MXPA99011769A - Sales de 5'-tetrafosfato de di(uridina), metodo para su preparacion y usos de las mismas - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a nuevos métodos para la síntesis del dinucleótido terapéutico, P1,P4-di(uridina-5'tetrafosfato y demuestra la aplicabilidad a la producción en grandes cantidades. Los métodos de la presente invención reducen substancialmente el periodo que se requiere para sintetizar tetrafosfato de diuridina, preferiblemente a tres días o menos. Las sales novedosas de tetraamonio y tetrasodio de P1,P4-ldi(uridina-5'-tetrafosfato) fórmula (1) preparadas mediante estos métodos son estables, solubles, no tóxicas y fáciles de manejar durante la manufactura. En la fórmula 1, X es Na, NH4 o H, con la condición de que todos los grupos X no sean H.

Description

SALES DE 5'-TETRAFOSFATO DE DI(URIDINA), MÉTODO PARA SU PREPARACIÓN Y USOS DE LAS MISMAS CAMPO TÉCNICO Esta invención se refiere la métodos para la producción de dinucleótidos terapéuticos que incluyen sales novedosas de los mismos. Más específicamente, se refiere a métodos para la síntesis de P1,P4-tetrafosfato de dí(uridina 5'), es decir, tetrafosfato de diuridina (U2P4) la cual tiene ventajas sobre los métodos de la técnica anterior de manufactura. ANTECEDENTE DE LA INVENCIÓN P1,P -tetrafosfato de di(urjdina 5') es un nucleótido de la siguiente estructura: - ' Formula l en donde: X es Na, NH4 o H, de manera que todos los grupos X no son H.

El ácido libre de P1,P4-tetrafosfato de di(uridina 5'), donde X es hidrógeno, ha sido previamente descrito como pentahidrogeno de tetrafosfato de uridina 5', P"'?5'-éster con uridina (Número de Registro CAS: 59985-21-6; C. Vallejo y otros, Biochimica et Biophysica Acta 438, 305 (1976) y H. Coste y otros, J. Biol.. Chem. Se han descrito diferentes métodos para la síntesis de dinucleótidos de purina tales como tetrafosfato de diadenosina (A2P4) (E. Pappaport y otros, Proc. Nati. Acad. Sci, 78, 838 (1981); A. Guranowski y L. Orgel, Nucí. Acid Res., 15, 3573, (1987)). Sin embargo, esto no ha sido real para el U2P4 el cual es nucleótido de pirimidina. Aunque los nucleótidos de purina y nucleótidos de pirinrridina aparentan ser análogos, los métodos usados para síntesis de nucleótidos de purina no trabajan necesariamente para pirimidinas tales como uridina. Se ha mostrado que el tetrafosfato de diuridina tiene propiedades benéficas para el tratamiento de varias enfermedades, tales como enfermedad de obstrucción pulmonar crónica (EOPC). Por ejemplo, se ha demostrado que facilitan la eliminación de secreciones mucosas de los pulmones de un individuo tal como mamíferos que incluye humanos en necesidad de tratamiento por varias razones, que incluye fibrosis cística, bronquitis crónica, asma, bronquiectasis, retención de mucosa post-operativa, neumonía, disquinesia ciliar primaria (M. J. Stutts, lll, y otros, la Patente de E.U.A No. 5,635,160; Publicación internacional de TCP WO 58 96/40059) y la prevención y tratamiento de la neumonía en pacientes inmovilizados (K. M. Jacobus y H.J. Leighton, Patente de E.U.A. No. 5,763,447). Además de usos terapéuticos incluyen tratamiento de fibrosis cística, bronquitis crónica, asma, bronquiectasia, alectectasia post-operativa y síndrome de Kartagener (Publicación Internacional TCP WO 98/03177), otitis media (Publicación Internacional TCP WO 97/29756)~ ojos resecos, desprendimiento de la retina, obstrucción del conducto nasolagrimal, el tratamiento de infertilidad femenina e irritación debido a resequedad vaginal vía secreción de mucosas incrementada e hidratación de la superficie epitelial, y el mejoramiento del desempeño de los atletas. ~-¿ El U2P también tiene utilidad como un producto veterinario en mamíferos tales como, pero no se limita a, perros, gatos y caballos. La metodología de la técnica anterior solamente un protocolo para la producción de tetrafosfato de diuridina. Este método es muy tardado, tarda alrededor de cinco días y produce solamente cantidades pequeñas de tetrafosfato de diuridina (C. Vallejo y otros, Biochimica et Biophysica Acta 43*8, 305 (1976), Sillero y otros, Eur. J. Biochem. 76, 332 (1972)). De acuerdo con esta técnica, el tetrafosfato de diuridina se sintetizó a través de una reacción de moriofosfomorfolidato de uridiná" 5' (0.54 _ mmoles) con la sal de trietilamina de ácido pirofosfórico (0.35 mmoles) en un medio de piricfina anhídrida (10 ml). Después de 5 días a 30°C, la piridina se removió de la mezcla de reacción por evaporación, y el residuo resúspendido en agua destilada en vidrio (8 ml), la suspensión A aplicada a la columna de celulosa DEAE (37.5 X 2.6 cm) y se fracciona con 3.2 L de un gradiente lineal (0.06-0.25 M) de bicarbonato de amonio, pH 8.6. La elución pico entre 0.17-0.19 M bicarbonato de amonio se caracterizó parcialmente como U2P4 mediante el siguiente criterio: insensibilidad a fosfatasa alcalina, relación de fósforo a la base y análisis de los productos de hidrólisis (UTP + UMP), después del tratamiento con fosfodiesterasa I, por electroforesis en el agente regulador de pH de citrato, pH 5.0. No se dan datos de rendimiento o espectroscópicos. Por lo tanto, el procedimiento de la técnica anterior para la síntesis de tetrafosfato de diupdina es prolongado y se producen solamente cantidades pequeñas de solamente tetrafosfato de diupdina parcialmente caracterizada. La presente invención se enfoca a métodos para producir este compuesto útil médicamente el cual puede llevarse a cabo más eficiente y convenientemente, y el cual puede aplicarse a la producción a gran escala de tetrafosfato de diuridina y sales del mismo. