MXPA99011188A - Moduladores de las rutas intracelulares de inflamacion muerte celular y sobrevivencia celular - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una proteína B1, sus isoformas, análogos, fragmentos y derivados, ADN que codifica para la misma y la producción recombinante de la misma;la proteína esútil en la modulación de rutas de inflamación intracelular, muerte celular y/o supervivencia celular.

Description

MODULADORES DE LAS RUTAS INTRACELULARES DE INFLAMACIÓN, MUERTE CELULAR Y SOBREVIVENCIA CELULAR CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención está, de manera general, en el campo de los moduladores de las rutas intracelulares de muerte celular y sobrevivencia celular mediadas, entre otros, por los receptores de la superfamilia de receptores de FNT/FCN y sus proteínas adaptadoras intracelulares asociadas, y las enzimas caspasa y cinasa. Más específicamente, la presente invención se refiere a una nueva proteína, denominada originalmente como CBK, pero designada actualmente como B1 , sus isoformas, análogos, fragmentos y derivados, los cuales parecen ser capaces de interactuar directa o indirectamente, con diversas proteínas y enzimas ¡ntracelulares que pertenecen a las rutas de muerte celular, sobrevivencia celular e inflamación, y la cual es, por lo tanto, un modulador de estas rutas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La superfamilia de receptores del Factor de Necrosis Tumoral/Factor de Crecimiento Nervioso (FNT/FCN) es definida por la homología estructural entre los dominios extracelulares de sus elementos (Bazan, 1993; Beutler y van Huffel, 1994; Smith y otros, 1994). Excepto por dos receptores, el receptor p55 de FNT y el receptor Fas/APO1 , los diversos elementos de esta familia de receptores no muestran una clara similitud de estructura en sus dominios intracelulares. No obstante, existe mucha similaridad de función entre los receptores, lo que indica que comparten rutas de señalización comunes. Un ejemplo de esta similitud es la capacidad de varios receptores de la familia FNT/FCN para activar al factor de transcripción NF-?B. Esta capacidad común se atribuyó a una capacidad de una proteína citoplasmática que activa a NF-?B, el Factor 2 Asociado al Receptor de FNT (TRAF2) para unirse a los dominios intracelulares estructuralmente no similares de varios de los receptores de la familia FNT/FCN. Se desconoce mediante que mecanismos el TRAF2 actúa y como se coordina su respuesta hacia los diferentes receptores a los cuales éste se une. El TRAF2 es un elemento de una familia recientemente descrita de proteínas denominadas TRAF que incluye varias proteínas identificadas como, por ejemplo, TRAF1 , TRAF2, (Rothe, M., Wong, s.c., Henzel, W.J. y Goeddel, D (1994) Cell 78:681 -692; la solicitud publicada en PCT WO 95/33051 ), TRAF3 (Cheng, G. y otros (1995)), y TRAF6 (véase Cao y otros, 1996a). Todas las proteínas que pertenecen a la familia TRAF comparten un alto grado de identidad de aminoácido en sus dominios C-terminales, mientras que sus dominios N-terminales pueden no estar relacionados. Tal y como se muestra en una figura esquemática de TRAF (fig. 1 ), la molécula contiene un motivo de dedo de anillo y dos motivos de dedo de zinc tipo TFIIIA en su área C-terminal. La mitad C-terminal de la molécula incluye una región conocida como el "dominio TRAF" que contiene una región de zipper de leucina que se extiende entre los aminoácidos 264-358 (denominada N-TRAF), y otra parte hacia el extremo carboxi del dominio entre los aminoácidos 359-501 (denominada C-TRAF) la cual es responsable del enlace del TRAF a los receptores y a las otras moléculas TRAF para formar homo- ó heterodímeros. La activación del factor de transcripción NF-?B es una manifestación de la cascada de señalización iniciada por algunos de los receptores de FNT/FCN y mediada por TRAF2. El NF-?B comprende elementos de una familia de proteína formadoras de dímeros con homología al oncogen Reí los cuales, en su forma dimérica, actúan como factores de transcripción. Estos factores son ubicuos y participan en la regulación de la expresión de genes múltiples. Aunque identificados inicialmente como un factor que está presente de manera, constitutiva en las células B en la etapa de expresión de la cadena ligera de lg?, el NF-?B se conoce principalmente por su acción como un activador transcripcional inducible. En la mayoría de los casos conocidos el NF-?B se comporta como un factor primario, es decir, la inducción de su actividad es mediante la activación de moléculas preexistentes presentes en la célula en su forma inactiva, en vez de su síntesis de-novo, la cual a su vez descansa en factores de transcripción inducibles que encienden al gen de NF-?B. Los efectos de NF-?B son altamente pleiotrópicos. La mayoría de estos efectos numerosos comparten las características comunes de ser rápidamente inducidos en la respuesta a un estímulo extracelular. La mayoría de los agentes que activan a NF-?B son inductores de la defensa inmune, incluyendo componentes de virus y bacterias, citocinas que regulan la respuesta inmune, luz UV y otros. Por consiguiente, muchos de los genes regulados por NF-?B contribuyen a la defensa inmune (véase Blank y otros, 1992 Grilli y otros, 1993; Baeuerle y Henkel, 1994, para revisiones). Una característica principal de la regulación de NF-?B es que este factor puede existir en una forma citoplásmica que no se une a ADN que puede ser inducida a translocación al núcleo, unirse al ADN y activar la transcripción. Esta forma dual de las proteínas de NF-?B está regulada por I-KB - una familia de proteínas que contiene repeticiones de un dominio que inicialmente ha sido discernido en la proteína anquirina de eritrocito (Gilmore y Morin, 1993). En la forma no estimulada, el dímero de NF-?B se presenta en asociación con una molécula de 1-?B la cual le impone la localización citoplasmática y previene su interacción con la secuencia de ADN que se une a NF-?B y la activación de la transcripción. La disociación de 1-?B a partir del dímero de NF-?B constituye el paso crítico de su activación por muchos de sus agentes inductores (DiDonato y otros, 1995). El conocimiento de los mecanismos que están implicados en esta regulación todaruta es limitado. Existe también poco entendimiento sobre la manera en la cual se determina la especificidad celular en términos de respuesta a los diversos agentes inductores de NF-?B.

Uno de los más potentes agentes inductores de NF-?B es la citocina del factor de necrosis tumoral (FNT). Existen dos diferentes receptores de FNT, los receptores p55 y p75 (p55-R y p75-R). Sus niveles de expresión varían independientemente entre células diferentes (Vandenabeele y otros, 1995). El receptor p75 responde de manera preferencial a la forma de FNT unida a célula (el FNT se expresa tanto como una proteína beta de transmembrana y como una proteína soluble) mientras que el receptor p55 responde igual de efectivamente a las moléculas de FNT solubles (Grell y otros, 1995). Los dominios intracelulares de los dos receptores no están estructuralmente relacionados y se unen a diferentes proteína citoplasmáticas. Sin embargo, por lo menos parte de los efectos de FNT, incluyendo el efecto citocida de FNT y la inducción de NF-?B, pueden inducirse por ambos receptores. Esta característica es específica de la célula. El receptor p55 es capaz de inducir un efecto citocida o activación de NF-?B en todas las células que muestran tales efectos en respuesta a FNT. El p75-R puede tener tales efectos solo en algunas células. Otras, aunque expresan al p75-R en niveles elevados, solo muestran inducción de los efectos en respuesta a la estimulación del p55-R (Vandenabeele y otros, 1995). Además de los receptores de FNT, algunos otros receptores de la familia de receptores de FNT/FCN: CD30 (McDonald y otros, 1995), CD40 (Berberich y otros, 1994, Lalmanach-Girard y otros, 1993), el receptor de linfotoxina beta y, en unos cuantos tipos de células, Fas/APO1 , (Rensing-Ehl y otros, 1995), también son capaces de inducir la activación de NF-?B. El receptor de IL-1 tipo 1 , también desencadena efectivamente la activación de NF-?B, comparte la mayoría de los efectos de los receptores de FNT a pesar del hecho de que este no tiene una similaridad estructural a los mismos. La activación de NF-?B después del desencadenamiento de estos diversos receptores resulta de la fosforilación inducida de sus moléculas 1-?B asociadas. Esta fosforilación marca a 1-?B para degradación, lo cual sucede más probablemente en el proteosoma. La naturaleza de la cinasa que fosforila a 1-?B, y su mecanismo de activación después del desencadenamiento de receptor todaruta se desconoce. Sin embargo, en los dos años recientes se ha obtenido algo de conocimiento en cuanto a la identidad de las tres proteínas asociadas al receptor que parecen tomar parte en la iniciación de la fosforilación (véase la ilustración diagramática en las figuras 2a y 6). Una proteína denominada TRAF2, inicialmente clonada por D. Goeddel y sus colegas (Rhote y otros, 1994), parece jugar un papel central en la activación de NF-?B por los diversos receptores de la familia de FNT/FCN. La proteína, la cual cuando es expresada en niveles elevados puede por si misma hacer desencadenar la activación de NF-?B, se une a FNT-R p75 activado (Rothe y otros, 1994), al receptor de linfotoxina beta (Mosialos y otros, 1995), CD40 (Rothe y otros, 1995a) y CD-30 (datos no publicados) y regula la inducción de NF-?B por los mismos. La TRAF2 no se une al receptor de FNT p55 ni a Fas/APO1 , sin embargo, esta se puede unir a la proteína asociada al receptor p55 denominada TRADD y esta proteína TRADD tiene la capacidad de unirse a la proteína asociada con Fas/APO1 denominada MORT1 (o FADD- véase Boldin y otros, 1995b y 1996). Otra proteína que interactúa con el receptor, denominada RIP (véase Stanger y otros, 1995) también es capaz de interactuar con TRAF2 así como con FAS/APO1 , TRADD, el receptor de FNT p55 y MORT-1. Por lo tanto, aunque RIP ha sido asociada con la inducción de citotoxicidad celular (muerte celular), su capacidad para interactuar con TRAF2 también la implica en la activación de NF-?B y está puede también servir para aumentar adicionalmente la interacción entre FAS/APO1 , MORT-1 , el receptor p55 de FNT y TRADD con TRAF2 en la ruta que conduce a la activación de NF-?B. Estas asociaciones aparentemente permiten que el receptor p55 de FNT y Fas/APO1 desencadenen la activación de NF-?B (Hsu y otros, 1995, Boldin y otros, 1995; Chinnaiyan y otros, 1995; Varfolomeev y otros, 1996; Htsu y otros, 1996). El desencadenamiento de la activación de NF-?B por el receptor de IL-1 se presenta independientemente de TRAF2 y puede implicar una proteína-cinasa asociada al receptor IL-1 recientemente clonada denominada IRAK (Croston y otros, 1995). No es claro mediante qué mecanismo actúa TRAF2. Se han identificado diversas moléculas citoplasmáticas que se unen a TRAF2 (Rothe y otros, 1994; Rothe y otros, 1995b). Sin embargo, la información sobre estas moléculas no proporciona ninguna pista en cuanto a la manera en la cual TRAF2, la cual por si misma no posee ninguna actividad enzimática, desencadena la fosforilación de l-?B. No existe información todaruta de los mecanismos que dictan el patrón de activación específico de la célula de TRAF2 por diferentes receptores, tal como se ha observado para la inducción de NF-i B por los dos receptores de FNT. Además de lo antes mencionado, acerca de las diversas proteínas TRAF, deberá también indicarse que TRAF2 se une a los receptores de FNT p55 (CD120a) y p75 (CD120b), así como a diversos otros receptores de' la familia de receptores de FNT/FCN, ya sea directa o indirectamente mediante otras proteínas adaptadoras tal y como se indicó anteriormente, por ejemplo con referencia al receptor de FAS/APO1 , y las proteínas adaptadoras MORT-1 , TRADD y RIP. Como tal, TRAF2 es crucial para ia activación de NF-kB (véase también Wallach, 1996). Sin embargo, TRAF3 normalmente inhibe la activación de NF-kB por algunos receptores de la familia de FNT/FCN (véase Rothe y otros, 1995a), mientras que TRAF6 se requiere para la inducción de NF-kB por IL-1 (véase Cao y otros, 1996a). Por consiguiente, en cuanto a la activación de NF-kB y su importancia para mantener la viabilidad celular, hasta hoy no han sido claramente elucidadas las diversas rutas intracelulares implicadas en esta activación, por ejemplo, el cómo las diversas proteínas TRAF están implicadas directa o indirectamente. Además, según se sabe actualmente respecto a los diversos elementos de la familia de receptores de FNT/FCN y sus rutas intracelulares de señalización asociadas que incluyen a diversas proteínas adaptadoras, mediadoras/moduladoras (véanse las revisiones breves y referencias en, por ejemplo las solicitudes de patente Israelíes co-pendientes de propiedad común Nos. 1 14615, 1 14986, 115319, 1 16588), FNT y el ligando FAS/APO1 , por ejemplo, pueden ambos tener efectos tanto benéficos como dañinos en las células. Por ejemplo FNT contribuye a la defensa del organismo en contra de tumores y agentes infecciosos y contribuye a la recuperación del daño induciendo la muerte de células tumorales y células infectadas con virus, aumentando las actividades antibacterianas de los granulocitos, y por lo tanto en esos casos la aniquilación celular inducida por FNT es deseable. Sin embargo, un exceso de FNT puede ser dañino y se sabe que FNT como tal juega un papel patogénico importante en un número de enfermedades tales como choque séptico, anorexia, enfermedades reumáticas, inflamación y reacciones injerto vs hospedero. En tales casos la aniquilación celular inducida por FNT no es deseable. Por ejemplo, el ligando FAS/APO1 también tiene efectos deseables y dañinos. Este ligando de FAS/APO1 induce mediante su receptor la aniquilación de células T autoreactivas durante la maduración de las células T, es decir la aniquilación de células T que reconocen auto-antígenos, durante su desarrollo y previniendo por lo tanto las enfermedades autoinmunes. Además, diversas células malignas y células infectadas con VIH portan al receptor de FAS/APO1 sobre su superficie y pueden de está manera ser destruidas mediante la activación de su receptor por su ligando o por anticuerpos específicos al mismo, y por lo tanto la activación de las rutas intracelulares de muerte celular (apoptosis) mediadas por este receptor. Sin embargo, el receptor de FAS/APO1 puede mediar efectos dañinos, por ejemplo, la aniquilación no controlada de tejido que se observa en ciertas enfermedades tales como hepatitis aguda que es acompañada por la destrucción de las células hepáticas. En vista de lo anterior, es decir, que los receptores de la familia de FNT/FCN pueden inducir las rutas de muerte celular por un lado y pueden inducir las rutas de sobrevivencia celular (mediante la inducción de NF-kB) por el otro lado, existe aparentemente un balance fino, intracelularmente entre estas dos rutas opuestas. Por ejemplo, cuando se desea conseguir la destrucción máxima de células cancerosas u otras células enfermas o infectadas, sería deseable tener a FNT y/o el FAS/APO1 induciendo solo la ruta de muerte celular sin inducir a NF-kB. De manera contraria, cuando se desea proteger células en contra de, por ejemplo la inflamación, las reacciones injerto vs hospedero, hepatitis aguda, seria deseable bloquear la inducción de aniquilación celuiar de FNT y/o el ligando de FAS/APO1 y aumentar, en cambio, su inducción de NF-kB. De manera similar, en ciertas circunstancias patológicas sería deseable bloquear las rutas de señalización intracelular mediadas por el receptor p75 de FNT y el receptor IL-1 , mientras que en otras sería deseable aumentar estas rutas intracelulares. Recientemente, los inventores de la presente han aislado una cinasa denominada NIK (solicitud de patente Israelí Nos. 1 7800, 1 19133 y documento WO 97/37016), que es capaz de unirse a TRAF2 y está directamente implicada en las reacciones de fosforilación que conducen a la inducción de la activación de NF-kB.

Además, diversos investigadores han aislado recientemente un número de caspasas (incluyendo los inventores de la presente (ver solicitud de patente Israelí co-pendiente, de propiedad común No. IL 120759)), que interactúan con las proteínas adaptadoras antes mencionadas (por ejemplo MORT-1/FADD) o con complejos entre las proteínas adaptadoras y los diversos receptores de la familia de receptores de FNT/FCN y las cuales efectúan las reacciones proteolíticas que conducen a la muerte celular apoptópica. Por lo tanto, la modulación directa de estas caspasas podría desearse en situaciones indicadas anteriormente cuando se desea inhibir o aumentar la muerte celular, por ejemplo, cuando se desea inhibir la muerte celular sería deseable inhibir la actividad de estas caspasas. En este sentido se ha reportado (véase la revisión en Hofmann y otros, 1997) que existe una región denominada un prodominio en muchas de estas caspasas que también está presente en un número de proteínas adaptadoras tales como, por ejemplo, RAIDD (la cual interactúa con RIP, TRADD y por lo tanto con MORT-1/FADD, de FNT-R-p55 y FAS/APO1 ), una proteína adaptadora de la ruta de muerte celular; y c-IAPI , C-IAP2, dos proteínas que parecen ser inhibidores de apoptosis y las cuales por sí mismas interactúan con TRAF2, y con lo cual pueden ser inhibidores de caspasas o de alguna otra manera estimulan la implicación de TRAF2 en la ruta de sobrevivencia celular que resulta en la inducción de la activación de NF-kB. Como tal este prodominio ha sido también designado como CARD por "dominio de reclutamiento de caspasas" (véase Hofmann y otros, 1997). Este prodominio (CARD) por lo tanto representa otro objetivo para la modulación de las rutas intracelulares de señalización asociadas con la inducción de muerte celular. Además, se ha descrito recientemente (véase la revisión por Yang y Korsmeyer, 1996) otra familia de proteínas denominadas la familia de proteínas BCL2, de las cuales las proteínas BCL2, sus homólogos BCL-X incluyendo las dos formas de las mismas que son BCL-XL y las BCL-Xs alternativamente empalmadas, MCL1 , A1 , BAK, BAD, BAG1 , BAX, la E1B-19k de adenovirus y la proteína CED-9 de Caenorkabditis elegans (C. Elegans) son todas elementos. De estas proteínas se ha observado que BCL2, BCL-XL, E1 B-19k y CED-9 funcionan para inhibir la apoptosis, o para proteger en contra de la apoptosis inducida por diversas rutas intracelulares de señalización (véase Yang y Korsmeyer, 1996). BCL2 y BCL-XL también son aparentemente proteínas intracelulares unidas a membrana localizadas en la mitocondria así como en el retículo endoplásmico liso, y la membrana perinuclear, cuyo extremo C-terminal tiene una secuencia de señal de anclaje responsable de marcar o insertar a las mismas en la membrana mitocóndrica exterior y las otras, antes anotadas, membranas intracelulares. Una vez que están ancladas en las diversas membranas intracelulares, las proteínas. BCL2 y BCL-XL quedan expuestas al citosol en donde estas pueden interactuar con algunas otras proteínas intracelulares. Aun no se elucida completamente la manera en la cual las BCL2, BCL-XL, E1 B-19k y CED-9 protegen a las células, pero parece que su efecto es aparentemente en las etapas posteriores de los efectores de muerte celular siendo las diversas caspasas indicadas anteriormente, tales como por ejemplo ICE y las proteasas tipo ICE de la familia ICE/CED-3 incluyendo CPP32/Yama, ICE-LAP3 (Mch3), ICH-1 y otros. De hecho, se encontró que CED-9 es un inhibidor específico de las proteasas CED-3 y CED-4 efectoras de muerte de C. Elegans, y BCL2 es aparentemente un inhibidor de ICH-1 (también denominado NEDD2), en particular, la forma ICH-1 la cual promueve la muerte celular. Por lo tanto, mientras que el mecanismo preciso de inhibición de apoptosis por BCL2, BCL-X , CED-9 yEIB-19k, no es todaruta claro, este es aparentemente en etapas posteriores de las proteasas ICE-CED-3 que son los efectores de muerte (véase la revisión de Yang y Korsmeyer, 1996, así como de Chinnaiyan y otros, 1996). En cuanto a los otros elementos de la familia de BCL2 indicados anteriormente, BAX es un promotor de muerte celular. BAX se une así mismo y en la forma de tales homodímeros de BAX este promueve la apoptosis. BAX también se une a BCL2 y BCL-XL y tales heterodímeros están asociados con el efecto protector de BCL2 en contra de apoptósis. De esta manera el balance entre las cantidades de los homodímeros de BAX/BAX y los heterodímeros de BAX/BLC2 determina si la célula será susceptible a apóptosis o si ésta será protegida en contra de apóptosis. BAX aparentemente también es una proteína unida a membrana intracelular que también está localizada en grado elevado en la membrana exterior mitocóndrica (para lo concerniente a BAX antes mencionado, véase también la revisión por Yang y Korsmeyer, 1996). Además, las proteínas BAK y BAD antes indicadas actúan también como reguladores negativos de la actividad de BCL2 y BCL-X , es decir, estas reprimen la capacidad de BCL2 y BCL-X para proteger a las células de la apóptosis. Parece que ambas BAK y BAD unen a BCL2 y BCL-XL y por lo tanto previenen que BAX se una a BCL2 y BCL-XL lo que resulta en cantidades incrementadas de homodímeros de BAX/BAX y subsecuentemente una muerte celular incrementada (véase la revisión por Yang y Korsmeyer, 1996). En este sentido también parece que BAK funciona para bloquear la actividad represora de muerte de BCL2 y BCL-X directamente ya que los heterodímeros de BAK/BCL2 y BAK/BCL-XL carecen de la capacidad para proteger las células de la apoptósis. BAD parece remplazar a BAX a partir de los herodímeros a partir de BAX BCL2 y BAX/BCL-XL proveyendo por lo tanto cantidades aumentadas de homodímeros de BAX/BAX promotores de muerte. Mientras que BAK también parece ser una proteína unida a membrana intracelular localizada a, entre otras, las membranas exteriores mitocónd ricas, BAD, sin embargo, carece aparentemente de una secuencia de anclaje a membrana y como tal no es una proteína unida a membrana (véase la revisión de Yang y Korsmeyer, 1996). Otro de los elementos anteriores de la familia de BCL2 es BAG1 (véase Yang y Korsmeyer, 1996) la cual es un modulador positivo de la actividad de BCL2 que conduce a una actividad protectora de BCL2 incrementada en contra de apóptosis e incluso provee actividad protectora de BCL2 en contra de apóptosis en células a las que se induce apóptosis mediante señales que normalmente no están suprimidas por BCL2.

