MXPA99010304A - Formas atenuadas del virus de la diarrea viral bovina - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un método para producir formas atenuadas de virus de la diarrea viral bovina (BVD) mutando el gen de proteasa Npro. La invención incluye los virus atenuados preparados por este método, los anticuerpos creados utilizando estos virus y las vacunas que se pueden utilizar para inmunizar ganado vacuno.

Description

FORMAS ATENUADAS DEL VIRUS DE LA DIARREA VIRAL BOVINA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a métodos para producir una forma atenuada del virus de la diarrea viral bovina (BVD) inactivando un gen específico en el genoma viral. El virus atenuado, o el genoma viral mutado, se puede utilizar para producir anticuerpos contra el virus BVD o en vacunas destinadas a proteger al ganado vacuno contra la infección viral.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El virus de la diarrea viral bovina (BVD) se clasifica en el género pestivirus y en la familia Flaviviridae. Está estrechamente relacionado con los virus que causan la enfermedad border (enfermedad de la frontera) en las ovejas y la fiebre porcina clásica. Ei ganado vacuno infectado presenta la "enfermedad de las mucosas" que se caracteriza por temperatura elevada, diarrea, tos y ulceraciones de la mucosa alimentaria (Olafson, y otros, Cornell Vet. 36:205-213 (1946); Ramsey y otros., North Am. Vet. 34:629-633 (1953)). El virus BVD es capaz de atravesar la placenta de las vacas preñadas y puede dar como resultado el nacimiento de terneros persistentemente infectados (Pl) (Malmquist, J. Am. Vet. Med. Assoc. 152:763-768 (1968); Ross y otros, J. Am. Vet. Med. Assoc. 188:618-619 (1986)). Estos terneros son inmunotolerantes al virus y persistentemente virémicos por el resto de sus vidas. Constituyen una fuente de brotes de enfermedad de las mucosas (Liess, y otros., Dtsch. Tieraerztl. Wschr.81 : 481-487 (1974)) y están muy predispuestos a la infección con microorganismos que causan enfermedades tales como neumonía o enfermedad entérica (Barber y otros, Vet. Rec. 117:459-464 (1985)). Los virus BVD se clasifican según tengan uno de dos biotipos diferentes. Los del biotipo "cp" inducen un efecto citopático en células cultivadas, mientras que los virus del biotipo "ncp" no lo hacen (Gillespie y otros, Cornell Vet. 50:73-79 (1960)). Además se reconocen dos genotipos principales (tipos I y II), y se ha demostrado que ambos causan una gama de síndromes clínicos (Pellerin y otros, Virology 203:260-268 (1994); Ridpath y otros, Virology 205: 66-74 (1994)). El genoma del virus BVD tiene aproximadamente 12.5 kb de longitud y contiene un solo marco de lectura abierto ubicado entre las regiones no traducidas 5' y 3' (NTR) (Collett y otros, Virology 165:191-199 (1988)). Se traduce una poliproteína de aproximadamente 438 kD a partir de este marco de lectura abierto y es transformada en proteínas estructurales y no estructurales virales por proteasas celulares y virales (Tautz y otros, J. Virol. 71:5415-5422 (1997); Xu y otros, J. Virol. 71 :5312-5322 (1997); Elbers y otros J. Virol. 70:4131-4135 (1996); y Wiskerchen y otros, Virology 184:341-350 (1991)). Entre las enzimas virales que participan en esta formación están las proteasas Npro y NS3. Npro es la primera proteína codificada por el marco de lectura abierto viral y se auto-escinde del resto de la poliproteína sintetizada (Stark y otros, J. Virol. 67:7088-7093 (1993); Wiskerchen y otros, Virol. 65:4508-4514 (1991)). Entre las vacunas de BVD que están disponibles actualmente están aquellas en la que el virus ha sido inactivado químicamente (McCIurkin y otros, Arch. Virol. 58:119 (1978); Ferneiius y otros, Am. J. Vet. Res. 33:1421-1431 (1972); y Kolar y otros, Am. J. Vet. Res. 33:1415-1420 (1972)). Estas vacunas han requerido típicamente la administración de dosis múltiples para producir inmunización primaria, proporcionan inmunidad de corta duración y no protegen contra la transmisión fetal (Bolin, Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract. 11 :615-625 (1995)). En las ovejas, se ha dado a conocer una vacuna subunitaria basada en una proteína E2 purificada (Bruschke y otros, Vaccine 15:1940-1945 (1997)). Por desgracia, aparentemente sólo una de estas vacunas protege a los fetos de la infección y esta protección está limitada a una cepa de virus homólogo. No hay ninguna correlación entre los títulos de anticuerpo y la protección contra la infección viral. Además, se han producido vacunas de virus vivos modificados (MLV) utilizando el virus BVD que se ha atenuado por pase repetido en células bovinas o porcinas (Coggins y otros, Cornell Vet 51 : 539 (1961 ); y Phillips y otros, Am. J. Vet. Res. 36:135 (1975)) o por mutaciones inducidas químicamente que confiere un fenotipo termo-sensible al virus (Lobmann y otros, Am. J. Vet. Res. 45:2498 (1984); y Lobmann y otros, Am. J. Vet. Res. 47:557-561 (1986)). Una sola dosis de vacuna de MLV ha resultado suficiente para la inmunización, y la duración de la inmunidad se puede prolongar durante años en el ganado vacuno vacunado (Coria y otros, Can. J. Con. Med. 42:239 (1978)). Además, se ha dado a conocer protección cruzada de terneros vacunados con vacunas de tipo MLV (Martin y otros, en Proceedings of the Conference Res. Workers' Anim. Dis. 75:183 (1994)). Sin embargo, las consideraciones de seguridad, tales como la posible transmisión fetal del virus, han sido una preocupación importante con respecto al uso de estas vacunas (Bolin, Veí. Clin. North Am. Food Anim. Pract. 11 :615-625 (1995)). Existe una clara necesidad de vacunas nuevas y eficaces para controlar la propagación del virus BVD. Dado que la enfermedad causada por este virus es una de las enfermedades más difundidas y económicamente importantes del ganado vacuno, estas vacunas representarían un avance substancial en la ganadería.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa en el descubrimiento de que se pueden producir formas atenuadas del virus BVD delecionado o inactivando el gen de la proteasa Npro. Estos virus son mucho menos infecciosos que sus contrapartes de tipo salvaje en líneas celulares bovinas y son adecuados para uso en vacunas para ganado vacuno. Se describe aquí una secuencia genómica completa de uno de dichos virus atenuados, y se ha depositado un plásmido que codifica este virus, es decir, pBVDdNI , en el American Type Culture Collection (ATCC) como ATCC n° 203354.

A. Composiciones y métodos basados en el virus atenuado BVDdNI En su primer aspecto, la presente invención de basa en el desarrollo de una cepa viral BVD atenuada específica. La cepa se produce mutando un genoma viral de tipo salvaje para delecionar el gen de la protéasa Npro, y su secuencia de longitud completa se indica en SEQ ID N°:1 y en la figura 2, desde el nt 39 hasta el nt 12,116. Así, la presente invención se refiere a un virus que tiene una secuencia genómica que comprende la indicada y preferiblemente consta esencialmente de la indicada. Normalmente, el virus BVD tiene un genoma en forma de ARN. Cuando se clona, estará más típicamente en forma de ADN. Salvo indicación en contrario, la expresión "ácido nucleico" se refiere a secuencias tanto de ADN como de ARN de virus BVD. Por conveniencia, las entradas de los listados de secuencias sólo indican secuencias de ADN, pero la correspondiente secuencia de ARN para cada una será fácilmente evidente para los expertos en la técnica. La expresión "consta esencialmente de" se refiere a secuencias que son substancialmente las mismas que las especificadas tanto en términos de estructura como de función. Así, la invención incluye no sólo las secuencias expresamente representadas, sino también las correspondientes secuencias producidas introduciendo adiciones o substituciones insubstanciales. En particular, la invención incluye secuencias de ácido nucleico degeneradas que codifican las mismas proteínas de BVD que SEQ ID N°:1. Esta secuencia particular, es decir, SEQ ID N°:1 , del nt 39 al nt 12,116, y el correspondiente virus que la codifica se han designado, por conveniencia, como genoma y virus "BVDdNI". El virus puede estar presente, o bien como parte de una preparación más grande o en una forma substancialmente purificada, es decir, en una forma esencialmente libre de cualquier otro tipo de virus. La invención incluye células hospedantes que llevan una molécula de ácido nucleico BVDdNI de la presente invención. La expresión "células hospedantes" se entiende que incluye cualesquier células procarióticas que lleven una molécula de ácido nucleico BVDdNI , y cualesquier células eucarióticas infectadas con el virus o que lleven, si no, una molécula de ácido nucleico BVDdNI . Para células procarióticas, se han encontrado que la cepa STBL2 de Escherichia coli (DifcoBRL) da los mejores resultados para propagar el plásmido, y generalmente se prefiere. Para células eucarióticas, se prefieren en general las células de mamíferos tales como las células MDBK (ATCC CCL-22) y las células RD (células testiculares bovinas transformadas estables). Sin embargo, también se pueden utilizar otras células cultivadas. La invención incluye además los virus descendientes producidos en estas células hospedantes. El virus BVDdNI se puede utilizar para inducir la producción de anticuerpos infectando un animal a una dosis eficaz, es decir a una dosis suficientemente alta para provocar la producción de anticuerpos. Los anticuerpos se pueden fabricar en cualquiera de los animales utilizados normalmente para este fin (tales como ratones, conejos, cabras u ovejas) pero, preferiblemente, los anticuerpos se fabricarán en ganado vacuno. La expresión "anticuerpos frente al virus BVD", según se utilizara aquí, se refiere a anticuerpos que reaccionan preferentemente en el sentido de tener al menos 100 veces más afinidad por una cepa de virus BVD que por cualquier otra, virus no BVD. Aunque no se prefiere, el virus se puede inactivar además antes de la administración a un animal utilizando tratamientos químicos que implican a agentes tales como formalina, paraformaldehído, fenol, lactopropionato, psoralenos, complejos platino, ozono y otros agentes viricidas. Los anticuerpos producidos por estos procedimientos están incluidos por si mismos dentro del alcance de la invención y se pueden aislar utilizando técnicas que son bien conocidas en la materia (véase, v.g., Harlow y otros, Antibodies: A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1998)). Los anticuerpos se pueden utilizar, entre otros, en métodos pensados para detectar la presencia de BVD en muestras biológicas o de laboratorio. En otro aspecto, la invención se refiere a una vacuna que comprende el virus BVDdNI y un vehículo veterinariamente aceptable. Esta vacuna puede incluir cualquiera de los adyuvantes y otros agentes utilizados típicamente en estas preparaciones. Se puede conducir una respuesta inmune en ganado vacuno administrando la vacuna a una dosificación suficiente para inducir inmunidad protectora contra la provocación subsiguiente con virus BVD. Típicamente, la vacuna se administrará parenteralmente, pero otras rutas de administración también son compatibles con la invención. Si es necesario, se puede dar dos o más inoculaciones a intervalos regulares de, por ejemplo, dos a ocho semanas. Se pueden utilizar procedimientos clásicos bien conocidos en la materia para optimizar los protocolos de inmunización.

