MXPA99009761A - Composicion que comprende metilesterasa de pectina y dos substratos - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una composición de gelificación, caracterizada porque comprende una metilesterasa de pectina (PME), un substrato de PME y una pectina tratada con PME de altoéster o un derivado de pectina tratado con PME de altoéster, cuya pectina tratada con PME de altoéster o derivado de pectina tratado con PME de altoéster es sensible a iones de calcio, en donde ni el substrato de PME ni la pectina tratada con PME de altoéster o el derivado de pectina tratado con PME de altoéster se origina in situ uno del otro.

Description

COMPOSICIÓN QUE COMPRENDE METILESTERASA DE PECTINA Y DOS SUBSTRATOS MEMORIA DESCRIPTIVA La presente invención se refiere a una composición. En particular, la presente invención se refiere a una composición para usarse como, o en la preparación de un artículo alimenticio. Más en particular, la presente invención se refiere a una composición para usarse como, o en la preparación de un artículo alimenticio que comprende o está hecho de una pectina o un derivado de pectina. La pectina es un artículo de consumo importante en la industria actual. Por ejemplo, se puede usar en la industria alimenticia como un agente espesante o gelificante, tal como en la preparación de mermeladas. La pectina es un polisacárido estructural encontrado comúnmente en forma de protopectina en las paredes de células vegetales. La estructura de base de la pectina comprende residuos de ácido galacturónico a-1-4 enlazados que son interrumpidos con un número pequeño de unidades de a-L-ramnosa 1 ,2 enlazadas. Además, la pectina comprende regiones altamente ramificadas con una cadena de ramnogalacturonano casi alternante. Estas regiones altamente ramificadas contienen también otras unidades de azúcar (tales como D-galactosa, L-arabinosa y xilosa) unidas por enlaces glucosídicos a los átomos C3 o C4 de las unidades de ramnosa o a los átomos C2 o C3 de las unidades de ácido galacturónico. Las cadenas largas de los residuos de ácido galacturónico a-1-4 enlazados se conocen comúnmente como regiones "lisas", mientras que las regiones altamente ramificadas se conocen comúnmente como las "regiones pilosas". Algunos de los grupos carboxilo de los residuos galacturónicos son esterificados (por ejemplo, los grupos carboxilo son metilados). Típicamente, la esterificación de los grupos carboxilo ocurre después de la polimerización de los residuos de ácido galacturónico. Sin embargo, es extremadamente raro que todos los grupos carboxilo sean esterificados (por ejemplo, metilados). Normalmente, el grado de esterificación variará de 0-90%. Si 50% o más de los grupos carboxilo son esterificados entonces la pectina resultante es conocida como "pectina de alto éster" ("pectina HE" para abreviar) o una "pectina de alto metoxüo". Si menos del 50% de los grupos carboxilo son esterificados entonces la pectina resultante es conocida como "pectina de bajo éster" ("pectina LE" para abreviar) o una "pectina de bajo metoxilo". Si 50% de los grupos carboxilo son esterificados entonces la pectina resultante es conocida como "pectina de medio éster" ("pectina ME" para abreviar) o una "pectina de medio metoxilo". Si la pectina no contiene ninguno -o sólo pocos- grupos esterificados, se le conoce normalmente como ácido péctico. La estructura de la pectina, en particular el grado de esterificación (por ejemplo, metilación), rige muchas las propiedades físicas y/o químicas resultantes de la pectina. Por ejemplo, la gelificación de la pectina depende de la naturaleza química de la pectina, especialmente del grado de esterificación. Sin embargo, además, la gelificación de la pectina depende también del contenido de sólidos solubles, del pH y de la concentración de iones de calcio. Con respecto a estos últimos, se cree que los iones de calcio forman complejos con los grupos carboxilo libres, particularmente aquéllos en una pectina LE. Las enzimas pécticas se clasifican de acuerdo con su modo de ataque en la parte de galacturonano de la molécula de pectina. Una revisión de algunas enzimas pécticas se ha preparado por Pilnik y Voragen (Food Enzymology, Ed.: P.F.Fox; Elsevier; (1991 ); pp: 303-337). En particular, las metilesterasas de pectina (EC 3.1.1.1 1 ), conocidas de otra manera como PMEs, desesterifican pectinas HE o pectinas LE o ácidos pécticos. En contraste, y a manera de ejemplo, las despolimerasas de pectina separan los enlaces glucosídicos entre residuos de éster metílico de galacturonosilo. En más detalle, la actividad de PME produce grupos carboxilo libres y metanol libre. El incremento en grupos carboxilo libres puede monitorearse fácilmente mediante titulación automática. A este respecto, estudios anteriores han mostrado que algunas PMEs desesterifican pectinas de una manera aleatoria, en el sentido de que desesterifican cualquiera de los residuos de ácido galacturónico esterificados (por ejemplo, metilados) en una o más de una de las cadenas de pectina. Ejemplos de PMEs que desesterifican aleatoriamente pectinas pueden obtenerse de fuentes micóticas tales como Aspergillus aculeatus (véase WO 94/25575) y Aspergiiius japonicus (Ishii y otros 1980 J Food Sci 44 pp 61 1-14). Barón y otros (1980 Lebensm. Wiss. M-Technol 3 pp 330-333) aparentemente han aislado una PME micótica de Aspergillus niger. Se reporta que esta PME micótica tiene un peso molecular de 39000 D, un punto isoeléctrico de 3.9, un pH óptimo de 4.5 y un valor Km (mg/ml) de 3. En contraste, se sabe que algunas PMEs desesterifican pectinas por bloques, en el sentido de que se cree que atacan a las pectinas ya sea en extremos no reductores o cerca de grupos carboxilo libres y después proceden a lo largo de las moléculas de pectina mediante un mecanismo de cadena individual, creando de esta manera bloques de unidades de ácido galacturónico no esterificados que pueden ser sensibles al calcio. Ejemplos de dichas enzimas que enzimáticamente desesterifican a la pectina por bloques son las PMEs vegetales. Se ha sugerido que existen hasta 12 isoformas de PME en cítricos (Pilnik W. y Voragen. A.G.J. (Food Enzymology (Ed.: P.F.Fox); Elsevier; (1991 ); pp: 303-337). Estas isoformas tienen diferentes propiedades. La distribución aleatoria o por bloques de los grupos carboxilo libres puede distinguirse mediante cromatografía de intercambio de iones de alto rendimiento (Schols y otros Food Hydrocolloids 1989 6 pp 115-121 ). Estas pruebas se usan comúnmente para revisar una actividad de PME residual no deseable en jugos de cítricos después de la pasteurización debido a que la PME residual puede ocasionar lo que se conoce como "pérdida de turbidez" en el jugo de naranja, además de una acumulación de metanol en el jugo.