Deberá indicarse que la forma empalmada alternativamente antes mencionada de BCL-XL, es decir la proteína BCL-Xs también es un antagonista de la actividad de BCL-XL y BCL2, y bloquea su actividad protectora en contra de apóptosis (véase además la revisión de Yang y Korsmeyer, 1996). En vista de lo antes mencionado parece que la familia de BCL2 de proteínas juega un papel para regular las rutas de sobrevivencia o muerte celular de manera entraceiular y un desplazamiento en el balance de proteínas de esta familia que activamente bloquea la apóptosis hacia aquellas que promueven la apóptosis o inhiben la activadad antiapoptótica puede resultar en muerte celular aumentada, y de manera similar, un desplazamiento en el balance en el otro sentido puede resultar en una sobrevivencia celular aumentada. Por consiguiente, cuando se desea incrementar la muerte celular incrementando la apóptosis en las células bajo las circunstancias indicadas anteriormente seria deseable bloquear la actividad de BCL2, BCL-X y otros elementos de esta familia los cuales suprimen o inhiben la apóptosis, o incrementar la actividad de BAX, BAK, BAD, BCL-XS y otros elementos de esta familia los cuales promueven la apóptosis o inhiben las actividades antiapoptóticas de BCL2 o BCL-XL. De manera similar, cuando se desea incrementar la sobrevivencia celular en células disminuyendo la apóptosis, sería deseable incrementar la actividad de BCL2, BCL-XL y otros elementos de esta familia los cuales suprimen o inhiben la apóptosis, o disminuir la actividad de los promotores de apóptosis de esta familia como se indicó anteriormente. Es un objetivo de la presente invención proveer proteínas novedosas, incluyendo isoformas, análogos, fragmentos o derivados de las mismas que son capaces de modular las rutas intracelulares de señalización que conducen a inflamación, muerte celular o sobrevivencia celular, siendo posible esta modulación mediante el prodominio (CARD) de las diversas caspasas o mediante los dominios cinasa de las diversas cinasas implicadas en la activación de NF-«B. Tales proteínas novedosas de la invención posiblemente podrían, por lo tanto ser moduladores directos de la actividad de caspasa (ruta de muerte celular) y/o activación de NF-«B mediante la actividad cinasa (ruta de sobrevivencia celular). De manera similar, las proteínas novedosas de la invención también posiblemente son moduladores indirectos de la actividad biológica intracelular de una diversidad de otras proteínas implicadas en la ruta de inflamación, muerte o sobrevivencia celular (por ejemplo FAS/APO1 , FNT-R p55, FNT-R p75, IL-1-R, MORT-1 , TRADD, RIP, TRAF2, NIK, y otras). De igual manera, esta modulación también puede posiblemente ser mediante interacción directa o indirecta con los elementos de la familia de proteínas de BCL2, las proteínas novedosas de la invención presente también pueden ser capaces de modular la actividad de BCL2 u otras proteínas de esta familia y en ese sentido las proteínas novedosas de la invención puede ser moduladores indirectos de las diversas caspasas, las cuales, a su vez, son moduladas por elementos de la familia de proteínas de BCL2. Otro objetivo de la invención es proveer antagonistas (por ejemplo anticuerpos, péptidos, compuestos orgánicos o incluso algunas isoformas) a las proteínas novedosas anteriores, incluyendo isoformas, análogos, fragmentos y derivados de las mismas, las cuales pueden ser utilizadas par inhibir los procesos de señalización de inflamación, muerte celular o sobrevivencia, según se desee. Un objeto adicional de la invención es utilizar las proteínas novedosas anteriores, isoformas, análogos, fragmentos y derivados de las mismas, para aislar y caracterizar proteínas o factores adicionales, los cuales pueden estar implicados en la regulación de las rutas de inflamación, muerte o sobrevivencia celular y tienen influencia en su actividad, y/o para aislar e identificar otros receptores u otras proteínas celulares adicionales en las etapas anteriores o posteriores en el proceso o procesos de señalización hacia los cuales estas proteínas novedosas, análogos, fragmentos y derivados se unen, y por lo tanto, en cuya función también están implicadas. Un objeto adicional de la invención es proveer inhibidores que puedan ser introducidos en las células para unirse o interactuar con las proteínas novedosas y las posibles isoformas de las mismas, cuyos inhibidores pueden actuar para inhibir los procesos de inflamación, muerte o sobrevivencia celular cuando se desee.

Además, es un objetivo de la presente invención utilizar las proteínas novedosas antes mencionadas, isoformas y análogos, fragmentos y derivados de las mismas como antígenos para la preparación de anticuerpos policlonales y/o monoclonales hacia las mismas. Los anticuerpos, a su vez pueden ser utilizados, por ejemplo, para la purificación de proteínas nuevas provenientes de fuentes diferentes, tales como extractos celulares transformadas. También, estos anticuerpos pueden ser utilizados para propósitos de diagnóstico por ejemplo, para identificar posibles trastornos relacionados al funcionamiento anormal de los efectos celulares mediados directamente por las caspasas, cinasas, proteínas que pertenecen a la familia BCL2, o proteínas TRAF o reguladas por el receptor p55 de FNT, el receptor FAS/APO1 , u otros receptores relacionados y sus proteínas celulares asociadas (por ejemplo RAIDD, MORT-1 , TRADD, RIP), las cuales actúan directa o indirectamente para modular/mediar los procesos intracelulares mediante la interacción con las proteínas TRAF, caspasas, cínasas o elementos de la familia de proteínas de BCL2. Un objeto adicional de la invención es proveer composiciones farmacéuticas que comprendan las proteínas novedosas anteriores, ¡soformas o análogos, fragmentos o derivados de las mismas, así como composiciones farmacéuticas que comprendan los anticuerpos o los otros antagonistas antes mencionados.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN De conformidad con la presente invención, se ha aislado una nueva proteína denominada B1 , (originalmente denominada CBK debido a "cinasa que se une a lAPc, debido a que tiene alguna homología con c-IAP, ver ejemplo 1 siguiente, pero de aquí en adelante se denominará "B1 "), la cual tiene una región de prodominio (CARD), un dominio de cinasa y una región intermedia entre dichos dominios CARD y de cinasa, y por lo tanto está posiblemente implicada en la modulación de los procesos de inflamación, muerte celular y sobrevivencia celular como se indica en la presente posteriormente. Como también se explica posteriormente en la presente, la modulación mediante B1 de las rutas de muerte o sobrevivencia celular puede ser positiva (aumentadora) o negativa (inhibidora) dependiendo de el tipo de proteínas intracelulares con las cuales ésta interactúa. Por consiguiente, la presente invención provee una secuencia de ADN que codifica para una proteína B1 , isoformas, fragmentos o análogos de la misma, siendo dicha B1 , isoformas, fragmentos o análogos de la misma capaces de interactuar con mediadores o moduladores intracelulares de las rutas de inflamación, muerte celular o sobrevivencia celular directa o indirectamente, siendo dicha B1 , isoformas, fragmentos o análogos moduladores intracelulares de dichas rutas de inflamación, muerte celular y/o sobrevivencia celular.

Las modalidades de la secuencia de ADN anterior de la invención incluyen: (i) una secuencia de ADN que se selecciona del grupo que consiste de: (a) una secuencia de ADNc obtenida a partir de la región de codificación de una proteína B1 nativa; (b) un fragmento de una secuencia de (a) la cual codifica para una proteína biológicamente activa capaz de modular la ruta de inflamación, muerte celular o sobrevivencia celular, o ambas; (c) una secuencia de ADN que permite la hibridación a una secuencia de (a) o (b) bajo condiciones moderadamente astringentes y la cual codifica para una proteína B1 biológicamente activa, análogo o fragmento capaz de modular la ruta de inflamación, muerte o sobrevivencia celular intracelular o ambas; (d) una secuencia de ADN que está degenerada como resultado del código genético para las secuencias de ADN definidas en (a)-(c) y la cual codifica para una proteína B1 biológicamente activa, análogo o fragmento capaz de modular la ruta de inflamación muerte celular o sobrevivencia celular o ambas. (ii) Una secuencia de ADN como la que se indica anteriormente, que comprende por lo menos parte de la secuencia mostrada en la figura 3 y que codifica por lo menos para una proteína B1 , isoforma, análogo o fragmento activo. (iii) Una secuencia de ADN como la que se indica anteriormente, que codifica para una proteína B1 , ¡soforma, análogo o fragmento que tiene por lo menos parte de la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 3. En otro aspecto, la invención provee un vector que comprende cualquiera de las secuencias de ADN antes mencionadas de la invención, que pueden ser expresadas en células hospederas seleccionadas de células procarionte y eucariontes; y las células procariontes y eucariontes transformadas que contiene a dicho vector. A manera de otro aspecto de la invención, se provee una proteína B1 , isoformas, fragmentos, análogos funcionales y derivados de la misma, codificadas por una secuencia ADN de la invención, como se indica anteriormente, siendo capaz dicha proteína, isoformas, fragmentos, análogos y derivados de la misma posiblemente de modular las rutas de inflamación, muerte celular o sobrevivencia celular, o ambas, directa o indirectamente, mediante asociación con otros moduladores o mediadores intracelulares de estas rutas. Una modalidad de la proteína de la invención es, una proteína B1 , ísoforma, fragmento, análogos y derivados de la misma, en donde dicha proteína, isoforma, análogos, fragmentos y derivados tienen por lo menos parte de la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 3. La invención provee también un método para producir una proteína B1 , isoforma, fragmento, análogo o derivado de la misma, como se indica anteriormente, que comprende hacer desarrollar las células hospederas transformadas antes mencionadas bajo condiciones apropiadas para la expresión de dicha proteína, isoforma, fragmento, análogo o derivado de la misma, efectuando modificación post-traduccional, según sea necesario, para obtener dicha proteína, isoforma, fragmento, análogo o derivado de la misma, y aislando dicha proteína expresada, isoforma, fragmento, análogo o derivado. En un aspecto adicional, la invención provee anticuerpos o fragmentos activos o derivados de los mismos, específicos para la proteína B1 , isoforma, análogo, fragmento o derivado de la misma de la invención. En un aspecto adicional, la invención provee diversos métodos para la modulación de las rutas intracelulares de señalización, por ejemplo, los siguientes: (i) un método para la modulación o mediación en células de la actividad de las rutas de inflamación, muerte o sobrevivencia celular o cualquier otra actividad de señalización intracelular modulada o mediada directa o indirectamente por B1 o mediante otras moléculas a las cuales una proteína B1 , isoforma, análogo, fragmento o derivado de la misma de la invención se une o de otra manera interactúa, directa o indirectamente, comprendiendo dicho método tratar dichas células introduciendo en dichas células una o más de dichas proteína B1 , isoforma, análogo, fragmento o derivado de la misma en una forma apropiada para la introducción intracelular de la misma, o introduciendo en dichas células una secuencia de ADN que codifica a dicha una o más proteínas B1 , ¡soforma, análogo, fragmento o derivada de la misma en forma de un vector apropiado que porta dicha secuencia, siendo capaz dicho vector de efectuar la inserción de dicha secuencia en dichas células en una manera en la que dicha secuencia se expresa en dichas células. (¡i) un método como el que se indica anteriormente, en donde dicho tratamiento de las células comprende introducir en dichas células una secuencia de ADN que codifica a dicha proteína B1 , isoforma, fragmento, análogo o derivado en la forma de un vector apropiado que porta dicha secuencia, siendo capaz dicho vector de efectuar la inserción de dicha secuencia en dichas células en una manera en que dicha secuencia es expresada en dichas células. (iii) un método como el que se indica anteriormente, en donde dicho tratamiento de dichas células es mediante transfección de dichas células con un vector de virus animal recombinante que comprende los pasos de: (a) construir un vector de virus de animal recombinante que porta una secuencia que codifica para una proteína de superficie viral (ligando) que es capaz de unirse a un receptor de superficie celular específico sobre la superficie de dichas células que se van a tratar y una segunda secuencia que codifica para una proteína seleccionada de dicha proteína B1 , isoformas, análogos, fragmentos y derivados como se indica anteriormente, que cuando son expresados en dichas células son capaces de modular/mediar la actividad de las rutas de inflamación, muerte o sobrevivencia celular, directa o indirectamente, o cualquier otra actividad intracelulares de señalización modulada/mediada por otras moléculas intracelulares con las cuales dicha proteína B1 , isoformas, análogos, fragmentos y derivados interactúan directa o indirectamente; y. (b) infectar dichas células con dicho vector de (a). (iv) un método para modular las rutas de inflamación, sobrevivencia o muerte celular en células que son moduladas directa o indirectamente por B1 , que comprende tratar dichas células con anticuerpos o fragmentos activos o derivados del mismo, como se indica anteriormente, siendo dicho tratamiento mediante la aplicación de una composición apropiada que contiene dichos anticuerpos, fragmentos activos o derivados del mismo a dichas células, en donde cuando la proteína o proteínas B1 de la misma de dichas células son expuestas sobre la superficie extracelular, dicha composición se formula para aplicación extracelular, y cuando dicha proteína o proteínas B1 son intracelulares dicha composición se formula para aplicación intracelular. (v) un método para modular las rutas de inflamación, muerte o sobrevivencia celular u otra ruta en células que son moduladas directa o indirectamente por B1 , que comprende tratar dichas células con una secuencia de oligonucleótidos que codifica una secuencia antisentido para por lo menos parte de la secuencia de ADN que codifica una proteína B1 de la invención, siendo capaz dicha secuencia de oligonucleótidos de bloquear la expresión de la proteína B1 . (vi) un método como el que se indica anteriormente, en donde dicha secuencia de oligonucleótidos se introduce a dichas células mediante un virus indicado en (ii) anteriormente, en donde dicha segunda secuencia de dicho virus codifica dicha secuencia de oligonucleótidos. (vii) un método para modular las rutas de inflamación, sobrevivencia celular, muerte celular o cualquier otra ruta en la cual las células son moduladas directa o indirectamente por B1 , que comprende aplicar el procedimiento de ribozima en el cual un vector que codifica una secuencia de ribozima capaz de interactuar con una secuencia de ARNm celular que codifica para una proteína B1 de la invención, se introducen dichas células en una forma que permite la expresión de dicha secuencia de ribozima en dichas células, y en donde cuando dicha secuencia de ribozima se expresa en dichas células ésta interactúa dicha secuencia de ARNm celular y corta dicha secuencia de ARNm resultando en la inhibición de la expresión de dicha proteína B1 en dichas células. En un aspecto diferente, la presente invención provee un método para aislar e identificar proteínas de la invención, que tienen homología con o que son capaces de interacciones directas o indirectas con cualquiera de las proteínas que tienen un prodominio o un dominio reclutador de caspasa (CARD), u otras proteínas o enzimas implicadas en la señalización intracelular, mediante la cinasa o los dominios intermedios presentes en las proteínas de la invención, que comprende aplicar el procedimiento de dos híbridos de levadura en los cuales una secuencia que codifica a dicha proteína con dichos dominios CARD, cinasa, y dominios intermedios, o por lo menos uno de los dominios, es portada por un vector híbrido y una secuencia proveniente de una genoteca de ADNc o ADN genómico es portada por el segundo vector híbrido, utilizando después los vectores para transformar las células hospederas de levadura y aislando las células transformadas positivas, seguido por esta acción de dicho segundo vector híbrido para obtener una secuencia que codifica una proteína que se une a dicha proteína que contiene CARD-, cinasa, y/o proteína que contiene dominio intermedio. En otro aspecto adicional de la presente invención, se provee una composición farmacéutica para la modulación de las rutas de inflamación, muerte celular, sobrevivencia celular o cualquier otra ruta en células que son moduladas directa o indirectamente por B1 , que comprende, como ingrediente activo, por lo menos una proteína B1 de la invención, sus fragmentos biológicamente activos, análogos, derivados o mezclas de los mismos. Una de las modalidades de la composición farmacéutica anterior es una para modular las rutas de inflamación, muerte celular, sobrevivencia celular o cualquier otra ruta en las células que son moduladas directa o indirectamente por B1 , que comprende, como ingrediente activo, un vector de virus animal recombinante que codifica una proteína que es capaz de unirse a un receptor de superficie celular y que codifica por lo menos una proteína B1 , isoforma, fragmentos activos o análogos. Otra modalidad de la composición farmacéutica anterior es una para modular las rutas de inflamación, muerte celular, sobrevivencia celular o cualquier otra ruta en las células que son moduladas directa o indirectamente por B1 , que* comprende como ingrediente activo, una secuencia de oligonucleótidos que codifica una secuencia antisentido de la secuencia de ARNm de la proteína B1. Una modalidad adicional de la composición farmacéutica anterior es una que se utiliza para la prevención o tratamiento de una condición patológica asociada con la regulación de apóptosis por una o más moléculas a las cuales una proteína B1 se une directa o indirectamente, comprendiendo dicha composición una cantidad efectiva de una proteína B1 o una molécula de ADN que codifica para la misma, o una molécula capaz de perturbar la interacción directa o indirecta de dicha proteína B1 con una o más moléculas a las cuales una proteína B1 se une o con la cual ésta interactúa. incluso uno modalidad adicional de la composición farmacéutica anterior es una que se utiliza para la prevención o tratamiento de una condición patológica asociada con la regulación de apóptosis por una o más moléculas a las cuales una proteína B1 se une directa o indirectamente, comprendiendo dicha composición una cantidad efectiva de una proteína B1 , isoforma, fragmento, análogo o derivado de la misma, o un molécula de ADN que codifica para la misma, o una molécula que puede perturbar la interacción directa o indirecta de dicha proteína B1 , isoforma, fragmento, análogo o derivado de la misma con una o más moléculas a las cuales dicha proteína B1 , isoforma, fragmento, análogo o derivado se une.

Una modalidad adicional de la composición farmacéutica anterior es una que se utiliza para la prevención o tratamiento de una condición patológica asociada con la regulación de apóptosis por una o más moléculas a las cuales la proteína B1 se une directa o indirectamente, comprendiendo dicha composición una molécula que puede interferir con la actividad de proteína-cinasa de B1. En un aspecto diferente de la invención se proveen métodos terapéuticos como sigue: (i) Un método para la prevención o tratamiento de una condición patológica asociada con la regulación de apóptosis por una o más moléculas a las cuales una proteína B1 se une directamente o indirectamente, comprendiendo dicho método administrar a un paciente que lo necesite, una cantidad efectiva de una proteína o ¡soforma, fragmento, análogo y derivado de la misma o una mezcla de cualquiera de las mismas, o una molécula de ADN que codifica para las mismas, o una molécula que pueda perturbar la interacción directa o indirecta de dicha proteína B1 o ¡soforma, fragmento, análogo y derivado de la misma o una mezcla de cualquiera de las mismas con una o más moléculas a las cuales dicha proteína B1 o isoforma, fragmento, análogo y derivado de las misma o una mezcla de cualquiera de las misma se une directa o indirectamente. (ii) un método para modular los procesos de inflamación, procesos apoptóticos o procesos de muerte celular programa (rutas de muerte celular) en la cuales la proteína B1 está implicada directa o indirectamente, que comprende tratar dichas células con una o más proteína B1 , ¡soformas, análogos, fragmentos o derivados, en donde dicho tratamiento de dichas células comprende .introducir en dichas células dicha una o más proteínas B1 , isoformas, análogos, fragmentos o derivados en una forma apropiada para introducción intracelular de las mismas, o introduciendo en dichas células una secuencia de ADN que codifica a dicha una o más proteínas B1 , ¡soformas, análogos, fragmentos o derivados en forma en forma de un vector apropiado que porta a dicha secuencia, siendo capaz dicho vector de efectuar la inserción de dicha secuencia en dichas células en una manera en la que dicha secuencia es expresada en dichas células. (iii) Un método para modular los procesos de sobrevivencia celular en los cuales la proteína B1 está implicada directa o indirectamente, que comprende tratar dichas células con una o más proteínas B1 , isoformas, análogos, fragmentos o derivados, en donde dicho tratamiento de las células comprende introducir en dichas células dicha una o más proteínas B1 , isoformas, análogos, fragmentos o derivados en una forma apropiada para la introducción intracelular de las mismas, o introduciendo en dichas células una secuencia de ADN que codifica para dicha una o más proteínas B1 isoformas, análogos, fragmentos, o derivados en forma de un vector apropiado que porta dicha secuencia, siendo capaz dicho vector de efectuar la inserción de dicha secuencia en dichas células en una manera en la que dicha secuencia es expresada en dichas células.

Un aspecto adicional de la presente invención, provee los siguientes métodos de selección y métodos para la identificación y producción de diversos ligandos: (i) Un método para seleccionar un ligando que puede unirse a una proteína B1 que comprende poner en contacto una matriz de cromatografía por afinidad a la cual dicha proteína está unida con un extracto celular con lo cual el ligando se une a dicha matriz, y eluyendo, aislando y analizando dicho ligando. (ii) Un método para seleccionar una secuencia de ADN que codifica para un ligando que puede unirse a una proteína B1 , que comprende aplicar el procedimiento de dos híbridos de levadura en el cual una secuencia que codifica a dicha proteína B1 es portado por un vector híbrido y la secuencias provenientes de una genoteca de ADNc o ADN genómico son portadas por el segundo vector híbrido, transformando las células hospederas de levadura con dichos vectores, aislando las células positivamente transformadas y extrayendo dicho segundo vector híbrido para obtener una secuencia que codifica a dicho ligando. (i¡¡) Un método para identificar y producir un ligando que puede modular la actividad celular modulada/mediada por B1 que comprende: a) seleccionar un ligando que puede unirse a un polipéptido que comprende por lo menos una porción de B1 que tiene por lo menos algo de los residuos de aminoácido de B1 mostrados en la figura 3, que incluye esencialmente todo el prodominio (o CARD) de B1 ; b) identificar y caracterizar un ligando, diferente de BCL2, TRAF2, o porciones de un receptor de la familia de receptores de FNT/FCN u otras proteínas conocidas que tengan un prodominio (CARD), que se ha descubierto mediante dicho paso de selección que es capaz de dicha unión; y c) producir dicho ligando en una forma sustancialmente aislada y pura. (¡v) Un método para identificar y producir un ligando que puede modular la actividad celular modulada o mediada por una proteína B1 que comprende: a) seleccionar un ligando capaz de unirse a un polipéptido que comprende por lo menos ¡a porción carboxi terminal de la secuencia de B1 mostrada en la figura 3 que incluye al prodominio (CARD); b) identificar y caracterizar un ligando, diferente de BCL2, TRAF2, o porciones de un receptor de la familia de receptores de FNT/FCN u otras proteínas conocidas que tengan un prodominio (CARD), que mediante dicho paso de selección se descubre que es capaz de dicha unión; y c) producir dicho ligando en una forma sustancialmente aislada y pura. (v) Un método para identificar y producir un ligando que puede modular la actividad celular modulada/mediada por B1 que comprende: a) seleccionar un ligando capaz de unirse a por lo menos la porción N-terminal de la secuencia de B1 mostrada en la figura 3, que incluye sustancialmente todo el dominio cinasa de B1 ; b) identificar y caracterizar un ligando, diferente de BCL2, TRAF2, o porciones de un receptor de la familia de receptores de FNT/FCN u otras proteínas conocidas intracelulares moduladoras, que se ha descubierto mediante dicho paso de selección que son capaces de dicha unión; y c) producir dicho ligando en una forma sustancialmente aislada y pura. (vi) Un método para identificar y producir una molécula que puede modular directa o indirectamente la actividad celular modulada/mediada por B1 , que comprende: a) seleccionar una molécula que pueda modular las actividades moduladas/mediadas por B1 ; b) identificar y caracterizar dicha molécula; y c) producir dicha molécula en forma sustancialmente aislada y pura. (vü) Un método para identificar y producir una molécula que puede modular directa o indirectamente la actividad celular modulada/mediada por una proteína de la invención, que comprende: a) seleccionar una molécula que pueda modular las actividades moduladas/mediadas por una proteína de la invención; b) identificar y caracterizar dicha molécula; y c) producir dicha molécula en forma sustancialmente aislada y pura.