B. Composiciones y métodos basados en el ácido nucleico genómico BVDdNI Trabajos recientes han demostrado que es posible preparar vacunas eficaces inyectando en animales ácidos nucleicos que codifican inmunógenos. Los métodos para producir y administrar estas "vacunas de ADN" han sido descritos en detalle (véanse, v.g., las memorias de las patentes de los EE.UU. 5.589.466; 5.580.859; y 5.703.055) y se pueden aplicar a ácido nucleico genómico BVDdNI . Así, en otros aspecto, la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico, preferiblemente en forma sustancialmente purificada, que comprende la secuencia de SEQ ID N°:1 , del nt 39 al nt 12,116, o una variante degenerada de la misma. En una realización preferida, la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico, preferiblemente en forma substancialmente purificada, que consta esencialmente de la secuencia de SEQ ID N°:1 , del nt 39 al nt 12,116. Como se utiliza aquí, la expresión "substancialmente purificada" se refiere a un producto deseado que está esencialmente libre de materiales contaminantes. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico "substancialmente purificada" estaría esencialmente libre de otras moléculas de ácidos nucleicos contaminantes y típicamente comprendería al menos 85% en peso de las moléculas de ácido nucleico en una muestra, prefiriéndose los porcentajes más altos. Un método para determinar la pureza de un ácido nucleico es electroforizando una preparación en una matriz tal como poliacrilamida o agarosa. La pureza se pone en evidencia por la aparición de una sola banda después de la tinción. Otros métodos para estimar pureza incluyen la cromatografía y la centrifugación analítica. El ácido nucleico genómico BVDdNI se puede incorporar en un vector como un elemento codificante característico. La frase "elemento codificante característico" se refiere a la posición del vector que se traduce a polípeptido viral y, finalmente, a virus. Es característico en el sentido de que no incluye ningún otro elemento traducido que alternaría substancialmente al producto BVDdNI . Este vector, o el propio ácido nucleico BVDdNI , se puede utilizar para transfectar una célula hospedante con el fin de producir virus atenuado descendiente. La invención también incluye métodos para inducir la producción de anticuerpos frente al virus BVD inyectando el ácido nucleico BVDdNI , o un vector que contenga este ácido nucleico, directamente en un animal. Se puede utilizar cualquier animal capaz de producir anticuerpos, pero generalmente se prefiere el ganado vacuno. Los anticuerpos producidos de este modo forman parte de la invención y se pueden purificar a partir de animales y utilizar, por ejemplo, en ensayos destinados a detectar la presencia de virus BVD en medio de cultivo o fluido biológico. Se pueden preparar vacunas para administración a ganado vacuno en base al ácido nucleico genómico BVDdNI (véanse las referencias citadas anteriormente), en combinación con un vehículo veterinariamente aceptable, y utilizarlas en protocolos de inmunización optimizados para inducir inmunidad protectora frente a una infección viral subsiguiente.

C. Métodos para mutar genomas BVD de tipo salvaje En un sentido más general, la presente invención se refiere a un método para modificar un genoma a partir de un virus BVD de tipo salvaje substancialmente purificado de tal manera que lo haga adecuado para uso en una vacuna. La expresión "substancialmente purificado", como se utiliza en este contexto, se refiere a una preparación viral que consta, preferiblemente, de una sola cepa de virus BVD, sin que esté presente ningún otro tipo de virus. Las características más distinguidas del procedimiento es que el ácido nucleico genómico es mutado para inactivar el gen de la proteasa Npro. En este contexto, se considera que un gen estará inactivado si, o bien no se forma ningún producto (por ejemplo, el gen está delecionado), o se forma un producto que no puede realizar más función biológica normal (v.g., escisión proteolítica), o se forma un producto que realiza su función biológica normal pero a una velocidad significativamente reducida. Se pueden utilizar cualquier método que de como resultado la inactivación de la proteasa Npro. Por ejemplo, se puede aislar ARN genómico del virus BVD de tipo salvaje, éste puede someter a transcripción inversa para formar ADNc, que después se puede clonar utilizando procedimientos clásicos. Después se pueden introducir mutaciones en el gen de proteasa Npr0 por procedimientos tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la mutagénesis dirigida en un punto, sintetizando y ligando fragmentos de ADN de tal manera que Npró sea eliminado parcial o completamente, o por técnicas de mutagénesis al azar, incluyendo v.g. la exposición a un mutágeno químico o radiación, como se conoce en la materia, o por una combinación de estos procedimientos. Una vez que se ha modificado el genoma viral BVD de modo que el gen Npro esté ¡nactivado, puede clonarse en un vector apropiado y producirse en grandes cantidades. Como se ha discutido anteriormente, los vectores incluirán la secuencia BVD como un elemento característico con una secuencia que comprende, o que consta esencialmente de, la del virus de tipo salvaje mutado. Uno cualesquiera del genoma BVD mutado o del vector que comprende el genoma se puede transformar y transfectar en una célula hospedante con el propósito de producir grandes cantidades, o bien de ácido nucleico viral o del virus mismo. Como se ha discutido anteriormente en relación con el ADN genómico de BVDdNI , se pueden producir anticuerpos frente a BVD en un animal administrando cualquier tipo de genoma viral BVD de tipo salvaje que haya sido mutado de la manera discutida anteriormente. En general, se prefiere que la producción de anticuerpos tenga lugar en ganado vacuno, pero también puede utilizar otros animales. Pueden producirse vacunas que incorporan el ácido nucleico genómico BVD mutado y utilizarse para inducir una respuesta inmune en ganado vacuno utilizando procedimientos clásicos de inmunización con ADN (v.g., aquellos discutidos en las memorias de las patentes de los EE.UU. .589.466; 5.580.859; y 5.703.055). Las vacunas, los anticuerpos y los ácidos nucleicos fabricados por los métodos discutidos aquí forman, en su totalidad, parte de la presente invención.

D. Métodos para producir virus BVD atenuado Se ha descubierto que cuando el ácido nucleico de un virus BVD se muta con objeto de inactivar el gen de proteasa Npro, se produce un virus atenuado que es mucho menos infeccioso en cultivo de células. La replicación relativamente lenta de estos virus atenuados permite a los animales ordenar sus defensas inmunológicas de un modo que no es posible para un virus de tipo salvaje, que se propaga rápidamente. Así, los métodos para producir un genoma viral mutado, discutidos anteriormente para BVDdNI , conducen directamente a un método general para atenuar virus BVD, de modo que lo hacen adecuado para uso en una vacuna. En general, el procedimiento implica aislar un virus BVD de tipo salvaje; clonar su ácido nucleico genómico; mutar el ácido nucleico clonado con objeto de inactivar el gen de proteasa Npro; y después transformar o transfectar ei ácido nucleico mutado en un organismo hospedante para producir el virus atenuado. Aunque se puede utilizar cualquiera de los métodos discutidos anteriormente para producir mutaciones, el método preferido será delecionar todo o parte del gen de proteasa Npro.

La presente invención abarca no sólo métodos para preparar virus atenuados sino también el propio virus, células hospedantes infectadas con el virus y virus descendientes producidos por estas células hospedantes.

Se pueden preparar anticuerpos frente al virus BVD atenuado infectando animales, preferiblemente ganado vacuno, a una dosis eficaz. Los anticuerpos preparados de esta manera son parte de la invención y se pueden aislar y utilizar en procedimientos diagnósticos, o para detectar la presencia de BVD en cultivo de células. Como se ha discutido en relación con el virus BVDdNI , el virus atenuado caracterizado por un gen de proteasa Npra inactivado se puede incorporar en vacunas y utilizar para inducir una respuesta inmune en ganado vacuno. Las dosificaciones y los protocolos de inmunización se pueden optimizar de modo que los animales den como resultado una inmunidad protectora contra la provocación viral subsiguiente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1 (cuadros A y B): El cuadro A muestra una representación esquemática del plásmido pVVNADL. Este plásmido se mutó para delecionar el primer gen en el marco de lectura abierto, es decir, proteasa Npro. El producto plasmídico mutado resultante, pBVDdNI , se muestra esquemáticamente en el cuadro B. En la figura 1 , también se muestran otras varias regiones del gen. C representa un gen que codifica una proteína central estructural que empaqueta ADN genómico y forma el virión viral. Este está seguido por genes que codifican tres glicoproteínas de la cubierta -EO, E1 y E2. P7 codifica una proteína no estructural con una función desconocida y está seguida por una región designada como "NS2-inserción-NS3". NS2 codifica una proteína muy hidrófoba con un resto de dedo de zinc.

NS3 es hidrófilo y es un marcador del virus BVD citopático. La replicación del virus ncp en un animal infectado puede convertir el virus en el biotipo cp a través de una recombinación genética que implica la inserción de una secuencia de ARN celular o viral extra entre las regiones codificantes NS2 y NS3. Como resultado de la recombinación, se liberan proteínas NS2 y NS3 libres. Esta última, es decir, NS3, es una proteasa responsable de la mayor parte de la transformación de la proteína no estructural que tiene lugar. NS4A está localizada a continuación de NS3 y se sabe que codifica un cofactor para la actividad de la proteasa NS3. A continuación de NS4 hay dos genes que codifican proteínas virales, NS4B y NS5A, con funciones desconocidas. El último gen, NS5B, codifica una ARN polimerasa dependiente de ARN y es responsable de la replicación viral. La secuencia nucleotídica (SEQ ID N°: 9) indicada en el cuadro B es la secuencia que rodea al codon de iniciación de pBVDdNI . Figura 2. Muestra la secuencia nucleotídica completa el plásmido pBVDdNI . La secuencia genómica de BVDdNI está representada por los nucleótidos 39 a 12,116.