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención provee nuevos métodos para la síntesis del _nucleótido terapéutico, P ,P -tetrafosfato de di(uridina 5') (Fórmula I), y demuestra su aplicabilidad en la producción de grandes cantidades. Los métodos de la presente invención reducen sustancialmente el tiempo requerido para sintetizar el tetrafosfato de diuridina, preferiblemente de tres días o menos. Las sales de amonio o sodio novedosas de P1,P4-tetrafosfato de di(uridina 5') preparadas mediante estos métodos, son estables, solubles, no tóxicas, y fáciles de manejar durante la fabricación. Se prefiere la sal de tetraamonio; la sal de tetrasodio es más preferida. Fórmula I en donde: -X es Na, NH4 o H, siempre y cuando todos los grupos X no sean H. ~ El método para sintetizar los compuestos de la Formula I, y sales farmacéuticamente aceptables de la misma, se lleva a cabo mediante los siguientes pasos: 1) disolución de uridina o compuestos de nucleótidos de uridina de las Formulas 11 a-d en un solvente orgánico aprótico, polar, y una amina hidrofóbica; 2) fosforilación con un agente de fosforilación de las Fórmulas IVa-b y/o activación con un agente de activación de las Fórmulas llla-c; y 3) purificación por cromatografía de intercambio de iones. Otro aspecto de la presente invención son métodos para tratar varios estados de enfermedades, que incluyen, pero no se limitan a: enfermedades de obstrucción pulmonar crónica, sinusitis, otitis medía, obstrucción del conducto nasolagrimal, enfermedad de ojos resecos, separación de la retina, neumonía, e infertilidad femenina o irritación ocasionada por resequedad vaginal. - Otro aspecto de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende un compuesto de Formula I junto con un portador farmacéuticamente aceptable. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención provee nuevos métodos para la síntesis del nucleótido terapéutico, P1,P4-tetrafosfato de di(uridina 5'), y demuestra la capacidad de aplicación a la producción de grandes cantidades. Los métodos de la presente invención reducen sustancialmente el tiempo requerido para sintetizar P1,P4-tetrafosfato de di(uridina 5'), preferiblemente a tres días o menos. Las sales de amonio y sodio de P1,P4- tetrafosfato de di(uridina 5') (Fórmula I) preparadas por estos métodos son estables, solubles, no tóxicos, y de manejo fácil durante la manufactura. La presente invención, además, provee compuestos de la Fórmula I: Fórmula en donde: - X es Na, NH4 ó H, siempre y cuando todos los grupos X no sean H. Las sales de sodio y de amonio de P1,P4- tetrafosfato de di(uridina 5') tienen muchas ventajas. Las sales de sodio y amonio proveen buenos perfiles de estabilidad a largo plazo comparadas a los ,de cationes divalentes (por ejemplo, Ca2+, Mg2+, Mn2+) el cual cataliza la hidrólisis de esteres de fosfato. La sal de tetrasodio de P1,P4- tetrafosfato de di(uridina 5') no es irritante para los pulmones y los ojos. Otros cationes pueden irritar a los pulmones, ojos, y otros epitelios mucosos, o de otra manera no son bien tolerados por el cuerpo humano. Estas sales de sodio y amonio inorgánicas imparten excelente solubilidad en agua comparado con las sales de amina hidrofóbicas tales como tri- y tetrabutilamonio, y sales similares. La alta solubilidad en agua es una ventaja importante para la flexibilidad en formulaciones farmacéuticas de concentración variable. Las sales de tetraamonio y tetrasodio de P 1 , rP>4 - tetrafosfato de di(uridina 5') también son ventajosas en cuanto a que se purifican fácilmente por cromatografía de iones acuosa en la cual no se usan solventes orgánicos. Además, éstas sales se manejan fácilmente como sólidos blancos fofos comparado con un aceite o goma así como algunas sales de amina. Se prefiere la sal de tetrasodio. Los compuestos de la Fórmula I pueden usarse para facilitar la eliminación de secreciones mucosas de los pulmones de un individuo tal como un mamífero incluyendo seres humanos que necesitan el tratamiento por varias razones, incluyendo fibrosis cística, bronquitis crónica, asma, bronquiectasia, retención de mucosa post-operativa, neumonía, disquinesia ciliar primaria (M. J. Stütts, lll, y otros, Patente de E.U.A No. 5,635,160; Publicación -tí-internacional TCP WO 96/40059) y la prevención y tratamiento de neumonía en pacientes inmovilizados (K. M. Jacobus y H. J. Leighton, Patente de E.U.A No. 5,763,447). Además, los usos terapéuticos incluyen tratamientos de sinusitis (Publicación Internacional TCP Wo 98/03177), otitis media (Publicación Internacional TCP WO 97/29756), ojos resecos, desprendimiento de retina, obstrucción del conducto nasolagrimal, tratamiento de infejtilidad femenina e irritación debido a resequedad vaginal vía secreciones incrementadas de mucosa e hidratación de la superficie epitelial, y aumento del desempeño de atletas. Los compuestos de la fórmula I pueden administrarse oralmente, tópicamente, parenteralmente, por inhalación o rocío, intra-operativamente, rectalmente, ó vaginalmente en dosis de formulaciones unitarias que contienen portadores, adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables, no tóxicos, convencionales. El término tópicamente, como se usa en la presente, incluye parches, gelés, cremas, ungüentos, supositorios, pesarios, o gotas para nariz, oído u ojos. El término parenteral, como se usa en la presente, incluye inyecciones subcutáneas, intravenosas, intramusculares, inyección intraesternal o técnicas de infusión. Además, se provee una formulación farmacéutica que comprende un compuesto de la fórmula general I y un portador farmacéuticamente aceptable. Uno ó más compuestos de la Fórmula General I, pueden presentarse en asociación con uno o más portadores o diluyentes o adyuvantes farmacéuticamente aceptables no tóxicos y, si se desea, otros ingredientes activos. Uno de tales portadores podrían ser azúcares, en donde los compuestos pueden incorporarse íntimamente en la matnz a través de la vitrificación_o simplemente mezclándolos con el portador (por ejemplo, lactosa, sacarosa, trehalosa, manitol) u otros excipientes aceptables para el suministro a los pulmones o vías respiratorias. Uno o más compuestos de la fórmula general I, pueden administrarse por separado o junto con: mucolíticos tales como ADÑsa (Pulmozyme®) ó acetilcisteína, antibióticos, que incluyen pero" no se limitan a, Tobramycin® inhalado; anti-inflamatorios no esteroidales, antivirales, vacunas, descongestionantes y corticosteroides.