Otros aspectos de la invención serán aparentes a partir de la siguiente descripción detallada de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra una ilustración diagramática de la estructura de la molécula de TRAF2; La figura 1 muestra un diagrama esquemático que ilustra algunas de las proteínas implicadas en las rutas de inflamación, muerte celular y sobrevivencia celular (activación de NK-?B); Las figuras 3 (A,B) muestran esquemáticamente la secuencia de aminoácidos deducida (A) de la proteína B1 de la presente invención y la secuencia de nucleótidos determinada que codifica para la misma (b), en donde en la secuencia de aminoácidos se muestra el dominio cinasa de B1 (región enmarcada en el extremo N-terminal) y el dominio CARD de B1 (región subrayada en el extremo C-terminal). La figura 4 muestra un análisis Northern de la expresión de B1 en diferentes tejidos humanos, los cuales muestran que B1 se expresa en la mayoría de ios tipos de tejido humanos; y la figura 5 muestra esquemáticamente las diferentes construcciones de B1 probadas en cuanto a la actividad de NF-?B, la potenciación de muerte celular y la activación de JNK. la figura 6 muestra los resultados de las mediciones de activación de NF-?B realizadas con las diferentes construcciones de la figura 6 y el ejemplo 3; la figura 7 muestra los resultados de las mediciones de activación de JNK1 realizada con algunas de las construcciones anteriores; y la figura 8 muestra que B1 se autoasocia y se une a TRAF1 in vivo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere, en un aspecto a una proteína novedosa B1 que tiene un prodominio o un dominio CARD (dominio reclutador de caspasa) y la cual tiene un dominio de proteína cinasa de similitud con el dominio RIP-cinasa. Como tal la proteína B1 de la presente invención es posiblemente capaz de interactuar con un número de proteínas intracelulares implicadas en las rutas de inflamación, muerte celular (apóptosis) y sobrevivencia celular (activación de NF-?B). Esta interacción puede ser mediante la unión de diversas proteínas o de otra manera mediante la interacción con las mismas mediante el prodominio (CARD), o ésta puede ser por medio de la actividad del dominio cinasa, o ambos de estos tipos de interacciones pueden presentarse al mismo tiempo. Por ejemplo, B1 puede ser capaz de reclutar un número de proteínas que tengan prodominios (CARD) y después fosforilarlas mediante su dominio cinasa. De manera similar, B1 puede servir en algunos casos como una proteína de anclaje o de reclutamiento mediante su prodominio (CARD) para algunas otras proteínas que contienen prodominio, las cuales pueden no ser sustratos para dominio cinasa de B1 , o B1 puede ¡nteractuar con diversas proteínas solo a través de su dominio cinasa y no mediante su dominio CARD. Además, tal y como se detalla en la presente, los resultados de las pruebas de unión indican que la proteína B1 nueva de la invención posiblemente es capaz de unirse a la proteína BCL2. Este hallazgo sugiere la posibilidad de que la proteína B1 puede ser un regulador de la actividad de BCL2, especialmente en cuanto a la regulación de apóptosis. En los análisis de actividad biológica iniciales, la posibilidad también sugiere que la proteína B1 pueda inhibir el efecto protector de BCL2 en contra de la apóptosis. Por lo tanto en vista de las observaciones de que ia proteína B1 por si misma no ocasiona la muerte celular, sino que actúa para aumentar la muerte celular cuando es agregada a las células con otros inductores de muerte celular tales como por ejemplo, FAS-R, FNT-R p55 y RIP (dicha adición a las células mediante cotransformación con vectores capaces de expresar en las células B1 , FAS-R, FNT-R p55 o RIP, véase el ejemplo 2 siguiente). Por lo tanto, se sugiere la posibilidad de que B1 podría no actuar en una forma análoga a BAX o BAK, las cuales por sí mismas, en forma de homodímeros, pueden ocasionar la muerte celular (véase la sección de antecedentes anterior), sino más bien B1 puede posiblemente actuar en una manera análoga a BAD la cual sirve para regular de manera negativa a BCL2 uniéndose a BCL2 y previniendo su unión a BAX o BAK resultando por lo tanto en BAX y/o BAK más libres, las cuales, a su vez, causan un incremento en la muerte celular (véase la sección de antecedentes anterior). Además, con respecto a la activación de NF-kB antes indicada y la sobrevivencia celular, B1 posiblemente puede también lograr su actividad observada de incremento de muerte celular posiblemente por medio de ocasionar una reducción en ia activación de NF-kB, quizás mediante la actividad de cinasa de B1 la cual posiblemente puede servir para modular diversas proteínas (por ejemplo NIK) necesarias para la inducción de la activación de NF-kB, con el resultado de que la activación reducida de NF-kB se presentará y por consiguiente se reducirá ia sobrevivencia celular. En este sentido es interesante indicar que cuando se agrega B1 con inductores de muerte celular tales como FAS-R, FNT p55-R o RIP, está incrementa su actividad de aniquilación celular. Se sabe que tanto FNT p55-R y FAS-R, y posiblemente también RIP induce además las rutas de muerte celular culminando en una actividad aumentada de caspasa, inducen también la activación de NF-kB lo cual, en algún grado, niega la muerte celular inducida. Se ha observado incluso en algunas células que TNF no aniquila las células, atribuyéndose esto a la inducción de la activación de NF-kB por los receptores de TNF y no la fracaso de las rutas de muerte celular co-inducidas por estos receptores, de modo que en esas células las rutas de sobrevivencia celular mediadas por NF-kB aparentemente son más activas que las rutas de muerte celular. Por lo tanto, bloqueando la inducción de NF-kB sería posible aumentar la aniquilación celular mediada por, por ejemplo FAS-R, FNT p55, RIP y la proteína B1 de la invención posiblemente podría servir a esta función y dar origen a su incremento observado de muerte celular cuando se agrega con FAS-R, FNT-R p55 o RIP. En vista de lo anterior, se sugiere que B1 posiblemente podría regular los procesos de inflamación, muerte celular o sobrevivencia celular en una diversidad de maneras, y que podría incluso hacerlo de manera simultánea. Por ejemplo, posiblemente B1 podría inhibir la activación de NF-kB, o B1 podría incluso actuar posiblemente sobre otras proteínas intracelulares implicadas en las rutas de sobrevivencia celular o de muerte celular independientemente de sus posibles efectos sobre NF-kB o además de sus posibles efectos sobre NF-kB. Por lo tanto, parece que B1 posiblemente tiene la capacidad de modular una amplia gama de proteínas intracelulares, en particular, aquellas implicadas en las rutas de inflamación, muerte celular y sobrevivencia celular. Como se indica posteriormente en la presente, con un número de proteínas intracelulares conocidas poseen predominios (CARD), tales como, por ejemplo, diversas enzimas caspasa implicadas en la destrucción proteolítica de células (ruta de muerte celular) incluyendo ICE, ICH-I, Mch6 y otras, así como diversas proteínas adaptadoras implicadas también en la rutas de muerte celular incluyendo RAIDD, c-IAP, C-IAP2 y otras. De esta manera, posiblemente B1 podría interactuar directa o indirectamente con diversas caspasas mediante sus dominios CARD comunes y por lo tanto modular posiblemente su actividad. Esta modulación puede ser positiva, es decir, posiblemente B1 podría servir para concentrar diversas caspasas e incrementar por lo tanto su actividad proteolítica conducente a un incremento en la muerte celular. Además, se aisló B1 utilizando la secuencia de c-IAPI y B1 comparte homología con c-IAP, el cual por sí mismo es un inhibidor de apoptosis. c-IAPI tiene un prodominio (CARD) y puede inhibir la apoptosis reclutando caspasas previniendo por lo tanto su actividad. Por lo tanto B1 podría posiblemente interactuar directa o indirectamente con c-IAPl, y llevar a una supresión de su inhibición de apoptosis, resultando por lo tanto en muerte celular incrementada. Además, B1 posiblemente por interacción directa o indirecta con diversas caspasas mediante sus dominios CARD, podría también ser capaz de modularlas por fosforilación mediante su dominio cinasa, y en esta forma B1 puede incrementar la actividad de caspasa. En una forma más indirecta, B1 posiblemente por ser capaz de interactuar indirectamente o directamente con las proteínas adaptadoras tales como RAIDD, c-IAPI, C-IAP2 y otras que tengan CARD pueden de esta manera ¡nteractuar posiblemente con otras proteínas que están en las etapas posteriores en las rutas de inflamación, muerte celular y sobrevivencia celular. Por ejemplo, RAIDD interactúa con otras proteínas intracelulares tales como RIP y TRADD mediante dominios de muerte comunes, los cuales, a su vez interactúan con proteína tales como MORT-1 , el FNT-R p55 y FAS-R. De esta manera, mediante una imposible interacción con RAIDD, B1 es posiblemente por lo tanto unida indirectamente a estos receptores efectores de muerte y proteínas. Similarmente, c-IAPI y C-IAP2 interactúan con la proteína TRAF2, la que a su vez interactúa con el p75-TNF-R y con MORT-1 , FNT-R p55 y FAS-R mediante la interacción entre TRAF2 y RIP a sí como TRADD. Por consiguiente, B1 puede posiblemente ser un modular indirecto de los procesos de muerte celular al estar indirectamente unida a las proteínas adaptadoras antes indicadas, proteínas efectoras y receptores. Esta modulación indirecta puede ser positiva, es decir, esta puede conducir a una muerte celular incrementada. Además, en virtud de que B1 posiblemente es capaz de interactuar al menos indirectamente (mediante c-IAPI) con TRAF2 surge la posibilidad de la implicación de B1 en la ruta de sobrevivencia celular que está asociada con la inducción de la activación de NF-kB. Actualmente se sabe que TRAF2 se une directamente a NIK (Malinin y otros, 1997), la cual está directamente implicada en la inducción de la activación de NF-kB y por lo tanto la sobrevivencia celular. Por consiguiente, al ser posiblemente capaz de modular TRAF2 indirectamente, B1 puede ser capaz de modular la ruta de sobrevivencia celular también. Además, en virtud de su domino de cinasa B1 puede posiblemente incluso estar más implicada en la ruta de MAP cinasa (a la cual pertenece NIK) conduciendo ia inducción de la activación de NF-kB y de la sobrevivencia celular. Sin embargo, como se indicó anteriormente, en vista del hecho de que B1 conduce a un incremento de muerte celular, podría ser que B1 tenga un papel negativo en la modulación de los procesos de sobrevivencia celular, es decir, B1 posiblemente podría modular TRAF2 o B1 podría posiblemente estar implicada directamente en la ruta de MAP cinasa pero en una forma que lleve a una activación reducida de NF-kB. También es posible que B1 juegue en papel central en la modulación de las rutas intracelulares de señalización, en particular, las rutas de inflamación, muerte celular y sobrevivencia celular, y como tal B1 puede servir para modular estas en una manera que puede desplazar el balance desde la sobrevivencia celular hacia la inducción de muerte celular en conformidad con el efecto incrementador observado (véase ejemplo 2) que B1 tiene sobre la inducción de muerte celular. Por lo tanto B1 puede ser considerada como "un modulador de la actividad intracelulares de señalización" directa o indirectamente en diversas proteínas componentes que constituyen estas rutas. Por lo tanto, cuando se consideran los posibles usos diversos B1 terapéuticamente, es importante entender que en todos los casos B1 puede tener papeles múltiples, es decir, esta puede incrementar los procesos de muerte celular, y al mismo tiempo posiblemente puede de manera activa inhibir la inducción de NF-kB e inhibir por lo tanto la ruta de sobrevivencia celular, o dependiendo de las proteínas/enzimas actuales a las cuales B1 se une y sus cantidades relativas en la célula, B1 puede de manera posible en algunas células, actuar para inhibir las rutas de sobrevivencia celular, y en otras posiblemente puede actuar para incrementar las rutas de muerte celular suprimiendo los inhibidores de muerte celular.

Por lo tanto, en general, como será sugerido a partir de lo siguiente cuando se desee incrementar la muerte celular, por ejemplo en tumores células infectadas con VIH y similares, podría ser posible utilizar B1 para conseguir este objetivo. Por ejemplo, B1 puede ser administrada la célula directamente o una molécula de ADN que codifica a B1 puede se introducida en la célula para incrementar la expresión de B1. De manera similar, en situaciones en las cuales se desea salvar células de la muerte celular inducida por TNF o ligando de FAS, por ejemplo, en diversas inflamaciones, enfermedades autoinmunes, reacciones injerto vs hospedero y similares, y en lugar de promover la sobrevivencia celular, entonces los antagonistas de B1 podrían posiblemente ser utilizados para conseguir este objetivo. Por ejemplo, los antagonistas de B1 podrían ser administrados, tales como, anticuerpos anti-B1 , oligonucleótidos que tengan secuencias antisentido para B1 , ribosomas con secuencias para B1 , o diversos péptidos o moléculas orgánicas diseñadas específicamente para inhibir la actividad de B1. Por lo tanto, cuando se indiquen los usos de B1 en la presente posiblemente, estos indicarán en términos de los efectos moduladores de B1 sobre diversos procesos o enfermedades intracelulares, y se deberá entender en vista de lo antes mencionado que esta modulación puede se positiva (aumentadora) como en el caso cuando se considera las rutas de muerte celular, o negativa (inhibidora) como es el caso cuando se considera las rutas de sobrevivencia celular.

La presente invención también se refiere a secuencias de ADN que codifican proteínas B1 biológicamente activas, así como secuencias de ADN que codifican análogos biológicamente activos, fragmentos y derivados de los mismos, y las proteínas B1 , análogos, fragmentos y derivados de las proteínas codificadas por las secuencias de ADN. La preparación de tales análogos, fragmentos y derivados es mediante procedimientos estándar (véase por ejemplo, Sambroook y otros, (1989) en la cual en las secuencias que codifican el ADN, uno o más codones pueden ser eliminados, agregados, o sustituidos por otro, para rendir análogos codificados que tienen por lo menos un cambio de un residuo de aminoácido con respecto a la proteína nativa. Los análogos aceptables son aquellos que conservan por lo menos el predominio (CARD) o el dominio cinasa de B1 o por lo menos las porciones activas de cualquiera o ambos de estos dominios, con o sin mediación de cualquier otra unión o actividad enzimática, es decir, no se unen o de otra manera interactúan, directa o indirectamente, a una proteína adicional en la etapa anterior o a otro factor, o no catalizan una reacción dependiente de la señal (por ejemplo la reacción cinasa). En tal manera, se pueden producir análogos que tengan un efecto negativo dominante, es decir, un análogo que es defectuoso ya sea para unirse o para de otra manera interactuar con otras proteínas mediante el prodomino, o en la señalización subsecuente (también posiblemente actividades cinasa) después de tal unión como se indicó anteriormente. Tales análogos pueden ser utilizados, por ejemplo, para modular las rutas de inflamación, muerte celular o sobrevivencia como se indicó anteriormente, compitiendo con las proteínas B1 naturales. De manera similar, los denominados análogos positivos dominantes se pueden producir los cuales podrían servir para aumentar el efecto de B1. Estos podrían tener las mismas propiedades o propiedades mejoradas de unión relacionado a B1 que las otras proteínas y las mismas o mejores propiedades de señalización o actividades de cinasa que las proteínas B1 naturales. En una forma análoga, los fragmentos biológicamente activos de estos clones de la invención pueden ser preparados como se indicó anteriormente con respecto a la preparación de los análogos. Los fragmentos apropiados de las secuencias de ADN de la invención son aquellos que codifican una proteína o polipéptido que conserva la capacidad de unión B1 a otras proteínas o las cuales puede regular cualquier otro actividad de unión o enzimática (cinasa) como se indicó anteriormente. Por consiguiente, se pueden preparar fragmentos de las proteínas codificadas de la invención que contengan en efecto negativo dominante o un efecto positivo dominante como se indicó anteriormente con respecto a los análogos. De manera similar, se pueden preparar derivados mediante modificaciones estándar de los grupos laterales de uno o más residuos de aminoácido de las proteínas, sus análogos o fragmentos, o mediante conjugación de las proteínas, sus análogos o fragmentos, a otra molécula por ejemplo un anticuerpo, enzima, receptor, etc., como es bien conocido en la técnica. De las secuencias de ADN anteriores de la invención las cuales codifican una proteína B1 , isoforma, análogo, fragmento o derivado, se incluyen también, como una modalidad de la invención, secuencias de ADN que pueden hibridizar con una secuencia de ADNc obtenida a partir de una región de codificación de una proteína B1 nativa, en la cual tal hibridación se realiza bajo condiciones moderadamente astringentes, y la cual se puede hibridizar la cual se puede hibridizar a secuencias de ADN que codifican a una proteína B1 biológicamente activa. Estas secuencias de ADN hibridizables por lo tanto incluyen secuencias de ADN que tienen una homología relativamente alta con la secuencia de ADNc de la proteína B1 nativa, y como tal representa secuencias tipo B1 , que pueden ser, por ejemplo, secuencias obtenidas naturalmente, que codifican las diversas proteínas B1 , ¡soformas, o secuencias que se presentan en la naturaleza que codifican a proteínas que pertenecen a un grupo de secuencias tipo B1 que codifican a una proteína que tiene la actividad de las proteínas B1. Además, estas secuencias pueden también, por ejemplo incluir secuencias producidas sintéticamente que no se presentan en la naturaleza, que son similares a las secuencia de ADNc de la proteína B1 nativo pero que incorporan un número de modificaciones deseadas. Tales secuencias sintéticas incluyen por lo tanto todas las posibles secuencias que codifican a análogos, fragmentos y derivados de las proteínas B1 , de las cuales todas tienen la actividad de las proteínas B1. Para obtener las secuencias tipo proteína B1 que se presentan naturalmente indicadas anteriormente, se pueden utilizar procedimientos estándar de selección y aislamiento de muestras de ADN o ARN obtenidos naturalmente a partir de diversos tejidos utilizando ADNc o porción del mismo de la proteína B1 como son (véase por ejemplo los procedimientos estándar indicados en Sambrook y otros, 1989). De manera similar, para preparar las secuencias tipo proteína B1 sintéticas diversas que codifican análogos, fragmentos o derivados de las proteínas B1 , se pueden utilizar un número de procedimientos estándar tal como los que se detallan en la presente posteriormente referente a la preparación de tales análogos, fragmentos y derivados. Un polipéptido o proteína (sustancialmente correspondiente) a la proteína B1 incluye no solo la proteína B1 sino también los poiipéptidos o proteínas que son análogos de la proteína B1. Los análogos que sustancialmente corresponden a la proteína B1 son aquellos polipéptidos en los cuales uno o más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de la proteína B1 han sido reemplazados con otro aminoácido, eliminados y/o insertados, con la condición de que la proteína resultante muestre sustancialmente una actividad biológica igual o superior que el de la proteína B1 a la cual corresponde. Para corresponder sustancialmente a la proteína B1 , los cambios en la secuencia de las proteínas B1 , tales como isoformas generalmente son relativamente menores. Aunque el número de cambios puede ser más de 10, de preferencia no más de 10 cambios, más preferiblemente no más de 5 cambios y más preferido no más de tres de tales cambios. Aunque cualquier técnica se puede utilizar para encontrar proteínas potencialmente activas biológicamente que correspondan sustancialmente a las proteínas B1 , una de tal técnica es la utilización de técnicas de mutagénesis convencional sobre el ADN que codifica a la proteína, resultante en unas cuantas modificaciones. Las proteínas expresadas por tales clones pueden después ser seleccionados en cuanto a su capacidad para unirse a algunas otras proteínas que tengan, por ejemplo prodominios (CARD), sitios de unión a cinasa, o a B1 misma, y para modular la actividad de estas otras proteínas o B1 misma en la modulación/mediación de las rutas intracelulares indicadas anteriormente. Los cambios "conservadores" son aquellos cambios de los cuales se espera que no cambien la actividad de la proteína y usualmente son los primeros que se seleccionan ya que se espera que estos no cambien sustancialmente el tamaño, carga o configuración de la proteína y por lo tanto no se espera que cambien las propiedades biológicas de la misma. Las sustituciones conservadoras de las proteínas B1 incluyen un análogo en donde por lo menos un residuo de aminoácido en el polipéptido se ha reemplazado de manera conservativa por un aminoácido diferente. Tales sustituciones de preferencia se realizan de conformidad con la siguiente lista que se presenta en el cuadro IA, cuyas sustituciones se pueden determinar mediante experimentación rutinaria para proveer propiedades estructurales y funcionales modificadas de una molécula de polipéptidos sintetizada mientas que se mantiene la actividad biológica característica de la proteína B1.

CUADRO IA Residuo Original Ejemplo de sustitución Ala Gly;Ser Arg Lys Asn Gln; His Asp Glu Cys Ser Gln Asn 10 Glu Asp Gly Ala; Pro His Asn; Gln He Leu; Val Leu lie; Val 15 Lys Arg;Gln;Glu Met Leu;Tyr;lle Phe Met;Leu;Tyr Ser Thr Thr Ser 20 Trp Tyr Tyr Trp; Phe Val Ile;Leu Alternativamente, otro grupo de sustituciones de la proteína B1 con aquellos en los cuales por lo menos un residuo de aminoácido en el polipéptido ha sido eliminado y se ha insertado un residuo diferente en su lugar de conformidad con el cuadro IB siguiente. Los tipos de sustituciones que pueden hacerse en el polipéptido pueden basarse sobre el análisis de las frecuencias de cambios de aminoácido entre una proteína homologa de especies diferentes, tales como aquellas presentadas en el cuadro 1-2 de Schulz y otros, G.E., Principies of Protein Structure Springer-Verlag, New York, NY, 1798, y las figuras 3-9 de Creighton, T.E. Proteins: Structure y Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, CA 1983. Tomando como base tales análisis, las sustituciones conservadoras alternativas se definen en la presente como intercambios dentro de uno de los cinco grupos siguientes: CUADRO IB 1. Residuos alifáticos pequeños, no polares o ligeramente polares: Ala, Ser, Thr, (Pro, Gly); 2. Residuos polares cargados negativamente y sus amidas: Asp, Asn, Glu, Gln; 3. Residuos polares, con carga positiva: His, Arg, Lys; 4. Residuos grandes alifáticos no polares: Met, Leu, lie, Val (Cys); y 5. Residuos grandes aromáticos: Phe, Tyr, Trp. Los tres residuos de aminoácido (anteriores) tiene papeles especiales en la arquitectura de la proteína. Gly es el único residuo que carece de cualquier cadena secundaria y por lo tanto imparte flexibilidad a la cadena. Sin embargo esto tiene la tendencia de promover la formación de estructuras secundarias diferentes de la a-hélice. Pro, debido a su geometría poco común, impide fuertemente la cadena y generalmente tiende a promover las estructuras tipo vuelta en ß, aunque el algunos casos Cys puede ser capaz de participar en la formación de puentes disulfuro lo cual es importante en la configuración tridimensional de la proteína. Nótese que Shulz y otros, supra, unirá a los grupos 1 y 2, anteriores. Note también que Tyr, debido de su potencial de formación de puentes de hidrógeno, tiene una afinidad significativa con Ser, y Thr, etc. Las sustituciones de aminoácido conservadores de conformidad con la presente invención, por ejemplo, tal y como se presentó anteriormente, se conocen en la técnica y se espera que mantengan las propiedades biológicas y estructurales del polipéptido después de la sustitución de aminoácido. La mayoría de las eliminaciones y sustituciones de conformidad con la presente invención son aquellas que no producen cambios radicales en las características de la molécula de polipéptido o proteína. "Características" se defina como una forma no inclusiva para definir ambos cambios en la estructura secundaria, por ejemplo, a-hélice o ß-lámina así como los cambios en la actividad biológica, por ejemplo la unión a otras proteínas con prodominios (CARD), o actividad cinasa y/o modulación de muerte celular o rutas de sobrevivencia celular como se indicó anteriormente y se indica posteriormente. Ejemplos de producción de sustituiciones de amino ácido en proteínas que pueden ser utilizadas para obtener análogos de las proteínas B1 para ser utiliza en la presente invención incluyen cualquiera de los pasos de métodos conocidos, tales como los presentados en la patente E.U.A. RE 33,653, 4,959,314, 4,588, 585 y 4,737,462, to Mark et al; 5,1 16,943 to Koths et al, 4,965,195 to Ñamen et al; 4,879,1 11 to Chong et al; y 5,017,691 to Lee et al; y proteínas sustituidas con lisina presentadas en la patente E.U.A. No. 4,904,584 (Shaw et al). Además de las sustituciones conservadores discutidas anteriormente las cuales podrían no cambiar significativamente la actividad de la proteína B1 , cualquiera de las sustituciones conservativas menos conservadoras y los cambios más aleatorios, que conducen a un incremento en la actividad biológica de los análogos de las proteínas B1 , están diseñadas para estar dentro del campo de la invención. Cuando el efecto exacto de la sustitución o eliminación se va a confirmar, un experto en la técnica apreciará que el efecto de la sustitución (s), eliminación (es) etc, serán evaluadas mediante pruebas rutinarias de muerte celular y de unión. La selección utilizando una prueba estándar como tal no implica la experimentación indebida.