Figura 3. Indica los datos que demuestran la seroconversión en ganado vacuno en respuesta de la administración de virus BVDdNI .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN A. Producción de BVDdNI y del ácido nucleico que codifica el virus La presente invención se refiere a un virus BVD que ha sido atenuado por la deleción del gen de proteasa Npro. El virus se ha designado BVDdNI y, como sugiere el término "atenuado", se ha encontrado que se replica a una velocidad mucho más lenta en líneas celulares susceptibles (v.g., líneas celulares testiculares bovinas (RD), o líneas celulares de riñon bovino (MDBK) que su contraparte de tipo salvaje in vivo. Además, BVDdNI no causa infección productiva en células de tráquea bovina embriónica (EBTr) o células de turbinado bovino (BT-2), lo que puede contrastar con la infección productiva que ocurre tras la infección con virus de tipo salvaje. El crecimiento lento del virus BVDdNI e varías líneas celulares bovinas diferentes sugiere una amplia atenuación del tropismo de tejidos en animales. BVDdNI es genéticamente estable, ya que la deleción Npro se mantiene después de hasta 10 pases de células RD bovinas. Aunque el genoma del virus natural consta de ARN, éste puede transcribirse inversamente dando ADN y clonarse. Se entenderá que las referencias hechas aquí a las secuencias de virus BVD y de ácido nucleico abarcan tanto las secuencias de ADN inversamente transcritas derivadas de las secuencias de ARN viral, como el correspondiente ARN mismo. La secuencia nucleotídica completa el genoma viral de BVDdNI se muestra en SEQ ID N°:1 , desde el nt 39 hasta el nt 12,116. Se entenderá que la invención incluye no sólo los genomas virales que tienen la secuencia exacta indicada, sino también otras secuencias que no difieren substancialmente en términos de estructura o función, incluyendo, por ejemplo, secuencias que codifican las mismas proteínas BVD que SEQ ID N°:1 que estén basadas en la degeneración del código genético. Además, v.g., es bien sabido que se pueden utilizar técnicas tales la mutagénesis dirigida a un punto para introducir variaciones en la estructura de ácidos nucleicos. Las mutaciones en la secuencia de ácido nucleico del virus BVD introducidas por este método o alguno similar, o alternativamente por mutagénesis al azar conocida en la técnica, están dentro del alcance de la invención, siempre que al menos una característica biológica fundamental del virus resultante siga siendo substancialmente la misma que la del virus del cual se derivó. En particular, las mutaciones que no alteran substancialmente las características de BVDdNI con respecto a la capacidad de infección caen dentro del alcance de la invención. El ácido nucleico BVDdNI mutado se obtuvo a partir de una cepa del National Animal Disease Laboratory (NADL) de un BVD obtenido a partir de la American Type Culture Collection (VR-534). Esta se incorporó en un vector y se delecionó el gen de proteasa Npro de longitud completa por PCR selectiva y religación, como se describe más adelante en la sección de los ejemplos. Aunque se puede utilizar este procedimiento para el genoma viral y, en último término el virus mismo, un plásmido que contiene la secuencia genómica BVDdNI completa, designando pBVDdNI , ha sido depositada como ATCC n° 203354, y éste representa la fuente preferida para procedimientos de aislamiento. Se puede utilizar metodología clásica para propagar y purificar el plásmido, y transfectarlo en células hospedantes capaces de soportar la producción del virus. Las células hospedantes procarióticas preferidas en la propagación del plásmido son las células E. coli STBL2 (disponibles a partir de GibcoBRL), pero también se pueden utilizar otros tipos de células. El virus puede producirse en células eucarióticas, tales como células RD o MDBK, aislarse a partir de ellas en forma muy purificada utilizando técnicas conocidas de separación tales como centrifugación en gradiente de sacarosa, y utilizarse en vacunas o para crear anticuerpos. Alternativamente, se puede utilizar el plásmido para aislar la secuencia genómica BVDdNI y ésta se puede utilizar directamente en la creación de anticuerpos o en vacunas.

B. La preparación de otras cepas virales BVD atenuadas Se puede utilizar los mismos procedimientos básicos para crear virus BVDdNI y ácido nucleico genómico conjuntamente con otras cepas de tipo salvaje de BVD. En cada caso, se aisla el virus de tipo salvaje y se lleva a cabo la atenuación inactivando el gen de proteasa Npro. Preferiblemente esto se puede llevar a cabo delecionando el gen entero utilizando una estrategia basada en una PCR, como se discute aquí para BVDdNI . Sin embargo también se pueden utilizar otros métodos para inactivar el gen, v.g., por deleción de una porción de la secuencia o introducción de mutaciones ai azar o en sitios específicos. En todos los casos, el objetivo es producir un virus mutado que prolifere a una velocidad lenta después de la infección. Como se discute en la sección de los ejemplos, la capacidad de infección del virus se puede determinar in vitro realizando inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo monoclonal específico para el virus BVD.

C. Creación de anticuerpos frente a virus BVD atenuados Se pueden producir anticuerpos frente a virus BVD en cualquiera de los animales utilizados típicamente para la producción de anticuerpos, incluidos ratones, conejos, etc. Sin embargo, se prefiere que los anticuerpos sean producidos en ganado vacuno. Las composiciones que contienen el virus se pueden administrar a los animales por cualquier ruta, pero típicamente serán inyectadas en los animales por vía intramuscular, subcutánea o intravenosa. En general, la preparación del virus incluirá un adyuvante, v.g., adyuvante completo o incompleto de Freund. Las preparaciones apropiadas para inyección, las pautas de inyección y similares son bien conocidas en la técnica y pueden ser empleadas (véase, v.g., Harlow y otros, Antibodies, A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1998); Klein, Immunoloqy: The Science of Self-Nonself Discrimination (1982)). También se pueden preparar anticuerpos monoclonales utilizando procedimientos clásicos (Kennett y otros, Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A New Dimensión in Biological Analvses (1980); Campbell, "Monoclonal Antibody Technology" in Laboratorv Techniques in Biochemistry and Molecular Bioloqy (1984)). Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que reaccionan con especificidad frente a virus BVD (es decir, que tiene una afinidad al menos 100 veces mayor por BVD que cualquier otro tipo de virus) se puede utilizar en cualquiera de una gama de inmunoensayos. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden utilizar para detectar virus BVD en radioinmunoensayos o ensayos inmunométricos, también conocidos como de "dos sitios" o "sandwich" véase Chard, "An introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques" en Laboratorv Techniques in Biochemistry and Molecular Bioloqy, North Holland Publishing Co., N.Y. (1978)). En un ensayo ¡nmunométrico típico , se une una cantidad de anticuerpo no marcada a un soporte sólido que sea insoluble en el fluido que se está ensayando, v.g., sangre, linfa, extractos celulares, etc. Después de la unión inicial del antígeno al anticuerpo inmovilizado, se añade una cantidad en un segundo anticuerpo (que puede ser o no ser igual que el primero) marcado de manera detectable para permitir la detección y/o la cuantificación del antígeno (véase, v.g., Radioimmune Assav Methods, compilado por Kirkham y otros, págs. 199-206, E&S Livingstone Edinburgh (1970). Muchas variaciones de estos tipos de ensayos bien conocidas en la técnica y se pueden emplear estos tipos de ensayos son bien conocidas en la técnica y se pueden emplear para la detección de virus BVD.

D. Vacunas y procedimientos de vacunación convencionales Las vacunas y los procedimientos de vacunación que emplean el virus BVD han sido discutidos en numerosas referencias (véase, v.g., Femelius y otros, Am. J. Vet. Res. 33:1421-1431 (1972); Kolar y otros, Am. J. Vet. Res. 33:1415-1420 (1972); McCIurkin y otros, Arch. Virol. 58:119 (1978); Coggins y otros, Cornell Vet. 51 :539 (1961); Phillips y otros, Am. J. Vet. Res. 36:135 (1975); Lobmann y otros, Am. J. Vet. Res. 45:2498 (1984); Coria y otros, Can. J. Comp. Med. 42:239 (1978); Martin y otros, en Proceedings of the Conference Res. Workers Anim. Dis. 75:183 (1994); y memoria de la patente de los EE.UU. 4.618.493). Típicamente, una vacuna contendrá entre aproximadamente 1 x 106 y aproximadamente 1 x 108 partículas de virus, con un vehículo veterinariamente aceptable, en un volumen entre 0.5 y 5 ml. La formulación puede tener lugar utilizando métodos tales como aquellos descritos en Remington' s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, Pa, 16a ed. (1982)). La invención es compatible con diversos excipientes y adyuvantes, y éstos se pueden incluir en preparaciones según se desee. Por ejemplo, las composiciones de vacunas de la presente invención se pueden formular siguiendo los formalismos aceptados, utilizando tampones, vehículos, estabilizantes, diluyentes, conservantes y solubilizantes clásicos, y también se pueden formular para facilitar una liberación sostenida. Los diluyentes pueden incluir agua, solución salina, dextrosa, etanol, glicerol y similares. Los aditivos para isotonicidad pueden incluir cloruro de sodio, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa, entre otros. Los estabilizantes incluyen albúmina, entre otros. Ejemplos no limitados de adyuvantes incluyen el sistema de adyuvantes RIBI (Ribi Inc.), alumbre, gel de hidróxido de aluminio, emulsiones de aceite en agua, emulsiones de agua en aceite tales como, v.g., los adyuvantes completo e incompleto de Freund, copolímero de bloques (CytRx, Atlanta GA), SAF-M (Chiron, Emeryville CA), adyuvante AMPHIGEN®, saponina, Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc. Cambridge MA), u otras fracciones de saponina, monofosforil-lípido A, adyuvante de lípido-amina Avridine, enterotoxina termo-lábil de E. coli (recombinante o de otro tipo), toxina del cólera, o muramil-dipéptido, entre otros muchos. La vacuna también puede comprender uno o más agentes inmuno-modulares tales como, v.g., interleuquinas, interferones, u otras citoquinas. Generalmente, las vacunas están destinadas a la administración parenteral, aunque la presente invención también es compatible con otras formas de administración, tales como, v.g., por la administración oral, intranasal, intramuscular, intra-ganglios linfáticos, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, rectal o vaginal, o por una combinación de rutas. Los expertos en la materia serán capaces de formular fácilmente la composición de rutas. Los expertos en la materia serán capaces de formular fácilmente la composición de vacuna de acuerdo con la ruta escogida. Los procedimientos de inmunización se pueden optimizar utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica. Se puede administrar una sola dosis a los animales o, alternativamente, pueden tener lugar dos o más inoculaciones con vacunas separadas por intervalos de dos o diez semanas. Si se desea, se puede recoger suero de los animales inoculados y analizarlos para determinar la presencia de anticuerpos frente al virus BVD. Las expresiones "inducción de una respuesta inmune" y similares se utilizan aquí en un sentido amplio para incluir la inducción o el crecimiento de cualquier respuesta básicamente inmune en ganado vacuno en respuesta a la vacunación, incluyendo cualquier respuesta inmune humoral o celular, o ambas, que sirvan para proteger el animal vacunado contra el virus BVD. Las expresiones "inmunidad protectora" , "respuesta inmune protectora", "proteger", y similares, tal como se utilizan aquí, no se limitan a la prevención absoluta a la diarrea viral bovina en ganado vacuno, ni a la prevención absoluta de infección de ganado vacuno por el virus BVD, sino que debe entenderse que también se refieren a cualquier disminución en el grado o velocidad de infección por el patógeno, o a cualquier disminución en la gravedad de la enfermedad o en cualquier síntoma o condición que sea el resultado de infección con el patógeno, comparada con la que ocurre en un animal testigo infectado, no vacunado.

