NL1000732C1 - Eiwit-bevattende fractie. - Google Patents

Description

Titel: Eiwit-bevattende fractie

De uitvinding heeft betrekking op produkten die bruikbaar zijn als hechtmiddel in vochtige omgeving.

In verschillende biologische en biochemische laboratoria is onderzoek gedaan naar de hechting van mosselen aan een oppervlak 5 en naar de samenstelling van de betreffende hechtsubstantie, met name voor de zeemossel Mytilus edulis, die sterke byssusdraden vormt. Er is veel moeite gedaan om de door mosselen uitgescheiden eitwitten, de zg. "marine adhesive proteins" (MAP) te zuiveren en te karakteriseren. De voor de hechting belangrijkste 10 componenten in de byssusdraden zijn eiwitten, die een repeterend decapeptide bevatten waarin relatief veel fenolische groepen voorkomen. Eén van de aminozuren is 3,4-dihydroxy-fenylalanine (DOPA), een bijzonder eiwitbestanddeel. Een uit dit onderzoek voortgekomen preparaat (Cell-Tak) is in de handel verkrijgbaar 15 als coating van vaste substraten voor cel- en weefselkweken en wordt getest voor hoornvliestransplantaties. In deze vorm levert het MAP echter geen mechanisch sterke lijmverbindigen op.

In de geneeskunde bestaat voor chirurgische toepassingen waar conventionele hechtmethoden niet bruikbaar zijn of dikwijls 20 falen een behoefte aan goed verwerkbare, biocompatibele en biodegradeerbare lijmen met een grote bindingssterkte. Kenmerk van deze lijmen is dat ze in een vochtige omgeving kunnen worden toegepast. Op kleine schaal reeds toegepaste lijmen zijn cyanoacrylaten en fibrinelijm. Cyanoacrylaten zijn echter erg 25 vochtgevoelig. Fibrinelijm hecht niet op lipide-oppervlakken en is zeer gevoelig voor infecties. Beide typen lijmen geven een relatief lage bindingssterkte en een ander nadeel van deze lijmen is de zeer korte verwerkingstijd, hetgeen klinische gebruik erg lastig maakt.

30 Tot de sterkste lijmverbindingen in de natuur behoren die welke tot stand gebracht worden met eiwitten, uitgescheiden door mosselen. Mosselen kunnen zich, zowel in rustig als in sterk 1000732 2 stromend water vasthechten aan een grote variëteit van oppervlakken. Een lijm gebaseerd op deze "marine adhesive proteins" lijkt daarom een oplossing voor bovenstaande problemen.

In het Amerikaanse octrooi 4,585,583 worden decapeptiden 5 beschreven waarvan gesteld wordt dat deze hechtende eigenschappen bezitten. Deze decapeptiden kunnen geïsoleerd worden uit eiwitten, die aanwezig zijn in mosselvoetjes en hebben de navolgende structuur [Ala-Lys-Pro/Hyp-Ser/Thr-Ser/Thr-Tys/DOPA-Pro/Hyp-Pro/Hyp-Ser/Thr-Tys/DOPA-Lys}.

10 Met name de aanwezigheid van 3,4 dihydroxyfenylalanine [DOPA] wordt verantwoordelijk geacht voor de hechtende eigenschappen .

In het Amerikaanse octrooi 5.015.677 wordt de toepassing van genoemd decapeptide in een samenstelling samen met een 15 verknoper en eventuele andere additieven in hechtings- of bekledingsformuleringen beschreven. In dit octrooi worden een groot aantal van dergelijke toepassingen beschreven, met name in de biomedische sfeer, bijvoorbeeld voor het hechten van lenzen in ogen, of bij chirurgie. In de voorbeelden van dit octrooi 20 werden hechtingen van ten hoogste 9,2 N/cm2 gerapporteerd, een bijzonder lage waarde. Ook het commerciële produkt dat op deze materialen gebaseerd is, heeft tot op heden geen bevredigende hechtende eigenschappen gegeven. Het doel van de uitvinding is derhalve het verschaffen van een produKt dat geschikt is als 25 hechtmiddel, bijvoorbeeld in biomedische toepassingen, welke gebaseerd is op eiwitten die verkrijgbaar zijn uit mosselvoet jes .