A nivel genético, estos análogos generalmente se preparan por mutagenesis dirigida al sitio de los nucleótidos en el ADN que codifica la proteína B1 , produciendo por lo tanto ADN que codifica al análogo, y después de esto sintetizar el ADN y expresar el polipéptido en cultivo celular recombinante. Estos análogos típicamente exhiben la misma actividad biológica cualitativa o incrementada igual que la proteína que se presenta naturalmente, Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publications y Wiley Interscience, New York, NY, 1987-1995; Sambrook et al, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989. La preparación de una proteína B1 de conformidad con la misma, o con una secuencia de nucleótidos alternativa que codifica al mismo polipéptido pero que difiere de la secuencia natural debido a cambios permitidos por la degeneración conocida del código genético, se puede conseguir por mutagenesis específica de sitio del ADN que codifica para un análogo preparado con anterioridad o una versión nativa de la proteína B1. La mutagénesis específica de sitio permite la producción de análogos a través del uso de secuencias de oligonucleótido específica que codifican a la secuencia de ADN de la mutación deseada así como un número suficiente de nucleótidos adyacentes, para proveer una secuencia de iniciador de tamaño suficiente y complexidad de secuencia para formar un duplicado estable en ambos lados de ia unión de eliminación que esta siendo transversada. Típicamente, un iniciador de aproximadamente20 a 25 nucleótidos de longitud se prefiere, teniendo alterado cerca de 5 a 10 nucleótidos complementarios en cada lado de la secuencia que esta siendo alterada. En general, la técnica de mutagénesis específica de sitio es bien conocida en la técnica, tal y como se ejemplifica por las publicaciones tales como Adelman et al, DNA 2: 183 (1983), cuya descripción se incorpora en la presente para referencia para referencia. Como se apreciará, la técnica de mutagénesis específica decide típicamente emplea un vector de fago que existe tanto en forma de cadena individual como de cadena doble. Los vectores típicos útiles en la mutagénesis dirigida a sitio incluyen vectores tales como el fago M13, por ejemplo, tal y como se describe por Messing et al, Third Cleveland Symposium on Macromoleculas y Recombinant DNA, Editor A. Walton, Elsevier, Amsterdam (1981 ), cuya descripción se incorpora en la presente para referencia. Estos fagos se pueden conseguir fácilmente de manera comercial y su uso generalmente es bien conocido por lo expertos en la técnica. Alternativamente, los vectores plásmidos que contienen un origen de replicación de pago de cadena individual (Veira et al, Meth Enzimol. 153:3, 1987) se pueden utilizar para obtener ADN de cadena individual. En general, la mutagénesis dirigida al sitio de conformidad con la misma se realiza primero obteniendo un vector de cadena sencilla que incluyen dentro de su secuencia de ADN una secuencia de ADN que codifica al polipéptido o relevante. Un iniciador de oligonucleótidos que porta la secuencia mutada deseada se prepara sintéticamente mediante síntesis de ADN/oligonucleótidos automatizada. Este iniciador es después templado con el vector que contienen la secuencia de proteína de cadena individual, y sometido a enzimas de polimerización de ADN tales como el fragmento de E. coli polimerasa I Klenow, para completar la síntesis de la cadena que porta la mutación. Por lo tato, una secuencia mutada y una segunda cadena portan la mutación deseada. Este vector heteroduplex es después utilizado para transformar las células apropiadas, tales como células de E. coli JM101 y se seleccionan los clones que incluyen los vectores recombinantes que portan el arreglo de secuencia mutada. Después de que se selecciona un clon tal, la secuencia de proteína B1 mutada puede ser eliminada y colocada en un vector apropiado, generalmente un vector de transferencia o de expresión del tipo que puede ser utilizado para transfección de un hospedero apropiado. Por consiguiente, el gene o ácido nucleico que codifica para una proteína B1 también puede ser detectado, obtenido y/o modificado, in vitro, in situ y/o in vivo, utilizando técnicas de amplificación de ADN o ARN conocidas, tales como síntesis de PCR y de oligonucleotidos química. La PCR permite la amplificación (aumento en el número) de secuencias de ADN específicas mediante reacciones de ADN polimerasa repetidas. Esta reacción se puede utilizar como un remplazo para la cronación; todo lo que se requiere es conocimiento de las secuencia de ácido nucleico. Para realizar debidamente la PCR, se diseñan iniciadores que son complementarios a la secuencia de interés. Los iniciadores después son generados mediante síntesis automatizada de ADN. Debido a que los iniciadores pueden ser diseñados para hibridar cualquier parte del gen, se pueden crear condiciones tales que se puedan tolerar apareamientos equivocados en el apareamiento complementario de las bases. La amplificación de estas regiones de apareamiento equivocado puede conducir a la síntesis de un producto mutado que resulta la generación de un péptido con propiedades nuevas (es decir mutagénesis dirigida al sitio). Véase también, por ejemplo, Ausubel, supra, Ch 16. Además, mediante síntesis de copulación de ADN complementario (cDNA) utilizando transcriptasa inversa, con PCR, se puede utilizar ARN como el material de partida para la síntesis del dominio extracelular de un receptor de prolactina sin clonación. Además, los iniciadores de PCR se puede diseñar para incorporar nuevos sitios de restricción u otras características tales como codones determinación en los extremos del segmento génico que se va amplificar. Esta colocación de sitios de restricción en los extremos 5' y 3' de la secuencia génica amplificada permite que los segmentos de gen que codifican a la proteína B1 o un fragmento de la misma sean diseñados a la medida para la unión o enlace a otras secuencias y/o sitios de clonación en los vectores. La técnica de PCR y otros métodos de amplificación de ARN y/o ADN son bien conocidos en la técnica y se pueden utilizar de conformidad con la presente invención sin experimentación indebida, tomando como base las enseñanzas y las guías presentadas en la presente. Los métodos conocidos de amplificación de ADN o ARN incluyen, pero no están limitados a la reacción en cadena de polimerasa (PCR) y procedimientos de amplificación relacionados (véase por ejemplo, patentes E.U.A no. 4,683,195, 4,683,202, 4, 800, 159, 4,965,188 to Mullís et al; 4,795,699 y 4,921 ,794 to Tabor et al; 5,142,033 to Innis; 5,122,464 to Wilson et al; 5,391 ,310, to Innis; 5,066,584 to Gyllensten et al; 4,889,818 to Gelfand et al; 4,994,370 to Silver et al; 4,766,067 to Biswas; 4,656,134 to Ringold; y Innis et al, eds, PCR Protocols: A Guide to Method y Applications) y la amplificación mediada por ARN que utiliza ARN antisentido para la secuencia objetiva o como un molde para la síntesis de ADN de doble cadena (patente E.U.A. no. 5,130,238 to Malek et al, con el nombre comercial NASBA); y la técnica de inmuno-PCR cual combina la utilización de amplificación de ADN con con anticuerpos (Ruzicka et al, Science 260:487 (1993); Sano et al, Science 258:120 (1992); Sano et al, Biotechniques 9:1378 (1991 ), cuyos contenidos en su totalidad de las patentes y referencias se incorporan completamente en la presente para referencia. En una manera análoga, los fragmentos biológicamente activos de B1 o sus isoformas se pueden preparar como se indicó anteriormente con respecto a los análogos de proteínas B1 . Los fragmentos apropiados de proteínas B1 son aquellos que conservan por lo menos la capacidad de unión relacionada al prodominio o la actividad cinasa y que pueden regular la actividad biológica de las algunas otras proteínas o las rutas intracelulares asociadas con la proteínas B1 directa o indirectamente. Por consiguiente, se pueden preparar fragmentos de proteína B1 que tiene un efecto negativo dominante o un efecto positivo dominante como se indicó anteriormente con respecto a los análogos. Deberá indicarse que estos fragmentos representan una clase especial de los análogos de la invención, es decir, estos son porciones definidas de proteínas B1 obtenidas a partir de la secuencia completa de proteína B1 , teniendo cada una de tales porciones o fragmentos cualquiera de las actividades deseadas antes indicadas. Tales fragmentos pueden se por ejemplo, un péptido. De manera similar, se pueden preparar derivados mediante modificaciones estándar de los grupos laterales de uno o más residuos de amino ácido de la proteína B1 , sus análogos o fragmentos, o mediante conjugación de la proteína B1 , sus análogos o fragmentos, con otra molécula por ejemplo un anticuerpo, enzima, receptor, etc, como es bien sabido en la técnica. Por consiguiente, "derivados" tal y como se utiliza en la presente cubre derivados que puedan ser preparados a partir de grupos funcionales que se presentan como cadenas secundarias sobre los residuos o los grupos N- o C-terminales, mediante métodos conocidos en la técnica, y están incluidas en la invención. Los derivados pueden tener porciones químicas tales como residuos de carbohidrato o fosfato, como la condición de que una fracción como tal tenga la misma actividad biológica o superior de las proteínas B1. Por ejemplo, los derivados pueden incluir este alifáticos de los grupos carboxilos, amidas de los grupos carboxílos mediante reacción con amoniaco o con aminas primarias o secundarias, derivados N-acilo o grupos amino libres de los residuos de amino ácido formados con las porciones acilo (por ejemplo, grupos alcanoilo o aroilo carboxiclicos) o derivados O-acilo del grupo hidroxilo libre (por ejemplo el de los residuos de seril o trionilo) formados con las porciones acilo. El témino "derivados" esta diseñado para incluir solo aquellos derivados que no cambian un amino ácido por otro de los veinte comúnmente presentes en la naturaleza. Una proteína B1 es una proteína o polipéptido, es decir una secuencia de residuos de amino ácido. Un polipéptido que consiste de una secuencia mayor que incluye la secuencia entera de una proteína B1 , de conformidad con las definiciones en la presente, esta diseñado para hacer incluido dentro del campo de un polipéptido como tal en tanto que las adiciones no afecten las características básicas y novedosas de la invención, es decir, si estos conservan o incrementan la actividad biológica de la proteína B1 o puede cortada para dejar una proteína o un polipéptido que tenga la actividad biológica de la proteína B1. Por lo tanto, por ejemplo, la presente invención está diseñada para incluir proteínas de fusión de la proteína B1 con otros aminoácidos o péptidos. Las nuevas proteínas B1 , sus análogos, fragmentos y derivados tienen un número de posibles usos tal y como se indica anteriormente y se indicará posteriormente por ejemplo: (i) Estas pueden ser utilizadas para modular las rutas de sobrevivencia celular mediante modulación directa o indirecta de las proteínas intracelulares a las que se unen. En situaciones en donde una actividad aumentada de estas rutas no se desea, es decir, se desea inhibirlas favoreciendo las rutas de muerte celular, por ejemplo, tales como en aplicaciones antitumores o antiestimulatorios, entonces se desea que esta modulación, por B1 , sus isoformas, análogos, fragmentos, o derivados sean inhibidoras. En este caso las proteínas de la invención, sus análogos, fragmentos o derivados, cuando estas son inhibidoras de las rutas de sobrevivencia celular, pueden ser introducidas en las células mediante procedimientos estándar conocidos per se. Por ejemplo, ya que las proteínas codificadas por los clones de ADN de la invención son intracelulares y estas deberían ser introducidas solo en las células cuando se desee, es necesario un sistema para la introducción específica de estas proteínas en las células. Una manera de ejecutar esto es creando un virus animal recombinante por ejemplo uno obtenido de Vaccinia, a cuyo ADNs se introducirán los siguientes los siguientes dos genes: el gen que codifica un ligando que se une a proteínas de la superficie celular específicamente expresadas por estas células, por ejemplo aquellas tales como la proteína gp120 del virus de SIDA (VIH) que se une específicamente a algunas células (linfocitos CD4 y leucemia relacionada) o cualquier otro ligando que se une específicamente a células que portan un receptor conocido, de manera que el vector de virus recombinante será capaz de unirse a tales células; y el gen que codifica las proteínas de la invención. Por lo tanto, la expresión de la proteína que se une a la superficie celular sobre la superficie del virus estará dirigido al virus de manera específica hacia las células tumorales u otra célula que porta al receptor, después de lo cual las secuencias que codifican a las proteínas se introducirán en las células mediante el virus, y una vez expresada en las células resultará en inhibición de las rutas de sobrevivencia celular conduciendo a un efecto de muerte celular o inmunoestimulador deseado en estas células. La construcción de un virus animal recombinante como tal es mediante procedimientos estándar (véase por ejemplo Sambrook y otros, 1989). Otra posibilidad es introducir las secuencias de las proteínas codificadas en forma de oligonucleótidos que pueden ser absorbidos por las células y expresadas en las mismas. De manera similar, cuando las proteínas B1 , isoformas, análogos, fragmentos o derivados son estimuladores o de otra manera aumentan los procesos de muerte celular, entonces éstas también se pueden administrar a células como se indica anteriormente para proveer una actividad antitumoral, inmunoestimuladora u otra actividad de muerte celular incrementada. (ii) Estas pueden ser utilizadas para aumentar o incrementar las rutas de sobrevivencia celular, o, por ejemplo en casos tales como daño a tejidos que se presenta en SIDA, choque séptico o rechazo de injerto vs hospedero, en el cual se desea bloquear las rutas de muerte celular o estimular las rutas de sobrevivencia celular. En esta situación es posible, cuando las proteínas B1 normalmente inhiben los procesos de sobrevivencia celular, o son estimulatorias o de otra manera aumentan las ruta de muerte celular, a, por ejemplo, introducir en las células, mediante procedimientos estándar, oligonucleótidos que tengan la secuencia codificadora antisentido para las proteínas B1 de la invención, las cuales bloquearán efectivamente la traducción de las moléculas de ARNm que codifican las proteínas y por lo tanto bloquearán la expresión y conducirán a la inhibición del efecto no deseado (muerte celular). Tales oligonucleótidos deben introducirse en las células utilizando el método de virus recombinante anterior, siendo la segunda secuencia portada por el virus la secuencia de oligonucleótido. Otra posibilidad es utilizar anticuerpos específicos para las proteínas de la invención para inhibir su actividad intracelulares de señalización. Incluso otra manera de inhibir el efecto no deseado es mediante el método de ribozima recientemente desarrollado. Los ribozimas son moléculas de ARN catalíticas que específicamente cortan las moléculas de ARN. Los ribozimas pueden ser manipulados genéticamente para cortar moléculas de ARN objetivo de elección, por ejemplo las moléculas de ARNm que codifican a las proteínas D1 de la invención. Tales ribozimas tendrán una secuencia específica para el ARNm de las proteínas y serán capaces de interactuar con las mismas (unión complementaria) seguido por corte de la molécula de ARNm, los que resulta en una disminución (o pérdida completa) de la expresión de las proteínas, dependiendo el nivel de la expresión disminuida del nivel de la expresión de ribozima en la célula objetivo. Para introducir ribozimas en las células de la elección (por ejemplo aquellas que portan la secuencia de las proteínas B1 ) se puede utilizar cualquier vector apropiado, por ejemplo vectores plásmidos, vectores de virus animal (retrovirus), que son usualmente utilizados para este propósito (véase también (i) anterior, en donde el virus tiene, una segunda secuencia, una molécula de ADNc que codifica la secuencia de ribozima de la elección). (Para revisiones, métodos etc., referentes a ribozimas véase Chen y otros, 1992; Zhao y Pick, 1993). (¡ii) Estas pueden ser utilizadas para aislar, identificar y clonar otras proteínas que son capaces de unirse a las mismas, por ejemplo otras proteínas implicadas en las rutas intracelulares de inflamación, muerte celular o sobrevivencia celular. Por ejemplo, las secuencias de ADN que codifican las proteínas de la invención pueden utilizarse en el sistema de dos híbridos de levadura en los cuales las proteínas codificadas pueden ser utilizadas como "sebo" para aislar, clonar e identificar otras secuencias a partir de genotecas de ADNc o ADN genómico ("presas") que codifican a proteínas que pueden unirse a las proteínas de los clones. En el mismo sentido, también se puede determinar si es que las proteínas de la presente invención pueden unirse a otras proteínas celulares, por ejemplo otros receptores de la superfamilia de receptores de TNF/NGF, u otros elementos de la familia de BCL2. (¡v) Las proteínas codificadas, sus análogos, fragmentos o derivados pueden también ser utilizados para aislar, identificar y clonar otras proteínas de la misma clase, es decir aquellas que tienen prodominios (CARD) o dominios cinasa, o a proteínas funcionalmente relacionadas, e implicadas en el proceso intracelulares de señalización. En esta aplicación se puede utilizar el sistema de dos híbridos de levadura antes indicados, o estos pueden ser utilizados como un sistema recientemente desarrollado que utiliza hibridación Southern no astringente seguido por clonación mediante PCR (Wilks y otros, 1989). (v) Incluso otro método para utilizar las proteínas codificadas de la invención, sus análogos, fragmentos o derivados es utilizarlas en métodos de cromatografía de afinidad para aislar e identificar otras proteínas o factores a las cuales son capaces de unirse, por ejemplo, proteínas relacionadas a las proteínas B1 u otras proteínas o factores implicados en el proceso intracelulares de señalización. En esta aplicación, las proteínas, sus análogos, fragmentos o derivados de la presente invención, pueden unirse individualmente a matrices de cromatografía por afinidad y después ponerse en contacto con extractos celulares o proteínas o factores aislados de las cuales se sospecha están implicadas en el proceso ¡ntracelulares de señalización. Después del procedimiento de cromatografía por afinidad, las otras proteínas o factores que se unen a las proteínas, sus análogos, fragmentos o derivados de la invención, pueden ser eluidos, aislados y caracterizados. (vi) como se indicó anteriormente, las proteínas, sus análogos, fragmentos o derivados de la invención pueden también ser utilizados como inmunógenos (antígenos) para producir anticuerpos específicos a las mismas. Estos anticuerpos pueden también ser utilizados con los propósitos de purificación de las proteínas de la invención ya sea a partir de extractos celulares o a partir de líneas celulares transformadas que las producen, sus análogos o fragmentos. Además, estos anticuerpos pueden ser utilizados para propósitos de diagnóstico para identificar trastornos relacionados al funcionamiento anormal del sistema de receptores o de las rutas de inflamación, muerte celular o sobrevivencia en los cuales estas funcionan. Por lo tanto, en el caso de que tales trastornos están relacionados a un sistema intracelulares de señalización que funciona mal que implica a las proteínas de la invención, tales anticuerpos podrían servir como una herramienta importante de diagnóstico. El término "anticuerpo" está diseñado para incluir anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales (mAbs), anticuerpos quiméricos, anticuerpos anti-idiotípicos (anti-ld) a anticuerpos que pueden ser marcados en forma soluble o unida, así como a fragmentos de los mismos, tales como, por ejemplo, fragmentos Fab y F(ab')2 que carecen de fragmentos Fc de anticuerpo intacto, los cuales son capaces de unirse al antígeno. (vii) Los anticuerpos, incluyendo fragmentos de anticuerpos, útiles en la presente invención puede utilizarse para detectar cuantitativa o cualitativamente los clones de la invención en una muestra, o para detectar la presencia de células que expresan los clones de la presente invención. Esto se puede lograr mediante técnicas de inmunoflourescencia utilizando un anticuerpo marcado fluorescentemente acoplado con detección microscópica, citometría de flujo o detección fluorométrica.

Los anticuerpos (o fragmentos de los mismos) útiles en la presente invención se pueden utilizar de manera histológica, tal como en microscopía de inmunofluorescencia o inmunoelectrónica, para la detección in situ de los clones de la presente invención. La detección in situ puede ser conseguida removiendo un espécimen histológico de un paciente, y proveyendo el anticuerpo marcado de la presente invención a tal muestra. El anticuerpo (o fragmentos) de preferencia se provee por aplicación o traslapación del anticuerpo marcado (o fragmento) a una muestra biológica. Mediante el uso de un procedimiento como tal, es posible determinar no solo la presencia de los clones, sino también su distribución en el tejido examinado. Utilizando la presente invención, los expertos en la técnica percibirán fácilmente que cualquiera de una amplia variedad de métodos histológicos (tales como procedimientos por tinción) pueden ser modificados para conseguir debidamente tal detección in situ. Tales pruebas para los clones de la presente invención típicamente comprenden incubar una muestra biológica, tal como un fluido biológico, un extracto de tejido, células recién cosechadas tales como iinfocitos o leucocitos, o células que han sido incubadas en cultivo de tejidos, en presencia de un anticuerpo marcado de manera detectable que es capaz de identificar las proteínas codificadas, y detectar el anticuerpo mediante un número de técnicas bien conocidas en la técnica. (vii) Las proteínas codificadas de la invención también pueden ser utilizadas como moduladores indirectos de un número de otras proteínas en virtud de su capacidad de unión a otras proteínas intracelulares, cuyas otras proteínas intracelulares directamente se unen incluso a otras proteínas intracelulares o a un dominio intracelular de una proteína transmembránica. Con el propósito de modular estas otras proteínas intracelulares o los dominios intracelulares de proteínas de transmembrana, las proteínas de la invención pueden ser introducidas en células de varias formas como se mencionó anteriormente en los incisos (i) y (ii). Debe observarse también que el aislamiento, identificación y caracterización de las proteínas de la invención se puede llevar a cabo usando cualquiera de los procedimientos de selección estándar bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, uno de estos procedimientos de selección, es el procedimiento de dos híbridos de levadura, el cual se uso para identificar las proteínas de la invención, del mismo modo, se pueden usar otros procedimientos tales como cromatografía de afinidad, procedimiento de hibridación de ADN, etc, los cuales son bien conocidos en la técnica para aislar, identificar y caracterizar las proteínas de la invención, o para aislar, identificar y caracterizar otras proteínas, factores, receptores, etc, los cuales sean capaces de unirse a las proteínas de la invención. Además, las proteínas que se ha encontrado se unen a las proteínas de la invención se pueden utilizar, en forma análoga en la cual las proteínas de la invención se usaron como se describió anteriormente y como se describe más adelante, para aislar, identificar y caracterizar otras proteínas, factores, etc, los cuales sean capaces de unirse a las proteínas de la invención - proteínas de unión - y los cuales pueden representar factores que intervienen más corriente a bajo en el proceso de señalización asociado, con los cuales puedan tener actividades de señalización propios y por lo tanto, representarían proteínas que intervienen en un proceso de señalización diferente. Las secuencias de ADN y las proteínas codificadas de la invención se pueden producir mediante cualquier procedimiento de ADN recombinante estándar (véase por ejemplo, Sambrook, y otros, 1989) en el cual células hospederas procarióticas o eucarióticas adecuadas son transformadas mediante vectores procarióticos o eucarióticos apropiados que contengan las secuencias que codifiquen para las proteínas. Por consiguiente, la presente invención se refiere también a dichos vectores de expresión y hospederos transformados para la producción de las proteínas de la invención. Como se mencionó anteriormente, dichas proteínas incluyen también sus análogos, fragmentos y derivados biológicamente activos, y así los vectores que la codifican incluyen también vectores que codifican para análogos y fragmentos de estas proteínas, y los hospederos transformados incluyen aquellos que producen dichos análogos y fragmentos. Los derivados de las proteínas son los derivados producidos mediante modificación estándar de las proteínas o de sus análogos o fragmentos, producidos por los hospederos transformados. La presente invención se refiere también a composiciones farmacéuticas para la modulación de los efectos mediados por B1. Las composiciones farmacéuticas comprenden, como ingrediente activo, cualquiera de uno o más de los siguientes: (i) una o más secuencias de ADN de la invención, o partes de las misma, suclonadas en el vector de la expresión apropiado; (ii) una proteína de conformidad con la invención, sus fragmentos, análogos, derivados o una mezcla de los mismos biológicamente activos; (iii) un vector de virus animal recombinante que codifique para una proteína de conformidad con la invención, sus fragmentos análogos o derivados biológicamente activos. Las composiciones farmacéuticas se aplican de acuerdo a la enfermedad que será tratada y en cantidades benéficas para el paciente, dependiendo del peso corporal y otras consideraciones determinadas por el médico. Como se describió anteriormente, de uno puede ser posiblemente un modulador indirecto TRAF2, como tal puede intervenir posiblemente la activación de NF-kB mediante la interacción de TRAF2-NIK. B1 tiene así una función posible en rutas de supervivencia celular de tal forma que TRAF2 funciona independientemente o en conjunto con otras proteínas (por ejemplo, receptores de FNT p55 y FNT p75, receptor de FAS/APO1 , MORT-1 , RIP y TRADD). A este respecto, se ha reconocido la importancia de desarrollar fármacos que puedan incrementar o inhibir la interacción de TRAF2-NIK, según se desee. Por ejemplo, cuando se desee incrementar la citotoxicidad celular inducida por el FNT, sería conveniente inhibir la inducción de NF-kB, inhibiendo la interacción TRAF2-NIK o inhibiendo específicamente TRAF2 y/o NIK. Del mismo modo, por ejemplo, cuando se desee inhibir la citotoxicidad celular inducida por el FNT, sería conveniente incrementar la inducción de NF-kB incrementar la inducción de TRAF2-NIK o incrementando la inducción TRAF2 y/o NIK específica de NF-kB. Existen muchas enfermedades en las cuales dichos fármacos pueden ser de gran ayuda. Entre otros (véase también la discusión anterior), se puede citar a la hepatitis aguda, en la cual el daño agudo al hígado parece reflejar la muerte de células hepáticas mediadas por el receptor de FAS/APO1 , consecutiva a la inducción por el ligando fas; muerte celular autoinmune-inducida tal como la muerte de células ß Langerhans del páncreas, la cual da como resultado diabetes; la muerte de células en el rechazo a injerto (por ejemplo, riñon, corazón e hígado); la muerte de ologodendrocitos en el cerebro en esclerosis múltiple; y el suicidio de células T inhibido por SIDA que causa proliferación el virus del SIDA y por consiguiente dicha enfermedad. En tales casos, sería conveniente inhibir la ruta de citotoxicidad celular FAS/APO1 mediada por el receptor de (apoptosis), e incrementar la inducción NF-kB mediada por el receptor de FAS/APO1 mediante TRAF2 y la interacción TRAF2-NIK. Una forma de lograrlo, sería incrementando la cantidad de NIK en las células o incrementar la cantidad de TRAF2 y NIK, de modo de que la inducción de la activación de NF-kB mediada por NIK o TRAF2-NIK sea incrementada proveyendo niveles mayores de activación de NF-kB y, por consiguiente, supervivencia celular; o también que la interacción directa o indirecta entre el receptor FAS/APO1 y TRAF2 (o TRAF2-NIK) sea incrementada, dando como resultado una disminución en las interacciones del receptor de FAS/APO1 con los mediadores de citotoxicidad celular (por ejemplo, MACH véase esquema de la figura 2) para proveer un incremento en la inducción de la activación de NF-kB y supervivencia celular. Ala inversa, en el caso de, por ejemplo, tumor y células infectadas (véase también discusión anterior), sería conveniente incrementar la citotoxicidad mediada por el receptor de FAS/APO1 para producir muerte celular incrementada. En este caso, sería conveniente inhibir las interacciones del receptor FAS/APO1 -TRAC2 (o - TRAF2-NIK), y/o inhibir directamente a NIK, y así disminuir la inducción de la actividad de NF-kB. Como la proteína B1 de la invención puede tener posiblemente una interacción con TRAF2, puede ser posible incrementar o bloquear esta interacción e incrementar o inhibir de está manera la actividad de TRAF2, en partícula, la interacción de TRAF2 con NIK, y la inducción asociada de la activación de NF-kB. El incremento o la inhibición de la interacción entre B1 y TRAF2 puede ser posible directa o mediante otras proteínas (por ejemplo c-IAP1 , C-IAP2) las cuales se unen a TRAF2, y las cuales interactúan posiblemente con B1 en forma directa o indirecta. De está manera, centrándose en la proteína B1 y modulando su interacción posible (directa o indirecta) con TRAF2, es posible modular también la actividad de TRAF2 y de está manera también los efectos de FAS/APO1 (FAS-R) así como también de FNT-R p55 como se describió anteriormente.