E. Vacunas de ADN Las referencias que describen vacunas y procedimientos de vacunación que utilizan ácidos nucleicos (ADN o ARN) incluyen, entre otras las memorias de la patente de los EE. UU. n° 5.703.055; de la patente de los EE.UU. n° 5.580.859; de la patente de los EE.UU. n° 5.589.466, de la publicación de la patente internacional WO 98/35562, y diversas publicaciones científicas, incluyendo Ramsay y otros, 1997, Immunol. Cell Biol. 75:360-363; Davis, 1997, Cur. Opinión Biotech. 8:635-640; Manickan y otros, 1997, Critical Rev. Immunol. 17:139-154; Robinson, 1997, Vaccine 15 (8): 785-787; Robinson y otros,1996, AIDS Res. Hum. Retr. 12(5): 455-457; Lay y Bennett, 1998, Critical Rev. immunol. 18:449-484 y Vogel y Sarver, 1995, Clin. Microbiol. Rev. 8(3): 406-410, que se incorporan aquí como referencia. Estos procedimientos se pueden utilizar para producir una vacuna contra el virus BVD en la que el ácido nucleico correspondiente a ácido nucleico BVDdNI , o a un genoma viral BVD similar, que ha sido atenuado por la inactivación del gen de proteasa Npro, se administra a ganado vacuno. También se puede utilizar un vector que contiene estas moléculas de ácido nucleico. Los inmunógenos liberados de esta manera evocan típicamente una respuesta inmune tanto humoral como celular en los animales. O bien ADN o ARN que codifique el genoma viral BVD atenuado se puede utilizar en vacunas. El ADN o ARN puede estar presente en una forma "desnuda" o se puede administrar junto con un agente que facilite la absorción celular (v.g., liposomas o lípidos catiónicos). La ruta típica de administración será inyección intramuscular de entre aproximadamente 0.1 y aproximadamente 5 ml de vacuna. El polinucleótido total en la vacuna estará generalmente entre aproximadamente 0.1 µg/mi y aproximadamente 5.0 mg/ml. Los polinucleótidos pueden estar presentes por parte de una suspensión, solución o emulsión, pero generalmente se prefieren los vehículos acuosos. Se puede obtener inmunización como resultado de una sola inoculación o debido a múltiples inoculaciones. Si se desea, pueden recogerse sueros de los animales inoculados y analizarse para determinar la presencia de anticuerpos frente al virus BVD. Los siguientes ejemplos sólo son ilustrativos y no se proponen para limitar el alcance de la presente invención.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Ensayos y métodos experimentales ADN En la figura 1A se muestra esquemáticamente el clon infeccioso de longitud completa pWNADL. Este plásmido contiene un replicón ColEl derivado de pGEM4 (Promega Corp.) y tiene 14,578 pb de longitud (Vassilev y otros, J. Virol. 71 ;471-478 (1997)). Un promotor de T7 ARN polimerasa está insertado curso arriba del genoma viral BVD y este promotor puede dirigir la síntesis de ARN viral. La secuencia del genoma viral BVD se derivó de la cepa NADL del virus BVD (ATCC VR-534).

Amplificación de pWNADL en E. coli En general la amplificación del clon pWNADL de longitud completa en E. coli ha resultado difícil. Los efectos deletéreos de ADNc largos de pestivirus y clones de longitud completa durante la propagación en E. coli han sido indicados previamente (Moormann y otros, J. Virol. 70:763-770 (1996); Rugglie y otros, J. Virol. 70:3478-3487 (1996)). La estabilidad de pWNADL se ensayó en varios hospedantes bacterianos; incluidos E. coli JM109 (Stratagene); DH5a (GibcoBRL); y células STBL2 (GibcoBRL).

Después de la transformación del ADN del plásmido en cada una de estas cepas, se vigiló el tamaño de las colonias y se analizó la estructura plasmídica gruesa por su mapa de restricción. Los mejores resultados se obtuvieron con células STBL2. La transformación de pVVNADL en estas células produjo poblaciones relativamente uniformes de pequeñas colonias sin evidencia de transposición del ADN en condiciones de crecimiento restringidas {30°C durante no más de 20 horas) y rendimiento razonable de ADN.

Transcripción y transfección de ARN in vitro Se sintetizaron transcritos de ARN in vitro con T7 ARN polimerasa utilizando el reactivo MEGAscript (Ambion) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El modelo de ADN de pWNADL se linearizó con Sacl I y se trató con T4 ADN polimerasa para eliminar el extremo saliente 3'. Los productos de la reacción de transcripción se analizaron por electroforesis en gel. Se añadieron de 1 a 5 µg de ARN transcrito a 200 µl de Opti-MEM (GibcoBRL) que contenía 6 µg de lipofectina (GibcoBRL) y las muestras de ARN/lípido se incubaron durante 10 a 15 minutos a temperatura ambiente. Durante este tiempo, crecieron (50 a 60% de confluencia) monocapas de MDBK (un derivado de células de riñon bovino Madin Darby (clon 6)) o RD (una línea celular de testículo bovino transformada estable) en las placas de 6 pocilios (35 mm de diámetro), que se lavaron dos veces con PBS libre de RNasa y una vez con Opti-MEM. Después del lavado final, las mezclas de transfección se añadieron a cada pocilio, que seguidamente se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente con balanceo suave. Después, los pocilios recibieron 1 ml de OPTI-MEM y se incubaron durante otras 3 horas a 37°C. A cada pocilio se añadió un volumen de 3 ml de Opti-MEM que contenía 5% de suero equino fetal (para células RD) o suero bovino fetal (para células MDBK). Después de incubar durante 1 a 4 días a 37°C, las células se fijaron con 80% de acetona y se realizaron ensayos ¡nmunohistoquímicos para ayudar a visualizar las placas de virus BVD.

EJEMPLO 2 Construcción de clon viral BVD con el gen Npro delecionado Con el fin de crear un virus BVD con el gen Npro delecionado de su genoma, primero se crearon tres fragmentos de ADN y después se ligaron entre ellos. El procedimiento exacto se describe a continuación.

Creación del fragmento I de PCR Se diseño el "fragmento I de PCR" para que contuviera una deleción de la secuencia codificante de Npro. Para crear este fragmento se necesitaron tres amplificaciones por PCR. En la primera, se utilizaron los cebadores 5NTR3 (+) y 5NTR4 (-) para amplificar la mitad de la región 5'NTR curso arriba de la secuencia codificante de Npro. El cebador en sentido positivo ', 5NTR3 (+), tenía la secuencia: 5'-AAAGGTCTCGAGATGCCACG-3' (oligonucleótido 218-237, SEQ ID N°: 2). El cebador en sentido negativo 3', 5NTR4 (-), tenía la secuencia: 5'- GTCTGACATGTGCCATGTACAGCAGAGATTTTTAGTAGC-3' (oligonucleótido 895-890+388-356, SEQ ID N°:3). Ambos cebadores están ubicados en la región 5'NTR del genoma viral y el cebador 5NTR3 (+) contiene un único sitio para enzima de restricción Xhol. El cebador 5NTR4 (-) contiene seis oligonucleótidos extra en su extremo 5' que son homólogos al extremo 5' de la secuencia codificante de la proteína C del virus BVD. La amplificación por OCR se realizó utilizando cebadores a una concentración final de 0.5 µM, 10 ng de ADN de plásmido pWNADL como molde, y 2.5 unidades de Pfu ADN polimerasa (Stratagene, La Jolla, CA). Se realizaron veinte ciclos de amplificación utilizando las siguientes condiciones: desnaturalización a 94°C durante 30 segundos; reasociación a 55°C durante un minuto; y extensión a 72°C durante dos minutos. Después de la purificación por electroforesis en gel de agarosa, el fragmento resultante de 177 pares de bases (fragmento A) se resuspendió en tampón TE. Se realizó una segunda amplificación PCR utilizando los oligonucleótidos NADLC6 (+) y Seq23 (-) como cebadores para amplificar un fragmento curso abajo de la secuencia codificante de Npr0. El cebador en sentido positivo 5', NADLC6(+), tenía la secuencia: 5'- CACATGTCAGACACGAAAGAAGAGGGAGC-3' (oligonucleótidos 383- 388+890-913, SEQ ID N°:4). El cebador en sentido negativo 3', Seq23 (-) tenía la secuencia: 5'-CAGGTTTGCAATCCAAGTGCCC-3' (oligonucleótido 2480-2459, SEQ ID N°:5). El cebador NADLC6 está ubicado en ia región N-terminal de la proteína C. Contiene tres nucleótidos extra homólogos al extremo 3' del 5' NTR y un codon de iniciación, ATG, está ubicado en su extremo 57 El cebador Sep23 (-) está ubicado cerca del extremo N-terminal de la proteína E2. El plásmido pWNADL se utilizó como molde en la reacción de amplificación y las condiciones fueron las mismas que las que se han descrito anteriormente. El fragmento de ADN resultante (fragmento B) se purificó por electroforesis en gel de agarosa y tenía un tamaño de 1596 pb. La tercera amplificación se realizó utilizando los oligonucleótidos 5'NTR3 (+) (SEQ ID N°:2) y Seq23 (-) (SEQ ID N°:5) como cebadores a una concentración de 0.5 µM, los fragmentos A y B como moldes (0.5 µg) y 2.5 unidades de Pfu ADN de polimerasa (Stratagene, La Jolla, CA). Durante los cuatro primeros ciclos de amplificación, las condiciones fueron: desnaturalización a 94°C durante 30 segundos; reasociación a 40°C durante un minuto; y extensión a 72°C durante dos minutos. Esto estuvo seguido por 20 ciclos cuyas condiciones fueron: desnaturalización a 94°C durante 30 segundos; reasociación a 60°C durante un minuto; y extensión a 72°C durante dos minutos. Esto dio el producto final, designado "fragmento I de PCR", con un tamaño de 1 ,767 pb. Este fragmento se dirigió con Xhol y Pvul para formar un fragmento de 1 ,175 pb antes de ser utilizado para ligación.