Los substratos de PME, tales como las pectinas obtenidas de fuentes vegetales naturales, están generalmente en forma de una pectina de alto éster que tiene un DE de aproximadamente 70%. Debe añadirse azúcar a los extractos que contengan estos substratos de PME de alto éster para proveer sólidos solubles suficientes como para inducir la gelificación. Normalmente se requiere un mínimo de 55% de sólidos solubles. La sinéresis tiende a ocurrir más frecuentemente cuando el porcentaje de sólidos solubles es de menos del 55%. Cuando ocurre la sinéresis, debe usarse aditivos costosos para inducir la gelificación. Versteeg y otros (J Food Sci 45 (1980) pp 969-971 ) aparentemente han aislado una PME de naranja. Se reporta que esta PME vegetal ocurre en varias isoformas de propiedades diferentes. La ¡soforma I tiene un peso molecular de 36000 D, un punto isoeléctrico de 10.0, un pH óptimo de 7.6 y un valor Km (mg/ml) de 0.083. La isoforma II tiene un peso molecular de 36200 D, un punto isoeléctrico de 1 1 .0, un pH óptimo de 8.8 y un valor Km (mg/ml) de 0.0046. La isoforma lll (HMW-PE) tiene un peso molecular de 54000 D, un punto isoeléctrico de 10.2, un pH óptimo de 8 y un valor Km (mg/ml) de 0.041. Sin embargo, hasta la fecha han habido datos de secuencia muy limitados para dichas PMEs. De acuerdo con Pilnik y Voragen (ibid), las PMEs pueden encontrarse en un número de otras plantas superiores, tales como manzana, albaricoque, aguacate, plátano, moras, lima, toronja, mandarina, cerezas, grosellas, uvas, mango, papaya, maracuyá, durazno, pera, ciruelas, frijoles, zanahorias, colilflor, pepino, cebollas, chícharo, papa, rábano y tomate. Sin embargo, de igual manera, hasta la fecha ha habido muy pocos datos de secuencia para dichas PMEs. Una PME vegetal se ha reportado en WO-A-97/03574 (cuyos contenidos se incorporan en la presente a manera de referencia). Esta PME tiene las siguientes características: un peso molecular de aproximadamente 36 kD a aproximadamente 64 kD; un pH óptimo de pH 7-8 cuando se mide con pectina de lima al 0.5% en NaCI a 0.15 M; una temperatura óptima de por lo menos 50°C; una estabilidad de temperatura en escala de 10o- por lo menos 40°C; un valor Km de 0.07%; un máximo de actividad a niveles de NaCI de aproximadamente 0.25 M; un máximo de actividad a niveles de Na2SO de aproximadamente 0.2 M y un máximo de actividad a niveles de NaN?3 de aproximadamente 0.3 M. Otra PME se ha reportado en WO 97/31102 (cuyos contenidos se incorporan en la presente a manera de referencia). Las PMEs tienen usos importantes en la industria. Por ejemplo, pueden usarse en, o como agentes secuestrantes para iones de calcio. A este respecto, y de conformidad con Pilnik y Voragen {ibid), puede prepararse alimento para ganado añadiendo una suspensión de hidróxido de calcio a cascaras de cítricos después de la extracción del jugo. Después de la adición, el alto pH y los iones de calcio activan cualquier PME nativa en la cascara ocasionando la rápida desesterificación de la pectina, y ocurre la coagulación de pectato de calcio. La fase líquida unida se libera y se prensa fácilmente, por lo que sólo una fracción del contenido de agua original necesita ser removida mediante secado térmico costoso. El líquido de prensado se usa después como un elemento para animales. Como se indicó antes, se ha obtenido una PME de Aspergillus aculeatus (WO 94/25575). Aparentemente, esta PME puede usarse para mejorar la firmeza de un material que contenga pectina, o para desmetilar la pectina, o para incrementar la viscosidad de un material que contenga pectina. También se ha vuelto común usar PME en la preparación de artículos alimenticios preparados a partir de materiales de frutas o vegetales que contengan pectina -tales como mermeladas o conservas. Por ejemplo, WO-A-94/25575 reporta además acerca de la preparación de mermelada de naranja y pasta de tomate usando PME obtenida de Aspergillus aculeatus. JP-A-63/209553 describe geles que se obtienen mediante la acción de metilesterasa de pectina, en presencia de un ion de metal polivalente, sobre un polisacárido péctico que contiene como ei componente principal una cadena de poli a-1 ,4-D-galacturónido de alto metoxilo y un procedimiento para su producción. Pilnik y Voragen {ibid) listan usos de PMEs endógenas que incluyen su adición a jugos de frutas para reducir la viscosidad del jugo si éste contiene demasiada pectina derivada de la fruta, su adición como soluciones de pectinasa a las burbujas de gas en el albedo de frutas cítricas que han sido calentadas a una temperatura central de 20°C a 40°C para facilitar la remoción de la cascara y otra membrana de los segmentos de jugo intactos (US-A- 4284651 ), y su uso para proteger y mejorar la textura y firmeza de varias frutas y vegetales procesados tales como manzana (Wiley & Lee 1970 Food Technol 24 1 168-70), tomates enlatados (Hsu y otros 1965 J Food Sci 30 pp 583-588) y papas (Bartolomé & Hoff 1972 Agrie Food Chem 20 262-266). Glahn y Rolin (1994 Food Ingredients Europe, Conf Proceedings pp 252-256) reportan acerca de la aplicación hipotética de la "pectina GENU tipo YM-100" industrial para interactuar con bebidas de leche agria. No se presentan detalles en absoluto acerca de cómo se prepara la pectina GENU tipo YM-100. EP-A0664300 un método de fraccionado químico para preparar pectina sensible a calcio. Se menciona que esta pectina sensible a calcio es ventajosa para la industria alimenticia. De esta manera, las pectinas y las pectinas desesterificadas, además de las PMEs, tienen una importancia industrial. Se ha encontrado ahora que un beneficio derivado del uso de una PME en la preparación de, por ejemplo, un artículo alimenticio dependerá hasta cierto punto de la calidad y cantidad y tipo de la PME usada, y también de la calidad y la cantidad y tipo de los substratos de PME -en particular pectina- que puedan estar presentes en el materiales usado para preparar el artículo alimenticio. Por ejemplo, si el substrato es un material de fruta, o un material vegetal, entonces la cantidad y/o estructura de pectina natural en ese substrato será diferente para tipos diferentes de material de fruta o material vegetal. Esto también se origina a partir de los datos presentados en WO-A- 94/25575, especialmente figura 7, en donde se observa claramente que su sistema de PME no es ideal. De acuerdo con la presente invención, se ha encontrado ahora que la adición de un substrato de PME adicional hace posible derivar aún más beneficios del uso de una PME en la preparación de, por ejemplo, un artículo alimenticio. A este respecto, la adición de un substrato de PME adicional superará cualquier problema asociado con cantidades y calidades diferentes de substratos de PME que puedan encontrarse en los materiales usados en la preparación de, por ejemplo, artículos alimenticios. De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se provee una composición que comprende una metilesterasa de pectina ("PME"); un primer substrato de PME y un segundo substrato de PME, en donde ni el primer substrato de PME ni el segundo substrato de PME se originan in situ uno del otro. De acuerdo con un segundo aspecto de la presente invención, se provee un método para preparar una composición, el método comprende formar una mezcla de una PME; un primer substrato de PME y un segundo substrato de PME; en donde ni el primer substrato de PME ni el segundo substrato de PME se originan in situ uno del otro. De acuerdo con un tercer aspecto de la presente invención, se provee un procedimiento que comprende añadir a un primer substrato de PME, PME y un segundo substrato de PME; en donde ni el primer substrato de PME ni el segundo substrato de PME se originan in situ uno del otro. De acuerdo con un cuarto aspecto de la presente invención, se provee un artículo alimenticio que comprende o que es preparado a partir o por medio de los demás aspectos de la presente invención. De acuerdo con un quinto aspecto de la presente invención, se provee también una composición hecha de una metilesterasa de pectina ("PME"); un primer substrato de PME y un segundo substrato de PME; en donde ni el primer substrato de PME ni el segundo substrato de PME se originan in situ uno del otro. De acuerdo con un sexto aspecto de la presente invención, se provee un procedimiento para impartir estabilidad a un medio de reacción que comprende un primer substrato de PME, el procedimiento comprende añadir por lo menos PME y un segundo substrato de PME; en donde ni el primer substrato de PME ni el segundo substrato de PME se originan in situ uno del otro. De esta manera, en su sentido más amplio, la presente invención provee una composición que comprende una PME; un primer substrato de PME y un segundo substrato de PME; en donde ni el primer substrato de PME ni el segundo substrato de PME se originan in situ uno del otro. Con la presente invención, ni el primer substrato de PME ni el segundo substrato de PME se originan in situ uno del otro. El término "ni el primer substrato de PME ni el segundo substrato de PME se originan in situ uno del otro" significa que el primer substrato de PME no se origina in situ del segundo substrato de PME y/o el segundo substrato de PME no se origina del primer substrato de PME. Por consiguiente, con la presente invención, el primer substrato de PME no ha sido derivado in situ uno del segundo substrato de PME y w'ce versa. De esta menera, por ejemplo, la composición de la presente invención no abarca sólo una cantidad de un primer substrato de PME en la que una porción de ese substrato de PME ha sido modificado parcialmente por una enzima de PME. En contraste, también debe estar presente un segundo substrato de PME -en donde ese segundo substrato de PME no se haya originado in situ del primer substrato de PME. Con la composición de la presente invención pueden estar presentes substratos de PME diferentes adicionales. Los substratos de PME en, o para la composición de la presente invención pueden obtenerse de diferentes fuentes y/o pueden tener diferente composición química. Asimismo, con la composición de la presente invención pueden estar presentes enzimas PME diferentes y adicionales. Si hay más de una PME presente, entonces las enzimas PME pueden obtenerse de diferentes fuentes y/o o pueden tener diferente composición y/o pueden tener un perfil de reactividad diferente (por ejemplo, diferente pH óptimo y/o diferente temperatura óptima). Con la presente invención, la enzima PME puede desesterificar los substratos de PME de manera aleatoria o por bloques. Si hay más de una PME, entonces cada PME se selecciona independientemente de una PME que puede desesterificar los substratos de PME de una manera aleatoria o una PME que puede desesterificar los substratos de PME por bloques. En una modalidad preferida, la (o por lo menos una) enzima PME desesterifica el substrato de PME por bloques. Si hay más de una PME, entonces cada PME se selecciona independientemente de una enzima PME que sea sensible a iones de sodio (sensible a Na) o una enzima PME que sea insensible a iones de sodio (insensible a Na). En una modalidad preferida, la (o por lo menos una) enzima PME es una enzima PME que es sensible a Na. La PME puede obtenerse de fuentes naturales o incluso obtenerse de fuentes naturales, o puede sintetizarse químicamente. Por ejemplo, la PME puede obtenerse de un hongo, tal como a manera de ejemplo una PME de origen micótico (es decir una PME que haya sido obtenida de un hongo). Como alternativa, la PME puede obtenerse de una bacteria, tal como a manera de ejemplo una PME de origen bacteriano (es decir, una PME que haya sido obtenida de una bacteria). Alternativamente, la PME puede obtenerse de una plante, tal como a manera de ejemplo una PME de origen vegetal (es decir una PME que se haya obtenido de una planta). En una modalidad preferida, la PME se prepara mediante el uso de técnicas de ADN recombinante.

Por ejemplo, la PME puede ser una PME recombinante como la descrita en WO-A-97/03574 o la PME descrita en WO-A-94/25575 o WO-A- 97/31 102, así como variantes, derivados u homólogos de las secuencias descritas en esas solicitudes de patente. En una modalidad preferida, la PME es la PME recombinante de WO-A-97/03574 (cuyos contenidos se incorporan en la presente a manera de referencia) -tal como la PME de SEQ. I.D. No. 1 o SEQ. I.D. No. 2 (las cuales son codificadas por las secuencias de nucleótidos presentadas como SEQ.

I.D. No. 3 y SEQ. I.D. No. 4, respectivamente) o una variante, derivado u homólogo de la misma; y/o la PME de WO-A-94/25575 (cuyos contenidos se incorporan en la presente a manera de referencia) o una variante, derivado u homólogo de la misma. Los términos "variante", "homólogo" o "fragmento" en relación con la enzima recombinante de la presente invención incluyen cualquier sustitución de, variación de, modificación de, reemplazo de, deleción de o adición de uno (o más) aminoácidos de, o a la secuencia, siempre que la secuencia de aminoácidos resultante tenga actividad PME, preferiblemente tenga por lo menos la misma actividad de una enzima recombinante que comprenda una o más de las secuencias mostradas como SEQ. I.D. Nos. 1 y 2. En particular, el término "homólogo" cubre la homología con respecto a la estructura y/o función, siempre y cuando la enzima recombinante resultante tenga actividad PME. Con respecto a la homología de secuencia (es decir, similaridad), preferiblemente hay por lo menos 75%, muy preferiblemente por lo menos 85%, más preferiblemente por lo menos 90% de homología con las secuencias mostradas en los listados de secuencias anexos. Muy preferiblemente hay por lo menos 95%, más preferiblemente por lo menos 98% de homología con las secuencias mostradas en los listados de secuencias anexos. Los términos "variante", "homólogo" o "fragmento" en relación con la secuencia de nucleótidos que codifica para la enzima recombinante de la presente invención incluyen cualquier sustitución de, variación de, modificación de, reemplazo de, deleción de o adición de uno (o más) ácidos nucleicos de, o a la secuencia, siempre que la secuencia de nucleótidos resultante codifique para una enzima recombinante que tenga actividad PME, preferiblemente tenga por lo menos la misma actividad de una enzima recombinante que comprenda cualquiera o más de las secuencias mostradas como SEQ I.D. Nos. 1 y 2. En particular, el término "homólogo" cubre la homología con respecto a la estructura y/o función, siempre y cuando la secuencia de nucleótidos resultante codifique para una enzima recombinante que tenga actividad PME. Con respecto a la homología de secuencia (es decir similaridad), preferiblemente hay por lo menos 75%, muy preferiblemente por lo menos 85%, más preferiblemente por lo menos 90% de homología. Más preferiblemente, hay por lo menos 95%, muy preferiblemente por lo menos 98% de homología. Los términos anteriores son sinónimos con las variaciones alélicas de las secuencias.

En una modalidad preferida, por lo menos uno de los substratos de PME es pectina o es un substrato que se puede derivar de, o derivado de pectina (por ejemplo, un derivado de pectina). El término "derivado de pectina" incluye pectina derivada, pectina degradada (tal como parcialmente degradada) y pectina modificada. Un ejemplo de una pectina modificada es pectina que ha sido tratada anteriormente con una enzima tal como una PME. Un ejemplo de un derivado de pectina es pectina que ha sido tratada químicamente -por ejemplo, amidada. De manera preferible, cada uno del primer substrato de PME y el segundo substrato de PME se selecciona independientemente de pectina, un substrato que sea derivable de pectina, o un substrato que sea derivado de pectina. En una modalidad preferida, cada uno del primer substrato de pectina y el segundo substrato de pectina es pectina. En otra modalidad preferida, ya sea el primer substrato de PME o el segundo substrato de PME es una pectina modificada -en particular una pectina enzimáticamente modificada, preferiblemente una pectina tratada con PME. En una modalidad preferida, el segundo substrato de PME es dicha pectina modificada. En otra modalidad preferida, cada uno del primer substrato de PME y el segundo substrato de PME es dicha pectina modificada.

De manera preferible, el primer substrato de PME está presente dentro (es decir, in situ) de una planta o un material vegetal. La planta puede ser una planta transgénica, tal como una planta que haya sido genéticamente manipulada para producir diferentes niveles y/o tipos de pectina. Asimismo, el material vegetal puede obtenerse de una planta transgénica, tal como una planta que haya sido manipulada genéticamente para producir diferentes niveles y/o tipos de pectina. La planta o material vegetal puede ser o puede derivarse de un vegetal, una fruta u otro tipo de planta que contenga o produzca pectina. De manera preferible, el material vegetal es un material vegetal y/o un material de fruta. Preferiblemente, el material vegetal y/o el material de fruta es una masa pulposa. El primer substrato de PME y/o el segundo substrato de PME puede ser cualquiera o más de una pectina de bajo éster, pectina de medio éster o pectina de alto éster. De manera preferible, el segundo substrato de PME es una pectina de bajo éster, una pectina de medio éster o una pectina de alto éster. Un protocolo para determinar el grado de esterificación del substrato de PME puede encontrarse en la página 58 de WO-A97/03574 (cuyos contenidos se incorporan en la presente a manera de referencia). Para facilitar la referencia, este protocolo se describe en la sección de ejemplos (abajo).

