NL1000732C1

NL1000732C1 - Protein-contg. fraction from mussel feet

Info

Publication number: NL1000732C1
Application number: NL1000732A
Authority: NL
Inventors: Maria Cornelia Van Der Leeden; Barend Willem Groen
Original assignee: Univ Delft Tech
Priority date: 1995-07-05
Filing date: 1995-07-05
Publication date: 1997-01-08

Abstract

A protein-contg. fraction suitable for use as an adhesive that can provide an adhesive bond with a strength of more than 15 N/cm2 is claimed. The fraction comprises one or more proteins contg. 3,4-dihydroxyphenylalanine (Dopa) and is obtd. by a process comprising treating mussel feet with a buffer soln. with a pH of \- 7, washing the feet at a pH of 3 or less, subjecting the purified mass to a high pressure drop and shearing stress, separating solids, and recovering an aq. soln. of the protein-contg. fraction.

Description

Titel: Eiwit-bevattende fractieTitle: Protein-containing fraction

De uitvinding heeft betrekking op produkten die bruikbaar zijn als hechtmiddel in vochtige omgeving.The invention relates to products useful as an adhesive in a humid environment.

In verschillende biologische en biochemische laboratoria is onderzoek gedaan naar de hechting van mosselen aan een oppervlak 5 en naar de samenstelling van de betreffende hechtsubstantie, met name voor de zeemossel Mytilus edulis, die sterke byssusdraden vormt. Er is veel moeite gedaan om de door mosselen uitgescheiden eitwitten, de zg. "marine adhesive proteins" (MAP) te zuiveren en te karakteriseren. De voor de hechting belangrijkste 10 componenten in de byssusdraden zijn eiwitten, die een repeterend decapeptide bevatten waarin relatief veel fenolische groepen voorkomen. Eén van de aminozuren is 3,4-dihydroxy-fenylalanine (DOPA), een bijzonder eiwitbestanddeel. Een uit dit onderzoek voortgekomen preparaat (Cell-Tak) is in de handel verkrijgbaar 15 als coating van vaste substraten voor cel- en weefselkweken en wordt getest voor hoornvliestransplantaties. In deze vorm levert het MAP echter geen mechanisch sterke lijmverbindigen op.Various biological and biochemical laboratories have investigated the adhesion of mussels to a surface and the composition of the adhesive substance in question, in particular for the sea mussel Mytilus edulis, which forms strong byssus threads. Much effort has been made to purify and characterize the proteins excreted by mussels, the so-called "marine adhesive proteins" (MAP). The most important components in the byssus wires for the adhesion are proteins, which contain a repeating decapeptide in which relatively many phenolic groups occur. One of the amino acids is 3,4-dihydroxy-phenylalanine (DOPA), a special protein component. A preparation (Cell-Tak) resulting from this study is commercially available as a coating of solid substrates for cell and tissue cultures and is being tested for corneal transplants. In this form, however, the MAP does not yield mechanically strong adhesive bonds.

In de geneeskunde bestaat voor chirurgische toepassingen waar conventionele hechtmethoden niet bruikbaar zijn of dikwijls 20 falen een behoefte aan goed verwerkbare, biocompatibele en biodegradeerbare lijmen met een grote bindingssterkte. Kenmerk van deze lijmen is dat ze in een vochtige omgeving kunnen worden toegepast. Op kleine schaal reeds toegepaste lijmen zijn cyanoacrylaten en fibrinelijm. Cyanoacrylaten zijn echter erg 25 vochtgevoelig. Fibrinelijm hecht niet op lipide-oppervlakken en is zeer gevoelig voor infecties. Beide typen lijmen geven een relatief lage bindingssterkte en een ander nadeel van deze lijmen is de zeer korte verwerkingstijd, hetgeen klinische gebruik erg lastig maakt.In medicine, for surgical applications where conventional suturing methods are not useful or often fail, there is a need for high processability, biocompatible and biodegradable adhesives with high bond strength. Characteristic of these adhesives is that they can be applied in a moist environment. Glues already used on a small scale are cyanoacrylates and fibrin glue. However, cyanoacrylates are very sensitive to moisture. Fibrin glue does not adhere to lipid surfaces and is very sensitive to infections. Both types of adhesives have a relatively low bond strength and another disadvantage of these adhesives is the very short processing time, which makes clinical use very difficult.