Creación del fragmento II de PCR El "fragmento II de PCR" se creó utilizando los oligonucleótidos Seq2(+) y Seq24(-) como cebadores. La secuencia del cebador en sentido positivo 5', Seq2(+), es como sigue: 5'-GGAGCATACGCTGCTTCCCC-3' (oligonucleótido 1865-1884, SEQ ID N°:6). El cebador en sentido -3', Seq24(-) tenía la secuencia: GCCTTGCCTATGAGGGAATGG-3' (oligonucleótido 2,963-2,942, SEQ ID N°:7). El oligonucleótido Seq2(+) está ubicado cerca del extremo N terminal de E1 y el oligonucleótido Seq24(-) está ubicado cerca de la región E2. La amplificación se realizó utilizando el ADN de plásmido pWNADL como molde de las condiciones descritas anteriormente en relación con ia amplificación utilizando los fragmentos A y B. El fragmento resultante, designado "fragmento II de PCR", tenía un tamaño de 1098 pb. Se dirigió con Pvul y Rsrll para formar un fragmento de 929 pb de longitud antes de utilizarse para ligación.

Creación del fragmento vector lll El plásmido pWNADL de 14,579 pb se dirigió con Xhol y Rsrll para dar un fragmento de 11,974 pb de longitud. Este se designó "fragmento vector III".

Creación del plásmido pBVDdNI Los fragmentos I y II de PCR y el fragmento vector III se mezclaron entre sí a una relación molecular de 2:2:1 y se ligaron con 200 unidades de T4 ADN ligasa (Boehringer Mannheim) durante una noche a 16°.

Después, el producto de ligación se transformó en células de E. coli STBL2 y se escrutaron las colonias heterólogas por purificación de mini-ADN y digestión con enzimas de restricción específicas. Los plásmidos que tenían el tamaño esperado (14,079 pb) se analizaron además por análisis de secuencia. El plásmido resultante pBVDdNI se indica en la figura 1 B y contiene la deleción esperada del gen de Npro proteasa en el genoma viral BVD. El origen del vector para pBVDdNI es el mismo que para pWBNADL.

EJEMPLO 3 Caracterización del clon viral BVD con la deleción del gen Npro Capacidad de infección del clon viral BVD con la deleción del gen Npro, pBVDdNI Se sintetizó ARN de pBVDdNI y pVVNADL (control positivo) in vitro como se ha descrito previamente, y se efectuó la transfección de ARN utilizando lipofectina sobre monocapas de células RD. A las 48, 72 y 96 horas después de la transfección, se recogió el líquido sobrenadante de las células transfectadas y se utilizó para reinfectar monocapas de RD recientes. Las células transfectadas se fijaron con 80% de acetona y después se examinaron en un ensayo inmunohistoquímico realizado utilizando un estuche de Vectastain Élite ABC (Vector Laboratories). Los anticuerpos monoclonales utilizados para detectar proteínas virales específicas de BVD fueron 15C5 (específica para EO) y CA3 (específica para E2) (internos de Pfizer), aunque en estos mismos procedimientos pueden prepararse por técnicas convencionales y utilizarse otros anticuerpos monoclonales suscitados contra estos antígenos. Estos anticuerpos se utilizaron a una dilución de 1 :1.000. Se detectaron las proteínas de la cubierta y se produjo virus 24 h después de la transfección con ARN derivado del virus madre. En contraste, las proteínas virales EO y E2 se detectaron primero a las 48 horas después de la transfección en células tratadas con ARN derivado de pBVDdNI . El virus BDVdNI no fue rescatado hasta 72 horas después de la transfección.

Análisis del fenotipo Se utilizaron partidas de virus BVDdNI de uno de los primeros pases (pase 3) para inocular monocapas de células RD y MDBK. Estas células se compararon con controles inoculados con el virus madre. Las monocapas de células se fijaron con 80% de acetona a las 20 horas después de la transfección (células RD) o 24 horas después de la transfección (células MDBK). Después, las células fijadas se analizaron por inmunohistoquímica con el anticuerpo monoclonal CA3 específico para E2 a una dilución 1 :1 ,000 y se examinaron microscópicamente. Se encontró para ambos tipos de células que la velocidad de replicación del virus madre era considerablemente más rápida que la velocidad de replicación presentada por el virus BVDdNI .

Análisis del genotipo Se purificó ARN tanto de virus madre como de BVDdNI (pase 3) a partir de monocapas de RD infectadas, utilizando el reactivo de ARN Ultraspec™ (Biotect) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se realizaron experimentos RT/PCR utilizando perlas RT-PCR (Pharmacia Biotech) y los oligonucleótidos NADLE07 (-) y 5NTR3 (+). La secuencia y la localización del oligonucleótido 5NTR3 (+) ha sido descrita anteriormente. La secuencia del oligonucleótido NADLE07 (-) en la siguiente: 5'-CACTTGCATCCATCATACC-3' (sentido negativo, oligonucleótido 1 ,379-1 ,361 , SEQ ID N°:8). Este oligonucleótido está ubicado aproximadamente a 150 pb del extremo N-terminal de EO. Se encontró que RT/PCR de ARN madre dio un fragmento de 1 ,162 pb de tamaño. RT/PCR de ARN de BVDdNI dio un fragmento de 661 pb de tamaño, que es lo que se esperaba para un fragmento que tenía delecionado el gen de proteasa Npro. Los fragmentos RT/PCR creados a partir de los ARN tanto madre como de BVDdNI se secuenciaron. En ambos casos, la secuencia obtenida fue esperada y correspondía a la disposición de elementos indica en la figura 1. La secuencia completa de BVDdNI se indica en SEQ ID N°: 1 desde el nt 39 hasta el nt 12,116.

EJEMPLO 4 Estudio de eficacia de BVDdNI El objeto del presente estudio fue evaluar la capacidad de la vacuna que comprende BVDdNI para causar seroconversión en terneros. Quince animales (10 para vacunación en dos dosis con 5 centinelas) se asignaron aleatoriamente a una primera habitación. Otros diez animales se asignaron aleatoriamente a una segunda habitación (vacunación en una dosis sin centinelas). Se administró virus BVDdNI a los animales subcutáneamente a una dosis DICT50 de 107/animal en 2.0 ml de lisado de células MDBK. Los días de inmunización, los 5 animales centinelas designados se sacaron de su habitación. Los 10 terneros restantes se vacunaron con virus BVDdNI . Aproximadamente 24 horas después de la inmunización, los animales centinelas se devolvieron a la habitación de tratamiento. Se administró una segunda dosis de vacuna a los 10 primeros animales de una manera similar aproximadamente 28 días después de la primera dosis. Se tomaron las temperaturas rectales los días -1 ,0 (antes de la vacunación), 1, 2,3,4,5,6,7,8, 9,10 (todos los grupos) y los días 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33,34, 35,36,37 y 38 (para los animales del grupo que recibía 2 dosis). Se extrajeron muestras de sangre de los animales del grupo que recibía 2 dosis el día 0 y después semanalmente (es decir, los días 7,14,21,28,35,42,49,56,63,70,77,84 y 91).

Se detectaron anticuerpos neutralizantes en suero por el ensayo SN (utilizando el aislado 5960 de virus BVD para el tipo I, y el aislado 890 para el tipo II) para vigilar la protección homologa y heteróloga anticipada. No se observaron variaciones significativas ni en las observaciones generales ni en las temperaturas rectales. Ninguno de los animales centinelas experimentó seroconversión durante el curso del estudio (datos no indicados). Todos los animales vacunados con el virus BVDdNI experimentaban seroconversión, según se determinó por el ensayo de neutralización de suero de tipo I. Después de una vacunación con una sola dosis, el 60% de los animales obtuvieron un título positivo de 1 :8 o más en 28 días; y el 90% de los animales obtuvieron un título positivo de 1 :8 o más al día 35, y subsiguientemente retuvieron un alto título (figura 3A). En el ensayo de neutralización de suero de tipo II, el 70% de los animales fueron positivos al día 63 después de la vacunación (datos no indicados). Después de una vacunación en dos dosis, todos los animales obtuvieron un título positivo de 1 :64 o más en 7 días, como el indicado por el ensayo de neutralización de suero de tipo I, y subsiguientemente mantuvieron un nivel similar de seroconversión (figura 3A). Para el ensayo de neutralización de suero de tipo ll, la mayoría de los animales tuvieron un título positivo a los 7 días después de la segunda vacunación, y al menos el 60% de los animales obtuvieron un título positivo de 1 :8 o más en el día 28 (figura 3B). Estos resultados indican que el virus BVDdNI es capaz de replicarse en ganado vacuno e inducir un suero de neutralización positiva para ambos virus de tipo 1 y tipo 2, lo que avala el uso de este virus como un agente vacunal para la prevención de BVDV.