Las composiciones farmacéuticas que contienen compuestos de la Formula General I, pueden estar en una forma adecuada para uso oral, por ejemplo, como tabletas, cápsulas, pastillas, suspensiones acuosas u oleosas, polvos o granulos dispersibles, emulsión, cápsulas duras o suaves, ó jarabes o elixires. Las composiciones diseñadas para uso oral pueden prepararse de acuerdo a cualquier método conocido en la técnica de fabricación de composiciones farmacéuticas y tales composiciones pueden contener uno o más agentes seleccionados del grupo que consiste de agentes endulcorantes, agentes saborizantes, agentes colorantes y agentes conservadores con el fin de proveer preparaciones agradables al sabor y elegantes. Las tabletas contienen el ingrediente activo en combinación con excipientes farmacéuticamente aceptables no tóxicos, los cuales son adecuados para la fabricación de tabletas. Estos excipientes pueden ser, por ejemplo, diluyentes inertes, tales como, carbonato de calcio, carbonato de sodio, lactosa, fosfato de calcio o fosfato de sodio; los agentes de granulación y de desintegración, por ejemplo, afmidón de maíz o ácido algínico; agentes aglutinantes, por ejemplo, almidón, gelatina o acacia; y agentes lubricantes, por ejemplo, estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Las tabletas pueden ser no revestidas o revestidas mediante técnicas conocidas para retardar la desintegración y absorción en el tracto gastrointestinal y mediante el cual provee una acción sustanciada sobre un largo periodo. Por ejemplo, puede Ti emplearse un material de retardoLTtal como monoestearato de glicerol o diestearato de glicerilo. Las formulaciones para uso oral, también pueden presentarse como cápsulas de gelatina dura en donde el ingrediente activo se mezcla con un diluyente sólido Inerte, por ejemplo, carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolín^o como cápsulas de gelatina suave en donde el ingrediente activo se mezcla con agua o un medio oleoso, por ejemplo, aceite de cacahuate, parafina líquida o aceite de oliva. * Las suspensiones acuosas contienen los materiales activos en combinación con excipientes adecuados para la fabricación de suspensiones acuosas. Tales excipientes son agentes de suspensión, por ejemplo: carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa y alginato de sodio. Los agentes de dispersión o humectantes pueden ser un fosfatido presente en la naturaleza o productos de condensación de un óxido de alileno con ácidos grasos, ó productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga, o productos de condensación de óxido de etileno con esteres parciales de ácidos grasos y un hexitol, o productos de condensación de óxido de etileno con esteres derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol. Los expertos en la técnica reconocerán los diferentes excipientes específicos y agentes humectantes abarcados por la descripción general anterior. Las suspensiones acuosas también pueden contener uno o más conservadores, por ejemplo, etilo, o p-hidroxibonzoato de n-propilo, '?2 uno ó más agentes de coloración, uno o más agentes saborizantes, y uno o más agentes endulcorantes, tales como sacarosa o sacarina. s Los polvos dispersibles y granulos adecuados para la preparación de una suspensión acuosa por la adición de agua provee los ingredientes activos en combinación con agentes de dispersión o humectantes, y agentes de suspensión se ejemplifican por aquellos ya rñencionados anteriormente. También pueden estar presentes los excipientes adicionales, por ejemplo, agentes endulcorantes, saborizantes, y colorantes. __ Los - compuestos de la Fórmula I pueden administrarse parenteralmente en un medio estéril. El fármaco, dependiendo del vehículo y la concentración usados, puede, además, suspenderse o disolverse en el vehículo. Ventajosamente, los adyuvantes tales contó anestésicos locales, conservadores y agentes reguladores de pH, pueden disolverse en el vehículo. La preparación inyectable estéril puede ser una solución inyectable estéril o suspensión en un diluyente o solvente parenteralmente aceptable, no-tóxico. Entre los vehículos y solventes aceptables que pueden emplearse están el agua estéril, solución salina, ó solución de Ringer. Los compuestos de la Fórmula general I también pueden administrarse en forma de supositorios para la administración ótica, rectal o vaginal del fármaco. Estas composiciones pueden prepararse mezclando el fárrnaco con un excipiente no irntante adecuado el cual es sólido a temperaturas ordinarias pero líquido a la temperatura corporal y, por lo tanto, se fusionará para liberar el fármaco. Tales materiales son man'teca de cacao y glicoles de polietileno. Las soluciones de los compuestos de la Fórmula I pueden administrarse mediante instalación intra-operativa en cualquier sitio en el cuerpo. Los niveles de dosis únicas del orden de desde alrededor de 400 mg, preferiblemente en la escala de 10 a 300 mg, y más preferiblemente en la escala de 25 a 250 mg, son útiles en el tratamiento de las condiciones respiratorias indicadas anteriormente. Los niveles de dosis sencillas del orden de alrededor de 0.0005 a alrededor de 5 mg, preferiblemente en la escala de 0.001 a 3 mg y más preferiblemente en la escala de 0.025 a 1 mg, son útiles en el tratamiento de las condiciones oftálmicas indicadas anteriormente. La cantidad e ingrediente activo que puede combinarse con los materiales del portador para producir una forma de dosis única, variará dependiendo del huésped tratado y del modo particular de administración. Se entenderá, sin embargo, que el nivel de dosis especifica para cualquier paciente en particular, dependerá de una variedad de factores que incluyen la actividad del compuesto específico empleado, la edad, peso corporal, salud general, sexo, dieta, tiempo de administración, ruta de administración, y el régimen de excreción, la combinación del fármaco y la severidad de la enfej-medad particular que se somete a terapia. Los métodos sintéticos descritos posteriormente, abarcan varias estrategias sintéticas para producir P1,P4-tetrafosfato de di(uridina 5'). Generalmente, todos los métodos usan uridina o compuestos de nucleótido de updina de la Fórmula lla-d como materiales de inicio, los cuales se disuelven en un solvente orgánico aprótico, polar (por ejemplo, dimetilformamida, sulfóxido de dimetilo, dioxano, N-metilpirrolidona, trimetilfosfato) y una amina hidrofóbica (por ejemplo, trietilamina, tributilamina, trioctilamina, 2,4,6-colidina, tetrabutilamonio, tri- y tetra-aminas de alquilo, aminas heterocíclicas). El producto se obtiene fosforilando con un agente fosforilación de la Fórmula IV (por ejemplo, oxicloruro fosforoso, pirofosfato, cloruro de pirofosforilo) o activando un grupo fosfato con un agente de activación de la Fórmula lll (por ejemplo, carbonildiimidazol, un carbodiímida de alquilo o arilo, un fosfoclorhidrato de alquilo o arilo), respectivamente, con varios medios de purificación subsecuentes bien conocidos por los expertos en Fa técnica, que incluyen, pero no se limitan a, cromatografía de iones (por ejemplo, DEAE Sephadex, celulosa de DEAE, Dowex 50, resinas de intercambio aniónico y catiónico). Los materiales de partida de ß-D-ribofuranosilo de pipm¡dina,_ uridína, monofosfato de uridina 5' (UMP), difosfato de uridina 5' (UDP), y trifosfato de uridina 5' (UTP), se muestran como ácidos libres en las Fórmulas lla-d siguientes, respectivamente. Estos materiales están todos comercialmente disponibles en gran cantidad en diferentes formas de sales.

