrence of side reactions, in particular the decomposition of amino acids, to a limited extent.

Nog een ander doel van de onderhavige uitvinding is het verschaffen van een bijzondere toepassing van de aminozuren bevattende oplossing, welke toepassing een aanzienlijke commerciële waarde bezit.Yet another object of the present invention is to provide a particular application of the amino acid-containing solution, which application has considerable commercial value.

20 De werkwijze zoals vermeld in de aanhef wordt gekenmerkt doordat als uitgangsmateriaal waterstofgebonden biopolymeren worden overgebracht naar een gesloten houder, waarna de gesloten houder bij een temperatuur van ten minste 180 eC in aanwezigheid van water wordt verwarmd.The method as stated in the preamble is characterized in that hydrogen-bound biopolymers are transferred to a closed container as a starting material, after which the closed container is heated at a temperature of at least 180 ° C in the presence of water.

25 Op basis van de onderhavige werkwijze worden een of meer doelstellingen van de onderhavige uitvinding bereikt.On the basis of the present method, one or more objects of the present invention are achieved.

Proteïnen bestaan hoofdzakelijk uit aminozuren waarbij in de meeste uitvoeringsvormen de driedimensionale kristalstructuur ontstaat vanwege de waterstofbinding tussen de moleculaire keten. De waterstof-30 binding in proteïnen, biopolymeren in het algemeen, wordt sterk beïnvloed door de pH-waarde van de oplossing. De amionzuurgroepen langs de 1023602 I moleculaire keten kunnen zowel als waterstofbinding-acceptoren als I -donoren over een bepaald pH-gebied functioneren, en als acceptoren of donoren (maar niet beide functies) bij andere pH-waarden. In proteïnen is I water een actieve deelnemer in moleculaire interacties. Net zoals de I 5 biopolymeren is water ook een polair molecuul en vertonen de watermoleculen een hoge affiniteit voor elkaar. De polariteit en het I waterstofbindend vermogen van water zorgt ervoor dat water een molecule I is dat een sterke interactie met de biopolymeren vertoont. Het gevolg is I dat water de elektrostatische en waterstofbindinginteracties tussen I 10 andere moleculen verzwakt. Aldus is water een zeer effectieve competitor I in deze polaire interacties. Onder toepassing van de hiervoor beschreven I werkwijze worden proteïnen opgelost, gehydrolyseerd in water.Proteins consist essentially of amino acids with the three-dimensional crystal structure arising in most embodiments due to hydrogen bonding between the molecular chain. The hydrogen bonding in proteins, biopolymers in general, is strongly influenced by the pH value of the solution. The amionic acid groups along the 1023602 I molecular chain can function both as hydrogen bond acceptors and I donors over a certain pH range, and as acceptors or donors (but not both functions) at different pH values. In proteins, I water is an active participant in molecular interactions. Just like the biopolymers, water is also a polar molecule and the water molecules show a high affinity for each other. The polarity and the hydrogen-binding capacity of water ensures that water is a molecule I that exhibits strong interaction with the biopolymers. The result is that water weakens the electrostatic and hydrogen bonding interactions between other molecules. Water is thus a very effective competitor I in these polar interactions. Using the method described above, proteins are dissolved, hydrolysed in water.

I Het is gewenst dat de hoeveelheid waterstofgebonden biopolymeren 5-20 gew.% bedraagt, op basis van het totale mengsel van I 15 waterstofgebonden biopolymeren en water. Indien de hoeveelheid waterstofgebonden biopolymeren minder dan 5 gew.% bedraagt, zal de I verkregen aminozuren bevattende oplossing een geringe concentratie aminozuren bevatten, hetgeen in de praktijk ongewenst is. Indien daarentegen de hoeveelheid waterstofgebonden biopolymeren meer dan 20 20 gew.% bedraagt, zal een onvoldoende omzetting van proteïnen in het uitgangsmateriaal plaatsvinden.It is desirable that the amount of hydrogen-bound biopolymers is 5-20% by weight, based on the total mixture of hydrogen-bound biopolymers and water. If the amount of hydrogen-bound biopolymers is less than 5% by weight, the solution containing amino acids will contain a small concentration of amino acids, which is undesirable in practice. On the other hand, if the amount of hydrogen-bound biopolymers is more than 20% by weight, an insufficient conversion of proteins into the starting material will take place.