DEPÓSITOS DE MATERIALES BIOLÓGICOS El plásmido pBVDdNI se depositó en la American Type Culture Collection (ATCC), domiciliada en 10801 University Blvd. Manassas, VA, 20110, EE. UU., el 20 de octubre de 1998, y se le asignó el número de entrada ATCC 203354. Todas las patentes, solicitudes de patentes y trabajos publicados citados anteriormente se incorporan aquí íntegramente como referencia. La presente invención no está limitada en cuanto a su alcance por las realizaciones específicas descritas, que se proponen como simples ilustraciones de aspectos individuales de la invención. Dentro del alcance de la presente invención hay composiciones y métodos funcionalmente equivalentes. En realidad, diversas modificaciones de la invención, además de las indicadas en la técnica a partir de la descripción anterior. Se propone que tales modificaciones caigan dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

LISTA DE SECUENCIAS < no> PGI ZER PRODUCTS INC < 120> FORMAS ATENUADAS DEL VIRUS DE LA DIARREA VIRAL BOVINA <130> PC10435A <140> <141> <150> 60/107,908 <151> 1998-11-10 <160> 9 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 14078 <212> ADN <213 > Virus dc la diarrea viral bovina <400> 1 cacgcgtatc gatgaattcg ttaatacgac tcactatact atacgagaat tagaaaaggc 60 actcgtatac gtattgggca attaaaaata ataattaggc ctagggaaca aatccctctc 120 agcgaaggcc gaaaagaggc tagcca tgcc cttagtagga ctagcataat gaggggggta 180 gcaacagcgg tgagttcgtt ggatggctta agccctgagt acagggtagt cgtcagtggt 240 tcgacgcctt ggaataaagg tctcgagatg ccacgtgg?c gagggcatgc ccaaagcaca 300 tct taacct g agcgggggt gcccaggcaa aagcagt tt aaccgactgt tacgaataca 360 gcctgatagg gtgctgcaga ggcccactgt attgctacta aaaatctctg ctgtacatgg 420 cacatgtcag acacgaaaga agagggagca acaaaaaaga aaacacagaa acccgacaga 480 ctagaaaggg ggaaaatgaa aacagtgccc aaagaatctg aaaaagacag caaaactaaa 540 cctccggatg ctacaatagt ggtggaagga gtcaaatacc aggtgaggaa gaagggaaaa 600 accaagagta aaaacactca ggacggcctg taccataaca aaaacaaacc tcaggaatca 660 cgcaagaaac tggaaaaagc attgttggcg tgggcaataa tagctatagt tttgtttcaa 720 gttacaatgg gagaaaaca aacacagtgg aacctacaag ataatgggac ggaagggata 780 caacgggcaa tgttccaaag gggtgtgaat agaagtttac atggaacctg gccagagaaa 840 atctgtactg gcgtcccttc ccatctagcc accgatatag aactaaaaac aattcatggt 900 atgatggatg caagtgagaa gaccaactac acgtgttgca gact-caacg ccatgagtgg 960 aacaagcatg gttggtgcaa ctggtacaac attgaaccct ggattctagt catgaataga 1020 acccaagcca atctcactga gggacaacca ccaagggagt gcgcagtcac ttgtaggtat 1080 gatagggcta gtgacttaaa cgtggtaaca caagctagag atagccccac acccttaaca 1140 ggctgcaaga aaggaaagaa cttctccttt gcaggcatat tgatgcgggg cccctgcaac 1200 tttgaaatag ctgcaagtga tgtattattc aaagaacatg aacgcattag tatgttccag 1260 gataccactc tttaccttgt tgacgggttg accaactcct tagaaggtgc cagacaagga 1320 accgctaaac tgacaacctg gttaggcaag cagctcggga tactaggaaa aaagttggaa 1380 aacaagagta agacgtggct tggagcatac gctgcttccc c tactgtga tgtcgatcgc 1440 aaaattggct acatatggta tacaaaaaat tg acccctg cctgcttacc caagaacaca 1500 aaaattgtcg gccctgggaa atttggcacc aatgcagagg acggcaagat attacatgag 1560 atggggggtc acttgtcgga ggtactacta ctttctttag tggtgctgtc cgacttcgca 1620 ccggaaacag ctagtgtaat gtacctaatc ctacattttt ccatcccaca aagtcacgtt 1680 gatgtaatgg attgtgataa gacccagttg aacctcacag tggagctgac aacagctgaa 1740 gtaataccag ggtcggtctg gaatctaggc aaatatgtat gtataagacc aaattggtgg 1800 ccttatgaga caactgtagt gttggcattt gaagaggtga gccaggtggt gaagttagtg 1860 ttgagggcac tcagagattt aacacgcatt tggaacgctg caacaactac tgctttttta 1920 gtatgccttg ttaagatagt cagggggcca gatggtacag ggcattctgt ggctactatt 1980 gataacaggg gtacaagggc acttggattg caaacctgaa t ctcgtatg ccatagcaaa 2040 ggacgaaaga attggtcaac tgggggctga aggccttacc accacttgga aggaatactc 2100 acctggaatg aagctggaag acacaatggt cattgcttgg tgcgaagatg ggaagttaat 2160 gtacctccaa agatgcacga gagaaaccag atatctcgca atcttgcata caagagcctt 2220 gccgaccagt gtggtattca aaaaactctt tgatgggcga aagcaagagg atgtagtcga 2280 aatgaacgac aactttgaat ttggactctg cccatgtgat gccaaaccca tagtaagagg 2340 gaagttcaat acaacgctgc tgaacggacc ggccttccag atggtatgcc ccataggatg 2400 gacagggac gtaagctgta cgtcattcaa tatggacacc ttagccacaa ctgtggtacg 2460 gacatataga aggtctaaac cattccctca taggcaaggc tgtatcaccc aaaagaatct 2520 gggggaggat ctccataact gcatccttgg aggaaattgg acttgtgtgc ctggagacca 2580 actactatac aaagggggct ctattgaatc ttgcaagtgg tgtggctatc aatttaaaga 2640 gagtgaggga ctaccacact accccattgg caagtgtaaa ttggagaacg agactggtta 2700 caggctagta gacagtacct cttgcaatag agaaggtgtg gccatagtac cacaagggac 2760 attaaagtgc aagataggaa aaacaactgt acaggtcata gctatggata ccaaactcgg 2820 acctatgcct tgcagaccat atgaaatcat atcaagtgag gggcctgtag aaaagacagc 2880 gtgtactttc aactacacta agacattaaa aaataagtat tttgagccca gagacagcta 2940 ctttcagcaa tacatgctaa aaggagagta tcaatactgg tttgacctgg aggtgactga 3000 ccatcaccgg gattacttcg ctgagtccat attagtggtg gtagtagccc tcttgggtgg 3060 cagatatgta ctttggttac tggttacata catggt tta tcagaacaga aggccttagg 3120 gattcagtat ggatcagggg aagtggtgat gatgggcaac tgctaaccc ataacaatat 3180 tgaa'gtggtg acatacttct tgctgctgta cctactgctg agggaggaga gcgtaaagaa 3240 gtgggtctta ctcttatacc acatcttagt ggtacaccca a caaatctg taattgtgat 3300 cctactgatg attggggatg tggtaaaggc cgattcaggg ggccaagagt acttggggaa 3360 aatagacctc tgttttacaa cagtagtact aatcgtcata ggtttaatca tagctaggcg 3420 tgacccaact atagtgccac tggtaacaat aatggcagca ctgagggtca ctgaactgac 3480 ccaccagcct ggagttgaca tcgctgtggc ggtcatgact ataaccctac tgatggttag 3540 ctatgtgaca gattatttta gatataaaaa atggttacag tgcattctca gcctggtatc 3600 tgcggtgttc ttgataagaa gcctaatata cctaggtaga atcgagatgc cagaggtaac 3660 tatcccaaac tggagaccac taactttaat actattatat ttgatctcaa caacaattgt 3720 aacgaggtgg aaggttgacg tggctggcct attgttgcaa tgtgtgccta tcttattgct 3780 ggtcacaacc ttgtgggccg acttcttaac cctaatactg atcctgccta cctatgaatt 3840 ggttaaatta tactatctga aaactgttag gactgataca gaaagaag t ggctaggggg 3900 gatagactat acaagagttg actccatcta cgacgttgat gagagtggag agggcgtata 3960 tctttttcca tcaaggcaga aagcacaggg gaatttttct atactcttgc cccttatcaa 4020 agcaacactg ataagttgcg tcagcagtaa atggcagcta atatacatga gttacttaac 4080 tttggacttt atgtactaca tgcacaggaa agttatagaa gagatctcag gaggtaccaa 4140 cataatatcc aggttagtgg cagcactcat agagctgaac tggtccatgg aagaagagga 4200 gagcaaaggc ttaaagaagt tttatctatt gtctggaagg ttgagaaac taataataaa 4260 acataaggta agsaatgaga ccgtggcttc ttggtacggg saggaggaag tctacggtat 4320 gccaaagatc atgactataa tcaaggccag tacactgagt aagagcaggc actgcataat 4380 atgcactgta tgtgagggcc gagagtggaa aggtggcacc tscccaaaat gtggacgcca 4440 tgggaagccg ataacgtgtg ggatgtcgct agcagatt tt gaagaaagac actataaaag 4500 aatctttata agggaaggca actttgaggg tatgtgcagc cgatgccagg gaaagcatag 4560 gaggtttgaa atggaccggg aacctaagag tgccagatac tgtgct gagt gtaataggct 4620 gcatcctgct gaggaaggtg acttttgggc agagtcgagc a t gt t gggcc tcaaaatcac 4680 ctactttgcg ctgatggatg gaaaggtgta tgatatcaca gagtgggctg gatgccagcg 4740 tgtgggaatc tcccca?rata cccacagagt cccttgtcac at ctcat ttg gttcacggat 4800 gcctttcagg caggaa taca atggctttgt acaatatacc gct agggggc aactatttct 4860 gagaaacttg cccgtactgg caactaaagt aaaaatgctc a ggt aggca accttggaga 4920 agaaattggt aatct ggaac atcttgggtg gatcctaagg gggcctgccg tgtgtaagaa 4980 gatcacagag cacgaaaaat gccacattaa tatactggat aaactaaccg catttttcgg 5040 gatcatgcca agggggacta cacccagagc cccggtgagg t tccctacga gcttactaaa 5100 agtgaggagg ggtctggaga ctgcctgggc ttacacacac caaggcggga taagttcagt 5160 cgaccatgta accgccggaa aagatctact ggtctgtgac agcatgggac gaactagagt 5220 ggtttgccaa agcaacaaca ggttgaccga tgagacagag tatggcctca agactgactc 5280 agggtgccca gacggtgcca gatgttatgt gttaaatcca g=ggccgtta acatatcagg 5340 atccaaaggg gcagtcgttc acctccaaaa gacaggtgga gaatt cacgt gtgtcaccgc 5400 atcaggcaca ccggctttct tcgacctaaa aaacttgaaa ggatggtcag gcttgcctat 5460 atttgaagcc tccagcggga gggtggttgg cagagtcaaa g agggaaga atgaagagtc 5520 taaacctaca aaaataatga gtggaatcca gaccgtctca aaaaacagag cagacctgac 5580 cgagatggtc aagaagataa ccagcatgaa caggggagac ttcaagcaga ttactttggc 5640 aacaggggca ggcaaaacca cagaactccc aaaagcagtt atagaggaga taggaagaca 5700 caagagagta ttagttctta taccattaag ggcagcggca gagtcagtct accagtatat 5760 gagattgaaa cacccaagca tctcttttaa cctaaggata ggggacatga aagaggggga 5820 catggcaacc gggataacct atgcatcata cgggtact tc tgccaaatgc ctcaaccaaa 5880 gctcagagct gctatggtag aatactcata catattctta gatgaatacc attgtgccac 5940 tcctgaacaa ctggcaatta tcgggaagat ccacagattt t cagagagta taagggttgt 6000 cgccatgact gccacgccag cagggtcggt gaccacaaca gstcaaaagc acccaataga 6060 ggaattcata gcccocgagg taatgaaagg ggaggat ct t gg agtcagt tccttgatat 6120 agcagggtta aaaataccag tggatgagat gaaaggcaa t atgt tggtt t ttgtaccaac 6180 gagaaacatg gcagtagagg tagcaaagaa gctaaaagct aagggctata actctggata 6240 ctattacagt ggagaggatc cagccaatct gagagttgtg acatcacaat ccccctatgt 6300 aatcgtggct acaaatgcta ttgaatcagg agtgacacta cagatttgg acacggttat 6360 agacacgggg ttgaaatgtg aaaagagggt gagggtat ca tcaaagatac ccttcatcgt 6420 aacaggcctt aagaggatgg ccgtgactgt gggtgagcag gcgcagcgta ggggcagagt 6480 aggtagagtg aaacccggga ggtattatag gagccaggaa acagcaacag ggtcaaagga 6540 ctaccactat gacctcttgc aggcacaaag atacgggatt gaggatggaa tcaacgtgac 6600 gaaatccttt agggagatga attacgattg gagcctatac gaggaggaca gcctactaat 6660 aacccagctg gaaatactaa ataatctact catctcagaa gacttgccag ccgctgttaa 6720 n gaacataatg gccaggactg atcacccaga gccaatccaa ct tgcataca acagctatga 6780 agtccaggtc ccggtcctat tcccaaaaat aaggaatgga