MXPA99007979A

MXPA99007979A - Molecula de superficie celular mediadora de adhesion celular y de transmision de señales

Info

Publication number: MXPA99007979A
Application number: MXPA/A/1999/007979A
Authority: MX
Inventors: Tamatani Takuya; Tezuka Katsunari
Original assignee: Japan Tobacco Inc
Priority date: 1997-02-27
Filing date: 1999-08-27
Publication date: 2000-08-01

Abstract

La presente invención se refiere a las moléculas de superficie celular novedosas, reconocidas por los anticuerpos monoclonales contra una molécula de superficie celular de células linfocíticas, que tienen un papel importante en las enfermedades autoinmunes y en las enfermedades alérgicas, se han aislado, identificado, y analizado, para determinar sus funciones. Las moléculas de superficie celular se expresan específicamente en los timocitos, los linfocitos activados mediante el estimulo de ConA, y los linfocitos de la sangre periférica, e inducen adhesión celular. Los anticuerpos contra las moléculas de superficie celular aminoran de una manera significativa las condiciones patológicas de enfermedades autoinmunes y enfermedades alérgicas.

Description

MOLÉCULA DE SUPERFICIE CELULAR MEDIADORA DE ADHESIÓN CELULAR Y DE TRANSMISIÓN DE SEÑALES Campo Técnico La presente invención se refiere a novedosas moléculas de superficie celular de mamíferos; a polipéptidos y sus fragmentos que constituyen las moléculas; a polipéptidos de fusión que comprenden los fragmentos de polipéptido y fragmentos de inmunoglobulina; a genes que codifican los polipéptidos y los fragmentos; a vectores que comprenden los genes; a transformantes en los que se introducen los vectores; a anticuerpos que tienen reactividad a los polipéptidos o a las moléculas de superficie celular que comprenden los polipéptidos; a hibridomas que producen los anticuerpos; a composiciones farmacéuticas que comprenden los fragmentos de polipéptidos o los polipéptidos de fusión; a composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos; a ratones transgénicos; y a ratones knockout (con reducción genética) .

Técnica Antecedente Un cuerpo vivo de mamífero tiene sistemas de respuesta inmune que excluye microorganismos patogénicos (virus, bacterias, parásitos, etcétera) o cuerpos extraños (ambos se denominan "antígeno" en lo siguiente) que han invadido el cuerpo vivo. Uno de ellos se denomina sistema de respuesta inmune natural, y otro, sistema de respuesta inmune adquirida. El primero es un mecanismo de exclusión que comprende fagocitosis por parte de los fagocitos (leucocitos polimorfonucleares, monocitos, macrófagos, etcétera) , ataque por células aniquiladoras naturales (NK) , y reconocimiento no específico, tal como opsonización de antígeno por parte de los complementos. El último, el sistema de respuesta inmune adquirida, es un mecanismo de exclusión por parte de los linfocitos (principalmente células T y células B) que adquirieron la especificidad para el antígeno (es decir, linfocitos activados) . Las células B que adquirieron la especificidad del antígeno atacan al antígeno que existe afuera de las células a través de la producción de anticuerpos específicos para el antígeno. Las células T que adquirieron especificidad del antígeno (es decir, células T activadas) se clasifican en células T auxiliares y células T citotóxicas (linfocito citotóxico, CTL) . Las células T auxiliares regulan una diferenciación de las células B y una producción de anticuerpos, y destruyen al antígeno que coopera con los fagocitos. Las últimas, CTLs atacan a las células infectadas por virus, y así sucesivamente por ellas mismas (Experimental Medicine: SUPLEMENTO, "Bio Science Term Library, Immunity" , Yodosha, páginas 14-17 (1995) ) . Esta adquisición de especificidad de antígeno por parte de las células T (es decir, activación de células T) se inicia a través del reconocimiento por parte de las células T del antígeno presentado por las células presentadoras de antígeno (APC) , tales como macrófagos, células B, o células dendríticas . Las células presentadoras del antígeno procesan los antígeno así incorporados, y