De uitvinding betreft derhalve een eiwit-bevattende fractie geschikt als hechtmiddel die een lijmverbinding met een 30 hechtkracht van meer dan 15 N/cm2 kan leveren, omvattende één of meer eiwitten gebaseerd op 3,4-dihydroxyfenyl-alanine, verkrijgbaar door mosselvoetjes bij een pH > 7,0 te behandelen met een bufferoplossing, vervolgens bij een pH < 3,0 te wassen en vervolgens de gezuiverde massa met hoge drukval en grote 35 afschuifkrachten te behandelen, gevolgd door afscheiding van de i 1000732 3 vaste stof en winning van een waterige oplossing van de eiwit-bevattende fractie.

Desgewenst kan de waterige oplossing van de eiwit-bevattende fractie verder gezuiverd, gemodificeerd en/of 5 geconcentreerd worden. De aldus verkregen oplossing die een pH heeft van ongeveer 3,5 blijkt de initiële bestanddelen te bevatten waarmee de mossel sterke hechtende verbindingen weet te maken. De sterkte van de lijmverbindingen van dit ruw preparaat werd getest op een wijze analoog aan din 53283, waarbij in 10 plaats van aluminiumfolie glasplaatjes van 7,55 bij 2,55 cm werden gebruikt. De gemeten sterkte was, zonder verder optimalisatie, reeds ongeveer 25 N/cm2 (0,25 MPa).

Een essentieel verschil tussen de winningsmethode zoals beschreven in de stand van de techniek en de hierboven 15 beschreven methode ligt in de toepassing van een hoge druk en grote afschuifkrachten op de gezuiverde celmassa. Voor het verkrijgen van dergelijke condities wordt een zogenaamde "French Press" gebruikt, een apparaat waarmee cellen in een gehomogeniseerde celmassa gekraakt kunnen worden.

20 De eiwit fractie volgens de uitvinding wordt bij voorkeur verkregen door mosselvoetjes, bijvoorbeeld van Mytilus edulis en Mytilus Provincialis eerst bij een temperatuur van 4°C of minder gedurende circa 10 minuten te weken in een 0,05 M Tris(hydroxymethyl )-aminomethaan bufferoplossing met een pH van 7,5 welke 25 verder 1 M NaCl, 25 mM EDTA, 1 mM KCN, 10 mM N-ethylmaleimide/N-ethylmaleinimide en 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride bevat. Hierbij worden een aantal eiwitten die geen functie hebben voor de hechting geëxtraheerd, terwijl door de diverse toevoegingen voorkomen wordt dat voortijdige degradatie en oxidatie van de 30 polyfenolische proteïnen optreedt.

De aldus behandelde voetjes worden gezuiverd met 5% azijnzuur van circa 4°C en in deze oplossing met behulp van een blender gehomogeniseerd. Vervolgens wordt de celwandstructuur van de verkregen celsuspensie gekraakt met behulp van een 35 zogenaamde "French Press" bij 280 bar en 4°C. De oplossing kan 1000732 4 dan in 5% azijnzuur gedurende circa 1 uur gecentrifugeerd worden bij 50.000 r.p.m.

De aldus verkegen oplossing heeft een pH van ca. 3,5.

Het produkt van de uitvinding, een eiwit fractie in 5 oplossing, danwel een verder gezuiverde en/of geconcentreerde eiwit fractie is op diverse gebieden in de medische sfeer toepasbaar, bijvoorbeeld voor het lijmen bij splinterfracturen en kraakbeenbreuken. In zacht weefsel, bijvoorbeeld voor wondgenezing of zelfs als darmnaadlijm, kan het produkt volgens 10 de uitvinding bijvoorbeeld gebruikt worden voor volledige afdichting van een wond, eventueel in combinatie met hechtdraden of nieten, ter verbetering van de sterkte. Bij de conventionele hechtmethoden, met hechtdraden en/of nieten, is het weefsel alleen werkelijk dicht daar waar de hechtingen zitten. Tussen de 15 hechtingen kunnen nog lekkages en bloedingen optreden waardoor bijvoorbeeld bij gehecht darmweefsel ontstekingen kunnen ontstaan. Door de lijm volgens de uitvinding zou dit niet optreden.

De onderhavige uitvinding heeft in de meest ruime vorm 20 betrekking op een eiwit fractie welke bruikbaar is als component voor lijmen. Aan deze eiwit fractie kunnen andere componenten toegevoegd worden ter verbetering van de hechtkracht en/of ter modificatie van de eigenschappen. Voorbeelden van dergelijke toevoegingen zijn onder meer enzympreparaten, collageen, 25 polysacchariden, vulstoffen zoals hydroxyapatiet, en dergelijke.