30 Tot de sterkste lijmverbindingen in de natuur behoren die welke tot stand gebracht worden met eiwitten, uitgescheiden door mosselen. Mosselen kunnen zich, zowel in rustig als in sterk 1000732 2 stromend water vasthechten aan een grote variëteit van oppervlakken. Een lijm gebaseerd op deze "marine adhesive proteins" lijkt daarom een oplossing voor bovenstaande problemen.30 The strongest adhesive bonds in nature include those made with proteins secreted by mussels. Mussels can adhere to a wide variety of surfaces, both in calm and in strong 1000732 2 running water. An adhesive based on these "marine adhesive proteins" therefore seems to be a solution to the above problems.

In het Amerikaanse octrooi 4,585,583 worden decapeptiden 5 beschreven waarvan gesteld wordt dat deze hechtende eigenschappen bezitten. Deze decapeptiden kunnen geïsoleerd worden uit eiwitten, die aanwezig zijn in mosselvoetjes en hebben de navolgende structuur [Ala-Lys-Pro/Hyp-Ser/Thr-Ser/Thr-Tys/DOPA-Pro/Hyp-Pro/Hyp-Ser/Thr-Tys/DOPA-Lys}.U.S. Patent 4,585,583 discloses decapeptides 5 which are said to have adhesive properties. These decapeptides can be isolated from proteins present in mussel feet and have the following structure [Ala-Lys-Pro / Hyp-Ser / Thr-Ser / Thr-Tys / DOPA-Pro / Hyp-Pro / Hyp-Ser / Thr -Tys / DOPA-Lys}.

10 Met name de aanwezigheid van 3,4 dihydroxyfenylalanine [DOPA] wordt verantwoordelijk geacht voor de hechtende eigenschappen .In particular, the presence of 3,4 dihydroxyphenylalanine [DOPA] is believed to be responsible for the adhesive properties.

In het Amerikaanse octrooi 5.015.677 wordt de toepassing van genoemd decapeptide in een samenstelling samen met een 15 verknoper en eventuele andere additieven in hechtings- of bekledingsformuleringen beschreven. In dit octrooi worden een groot aantal van dergelijke toepassingen beschreven, met name in de biomedische sfeer, bijvoorbeeld voor het hechten van lenzen in ogen, of bij chirurgie. In de voorbeelden van dit octrooi 20 werden hechtingen van ten hoogste 9,2 N/cm2 gerapporteerd, een bijzonder lage waarde. Ook het commerciële produkt dat op deze materialen gebaseerd is, heeft tot op heden geen bevredigende hechtende eigenschappen gegeven. Het doel van de uitvinding is derhalve het verschaffen van een produKt dat geschikt is als 25 hechtmiddel, bijvoorbeeld in biomedische toepassingen, welke gebaseerd is op eiwitten die verkrijgbaar zijn uit mosselvoet jes .US Patent 5,015,677 discloses the use of said decapeptide in a composition together with a crosslinker and any other additives in adhesive or coating formulations. This patent describes a large number of such applications, particularly in the biomedical sphere, for example, for attaching lenses to eyes, or in surgery. In the examples of this patent 20, sutures of up to 9.2 N / cm 2 were reported, a particularly low value. Also, the commercial product based on these materials has not yet yielded satisfactory adhesive properties. The object of the invention is therefore to provide a product suitable as an adhesive, for example in biomedical applications, which is based on proteins available from mussel feet.

De uitvinding betreft derhalve een eiwit-bevattende fractie geschikt als hechtmiddel die een lijmverbinding met een 30 hechtkracht van meer dan 15 N/cm2 kan leveren, omvattende één of meer eiwitten gebaseerd op 3,4-dihydroxyfenyl-alanine, verkrijgbaar door mosselvoetjes bij een pH > 7,0 te behandelen met een bufferoplossing, vervolgens bij een pH < 3,0 te wassen en vervolgens de gezuiverde massa met hoge drukval en grote 35 afschuifkrachten te behandelen, gevolgd door afscheiding van de i 1000732 3 vaste stof en winning van een waterige oplossing van de eiwit-bevattende fractie.The invention therefore relates to a protein-containing fraction suitable as an adhesive which can provide an adhesive bond with an adhesive strength of more than 15 N / cm2, comprising one or more proteins based on 3,4-dihydroxyphenyl-alanine, available through mussel feet at a pH > 7.0 with a buffer solution, then washing at pH <3.0 and then treating the purified mass with high pressure drop and high shear, followed by separation of the 1000732 3 solid and recovery of an aqueous solution of the protein-containing fraction.