gaagtcacag acacctacga 6840 aaattactcg tttctaaatg ccagaaagtt aggggagga gtgcccgtgt atatctacgc 6900 tactgaagat gaggatctgg cagttgacct cttagggcta gactggcctg atcctgggaa 6960 ccagcaggta gtggagactg gtaaagcact gaagcaagtg accgggttgt cctcggctga 7020 aaatgcccta ctagtggctt tatttgggta tgtgggtta c caggct ctct caaagaggca 7080 tgtcccaatg ataacagaca ta tataccat cgaggaccag agactagaag acaccaccca 7140 cc ccagta t gcacccaacg ccataaaaac cgatgggaca gagact gaac tgaaagaact 7200 ggcgtcgggt gacgtggaaa aaatcatggg ag3c9catttca gattatgcag ctgggggact 7260 ggagtttgtt aaatcccaag cagaaaagat aaaaacagct cctttgttta aagaaaacgc 7320 agaagccgca aaaggg atg tccaaaaa cattgactca ttaattgaaa ataaagaaga 7380 aataatcaga tatggtttgt ggggaacaca cacagcacta tacaaaagca tagctgcaag 7440 actggggcat gaaacagcgt ttgccacact agtgttaaag tggctagctt ttggagggga 7500 atcagtgtca gaccacgtca agcaggcggc agttgattta gtggtctatt atgtgatgaa 7560 taagccttcc ttcccaggtg actccgagac acagcaagaa gggaggcgat tcgtcgcaag 7620 cctgttcatc tccgcacrgg caacctacac atacaaaact tggaattacc acaatctctc 7680 taaagtggtg gaaccagccc tggcttacct cccctatgct accagcgcat taaaaatgtt 7740 caccccaacg cggctggaga gcgtggtgat actgagcacc acgatatata aaacatacct 7800 ctctataagg aaggggaaga gtgatggatt gctgggtacg gggataagtg cagccatgga 7860 aatcctgtca caaaacccag tatcggtagg tatatctgtg atgttggggg taggggcaat 7920 cgctgcgcac aacgctattg agtccagtga acagaaaagg accctactta tgaaggtgtt 7980 tgtaaagaac ttcttggatc aggctgcaac agatgagctg gtaaaagaaa acccagaaaa 8040 aattataatg gccttat tg aagcagtcca gacaattggt aaccccctga gactaatata 8100 ccacctgtat ggggtttact acaaaggttg ggaggccaag gaactatctg agaggacagc 8160 aggcagaaac ttattcacat tgataatgtt tgaagccttc gagttattag ggatggactc 8220 acaagggaaa ataaggaacc tgtccggaaa ttacattttg gatttgatat acggcctaca 8280 caagcaaatc aacagagggc tgaagaaaat ggtactgggg tgggcccctg caccctttag 8340 ttgtgactgg acccctagtg acgagaggat cagattgcca acagacaact atttgagggt 8400 agaaaccagg tgcccatgtg gctatgagat gaaagctttc aaaaatgtag gtggcaaact 8460 taccaaagtg gaggagagcg ggcctttcct atgtagaaac agacctggta ggggaccagt 8520 caactacaga gtcaccaagt attacgatga caacctcaga gagataaaac cagtagcaaa 8580 gttggaagga caggtagagc actactacaa aggggtcaca gcaaaaattg actacagtaa 8640 aggaaaaatg ctcttggcca ctgacaagtg ggaggtggaa catggtgtca taaccaggtt 8700 agctaagaga tatactgggg tcgggttcaa tggtgcatac ttaggtgacg agcccaatca 8760 ccgtgctcta gtggagaggg actgtgcaac tataaccaaa aacacagtac agtttctaaa 8820 aatgaagaag gggtgtgcgt tcacctatga cctgaccatc tccaatctga ccaggctcat 8880 cgaactagta cacaggaaca atcttgaaga gaaggaaata cccaccgcta cggtcaccac 8940 atggctagct tacaccttcg tgaatgaaga cgtagggact ataaaaccag tactaggaga 9000 gagagtaatc cccgaccctg tagttgatat caatttacaa ccagaggtgc aagtggacac 9060 gtcagaggtt gggatcacaa taattggaag ggaaaccctg atgacaacgg gagtgacacc 9120 tgtcttggaa aaagtagagc ctgacgccag cgacaaccaa aactcggtga agatcgggtt 9180 ggatgagggt aattacccag ggcctggaat acagacacat acactaacag aagaaataca 9240 caacagggat gcgaggccct tcatcatgat cctgggctca aggaattcca tatcaaatag 9300 ggcaaagact gctagaaata taaatctgta cacaggaaat gaccccaggg aaatacgaga 9360 cttgatggct gcagggcgca tgttagtagt agcactgagg gatgtcgacc ctgagctgtc 9420 tgaaatggtc gatttcaagg ggactttttt agatagggag gccctggagg ctctaagtct 9480 cgggcaacct aaaccgaagc aggttaccaa ggaagctgtt aggaatttga tagaacagaa 9540 aaaagatgtg gagatcccta actggtttgc atcagatgac ccagtatttc tggaagtggc 9600 cttaaaaaat gataagtact acttagtagg agatgttgga gagctaaaag atcaagctaa 9660 agcacttggg gccacggatc agacaagaat tataaaggag gtaggctcaa ggacgtatgc 9720 catgaagcta tctagctggt tcctcaaggc atcaaacaaa cagatgagtt taactccact 9780 gtttgaggaa ttgttgctac ggtgcccacc tgcaactaag agcaataagg ggcacatggc 9840 atcagcttac caattggcac agggtaactg ggagcccctc ggttgcgggg tgcacctagg 9900 tacaatacca gccagaaggg tgaagataca cccatatgaa gcttacctga agttgaaaga 9960 tttcatagaa gaagaagaga agaaacctag ggttaaggat acagtaataa gagagcacaa 10020 caaatggata cttaaaaaaa taaggtttca aggaaacctc aacaccaaga aaatgctcaa 10080 cccagggaaa cta ctgaac agttggacag 40 ggaggggcgc aagaggaaca tctacaacca 10140 ccagattggt actataatgt caagtgcagg cataaggctg gagaaattgc caatagtgag 10200 ggcccaaacc gacaccaaaa cctttcatga ggcaataaga gataagatag acaagagtga 10260 aaaccggcaa aatccagaat tgcacaacaa attgttggag attttccaca cgatagccca 10320 acccaccctg aaacacacct acggtgaggt gacgtgggag caacttgagg cgggggtaaa 10380 tagaaagggg gcagcaggct tcctggagaa gaagaacatc ggagaagtat tggattcaga 10440 aaagcacctg gtagaacaat tggtcaggga tctgaaggcc gggagaaaga taaaatatta 10500 tgaaactgca ataccaaaaa atgagaagag agatgtcagt gatgactggc aggcagggga 10560 cctggtggtt gagaagaggc caagagttat ccaatac ct gaagccaaga caaggctagc 10620 catcactaag gtcatgtata actgggtgaa acagcagccc gttgtgattc caggatatga 10680 aggaaagacc cccttgttca acatctttga taaagtgaga aaggaatggg actcgttcaa 10740 tgagccagtg gccgtaagtt ttgacaccaa agcctgggac actcaagtga ctagtaagga 10800 tctgcaactt attggagaaa tccagaaata ttactataag aaggagtggc acaagttcat 10860 tgacaccatc accgaccaca tgacagaagt accagttata acagcagatg gtgaagtata 10920 tataagaaat gggcagagag ggagcggcca gccagacaca agtgctggca acagcatgtt 10980 aaatgtcctg acaatgatgt acggcttctg cgaaagcaca ggggtaccgt acaagagttt 11040 caacagggtg gcaaggatcc acgtctgtgg ggatgatggc ttcttaataa ctgaaaaagg 11100 gttagggctg aaa tttgcta acaaagggat gcagattctt catgaagcag gcaaacctca 11160 gaagataacg gaaggggaaa agatgaaagt tgcctataga tttgaggata tagagttctg 11220 ttctcatacc ccagtccctg ttaggtggtc cgacaacacc agtagtcaca tggccgggag 11280 agacaccgct gtgatactat caaagatggc aacaagattg gattcaagtg gagagagggg 11340 taccacagca tatgaaaaag cggtagcctt cagtttcttg ctgatgtatt cctggaaccc 11400 gcttgttagg aggatttgcc tgttggtcct ttcgcaacag ccagagacag acccatcaaa 11460 acatgccact tattattaca aaggtgatcc aataggggcc tataaagatg taataggtcg 11520 gaatctaagt gaactgaaga gaacaggctt tgagaaattg gcaaatctaa acctaagcct 11580 gtccacgttg ggggtctgga ctaagcacac aagcaaaaga ataattcagg actgtgttgc 11640 cattgggaaa gaagagggca actggctagt taagcccgac aggctgatat ccagcaaaac 11700 tggccactta tacatacctg ataaaggctt tacattacaa ggaaagcatt atgagcaact 11760 gcagctaaga acagagacaa acccggtcat gggggttggg actgagagat acaagttagg 11820 tcccatagtc aatctgctgc tgagaaggtt gaaaatt tg ctcatgacgg ccgtcggcgt 11880 cagcagctga gacaaaatgt atatattgta aataaattaa tccatgtaca tagtgtatat 11940 aaatatagtt gggaccgtcc acctcaagaa gacgacacgc ccaacacgca cagctaaaca 12000 gtagtcaaga ttatctacct caagataaca ctacatttaa tgcacacagc actttagctg 12060 tatgaggata cgcccgacgt ctatagttgg actagggaag acctctaaca- gcccccgcgg 12120 atctagagga gcatgcgacg tcaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta 12180 tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat 12240 aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc 12300 ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga 12360 aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca 12420 acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg t ttccaatg atgagcactt 12480 ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg 12540 gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc 12600 atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata 12660 acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt 12720 tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag 12780 ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca 12840 aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg 1290C aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg 12960 ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag 13020 atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg 13080 aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag 13140 accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga 13200 tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt 13260 tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc 13320 tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc 13380 cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac 13440 caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac 13500 cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt 13560 cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct 13620 gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat 13680 acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt 13740 atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg 13800 cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt 13860 gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt 13920 tcctggcctt ttsctggcct tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg 13980 tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg 14040 agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg aagagcgc 14078 <210> 2 <211> 20 <212> ADN <213 > Secuencia artificial <400> 2 aaaggtctcg agatgccacg 20 <210> 3 <211> 39 <212> ADN < 213 > Secuencia artificial <400> 3 gtctgacatg tgccatgtac agcagagatt tttagtagc 39 <210> 4 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia artificial <400> 4 cacatgtcag acacgaaaga agagggagc 29 <210> 5 <211> 22 <212> ADN <213 > Secuencia artificial caggtttgca atccaagtgc ce 22 <210> 6 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artíffcial < _00> 6 ggagcatacg ctgcttcccc 20 <210> 7 <211> 21 <212> ADN < 213 > Secuencia artificial <400> 7 gccttgccta tgagggaatg g 21 <210> 8 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia artificial <400> 8 cacttgcatc catcatacc 19 <210> 9 '<211> 27 <212> ADN <213> Virus de la diartea viral bovina <400> 9 tgtacatggc acatgtcaga caegaaa 27