Formula Ha: Uridina Fórmula llb: UMP y sales de la misma; Fórmula He: UDP y sales de la misma; Fórmula lid: UTP y sales de la misma. - Los agentes de activación carbodiimida, carbonilo activado, y compuestos de fósforo activado, se muestran en las fórmulas generales 111 a-c posteriores, respectivamente. Fórmula Illa: Carbodiimida N=C=N < en donde R-i y R2 son alquilo ó cicloalquilo de C?-C8, alquilo o cicloalquilo de C1-C8 opcionalmente substituido (por ejemplo, grupos hidrbxi y amino); arilo o arilo opcionalmente substituido (por ejemplo, grupos hidroxi y amino). Los compuestos preferidos de la Fórmula Illa son diciclohexilcarbodiirrjida y clorhidrato de 1-(3-Dimetilaminopro pilo)- 3- eti I carbodiimida. Fórmula lllb: Carbonilo Activado o X A. en donde X es imidazol, tetrazol, y/o halógeno. Los compuestos preferidos de la Fórmula lllb son carbonildiimidazol y carbonilditriazol. Fórmula lile: Fósforo Activado O 11 Ri— — X -I R2 ~ en donde R y R2 son alquilo o cicloalquilo de C?-C8, alquilo, alcoxi o cicloalquilo de C?-C8 opcionalmente substituido (por ejemplo, grupos hidroxi y amino); arilo, ariloxi, alcoxi u opcionalmente arilo, ariloxi, o alcoxi substituidos (por ejemplo, grupos hidroxi y amino) y/o halógeno; y X es halógeno. Los compuestos preferidos de la Fórmula Ule son fosforoclorhidrato de difenilo, fósforodiclorhidrato de fenilo, dicloruro fenilfosfónico y cloruro de difenilfosfínico. Los agentes de mono- y difosforilación se muestran posteriormente en las fórmulas generales IVa-b. Formula IVa: Agentes de Monofosofrilación o II X— P— X I X en donde X es halógeno. El compuesto preferido de la fórmula IVa es un oxicloruro de fósforo.

Fórmula IVb: Agentes de Difosforilación en donde X es hidrógeno, hidroxi ó halógeno, y sales de los mismos. Los compuestos preferidos de la Fórmula IVb son cloruro de pirofosforilo y pirofosfato. Los expertos en la materia reconocen que la presente invención no se limita a los siguientes ejemplos y que pueden variar los pasos en los siguientes ejemplos. EJEMPLO 1 Método para la Producción de tetrafosfato de Diuridina, Sal de Tetrasodio Usando Difosfato de Uridina 5' La sal de disodio de uridina 5'difosfato (Yamasa, Choshi, Japón; 600 gramos) se disolvió en agua desionizada (5.4 L). La solución se pasó a través de una columna de Dowex 50W x 4 H + (Dow Chemical). Las fracciones que contienen difosfato de uridina 5' se hidrataron y se neutralizaron con tributilamina (Aldrich, St. Louis; 300 mL). Las fracciones neutralizadas se concentraron a un aceite usando un evaporador giratorio a una temperatura de baño de 55-60°C. El aceite se disolvió en dimetilformamida seca (Aldrich, 3L) y después se secó concentrando a un aceite usando un evaporador giratorio (temperatura de baño 55-60°C). Este paso se repitió dos veces. El aceite se disolvió de nuevo en dimetilformamida (3 L) y se agregó 1 , 1-carbonildiimidazol (Aldrich; 100 g). La solución se calentó a 50°C por 21/2 horas. Una cantidad adicional del agente de activación (33 gramos) se agregó y se continuó calentando por 21/2 horas adicionales. La solución se concentró de nuevo a un aceite en un evaporador giratorio (temperatura de baño 55-60°C). El aceite resultante se disolvió en agua desionizada a una conductividad igual a la de 0.2 M NH NCO3. La solución después se cargó en una columna de Sephadex DEAE-A25 (Farmacia, Upsala, Sweden; pre-dilatada en 1.0 M NaHCO3 y se lavó con 2 volúmenes de columna de H2O desionizada). La columna se eluyó con las siguientes soluciones en el siguiente orden: 60 L de 0~.25 M NH4HCO3, 120 L de 0.275 M NH4HCO3, 40 L de 0.30 M NH4HCO3 y 40L de 0.35 M NH4HCO3. Las fracciones que tienen cantidades suficientes de tetrafosfato de diuridina se agruparon como se determinó por análisis de CLAR y se concentraron en un evaporador giratorio (temperatura de baño 55-60°C). El residuo resultante se disolvió en agua desionizada (1.5 L) y se concentró sobre un evaporador giratorio. Este paso se repitió 15 veces o hasta que se removió el exceso del agente regulador de pH de bicarbonato. El aceite resultante se disolvió en una cantidad suficiente de agua desionizada para formar aproximadamente 10% de solución, la solución se cargó a una columna de Dowex 50Wx4 Na+ (Dow) y se eluyó con agua desionizada. Las fracciones que confienen U2P4 se agruparon y se concentraron a aproximadamente 10-15% de solución, las cuales se liofilizaron para producir sal de tetrasodio U2P4 como un sólido blanco (150 g aproximadamente dieron 35% basado en difosfato de uridina 5').

Estructura de Elucidación de la Sal de Tetrasodio P?_, P4-tetrafosfato de di(uridina 5') Debido a la carencia de datos espectroscópicos adecuados de dinucleótidos no-adenilados en la literatura, una elucidación de estructura completa de la sal de tetrasodio P-¡ , P4-tetrafosfato de di(uridina 5'), se desarrolló empleando técnicas analíticas modernas.