presentan estos antígenos procesados a través de su enlace con el complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) . Las células T reciben la señal primaria para la activación de las células (o adquisición de especificidad) , mediante el reconocimiento de los antígenos procesados presentados por las células presentadoras de antígeno a través de un complejo entre el receptor de células T (PCR) y el antígeno CD3 que existe sobre la superficie de la membrana celular (complejo TcR/CD3) . Sin embargo, la señal primaria mediada por el complejo TcR/CD3 sola no puede activar las células T lo suficiente, y conduce a una falta de responsividad o anergia clonal, de tal manera que las células no pueden reaccionar con cualquier estímulo recibido posteriormente . La autocrina de la interleucina 2 (IL-2) es necesaria para que se activen las células T, para diferenciarse en clones de células T específicas de antígeno, y para proliferarse . En la anergia clonal, las células T se inactivan debido a que no hay producción de IL-2, y no hay división celular. Es decir, la activación de las células T acompañada por la producción de citoquinas, tales como IL-2, requiere de la señal secundaria en seguida de la primera señal a través del complejo TcR/CD3. Esta señal secundaria se denomina señal coestimulante. Las células T reciben esta señal secundaria, y la transmiten a las células mediante su interacción (adhesión celular) con moléculas diferentes de MHC o células presentadoras de antígeno, a través de moléculas diferentes del complejo TcR/CD3 sobre la superficie de las células T. Esta señal secundaria evita la anergia celular (anergia clonal) , y activa las células. Aunque alguna parte del mecanismo de la transmisión de la señal secundaria entre las células presentadoras de antígeno y los linfocitos, tales como las células T, no se ha elucidado todavía con detalle, los estudios hasta ahora han revelado que un factor importante para la transmisión de la señal secundaria es la interacción de CD28 (también denominado Tp44, T44, ó antígeno 9.3), que es una molécula de superficie celular expresada principalmente sobre las células T y las células del timo, con CD80 (también denominada B7-1, B7, BB1, ó B7/BB1) , que es una molécula de superficie celular expresada sobre las células presentadoras de antígeno (macrófagos, monocitos, células dendríticas, etcétera) , y con CD86 (también denominada B7-2 ó B70) , que también es una molécula de superficie celular sobre las células presentadoras de antígeno (es decir, adhesión celular a través del enlace entre estas moléculas) . Más aún, se ha elucidado experimentalmente que la interacción del antígeno 4 asociado con linfocito citolítico T (CTLA-4) , cuya expresión se piensa que se mejora dependiendo de la señal secundaria, con el CD80 (B7-1) y el CD86 (B7-2) (es decir, adhesión celular a través del enlace entre estas moléculas) , también tiene un papel importante en la regulación de la activación de células T por la señal secundaria. En otras palabras, la regulación de la activación de células T mediante la transmisión de la señal secundaria involucra cuando menos la interacción entre CD28 y CD80/CD86, la mejora de la expresión de CTLA-4, que se piensa que depende de la interacción, y la interacción entre CTLA-4 y CD80/CD86. Se sabe que el CD28 es una molécula coestimulante que transmiten la señal secundaria (señal coestimulante) requerida para la activación de las células T, y para evitar la anergia. La señal secundaria transmitida mediante el enlace de esta molécula con moléculas coestimulantes, CD80 (B7-1) y CD86 (B7-2) , sobre las células presentadoras de antígeno (adhesión celular a través del enlace entre estas moléculas) , estabiliza el JARNm de las citoquinas de tipo Thl, y en consecuencia, promueve la producción por parte de las células T, de una gran cantidad de citoquinas de tipo Thl, tales como IL-2, IFN?, y TNFa.. La expresión de CTLA-4 se induce mediante la señal primaria trasmitida a través de TcR/CD3, y la expresión también se mejora mediante la señal secundaria transmitida por