Como se observó anteriormente, posiblemente B1 puede actuar directamente sobre los mediadores de muerte celular, a saber, varias enzimas caspasas cuya actividad proteolítica conduce a muerte celular. Por consiguiente, los efectos de FAS/APO1 (FAS-R) o FNT-R p55 mencionados anteriormente pueden ser modulado directa o indirectamente por B1 mediante modulación posible de las caspasas por B1 (por ejemplo, MACH y otros), los cuales están asociados con FNT-R p55, FAS-R o su proteína de unión MORT-, y os cuales aparentemente efectúan las reacciones apoptópicas mediadas por los mismos. De está manera, si ve uno interactúa con estas caspasas de tal forma que incrementa su actividad, entonces dicha interacción sería aumentada cuando se desee muerte celular como se describió anteriormente, o sería inhibida cuando no se desee muerte celular como se describió anteriormente. De está manera, en vista de lo anterior, se pueden seleccionar varías sustancias tales como péptidos, compuestos orgánicos, anticuerpos, etc, para obtener fármacos específicos que sean capaces de inhibir la interacción posible entre B1 y varias otras proteínas, cuando dicha interacción no se desee. Dichos fármacos probablemente serán aquellos que reconozcan específicamente el prodominio (CARD) de B1 , por ejemplo, péptidos, moléculas orgánicas, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, los cuales se unen específicamente al CARD de B1 , y evitan que interactue con otras proteínas que contengan CARD. Ala inversa, cuando se desee dicha interacción entre B1 y las otras proteínas, esta se puede incrementar entonces incrementando las cantidades de B1 en las células mediante procedimientos estándar descritos en el (i) anterior. Aquí también, también puede ser posible seleccionar para varios fármacos específicos que sean capaces de incrementar intracelularmente la actividad de B1 , o de incrementar su interacción con otras proteínas. Además, como se describió anteriormente, tiene también dominio de cinasa el cual puede intervenir en sus efectos moduladores de rutas de inflamación, muerte celular o supervivencia celular. Por consiguiente, este dominio de cinasa puede funcionar para unir y fosforilar varias proteínas e incrementar o disminuir así su actividad, y de esta forma incrementar o disminuir la actividad de las rutas de inflamación, muerte celular o supervivencia celular, según sea el caso. Por consiguiente, se pueden seleccionar varios péptidos, compuestos orgánicos, anticuerpos, etc, para obtener fármacos específicos que sean capaces de inhibir la actividad de cinasa B1 , cuando se desee inhibir o incrementar las rutas de inflamación, muerte celular o supervivencia celular. Un ejemplo no limitantes de como inhibidores de la interacción de B1 con otras proteínas mediante su prodominio o dominio de cinasa, como se describió anteriormente, serían desarrollados y seleccionados, se basa en estudios previos sobre inhibidores de péptidos de ICE o proteasas similares a ICE, el carácter específico de ICE por el substrato, y estrategias para el análisis de epítopes usando síntesis de péptidos. Se encontró que el requisito mínimo para el corte eficiente de un péptido por ICE implica cuatro amino ácidos a la izquierda del sitio del corte con una fuerte preferencia por ácido aspártico en la posición P-?, siendo suficiente metilamina a la derecha de dicha posición (Sleath y otros, 1990; Howard y otros, 1991 , Thornberry y otros, 1992). Además, el péptido de sustrato fluorógeno (un tetrapéptido), acetil-Asp-Glu-Val-Asp-a-(4-metil-coumaril-7-amida) abreviado como Ac-DEVD-AMC, corresponde a una secuencia en poli(ADP-ribosa)polimerasa(PARP) que se ha encontrado es cortada en células poco después de la estimulación FAS-R, así como también otros procesos apoptópicos (Kaufmann, 1989; Kaufmann y otros, 1993; Lazebnik y otros, 1994), y es cortado eficazmente por CPP32 (un miembro de la familia de CED3/ICE proteasa) y MACH proteasas. Como copiar Asp en la posición Pi del sustrato parece ser importante, los tretra péptidos que tengan Asp como cuarto residuo de amino ácido y varias combinaciones de amino ácidos en las tres primeras posiciones de residuos, se pueden seleccionar rápidamente para su unión al sitio activo de las proteasas, usando, por ejemplo, el método desarrollado por Geysen (Geysen, 1985, Geysen y otros, 1987) donde se selecciono un gran número de péptidos sobre soportes sólidos para interacciones específicas con anticuerpos. La unión de MACH proteasas a péptidos específicos se pueden detectar mediante varios métodos de detección bien conocidos por los expertos en la técnica, tales como marcación radiactiva, etc. Se demostró que este método de Geysen es capaz de poner a prueba por lo menos 4000 péptidos en cada día de trabajo.

En forma similar, se puede dilucidar la región de unión exacta o región de homología que determina la interacción entre B1 y otras proteínas, y entonces se pueden seleccionar péptidos que puedan servir para bloquear esta interacción, por ejemplo, péptidos sintetizados que tengan una secuencia similar a aquella de la región de unión o complementaria a los mismos, que puedan competir con la B1 natural para su unión a, de otra manera interactuar con otras proteínas de las rutas de muerte celular o supervivencia celular, mediante los dominios de cinasa o CARD, o incluso el dominio intermediario de B1 entre su dominio de cinasa y CARD. Dado que puede ser ventajoso desarrollar inhibidores de péptidos que inhiban selectivamente las interacciones de B1 sin interferir con procesos fisiológicos de supervivencia o muerte celular en los cuales intervienen otros miembros de las rutas intracelulares de señalización, el grupo de péptidos que se unen a B1 en dicha prueba tal como la descrita anteriormente, se puede sintetizar además como un péptido de sustrato fluorogeno para poner a prueba la unión selectiva de B1 a dichas otras proteínas para seleccionar únicamente aquellas específicas para B1. Los péptidos que se determinen son específicos para, por ejemplo, el dominio de cinasa o CARD de B1 pueden ser modificados para incrementar la permeabilidad celular y modular reversible o irreversiblemente procesos de inflamación, muerte celular o supervivencia celular. Thomberry et al. (1994) reportar un que tetrapéptido (aciloxi) un metil cetona Ac-Tyr-Val-Ala-Asp- CH2OC (O)[2,6-(CF3)2]Ph era un inactivador potente de ICE. Del mismo modo, Milligan y otros. (1994) reportar un que los inhibidores de tetrapéptidos que tienen una clorometilcetona (irreversiblemente) o grupos de aldeido (reversiblemente) inhibían a ICE. Además, se demostró que benciloxicarboxil-Asp- CH2OC (O) -2,6-diclorobenceno (DCB) inhibe a ICE (Mashima y otros., 1995). Por consiguiente, en forma análoga, los tetrapéptidos que se unen selectivamente a, por ejemplo, el dominio de cinasa o CARD de B1 , pueden ser modificados con, por ejemplo, un grupo aldeido, clorometilcetona, (aciloxi)metil cetona o un grupo CH2OC (O)-DCB para crear un modulador péptidico de la actividad de B1. Además, para mejorar la permeabilidad, los péptidos pueden ser, por ejemplo, químicamente modificados o derivados para incrementar su permeabilidad a través de la membrana celular y facilitar el transporte de dichos péptidos a través de la membrana y en el citoplasma Muranishi y otros. (1991 ) reportaron la derivación de hormonas liberadora de tirotropina con ácido laurico para formar un derivado lipofilo de lauroilo con buenas características de penetración a través de membrana celulares. Zacharia y otros. (1991 ) reportaron también la oxidación de metiolina hasta sulfóxido, y él remplazo del enlace péptidico con su y su éster de cetometileno (COCH2) para facilitar el transporte de péptidos a través de la membrana celular. Estos son solo algunos de los derivados y modificaciones conocidos que son bien conocidos por los expertos en la técnica. Además, inhibidores de péptidos o fármacos, los cuales son capaces de inhibir la actividad de, por ejemplo, las rutas de supervivencia celular con muerte celular, interfiriendo con la interacción posible entre B1 y cualquiera de las proteínas de unión mediante los dominios de intermediario o de cinasa o CARD, pueden ser conjugados o combinados con moléculas que faciliten su entrada en la célula. La patente de E.U.A. 5,149,782 describe la conjugación de una molécula que será transportada a través de la membrana con un agente de mezclado en membrana tal como polipéptidos fusogenos, polipéptidos de formación de canales de hierro, otros polipéptidos de membrana, y ácidos grasos de cadena larga, por ejemplo, ácido miristico y ácido palmitico. Estos agentes de mezclado en membrana insertan los conjugados moleculares en las dicapa lipidica de las membranas celulares, y facilitan su entrada en el citoplasma. Low y otros., patente de E.U.A. 5,108,921 , revisan los métodos disponibles para el suministro transmembrana de moléculas tales como, pero no limitadas a, proteínas y ácidos nucleicos mediante el mecanismo de actividad endocitotica mediada por el receptor. Estos sistemas de receptores incluyen los que reconocen galactosa, mañosa, mañosa 6-fosfato, transferrina, asialoglucoproteina, transcobalamina (vitaminaB-^), .a-2 macroglobulinas, insulina, y otros factores péptidicos de crecimiento tales como factor de crecimiento epidérmico (EGF). Low y otros enseña que se pueden usar ventajosamente receptores de nutrientes, tales como, receptores para biotina y foleato, para incrementar el transporte a través de la membrana celular debido a la localización y multiplicidad de receptores de biotina y foleato sobre la superficie de membrana de la mayoría de la células y los procesos de transporte transmembrana asociados mediados por receptores. De esta manera, un complejo formado entre un compuesto que será suministrado en el citoplasma y un ligando, tal como biotina o foleato, se pone en contacto con una membrana celular que posee receptores de biotina o foleato para in ar el mecanismo de transporte transmembrana mediada por receptores, y permitir de esta manera la entrada del compuesto deseado en la célula. Se sabe que ICE tiene la capacidad para tolerar sustituciones liberales en la posición P2, y esta tolerancia a sustituciones liberales exploto para desarrollar una marca de afinidad potente y altamente selectiva que contiene una marca de biotina Thomberry et al. (1994). Por consiguiente, la posición P2 así como también posiblemente el N-terminal del inhibidor de tetrapéptidos pueden ser modificados derivados, tal con la adición de una molécula de biotina, para incrementar la permeabilidad de estos inhibidores de péptidos a través de la membrana celular. Además, se sabe en la técnica que la fusión de una secuencia de péptidos deseada con una secuencia de péptidos líder/señal para crear "péptido quimérico" permitirá que dicho "péptido quimérico" sea transportado a través de la membrana celular en el citoplasma. Como será apreciado por los expertos en la técnica, de péptidos, los inhibidores de péptidos de la interacción de B1 con otras proteínas, como se describió anteriormente, de conformidad con la presente invención incluyen inhibidores o fármacos péptidomiméticos, los cuales se pueden seleccionar rápidamente para su unión al dominio CARD, de cinasa o de intermediario de B1 para desarrollar inhibidores quizá mas estable. Se apreciara que también que los mismo medios para facilitar o incrementar el transporte de inhibidores de péptidos a través de las membranas como se describió anteriormente son también aplicables a los análogos, fragmentos o isoformas de B1 , así como también otros péptidos de B1 (incluyendo proteínas de fusión) que ejercen ¡ntracelularmente sus efectos. Con respecto a los anticuerpos mencionados a lo largo de la presente, el término "anticuerpo" significa que incluye anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales (mAbs), anticuerpos quiméricos, anticuerpos antiidiotípicos (anti-ld) para anticuerpos que pueden ser marcados en forma soluble o unida, así como también fragmentos de los mismos provistos mediante cualquier técnica conocida tal como, pero no limitada a, corte enzimático, síntesis de péptidos o técnicas recombinantes. Los anticuerpos policlonales son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpos derivados de los sueros de animales inmunizados con el antígeno. Un anticuerpo monoclonal contiene una población de anticuerpos sustancialmente homogénea específica a antígenos, cuyas poblaciones contienen sitos de unión a epitope sustancialmente similares. Los MAbs se pueden obtener mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo Kohler y Milstein, Nature, 256:495-497 (1995); Patente de E.U.A. No. 4,376,1 10; Ausubel y otros., eds., Harlow y Lañe ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); y Colligan y otros., eds. Current Protocols in Inmunology, Grene Publishing Assoc. y Willey Interscience N.Y. (1992-1996), cuyos contenidos se incorporan en su totalidad en la presente como referencia. Dichos anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmonoglobulina que incluye IgG, ImM, IgE, IgA, GILD, y cualquier subclase de las mismas. Un hibridoma que produzca un mAb de la presente invención puede ser cultivado in vitro, in situ o in vivo. La producción de títulos altos de mAbs in vitro, in situ o in vivo, hace de este el método de producción actualmente preferido. Los anticuerpos quiméricos son moléculas de las cuales diferentes porciones se derivan de diferentes especies animales, tales como las que tienen la región variable derivada de un mAbs de murino y una región constante de inmonoglobulina humana. Los anticuerpos quiméricos se usan principalmente para reducir la inmunogenecidad en la aplicación, y para incrementar los rendimientos en producción, por ejemplo, donde los mAbs de murino tienen mayores rendimientos a partir de hibridomas, pero inmunogenecidad mayor en humano, de modo que se usan mAbs quiméricos de humano y murino. Los anticuerpos quiméricos y métodos para su producción son conocidos en la técnica (Cabilly y otros., Proc. Nati. Acad Sci. USA 81 :3273-3277 (1984); Morrison y otros., Proc. Nati. Acad Sci. USA 81 :6851-6855 (1984); Boulianne y otros., Nature 312:643-646 (1984); Cabilly y otros., solicitud de patente Europea 125053 (publicada el 14 de noviembre de 1984); Neugeber y otros., Nature 314:268-270 (1985); Taniguchi y otros., solicitud de patente europea 171496 (publicada el 19 de febrero de 1985); Morrison y otros., solicitud de patente europea 173494 (publicada el 5 de marzo de 1986); Neugeber y otros., PCT Application WO 8601533, (publicada el 13 de marzo de 1986) Kudo y otros., solicitud de patente europea 184187 (publicada el 1 1 de junio de 1986); Sahagan y otros., J. Immunol. 137:1066-1074 (1986); Robinson y otros., solicitud de patente internacional No. WO8702671 (publicada el 7 de mayo de 1987); Liu y otros., Proc. Nati. Acad Sci. USA84:3439-3443 (1987); Sun y otros., Proc. Nati. Acad Sci. USA 84:214-218 (1987) ; Beeter y otros., Science 240:1041 -1043 (1988); y Harlow y Lañe, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, citado anteriormente. Estas referencias se incorporan en su totalidad en la presente como referencia. Un anticuerpo antiidiotipico (anti-ld) es un anticuerpo que reconoce determinantes únicos asociados generalmente con el sitio de unión a antígeno de un anticuerpo, un anticuerpo Id se puede preparar inmunizando un animal de la misma especie y tipo genético (por ejemplo cepa de ratón), como la fuente del mAb al cual sé esta preparando un anti-ld. el animal inmunizado reconocerá y responderá a los determinantes idiotípicos del anticuerpo inmunizante produciendo un anticuerpo para estos determinantes idiotípicos (el anticuerpo anti-ld). Véase, por ejemplo, patente de E.U.A. No. 4,699,880, incorporada en la presente como referencia. El anticuerpo anti-ld se puede usar también como un "inmunógeno" para inducir una respuesta inmune en otro animal más, produciendo el denominado anticuerpo anti-anti-ld. El anti-anti-ld puede ser epitópicamente idéntico al mAb original que indujo en anti-ld. De está manera, usando anticuerpos para los determinantes idiotípicos de un mAb, es posible identificar otros clones que expresen anticuerpos de carácter específico idéntico. Por consiguiente, los mAbs generados contra las proteínas B1 , análogos, fragmentos o derivados de la misma, de la presente invención, se pueden usar para inducir anticuerpos anti-ld en animales adecuados, tales como ratones, BALB/c. Se usan células de bazo de dichos ratones inmunizados para producir hibridonas anti-ld que se crecen mAbs anti-ld. Además, mAbs anti-ld pueden ser acoplados a un vehículo tal como hemocianina de lata (KLH), y usarse para inmunizar a otros ratones BALB/c. Los sueros de estos ratones contendrán anticuerpos anti-anti-ld que tiene propiedades de unión del mAb original específico para un epítope de la proteína B1 anterior, o análogos, fragmentos y derivados de la misma. Los mAb anti-ld tienen así sus propios epítopes sus propios idiotípicos, o "idiótopes" estructuralmente similares al epítope que está siendo evaluado, tal como la proteína-a GRB. El término "anticuerpos significa también que incluye moléculas intactas así como fragmentos de las mismas tales, por ejemplo, Fab y F(ab')2, las cuales son capaces de unirse al antígeno. Los fragmentos Fab y F(ab')2 carecen del fragmento Fc del anticuerpo intacto, se depuran más fácilmente de la circulación, y pueden tener unión a tejido menos específica que un anticuerpo intacto (Wahl y otros, J.Nucl. Med. 24:316-325 (1983)).

Se apreciará que Fab y F(ab')2 y otros fragmentos de los anticuerpos útiles en la presente invención se pueden usar para la detección y cuantificación de la proteína B1 de conformidad con los métodos descritos en la presente para moléculas de anticuerpos intactas. Dichos fragmentos se producen típicamente mediante el corte proteolítico, usando enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')2). Se dice que un anticuerpo es "capaz de unirse" a una molécula si es capaz de reaccionar específicamente con la molécula para unir así la molécula al anticuerpo. El término "epítope" se refiere a esa porción de cualquier molécula capaz de ser unida por un anticuerpo la cual puede ser reconocida también por dicho anticuerpo. Los epítopes "determinantes antigénicos" consisten usualmente de grupos de moléculas de superficie químicamente activa tales como amino ácidos o cadenas laterales de azúcar, y tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como también características específicas de carga. Un "antígeno" es una molécula o una porción de una molécula capaz de ser unida por un anticuerpo el cual es adicionalmente capaz de inducir a un animal para que produzca anticuerpo capaz de unirse a un epítope de ese antígeno. Un antígeno puede tener uno o más de un epítope. La reacción específica referida anteriormente significa que implica que el antígeno reaccionará, en forma altamente selectiva, con su anticuerpo correspondiente y no con la multitud de otros anticuerpos que pueden ser evocados por otros antígenos. Los anticuerpos, incluyendo fragmentos de anticuerpos, útiles en la presente invención se pueden usar para detectar cuantitativa o cualitativamente la proteína B1 en una muestra, o para detectar la presencia de células que expresan la proteína B1 de la presente invención. Esto se puede lograr mediante técnicas de inmunofluorescencia que utilizan un anticuerpo marcado en forma fluorescente (véase más adelante) acoplado con detección fluorométrica, de citometría de flujo o con microscopio óptico. Los anticuerpos (o fragmentos de los mismos) útiles en la presente invención se pueden utilizar histológicamente, como en microscopia de inmunofluorescencia o inmunoelectrónica, para la detección in situ de la proteína B1 de la presente invención. La detección in situ se puede lograr removiendo un espécimen histológico de un paciente, y proveyendo el anticuerpo marcado de la presente invención para dicho espécimen. El anticuerpo (o fragmento) se provee preferiblemente aplicando o traslapando el anticuerpo marcado (o fragmento) a una muestra biológica mediante el uso de dicho procedimiento, es posible determinar no únicamente la presencia de la proteína B1 , si no también su distribución en el tejido examinado. Usando la presente invención, los expertos en la técnica apreciarán fácilmente que se puede modificar cualquiera de una amplia variedad de métodos histológicos (tales como procedimientos de tintinó) para lograr dicha detección in situ.