H De in de onderhavige uitvinding toegepaste H waterstofgebonden biopolymeren worden gekozen uit de groep van collageen, zijde en proteïnen van natuurlijke oorsprong, waarbij in het bijzonder 25 veren als proteïnen van natuurlijke oorsprong worden genoemd.H The H hydrogen bonded biopolymers used in the present invention are selected from the group of collagen, silk and proteins of natural origin, with springs being mentioned in particular as proteins of natural origin.

Ter verkrijging van een oplossing die aminozuren met 5 tot 6 monomere eenheden in lengte bezit, is het gewenst dat partiële oplossing/hydrolyse plaatsvindt door de proteïnen in aanwezigheid van water bij een temperatuur in het gebied van 200-220 *C te verwarmen.To obtain a solution having amino acids with 5 to 6 monomeric units in length, it is desirable that partial dissolution / hydrolysis take place by heating the proteins in the presence of water at a temperature in the range of 200-220 ° C.

30 Het oplossen van proteïnen onder relatief milde omstandigheden van temperatuur en druk, in aanwezigheid van een I 1n?3 602 » 5 milieuvriendelijk oplosmiddel, zoals water, verschaft een nieuwe toepassing op het gebied van coating en celgroei. Aldus is het mogelijk om de bioverenigbaarheid van het bedekte oppervlak met de specifieke donor van de proteïnen, zoals collageen, te verhogen. De conversie van 5 veren in aminozuren door oplossing verschaft aldus een volledig milieuvriendelijk recyclingproces van afval van de pluimvee-industrie.The dissolution of proteins under relatively mild conditions of temperature and pressure, in the presence of an environmentally friendly solvent, such as water, provides a new application in the field of coating and cell growth. Thus, it is possible to increase the biocompatibility of the coated surface with the specific donor of the proteins, such as collagen. The conversion of 5 feathers into amino acids by solution thus provides a completely environmentally friendly recycling process of waste from the poultry industry.

De onderhavige uitvinding heeft verder betrekking op een aminozuren bevattende oplossing, verkregen door de werkwijze zoals hiervoor omschreven, waarbij het met name de voorkeur verdient dat de 10 aminozuren 5 tot 7 monomere eenheden in lengte bezitten.The present invention further relates to an amino acid-containing solution obtained by the method as described above, wherein it is particularly preferred that the 10 amino acids have 5 to 7 monomeric units in length.

De onderhavige uitvinding heeft verder betrekking op de toepassing van de hiervoor beschreven, aminozuren bevattende oplossing, in het bijzonder als uitgangsmateriaal voor dieren, als een deklaag voor menselijke implantaten, als uitgangsmateriaal voor het dissociëren van 15 aminozuren in kleinere fragmenten in aanwezigheid van enzymen, welke kleinere monomere eenheden met name geschikt zijn om te worden toegepast in de cosmetische industrie.The present invention further relates to the use of the above-described amino acid-containing solution, in particular as a starting material for animals, as a coating for human implants, as a starting material for dissociating 15 amino acids in smaller fragments in the presence of enzymes, which smaller monomeric units are particularly suitable for use in the cosmetic industry.

De onderhavige uitvinding zal hierna aan de hand van een voorbeeld en ter vergelijking dienende voorbeelden worden toegelicht, 20 waarbij echter dient te worden opgemerkt dat de onderhavige uitvinding in geen geval tot een dergelijke bijzondere voorbeelden is beperkt.The present invention will be explained below with reference to an example and comparative examples, but it should be noted, however, that the present invention is by no means limited to such special examples.

Voorbeeld.Example.