Desgewenst kan de waterige oplossing van de eiwit-bevattende fractie verder gezuiverd, gemodificeerd en/of 5 geconcentreerd worden. De aldus verkregen oplossing die een pH heeft van ongeveer 3,5 blijkt de initiële bestanddelen te bevatten waarmee de mossel sterke hechtende verbindingen weet te maken. De sterkte van de lijmverbindingen van dit ruw preparaat werd getest op een wijze analoog aan din 53283, waarbij in 10 plaats van aluminiumfolie glasplaatjes van 7,55 bij 2,55 cm werden gebruikt. De gemeten sterkte was, zonder verder optimalisatie, reeds ongeveer 25 N/cm2 (0,25 MPa).If desired, the aqueous solution of the protein-containing fraction can be further purified, modified and / or concentrated. The solution thus obtained, which has a pH of about 3.5, appears to contain the initial constituents with which the mussel is able to make strong adhesive compounds. The strength of the adhesive bonds of this crude preparation was tested in a manner analogous to din 53283 using glass plates measuring 7.55 by 2.55 cm instead of aluminum foil. The measured strength, without further optimization, was already about 25 N / cm2 (0.25 MPa).

Een essentieel verschil tussen de winningsmethode zoals beschreven in de stand van de techniek en de hierboven 15 beschreven methode ligt in de toepassing van een hoge druk en grote afschuifkrachten op de gezuiverde celmassa. Voor het verkrijgen van dergelijke condities wordt een zogenaamde "French Press" gebruikt, een apparaat waarmee cellen in een gehomogeniseerde celmassa gekraakt kunnen worden.An essential difference between the recovery method as described in the prior art and the method described above lies in the application of high pressure and high shear forces to the purified cell mass. To achieve such conditions, a so-called "French Press" is used, a device with which cells can be cracked in a homogenized cell mass.

20 De eiwit fractie volgens de uitvinding wordt bij voorkeur verkregen door mosselvoetjes, bijvoorbeeld van Mytilus edulis en Mytilus Provincialis eerst bij een temperatuur van 4°C of minder gedurende circa 10 minuten te weken in een 0,05 M Tris(hydroxymethyl )-aminomethaan bufferoplossing met een pH van 7,5 welke 25 verder 1 M NaCl, 25 mM EDTA, 1 mM KCN, 10 mM N-ethylmaleimide/N-ethylmaleinimide en 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride bevat. Hierbij worden een aantal eiwitten die geen functie hebben voor de hechting geëxtraheerd, terwijl door de diverse toevoegingen voorkomen wordt dat voortijdige degradatie en oxidatie van de 30 polyfenolische proteïnen optreedt.The protein fraction according to the invention is preferably obtained by first soaking mussel feet, for example of Mytilus edulis and Mytilus Provincialis, at a temperature of 4 ° C or less for about 10 minutes in a 0.05 M Tris (hydroxymethyl) -aminomethane buffer solution. with a pH of 7.5 which further contains 1 M NaCl, 25 mM EDTA, 1 mM KCN, 10 mM N-ethylmaleimide / N-ethylmaleinimide and 1mM phenylmethylsulfonyl fluoride. Here, a number of proteins which have no function for the adhesion are extracted, while the various additives prevent premature degradation and oxidation of the polyphenolic proteins.

De aldus behandelde voetjes worden gezuiverd met 5% azijnzuur van circa 4°C en in deze oplossing met behulp van een blender gehomogeniseerd. Vervolgens wordt de celwandstructuur van de verkregen celsuspensie gekraakt met behulp van een 35 zogenaamde "French Press" bij 280 bar en 4°C. De oplossing kan 1000732 4 dan in 5% azijnzuur gedurende circa 1 uur gecentrifugeerd worden bij 50.000 r.p.m.The feet thus treated are purified with 5% acetic acid at about 4 ° C and homogenized in this solution using a blender. Then, the cell wall structure of the obtained cell suspension is cracked using a so-called "French Press" at 280 bar and 4 ° C. The solution can then be centrifuged at 50,000 r.p.m. in 5% acetic acid for about 1 hour.