Dichas pruebas para la proteína B1 de la presente invención, comprenden típicamente incubar una muestra biológica, tal como fluido biológico, extracto de tejido, células recién cosechadas tales como linfocitos o leucocitos, o células que han sido encubadas en cultivo de tejidos, en presencia de un anticuerpo marcado en forma detectable capaz de identificar la proteína B1 , y detectando el anticuerpo mediante cualquiera de un número de técnicas bien conocidas en la material. La muestra biológica se puede tratar con un soporte o vehículo de fase sólida tal como microcelulosa, u otro soporte o vehículo sólido que sea capaz de inmunomobilizar células, partículas de células o proteínas solubles. El soporte o vehículo se puede lavar entonces con reguladores de pH adecuados seguido de tratamiento con un anticuerpo marcado en forma detectable de conformidad con la presente invención, como se describió anteriormente. El soporte o vehículo de fase sólida se puede lavar entonces por segunda vez con el regulador de pH para remover el anticuerpo no unido. La cantidad de marca unida en dicho soporte o vehículo sólido puede detectar entonces mediante medios convencionales. Por "soporte de fases sólidas", "vehículo de fase sólida", "soporte sólido", "vehículo sólido", "soporte" o "vehículo", se entiende cualquier soporte o vehículo capaz de unir antígenos o anticuerpos. Los soportes o vehículos bien conocidos incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrán, amilasas de nylon, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, gabros y magnetita. La naturaleza del vehículo puede ser soluble hasta cierto grado o insoluble para los propósitos de la presente invención. El material de soporte puede tener virtualmente cualquier configuración estructural posible en tanto la molécula acoplada sea capaz de unirse a un antígeno o anticuerpo. De está manera, la configuración del soporte o vehículo puede ser esférica, como en una esfera, cilindrico, como en la superficie interior de un tubo de prueba, o la superficie externa de una varilla. En forma alternativa la superficie puede ser plana tal como una hoja, tira de prueba, etc. Los soportes o vehículos preferidos incluyen esferas de polietileno. Los expertos en la técnica conocerán muchos otros vehículos adecuados para unir antígenos o anticuerpos, no serán capaces de investigar los mismos mediante el uso de experimentación habitual. La actividad de unión de un lote determinado de anticuerpo de la invención como se describió anteriormente, se puede determinar de conformidad con métodos bien conocidos. Los expertos en la técnica serán capaces de determinar condiciones de prueba operativas y óptimas para cada determinación utilizando experimentación de rutina Otros pasos tales como lavado, agitación, filtración y similares^se pueden añadir a las pruebas como es habitual o necesario para la situación en particular. Una de las formas por las cuales un anticuerpo de conformidad con la presente invención puede ser marcado en forma detectable, es mediante la unión del mismo a una enzima, y siendo usado en una inmunoprueba de enzima (EIA). Esta enzima, a su vez, cuando se expone después a un sustrato apropiado, reaccionará con el sustrato en forma tal para producir una porción química la cual puede ser detectada, por ejemplo, mediante medios espectrofotométricos, fluorométricos o visuales. Las enzimas que se puedan usar para marcar en forma detectable el anticuerpo incluyen, pero no están limitadas a, malato deshidrogenasa, nucleasa de estafilococos, delta-5-esteroide isomerasa, alcohol deshidrogenasa de levaduras, alfa-glicerofosfato deshidrogenasa, triosa fosfato isomerasa, peroxidasa de rábano picante, fosfatasas alcalina, asparaginasa, flucosa oxidasa, beta-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, glucoamilasa y acetilcolina-esterasa. La detección se puede lograr mediante métodos colorimétricos que utilicen un sustrato cromógeno para la enzima juntos en la detección también se puede logran mediante comparación visual del nivel de reacción enzimática de un sustrato en comparación con estándares preparados del mismo modo. La detección se puede lograr utilizando cualquiera de una variedad de otras inmunopruebas. Por ejemplo, marcando radioactivamente los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, es posible detectar R-PTPasa mediante el uso de un radioinmunoensayo (RÍA). Una buena descripción de RÍA puede ser encontrada en Laboratory Techniques y Biochemistry in Molecular Biology, por Work, T.S. y otros, North Holland Publishing Company, NY (1978) con referencia particular al capítulo titulado "An Introduction to Radioimmune Assay y Related Techniques" por Chard, T., incorporado en la presente como referencia. El isótopo radioactivo puede ser detectado mediante medios tales como el uso de un contador gama o un contador de escintilación o mediante autoradiografía. También es posible marcar un anticuerpo de conformidad con la presente invención con un compuesto fluorescente. Cuando el anticuerpo marcado en forma fluorescente se expone a luz de la longitud de onda apropiada, su presencia se puede detectar entonces debido a fluorescencia. Entre los compuestos para marcación fluorescente que se utiliza más comúnmente están isotiocianato de fluoresceina, rodamina, ficoeritrina, picocianina, aloficocianina, o-ftaldehído y fluorescamina. El anticuerpo puede ser también marcado en forma detectable usando metales que emitan fluorescencia tales como 152E, u otros de la serie de lantanidos. Estos metales pueden ser fijados al anticuerpo usando dichos grupos quelatadores de metal tales como ácido dietilentriamino pentaacético (ETPA). El anticuerpo puede ser también marcado en forma detectable acoplándolo a un compuesto quimiluminoscente. La presencia del anticuerpo marcado en forma quimiluminoscente se determina después detectando la presencia de luminescencia que surge durante el curso de una reacción química. Ejemplos de compuestos para marcación quimiluminoscente particularmente útiles son luminal, isoluminol, éster teromatico de acridinio, imidazol, sal de acridinio y éster de oxalato. Del mismo modo, se puede usar un compuesto bioluminiscente para marcar el anticuerpo de la presente invención. La bioluminiscencia es un tipo de quimiluminiscencia presente en sistemas biológicos en los cuales una proteína catalítica incrementa la eficiencia de la reacción quimiluminescente. La presencia de una proteína de bioluminisente se determina detectando la presencia de luminiscencia. Los compuestos bioluminisentes importantes para propósitos de marcación son luciferina, luciferasa y aecuorina. Una molécula de anticuerpo de la presente invención puede ser adaptada para su utilización en una prueba inmunometrica, conocida también como prueba de "dos sitios" o de "sandwich". En una prueba inmunometrica típica, una cantidad de anticuerpos sin marcar (o fragmento de anticuerpo) es unida a un soporte o vehículo sólido, y se añade a una cantidad de anticuerpo soluble marcada en forma detectable para permitir la detección y/o cuantificación del complejo ternario formado entre el anticuerpo de fase sólida, el antígeno y el anticuerpo marcado. Las pruebas inmunometricas típicas y preferidas incluyen pruebas "hacia adelante" en las cuales el anticuerpo unido a la fase sólida se pone en contacto primero con la muestra que esta ha siendo puesta para extraer el antígeno de la muestra mediante la formación de un complejo binario de antígeno y anticuerpo de fase sólida. Después de un período de incubación adecuado, el soporte o vehículo sólido se lava para remover el residuo de la muestra de fluido, incluyendo antígeno sin reaccionar, si es que existe alguno, y se pone entonces en contacto con la solución que contenga una cantidad desconocida de anticuerpo marcado (el cual funciona como una "molécula reportera"). Después de un segundo período de incubación para permitir que el anticuerpo marcado se combine con el antígeno unido al soporte o vehículo sólido a través del anticuerpo sin marcar, el soporte o vehículo sólido se lava una segunda vez para remover el anticuerpo marcado sin reaccionar. En otro tipo de prueba de "sandwich", la cual puede ser también útil con los antígenos de la presente invención, se usan las denominadas pruebas "simultánea" y "inversa". Una prueba simultánea implica un paso de incubación individual mientras el anticuerpo unido al soporte o vehículo sólido y el anticuerpo marcado se añaden a la muestra que esta ha siendo puesta a prueba al mismo tiempo. Después de que concluye la incubación, el soporte o vehículo sólido se lava para remover el residuo de la muestra de fluido y el anticuerpo marcado sin combinar. La presencia de anticuerpo marcado asociado con el soporte o vehículo sólido se determina entonces como se haría en una prueba convencional de sandwich "hacia adelante". En la prueba "inversa", se utiliza la adición gradual primero de una solución de anticuerpo marcado para la muestra de fluido seguido por la adición de anticuerpo sin marcar unido a un soporte o vehículo sólido después de un período de incubación adecuado. Después de una segunda incubación, la fase sólida se lava en forma convencional para liberarla del residuo de la muestra que esta siendo puesta a prueba, y la solución de anticuerpo marcado sin reaccionar. La determinación del anticuerpo marcado asociado con un soporte o vehículo sólido se determina entonces como en las pruebas "simultánea" y "hacia adelante".

Como se mencionó anteriormente, la presente invención se refiere también a composiciones farmacéuticas que comprende vectores de virus animal recombinantes que codifican para las proteínas B1 , cuyo vector codifica también para una proteína de superficie viral capaz de unirse a proteína de superficie de células objetivo específicas (por ejemplo, células cancerosas) para dirigir la inserción de la secuencia de proteína B1 en las células. Otras composiciones farmacéuticas de la invención comprenden como ingrediente activo a) una secuencia de oligonucleótidos que codifican para una secuencia antisentido de la secuencia de proteína B1 , o b) fármacos que bloquean la interacción de B1 con otras proteínas. Las composiciones farmacéuticas de conformidad con la presente invención incluyen una calidad suficiente del ingrediente activo para lograr su propósito deseado. Además, las composiciones farmacéuticas pueden contener vehículos adecuados farmacéuticamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares que faciliten el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que se puedan usar farmacéuticamente, y que puedan estabilizar dichas preparaciones para su administración al sujeto que necesita de las mismas, como es bien conocido por los expertos en la técnica. Se supone que la proteína B1 y sus isoformas y isotipos son posiblemente expresados en diferentes tejidos a niveles notablemente diferentes y al parecer también con diferentes patrones de isotipos en forma análoga a la expresión de varios ejemplos de proteínas que intervienen en las rutas de señalización y intracelular como se indicó en la solicitud de patente coopendiente coasignadas mencionadas anteriormente. Estas diferencias pueden contribuir posiblemente a las características específicamente de tejidos de respuesta aligando Fas/APO1 y el FNT. Como en el caso de otros homólogos de CED3/ICE (Wang y otros, 1994, Alnemri y otros, 1995), los presente inventores han mostrado anteriormente (en las solicitudes de patente mencionadas anteriormente) que las isoformas de MACH que contienen regiones incompletas de CED3/ICE (por ejemplo MACHa3) exhiben un efecto inhibidor sobre la actividad de moléculas MACHal o MACHa2 coexpresadas; y que también bloquean la inducción de muerte por Fas/APO1 y p55-R (FNT-R p55). La expresión de dichas isoformas inhibidoras en células puede constituir un mecanismo de auto protección celular contra la citotocidad mencionada mediada por Fas/APO1 y TNF. La alta heterogeneidad de las isoformas MACH, la cual excede en gran medida la observada para cualquiera de las otras proteasas de la familia de CED3/ICE, debe permitir una afinación particularmente fina de la función de las isoformas de MACH activas. Se sabe también que BCL2, BCL-X y otros miembros de la familia de BCL2 son expresados y son activos a grados variables en diferentes tipos de células, dando lugar a variaciones en la susceptibilidad de células diferentes apoptosis inducida, es decir, es más probable que algunas células sobrevivan más que otras (véase la revisión señalada anteriormente por Yang y Korsmeyer, 1996). Como se mencionó anteriormente, las proteínas B1 o isoformas posibles pueden tener posiblemente efecto variables en diferentes tejidos. Por ejemplo, dichos efectos variables pueden ser posiblemente respecto a su interacción con otras proteínas de los procesos de inflamación, muerte celular o supervivencia celular, y su influencia así sobre la actividad de estas rutas, en particular, el balance entre las mismas y si o no este balance será desviado hacia una u otra dirección. También es posible que algunas de las isoformas posibles de la proteína B1 desempeñen otras funciones. Por ejemplo, B1 , sus análogos, o isoformas pueden actuar también como sitios de acoplamiento para moléculas que intervienen otras rutas intracelulares no relacionadas a las rutas de muerte celular o supervivencia celular descritas anteriormente. Debido a la capacidad única de los receptores de FNT y Fas/APO1 para causar muerte celular, así como también la capacidad de los receptores de FNT para desencadenar otras actividades nocivas para los tejidos, las aberraciones en la función de estos receptores podrían ser particularmente prejudiciales para el organismo. Además, se ha demostrado que el funcionamiento excesivo y deficiente de estos receptores contribuye a manifestaciones patológicas de varias enfermedades (Vassalli, 1992; Nagata y Golstein, 1995). Identificar las moléculas que participen en la actividad de señalización de los receptores, y encontrar formas para modular la actividad de estas moléculas, podría dirigir nuevos procedimientos terapéuticos. En vista de la supuesta función importante de las proteínas TRAF, y por lo tanto la proteína B1 que puede interactuar posiblemente en forma directa o indirecta con las mismas, o la supuesta interacción entre la proteína B1 y varias caspasas, parece particularmente importante desarrollar fármacos que puedan afectar o modular la interacción entre B1 y estas otras proteínas en las cuales interactua, y de esta forma incrementar o inhibir los procesos de muerte celular o supervivencia celular, según se desee. La presente invención se refiere también a proteínas u otros ligandos que se puedan unir a las proteínas de B1 de la invención y de esta manera modular/mediar la actividad de las proteínas B1 . Dichas proteínas o ligando se pueden seleccionar, aislar y producir mediante cualquiera de los métodos mencionados anteriormente. Por ejemplo, se puede aislar un número de nuevos ligandos, incluyendo proteínas, capaces de unirse a las proteínas B1 de la invención. Como se describió en forma detallada anteriormente, dichas nuevas proteínas/ligandos de unión a B1 pueden funcionar, por ejemplo, como inhibidores o incrementadores de la actividad medida por B1 , y como tales tendrán funciones importantes en varias situaciones patológicas y de otro tipo como se detallo anteriormente. Otra función de dichos ligandos/proteína de unión a B1 , sería funcionar como agentes específicos para la purificación de las proteínas B1 , por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad, estos nuevos ligando/proteínas de unión siendo adheridos a las matrices de cromatografía adecuadas para formar el soporte/matriz sólido o de afinidad a través del cual una solución, extracto o su similar, que contenga a las proteínas B1 , será pasar y de esta forma facilitará la purificación de las mismas. Dichos métodos de cromatografía de afinidad son ahora procedimientos de la técnica bien conocidos y generalmente estándar. El mismo modo, todas las proteínas B1 mencionadas anteriormente, análogos, fragmentos, isoformas y derivados de la presente invención se pueden usar para purificar mediante cromatografía de afinidad las diferentes proteínas de las rutas de inflamación, muerte celular o supervivencia celular a las cuales se unen. Por ejemplo, las proteínas de B1 y análogos, fragmentos y muteinas de las mismas se pueden usan para la purificación de las proteínas de unión a B1 mediante cromatografía de afinidad. Dicho método para identificar y producir estas proteínas de unión a B1 , incluir un paso de selección en el cual la proteína B1 , o por lo menos una porción específica de la misma, se usa como substrato o "sebo" para obtener proteínas o cualquier otro ligando capaz de unirse a la misma; seguido de pasos de identificación y caracterización de dichas proteínas/ligandos así obtenidas; y produciendo subsecuentemente dichas proteínas/ligandos en forma sustancialmente aisladas y purificadas. A todos estos pasos son bien conocidos por los expertos en la técnica, y se detallaron ya anteriormente y se detallan más adelante en la presente. La invención se describirá ahora en más detalle en los siguientes ejemplos no limitantes y los dibujos acompañantes: Se debe destacar también que los procedimientos de: i) selección de dos inhibidos y prueba de expresión de ß-galactosidasa de dos híbridos; ii) expresión inducida, marcación metabólica e inmunoprecipitación de proteínas; iii) unión in vitro; (iv) evaluación de la citotoxicidad; y (v) análisis Northern y de secuencias, así como también otros procedimientos usados en los siguientes ejemplos, sean detallado en publicaciones previas por los presentes inventores con respecto a otras proteínas y rutas intracelulares de señalizaciones (véase, por ejemplo Boldin y otros, 1995b, y Boldin y otros. 1996). Estos procedimientos aparecen también en detalla en la solicitud de Israel co-pendiente co-asignada Nos. 1 14615, 1 14986, 1 15319, 1 16588, 1 17932 y 120367, así como también en la solicitud de PCT correspondiente No. PCT/US96/10521. Por consiguiente, las descripciones completas de todas estas publicaciones y solicitudes de patentes incluyen en la presente en su totalidad y por lo menos en cuanto a los procedimientos experimentales detallados se refieren. Con respecto a la proteína NIK y su función en la activación de NK-?B y por consiguiente la supervivencia celular y la función desempeñada por TRAF2 en esta ruta de supervivencia celular, por ejemplo, la interacción entre TRAF2 y p55-R, FAS-R, RIP y otras proteínas, estas han sido detalladas por los presentes inventores en las solicitudes de 1L y PCT co-pendientes, y co-asignadas mencionadas anteriormente, y en Malinin y otros, 1997.

EJEMPLO 1 Aisalimento. secuenciación y caracterización parcial de la nueva proteína B1.

Utilizando varios métodos como se describe en las solicitudes de patente co-asignadas mencionadas anteriormente, una nueva secuencia de ADN clonado ha sido aislada, secuenciada y parcialmente caracterizada. Esta secuencia de ADN codifica para una nueva proteína, designada originalmente como cinasa de unión a c-IAP (CBK) en virtud de su homología con proteínas c-IAP, y al que tiene un dominio de cinasa, pero ahora designada como B1. En resumen, para elucidar mejor la actividad intracelular de los inhibidores celulares de apoptosis recientemente descubiertos (IAP), homólogos C-IAP1 y C-IAP2 (véase Rothe y otros, 1995; Uren y otros, 1996; Hofmann y otros, 1997) y con los cuales las proteínas intracelulares interactúan, la secuencias de c-IAP se usaron para seleccionar para otras secuencias posiblemente homologas o relacionadas de otra manera en varias bases de datos, incluyendo aquellas que tienen marcas de secuencia (ests) expresadas no caracterizadas (y no totalmente secuenciadas). De esta forma, se encontró una secuencia parcial de un nuevo clon que tenía alta homología con C-IAP1. Usando esta secuencia parcial, la cual no había sido caracterizada anteriormente, se prepararon iniciadores de PCR para la clonación, mediante PCR, de la secuencia de ADN de longitud total de este nuevo clon usando, como ADN molde, genotecas de ADNc obtenidas comercialmente. Como resultado, se obtuvo un nuevo clon de ADN de longitud total que codifica para una proteína hasta ahora desconocida, a saber, la nueva proteína designada como B1. Se determinó inicialmente una secuencia para B1 (ADN y aminoácidos). Un análisis posterior y la determinación de la secuencia inicial de B1 reveló algunas diferencias en la parte N-terminal de la secuencia de aminoácidos (el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos), las cuales involucraron los primeros 19 residuos de aminoácidos deducidos. Esta determinación de secuencia y análisis adicionales produjeron la secuencia deducida de aminoácido de B1 y, por lo tanto, la secuencia de nucleótidos de codificación, como se muestra en las figuras 3A y B, respectivamente. Después de analizar las secuencias de aminoácidos de la figura 3, se desprende que existe un motivo de cinasa en el extremo N-terminal de la proteína el cual es codificado por los primeros aproximadamente 1000 nucleótidos del marco de lectura abierta (ORF) de las secuencias de nucleótidos de la figura 3. Además, hacia el extremo C-terminal de la secuencia de aminoácidos existe una estructura de prodominio (CARD) la cual es común a un número de proteínas intracelulares que intervienen en las rutas de señalización apoptóticas, por ejemplo, C-IAP1 , RAIDD (véase Duan y Dixit, 1997), y otras caspasas tales como ICE e ICH-1. En la secuencia de aminoácidos de B1 mostrada en la figura 3A, se muestra el dominio de cinasa N-terminal (región incluida en un cuadro) y la CARD C-terminal (región subrayada). Entre estos dos dominios está el dominio intermediario de la proteína B1. El dominio de cinasa de B1 descrito anteriormente tiene alta homología (o similitud) con las cinasas de tipo RAF conocidas y el dominio de cinasa RIP. Recientemente también se ha designado el prodominio de B1 mencionado anteriormente como CARD para "dominio de reclutamiento de caspasas" (véase Hofmann y otros, 1997), y para funcionar como una región a través de la cual varias proteínas interactúan intracelularmente durante el proceso de señalización apoptótico. Por ejemplo, el FNT-R p55 que no tienen un prodominio (o CARD) interactúa con otra proteína ¡ntracelular TRADD (una proteína abastadora) mediante la región de dominio de muerte presente en estas proteínas. A su vea, TRADD puede ¡nteractúar con RIP y con RAIDD (adicionales a dichas proteínas adaptadoras, véase también Hofmann y otros, 1997; Duan y Dixit, 1997; Wallach, 1997), todas las cuales tienen dominios de muerte, de modo que, mediante la región de dominio de muerte del FNT-R p55 se pueden combinar directa o indirectamente con RAIDD. RAIDD tienen un prodominio (o CARD) el cual puede interactúar o unirse con una o más caspasas, por ejemplo ICH-1 (caspasa-2), y posiblemente también otras, y así puede unir al FNT-R p55 a dichas caspasas y producir apoptósis mediante la acción de las caspasas. Del mismo modo, el FNT-R p75 puede ¡nteractuar con las proteínas TRAF2 y TRAF1 mediante motivos comunes, y las proteínas TRAF pueden ¡nteractuar con c-IAPI y C-IAP2. En forma similar (véase también Malinin y otros, 1997, WO 97/37016), en virtud de la capacidad del FAS-R (Fas/APO1) para interactuar con MORTI (FADD) que, a su vez, interactúa con TRADD (todos mediante sus dominios de muerte comunes), y la capacidad de TRADD para interactuar con TRAF2, MORTI se puede unir así a C-IAP1 , c-IAP2 (ruta TRAF2) y de esta manera a ICE, Mchó y otras caspasas, o se pueden unir iCH-1 , FLICE/MACH u otras caspasas (mediante las interacciones de TRADD-RIP-RAIDO, descritas anteriormente). Se debe observar también que el FNT-R p55 también se puede unir a ICE, Mchó y otras de dichas caspasas mediante las interacciones TRADD-TRAF2-clAP1 , C-IAP2-ICE, Mchó, esto en virtud de la capacidad del FNT-R p55 para interactuar también con TRADD. Además, se sabe que TRAF2 interviene también en una ruta intracelular (o más de una ruta) que promueve la supervivencia celular mediante la inducción de la activación de NF-kB. En estas rutas, NIK parece intervenir directamente en la fosforilación de l-kB, lo cual conduce a la disociación de l-kB de NF-kB, y así la activación de NF-kB, con lo cual NF-kB, puede entrar al núcleo e iniciar la trasnfección de varios genes, cuya expresión está ligada a la supervivencia celular (véase también la sección de "antecedentes de la invención" descrita anteriormente). De esta manera, TRAF2 interviene en las rutas de muerte celular y supervivencia celular, y dependiendo de que proteínas interactúan predominantemente con TRAF2 en un periodo dado en respuesta a varios estímulos externos (por ejemplo, la unión de ligandos a varios receptores) la célula puede sufrir inducción de muerte celular o supervivencia celular. Claramente, existe un balance fino entre las diferentes proteínas intracelulares de señalización que puede ser desviado hacia cualquiera de las rutas opuestas de supervivencia celular o muerte celular, y TRAF2 parece ser una de las proteínas claves que mantiene este balance y que es responsable de cualquier cambio en el balance en una dirección u otra. En la figura 1 se muestra esquemáticamente la estructura de la proteína TRAF2 con sus diferentes dominios, y en la figura 2 se muestran esquemáticamente algunas de las interacciones posibles entre varios receptores celulares y proteínas intracelulares de señalización, y su participación en rutas de muerte celular o supervivencia celular (activación de NF-kB). Por consiguiente, surge la posibilidad de que la nueva proteína B1 de la presente invención pueda tener una función moduladora importante en las rutas de inflamación, muerte celular y supervivencia celular. B1 tiene un prodominio (o dominio CARD) el cual puede interactuar posiblemente incluso indirectamente con el prodominio de C-IAP1 , C-IAP2, RAIDD y varias caspasas (ICE, ICH-1 , etc) y de esta manera puede interactuar posiblemente incluso indirectamente con TRAF2 y las diferentes proteínas que interactúan directa o indirectamente con TRAF2, incluyendo RIP, TRADD, p75 TNF-R, FNT p55-R, MORT-1 y FAS-R. B1 tiene también un dominio de cinasa, y como tal posiblemente puede intervenir directa o indirectamente en la ruta de MAP cinasa, de la cual NIK parece ser un miembro, y de esta manera puede intervenir también en la ruta de activación de NF-kB. Además, B1 en virtud de su homología con C-IAP1 , puede ser posiblemente un modulador de la actividad de C-IAP1 (y C-IAP2) modulando la actividad biológica de c-IAP'1 , o modulando la unión de C-IAP1 con otras proteínas. A este respecto (véase también el ejemplo 2 siguiente), B1 puede actuar posiblemente para incrementar la apoptosis interactuando incluso indirectamente con proteínas c-IAP (c-IAPI , C-IAP2), e interrumpiendo o de otro modo disminuyendo su capacidad para reclutar caspasas y restringir su actividad proteolítica, con el resultado de que más caspasas quedaran libres para actuar proteolíticamente. Otra posibilidad es que B1 mediante su capacidad posible mencionada anteriormente de ser capaz de ¡nteractuar con varios mediadores de muerte celular, directa o indirectamente, incluyendo TRAF-1 y TRAF2, RAIDD, RIP, TRADD, FNT-R p55, p75-TNF-R, MORT-1 y FAS-R; y con varias caspasas, puede funcionar posiblemente para unir estas proteínas a las caspasas y posiblemente funcionar de esta manera como un agente intermediario en las rutas de muerte celular, a las cuales estas proteínas pertenecen. Como tal, B1 puede ser un mediador importante de apoptosis. Una posibilidad más es que mediante la interacción posible (incluso indirecta) de B1 con proteínas c-IAP descritas anteriormente, B1 puede evitar posiblemente la unión de c-IAP o la interacción con TRAF2 y de esta manera puede bloquear posiblemente la actividad de TRAF2 con respecto a la ruta de MAP cinasa, por ejemplo, las interacciones de TRAF2-C-IAP pueden ser importantes para las interacciones de TRAF2 con NIK, y si esto se previene mediante la interacción de B1 con c-IAP, entonces la activación de NF-kB, mediada por TRAF2 puede ser bloqueada, dando como resultado menos incremento de las supervivencia celular y posiblemente un incremento de la muerte celular. Una posibilidad más es que B1 pueda actuar en forma más directa modulando la actividad de las varias caspasas. De esta manera, mediante interacciones, directas o indirectas, entre los prodominios (dominios CARD) de B1 y varias caspasas, B1 puede conducir posiblemente a un incremento en la actividad de estas encimas e incrementar de esta manera la citotoxicidad de las mismas. De esta manera, B1 puede ser un incrementador directo de apoptosis reclutando o de otra manera activando caspasas (véase también el ejemplo 2 siguiente). Una posibilidad adicional es que una pueda actuar para modular rutas intracelulares de señalización mediando procesos de muerte celular o supervivencia celular mediante unión a, o interactuando, otras proteínas hasta ahora conocidas. El interesante observar (véase anteriormente) que B1 tiene un dominio de cinasa similar a la RIP cinasa. RIP es una proteína central que interviene en el balance de entre la rutas de muerte celular y supervivencia celular en virtud a su capacidad de unirse entre los mediadores de muerte celular (por ejemplo, FNT p55-R, FAS-R, MORT-1 , TRADD) y TRAF-2 y de esta manera a la activación de NF-?B y supervivencia celular (véase Fig. 2). La actividad de RIP-cinasa puede ser también un factor en este balance fino, dependiendo de cuales son los substratos para esta cinasa, por ejemplo, que proteínas son fosforiladas por RIP, y si esto afecta su actividad para incrementar la actividad apoptopica, disminuir la actividad apoptopica, incrementar la activación de NF-«B o disminuir la activación de NF-KB. Por analogía, B1 puede desempeñar también posiblemente dicha función central en la cual la actividad de cinasa de la misma puede ser importante, dependiendo que proteínas son un substrato para dicha actividad de cinasa.