El peso molecular se determinó por la espectrometría de masas para ser ' 878 [m/z 855, (M-Na+)"], confirmando la fórmula C18H22N4O23P4»4Na. La masa exacta medida para C?8H22N4O23P4«3Na [M-Na+)": calculado 854.9318] fue 854.9268. La masa medida difirió de fa masa teorética por 5.0 unidades de milimasa (5.9 ppm) por un nive? de confianza de 99.7%. Él análisis de hidratación de KarI Fisher dio un valor de 1.73% H20 y, además, la confirmación de la fórmula molecular se obtuvo del_análisis elemental: calculado para Na=10.70, encontrado 10.81%; relación de C:P calculada 1.74, encontrada 1.80, basada en la fórmula molecular: C18H22N4O23P »4.2Na«1.1H2O (PF = 902.4 g/mol). El espectro de infrarrojo mostró una señal amplia a 3422 cm"1 y una señal a 1702 cm"1, que indican la presencia de grupos funcionales de hidroxilo (extensión de O-H), y carbonilo (extensión de C = O). Además, una extensión de fosfato P = 0 se observó a 1265 cm-1. El espectro de UV en agua exhibió una ?max de 262 nm con una absortividad molar (e) de 17,004. La rotación especifica a 25°C (c=1,H2O) se determinó por un polarímetro siendo de -9.56°.

- Los espectros de RMN son: RMN 1H (D2O,TMS) d 4.11 (m, 2H), 4.14 (m, 1H), 4.25 (m, 1H), 4.27 fm,1 H), 5.84 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 5.86 (d, J = 5.4 Hz,1H), 7081 (D, j = 8.1 hZ); RMN 13C (D2O,TMS) d 65.1 (d, J = 5.5 Hz), 69.7, 73.5,83.4 (d, J = 9.4 Hz), 88.1, 102.8, 141.5,152.9, 167.5; RMN 31P (D2O, H3PO4 std) d -22,32 (m), -10.75 (m). El 1H acoplado al espectro 31P mostró una ampliación de multipletes a d-10.75 ppm debido a la introducción del acoplamiento de 1H. El mulfiplete, por lo tanto, se confirmó como Pa. No hubo efecto de acoplamiento de 1H en el multiplete a -22.23 ppm, asignando a éste por omisión como Pp. Un efecto de Overhauser Nuclear (NOE) se observó para para H6 para los protones de azúcar 2- y H3>. Debido a que X<o es posible para H5 mostrar un NOE para los protones de azúcar, H6 se confirma. Adicionalmente, la substitución de N-i se confirma, debido a que no es posible el NOE de azúcar-pirimidina para una estructura substituida de N3. Los experimentos adicionales de RMN de 2 dimensiones, se realizaron para verificar la conectividad. MC muestra conectividad de H5 para C5 y H6 para C6, confirmando C5 y C6. La conectividad COSY y NÓE se observaron para H5 a H6, verificando H5. La conectividad de la unión en NBC 3, se observó para: H6 a C-r, C6 a Hr, H a C2', H6 a C2. Estos datos por lo tanto confirman la substitución H-i, C2 y Ni. La conectividad COSY de Hr a Y - confirma 2- y la conectividad MC de H a Cr y H2r a C2- confirma C-¡- y C2-. Adicionalmente, la conectividad NBC muestra 2-unión J desde H5 hasta C4, confirmando C4. Un espectro de DEPT 13C con mult=1.5 muestra el carbón a d 65.1 invertido relativo a todos los otros carbonos. Esta observación confirma que C5 es un metileno. El acoplamiento de 31P a carbonos a d 65.1 y 83.4 confirma C5' y C4r, debido a que C4> es el único metino acoplado. Además, HMQC muestra conectividad para C5' a H5' y C - a H4r, confirmando H4r y H5'- Un NOE se observó para H a H4', H6 a H2' y H6 a H3' confirmando la configuración del azúcar de anómero ß. En conclusión, sal de tetrasodio de P1,P4-tetrafosfato de di(ur]dina 5'), se sintetizó 150 g de escala en 25% de producción de materiales de partida comercialmente disponibles con un tiempo de reacción total de 5 horas. El producto crudo se purificó eficientemente por una cromatografía de intercambio de iones y la estructura del producto de reacción se probó sin ambigüedad usando masa espectroscopia, RMN y otras técnicas analíticas. EJEMPLO 2 Método para la Producción de Sal de Tetra-amonio de Tetrafosfato de Diuridina Usando Monofosfato de Uridina 5' Monofosfato de uridina 5' (Sigma, Milwaukee, 3.0 g, 9.26 mm?les) se disolvió en DMF seco (10 mL) y tribulamina (Aldrich, 2 mL). La solución se evaporó a vació a 40°C a un aceite. El residuo se disolvió en DMF seco (Aldrich, 8 mL) para formar una solución. Se agregó carbonildiimidazol (Aldrich, 1.65 g, 10.18 mmoles) a esta solución. La reacción se calentó a 50°C por una hora. Trifosfato de uridina 5' (Yamasa, 5.60 g, 10.18 mmoles) preparada como la sal de tributilamonio anhídrido en DMF (5 mL) y tributilamina (2 mL), como se describe en el Ejemplo 3 posteriormente, se agregó a la solución de la reacción. La mezcla se dejó agitar a 50°C durante tres días cuando la solución se evaporó in vacuo a un aceite, se redisolvió en agua (5 mL) y se purificó por la cromatografía de columna (300 X 50 MM) (Sephadex DEAE-A25, 40-120µ, Aldrich, 'pre-dilatado en 1.0 M NaHCO3 y se lavó con 2 volúmenes de columna de H2O desionizada (gradiente de H2O?0.3 M NH HCO3). Las fracciones puras se concentraron in vacuo a 35°C, y H20 agregado y se volvió a evaporar 5 veces para obtener sal de tetraamonio de tetrafosfato de diuridina como un sólido blanco (2.37 g, 30% de producción): 92.11% puro por CLAR con el mismo tiempo de retención como la norma. Además, la sal "de tetraamonio se analizó por FABMS para dar una masa de [C18?25N4O23P4 (M-N + )": calculado 788.9860] 788.9857, confirmando una fórmula madre de C?8H26N4O23P para el ácido libre]. EJEJflPLO 3A Méto_do para la Producción de Sal de Tetraamonio de Tetrafosfato de Diuridina usando Tetrafosfato de Uridina 5' (UTP) , Una solución de sal de trisodio de trifosfato de uridina 5' (UTP) (ProBioSint, Várese, Italia; 5.86 g, 0.01 moles) en agua (5 mL) se paso a través de una columna de BiRad AG-MP 50 (Aldrich) resina de intercambio de cationes fuertes en su forma de tributilamina (50 mL volumen de cama) y elutida con agua destilada (alrededor de 300 mL), A esta solución se agregó tributilamina (Aldrich; 5 mL), y la suspensión mezclada hasta el pH de la fracción acuosa llegó a 8. Las capas se separaron y la solución acuosa se evaporó a un