el enlace entre CD28 y CD80. Se está revelando que el CTLA-4 recibe estas señales para trabajar con el fin de inhibir la función de las células T, lo cual es contrario a la activación de las células T por parte de la señal secundaria transmitida por CD28. El CD28 humano y el CTLA-4 son glicoproteínas de tipo I cuyos pesos moleculares son de 44 kD y de 41 a 43 kD, respectivamente. Ambos tienen un dominio de tipo de inmunoglobulina, pertenecen a la superfamilia de inmunoglobulina, y tienen tanto función como una molécula de adhesión celular, como una función como una molécula de transmisión de señales. El CD28 humano forma un homodímero con un enlace de disulfuro, mientras que el CTLA-4 existe como un monómero. Ambos genes CD28 y CTLA-4 se localizan en "2q33" en el cromosoma humano, y " 1C" en el cromosoma de ratón, y se componen de cuatro (4) exones. El CD28 humano y el CTLA-4 se componen de 220 y 223 aminoácidos, respectivamente, incluyendo las secuencias líder, y la homología de aminoácidos entre ellos es del 20 al 30 por ciento. Los ligandos para CD28 y CTLA-4 son CD80 (B7-1) y CD86 (B7-2) en seres humanos y en ratones. El CTLA-4 tiene aproximadamente 20 veces más afinidad con ambos ligandos que el CD28. Se ha elucidado que las estructuras de la secuencia de aminoácidos "MYPPPY (Met-Tyr-Pro-Pro-Pro-Tyr) " conservadas a través de las especies animales son importantes para el enlace de CD28 y CTLA-4 con CD80 (B7-1) . También se ha reportado que, cuando se estimula CD28, la quinasa PI3 (quinasa de fosfoinositida 3, PI3K) se asocia con el residuo de tirosina fosforilada en una secuencia parcial "YMNM (Tyr-Met-Asn-Met) " del CD28, y que el CD28 tiene un papel importante en la transmisión de señales intracelulares a través de esta estructura "YxxM" . Además, se ha reportado que el CTLA-4 también tiene una secuencia representada por "YxxM", es decir, "YVKM (Tyr-Val-Lys-Met) " en su región citoplásmica, y que, después de estimularse, el SYP se asocia con esta secuencia. El CD28 se expresa específicamente en los timocitos y en las células T sanguíneas periféricas, y el CTLA-4 se expresa específicamente en las células activadas (Cell Engineering: SUPLEMENTO, "Handbook of Adhesión Molecule", Shujunsha, páginas 93-102 (1994) ; ibid. páginas 120-136; Experimental Medicine: SUPLEMENTO, "BIO SCIENCE Term Library, Immunity" , Yodosha, páginas 94-98 (1995); Experimental Medicine: SUPLEMENTO, "BIO SCIENCE Term Library, Intracellular -Signal Transduction", Yodosha, páginas 58-59 (1997); Nihon Rinsho, Volumen 55, Número 6, páginas 215-220 (1997) . En la regulación de la función de células T (la activación y la inhibición de la función de células T) , de esta manera, se ha reconocido la importancia de las interacciones entre múltiples moléculas, tales como moléculas coestimulantes (CD28, CD80 (B7-1), CD86 B7-2), etcétera) y CTLA-4 que coopera con ellas (en otras palabras, adhesión celular a través del enlace entre estas moléculas) , y esto ha dirigido la atención a la relación entre estas moléculas y las enfermedades, y el tratamiento de las enfermedades mediante la regulación de la función de estas moléculas . Como se describió anteriormente, aunque un cuerpo vivo active su sistema de respuesta inmune adquirida contra los antígenos que sean cuerpos extraños para el cuerpo vivo (mismo) , también una tolerancia inmunológica para no demostrar respuesta inmune alguna contra su propio componente (autoantígeno) . Si se rompe la tolerancia inmunológica por alguna razón, se presenta la respuesta inmune para el autoantígeno, se inducen las células T que reaccionan con el autoantígeno mediante el mismo mecanismo que se mencionó anteriormente, para caer en un estado anormal de inmunidad, y se provocan diferentes enfermedades autoinmunes . En otras palabras, debido a que las células presentadoras de antígeno no estimuladas (APC) en los tejidos normales no expresan moléculas coestimulantes cuando el sistema inmune de un cuerpo vivo es normal, las células T están en el estado no responsivo para mantener la tolerancia inmunológica, inclusive cuando existan