Een hoeveelheid kippenveren werd, zonder enige voorbehandeling, overgebracht naar een dikwandig, afsluitbaar vat, 25 waarbij een overmaat water in een hoeveelheid van ongeveer 5-10% droge stof veren/water werd toegevoegd. Na afsluiten werd het vat gedurende anderhalf uur op een temperatuur van ongeveer 210 *C verhit. Na afkoelen werd het vat geopend en een heldere of enigszins troebele vloeistof verkregen. Een chemische analyse wees uit dat de oplossing korte, 30 oplosbare peptiden van 2-5 aminozuren lang bevat.An amount of chicken feathers was transferred, without any pre-treatment, to a thick-walled, sealable vessel, wherein an excess of water was added in an amount of about 5-10% dry matter feathers / water. After sealing, the vessel was heated at a temperature of approximately 210 ° C for one and a half hours. After cooling, the vessel was opened and a clear or slightly cloudy liquid was obtained. A chemical analysis revealed that the solution contains short, soluble peptides of 2-5 amino acids in length.

1 023602 I Ter vergelijking dienend voorbeeld 1.1 023602 I Comparative example 1.

I Dezelfde handelingen als in het hiervoor beschreven I voorbeeld werden uitgevoerd, behalve dat de verwarmingsstap bij een I temperatuur van 150 ’C plaatsvond. Als eindproduct werd verenmeel, een I 5 verteerbaar eiwitproduct verkregen, dat echter niet in water oplosbaar I was.The same operations as in the example described above were performed, except that the heating step took place at a temperature of 150 ° C. As a final product, feather flour, a digestible protein product, was obtained, which, however, was not water-soluble.

I Ter vergelijking dienend voorbeeld 2.Example 2 for comparison.

I Dezelfde handelingen als omschreven in ter vergelijking I dienend voorbeeld 1 werden uitgevoerd, behalve dat de verhittingsstap bij I 10 een temperatuur van 100 *C plaatsvond. Na het openen van de autoclaaf I werd geen effect op de veren waargenomen.The same operations as described in Example 1 for comparison I were carried out, except that the heating step at 100 took place at a temperature of 100 ° C. After opening of the autoclave I, no effect on the springs was observed.

Uit de hiervoor besproken experimentele resultaten kan I worden geconcludeerd dat onder toepassing van de juiste procesomstandigheden het grootste deel van de bewerkte veren in oplossing I 15 is gegaan. Bovendien heeft een zogenaamde PKL-test (gemiddelde peptiden- I ketenlengte onder toepassing van het reagens TNBS) uitgewezen dat de I aminozuren in de vorm van kleine peptiden aanwezig zijn.From the experimental results discussed above, I can conclude that the majority of the processed springs have gone into solution I under the correct process conditions. Moreover, a so-called PKL test (average peptide chain length using the TNBS reagent) has shown that the I amino acids are present in the form of small peptides.

I 1023602I 1023602

Claims

Process for preparing an amino-acid-containing solution, characterized in that hydrogen-bonded biopolymers are subjected as a starting material in a closed vessel to a temperature treatment in the presence of water, the temperature having a value of at least 180 ° C.

Process according to claim 1, characterized in that the amount of hydrogen-bound biopolymers is 5-20% by weight, based on the total mixture of hydrogen-bound biopolymers and water.

Method according to one or more of claims 1-2, characterized in that the hydrogen-bonded biopolymers are selected from the group consisting of collagen, silk and proteins of natural origin.

Method according to claim 3, characterized in that feathers are used as proteins of natural origin.

Method according to one or more of the preceding claims, characterized in that the temperature is between 200 and 220 ° C.

Amino acid-containing solution obtained by a method as described in one or more of the preceding claims.

Solution according to claim 6, characterized in that the amino acids have 5 to 7 monomeric units in length.

8. Solution according to one or more of claims 6-7, characterized in that the solution contains water-soluble peptides with 2-5 amino acids.

Use of a solution according to one or more of claims 6-8 as a foodstuff for animals.

10. Use of a solution according to one or more of claims 6-8 as a coating for biocompatible human implants. 1023602

Use of a solution according to one or more of claims 6-8 as a starting material for dissociating the I amino acids in smaller fragments in the presence of enzymes. I 1023602