En una modalidad preferida, el segundo substrato de PME es una pectina de alto éster. Para la presente invención, el primer substrato de PME y el segundo substrato de PME se seleccionan independientemente de un substrato de PME que sea sensible a iones de calcio (sensible a Ca) o un substrato de PME que sea insensible a iones de calcio (insensible a Ca). Un protocolo para determinar la sensibilidad al calcio puede encontrarse en la página 57 de WO-A-97/03574 (cuyos contenidos se incorporan en la presente a manera de referencia). Para facilitar la referencia, este protocolo se describe en la sección de ejemplos (abajo). En una modalidad preferida, el segundo substrato de PME es sensible a Ca. Preferiblemente, el segundo substrato de PME se añade al primer substrato de PME. Aquí, el término "se añade" incluye añadir físicamente el segundo substrato de PME al primer substrato de PME y vice versa. La PME puede añadirse al mismo tiempo que el segundo substrato de PME, o antes de la adición del segundo substrato de PME o después de la adición del segundo substrato de PME. Por consiguiente, la presente invención abarca por lo menos las siguientes posibilidades: añadir PME al primer substrato de PME y al mismo tiempo que el segundo substrato de PME; añadir PME al segundo substrato de PME y al mismo tiempo que el primer substrato de PME; añadir el segundo substrato de PME a PME y al mismo tiempo que el primer substrato de PME; añadir PME y el primer substrato de PME y el segundo substrato de PME al mismo tiempo a un recipiente de reacción; incubar el primer substrato de PME con PME antes de la adición al segundo substrato de PME; incubar el segundo substrato de PME con PME antes de la adición al primer substrato de PME, incubar el primer substrato de PME con PME antes de la adición al segundo substrato de PME y después añadir más PME (la cual puede ser la misma o diferente que la otra PME); incubar el segundo substrato de PME con PME antes de la adición al primer substrato de PME, y añadir después más PME (la cual puede ser la misma o diferente que la otra PME); incubar el primer substrato de PME con PME antes de la adición al segundo substrato de PME y añadir después un substrato de PME adicional (que puede ser el mismo o diferente que los demás substratos de PME); incubar el segundo substrato de PME con PME antes de la adición al primer substrato de PME y añadir después un substrato de PME adicional (el cual puede ser el mismo o diferente que los demás substratos de PME); añadir el primer substrato de PME cuando se incube con PME al segundo substrato de PME cuando se incube con PME (que puede ser la misma o diferente a la otra PME); adición del primer substrato de PME después de que ha sido incubado con PME (opcionalmente en donde la reacción se haya detenido -tal como mediante la aplicación de calor) al segundo substrato de PME después de que se haya incubado con PME que puede ser la misma o diferente que la otra PME (opcionalmente en donde la reacción se haya detenido -tal como mediante la aplicación de calor); así como cualquier combinación de los mismos. En un número de modalidades, la presente invención comprende preferiblemente cualquiera o más de: añadir PME al primer substrato de PME y al mismo tiempo que el segundo substrato de PME; añadir PME al segundo substrato de PME y al mismo tiempo que el primer substrato de PME; añadir el segundo substrato de PME a PME y al mismo tiempo que el primer substrato de PME; añadir PME y el primer substrato de PME y el segundo substrato de PME al mismo tiempo a un recipiente de reacción; incubar el primer substrato de PME con PME antes de la adición al segundo substrato de PME; incubar el segundo substrato de PME con PME antes de la adición al primer substrato de PME; incubar el primer substrato de PME con PME antes de la adición al segundo substrato de PME y después añadir más PME (que puede ser la itiisma o diferente que la otra PME); incubar el segundo substrato de PME con PME antes de la adición al primer substrato de PME y después añadir más PME (que puede ser la misma o diferente que la otra PME); incubar el primer substrato de PME con PME antes de la adición al segundo substrato de PME y después añadir un substrato de PME adicional (que puede ser el mismo o diferente que los demás substratos de PME); incubar al segundo substrato de PME con PME antes de la adición del primer substrato de PME y después añadir un substrato de PME adicional (el cual puede ser el mismo o diferente que los demás substratos de PME); añadir el primer substrato de PME cuando se incube con PME al segundo substrato de PME cuando se incube con PME (la cual puede ser la misma o diferente que la otra PME). De esta manera, en una modalidad, es posible preparar un segundo substrato de PME pretratado con PME de alto éster que después puede añadirse a un primer substrato de PME. A este respecto, sería posible aprovechar diferentes PMEs (tales como, pero no limitadas a, PMEs recombinantes, vegetales, micóticas y bacterianas) para modificar el segundo substrato de PME con vista a proveer substratos de PME con diferente funcionalidad en un sistema de combinación. Dicho de otra manera, esta modalidad de la presente invención provee una composición que comprende una PME; un primer substrato de PME y un segundo substrato de PME; en donde ni el primer substrato de PME ni el segundo substrato de PME se originan in situ uno del otro; y en donde por lo menos el segundo substrato de PME ha sido pretratado con PME. En otra modalidad, es posible añadir un substrato de PME a un primer substrato de PME de alto éster pretratado con PME. A este respecto, sería posible aprovechar diferentes PMEs (tales como, pero no limitadas a, PMEs recombinantes, vegetales, micóticas y bacterianas) para modificar el segundo substrato de PME con vista a proveer substratos de PME con diferente funcionalidad en un sistema de combinación. En otra modalidad, es posible preparar un segundo substrato de PME de alto éster pretratado con PME que puede añadirse entonces a un primer substrato de PME de alto éster pretratado con PME. A este respecto, sería posible aprovechar diferentes PMEs (tales como, pero no limitadas a, PMEs recombinantes, vegetales, micóticas y bacterianas) para modificar el segundo substrato de PME con vista a proveer substratos de PME con diferente funcionalidad en un sistema de combinación. La composición puede comprender uno o más componentes diferentes, tales como uno o más ingredientes alimenticios adecuados. Los ingredientes alimenticios típicos incluyen cualesquiera o más de un ácido -tal como ácido cítrico- o un azúcar -tal como sacarosa, glucosa o azúcar invertida -o fruta u -otras enzimas, conservadores, colorantes y otros componentes adecuados. La composición de la presente invención puede usarse en la preparación de un artículo alimenticio. Por ejemplo, puede ser un reactivo de partida o un intermediario en la preparación de un artículo alimenticio. Alternativamente, la composición de la presente invención puede ser el propio artículo alimenticio. El término "artículo alimenticio" puede incluir alimento para consumo humano y/o animal. Los artículos alimenticios típicos incluyen mermeladas, jaleas, productos lácteos (tales como leche o queso), productos cárnicos, productos de aves, productos de pescado y productos de repostería. El artículo alimenticio puede incluso ser una bebida. La bebida puede ser un yoghurt para beber, un jugo de frutas o una bebida que comprenda proteína de suero.

La (o cualquiera o más de cada una) PME se puede usar en conjunto con otros tipos de enzimas. Ejemplos de otros tipos de enzimas incluyen otras pectinasas, despolimerasas de pectina, poli-galacturonasas, pectato Masas, pectina liasas. ramno-galacturonasas, galactanasas, celulasas, hemicelulasas, endo-ß-glucanasas, arabinasas. acetilesterasas o enzimas liberadoras de pectina o combinaciones de las mismas. Estos otros tipos de enzimas pueden añadirse al mismo tiempo que la PME o, alternativamente, antes de, o después de la adición de la PME. En una modalidad preferida, la PME se usa en conjunto con una o más poligalacturonasas, tales como una endopoligalacturonasa (tal como la de WO-A-89/12648, cuyos contenidos se incorporan en la presente a manera de referencia) y/o una exopoligalacturonasa (tal como la de WO-A-94/14966 cuyos contenidos se incorporan en la presente a manera de referencia). Esta modalidad preferida es benéfica para la fabricación de mermeladas ya que los substratos de PME tratados resultantes pueden lograr una sensibilidad a calcio más controlada. Como se indicó arriba, las enseñanzas de WO-A-97/03574 proveen ciertas enseñanzas útiles acerca de cómo preparar una PME adecuada para usarse en la presente invención mediante el uso de técnicas de DNA recombinante. Algunas de estas enseñanzas se mencionan abajo. Para expresar una PME recombinante, el organismo hospedero puede ser un organismo procariótico o eucariótico. Ejemplos de hospederos procarióticos adecuados incluyen E.coli y Bacillus subtilis. Las enseñanzas acerca de la transformación de hospederos procarióticos están bien documentadas en la técnica, véase por ejemplo Sambrook y otros (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2da edición, 1989, Cold spring Harbor Laboratory Press). Si se utiliza un hospedero procariótico entonces el gen puede requerir ser modificado adecuadamente antes de la transformación -tal como mediante la remoción de los intrones. En una modalidad, el organismo hospedero puede ser del género Aspergillus, tal como Aspergillus niger. Puede prepararse un Aspergillus transgénico siguiendo las enseñanzas de Rambosek J. y Leach, J. 1987 (Recombinant DNA in filamentous fungí: Progress y Prospects. CRC Crit. Rev. Biotechnol. 6:357-393), Davis R.W. 1994 (Heterologous gene expression y protein secretion in Aspergillus. En Martinelli S.D., Kinghom J.R: (Editores) Aspergillus: 50 years on. Progress in industrial microbiology vol 29. Elsevier Amsterdam 1994. pp 525-560), Ballance, D.J. 1991 (transformation systems for Filamentous Fungi and an Overview of Fungal Gene structure. En Leong, S.A., Berka R.M: (Editores) Molecular Industrial Mycology. systems and Aplications for Filamentous Fungi. Marcel Dekker Inc. Nueva York 1991. pp 1-29) y Turner G. 1994 (Vectors for genetic manipulation. En Martinelli S.D., Kinghom J.R: (Editores) Aspergillus: 50 years on. Progress in industrial microbiology vol 29. Elseiver, Amsterdam 1994, pp. 641-666). Sin embargo, el siguiente comentario provee un resumen de esas enseñanzas para producir Aspergillus transgénico.