De aldus verkegen oplossing heeft een pH van ca. 3,5.The solution thus obtained has a pH of about 3.5.

Het produkt van de uitvinding, een eiwit fractie in 5 oplossing, danwel een verder gezuiverde en/of geconcentreerde eiwit fractie is op diverse gebieden in de medische sfeer toepasbaar, bijvoorbeeld voor het lijmen bij splinterfracturen en kraakbeenbreuken. In zacht weefsel, bijvoorbeeld voor wondgenezing of zelfs als darmnaadlijm, kan het produkt volgens 10 de uitvinding bijvoorbeeld gebruikt worden voor volledige afdichting van een wond, eventueel in combinatie met hechtdraden of nieten, ter verbetering van de sterkte. Bij de conventionele hechtmethoden, met hechtdraden en/of nieten, is het weefsel alleen werkelijk dicht daar waar de hechtingen zitten. Tussen de 15 hechtingen kunnen nog lekkages en bloedingen optreden waardoor bijvoorbeeld bij gehecht darmweefsel ontstekingen kunnen ontstaan. Door de lijm volgens de uitvinding zou dit niet optreden.The product of the invention, a protein fraction in solution, or a further purified and / or concentrated protein fraction can be used in various fields in the medical field, for example for gluing splinter fractures and cartilage fractures. In soft tissue, for example for wound healing or even as gut seam adhesive, the product according to the invention can for instance be used for complete sealing of a wound, possibly in combination with sutures or staples, to improve the strength. In the conventional suturing methods, with sutures and / or staples, the fabric is really closed only where the sutures are. Leaks and bleeding can still occur between the 15 stitches, which can lead to inflammation in sutured intestinal tissue, for example. This would not occur due to the glue according to the invention.

De onderhavige uitvinding heeft in de meest ruime vorm 20 betrekking op een eiwit fractie welke bruikbaar is als component voor lijmen. Aan deze eiwit fractie kunnen andere componenten toegevoegd worden ter verbetering van de hechtkracht en/of ter modificatie van de eigenschappen. Voorbeelden van dergelijke toevoegingen zijn onder meer enzympreparaten, collageen, 25 polysacchariden, vulstoffen zoals hydroxyapatiet, en dergelijke.The present invention in its broadest form relates to a protein fraction which is useful as a gluing component. Other components can be added to this protein fraction to improve the adhesive strength and / or to modify the properties. Examples of such additives include enzyme preparations, collagen, polysaccharides, fillers such as hydroxyapatite, and the like.

De uitvinding heeft ook betrekking op een werkwijze voor het bereiden van een eiwit fractie geschikt als hechtmiddel, welke werkwijze omvat het behandelen van mosselvoetjes bij een pH > 7,0 met een bufferoplossing, het wassen ervan bij een pH 30 < 3,0 en vervolgens het behandelen van de gezuiverde massa met hoge drukval en grote afschuifkrachten, gevolgd door afscheiding van de vaste stof en winning van een waterige oplossing van de eiwit-bevattende fractie.The invention also relates to a method of preparing a protein fraction suitable as an adhesive, which method comprises treating mussel feet at a pH> 7.0 with a buffer solution, washing them at a pH 30 <3.0 and then treating the purified mass with high pressure drop and high shear, followed by separation of the solid and recovery of an aqueous solution of the protein-containing fraction.

De uitvinding wordt thans toegelicht aan de hand van een 35 voorbeeld zonder daartoe beperkt te zijn.The invention will now be elucidated on the basis of an example without being limited thereto.

! 1 Ü U 0 i 3 2 5! 1 Ü U 0 i 3 2 5

Een aantal van 25 mosselvoetjes van Mytilus edulis werden eerst bij een temperatuur van ten hoogste 4°C gedurende 10 min. geweekt in een 0.05 molair Tris(hydroxymethyl)-aminomethaan bufferoplossing van pH 7,5 verder bevattende 1 M NaCl, 25 mM 5 EDTA, 1 mM KCN, 10 mM N-ethylmaleimide/N-ethylmaleinimide en 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride.A number of 25 mussel feet of Mytilus edulis were first soaked in a 0.05 molar Tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer solution of pH 7.5 further containing 1 M NaCl, 25 mM 5 EDTA at a temperature of not more than 4 ° C for 10 min. , 1 mM KCN, 10 mM N-ethylmaleimide / N-ethylmaleinimide and 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride.