EJEMPLO 2 Análisis de la actividad biológica de proteína B1 (i) Prueba de unión preliminar para determinar que proteínas conocidas pueden unirse a B1 Usando los métodos del documento WO 97/37016 para preparar y expresar construcciones de ADN y la prueba de unión de dos hídridos de levadura, se utilizó una construcción de B1 de la cual se removió su dominio de cinasa, es decir, B1 truncada teniendo únicamente la región intermedia y la región C-terminal CARD para poner a prueba su capacidad para unirse a varias proteínas conocidas que intervienen en las rutas intracelulares de señalización (rutas de muerte celular y supervivencia celular). Los resultados preliminares (no mostrados) parecen indicar que esta B1 truncada se une a BCL2. (ii) Análisis de citotoxicidad celular para determinar el efecto de B1 sobre las rutas de muerte celular o supervivencias celular Usando los métodos del documento WO 97/37016 para preparar las construcciones de ADN y transfectando/transformando células con las mismas terminando el efecto sobre la muerte celular o supervivencia celular por los productos expresados de estas construcciones, se uso una construcción de ADN que codifica para la proteína B1 de longitud total para transfectar celular en cultivo. Además, en otra serie de experimentos, se uso la construcción que codifica para B1 o transfectar células con otras construcciones que codifican para FAS-R, FNT p55-R y RIP. Los resultados obtenidos de estas trasfecciones (no mostrados), indican que la proteína B1 expresada no causa por si misma muerte celular. Sin embargo, cuando B1 es expresado junto con FAS-R, FNT p55-F o RIP, se incrementa el nivel de muerte celular inducida por estos inductores conocidos de muerte celular. Estos resultados considerados junto con los resultados del (i) anterior, de que B1 se puede unir a BCL2, plantea la posibilidad de que B1 puede funcionar como un inhibidor de la actividad BCL2, es decir, que B1 puede prevenir la actividad de BCL2 protegiendo de las células apoptosis (véase sección "antecedentes de la invención anterior"), y como tal B1 aparentemente es capaz de incrementar las rutas de muerte celular inducidas por FAS-R, FNT p55-F o RIP, y posiblemente otros inductores de muerte celular (descritos también en dicha sección. A este respecto B1 puede actuar posiblemente en forma análogo a la proteína BAD un miembro de la familia BCL2, la cual se une BCL2 y BCL-XL y de esta manera da como resultado niveles incrementados de BAX y BAK los cuales se sabe intervienen directamente en la inducción de muerte celular. Otra posibilidad puede ser que B1 , en virtud de su dominio de cinasa, pueda fosforilar a BCL2 en los sitios de fosforilación presentes en BCL2, y de esta manera pueda afectar la actividad de la misma para proteger a las células apoptosis, dando como resultado, finalmente, el efecto observado, que B1 tiene para incrementar la muerte celular inducida. Además, también es posible que B1 pueda, además, independiente de su interacción con BCL2, efectuar la inducción de la activación de NF-«B, y esto mediante la actividad de cinasa de B1 que actúa en la ruta que conduce a la activación de NF-«B, por ejemplo, B1 puede interactuar posiblemente con NIK u otras cinasas en la ruta en donde NIK es un miembro, o puede actuar sobre otras proteínas adaptadoras relacionadas a la misma, por ejemplo, TRAF2, en forma tal para dar como resultado activación de resultado reducida, y finalmente supervivencia celular reducida y muerte celular incrementada. Por consiguiente, en resumen, parece ser que B1 desempeña una función en la modulación de las rutas intracelulares de señalización que conducen a procesos de inflamación, muerte celular o supervivencia celular. De esta manera, se puede considerar a B1 como un 'modulador intracelulares de señalización', ya que tiene claramente la capacidad para influir sobre las guías de inflamación, muerte celular y supervivencia celular en varias formas directas (o reclutamiento de varias proteínas y activación o inhibición de las mismas o mediante actividad de cinasas) o indirectas (mediante interacción con varios otros intermediarios, por ejemplo, BCL2, y posiblemente también c-IAP y de esta manera a TRAF2, etc; o RAIDD y así a RIP, TRADD, etc).

EJEMPLO 3 Análisis adicional de la actividad biológica de B1 Se llevaron a cabo pruebas de actividad de NF-«B, prueba de muerte celular, análisis Northern y actividad de JNK con las siguientes construcciones de B1 y construcciones mutantes de B1 (véase fig. 6). B1 (véase ejemplo 1 ) Mutante de B1 , un mutante de B1 el cual la lisina la en la posición 47 fue remplazada con alanina. ?CARD, B1 que carece del dominio CARD creado mediante PCR, y clonación en vectores de expresión. B1 que carece del dominio, pero más corto en su extremo 3' que ?CARD, creado mediante el uso de sitio de restricción y clonación en vectores de expresión.

?Bam, similar a ?Xba, y creado de la misma manera, usando la enzima de restricción Bam. ?Nde, que contiene parte del dominio de cinasa y el dominio de CARD, creado mediante PCR y clonación en un vector de expresión, y ?K, creado mediante PCR usando los siguientes iniciadores: 1.- 5'-CAGAATTCCAGAGTGTTTCAAGTGCCATTC; 2.- 5'-AACTCGAGACTTACATGCTTTTATTTTGAA. El fragmento de PCR fue clonado en vectores de expresión, y verificado mediante secuenciación. Las mediciones de activación NF-?B se llevaron a cabo mediante prueba del gen reportero como se describe en el documento WO 97/37016. en resumen, las células fueron transfectadas con el plasmido con el gen LTR-lucíferasa del VIH (1 µg) y los vectores de expresión de B1 y vectores de expresión mutantes B1 (3 µg). La cantidad de ADN transfectados se mantuvo constante mediante la adición de un vector "vacío". 24 horas después de la transfección, las células fueron lavadas con PBS y usadas. La prueba de luciferasa se llevó a cabo como se describe en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y otros. Los resultados se pueden observar en la figura 6. La prueba de muerte celular se llevó a cabo desarrollando células 293-T en medio esencial mínimo Eagle modificado de Dulbecco complementado con suero fetal de ternera a 10%, aminoácidos no esenciales, 100 U/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina. Las células 293-T (5 x 105 célula en placas de 6 cm) fueron transfectadas transitoriamente usando el método de precipitación con fosfato de calcio con las moléculas de ADNc de las diferentes construcciones junto con el vector de expresión de ß-galactosidasa. En los experimentos, cuyos resultados se muestran en la figura 6, cada placa fue transfectada con 1 µg con una construcción de FNT p55-R, RIP o TRADD, 1 µg de la construcción de B1 o construcción mutante de B1 respectiva (o, como control, un vector vacío), y un 1 µg de pSV-ß-gal (Promega). Se evalúo el nivel de muerte celular al final del período de incubación mediante determinación de la expresión de ß-galactosidasa, como es descrito por Boldin y otros., 1996). El análisis Northern se llevó a cabo mediante métodos convencionales, véase, por ejemplo, Boldin y otros., 1995, y revelo que B1 esta presente en muchos tejidos humanos (fig 4.). La activación de JNK se llevó a cabo transfectando transitoriamente células 293-T (5 x 1010 células en placas de 6 cm), usando el método de precipitación con fosfato de calcio con 1.5 µg de construcción pSR-HA-JNK1 (un vector de expresión JNK-1 marcado con epitope HA) y 4 µg de cada uno de vector de expresión de construcción de B1 y vector de expresión de construcción de mutante de B1. Después de 24 horas, las células fueron usadas en regular de pH parálisis (Hepes a 20 mM, pH 7.6, EGTA a 10 mM, ß-glicerofosfato a 40 mM, MgCI2 a 2.5 mM, DTT, a 1 mM y NP-40 a 1 %), y la proteína Ha-JNKI fue inmuno precipitada con anticuerpo anti-HA (véase, por ejemplo, Rothe y otros, 1995b). La prueba de cinasa se llevó a cabo en 30 µl de regulador de pH paracinasa (Hepes a 20 mM, BH 7.6, ß-glícerofosfato a 40 mM, MgCI2 a 2.0 mM, DTT a 2 mM, 3 nmoles de ATP y 3 µCi de ?-P32 -ATP a 30°C durante 20 minutos. Se uso como substrato la proteína GST-Jun producida por bacterias (aproximadamente µg) la reacción se detuvo mediante la adición de 2 veces regulador de carga de SDS, se hirvió durante 3 minutos y se analizó mediante el SDS-PAGE. Los resultados se muestran en la figura 7. Los resultados de la figura 6 muestran que B1 puede inducir directamente en la activación de NF-KB. Sin embargo, viendo que B1 puede inducir también a NF-«B, esta activación parece ser independiente de su dominio de cinasa, y se piensa que puede estar relacionada al dominio de CARD, con o sin contribución de todo el dominio intermediario de B1 , o parte del mismo. Además, el análisis de citotoxicidad celular muestra que únicamente no hubo (véase ejemplo 2 (ii)), si no también el mutante de B1 , cuando se expresan junto con FNT-R p55, RIP o TRADD o potencia el nivel de muerte celular. ?CARD, ?Nde y ?K hacen esto en menor grado, mientras que las otras construcciones no lo hacen. Esto parece indicar que por lo menos el dominio CARD interviene en la potenciación de muerte celular, posiblemente junto con el dominio intermediario. Los resultados de la activación de JNK parecen indicar también que por lo menos el dominio CARD interviene en esta activación, de nuevo posiblemente junto con el dominio intermediario.

Además de lo anterior, las pruebas llevadas a cabo han demostrado que B1 sé autofosforila. Esta es una prueba que B1 es además una cinasa. Además, se ha conversado que B1 tiene una homología con RIP. El análisis en computadora indica una identidad de 37% de las dos proteínas a nivel de aminoácidos, y una homología de 47%. Se considera ahora ampliamente que RIP es principalmente un modulador de NF-kB, y los resultados anteriores indican que B1 actúan en forma similar.

EJEMPLO 4 Características de unión Las características de unión de B1 , y los mutantes de la misma se muestran en la figura VI: CUADRO VI A partir de los resultados mostrados en el cuadro anterior, parece ser que cuando B1 funciona para inducir la activación NF-kB, puede hacerlo independientemente de su unión a otras proteínas que sé sable intervienen en la activación de NF-kB, tales como, por ejemplo, IRAK, TRAF2, NIK, TRAF6 y RIP. De esta manera, B1 puede inducir directa o indirectamente ia activación de NF-kB mediante su interacción con algunas otras proteínas que forman parte de esta ruta de activación. En lo que se refiere a las actividades de incremento de la muerte celular observada para B1 , parece ser también a partir del cuadro anterior, que B1 lo hace sin interactuar directamente con varios mediadores de muerte celular tales como, por ejemplo, FNT p55-R, Fas-R, MORT1 , TRADD, RIP, ICE, ICH-1 , y similares. Por lo tanto B1 puede funcionar también para incrementar la muerte celular al interactor directamente con estos diferentes mediadores/moduladores de muerte celular, o mediante otras proteínas.

En vista de la participación de B1's en la activación de NF-kB, así como también en el incremento de la muerte celular, B1 puede ser una proteína central que interviene en el balance fino entre las rutas intracelulares que conducen a muerte celular o supervivencia celular. A este respecto, B1 , dependiendo de con que proteína interactua, puede ser capaz de cambiar el balance entre muerte celular y supervivencia celular. Célula 293 de riñon embrionario humano (5x106, 2.5x106/por placa de 10 cm) fueron transfectada transitoriamente mediante el procedimiento de fosfato de calcio con 10 µg de plásmido que codifica para proteína B1 con marcada HA (HA-B1 ) y 10 µg de un plásmido que codifica para proteína B1 marcada con Flag (FL-B1 ) o uno que codifica para proteína Flag marcada con C-IAP-1 (FL-IAP1 ), o uno que codifica para Flag marcada con TRAF1 (FL-TRAF1 ), o uno que codifica para Flag marcada con TRAF2 (FL-TRAF2) o con 10 µg de la combinación (a una relación de 1 :1 ) de flag marcada con TRAF1 y TRAF2 /FL-TR1 +TR2), o con 10 µm de la combinación (1 :1 :1 ) de flag marcada con TRAF1 , TRAF2 no marcada y c-IAP-1 (FL-TR1 +TR2+IAP1 ). Siete horas después de la transfección las células fueron lavadas, y 18 horas después, las células fueron usadas en un regular de pH que contenía hepes a 50mM, pH 7.5, NaCI a 250mM, NP-40 a 02.%, EDTA a 5mM, floruro de fenilmetilsulfonilo a 1mM, 2.0 µg/ml aprotinina y 20 µg/ml de leupeptina (regulador de pH para lisis). La inmunoprecipitación se llevó a cabo mediante incubación (2h, 4°C) de 1 ml de lisado con anticuerpo epítope anti-FLAG (5 µg/alicuota), y con esfera de proteína G-agarosa (30 µl/alicuota). Los inmunoprecipitados fueron lavados tres veces con regulador de pH para lisis, y una vez con PBS, fraccionados mediante SDS-PAGE a 10% y transferidos a una membrana de nitrocelulosa (Schleicher & Schuell, Dassel, Alemania). Se llevó análisis western blot con anticuerpos monoclonales para epítope ati-HA aplicados a una dilución de 1 :1000, y el equipo ECL (Amersham, Buckinghamshire, Inglaterra). Es evidente a partir de la figura 8 que B1 es capaz de autoasociarse, así como también de ¡nteractuan con TRAF1. El nivel de interacción parece ser aproximadamente igual a su autoasociación. No se observó interacción directa con TRAF-2 o 1 AP1.

EJEMPLO 5 B1 se une a la subunidad E de V-ATPasa Pruebas de selección de dos híbridos con el dominio CARD de B1 como cebo dieron como resultado la clonación de la subunidad E de V-ATPasa (revisión hecha por Nelson y otros, Experientia 52 (1996) pp. 1 101-1110). La subunidad E de V-ATPasa es marcada en forma fluorescente e incubada con una muestra del dominio CARD de B1 en presencia de varias muestras de una genoteca de moléculas o péptidos orgánicos. Después de la incubación, el motivo B1-CARD es inmunoprecipitado con anticuerpos específicos, y se mide la cantidad de fluorescencia asociada con este precipitado. Las moléculas que se encuentra interfiere con la precipitación de la proteína E marcada en forma fluorescente se examinan adicionalmente como compuesto principal potencial como fármacos que afectan la viabilidad celular y/ crecimiento celular y/o inflamación intracelular mediante la función de la subunidad de E de ATPasa, Habiendo ahora descrito completamente está invención, será apreciado por los expertos en la técnica que la misma se puede llevar a cabo dentro de una amplia escala de parámetros de equivalentes, concentraciones y condiciones sin apartarse del espíritu y el alcance de la invención, y sin experimentación indebida. Aunque está invención sea descrito en relación con modalidades especificas de la misma, se entenderá que es capaz de sufrir otras modificaciones. Se pretende que esta solicitud abarque cualquier variación, uso, o adaptaciones de las invenciones consecutivos, en general, a los principios de la invención he incluyendo dichas desviaciones de la presente descripción cuando forme en parte de la práctica conocido o acostumbrado dentro de la técnica a la cual la invención pertenece, y conforme se puedan aplicar a las características esenciales descritas anteriormente según se describe en el alcance de las reivindicaciones anexas. Todas las referencias citadas en la presente, incluyendo artículos o resúmenes de revistas, publicadas o que correspondan a solicitudes de patente de E.U.A. o extranjeras, o cualquier otra referencia, se incorporan totalmente en la presente como referencia, incluyendo todos los datos, cuadros, figuras y textos presentados en las referencias citadas. Adicionalmente, los contenidos completos de la referencia citadas dentro de las referencias citadas en la presente se incorporan también totalmente en la presente como referencia. La referencia a pasos de métodos conocidos, pasos de métodos convencionales, métodos conocidos o métodos convencionales, en ninguna manera es un reconocimiento de cualquier aspecto, descripción o modalidad de la presente invención es descrito, enseñado o sugerido en la técnica relevante. La descripción anterior de las modalidades específicas revelara así totalmente la naturaleza general de la invención que otros pueden, aplicando el conocimiento dentro de la técnica ( incluyendo los contenidos de las referencias citadas en la presente), fácilmente modificar y/o adaptar varias aplicaciones para dichas modalidades específicas, sin experimentación indebida, sin apartarse del concepto general de la presente invención. Por lo tanto, se pretende que dichas adaptaciones y modificaciones estén dentro del significado y la escala de equivalentes de las modalidades descritas, con base en las enseñanzas y guía presentadas en la presente. Se entenderá que la fraseología o terminología de la presente es únicamente con el propósito de descripción y no de limitación, de modo que la terminología o fraseología de la presente especificación deberá ser interpretada por el experto en la técnica a la luz de las enseñanzas y guía presentadas en la presente, en combinación con el conocimiento del experto en la técnica.

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LISTADO DE SECUENCIAS (1 ) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: YEDA RESEARCH AND DEVELOPMENT CO. LTD.