Durante casi un siglo, se han usado ampliamente hongos filamentosos en muchos tipos de industrias para la producción de compuestos orgánicos y enzimas. Por ejemplo, el koji japonés tradicional y las fermentaciones de soya han usado Aspergillus sp. De igual manera, en este siglo se ha usado Aspergillus niger para la producción de ácidos orgánicos, en particular ácido cítrico, y para la producción de varias enzimas para usarse en la industria. Existen dos razones principales por las cuales se han usado tan ampliamente hongos filamentosos en la industria. Primero, los hongos filamentosos pueden producir altas cantidades de productos extracelulares, por ejemplo, enzimas y compuestos orgánicos tales como antibióticos o ácidos orgánicos. Segundo, los hongos filamentosos pueden crecer sobre substratos de bajo costo tales como granos, salvado, pulpa de remolacha, etc. Las mismas razones han hecho a los hongos filamentosos organismos' atractivos como hospederos para la expresión heteróloga de PME recombinante. Para preparar el Aspergillus transgénico, se preparan construcciones de expresión insertando una secuencia de nucleótidos necesaria en una construcción diseñada para la expresión en hongos filamentosos. Se han desarrollado varios tipos de construcciones usadas para la expresión heteróloga. Estas construcciones pueden contener un promotor que sea activo en los hongos. Ejemplos de promotores incluyen un promotor micótico para una enzima extracelular altamente expresada, tal como el promotor de glucoamilasa o el promotor de a-amilasa. La secuencia de nucleótidos puede ser fusionada a una secuencia de señal que dirija la proteína codificada por la secuencia de nucleótidos que será secretada. Normalmente se usa una secuencia de señal de origen micótico. Un terminador activo én hongos concluye el sistema de expresión. Se ha desarrollado otro tipo de sistema de expresión en hongos en el que la secuencia de nucleótidos puede ser fusionada a una parte más pequeña o más grande de un gen micótico que codifique para una proteína estable. Esto puede estabilizar a la proteína codificada por la secuencia de nucleótidos. En dicho sistema se puede introducir un sitio de corte reconocido por una proteasa específica entre la proteína micótica y la proteína codificada por la secuencia de nucleótidos, por lo que la proteína de fusión producida puede ser cortada en esta posición por la proteasa específica liberando de esta manera la proteína codificada por la secuencia de nucleótidos. A manera de ejemplo, se puede introducir un sitio que sea reconocido por una peptidasa tipo KEX-2 encontrada en por lo menos algunos Aspergilli. Dicha fusión lleva al corte in vivo, dando como resultado la protección del producto expresado y no una proteína de fusión más grande. La expresión heteróloga en Aspergillus ha sido reportada para varios genes que codifican para proteínas bacterianas, micóticas, de vertebrados y vegetales. Las proteínas pueden ser depositadas intraceiularmente si la secuencia de nucleótidos no es fusionada a una secuencia de señal. Dichas proteínas se acumularan en el citoplasma y normalmente no serán glucosiladas, lo cual puede ser una ventaja para algunas proteínas bacterianas. Si la secuencia de nucleótidos está equipada con una secuencia de señal la proteína se acumulará extracelularmente. Con respecto a la estabilidad del producto y a las modificaciones en la cepa hospedera, algunas proteínas heterólogas no son muy estables cuando son secretadas en el fluido de cultivo de hongos. La mayoría de los hongos producen varias proteasas extracelulares que degradan proteínas heterólogas. Para evitar este problema se han usado cepas micóticas especiales con producción de proteasa reducida como hospederos para la producción heteróloga. Para la transformación de hongos filamentosos se han desarrollado varios protocolos de transformación para muchos hongos filamentosos (Ballance 1991 , ibid). Muchos de éstos se basan en la preparación de protoplastos y en la introducción de ADN en los protoplastos usando PEG e iones de Ca2+. Los protoplastos transformados se regeneran después y los hongos transformados se seleccionan usando varios marcadores selectivos. Entre los marcadores usados para la transformación está un número de marcadores auxotróficos tales como argB, trpC, niaD y pyrG, marcadores de resistencia a antibióticos tales como resistencia a benomilo, resistencia a higromicina y resistencia a fleomicina. Un marcador de transformación comúnmente usado es el gen amdS de A. Nidulans que en alto número de copias permite que el hongo crezca con acrilamida como la única fuente de nitrógeno. En otra modalidad, el organismo transgénico puede ser una levadura. A este respecto, también se ha usado ampliamente la levadura como un vehículo para la expresión de genes heterólogos. La especie Sacchromyces cerevisiae tiene un gran historial de uso en la industria, incluyendo su uso para la expresión de genes heterólogos. La expresión de genes heterólogos en Sacchromyces cerevisiae ha sido documentada por Goodey y otros (1967, Yeast Biotechnology, D R Berry y otros, eds, pp 401-429, Alien y Unwin, Londres) y por King y otros (1989, Molecular and Cell Biology of Yeasts, E F Walton y G T Yarronton, eds, pp-107-133, Blackie, Glasgow). Por varias razones Sacchoromyces cerevisiae es muy adecuado para expresión de genes heterólogos. Primero, no es patógeno para los humanos y es incapaz de producir ciertas endotoxinas. Segundo, tiene un gran historial de uso seguro a lo largo de siglos de explotación comercial para varios propósitos. Esto ha llevado a una amplia aceptación por parte del público. Tercero, el extenso uso comercial e investigación dedicada al organismo ha dado como resultado un cúmulo de conocimientos acerca de la genética y fisiología, así como de las características de fermentación a gran escala de Saccharomyces cerevisiae. Una revisión de los principios de la expresión de genes heterólogos en Saccharomcyces cerevisiae y de la secreción de productos de gen se da por E. Hinchcliffe E Kenny (1993, "Yeast as a vehicle for the expresision of heterologous genes", Yeasts, Vol 5, Anthony H Rose y J Stuart Harrison, eds, 2da edición, Academic Press Ltd.) Están disponibles varios tipos de vectores de levadura, incluyendo vectores integrantes, los cuales requieren la recombinación con el genoma del hospedero para su mantenimiento, y los vectores plasmídicos que se replican de manera autónoma. Para preparar la Saccharomyces transgénica, las construcciones de expresión se preparan insertado la secuencia de nucleótidos en una construcción diseñada para la expresión en levadura. Se han desarrollado varios tipos de construcciones usadas para la expresión heteróloga. Las construcciones contienen un promotor activo en levadura fusionado a la secuencia de nucleótidos; normalmente se usa un promotor de origen de levadura tal como el promotor GAL1. Normalmente se usa una secuencia de señal de origen de levadura, tal como la secuencia que codifica para ei péptido de señal SUC2. Un terminador activo en levadura concluye el sistema de expresión. Para la transformación de la levadura se han desarrollado varios protocolos de transformación. Por ejemplo, se puede preparar Saccharomyces transgénica siguiendo las enseñanzas de Hínnen y otros (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929); Beggs, J D (1978, Nature, Londres, 275, 104); y Ito, H y otros (1983, J Bacteriology 153, 163- 168).

Las células de levadura transformadas se seleccionan usando varios marcadores selectivos. Entre los marcadores usados para la transformación se encuentran un número de marcadores auxotróficos tales como LEU2, HIS4 y TRP1 , y marcadores dominantes de resistencia a antibióticos tales como marcadores antibióticos de aminoglucósido, por ejemplo G418. Otro organismo hospedero es una planta. A este respecto, la técnica está repleta con referencias para preparar plantas transgénicas. Dos documentos que proveen ciertos comentarios antecedentes acerca de los tipos de técnicas pueden emplearse para preparar plantas transgénicas son EP-B-0470145 y CA-A-2006454, algunos de sus comentarios presentándose más abajo. El principio básico en la construcción de plantas genéticamente modificadas es el de insertar información genética en el genoma de la planta de manera tal que se obtenga un mantenimiento estable dei material genético insertado. Existen varias técnicas para insertar la información genética, siendo los dos principios principales la introducción directa de la información genética y la introducción indirecta de la información genética mediante el uso de un sistema de vectores. Una revisión de las técnicas generales puede encontrarse en artículos por Portrykus (annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225) y Chirstou (agro-Food-Industry Hi-Tech, marzo/abril 1994 17-27).

Un sistema de transformación adecuado para una planta puede comprender un vector, pero puede comprender dos vectores. En el caso de dos vectores, el sistema de vectores se conoce normalmente como un sistema de vectores binario. Los sistemas de vectores binarios se describen en mayor detalle en Gynheung An y otros (1980), Binary Vectors, Plant Molecular Biology Manual A3, 1 -19. Un sistema extensamente empleado para la transformación de células vegetales con cierto promotor o secuencia de nucleótidos o construcción se basa en el uso de un plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens o un plásmido Ri de Agrobacterium rhizogenes como los descritos en An y otros (1986), Plant Physiol. 81 , 301 -305 y Butcher D.N. y otros (1980). Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, eds.: D. S. Ingrams y J.P. Helgeson, 203-208. Se han construido varios plásmidos Ti y Ri diferentes, los cuales son adecuados para la construcción de la planta o construcciones de células vegetales descritas arriba. Un ejemplo no limitante de dicho plásmido Ti es pGV3850. La secuencia de nucleótidos o construcción debe insertarse preferiblemente en el plásmido Ti entre las secuencias terminales del ADN-T o adyacentes a una secuencia de ADN-T, de manera tal que se evite la interrupción de las secuencias que rodean inmediatamente los límites del ADN-T, ya que por lo menos una de estas regiones parece ser esencial para la inserción de ADN-T modificado en el genoma de la planta.

Como se entenderá a partir de la explicación anterior, si el organismo es una planta, entonces el sistema de vectores es preferiblemente uno que contenga las secuencias necesarias para infectar la planta (por ejemplo, la región vir) y por lo menos una parte limítrofe de una secuencia de ADN-T, la parte limítrofe estando localizada sobre el mismo vector que la construcción genética. Preferiblemente, el sistema de vectores es un plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens o un plásmido Ri de Agrobacterium rhizogenes o un derivado de los mismos, ya que estos plásmidos se conocen bien y se emplean ampliamente en la construcción de plantas transgénicas. Existen muchos sistemas de vectores que están basados en estos plásmidos o derivados de los mismos. En la construcción de una planta transgénica la secuencia de nucleótidos puede construirse primero en un microorganismo en el cual el vector pueda replicarse y el cual sea fácil de manipular antes de su inserción en la planta. Un ejemplo de un microorganismo útil es E. coli, pero pueden usarse otros microorganismos que tengan las propiedades anteriores. Cuando un vector de un sistema de vectores como el definido arriba ha sido construido en E. coli, éste se transfiere, si es necesario, a una cepa de Agrobacterium adecuada, por ejemplo, Agrobacterium tumefaciens. El plásmido Ti que porta la secuencia de nucleótidos o construcción es de esta manera insertado preferiblemente en una cepa de Agrobacterium adecuada, por ejemplo, A. tumefaciens, de manera tal que se obtenga una célula de Agrobacterium que porte la secuencia de nucleótidos, cuyo ADN sea subsecuentemente transferido a la célula vegetal que será modificada. Como se reporta en CA-A-2006454, están disponibles un gran número de vectores de clonación que contienen un sistema de replicación en E. coli, y un marcador que permite una selección de las células transformadas.