De uitvinding heeft ook betrekking op een werkwijze voor het bereiden van een eiwit fractie geschikt als hechtmiddel, welke werkwijze omvat het behandelen van mosselvoetjes bij een pH > 7,0 met een bufferoplossing, het wassen ervan bij een pH 30 < 3,0 en vervolgens het behandelen van de gezuiverde massa met hoge drukval en grote afschuifkrachten, gevolgd door afscheiding van de vaste stof en winning van een waterige oplossing van de eiwit-bevattende fractie.

De uitvinding wordt thans toegelicht aan de hand van een 35 voorbeeld zonder daartoe beperkt te zijn.

! 1 Ü U 0 i 3 2 5

Een aantal van 25 mosselvoetjes van Mytilus edulis werden eerst bij een temperatuur van ten hoogste 4°C gedurende 10 min. geweekt in een 0.05 molair Tris(hydroxymethyl)-aminomethaan bufferoplossing van pH 7,5 verder bevattende 1 M NaCl, 25 mM 5 EDTA, 1 mM KCN, 10 mM N-ethylmaleimide/N-ethylmaleinimide en 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride.

Tijdens dit weken of wassen worden onbelangrijke eiwitten geëxtraheerd, terwijl voortijdige degradatie en oxidatie van de eitwitten verhinderd wordt. De aldus behandelde voetjes worden 10 gewassen met 5% azijnzuur bij 4°C en in deze oplossing met behulp van een blender gehomogeniseerd. De verkregen celsuspensie wordt vervolgens behandeld in een "French Press" bij 280 bar en 4°C, waardoor de celwand structuur gekraakt wordt. Een "French Press" bestaat uit een stalen cylinder met 15 plunjer die aan de zijkant van een zeer nauwe opening voorzien is, welke afsluitbaar is. De suspensie wordt in de cylinder gebracht en met behulp van een hydraulische pers onder druk gezet, in dit geval 280 bar. Vervolgens wordt de opening geopend waardoor de suspensie naar buiten wordt geperst. Door de grote 20 drukval en grote afschuifkrachten in de opening worden geaggregeerde componenten uit elkaar gehaald en worden cellen opengebroken. Het uit de French Press verkregen produkt wordt in 5% azijnzuur gedurende 1 uur gecentrifugeerd bij 50.000 r.p.m.

De aldus verkregen oplossing met een pH van 3,5 wordt gebruikt 25 om glasplaatjes van 7,55 bij 2,55 cm aan elkaar te hechten. De gemeten sterkte was, zonder verdere toevoegingen of optimalisatie, reeds 25 N/cm2.

1000732

Claims (8)

1. Eiwit-bevattende fractie geschikt als hechtmiddel die een lijmverbinding met een hechtkracht van meer dan 15 N/cm2 kan leveren, omvattende één of meer eiwitten gebaseerd op 3,4-dihydroxyfenyl-alanine, verkrijgbaar door mosselvoetjes bij 5 een pH > 7,0 te behandelen met een bufferoplóssing, vervolgens bij een pH < 3,0 te wassen en vervolgens de gezuiverde massa met hoge drukval en grote afschuifkrachten te behandelen, gevolgd door afscheiding van de vaste stof en winning van een waterige oplossing van de eiwit-bevattende fractie.

2. Produkt volgens conclusie 1, waarbij de verkregen oplossing verder gezuiverd, gemodificeerd en/of geconcentreerd is.

3. Produkt volgens conclusie 1, waarbij de fractie één of meer eiwitten bevat die gebaseerd zijn op 3,4-dihydroxyfenylalanine bevattende decapeptiden.

4. Produkt volgens conclusie 1, waarbij genoemd decapeptide de structuur {Ala-Lys-Pro/Hyp-Ser/Thr-Ser/Thr-Tys/DOPA-Pro/Hyp-Pro/Hyp-Ser/Thr-Tys/DOPA-Lys} bezit.

5. Werkwijze voor het bereiden van een eiwit-bevattende fractie geschikt als hechtmiddel volgens conclusies 1-4, 20 omvattende het behandelen van mosselvoetjes bij een pH > 7,0 met een bufferoplossing, het wassen ervan bij een pH < 3,0 en vervolgens het behandelen van de gezuiverde massa met hoge drukval en grote afschuifkrachten, gevolgd door afscheiding van de vaste stof en winning van een waterige oplossing van de 25 eiwit-bevattende fractie.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, waarbij de verkregen oplossing verder gezuiverd, gemodificeerd en/of geconcentreerd is.

7. Toepassing van het produkt van conclusies 1-4 als hecht-30 middel, meer in het bijzonder in vochtige omgeving.

8. Toepassing volgens conclusie 7, als hechtmiddel voor biomedische doeleinden. i 1000732