células T reactivas al autoantígeno, que reaccionen con el autoantígeno. Se ha sugerido que, en un estado anormal de inmunidad, se activan más células T reactivas al autoantígeno debido a un exceso anormal y a la expresión continua de moléculas coestimulantes, para ocasionar de esta manera enfermedades autoinmunes . A partir de estos puntos de vista, recientemente se han propuesto muchos intentos para tratar diferentes enfermedades autoinmunes mediante la modulación de la transmisión de señales coestimulantes, por ejemplo, la transmisión de señales anteriormente mencionada entre CD28/CTLA-4 y CD80/CD86. Se ha observado que el CD80, una molécula coestimulante como el ligando de CD28 y CTLA-4, se expresa de una manera anormal en las células presentadoras de antígeno, en el nido de la enfermedad autoinmune, tal como artritis reumatoide, esclerosis múltiple, tiroiditis autoinmune, dermatitis de tipo de contacto alérgico, y dermatosis inflamatoria crónica, tal como lichen planus y psoriasis. A partir de esta observación, se han hecho muchos intentos por tratar diferentes enfermedades autoinmunes mediante la modulación de la función de CD80. Se ha propuesto bloquear la función de CD80, mediante métodos que utilizan un anticuerpo contra CD80, proteína solubilizada de CD80 que es un ligando de CD80, y proteína solubilizada de CTLA-4 que también es un ligando de CD80. De una manera particular, basándose en el hecho de que la afinidad de enlace de CTLA-4 con CD80 es 20 o más veces más alta que la del CD28, se realizaron intentos terapéuticos utilizando "CTLA-4 solubilizado" , específicamente, la proteína de fusión (CTLA-4-IgFc) que comprende el dominio extracelular de "CTLA-4", y la región Fc de inmunoglobulina humana IgGl, en pruebas clínicas y de modelos animales (Nihon Rinsho, Volumen 55, Número 6, páginas 215-220 (1997)). Como se muestra en 1 a 5 más adelante, se han reportado los efectos terapéuticos de CTLA-4-IgFc en modelos animales de enfermedades autoinmunes . 1. En un ratón (NZB/NZW)F1, que es un modelo para el lupus eritematoso sistémico (SLE) humano, se suprimió la producción de autoanticuerpos y el establecimiento de lupus nefritis, mediante la administración de CTLA-4-IgFc antes del establecimiento, y se mejoraron las condiciones patológicas mediante la administración del fármaco, inclusive después del establecimiento (Science, Volumen 125, páginas 1225-1227 (1994) ) . 2. En encefalomielitis alérgica experimental (EAE) , que es un modelo para esclerosis múltiple (MS) , se impidió el establecimiento mediante la administración de corto plazo de CTLA-4-IgFc inmediatamente después de la inmunización (J. Clin. Invest. Volumen 95, páginas 2783-2789 (1995)). 3. En un ratón NOD (diabetes que no es por obesidad) , que es un modelo para diabetes melitus dependiente de insulina (IDDM) , la velocidad de establecimiento se redujo notablemente mediante la administración de CTLA-4-IgFc a los ratones hembras de dos o de tres semanas de edad durante 2 semanas (J. Exp. Med., Volumen 181, páginas 1145-1155 (1995)). 4. En nefritis de rata por inmunidad de membrana de basamento glomeruloso renal, el modelo de nefritis de Goodpasture, ha aumentado la mejora del síntoma mediante la administración de CTLA-4-IgFc (Eur. J. Immunol . Volumen 24, Número 6, páginas 1249-1254 (1994)). 5. En artritis inducida por colágeno tipo II (CÍA) utilizando un ratón DBA/1, es decir, un modelo para artritis reumatoide humana, se suprimió el establecimiento de artritis mediante la administración del fármaco de prueba en el momento de la inmunización, y se inhibió la producción de autoanticuerpos (IgGl e IgG2) contra colágeno (Eur. J. Immünol., Volumen 26, páginas 2320-2328 (1996)). Los resultados de los experimentos mencionados anteriormente todavía no han aclarado con detalle el mecanismo de la activación de células T mediante la interacción entre las moléculas coestimulantes y las moléculas relacionadas (en otras palabras, la adhesión celular a través del enlace entre estas moléculas) . Puede haber otras moléculas desconocidas involucradas en este mecanismo.