Los vectores contienen por ejemplo pBR 322, la serie pUC, las serie M13 mp, pACYC 184, etc. De esta manera, la secuencia de nucleótidos puede ser introducida en una posición de restricción adecuada en el vector. El plásmido contenido se usa para la transformación en E. coli. Las células de E. coli se cultivan en un medio nutriente adecuado y después se cosechan y se lisan. El plásmido es después recuperado. Como un método de análisis se usa generalmente el análisis de secuencia, análisis de restricción, electroforesis y métodos biológicos bioquímicos-moleculares adicionales. Después de cada manipulación, la secuencia de ADN usada puede ser restringida y conectada con la siguiente secuencia de ADN. Cada secuencia puede ser clonada en el mismo o diferente plásmido. Después de cada método de introducción del promotor o construcción o secuencia de nucleótidos deseado en las plantas, puede ser necesaria la presencia y/o inserción de secuencias de ADN adicionales. Si, por ejemplo, para la transformación se usa el plásmido Ti o Ri de las células vegetales, por lo menos el límite derecho y comúnmente sin embargo el límite derecho e izquierdo del ADN-T Ti y Ri plasmídico, como áreas de flanqueo de los genes introducidos pueden ser conectados. El uso de ADN-T para la transformación de células vegetales se ha estudiado extensamente y se describe en EP-A-120516; Hoekema, en: The Binary Plant Vector System Offset-drukkerij Kanters B.B., Alblasserdam, 1985, Capítulo V; Fraley, y otros, Crit. Rev. Plant Sci., 4:1-46; y An y otros., EMBO J. (1985) 4:277-284. La infección directa de tejidos vegetales por Agrobacterium es una técnica simple que se ha empleado ampliamente y la cual se describe en Butcher D. N. y otros (1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, eds.: D.S. Ingrams y J.P. Helgeson, 203-208. Para enseñanzas adicionales acerca de este tópico véase Potrikus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225) y Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech, marzo/abril 1994 17-27). Con esta técnica, la infección de una planta puede hacerse sobre cierta parte o tejido de la misma, es decir sobre una parte de una hoja, una raíz, un tallo u otra parte de la planta. Típicamente, con la infección directa de tejidos vegetales por Agrobacterium que porte el promotor y/o el GOI, una planta que será infectada es herida, por ejemplo cortando la planta con una navaja para rasurar o punzando la planta con una aguja o frotando la planta con un abrasivo. La herida es inoculada después con el Agrobacterium. La planta o parte de la planta inoculada es después cultivada en un medio de cultivo adecuado y se deja desarrollar para crear plantas maduras. Cuando se construyen células vegetales, estas células pueden ser cultivadas y mantenidas de conformidad con métodos de cultivo de tejidos bien conocidos tales como mediante el cultivo de las células en un medio de cultivo adecuado provisto con los factores de crecimiento necesarios, tales como aminoácidos, hormonas vegetales, vitaminas, etc. La regeneración de las células transformadas en plantas genéticamente modificadas puede lograrse usando métodos conocidos para la regeneración de plantas a partir de cultivos de células o tejidos, por ejemplo seleccionando brotes transformados usando un antibiótico y subcultivando los brotes sobre un medio que contenga los nutrientes, hormonas vegetales adecuados, etc. Enseñanzas adicionales acerca de la transformación de plantas pueden encontrarse EP-A-0449375. En resumen, se describe una composición adecuada para usarse como un artículo alimenticio o en la preparación de un artículo alimenticio. La composición comprende una PME, un primer substrato de PME y un segundo substrato de PME; en donde ni el primer substrato de PME ni el segundo substrato de PME se origina in situ a partir dei otro. Como se indicó arriba, los substratos de PME, tales como pectinas obtenidas de fuentes vegetales naturales, generalmente están en forma de una pectina de alto éster que tiene un DE de aproximadamente 70%. Se debe añadir azúcar a los extractos que contengan estos substratos de PME de alto éster par proveer suficientes sólidos solubles para inducir la gelificación. Normalmente se requiere de un mínimo de 55% de sólidos solubles. La sinéresis tiende a ocurrir más frecuentemente cuando el porcentaje de sólidos solubles es de menos del 55%. Cuando ocurre la sinéresis deben usarse aditivos costosos para inducir la gelificación. Con la presente invención se ha descubierto que es sorprendentemente posible inducir la gelificación de un extracto que contenga un substrato de PME de alto éster mediante la adición de un segundo substrato de PME de alto éster. Es completamente inesperada la capacidad de gelificación incrementada de estos substratos de PME de alto éster combinados a niveles de sólidos solubles que son de menos del 50%. La técnica anterior siempre ha enseñado que las pectinas de alto éster requieren típicamente de un contenido mínimo de sólidos solubles del 55% antes de que pueda ocurrir la gelificación. De esta manera, de acuerdo con el aspecto más amplio de esta modalidad preferida de la presente invención, se provee un sistema acuoso en un estado de gel solidificado que tiene un contenido de sólidos solubles de menos del 50% p/p; en el que la gelificación ha ocurrido mediante el uso de un substrato de PME de alto éster. En este respecto, el estado de gel solidificado puede determinarse por el procedimiento mencionado en la sección de ejemplos (abajo). La presente invención se puede distinguir de las enseñanzas de WO-A-94/25575, toda vez que esa solicitud de patente no describe o incluso sugiere una composición que comprenda una PME; un primer substrato de PME y un segundo substrato de PME; mucho menos una composición en la que ni el primer substrato de PME ni el segundo substrato de PME se originen in situ a partir del otro. Sucede lo mismo con referencia a las enseñanzas de JP-A-63/209533. También debe notarse que las enseñanzas de la página 12 (renglones 6-14) de WO-A-94/25575 incluso se alejan de la presente invención. A este respecto, el término "productos a base de vegetales o frutas" como el usado en los renglones 7 y 8 de WO-A-94/25575 no describe explícitamente un substrato de PME. Además, la siguiente oración "Alternativamente (poniendo énfasis), el contenido natural de la pectina puede ser desmetilado mediante el uso de la enzima..." en ios renglones 12 a 14 de WO-A-94/25575 claramente señala que el medio de reacción vislumbrado por WO-A-94/25575 sólo incluye un substrato de PME, y no por lo menos dos substratos de PME como se encuentra en la presente invención. La presente invención se describirá ahora únicamente a manera de ejemplo con referencia a los dibujos anexos: La figura 1 es una gráfica de barras (que muestra el efecto de la modificación con PPME, pectina añadida y +/- calcio). La figura 2 es una gráfica de barras (que muestra el efecto del tratamiento con PPME de fruta y pectina (P66)).

PROTOCOLOS PROTOCOLO 1 índice de sensibilidad a calcio (CF) Se mide la sensibilidad al calcio como la viscosidad de una pectina disuelta en una solución con 57.6 mg de calcio/g de pectina dividido entre la viscosidad exactamente de la misma cantidad de pectina en solución, pero sin calcio añadido. Una pectina insensible a calcio tiene un valor CF de 1. Se disuelven 4.2 g de pectina en 550 ml de agua caliente con agitación eficiente. La solución se enfría a aproximadamente 20°C y el pH se ajusta a 1.5 con HCl a 1 N. La solución de pectina se ajusta a 700 ml con agua y se agita. 145 g de esta solución se miden individualmente en 4 vasos de viscosidad. Se añaden 10 ml de agua a dos de los vasos (determinaciones dobles) y 10 mi de una solución de CaCb a 250 mM se añade a los otros dos vasos bajo agitación. Se añaden 50 ml de un regulador de pH de acetato (0.5 M, pH aproximadamente 4.6) a todos los cuatro vasos de viscosidad bajo agitación magnética eficiente, llevando de esta manera el pH de la solución de pectina hasta más de pH 4.0. Se retiran los imanes y los vasos se dejan durante la noche a 20°C. Las viscosidades se miden al día siguiente con un viscómetro Brookfíeld. El índice de sensibilidad a calcio se calcula como sigue: viscosidad de la solución con 57.6 mg Ca 2+ //g pectina CF= viscosidad de una solución con 0.0 mg Ca /g pectina PROTOCOLO II Grado de esterificación % DE) A 50 ml de una solución de isopropanol al 60% y de HCl al 5% se le añaden 2.5 g de muestra de pectina y se agita durante 10 min. La solución de pectina se filtra a través de filtro de vidrio y se lava con 15 ml de solución de isopropanol al 60%/HCI al 5% seis veces seguida por lavados adicionales con isopropanol al 60% hasta que el material filtrado esté libre de cloruros. El material filtrado se seca durante la noche a 80°C. Se combinan 20.0 ml de NaOH a 0.5 N y 20.0 ml de HCl a 0.5 N en un matraz cónico y se añaden dos gotas de fenolftaleína. Esto se titula con NaOH a 0.1 N hasta que se obtenga un cambio de color permanente. El HCl a 0.5 N debe ser ligeramente más fuerte que el NaOH a 0.5 N. El volumen de NaOH a 0.1 N añadido se anota como V0. Se miden en un matraz cónico 0.5 g de la muestra de pectina seca (el material filtrado) y la muestra se humedece con etanol al 96%. Se añaden 100 ml de agua destilada recientemente hervida y enfriada y la solución resultante se agita hasta que la pectina se disuelva completamente. Después se añaden cinco gotas de fenolftaleína y la solución se titula con NaOH a 0.1 N (hasta un cambio en el color y pH de 8.5). La cantidad de NaOH a 0.1 N usada aquí se anota como V-i. Se añaden 20.0 ml de NaOH a 0.5 N y el matraz se agita vigorosamente, y después se deja reposar durante minutos. Se añaden 20.0 ml de HCl a 0.5 N y el matraz se agita hasta que desaparezca el color rosado. Después se añaden tres gotas de fenoiftaleína y la solución resultante se titula después con NaOH a 0.1 N. El volumen de NaOH a 0.1 N usado se anota como V2. El grado de esterificación (% DE: % de grupos carboxi totales) se calcula como sigue: V„ -Vr % DE =- '2 v0 v1 + (v2 -v0) PREPARACIONES DE ALIMENTOS Introducción A manera de introducción, las composiciones alimenticias de conformidad con la presente invención pueden comprender uno más componentes diferentes, tales como uno o más ingredientes alimenticios. Los ingredientes alimenticios típicos incluyen cualquiera o más de un ácido (tal como ácido cítrico; o un azúcar tal como sacarosa, glucosa o azúcar invertida; o fruta o enzimas). Por ejemplo, la fruta imparte no sólo sabor, color y estructura al gel, sino también pectina, ácido y una pequeña cantidad de sólidos. Dependiendo del nivel de sabor y color naturales en la fruta, las dosis de frutas normalmente son de 25% a 60% de la mermelada. El contenido de sólidos de la fruta común es de alrededor de 10% Brix, pero también puede usarse un concentrado de frutas, que es típicamente de 65-70% Brix. El pH en las frutas varía ampliamente, dependiendo de la fruta en cuestión, pero la mayoría de las frutas tiene un pH de entre 3.0 y 3.5. El contenido de pectina varía también, dependiendo de la fruta en cuestión. Por ejemplo, la grosella roja, casis y naranjas tienen un alto contenido de pectina, y pueden obtenerse geles satisfactorios de estas frutas añadiendo sólo una pequeña cantidad de pectina adicional. La elección de pectina GRINDSTED™ depende del tipo de mermelada en cuestión. Por ejemplo, se usa pectina SS 200 GRINDSTED™ en mermeladas que no contienen pedazos de frutas o en mermeladas que sólo contienen pedazos muy pequeños de fruta. La separación de la fruta en dichas mermeladas no es un problema, y en consecuencia puede usarse una pectina de fijación lenta sedimentación y baja temperatura de llenado. Se usa pectina RS 400 GRINDSTED™ en mermeladas que contienen grandes pedazos de fruta o fruta entera, por ejemplo cerezas o fresas. En las mermeladas que contienen fruta entera puede ser difícil evitar la separación de la fruta, y por lo tanto es necesario usar una pectina de fijación rápida tal como la pectina RS 400 GRINDSTED™. La elección del tipo de pectina también puede depender del tamaño del contenedor en cuestión. Cuando se usan frascos normales, la temperatura de llenado es menos crítica con respecto a la estabilidad de la pectina, ya que los frascos se enfriarán relativamente más rápido después del llenado y la pectina no se degradará. Sin embrago, si la mermelada es llenada en contenedores grandes, por ejemplo de 500 o 1000 kg, el tiempo de enfriamiento será muy largo. En el centro de dicho gran contenedor la pectina será especialmente sometida a degradación, y el gel será más débil en el centro que en los lados. En consecuencia, se usa generalmente una pectina de más baja fijación para contenedores grandes, permitiendo el llenado a temperaturas más bajas y evitando de esta manera la degradación de la pectina. Se añade azúcar a la mermelada por varias razones, tales como: 1. Para proveer sólidos solubles -las pectinas de HE pueden requerir un contenido mínimo de sólidos solubles de 55% antes de gelificarse. 2. Para proveer dulzura. 3. Para proveer estabilidad física, química y microbiológica incrementada. 4. Para proveer una mejor sensación en la boca. 5. Para proveer color y brillo mejorados. La sacarosa es el azúcar que se usa normalmente, pero también pueden usarse otros azúcares dependiendo del sabor, efecto de endulzado, cristalización o estructura requeridos. El precio también puede tener influencia en el tipo de azúcar que se usará. El azúcar invertida tiene el mismo efecto endulzante que la sacarosa, mientras que el jarabe de glucosa, la glucosa y el sorbitol tienen un efecto de endulzado reducido. El jarabe de maíz de alta fructosa y la fructosa tendrán un efecto endulzante mayor que el de la sacarosa. La estructura y resistencia del gel así como la temperatura de gelificación serán, hasta cierto punto, influenciadas por los cambios en la composición del azúcar. El ácido se añade por dos razones: 1 ) en parte para reducir el nivel de pH a 3.0-3.2 para obtener un gel satisfactorio con la pectina y 2) en parte para mejorar el sabor de la fruta. El pH óptimo para la gelificación usando las pectinas de HE depende del tipo de pectina y del contenido de sólidos en cuestión. Si se usa pectina SS 200 GRINDSTED™ en mermelada con 65-68% Brix, el pH óptimo es de 3.0-3.2. Si el contenido de sólidos es mayor que esto, el pH óptimo es de 3.1-3.3. De manera inversa, si el contenido de sólidos es inferior el pH óptimo es de 2.8-3.0. Si se usa pectina RS 400 GRINDSTED™, el pH óptimo es aproximadamente 0.2 unidades más alto que para la pectina SS 200 GRINDSTED™. El ácido más comúnmente usado es ácido cítrico monohidratado, en una solución al 50% p/v. Pueden usarse otros ácidos (tales como ácido málico, ácido tartárico o ácido fosfórico), pero siempre deben de estar en solución.