pequeño volumen, después de liofiliza durante la noche. El residuo se disolvió en dimetilformamida seca (Aldrich; 20 ML) y el solvente evaporado a 0.1 mmHg. La sal de" tributilamina seca se formó a 100 mL con acetona anhídrida para producir una solución continua (0.1 M en UTP). Se agregó diciclohexilcarbodiimida (DCC) (Baker, Phillipsburg; 0.227 g, 1.2 mmoles) a una alícuota de la solución de UTP anterior (10 mL, 1.0 mmoles) y la solución se agitó a temperatura ambiente durante 30~minutos. La mezcla se agregó a la sal de trietilamina de monofosfato de uridína 5' (2.0 mmoles, preparada por la adición de trietilamina (0.5 mL) a una solución de moríofosfato de uridina 5' (UMP) (Sigma; 0.648 g en DMF), y se evaporó a sequedad). Esta suspensión después de evaporó 'a sequedad, el residuo se formó a 5.0 mL en DMF seco, y se dejó reposar a 40°C durante 24 horas. La mezcla de la reacción se separó por cromatografía semipreparativa de intercambio iónico (Hamilton columna de PRP X-100), eluyendo con un gradiente de bicarbonato de amonio 0-1.0 M, 5 mL/min, 30 minutos. El tetrafosfato de dinucleótido eluyó entre 21 y 23 minutos; el producto (76.7% de producción basada en UTP) se cuantificó por comparación de su absorción ultravioleta a ?max 263 jm con la de una solución normal de P1 P4-tetrafosfato de di(uridina 5'). EJEMPLO 3B Método para la Producción de Sal de Tetraamonio de Tetrafosfato de. iuridina Usando Trifosfato de Uridina 5' (UTP) y un Exceso de Agente de Activación ^La conversión de UTP a P1,P4-tetrafosfato de di(uridina 5') puede aumentarse por la activación de la sal de tributilamina (0.1 mmoles) con un gran exceso de DCC (0.1 g, .5 mmoles); en este caso la diciclohexilurea depositada se removió por filtración, la mezcla de reacción se extrajo con éter (10 mL) y el residuo se disolvió en DMF seco antes del tratamiento con UMP de tributilamina (0.2 mmoles). Mediante la separación cromatográfica de la mezcla de la reacción y la cuantificación por absorción ultravioleta como en el Ejemplo 3A anterior, el producto de tetrafosfato de uridina constituyó el 50.7% de las especies de uridilato en la mezcla, correspondiendo a una conversión de UTP de 95.9%. EJEMPLO 4A Método para la Producción de Sal de Tetraamonio de Tetrafosfato de Diuridina Usando Monofosfato de Uridina 5' Activado con Carbonildiimidazol Se disolvió monofosfato de uridina 5' (UMP) (0.324 g, 1.0 mmoles) en una mezcla de DMF seco (5mL) y tributilamina (237 µL, 1 mmoles), la solución se evaporó a sequedad, después dos veces más con'DMF para producir la sal de tributilamina anhídrida. El residuo se disolvió en DMF (5 mL) y carbonirdiimidazol (CDl) (0.81 g, 5 mmoles) agregado. La solución se dejó reposar durante 3 horas, después se agregó el metanol (324 µL, 8 mmoles) apara destruir el exceso de CDl. La solución se dejó reposar por una hora. Se agregó pirofosfato de tributilamina (Sigma, 0.228 g, 0.5 mmoles) y la suspensión se agitó bajo nitrógeno a temperatura ambiente. Después de 3 horas la reacción se extinguió con agua y'la mezcla se somete a CLAR como en el Ejemplo 3A anterior. El rendimiento de P1,P -tetrafosfato de di(uridina 5') como se cuantifica por su absorbencia a 263 nm, fue de 9.3%. EJEMPLO 4B Método para la Producción de Sal de Tetraamonio de Tetrafosfato de Diuridina Usando Monofosfato de Uridina 5' Activado con Fosfoclorhidrato de Difenilo La sal de tributilamina anhídrida de UMP (1.0 mmoles), preparada esencialmente como antes, se disolvió en una mezcla de dioxano seco (5 mL) y DMF (1 mL). Fosfoclorhidrato de difenilo (0.3 mL) y tributilamina (0.3 mL) se^agregaron y la solución se dejó reposar a temperatura ambiente durante 3 horas. El solvente se evaporó y el residuo se agitó con éter (-10 mL), después se dejó reposar a 4°C por 30 minutos El éter se decantó y el residuo se disolvió en una solución de pirofosfato de tributilamina (0.228 g, 0.5 mmoles) en DMF (3 mL). La sojución se guardó bajo nitrógeno a temperatura ambiente. Después de 3 horas la reacción se extinguió con agua y la mezcla se sometió a CLAR como en el Ejemplo 3A anterior. La producción de P1,P4- tetrafosfato de di(uridina 5') como se cuantificó por su absorbencia a 263 nm fue de 9.6%. EJEMPLO 5 Método para la Producción de Sal de Tetraamonio de Tetrafosfato de Diuridina Usando Uridina. Oxicloruro de Fósforo y Pirofosfato Se disolvió uridina (Aldrich, 0.244, 1 mmoles) en fosfato de trimetilo (Aldrich, 5 ml) y se agregó tributilamina (466 uL, 2 mm?les). La solución se agitó a 0 grados durante la adición de oxicloruro fosforoso (0.153 g (93.2 ul), 1 mmoles), y la suspensión resultante se agitó a 0°C durante 3 horas. La reacción se enfrió con 1.0 M de bicarbonato de trietilamina acuoso y la mezcla se extrajo con cloruro de metileno para remover fosfato de trimetilo. La solución acuosa se sometió a CLAR como en el Ejemplo 3A anterior. La conversión de uridina a P1,P4-tetrafosfato de di(uridina 5') se cuantificó por absorbancia del último a 263 nm fue de 6.83%. EJEMPLO 6 Método para la Producción de Tetrafosfato de Diuridina Usando Monofosfato de Uridina 5' y Cloruro de Pirofosforilo =.Se disolvió monofosfato de uridina 5' (UMP) (64.8 mg, 0.2 mmóles) en piridina seca (1 mL) y se agitó en hielo durante la adición de cloruro de pirofosforilo (13.9 uL (25 mg), 0.1 mmoles). La solución se volvió nebulosa casi inmediatamente, después se formó un precipitado blanco semicristaíino abundante el cual llegó a ser una masa gomosa dentro de 1-2 minutos. La mezcla se almacenó a temperatura ambiente toda la noche, se extinguió con agua y se sometió a CLAR como en el Ejemplo 3A anterior. La producción de P1,P4-tetrafosfato de di(uridina 5'), como se cuantifica por su absorbancia a 263 nm, fue de 15.8 %. Una cantidad substancial de P1, ^-trifosfato de di(uridina 5') (25.4%) se obtuvo como el producto principal.