Tijdens dit weken of wassen worden onbelangrijke eiwitten geëxtraheerd, terwijl voortijdige degradatie en oxidatie van de eitwitten verhinderd wordt. De aldus behandelde voetjes worden 10 gewassen met 5% azijnzuur bij 4°C en in deze oplossing met behulp van een blender gehomogeniseerd. De verkregen celsuspensie wordt vervolgens behandeld in een "French Press" bij 280 bar en 4°C, waardoor de celwand structuur gekraakt wordt. Een "French Press" bestaat uit een stalen cylinder met 15 plunjer die aan de zijkant van een zeer nauwe opening voorzien is, welke afsluitbaar is. De suspensie wordt in de cylinder gebracht en met behulp van een hydraulische pers onder druk gezet, in dit geval 280 bar. Vervolgens wordt de opening geopend waardoor de suspensie naar buiten wordt geperst. Door de grote 20 drukval en grote afschuifkrachten in de opening worden geaggregeerde componenten uit elkaar gehaald en worden cellen opengebroken. Het uit de French Press verkregen produkt wordt in 5% azijnzuur gedurende 1 uur gecentrifugeerd bij 50.000 r.p.m.During this soaking or washing, insignificant proteins are extracted, while premature degradation and oxidation of the proteins are prevented. The feet thus treated are washed with 5% acetic acid at 4 ° C and homogenized in this solution using a blender. The resulting cell suspension is then treated in a "French Press" at 280 bar and 4 ° C, thereby cracking the cell wall structure. A "French Press" consists of a steel cylinder with 15 plunger, which has a very narrow opening on the side, which is lockable. The suspension is introduced into the cylinder and pressurized with a hydraulic press, in this case 280 bar. Then the opening is opened through which the suspension is forced out. Due to the large pressure drop and large shear forces in the opening, aggregated components are disassembled and cells are broken open. The product obtained from the French Press is centrifuged in 50% acetic acid for 1 hour at 50,000 rpm.

De aldus verkregen oplossing met een pH van 3,5 wordt gebruikt 25 om glasplaatjes van 7,55 bij 2,55 cm aan elkaar te hechten. De gemeten sterkte was, zonder verdere toevoegingen of optimalisatie, reeds 25 N/cm2.The solution thus obtained with a pH of 3.5 is used to adhere glass plates of 7.55 by 2.55 cm together. The measured strength was, without further additions or optimization, already 25 N / cm2.

10007321000732

Claims

A protein-containing fraction suitable as an adhesive which can provide an adhesive bond with an adhesive strength of more than 15 N / cm 2, comprising one or more proteins based on 3,4-dihydroxyphenyl-alanine, available through mussel feet at pH> 7, Treat with a buffer solution, then wash at pH <3.0 and then treat the purified mass with high pressure drop and high shear, followed by separation of the solid and recovery of an aqueous solution of the protein-containing fraction .

The product of claim 1, wherein the resulting solution is further purified, modified and / or concentrated.

The product of claim 1, wherein the fraction contains one or more proteins based on decapeptides containing 3,4-dihydroxyphenylalanine.

The product of claim 1, wherein said decapeptide has the structure {Ala-Lys-Pro / Hyp-Ser / Thr-Ser / Thr-Tys / DOPA-Pro / Hyp-Pro / Hyp-Ser / Thr-Tys / DOPA-Lys } possession.

A method of preparing a protein-containing fraction suitable as an adhesive according to claims 1-4, comprising treating mussel feet at a pH> 7.0 with a buffer solution, washing them at a pH <3.0 and then treating the purified mass with high pressure drop and high shear, followed by separation of the solid and recovery of an aqueous solution of the protein-containing fraction.

The method of claim 5, wherein the resulting solution is further purified, modified and / or concentrated.

7. Use of the product of claims 1-4 as an adhesive, more particularly in a humid environment.

Use according to claim 7 as an adhesive for biomedical purposes. 1000732