La elección del ácido depende de la legislación, precio y de la acidez de dulzura requerida en el producto terminado. El ácido cítrico imparte un sabor ácido relativamente fuerte al producto terminado, mientras que el ácido málico da como resultado un sabor más suave pero más duradero. El ácido tartárico puede dar como resultado un sabor ligeramente amargo y el ácido fosfórico ocasiona un sabor más dulce. La pectina tratada enzimáticamente puede evitar la sinéresis que puede ocurrir comúnmente en la fabricación de mermeladas con bajos contenidos de sólidos solubles.

MERMELADA DE BAJO CONTENIDO DE AZÚCAR CON 25% DE SOLIDOS SOLUBLES Formulación *Las frutas típicas incluyen fresa, manzana, cereza, cítricos y casis. **O cualquier otro ácido alimenticio. 1La pectina modificada con enzima puede ser la de WO-A- 97/03574. 2La PME puede ser la de WO-A-97/03574 Procedimiento Preparación de la solución de pectina: 1 . Mezclar en seco la pectina modificada con enzima y azúcar 2. Disolver la mezcla de pectin a-azúcar en agua caliente (80°C) agitando bien.

Mermelada: t. Se mezclan fruta, azúcar y agua 2. A la mezcla de fruta se le da una corta ebullición y se enfría a 40°C 3. Después de enfriar a 40°C se añade la solución de PME 4. El tiempo de reacción para la mezcla de fruta es de una hora 5. La mezcla de fruta se calienta a 85°C durante pocos minutos y después la mermelada se evapora hasta el contenido de sólidos solubles (SS) deseado 6. Se añade la solución de pectina 7. Se añaden conservadores y se ajusta el pH 8. La mermelada se enfría a la temperatura de llenado, se llena y se enfría a temperatura ambiente Este ejemplo puede modificarse mediante la adición de, o sustitución con por lo menos algún otro ingrediente alimenticio adecuado, y/o mediante la adición de otra enzima adecuada (tal como una glucanasa).

MERMELADA DE BAJO CONTENIDO DE AZÚCAR CON 50% DE SOLIDOS SOLUBLES Formulación *Las frutas típicas incluyen fresa, manzana, cereza, cítricos y casis. **O cualquier otro ácido alimenticio. 1La pectina modificada con enzima puede ser la de WO-A- 97/03574. 2La PME puede ser la de WO-A-97/03574 Procedimiento Preparación de la solución de pectina: 1. Mezclar en seco la pectina modificada con enzima y el azúcar 2. Disolver la mezcla de pectina-azúcar en agua caliente (80°C) agitando bien Mermelada: 1. Se mezclan fruta y agua 2. A la mezcla de fruta se le da una corta ebullición y se enfría a 40°C 3. Después de enfriar a 40°C se añade la solución de PME 4. El tiempo de reacción para la mezcla de la fruta es de una hora 5. La mezcla de frutas se calienta a 85°C durante pocos minutos 6. Se añaden el azúcar restante y la solución de pectina y la mermelada se evapora al contenido de SS deseado 7. La mermelada se enfría a la temperatura de llenado, se llena y se enfría a la temperatura ambiente Este ejemplo puede modificarse mediante la adición de, o sustitución con por lo menos algún otro ingrediente alimenticio adecuado, y/o mediante la adición de otra enzima adecuada (tal como una glucanasa).

Las modificaciones a la presente invención serán aparentes para los expertos en la técnica. Por ejemplo, y como se indica en los ejemplos anteriores, ejemplos adicionales podrían incluir la aplicación tanto de PME como de glucanasa para obtener una pectina con un grado más bajo de esterificación (por ejemplo, una pectina de baja fijación).

PREPARACIÓN DE MASA PULPOSA DE NARANJA MODIFICADA CON PME VEGETAL Etapa I Se homogeneizaron pedazos de naranja en una licuadora y se hirvieron durante 15 minutos para inactivar cualquier enzima endógena. Después del congelamiento/descongelamiento se añadió 20% (p/p) de azúcar y la masa pulposa de naranja se diluyó 1 :1 con agua desionizada precalentada (95-100°C). La masa pulposa se transfirió a recipientes de vidrio, su pH y temperatura se ajustaron a 7.0 (usando NaOH al 10%) y 40°C respectivamente. PME vegetal purificada (300 µmol/min/ml), a una concentración de (1 13 µl/200) g de masa pulposa de naranja) se incubó con la masa pulposa a 40°C durante 15 minutos; después de lo cual el pH se ajustó a 3.2 (+/- 0.6) usando ácido cítrico (50% p/v). Para inactivar la PME vegetal añadida, la masa pulposa se trató con calor a 85°C durante 3 minutos. Aunque la actividad de la PME vegetal requiere típicamente la adición de NaCI para tener actividad, esta preparación de masa pulposa de naranja enzimáticamente modificada no requirió de ningún NaCI exógenamente añadido ya que estuvo presente suficiente NaCI endógeno (24 ppm) para asegurar la actividad de la PME. La masa pulposa tratada con PME vegetal (aproximadamente 90 g) se almacenó en platos de cristalización (diámetro: 60 mm, altura: 35 mm) a °C. Todas las mediciones de gelificación de pectina se llevaron a cabo a los tres días del procesamiento y produjeron resultados reproducibles.

Etapa 11 - Selección, preparación y adición de los substratos de pectina Selección: Se seleccionaron tres substratos de pectina para usarse. Todos los tres substratos, substratos de pectina SS200, P66 y P60 GRINDSTED™ tuvieron un alto grado de esterificación (% DE). Estos fueron 65%, 66% y 60% respectivamente. Ambas P60 y P66 se produjeron mediante el pretratamiento con PME vegetal de pectina GRINDSTED™ Ultra Rapid Set (URS), mientras que la pectina SS 200 GRINDSTED™ no fue tratada. Dos de los tres substratos, P60 y P66, fueron sensibles a calcio, mientras que la pectina SS200 GRINSTED™ fue insensible a calcio. Sólo uno de los substratos, pectina SS200 GRINSTED™, estuvo disponible comercialmente. Preparación: Se produjeron P66 y P60 mediante el pretratamiento con PME vegetal de pectina URS GRINSTED™ usando el siguiente procedimiento: pectina URS GRINSTED™ se solubilizó en NaCI a 0.15 M y se trató con PME vegetal durante varias horas a pH 7.0 a 40°C.

Después de ajustar el pH a 3.0, la pectina solubilizada se calentó a 100°C durante 5-10 minutos para ¡nactivar cualquier PME presente, después de lo cual se precipitó con isopropanol y se secó antes de usar. Todos los tres substratos de pectina se prepararon como una solución al 8% y se disolvieron completamente en agua desionizada precalentada (80°C) usando un agitador magnético. Adición: La adición de cada substrato de pectina a la masa pulposa modificada enzimáticamente con PME vegetal se llevó a cabo usando un agitador magnético de alta velocidad para asegurar una solución homogénea.

Etapa lll - Preparación y adición de citrato de calcio La gelificación de la pectina puede inducirse añadiendo calcio, ya sea como una suspensión o como un hidrato, a altas temperaturas. Se añadió citrato de calcio (C?2H?oCa3O?44H2O) a una concentración final de 5 mM a la mezcla.

Etapa IV - Medición de la resistencia del qel Se determinó el grado de gelificación de pectina/resistencia del gel mediante pruebas de comprensión usando un analizador de textura. La metodología se describe en "The Chemistry and Technology of Pectin" Ed.

Reginald H Walker; Academic Press; (1991 ) p 240 (cuyos contenidos se incorporan en la presente a manera de referencia). Las mediciones de viscosidad, inducidas por comprensión, se llevaron a cabo en un SMS TA-XT2 Texture Analyser (Reciproter) usando una sonda almacenada en frío (5°C) (P 25/L), a una velocidad de 2.0 mm/seg y a una penetración del 30%. La temperatura de la muestra fue de 5°C. La fuerza pico en la curva de compresión muestra la resistencia del gel en unidades newton (N).

Etapa V - Pruebas para sinéresis y solidificación La sinéresis se define como la incapacidad de un gel de pectina para formar un sólido. Se consideró que un gel presentaba sinéresis si éste no permanecía intacto después de la inversión de un recipiente de reacción que contenía el gel. Se consideró que un gel presentaba solidificación si permanecía intacto después de la inversión de un recipiente de reacción que lo contenía. Un gel intacto desplegó una superficie muy nivelada en comparación con un gel no intacto.

Resultados Caracterización de masa pulposa de naranja tratada con PME vegetal El tratamiento con PME vegetal de masa pulposa de naranja dio como resultado una pectina de alto éster con un grado de esterificación promedio (%DE) de 55.2% (el %DE se determinó de acuerdo con el protocolo II).

CUADRO 1 Efecto del calcio (0.096/g citrato de Ca/100/q masa pulposa de naranja) y/o del tratamiento con PME vegetal en la resistencia del gel de masa pulposa de naranja.

La resistencia de gel de masa pulposa de naranja extraída se modificó ligeramente ya sea por el tratamiento con PME vegetal o por la adición de. calcio (Cuadro 1 ). Sin embargo, el tratamiento secuencial de la masa pulposa de naranja con PME vegetal seguido por la adición de calcio no tuvo un efecto sinergístico alguno en la resistencia de gel lograda. La inspección visual de los geles indicó que todos se encontraban en forma líquida. Estos resultados demuestran que, aunque el tratamiento con PME vegetal de la masa pulposa de naranja dio como resultado un producto más homogéneo en términos de su grado de esterificación (% DE de 55.2%) y su capacidad de respuesta a niveles bajos de calcio endógeno, la masa pulposa enzimáticamente modificada no respondió a calcio exógenamente añadido en términos de gelificación de calcio o resistencia de gel incrementada. Estos resultados demuestran también que la reacción de la masa pulposa de naranja tratada con PME vegetal, ya sea con iones de calcio añadidos endógena o exógenamente, no es suficiente para que tenga lugar un incremento satisfactorio en la resistencia del gel. La adición de un segundo substrato de pectina, tal como P66 o P60, a la masa pulposa modificada con PME vegetal, ya sea en presencia o ausencia de calcio, indujo incrementos sustanciales en la resistencia del gel en comparación con el control de masa pulposa de naranja no tratada (Cuadro II; figura 1 ). Específicamente, ambos substratos de pectina P66 y P60 indujeron incrementos de 3 y 5 veces en la resistencia del gel respectivamente; después de la adición de cada substrato a la masa pulposa de naranja modificada con PME vegetal en presencia de calcio. El incremento de veces en la resistencia del gel es ligeramente menos pronunciado para ambos substratos de pectina en ausencia de calcio en la mezcla de reacción.

La adición de substrato de pectina SS200 GRINSTED™ a la masa pulposa modificada con PME vegetal no pudo inducir un incremento en veces en la resistencia del gel, ya que el substrato de pectina SS200 GRINSTED™ no fue pretratado con PME y los substratos combinados probaron ser entonces imposibles de gelificar.