EJEMPLO 7 Estabilidad Acuosa y Solubilidad de la Sal de Tetrasodio de P ,1 ,P Tetrafosfato de DKUridina 5') La solubilidad de la sal de tetrasodio de P1,P4-tetrafosfato de di(uridina 5') en agua, se determinó agregando porciones de sólido a un volumen conocido de agua desionizada hasta que la solución se volvió turbia. Por lo tanto, se determinó que la solubilidad máxima en agua es de aproximadamente 900 mg/mL. Los estudios de estabilidad de las soluciones acuosas o sólidas incubadas a temperaturas bajas (5°C) y elevadas (40°C), mostraron que menos del 1.5% de degradación se presente en un periodo de tres meses como se determina por el análisis de CLAR. Por lo tanto, se determinó que la sal de tetrasodio de P1 , P4-tetrafosfato de di(uridina 5'), tiene un excelente perfil de solubilidad y estabilidad adecuado para aplicaciones farmacéuticas EJE~MPLO 8 Toxicidad de la Sal de Tetrasodio de P1,P4-tetrafosfato de Difuridina yy 5'), en Animales El perfil toxicológico no-clínico de la sal de tetrasodio de P1,P4-tetrafosfato de di(uridina 5'), ha sido evaluada en una batería de pruebas toxicológicas genéticas que incluyen la prueba de mutación bacteriana inversa, la prueba citogenética in vitro en mamíferos, la prueba de mutación in vitro de genes de células de mamíferos, y la pru ba citogenética de micro-núcleos en ratones. Un estudio en conejos examinó la tolerancia _ ocular local y toxicidad ocular subcrónica después de las administraciones diarias múltiples por un periodo de seis semanas. Además, la sal de tetrasodio de P1,P4-tetrafosfato de di(uridina 5'), también ha sido probada en los dos estudios de toxicidad de inhalación aguda de dosis unitaria en ratas y perros, y un estudio de toxicidad intravenosa aguda de dosis unitaria en perros. Los resultados de estos estudios muestran que la sal de tetrasodio de P1,P4-tetrafosfato de di(uridina 5') no es genotóxica en una batería de pruebas de toxicología genética. No se observaron resultados adversos en los estudios de toxicología ocular. Un bajo grado de toxicidad aguda se observó en los estudios de inhalación de dosis unitaria (ratas y perros) y de toxicidad intravenosa (perros). Por lo tanto, se determinó que la sal de tetrasodio de P1,P4-tetrafosfato de di(uridina 5') tiene un excelente perfil de toxicología con un amplio margen de seguridad para la dosificación en seres humanos. EJE /GPLO 9 Seguridad y Eficacia de la Sal de Tetrasodio de P1,P4-Tetrafosfato ^ de D Uridina 5') en Voluntarios Humanos Normales La sal de tetrasodio de P , P4-tetrafosfato de di(uridina 5'), se evaluó en un estudio de seguridad y tolerancia, de aumento de dosis, controlado con placebo, doble siego de Fase I, en 75 voluntarios hornbres saludables normales. Se evaluaron cuarenta no fumadores y fumadores en 5 grupos de 16 voluntarios, comprendidos de 12 que reciben una sola dpsis en aerosol de la sal de tetrasodio de P ,1,P -tetrafosfato de d?(updina 5') (20-400 mg) y 4 que reciben placebo (solución salina normal). No se reportaron eventos adversos serios. No hubo cambios significantes en FEV1, FVC, MMEF, laboratorio clínico, ECG de plomo 12, o resultados de análisis de orina en cualquiera de los grupos con placebo o de fármacos activos. En los fumadores, la sal de tetrasodio de P1,P4-tetrafosfato de di(ur|dina 5') produjo un incremento de 2 veces a 7 veces dependiendo de la dosis, y la estimulación de la expectoración de esputo se sostuvo durante la siguiente hora de la recopilación del esputo. También se observó el efecto de la sal de tetrasodio de P1,P4-tetrafosfato de di(uridina 5') para inducir la expectoración de esputo en los no fumadores. En conclusión, la sal de tetrasodio de P1,P4-tetrafosfato de di(uridina 5'), es segura y bien tolerada en sujetos hombres normales y es efectiva para la estimulación de la expectoración de esputo cuando se comparó con el placebo.

Claims (25)

1. REIVINDICACIONES 1. Los compuestos de la fórmula I: Fórmula I en donde: X se selecciona del grupo que consiste de: Na, NH4 y H, siempre y cuando todos los grupos X no sean H.
2. 2. Sal deterasodi de P1,P4-tetrafosfato de di(uridina 5').
3. 3. Sal de tetraamonio de P1,P4-tetrafosfato de di(uridina 5'.
4. 4. Un proceso para la síntesis de un compuesto de la fórmula I, y sales farmacéuticamente aceptables del mismo, dicho proceso comprendiendo: -- a) disolución de uridina o un compuesto de nucleótido de uridina de las Fórmulas lla-d en un solvente orgánico aprótico, polar y uní amina hidrofóbica; ~ b) fosforilación con un agente fosforilación de una de las fórmulas IVa-b para dar un compuesto de Fórmula I, o activar un grupo de fosfato de dicho compuesto de nucleótido de uridina con un agente de activación de una de las fórmulas 111 a-c y haciéndolo reaccionar con un compuesto adecuado de la Fórmula llb-d para producir un compuesto de la Fórmula I; y c) purificar por cromatografía de intercambio de iones dicho compuesto de la Fórmula I y sales farmacéuticamente aceptables de la misma; Formula I en donde: X se selecciona del grupo que consiste de: Na, NH4 y H, siempre y cuando todos los grupos X no sean H; Fórmula Ha: Uridina Fórmula llb: UMP _ y sales de la misma; Fórmula lie: UDP y sales de la misma; Fórmula lld:UTP ; y sales de la misma; Fórmula Illa: Carbodiimida en donde R-i y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de: alquilo de C?-C8, cicloalquilo, y arilo, en donde dicho alquilo, cicloalquilo, o arilo se substituye opcionalmente con grupos hidroxi o amino; Fórmula lllb: Carbonilo Activado O x A. _en donde X se selecciona independientemente del grupo que consiste de: imidazol, tetrazol y halógeno; Fórmula Ule: Fósforo Activado R— P— X I R2 -en donde X es halógeno y Ri y R2 son seleccionados independientemente del grupo que consiste de: alquilo de C?-C8, cicloalquilo, alcoxi de C -C8, cicloalcoxi, arilo, y ariloxi, en donde dicho alquilo, cicloalquilo, alcoxi, cicloalcoxi, arilo o ariloxi se sustituyen opcionalmente con grupos hidroxi, amino, alcoxi, ó halógeno; Fórmula IVa: Agentes de Monofosforilación O 11 X— P— x I X en donde X es halógeno; Fórmula IVb: Agentes de Difosforilación en donde X se selecciona del grupo que consiste de: oxígeno, hidroxi, halógeno y sales de los mismos.