Claims (36)

NOVEDAD DE LÁ INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un virus atenuado de la diarrea viral bovina (BVD), en el dicho virus tiene una secuencia de ácido nucleico genómico que comprende la secuencia de SEQ ID N°: 1 desde el nt 39 hasta el nt 12,116, o una variante degenerada de la misma.

2.- El virus BVD atenuado de la reivindicación 1 , en el que dicho virus tiene una secuencia de ácido nucleico genómico que consta esencialmente de la secuencia de SEQ ID N°:1 desde nt 39 hasta el nt 12,116, o una variante degenerada del mismo.

3.- El virus de la reivindicación 1 , en forma substancialmente purificada.

4.- Una célula hospedante, infectada con el virus de la reivindicación 1.

5.- Virus descendiente, producido por la célula hospedante de la reivindicación 4.

6.- Una vacuna que comprende el virus BVD atenuado de la reivindicación 1 y un vehículo veterinariamente aceptable.

7.- Una molécula de ácido nucleico, que comprende la secuencia de SEQ ID N°: 1 desde el nt 39 hasta el nt 12,116, o una variante degenerada de la misma.

8.- La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 7, que consta esencialmente de la secuencia de SEQ ID N°:1 desde el nt 39 hasta el nt 12,116, o una variante degenerada de la misma.

9.- La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 7, en forma substancialmente purificada.

10.- Un vector, que comprende un elemento codificante característico que consta esencialmente de la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 7.

11.- El vector de la reivindicación 10, que es el plásmido pBVDdNI (ATCC N° 203354).

12.- Una molécula hospedante transportada o transfectada con la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 7 o el vector de la reivindicación 10.

13.- Virus BVD descendiente, producido por la célula hospedante de la reivindicación 12.

14.- Una vacuna, que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 7, y un vehículo veterinariamente aceptable.

15.- Un método para modificar un genoma viral de BVD de tipo salvaje, aislado, para hacerlo adecuado para uso en una vacuna, que comprende mutar el ácido nucleico genómico de dicho virus de tipo salvaje aislado para inactivar el gen de proteasa Npr0.

16.- El método de la reivindicación 15, en el que dicha inactivación de dicho gen de proteasa Npro se obtiene por un procedimiento que comprende: a) someter a transcripción inversa el ARN genómico de dicho virus BVD de tipo salvaje para formar ADNc; b) clonar el ADNc de la etapa a); c) mutar el gen de proteasa Npro en el ADNc clonado de la etapa b) para que dicho gen no pueda formar un producto génico completamente activo; y d) clonar el ADNc mutado de la etapa c).

17.- El método de la reivindicación 16, en el que dicho gen de proteasa Npro se inactiva delecionando toda o parte de su secuencia de dicho genoma viral BVD de tipo salvaje.

18.- Un genoma viral BVD, preparado por el método de la reivindicación 15.

19.- Un vector, que comprende un elemento de secuencia característica que consta esencialmente del genoma viral BVD de la reivindicación 18.

20.- Una célula hospedante, transfectada con el genoma viral de la reivindicación 18 o el vector de la reivindicación 19.

21.- Virus BVD descendiente, producido por la célula hospedante de la reivindicación 20.

22.- Una vacuna, que comprende el genoma viral de la reivindicación 18, y un vehículo veterinariamente aceptable.

23.- Un método para atenuar un virus BVD de tipo salvaje con objeto de hacerlos adecuado para uso en una vacuna, que comprende mutar el ácido nucleico genómico de dicho virus para inactivar el gen de proteasa Npro

24.- El método de la reivindicación 23, en el que la atenuación se obtiene por un procedimiento que comprende: a) aislar dicho virus BVD de tipo salvaje; b) clonar el ácido nucleico genómico del virus aislado de la etapa a); c) mutar el ácido nucleico genómico clonado de la etapa b) con objeto de inactivar el gen de proteasa Npro; y d) transformar o transfectar el ácido nucleico mutado de la etapa c) en una célula hospedante para producir el virus atenuado.

25.- El método de la reivindicación 24, en el que dicho gen de proteasa Npro se inactiva delecionando toda o parte de su secuencia de dicho genoma viral BVD de tipo salvaje.

26.- Un virus BVD atenuado, preparado por el método de la reivindicación 23.

27.- Una célula hospedante, infectada con el virus atenuado de la reivindicación 26.

28.- La célula hospedante infectada de la reivindicación 27, en la que la célula hospedante es una célula MDBK (ATCC CCL-22).

29.- Virus descendiente, producido por la célula hospedante de la reivindicación 28.

30.- Una vacuna que comprende el virus BVD atenuado de la reivindicación 26, y un vehículo veterinariamente aceptable.

31.- El uso de a) el virus BVD atenuado de conformidad con la reivindicación 1 o b) la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 7 o c) el genoma viral de conformidad con la reivindicación 18 o d) el virus BVD atenuado de conformidad con la reivindicación 26, cualquiera de ellos en combinación con un vehículo veterinariamente aceptable para la fabricación de una vacuna para inducir una respuesta inmune en ganado vacuno a una dosificación suficiente para inducir inmunidad protectora contra una infección subsiguiente con virus BVD.

32.- El uso de conformidad con la reivindicación 31 , en el que la inmunidad protectora es el resultado de una respuesta inmune tanto humoral como celular.

33.- El uso de a) el virus de conformidad con la reivindicación 1 o b) la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 7 o c) el vector de conformidad con la reivindicación 10 o d) el genoma viral de conformidad con la reivindicación 18 o e) el vector de conformidad con la reivindicación 19 o f) el virus atenuado de conformidad con la reivindicación 26 para la fabricación de una composición farmacéutica para inducir la producción de un anticuerpo al virus BVD en un animal capaz de hacer anticuerpo.

34.- El uso de conformidad con la reivindicación 33, en el que dichos anticuerpos se producen en ganado vacuno.

35.- El uso de conformidad con la reivindicación 33,en donde dicho anticuerpo es aislado de dicho animal.

36.- Un anticuerpo preparado por el método de la reivindicación 33.