CUADRO II Efecto de substratos de pectina combinados y de calcio en la resistencia de gel lograda Se obtuvo un gel solidificado después de combinar el substrato de pectina P66 con masa pulposa de naranja modificada con PME vegetal en presencia pero no en ausencia de calcio. En contraste, se indujeron geles solidificados después de combinar el substrato de pectina P60 con masa pulposa modificada con PME vegetal ya sea en presencia o ausencia de calcio. En la figura 2 se ilustra el efecto aditivo tanto del tratamiento con PME como de la presencia de calcio en la gelificación de la pectina. Esta figura establece el incremento relativo en porcentaje en la resistencia de gel (o dureza) observado cuando se añade un substrato de pectina P66 ya sea a una masa pulposa de naranja no tratada o tratada con PME en presencia y ausencia de calcio. Los valores reales para la resistencia de gel (N) se muestran después de cada columna y el incremento relativo en porcentaje en la resistencia del gel se muestra en la parte superior de cada columna. Leyendo la figura de izquierda a derecha, la columna uno indica que la masa pulposa de naranja no tratada tiene una baja resistencia de gel, la cual, en la inspección visual, está en una forma líquida. Cuando se añade un segundo substrato de pectina, tal como P66, a la masa pulposa de naranja no tratada en ausencia de calcio, no hay efecto alguno en la resistencia de gel obtenida (columna 2). Sin embargo, si ia P66 se añade a la masa pulposa de naranja tratada con PME vegetal se observa un incremento en la viscosidad de gel (columna 3). Se observa un incremento similar a la viscosidad de gel combinando P66 con la masa pulposa de naranja no tratada en presencia de calcio (columna 4). Finalmente, si se añade P66 a masa pulposa de naranja tratada con PME vegetal en presencia de calcio, se obtiene un gel solidificado (columna 5). Estos resultados se obtienen sin importar la secuencia en la cual tenga lugar la combinación y el tratamiento con PME de los substratos. De esta manera, se obtiene un gel solidificado si un substrato de pectina URS GRINSTED™ y una preparación de masa pulposa de naranja se combinan y se tratan con PME en presencia de calcio, o si un substrato de pectina URS GRINSTED™ y una preparación de masa pulposa de naranja se pretratan con PME por separado antes de su combinación en presencia de calcio. Los experimentos descritos en las figuras 1 y 2 fueron repetidos y los resultados se establecen en el cuadro III. Una inspección visual de los geles producidos en estos experimentos confirmó los primeros descubrimientos de que: (i) la masa pulposa de naranja sola o después del tratamiento con PME vegetal y calcio, ya sea sola o en combinación, no inducirá un incremento en la resistencia de gel. (ii) La adición de calcio solo a pectina URS GRINSTED™ no cambia la funcionalidad de pectina. Asimismo, si la pectina URS GRINSTED™ no se trata con PME vegetal, se observa un incremento en viscosidad pero no en solidificación cuando ésta se combina con masa pulposa de naranja tratada con PME vegetal, ya sea en presencia o ausencia de calcio. (iii) El tratamiento de pectina URS GRINSTED™ con PME vegetal produce P66 que hace a la pectina más funcional cuando se le combina con masa pulposa de naranja tratada con PME vegetal en presencia de calcio. Esta funcionalidad incrementada significa por la inducción de la solidificación en la muestra de gel. (iv) El tratamiento de dos substratos de pectina, tales como masa pulposa de naranja y pectina URS GRINSTED™ con PME vegetal da como resultado pectinas de alto éster más funcionales, las cuales en presencia de calcio son capaces de inducir la solidificación de una mermelada de bajo contenido de sólidos.

CUADRO 3 Efecto de substratos de pectina combinados y de calcio en la resistencia de gel observada * es pectina URS GRINSTED™ Discusión Cuando se prepara una mermelada de bajo contenido de sólidos solubles a partir de un homogenato de masa pulposa de naranja, no se observa gelificación alguna incluso después del tratamiento con PME vegetal o de la adición de calcio exógeno. Asimismo, si un segundo substrato de pectina de alto éster tal como P66 se añade a una preparación de masa pulposa de naranja no tratada, no tendrá efecto alguno en su capacidad de gelificación, incluso si el segundo substrato de pectina se hace más funcional penetrándolo con una enzima PME vegetal. Sin embargo, se observará un incremento en la viscosidad del gel si un segundo substrato de pectina tal como P66 se combina con una masa pulposa de naranja no tratada en presencia de calcio. Se observa un efecto similar, en términos de un incremento en viscosidad del gel, si el mismo substrato de pectina de alto éster (P66) se combina con masa pulposa de naranja tratada con PME vegetal en ausencia de calcio. Estos resultados indican que los incrementos en la viscosidad de gel pueden inducirse ya sea por el tratamiento con PME vegetal de masa pulposa de naranja antes de la combinación con un substrato de pectina de alto éster tal como P66, o combinando masa pulposa de naranja tratada con P66 en presencia de calcio. Los resultados indican también que la combinación de masa pulposa de naranja tratada con PME vegetal con P66 en presencia de calcio dará como resultado un gel solidificado. Este efecto se obtiene sin importar la secuencia en la cual tenga lugar la combinación y el tratamiento con PME del substrato. De esta manera, se observará la solidificación del gel ya sea mediante el pretratamiento con PME de los substratos de pectina antes de la combinación, o mediante el tratamiento con PME de los substratos combinados en presencia de calcio.

Conclusión Cuando se prepara una mermelada de bajo contenido de sólidos solubles a partir de masa pulposa de naranja, no se observa gelificación alguna incluso después del tratamiento con PME vegetal de la masa pulposa de naranja o de la adición de calcio exógeno. Si se añade un segundo substrato de pectina de alto éster a una masa pulposa de naranja no tratada, éste no tendrá efecto alguno en su capacidad de gelificación, incluso si el segundo substrato se hace más funcional antes de la adición mediante el pretratamiento con una enzima PME vegetal. La combinación de masa pulposa de naranja tratada con PME vegetal con substratos de pectina de alto éster pretratados con PME, ya sea en presencia o ausencia de calcio, producirá geles con una resistencia de gel sustancialmente incrementada y funcionalidad mejorada. De esta manera, el tratamiento con PME de substratos de pectina, ya sea solo o en combinación, mejorará su capacidad de gelificación haciendo a los substratos de pectina más funcionales como substratos de alto éster en presencia de calcio.