5. 5. El proceso de la reivindicación 4, en donde los compuestos de la Fórmula Illa se seleccionan del grupo que consiste de: diciclohexilcarbodiimida y clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropilo)-3-etilcarbodiimida.
6. 6. El proceso de la reivindicación 4, en donde los compuestos de la Fórmula lllb se seleccionan del grupo que consiste de: carbonildiimidazol y carbonilditriazol.
7. 7. El proceso de la reivindicación 4, en donde el compuesto de la Fórmula lile se selecciona del grupo que consiste de: fosforoclorhidrato de difenilo, fosfodiclorhidrato de fenilo, dicloruro fenilfofónico y cloruro difenilfosfínico. „
8. 8. El proceso de la reivindicación 4, en donde el compuesto de la Fórmula IVa es un oxicloruro de fósforo.
9. 9. El proceso de la reivindicación 4, en donde el compuesto de la Fórmula IVb se selecciona del grupo que consiste de: cloruro de pirofosforilo y pirofosfato. .
10. 10. El proceso de acuerdo con la reivindicación 4, que comprende la disolución de un compuesto de la Fórmula lie como se describe en la reivindicación 4 en un solvente orgánico aprótico, polar y una amina hidrofóbica, que se trata con un agente de activación de una de las fórmulas llla-c como se describe en la reivindicación 4, y subsecuentemente la purificación por medio de cromatografía.
11. 11. El proceso de acuerdo a la reivindicación 4, que comprende la disolución de un compuesto de la Fórmula llb como se describe en la reivindicación 4 en un solvente orgánico aprótico, polar y una amina hidrofóbica, que se trata con un agente de activación de una de Jas fórmulas llla-c como se describe en la reivindicación 4, seguido por la reacción con un compuesto de la Fórmula lid como se describe en la reivindicación 4, y subsecuentemente la purificación por medio de cromatografía.
12. 12. El proceso de acuerdo con la reivindicación 4, que comprende la disolución de un compuesto de la Fórmula lid como se describe en la reivindicación 4 en un solvente orgánico aprótico, polar y una amina hidrofóbica, que trata con una cantidad equimolar de agente de activación de una de las fórmulas llla-c como se describe en la reivindicación 4t seguido por la reacción con un compuesto de la Fórmula llb como se describe en la reivindicación 4, y subsecuentemente la purificación por medio de cromatografía.
13. 13. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 12, por el cual se usa un exceso de agente de activación.
14. 14. El proceso de acuerdo con la reivindicación 4, que comprende la disolución de un compuesto de Fórmula llb como se describe en la reivindicación 4 en un solvente orgánico aprótico, polar, y una amina hidrofóbica, que trata dicho compuesto con un agente de activación de una de las fórmulas llla-c como se describe en la reivindicación 4, seguido por la reacción con un compuesto adecuado de la Fórmula IVb como se describe en la reivindicación 4, y subsecuentemente la purificación por medio de cromatografía.
15. 15. El proceso de acuerdo con la reivindicación 4, que comprende la disolución de un compuesto de Fórmula Ha como se describe en la reivindicación 4 en un solvente orgánico aprótico, polar y una amina hidrofóbica, que trata dicho compuesto con agentes de fosforilación de una de las Fórmulas IVa-b como se describe en la reivindicación 4, y subsecuentemente la purificación por medio de la cromatografía.
16. 16. El proceso de acuerdo con la reivindicación 4, que comprende la disolución de un compuesto de la Fórmula llb como se describe en la reivindicación 4 en un solvente orgánico aprótico, polar y una mina hidrofóbica^ que trata con un agente de fosforilación de la Fórmula IVb como se describe en la reivindicación 4, y subsecuentemente la purificación por medio de cromatografía. ^
17. 17. Un método para tratamiento de enfermedades pulmonares obstructivas crónicas en un mamífero administrando una cantidad para tratamiento de enfermedades pulmonares obstructivas crónicas de un compuesto de la Fórmula I como se describe en la reivindicación 1. _-
18. 18 Un método para tratamiento de sinusitis, otitis media u obstrucción del conducto nasolagrimal en un mamífero administrando una cantidad de eliminación de secreción de mucosa efectiva de un compuesto de la Fórmula I, como se describe en la reivindicación 1.
19. 19. Un método para tratamiento de resequedad de ojos en un mamífero administrando una cantidad efectiva para tratamiento de resequedad el ojo de un compuesto de a Fórmula I como se describe en la reivindicación 1.
20. 20. Un método para tratamiento de desprendimiento de la retina en un mamífero administrando una cantidad efectiva para tratamiento de desprendimiento de la retina de un compuesto de la Fórmula I como se describe en la reivindicación 1. _
21. 21. Un método para tratamiento o prevención de neumonía en un mamífero administrando una cantidad efectiva para tratamiento de prevención de neumonía de un compuesto de la Fórmula I como se describe en la reivindicación 1.
22. 22. Un método para facilitar de inducción de esputo en un mamífero administrando una cantidad de un compuesto de la Fórmula I, como se describe en la reivindicación 1, efectivo para facilitar la inducción de esputo. r.
23. 23. Un método para facilitar la expectoración en un mamífero administrando una cantidad de un compuesto de la Fórmula I como se describe en la reivindicación 1 efectiva para facilitar la expectoración.
24. 24. Un método para tratamiento de infertilidad femenina o irritación vaginal debido a la resequedad vaginal administrando una cantidad efectiva para tratamiento de resequedad vaginal de un compuesto de la Fórmula I como se describe en la reivindicación 1. -
25. 25. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la Fórmula I como se describe en la reivindicación 1 junto con un portador farmacéuticamente aceptable de la misma.