Divulgación de la Invención Se pueden desarrollar productos farmacéuticos útiles para el tratamiento o la prevención de diferentes enfermedades, tales como las enfermedades autoinmunes anteriormente mencionadas, enfermedades alérgicas, y enfermedades inflamatorias, si se aclara el mecanismo de la activación de los linfocitos, tales como células T, mediante adhesión celular, a través del enlace entre las moléculas involucradas en la transmisión de la señal secundaria esencial para la activación de linfocitos, tales como células T mencionadas anteriormente, y el mecanismo de la regulación de la función de los linfocitos, y se identifican y caracterizan las moléculas conocidas o desconocidas capaces de mediar la adhesión celular involucrada en el mecanismo, y de transmitir señales. Un objetivo de la presente invención es identificar moléculas de superficie celular novedosas que tengan ambas funciones de mediar esta adhesión celular y transmisión de señales, y aclarar sus características estructurales y biológicas. Otro objetivo de la presente invención es proporcionar productos farmacéuticos útiles para el tratamiento o la prevención de diferentes enfermedades autoinmunes y enfermedades inflamatorias, mediante la utilización de las moléculas novedosos o anticuerpos contra las moléculas. Con el objeto de identificar estas moléculas útiles, los presentes inventores se enfocaron en el hecho de que los linfocitos, tales como las células T, tienen un papel importante en las enfermedades autoinmunes y en las enfermedades alérgicas, y el hecho de que_ la adhesión celular sea esencial para la transmisión de la señal secundaria (señal coestimulante) desde las células presentadoras de antígeno hasta los linfocitos, y planearon aislar e identificar moléculas de superficie celular que se expresaran específicamente sobre las células linfocíticas, y que mediaran la adhesión celular. Los presentes inventores obtuvieron anticuerpos monoclonales contra diferentes moléculas de superficie celular expresadas sobre la superficie de las células linfocíticas, mediante la inmunización de animales contra las células linfocíticas, y aislaron e identificaron las moléculas de superficies celular deseadas, que median la adhesión celular utilizando los anticuerpos monoclonales así obtenidos. Los métodos utilizados se describen con detalle más adelante. Los presentes inventores primero administraron la linea celular linfocítica de rata como un antígeno a ratones y prepararon diferentes anticuerpos monoclonales. Luego, los anticuerpos monoclonales obtenidos se hicieron reaccionar con células linfocíticas de rata utilizadas como un antígeno, y probaron el efecto que daban los anticuerpos monoclonales a las células. Como resultado, se encontró que uno de los anticuerpos monoclonales aglutina fuertemente las células linfocíticas de rata (este anticuerpo monoclonal se designó como "anticuerpo JTT-1") . Más aún, se encontró que otro de los anticuerpos monoclonales inhibe fuertemente la aglutinación de células linfocíticas de rata inducidas por el "anticuerpo "JTT-1" (este anticuerpo monoclonal se designó como "anticuerpo JTT-2") . Debido a que la aglutinación de células linfocíticas de rata por el "anticuerpo JTT-1" no era inhibida por lo anticuerpos contra la molécula de adhesión intercelular-1 (ICAM-1) o el antígeno-1 asociado con la función del linfocito (LFA-1) , que son las moléculas de adhesión celular conocidas más representativas expresadas en las células, los presentes inventores pensaron que esta aglutinación era ocasionada por la adhesión celular a través de moléculas de adhesión desconocidas que medien la adhesión celular. Entonces se identificaron, se aislaron, y se caracterizaron moléculas de superficie celular (designadas como "antígeno JTT-1" y "antígeno JTT-2") reconocidas por cada uno de estos dos anticuerpos monoclonales . Primero, se analizaron los análisis de los patrones de expresión del "antígeno JTT-1" y del "antígeno JTT-2" en diferentes células mediante citometría de flujo basada en la técnica de anticuerpo fluorescente, utilizando "anticuerpo JTT-1" y "anticuerpo JTT-2". Aunque tanto el "antígeno JTT-1" como el "antígeno JTT-2" se expresaron fuertemente en las células de linfoblasto activadas (células de linfoblasto T activadas, células de linfoblasto B activadas, etcétera) , activadas mediante el estímulo de los timocitos y las células del bazo con Concanavalina A (ConA) , un mitógeno, en particular, en las células de linfoblasto activadas, difícilmente se encontró la expresión en las células del bazo no estimuladas (estas células algunas veces son denominadas como "linfocitos en reposo" en la presente) . Los patrones de expresión de las moléculas reconocidas por cada uno del "anticuerpo JTT-1" y el "anticuerpo JTT-2" fueron casi iguales. Utilizando una columna de afinidad preparada mediante el enlace del "anticuerpo JTT-1" a adsorbentes, se purificaron moléculas atrapadas por el "anticuerpo JTT-1", es decir, "antígenos JTT-1", de la mezcla de moléculas de superficie celular solubles preparadas a partir de las células linfocíticas