LISTADO DE SECUENCIAS (1 ) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: DANISCO A/S (B) CALLE: LANGEBROGADE 1 , PO BOX 17 (C) CIUDAD: COPENHAGEN (E) PAÍS: DINAMARCA (F) CÓDIGO POSTAL: DK-1001 (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: COMPOSICIÓN QUE COMPRENDE METILESTERASA DE PECTINA Y DOS SUBSTRATOS (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 4 (iv) FORMA LEÍBLE POR COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disco Flexible (B) COMPUTADORA: Compatible con PC IBM (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.30 (EPO) (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 362 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 1 : Met lie Lys Asn Met Thr Asp Thr Asp Met Met lie Met Arg Thr Ser 1 5 10 15 Asn Asn Arg Lys Leu lie Glu Glu Thr Ser Thr Val Asp Gly Trp Pro 20 25 30 Ala Trp Leu Ser Thr Gly Asp Arg Arg Leu Leu Gln Ser Ser Ser Val 35 40 45 Thr Pro Asn Val Val Val Ala Ala Asp Gly Ser Gly Asn Phe Lys Thr 50 55 60 Val Ala Ala Ala Val Ala Ala Ala Pro Gln Gly Gly Thr Lys Arg Tyr 65 70 75 80 lie lie Arg He Lys Ala Gly Val Tyr Arg Glu Asn Val Glu Val Thr 85 90 95 Lys Lys His Lys Asn He Met Phe He Gly Asp Gly Arg Thr Arg Thr 100 105 1 10 He He Thr Gly Ser Arg Asn Val Val Asp Gly Ser Thr Thr Phe Lys 115 120 125 Ser Ala Thr Val Ala Val Val Gly Glu Gly Phe Leu Ala Arg Asp He 130 135 140 Thr Phe Gln Asn Thr Ala Gly Pro Ser Lys His GIn Ala Val Ala Leu 145 150 155 160 Arg Val Gly Ala Asp Leu Ser Ala Phe Tyr Asn Cys Asp Met Leu Ala 165 170 175 Tyr Gln Asp Thr Leu Tyr Val His Ser Asn Arg Gln Phe Phe Val Asn 180 185 190 Cys Leu lie Ala Gly Thr Val Asp Phe He Phe Gly Asn Ala Ala Ala 195 200 205 Val Leu Gln Asn Cys Asp He His Ala Arg Lys Pro Asn Ser Gly Gln 210 215 220 Lys Asn Met Val Thr Ala Gln Gly Arg Ala Asp Pro Asn Gln Asn Thr 225 230 235 240 Gly He Val lie GIn Lys Ser Arg lie Gly Ala Thr Ser Asp Leu Lys 245 250 255 Pro Val Gln Gly Ser Phe Pro Thr Tyr Leu Gly Arg Pro Trp Lys Glu 260 265 270 Tyr Ser Arg Thr Val He Met Gln Ser Ser He Thr Asp Val He His 275 280 285 Pro Ala Gly Trp His Glu Trp Asp Gly Asn Phe Ala Leu Asn Thr Leu 290 295 300 Phe Tyr Gly Glu His Gln Asn Ala Gly Ala Gly Ala Gly Thr Ser Gly 305 310 315 320 Arg Val Lys Trp Lys Gly Phe Arg Val He Thr Ser Ala Thr Glu Ala 325 330 335 Gln Ala Phe Thr Pro Gly Ser Phe He Ala Gly Ser Ser Trp Leu Gly 340 345 350 Ser Thr Gly Phe Pro Phe Ser Leu Gly Leu 355 360 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 584 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 2: Met Thr Arg He Lys Glu Phe Phe Thr Lys Leu Ser Glu Ser Ser Thr 1 5 10 15 Asn Gln Asn He Ser Asn He Pro Lys Lys Lys Lys Lys Leu Phe Leu 25 30 Ala Leu Phe Ala Thr Leu Leu Val Val Ala Ala Val lie Gly He Val 35 40 45 Ala Gly Val Asn Ser Arg Lys Asn Ser Gly Asp Asn Gly Asn Glu Pro 50 55 60 His His Ala He Leu Lys Ser Ser Cys Ser Ser Thr Arg Tyr Pro Asp 65 70 75 80 Leu Cys Phe Ser Ala lie Ala Ala Val Pro Glu Ala Ser Lys Lys Val 85 90 95 Thr Ser Gln Lys Asp Val He Glu Met Ser Leu Asn He Thr Thr Thr 100 105 1 10 Ala Val Glu His Asn Tyr Phe Gly He Gln Lys Leu Leu Lys Arg Thr 115 120 125 Asn Leu Thr Lys Arg Glu Lys Val Ala Leu His Asp Cys Leu Glu Thr 130 135 140 He Asp Glu Thr Leu Asp Glu Leu His Lys Ala Val Glu Asp Leu Glu 145 150 155 160 Glu Tyr Pro Asn Lys Lys Ser Leu Ser Gln His Ala Asp Asp Leu Lys 165 170 175 Thr Leu Met Ser Ala Ala Met Thr Asn Gln Gly Thr Cys Leu Asp Gly 180 185 190 Phe Ser His Asp Asp Ala Asn Lys His Val Arg Asp Ala Leu Ser Asp 195 200 205 Gly Gln Val His Val Glu Lys Met Cys Ser Asn Ala Leu Ala Met lie 210 215 220 Lys Asn Met Thr Asp Thr Asp Met Met He Met Arg Thr Ser Asn Asn 225 230 235 240 Arg Lys Leu He Glu Glu Thr Ser Thr Val Asp Gly Trp Pro Ala Trp 245 250 255 Leu Ser Thr Gly Asp Arg Arg Leu Leu Gln Ser Ser Ser Val Thr Pro 260 265 270 Asn Val Val Val Ala Ala Asp Gly Ser Gly Asn Phe Lys Thr Val Ala 275 280 285 Ala Ser Val Ala Ala Ala Pro Gln Gly Gly Thr Lys Arg Tyr He He 290 295 300 Arg He Lys Ala Gly Val Tyr Arg Glu Asn Val Glu Val Thr Lys Lys 305 310 315 320 His Lys Asn He Met Phe He Gly Asp Gly Arg Thr Arg Thr He He 325 330 335 Thr Gly Ser Arg Asn Val Val Asp Gly Ser Thr Thr Phe Lys Ser Ala 340 345 350 Thr Val Ala Val Val Gly Glu Gly Phe Leu Ala Arg Asp lie Thr Phe 355 360 365 Gln Asn Thr Ala Gly Pro Ser Lys His Gln Ala Val Ala Leu Arg Val 370 375 380 Gly Ala Asp Leu Ser Ala Phe Tyr Asn Cys Asp Met Leu Ala Tyr Gln 385 390 395 400 Asp Thr Leu Tyr Val His Ser Asn Arg Gln Phe Phe Val Asn Cys Leu 405 410 415 He Ala Gly Thr Val Asp Phe lie Phe Gly Asn Ala Ala Ala Val Leu 420 425 430 Gln Asn Cys Asp He His Ala Arg Lys Pro Asn Ser Gly Gln Lys Asn 435 440 445 Met Val Thr Ala Gln Gly Arg Ala Asp Pro Asn GIn Asn Thr Gly He 450 455 460 Val lie Gln Lys Ser Arg lie Gly Ala Thr Ser Asp Leu Lys Pro Val 465 470 475 480 Gln Gly Ser Phe Pro Thr Tyr Leu Gly Arg Pro Trp Lys Glu Tyr Ser 485 490 495 Arg Thr Val He Met Gln Ser Ser He Thr Asp Val He His Pro Ala 500 505 510 Gly Trp His Glu Trp Asp Gly Asn Phe Ala Leu Asn Thr Leu Phe Tyr 515 520 525 Gly Glu His Gln Asn Ala Gly Ala Gly Ala Gly Thr Ser Gly Arg Val 530 535 540 Lys Trp Lys Gly Phe Arg Val He Thr Ser Ala Thr Glu Ala Gln Ala 545 550 555 560 Phe Thr Pro Gly Ser Phe He Ala Gly Ser Ser Trp Leu Gly Ser Thr 565 570 575 Gly Phe Pro Phe Ser Leu Gly Leu 580 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1323 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) 0 (¡ii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTISENTlDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 3: GTAGCAATGC GCTTGCTATG ATCAAGAACA TGACTGACAC TGACATGATG ATCATGAGGA 60 CTTCAAACAA CAGGAAGCTG ATAGAGGAGA CCAGTACGGT TGATGGGTGG CCGGCGTGGC 120 o TGTCCACCGG AGACAGGAGG CTGTTGCAGT CCTCGTCGGT GACACCGAAC GTGGTGGTGG 180 CAGCAGATGG CAGCGGAAAC TTTAAGACGG TGGCGGCAGC GGTGGCGGCG GCTCCTCAGG 240 GAGGCACTAA GCGGTATATT ATTAGGATTA AAGCCGGTGT TTATCGGGAA AATGTTGAGG 300 TGACAAAGAA GCATAAAAAT ATAATGTTCA TCGGTGACGG GAGGACTAGA ACTATCATCA 360 CAGGAAGTAG AAATGTGGTT GATGGAAGCA CAACTTTCAA GTCTGCTACA GTTGCTGTTG 420 TTGGTGAAGG ATTCTTGGCC CGAGACATTA CATTCCAAAA CACAGCCGGC CCCTCAAAGC 480 ACCAGGCGGT GGCACTACGA GTGGGAGCTG ACCTTTCAGC ATTTTACAAT TGCGATATGT 540 TAGCTTACCA AGACACACTC TACGTCCACT CGAACCGCCA GTTCTTTGTG AACTGCTTAA 600 TTGCTGGCAC GGTTGATTTT A l I I I I GGTA ACGCTGCAGC CGTGTTACAA AATTGTGACA 660 TCCATGCACG AAAGCCCAAT TCCGGCCAAA AAAATATGGT CACAGCCCAA GGCAGGGCTG 720 ACCCTAACCA AAACACCGGC ATTGTCATTC AAAAATCTAG GATTGGTGCC ACCTCCGATT 780 TAAAACCGGT TCAGGGTAGT TTCCCGACGT ACCTCGGCAG GCCCTGGAAG GAGTACTCGA 840 GGACGGTGAT CATGCAGTCA TCGATTACTG ACGTGATCCA CCCTGCCGGG TGGCACGAGT 900 GGGATGGTAA CTTCGCGTTG AACACATTGT TTTACGGAGA GCATCAGAAC GCCGGAGCCG 960 GTGCCGGAAC TTCAGGGAGA GTGAAATGGA AGGGATTTAG GGTTATTACA AGTGCTACCG 1020 AGGCTCAAGC TTTTACTCCT GGAAGCTTCA TTGCTGGTAG TAGCTGGCTG GGCTCCACTG 1080 GTTTCCCATT CTCCCTTGGT TTGTAATATT CACTAGGAGT TTTAATTAAT ATGTTTTGTA 1140 TTAGTGGATC CATAGGTCTC TGGTCTTTCA ATTTGTAATA TTTGATTGAG CGTGTCTTAT 1200 TCGTGGCTTC GATTTCACAA ATACTATTGT GTGATTAACA AGAAATAAAA TAGCATGGGA 1260 AGAATAATAA TTTCCGGCTT CTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 1320 AAA 1323 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1975 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (¡i) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 4: CTTTTGTTCT CTCTTATCGA GAAAAAAAAT GACCCGCATA AAAGAATTCT TCACAAAACT 60 TTCTGAATCT TCTACCAACC AAAACATTTC CAATATTCCC AAGAAAAAAA AGAAACTATT 120 CTTAGCTCTT TTTGCAACGC TACTCGTTGT CGCTGCCGTA ATCGGCATTG TCGCCGGAGT 180 GAACTCAAGA AAAAACTCCG GCGACAACGG CAACGAGCCT CATCATGCTA TCCTCAAATC 240 ATCATGTAGC AGCACAAGGT ACCCGGACTT ATGCTTTTCG GCTATTGCTG CCGTTCCAGA 300 GGCCTCCAAA AAGGTGACAA GCCAAAAGGA CGTTATTGAG ATGTCCTTAA ACATCACAAC 360 AACAGCCGTG GAACACAACT ACTTCGGGAT TCAGAAGCTC TTGAAGAGAA CGAATCTCAC 420 CAAACGGGAA AAGGTTGCTC TCCATGACTG TCTTGAGACG ATCGATGAGA CTCTTGATGA 480 GTTACACAAA GCCGTCGAGG ATCTTGAGGA GTACCCGAAC AAGAAATCTT TATCACAGCA 540 TGCGGATGAT CTCAAAACCC TAATGAGTGC CGCGATGACC AATCAGGGGA CGTGTCTTGA 600 TGGGTTCTCT CATGATGATG CTAATAAGCA CGTGCGGGAT GCGTTGTCAG ACGGCCAGGT 660 TCATGTTGAG AAGATGTGTA GCAATGCGCT TGCTATGATC AAGAACATGA CTGACACTGA 720 CATGATGATC ATGAGGACTT CAAACAACAG GAAGCTGATA GAGGAGACCA GTACGGTTGA 780 TGGGTGGCCG GCGTGGCTGT CCACCGGAGA CAGGAGGCTG TTGCAGTCCT CGTCGGTGAC 840 ACCGAACGTG GTGGTGGCAG CAGATGGCAG CGGAAACTTT AAGACGGTGG CGGCATCGGT 900 GGCGGCGGCT CCTCAGGGAG GCACTAAGCG GTATATTATT AGGATTAAAG CCGGTGTTTA 960 TCGGGAAAAT GTTGAGGTGA CAAAGAAGCA TAAAAATATA ATGTTCATCG GTGACGGGAG 1020 GACTAGAACT ATCATCACAG GGAGTAGAAA TGTGGTTGAT GGAAGCACAA CTTTCAAGTC 1080 TGCTACAGTT GCTGTTGTTG GTGAAGGATT CTTGGCCCGA GACATTACAT TCCAAAACAC 1140 AGCCGGCCCC TCAAAGCACC AGGCGGTGGC ACTACGAGTG GGAGCTGACC TTTCAGCATT 1200 TTACAATTGC GATATGTTAG CTTACCAAGA CACACTCTAC GTCCACTCGA ACCGCCAGTT 1260 CTTTGTGAAC TGCTTAATTG CTGGCACGGT TGATTTTATT TTTGGTAACG CTGCAGCCGT 1320 GTTACAAAAT TGTGACATCC ATGCACGAAA GCCCAATTCC GGCCAAAAAA ATATGGTCAC 1380 AGCCCAAGGC AGGGCTGACC CTAACCAAAA CACCGGCATT GTCATTCAAA AATCTAGGAT 1440 TGGTGCCACC TCCGATTTAA AACCGGTTCA GGGTAGTTTC CCGACGTACC TCGGCAGGCC 1500 l o CTGGAAGGAG TACTCGAGGA CGGTGATCAT GCAGTCATCG ATTACTGACG TGATCCACCC 1560 TGCCGGGTGG CACGAGTGGG ATGGTAACTT CGCGTTGAAC ACATTGTTTT ACGGAGAGCA 1620 TCAGAACGCC GGAGCCGGTG CCGGAACTTC AGGGAGAGTT AAATGGAAGG GATTTAGGGT 1680 TATTACAAGT GCTACCGAGG CTCAAGCTTT TACTCCTGGA AGCTTCATTG CTGGTAGTAG 1740 15 CTGGCTGGGC TCCACTGGTT TCCCATTCTC CCTTGGTTTG TAATATTCAC TAGGAGTTTT 1800 AATTAATATG TTTTGTATTA GTGGATCCAT AGGTCTCTGG TCTTTCAATT TGTAATATTT 1860 GATTGAGCGT GTCTTATTCG TGGCTTCGAT TTCACAAATA CTATTGTGTG ATTAACAAGA 1920 0 AATAAAATAG CATGGGAAGA ATAATAATTT CCGGCTTCTT TAAATTAAAA AAAAA 1975

Claims (18)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1.- Una composición de gelificación que comprende una metilesterasa de pectina (PME), un substrato de PME; y una pectina tratada con PME o derivado de la misma; caracterizada porque ni el substrato de PME ni la pectina se originan in situ uno del otro. 2.- Una composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la PME es recombinante. 3.- Una composición de conformidad con la reivindicación 1 o reivindicación 2, caracterizada además porque el substrato de PME es pectina o un derivado de la misma. 4.- Una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque el substrato de PME está presente dentro de una planta y/o un material vegetal. 5.- Una composición de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque la planta o material vegetal es cualquiera o más de un vegetal, un material vegetal, una fruta o un material de fruta. 6.- Una composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque el material vegetal y/o el material de fruta es una masa pulposa. 7.- Una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque la pectina tratada con PME o derivado de la misma es una pectina de alto éster. 8.- Una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque el substrato de PME es un substrato de alto éster. 9.- Una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que se encuentra en un estado de gel solidificado y tiene un contenido de sólidos solubles de menos de 50% p/p. 10.- Una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque la composición es un artículo alimenticio o se usa en la preparación de un artículo alimenticio. 1 1.- Un método para preparar una composición que comprende un substrato de PME y una pectina tratada con PME o derivado de la misma, el método comp ende tratar un substrato de PME y una pectina o derivado de la misma con PME antes de, durante y/o después de combinar dicho substrato y pectina o derivado de la misma para formar la composición; caracterizado porque ni el substrato de PME ni la pectina o derivado de la misma se originan in situ uno del otro. 12.- Un método de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizado además porque la PME es recombinante. 13.- Un método de conformidad con la reivindicación 1 1 o reivindicación 12, caracterizado además porque el substrato de PME es como se define en cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6. 14.- Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 1 a 13, caracterizado además porque el método es para la preparación de un artículo alimenticio. 15.- Un método para impartir estabilidad a un medio de reacción que comprende un substrato de PME, el cual comprende añadir por lo menos una PME y una pectina o derivado de la misma; caracterizado porque ni el substrato de PME ni la pectina o derivado de la misma se originan in situ uno del otro. 16.- Un método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque el medio de reacción es un artículo alimenticio o es para preparar un artículo alimenticio. 17.- Una composición que puede obtenerse por medio del método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 1 a 13. 18.- Una composición de conformidad con la reivindicación 17, que se encuentra en un estado de gel solidificado y que tiene un contenido de sólidos solubles de menos de 50% p/p.