(B) CALLE: WEIZMANN INSTITUTE OF SCIENCE, P.O.B. 95 (C) CIUDAD: REHOVOT (E) PAÍS: ISRAEL (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 76100 (G) TELEFONO: 972-8-9344093 (H) TELEFAX: 972-8-9470739 (A) NOMBRE: WALLACH, DAVID (B) CALLE: 24 BOROCHOV STREET (C) CIUDAD: REHOVOT (E) PAÍS: ISRAEL (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 76406 (A) NOMBRE: BOLDIN, MARK (B) CALLE: BEIT CLORE, WEIZMANN INSTITUTE OF SCIENCE (C) CIUDAD: REHOVOT (E) PAÍS: ISRAEL (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 76100 (A) NOMBRE: MALININ, NIKOLAI (B) CALLE: BEIT CLORE, WEIZMANN INSTITUTE OF SCIENCE (C) CIUDAD: REHOVOT (E) PAÍS: ISRAEL (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 76100 (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: MODULADORES DE LAS RUTAS INTRACELULARES DE INFLAMACIÓN, MUERTE CELULAR Y SOBREVIVENCIA CELULAR (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 2 (iv) FORMA DE LECTURA EN COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Floppy disk (B) COMPUTADORA: IBM PC compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.30 (EPO) (vi) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR: (A) NUMERO DE SOLICITUD: IL 121011 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 05-JUN-1997 (vi) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR: (A) NUMERO DE SOLICITUD: IL 121 199 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 30-JUN-1997 (vi) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR: (A) NUMERO DE SOLICITUD: IL 121746 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 11-SEP-1997 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 540 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 1 : Met Asn Gly Glu Ala lie Cys Ser Ala Leu Pro Thr lie Pro Tyr His 1 5 10 15 Lys Leu Ala Asp Leu Arg Tyr Leu Ser Arg Gly Ala Ser Gly Thr Val 20 25 30 Ser Ser Ala Arg His Ala Asp Trp Arg Val Gln Val Ala Val Lys His 35 40 45 Leu His líe His Thr Pro Leu Leu Asp Ser Glu Arg Lys Asp Val Leu 50 55 60 Arg Glu Ala Glu lie Leu His Lys Ala Arg Phe Ser Tyr Me Phe Pro 65 70 75 80 He Leu Gly He Cys Asn Glu Pro Glu Phe Leu Gly lie Val Thr Glu 85 90 95 Tyr Met Pro Asn Gly Ser Leu Asn Glu Leu Leu His Arg Lys Thr Glu 100 105 110 Tyr Pro Asp Val Ala Trp Pro Leu Arg Phe Arg lie Leu His Glu He 115 120 125 Ala Leu Gly Val Asn Tyr Leu His Asn Met Thr Pro Pro Leu Leu His 130 135 140 His Asp Leu Lys Thr Gln Asn He Leu Leu Asp Asn Glu Phe His Val 145 150 155 160 Lys He Ala Asp Phe Gly Leu Ser Lys Trp Arg Met Met Ser Leu Ser 165 170 175 Gln Ser Arg Ser Ser Lys Ser Ala Pro Glu Gly Gly Thr He He Tyr 180 185 190 Met Pro Pro Glu Asn Tyr Glu Pro Gly Gln Lys Ser Arg Ala Ser He 195 200 205 Lys His Asp lie Tyr Ser Tyr Ala Val lie Thr Trp Glu Val Leu Ser 210 215 220 Arg Lys Gln Pro Phe Glu Asp Val Thr Asn Pro Leu GIn He Met Tyr 225 230 235 240 Ser Val Ser Gln Gly His Arg Pro Val He Asn Glu Glu Ser Leu Pro 245 250 255 Tyr Asp lie Pro His Arg Ala Arg Met He Ser Leu lie Glu Ser Gly 260 265 270 Trp Ala Gln Asn Pro Asp Glu Arg Pro Ser Phe Leu Lys Cys Leu lie 275 280 285 Glu Leu Glu Pro Val Leu Arg Thr Phe Glu Glu He Thr Phe Leu Glu 290 295 300 Ala Val lie Gln Leu Lys Lys Thr Lys Leu Gln Ser Val Ser Ser Ala 305 310 315 320 He His Leu Cys Asp Lys Lys Lys Met Glu Leu Ser Leu Asn lie Pro 325 330 335 Val Asn His Gly Pro Gln Glu Glu Ser Cys Gly Ser Ser Gln Leu His 340 345 350 Glu Asn Ser Gly Ser Pro Glu Thr Ser Arg Ser Leu Pro Ala Pro Gln 355 360 365 Asp Asn Asp Phe Leu Ser Arg Lys Ala Gln Asp Cys Tyr Phe Met Lys 370 375 380 Leu His His Cys Pro Gly Asn His Ser Trp Asp Ser Thr He Ser Gly 385 390 395 400 Ser Gln Arg Ala Ala Phe Cys Asp His Lys Thr Thr Pro Cys Ser Ser 405 410 415 Ala He He Asn Pro Leu Ser Thr Ala Gly Asn Ser Glu Arg Leu Gln 420 425 430 Pro Giy lie Ala Gln Gln Trp He Gln Ser Lys Arg Glu Asp lie Val 435 440 445 Asn Gln Met Thr Glu Ala Cys Leu Asn Gln Ser Leu Asp Ala Leu Leu 450 455 460 Ser Arg Asp Leu He Met Lys Glu Asp Tyr Glu Leu Val Ser Thr Lys 465 470 475 480 Pro Thr Arg Thr Ser Lys Val Arg Gln Leu Leu Asp Thr Thr Asp He 485 490 495 Gln Gly Glu Glu Phe Ala Lys Val lie Val Gln Lys Leu Lys Asp Asn 500 505 510 Lys Gln Met Gly Leu Gln Pro Tyr Pro Glu He Leu Val Val Ser Arg 515 520 525 Ser Pro Ser Leu Asn Leu Leu Gln Asn Lys Ser Met 530 535 540 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 2098 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 2: GGCCATTATG GATGGATGGG CGGCGCTACG GCGTTGGCAC CAGTCTCTAG AAAAGAAGTC 60 AGCTCTGGTT CGGAGAAGCA GCGGCTGGCG TGGGCCATCC GGGGAATGGG CGCCCTCGTG 120 ACCTAGTGTT GCGGGGCAAA AAGGGTCTTG CCGGCCTCGC TCGTGCAGGG GCGTATCTGG 180 GCGCCTGAGC GCGGCGTGGG AGCCTTGGGA GCCGCCGCAG CAGGGGGCAC ACCCGGAACC 240 GGCCTGAGCG CCCGGGACCA TGAACGGGGA GGCCATCTGC AGCGCCCTGC CCACCATTCC 300 CTACCACAAA CTCGCCGACC TGCGCTACCT GAGCCGCGGC GCCTCTGGCA CTGTGTCGTC 360 CGCCCGCCAC GCAGACTGGC GCGTCCAGGT GGCCGTGAAG CACCTGCACA TCCACACTCC 420 GCTGCTCGAC AGTGAAAGAA AGGATGTTTT AAGAGAAGCT GAAATTTTAC ACAAAGCTAG 480 ATTTAGTTAC ATTTTTCCAA TTTTGGGAAT TTGCAATGAG CCTGAATTTT TGGGAATAGT 540 TACTGAATAC ATGCCAAATG GATCATTAAA TGAACTCCTA CATAGGAAAA CTGAATATCC 600 TGATGTTGCT TGGCCATTGA GATTTCGCAT CCTGCATGAA ATTGCCCTTG GTGTAAATTA 660 CCTGCACAAT ATGACTCCTC CTTTACTTCA TCATGACTTG AAGACTCAGA ATATCTTATT 720 GGACAATGAA TTTCATGTTA AGATTGCAGA TTTTGGTTTA TCAAAGTGGC GCATGATGTC 780 CCTCTCACAG TCACGAAGTA GCAAATCTGC ACCAGAAGGA GGGACAATTA TTTATATGCC 840 ACCTGAAAAC TATGAACCTG GACAAAAATC AAGGGCCAGT ATCAAGCACG ATATATATAG 900 CTATGCAGTT ATCACATGGG AAGTGTTATC CAGAAAACAG CCTTTTGAAG ATGTCACCAA 960 TCCTTTGCAG ATAATGTATA GTGTGTCACA AGGACATCGA CCTGTTATTA ATGAAGAAAG 1020 TTTGCCATAT GATATACCTC ACCGAGCACG TATGATCTCT CTAATAGAAA GTGGATGGGC 1080 ACAAAATCCA GATGAAAGAC CATCTTTCTT AAAATGTTTA ATAGAACTTG AACCAGTTTT 1140 GAGAACATTT GAAGAGATAA CTTTTCTTGA AGCTGTTATT CAGCTAAAGA AAACAAAGTT 1200 ACAGAGTGTT TCAAGTGCCA TTCACCTATG TGACAAGAAG AAAATGGAAT TATCTCTGAA 1260 CATACCTGTA AATCATGGTC CACAAGAGGA ATCATGTGGA TCCTCTCAGC TCCATGAAAA 1320 TAGTGGTTCT CCTGAAACTT CAAGGTCCCT GCCAGCTCCT CAAGACAATG ATTTTTTATC 1380 TAGAAAAGCT CAAGACTGTT ATTTTATGAA GCTGCATCAC TGTCCTGGAA ATCACAGTTG 1440 GGATAGCACC ATTTCTGGAT CTCAAAGGGC TGCATTCTGT GATCACAAGA CCACTCCATG 1500 CTCTTCAGCA ATAATAAATC CACTCTCAAC TGCAGGAAAC TCAGAACGTC TGCAGCCTGG 1560 TATAGCCCAG CAGTGGATCC AGAGCAAAAG GGAAGACATT GTGAACCAAA TGACAGAAGC 1620 CTGCCTTAAC CAGTCGCTAG ATGCCCTTCT GTCCAGGGAC TTGATCATGA AAGAGGACTA 1680 TGAACTTGTT AGTACCAAGC CTACAAGGAC CTCAAAAGTC AGACAATTAC TAGACACTAC 1740 TGACATCCAA GGAGAAGAAT TTGCCAAAGT TATAGTACAA AAATTGAAAG ATAACAAACA 1800 AATGGGTCTT CAGCCTTACC CGGAAATACT TGTGGTTTCT AGATCACCAT CTTTAAATTT 1860 ACTTCAAAAT AAAAGCATGT AAGTGACTGT TTTTCAAGAA GAAATGTGTT TCATAAAAGG 1920 ATATTTATAT CTCTGTTGCT TTGACTTTTT TTATATAAAA TCCGTGAGTA TTAAAGCTTW 1980 AWWRAARGKT CTTTSRKTAA ATATTAGTCT CCCTCCATGA CACTGCAGTA TTTTTTTTAA 2040 TTAATACAAG TAAAAAGTTG AATTTGAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAA 2098

Claims (39)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una secuencia de ADN que codifica para una proteína B1 , isoformas, fragmentos o análogos de la misma, dicha proteína B1 , isoformas, fragmentos o análogos de la misma siendo capaces de interactuar directa o indirectamente con mediadores o moduladores intracelulares de rutas de inflamación, muerte celular o supervivencia celular, dicha proteína B1 , isoformas, fragmentos o análogos siendo moduladores intracelulares de dichas rutas de inflamación intracelular, muerte celular y/o supervivencia celular.

2.- La secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 1 , ' caracterizada además porque se selecciona del grupo que consiste de: (a) una secuencia de ADN derivada de la región de codificación de una proteína B1 nativa; (b) un fragmento de una secuencia de (a) que codifica para una proteína biológicamente activa capaz de modular las rutas de inflamación, muerte celular o supervivencia celular; (c) una secuencia de ADN capaz de hibridar con una secuencia de (a) o (b) bajo condiciones moderadamente astringentes, y la cual codifica para una proteína B1 biológicamente activa, análogo o fragmento de la misma capaz de modular las rutas de inflamación intracelular, muerte celular y/o supervivencia celular; (d) una secuencia de ADN que es degenerada como resultado del código genético para las secuencias de ADN definidas en (a)-(c), y la cual codifica para una proteína B1 biológicamente activa, análogo o fragmento capaz de modular las rutas de inflamación intracelular, muerte celular o supervivencia celular.

3.- La secuencia de ADN de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada además porque comprende por lo menos parte de la secuencia mostrada en la figura 3, y codifica para por lo menos una proteína B1 activa, isoforma, análogo o fragmento.

4.- La secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque codifica para una proteína B1 , isoforma, análogo o fragmento que tiene por lo menos parte de la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 3.

5.- Un vector, caracterizado porque comprende una secuencia de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6.- El vector de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque es capaz de ser expresado en una célula hospedera eucariótica.

7.- El vector de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque es capaz de ser expresado en una célula hospedera procariótica.

8.- Células hospederas procarióticas o eucarióticas transformadas que contengan un vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7.

9.- Una proteína B1 , isoformas, fragmentos, análogos funcionales y derivados de la misma, codificados por una secuencia de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, dicha proteína, isoformas, fragmentos, análogos y derivados de la misma siendo capaces de modular directa o indirectamente las rutas de inflamación intracelular, muerte celular o supervivencia celular, mediante asociación con otros moduladores o mediadores ¡ntracelulares de estas rutas.

10.- La proteína B1 , ¡soformas, fragmentos, análogos y derivados de la misma de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque dicha proteína, isoformas, análogos, fragmentos y derivados tienen por lo menos parte de la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 3.

11.- Un método para producir una proteína B1 , isoforma, fragmento, análogo o derivado de la misma de conformidad con las reivindicaciones 9 ó 10, caracterizado porque comprende desarrollar una célula hospedera transformada de conformidad con la reivindicación 8 bajo condiciones adecuadas para la expresión de dicha proteína, isoforma, fragmento, análogo o derivado de la misma, efectuando modificación de post traducción, según sea necesario, para obtener dicha proteína, isoforma, fragmento, análogo o derivado de la misma, y aislar dicha proteína expresada, isoforma, fragmento, análogo o derivado de la misma.

12.- Anticuerpos o fragmentos o derivados activos de los mismos, específicos para la proteína B1 , isoforma, análogo, fragmento o derivado de la misma, de conformidad con las reivindicaciones 9 ó 10.

13.- El uso de uno o más de proteína B1 , isoforma, análogo, fragmento o derivado de la misma, en la fabricación de un medicamento en una forma adecuada para la introducción intracelular de los mismos, o el uso de una secuencia de ADN que codifica para dichas una o más de proteína B1 , ¡soforma, análogo, fragmento o derivado de ia misma, en la fabricación de un medicamento para la modulación o mediación, en células, de la actividad de rutas de inflamación, muerte celular o supervivencia celular, o cualquier otra actividad de señalización intracelular modulada o mediada directa o indirectamente por B1 o por otras moléculas a las cuales una proteína B1 , isoforma, análogo, fragmento o derivado de la misma de conformidad con las reivindicaciones 9 ó 10 se une, o de otra manera interactúan, directa o indirectamente, en donde dicho medicamento contiene un vector adecuado que posee dicha secuencia, dicho vector siendo capaz de efectuar la inserción de dicha secuencia en dichas células de tal forma que dicha secuencia sea expresada en dichas células.

14.- El uso de conformidad con la reivindicación 13, en donde una secuencia de ADN que codifica para dicha proteína B1 , isoforma, fragmento, análogo o derivado de la misma está en forma de un vector adecuado que posee dicha secuencia, dicho vector siendo capaz de efectuar la inserción de dicha secuencia en dichas células, de tal forma que dicha secuencia sea expresada en dichas células.

15.- El uso de conformidad con las reivindicaciones 13 ó 14, en donde dichas células son transfectadas con un vector de virus animal recombinante, en donde dicho vector de virus animal recombinante es construido para llevar una secuencia que codifica para una proteína de superficie viral (ligando) que es capaz de unirse a un receptor específico de superficie celular sobre la superficie de dichas células que serán tratadas, y una segunda secuencia que codifica para una proteína seleccionada de dicha proteína B1 , isoformas, análogos, fragmentos y derivados de conformidad con las reivindicaciones 9 ó 10, en la fabricación de un medicamento, en donde cuando dicho vector es expresado en dichas células, es capaz de modular/mediar directa o indirectamente la actividad de las rutas de inflamación, muerte celular o supervivencia celular, o cualquier otra actividad de señalización intracelular modulada/mediada por otras moléculas con las cuales dichas proteína B1 , ¡soformas, análogos, fragmentos y derivados interactúan directa o indirectamente; y en donde dichas células son infectadas con dicho vector.

16.- El uso de anticuerpos o fragmentos o derivados activos de los mismos, de conformidad con la reivindicación 12, en la fabricación de una composición adecuada para modular las rutas de inflamación, muerte celular o supervivencia celular en células, las cuales son moduladas directa o indirectamente por B1 , en donde cuando la proteína B1 o porciones de la misma de dichas células son expuestas sobre la superficie extracelular, dicha composición es formulada para aplicación extracelular, y cuando dichas proteínas B1 son intracelulares, dicha composición se formula para aplicación intracelular.

17.- El uso de una secuencia de oligonucleótidos que codifica para una secuencia antisentido para por lo menos parte de la secuencia de ADN que codifica para una proteína B1 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la fabricación de un medicamento para modular las rutas de inflamación, muerte celular o supervivencia celular u otras rutas en células, las cuales son moduladas directa o indirectamente por B1 , en donde dicha secuencia de oligonucleótidos es capaz de bloquear la expresión de la proteína B1.

18.- El uso de conformidad con la reivindicación 17, en donde dicha secuencia de olígonucleótidos es introducida en dichas células mediante un virus de conformidad con la reivindicación 15, en donde dicha segunda secuencia de dicho virus codifica para dicha secuencia de oligonucleótidos.

19.- El uso de un vector que codifica para una secuencia de ribozima capaz de ¡nteractuar con una secuencia de ARN mensajero celular que codifica para la proteína B1 de conformidad con las reivindicaciones 9 ó 10, en la fabricación de un medicamento para modular las rutas de inflamación, muerte celular o supervivencia celular u otras rutas en las cuales las células son moduladas directa o indirectamente por B1 , en donde dicho vector que está en las células permite la expresión de dicha secuencia de ribozima en dichas células, y en donde cuando dicha secuencia de ribozima es expresada en dichas células, interactúa con dicha secuencia con ARN mensajero celular y corta dicha secuencia de ARNm, dando como resultado la inhibición de la expresión de dicha proteína B1 en dichas células.

20.- Un método para aislar e identificar proteínas, de conformidad con las reivindicaciones 9 o 10, teniendo homología con, o siendo capaces de tener interacciones directas o indirectas con, cualquier proteína que tenga un prodominio o dominio de reclutamiento de caspasa (CARD), u otras proteínas o enzimas que intervienen en la señalización intracelular, mediante los dominios de intermediario o de cinasa presentes en dichas proteínas de conformidad con las reivindicaciones 9 ó 10, caracterizado porque comprende aplicar el procedimiento de dos híbridos de levadura, en el cual una secuencia que codifica para dicha proteína con dichos dominios CARD, de cinasa y de intermediario, o por lo menos uno de estos dominios, es llevado por un vector híbrido, y una secuencia de una genoteca de ADN genómico o ADNc es llevada por el segundo vector híbrido, los vectores siendo usados entonces para transformar células hospederas de levadura, y las células transformadas positivas siendo aisladas, seguido de extracción de dicho segundo vector híbrido para obtener una secuencia que codifique para una proteína que se una a dicha proteína que contiene dominios CARD, de cinasa y/o de intermediario.

21.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 20, caracterizado además porque dicha proteína es por lo menos una de las isoformas de B1 , análogos, fragmentos y derivados de la misma.

22.- Una composición farmacéutica para la modulación de las rutas de inflamación, muerte celular, supervivencia celular u otras rutas en células, las cuales son moduladas directa o indirectamente por B1 , que comprende, como ingrediente activo, por lo menos un proteína B1 , de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 10, sus fragmentos, análogos, derivados o mezclas de los mismos biológicamente activos.

23.- Una composición farmacéutica para la modulación de las rutas de inflamación, muerte celular, supervivencia celular u otras rutas en células, las cuales son moduladas directa o indirectamente por B1 , que comprende, como ingrediente activo, un vector de virus animal recombinante que codifica para una proteína capaz de unirse a un receptor de superficie celular, y que codifica para por lo menos una proteína B1 , isoformas, fragmentos o análogos activos, de conformidad con las reivindicaciones 9 ó 10.

24.- Una composición farmacéutica para modular las rutas de inflamación, muerte celular, supervivencia celular u otras rutas en células, las cuales son moduladas directa o indirectamente por B1 , que comprende como ingrediente activo, una secuencia de oligonucleótidos que codifica para una secuencia antisentido de la secuencia de ARN mensajero para proteína B1 , de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

25.- El uso de una composición farmacéutica para la prevención o el tratamiento de una condición patológica asociada con la regulación de apoptosis mediante una o más moléculas a las cuales una proteína B1 , de conformidad con las reivindicaciones 9 o 10, se une directa o indirectamente, dicha composición comprendiendo una cantidad efectiva de una proteína B1 o una molécula de ADN que codifica para la misma, o una molécula capaz de interrumpir la interacción directa o indirecta de dicha proteína B1 con una o más moléculas a las cuales una proteína B1 se une o con las cuales interactúa.

26.- Una composición farmacéutica para la prevención o el tratamiento de una condición patológica asociada con la regulación de apoptosis medíante una o más moléculas a las cuales una proteína B1 , de conformidad con las reivindicaciones 9 a 10, se une directa o indirectamente, dicha composición comprendiendo una cantidad efectiva de una proteína B1 , isoforma, fragmento, análogo o derivado de la misma, o una molécula de ADN que codifica para la misma, o una molécula capaz de interrumpir la interacción directa o indirecta de dicha proteína B1 , isoforma, fragmento, análogo o derivado de la misma, con una o más moléculas a las cuales dicha proteína B1 , isoforma, fragmento, análogo o derivado se une.

27.- El uso de una composición farmacéutica para la prevención o el tratamiento de una condición patológica asociada con la regulación de apoptosis mediante una o más moléculas a las cuales la proteína B1 , de conformidad con las reivindicaciones 9 o 10, se une directa o indirectamente, dicha composición comprendiendo una molécula capaz de interferir con la actividad de proteína cinasa de B1.

28.- El uso de una proteína o isorfoma, fragmento, análogo o derivado de la misma, o una mezcla de cualquiera de los mismos, de conformidad con las reivindicaciones 9 o 10, o una molécula de ADN que codifica para los mismos, o una molécula capaz de interrumpir la interacción directa o indirecta de dicha proteína B1 o isorforma, fragmento, análogo y derivado de la misma, o una mezcla de cualquiera de los mismos, de conformidad con las reivindicaciones 9 o 10, con una o más moléculas a las cuales dicha proteína B1 o isorforma, fragmento, análogo y derivado de la misma, o una mezcla de cualquiera de los mismos, de conformidad con las reivindicaciones 9 o 10, se une directa o indirectamente, en la fabricación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de una condición patológica asociada con la regulación de apoptosis mediante una o más moléculas a las cuales una proteína B1 , de conformidad con las reivindicaciones 9 o 10, se une directa o indirectamente.

29.- El uso de una o más proteínas B1 , ¡sorformas, análogos, fragmentos o derivados de conformidad con las reivindicaciones 9 o 10, en la fabricación de un medicamento para modular procesos apoptóticos o procesos de muerte celular programados (rutas de muerte celular), en los cuales la proteína B1 interviene directa o indirectamente, en donde dichas una o más proteínas B1 , isorformas, análogos, fragmentos, o derivados están en una forma adecuada para su introducción intracelular en células, o en donde una secuencia de ADN que codifica para dichas una o más proteínas B1 , ¡sorformas, análogos, fragmentos, o derivados, está en forma de un vector adecuado que posee dicha secuencia, dicho vector siendo capaz de efectuar la inserción de dicha secuencia en dichas células de tal forma que dicha secuencia sea expresada en dichas células.

30.- El uso de una o más proteínas B1 , isoformas, análogos, fragmentos o derivados, de conformidad con las reivindicaciones 9 o 10, en la fabricación de un medicamento para modular procesos de supervivencia celular, en los cuales la proteína B1 interviene directa o indirectamente, y los cuales incluyen la modulación de supervivencia celular, en donde dichas una o más proteínas B1 , isoformas, análogos, fragmentos o derivados están en una forma adecuada para la introducción intracelular de los mismos, o en donde una secuencia de ADN que codifica para dichas una o más proteínas B1 , isoformas, análogos fragmentos o derivados está en forma de un vector adecuado que posee dicha secuencia, dicho vector siendo capaz de efectuar la inserción de dicha secuencia en dichas células de tal forma que dicha secuencia sea expresada en dichas células.

31.- Un método para seleccionar un ligando capaz de unirse a una proteína B1 de conformidad con las reivindicaciones 9 o 10, caracterizado porque comprende poner en contacto una matriz de cromatografía de afinidad a la cual dicha proteína se une, con un extracto celular, con lo cual el ligando se une a dicha matriz, y eluyendo, aislando y analizando dicho ligando.

32.- Un método para seleccionar una secuencia de ADN que codifica para un ligando capaz de unirse a una proteína B1 de conformidad con las reivindicaciones 9 a 10, caracterizado porque comprende aplicar el procedimiento de dos híbridos de levadura en el cual una secuencia que codifica para dicha proteína B1 es llevada por un vector híbrido, y secuencias de una genoteca de ADN genómico o ADNc son llevadas por el segundo vector híbrido, transformando células hospederas de levadura con dichos vectores, aislando las células transformadas positivamente, y extrayendo dicho segundo vector híbrido para obtener una secuencia que codifique para dicho ligando.

33.- Un método para identificar y producir un ligando capaz de modular la actividad celular modulada/mediada por B1 , caracterizado porque comprende: a) seleccionar para un ligando capaz de unirse a un polipéptido que comprenda por lo menos una porción de B1 que tenga por lo menos algunos de los residuos de aminoácidos de B1 mostrados en la figura 3, que incluya esencialmente todo el prodominio (CARD) de B1 ; b) identificar y caracterizar un ligando, diferente de BCL2, TRAF2 o porciones de un receptor de la familia de receptores de FNT/FCN u otras proteínas conocidas que tengan un prodominio (CARD), encontrados mediante dicho paso de selección que sean capaces de dicha unión; y c) producir dicho ligando en forma sustancialmente aislada y purificada.

34.- Un método para identificar y producir un ligando capaz de modular la actividad celular modulada o mediada por una proteína B1 , de conformidad con las reivindicaciones 9 o 10, caracterizado porque comprende: a) seleccionar para un ligando capaz de unirse a un polipéptido que comprenda por lo menos una porción carboxi terminal de la secuencia de B1 mostrada en la figura 3, incluyendo el prodominio (CARD); b) identificar y caracterizar un ligando, diferente de BCL2, TRAF2 o porciones de un receptor de la familia de receptores de FNT/FCN u otras proteínas conocidas que tengan un prodominio (CARD), encontrados mediante dicho paso de selección que sean capaces de dicha unión; y c) producir dicho ligando en forma sustancialmente aislada y purificada.

35.- Un método para identificar y producir un ligando capaz de modular la actividad celular modulada/mediada por B1 , caracterizado porque comprende: a) seleccionar para un ligando capaz de unirse a por lo menos la porción N-terminal de la secuencia de B1 mostrada en la figura 3, incluyendo sustancialmente todo el dominio de cinasa de B1 ; b) identificar y caracterizar un ligando, diferente de BCL2, TRAF2 o porciones de un receptor de la familia de receptores de FNT/FCN u otras proteínas conocidas que tengan un prodominio (CARD), encontrados mediante dicho paso de selección que sean capaces de dicha unión; y c) producir dicho ligando en forma sustancialmente aislada y purificada.

36.- Un método para identificar y producir una molécula capaz de modular directa o indirectamente la actividad celular modulada/mediada por B1 , caracterizado porque comprende: a) seleccionar para una molécula capaz de modular actividades moduladas/mediadas por B1 ; b) identificar y caracterizar dicha molécula; y c) producir dicha molécula en forma sustancialmente aislada y purificada.

37.- Un método para identificar y producir una molécula capaz de modular directa o indirectamente la actividad celular modulada/mediada por una proteína de conformidad con las reivindicaciones 9 o 10, caracterizado porque comprende: a) seleccionar para una molécula capaz de modular actividades moduladas/mediadas por una proteína de conformidad con las reivindicaciones 9 o 10; b) identificar y caracterizar dicha molécula; y c) producir dicha molécula en forma sustancialmente aislada y purificada.

38.- Un fragmento de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque es un péptido.

39.- El uso de una molécula capaz de interactuar con la subunidad E de V-ATPasa, en la fabricación de un medicamento para modular procesos de inflamación, muerte celular y/o supervivencia celular.