de rata anteriormente descritas. Los pesos moleculares de estos "antígenos JTT-1" purificados se analizaron mediante inmunoprecipitación, utilizando el "anticuerpo JTT-1" y el "anticuerpo JTT-2", y mediante SDS-PAGE. Como resultado, se encontró que las moléculas inmunoprecipitadas por cada uno del "anticuerpo JTT-1" y el "anticuerpo JTT-2" eran las mismas, y que cada molécula era un homodímero que tenía diferentes cadenas de azúcar. De una manera específica, cuando no se digerían las cadenas de azúcar N-enlazadas, las moléculas se identificaban como una molécula con aproximadamente 47 kD bajo una condición que no fuera de reducción, y como dos moléculas con aproximadamente 24 kD y aproximadamente 28 kD bajo condiciones de reducción; cuando se digerían las cadenas de azúcar N-enlazadas, las moléculas se identificaban como una molécula con aproximadamente 36 kD bajo condiciones que no fueran de reducción, y como una molécula con aproximadamente 20 kD bajo condiciones de reducción. Luego se analizó la adhesión de los timocitos de rata a la placa recubierta por el "antígeno JTT-1" purificado. Como resultado, los timocitos se adhirieron de una manera significativa a la placa (es decir, al "antígeno JTT-1") solamente en la presencia del "anticuerpo JTT-1", y la adhesión fue significativamente inhibida en la co-presencia del "anticuerpo JTT-2", indicando que el "antígeno JTT-1" era la molécula de superficie celular que mediaba la adhesión celular. En seguida, los presentes inventores clonaron genes que codificaban el "antígeno JTT-1" de rata, humano, y de ratón, y analizaron su estructura. Primero, se aisló el ADNc se codificaba la longitud completa del "antígeno JTT-1 de rata" a partir de la biblioteca de ADNc hecha de los linfoblastos derivados a partir de bazo de rata estimulado con ConA, mediante el método de clonación de expresión, utilizando el método panorámico que utiliza el "anticuerpo JTT-1", y se aisló e identificó un gen de rata completamente novedoso mediante la determinación de su secuencia de nucleótidos mediante el método de didesoxi. El ADNc que codifica la longitud completa del "antígeno JTT-1 humano" también se aisló a partir de la biblioteca de ADNc de linfoblastos de sangre periférica humana estimulados con ConA, mediante hibridación de placa, utilizando el ADNc que codificaba el "antígeno JTT-1 de rata" así obtenido, como una sonda, y se aisló e identificó un gen humano completamente novedoso mediante la determinación de su secuencia de nucleótidos por medio del método de didesoxi . De una manera similar, se aisló el ADNc se codificaba la longitud completa del "antígeno JTT-1 de ratón" a partir de la biblioteca de ADNc hecha de los linfoblastos derivados a partir de bazo de ratón estimulado con ConA, y se aisló e identificó un gen de ratón completamente novedoso mediante la determinación de su secuencia de nucleótidos por medio del método de didesoxi . Además, se aisló similarmente el ADNc que codificaba la longitud completa de la variante de empalme alternativa del "antígeno JTT-1 de rata" mencionado anteriormente, a partir de la biblioteca de ADNc hecha de la línea celular de timoma de rata, y se aisló e identificó otro gen de rata completamente novedoso mediante la determinación de su secuencia de nucleótidos por medio del método de didesoxi . Se encontró que el "antígeno JTT-1" es una proteína transmembrana (molécula de superficie celular) compuesta de una secuencia de señal, una región extracelular que tiene los sitios de glicosilación, una región transmembrana, y una región intracelular, mediante análisis de gráfica de hidropatía de la secuencia de aminoácidos codificada por el ADNc aislado del "antígeno JTT-1 humano" . La búsqueda de homología con moléculas conocidas reveló que los "antígenos JTT-1" de rata, humano, y de ratón, no tenían una homología significativa con cualesquiera moléculas conocidas, incluyendo las moléculas de adhesión celular, indicando que son moléculas de superficie celular novedosas que median la adhesión celular. Como el resultado de la búsqueda de motivos basada en la secuencia de aminoácidos del "antígeno JTT-1 humano", se encontró que el "antígeno JTT-1 humano" tenía similitud estructural con el "CD28" anteriormente mencionado, una molécula de superficie celular sobre los linfocitos, tales como las células T, que transmite una señal coestimulante importante para la activación de células T a través de la adhesión celular, y con "CTLA-4", una molécula de superficie celular sobre los linfocitos, tales como las células T, que regula las funciones de los linfocitos activados, tales como las células T activadas, cooperando con la señal. La similitud estructural es como sigue: 1. Se conservan altamente 20 o más residuos de aminoácido, incluyendo los residuos de cisteína. 2. Se conserva la secuencia de repetición de prolina "Pro-Pro-Pro (PPP) " esencial como la región de enlace del ligando, en la región extracelular. 3. Se conserva una secuencia "Tyr-Xaa-Xaa-Met (YxxM) " (Xaa y x representan cualquier aminoácido) , esencial como la región de transmisión de señal, en la región citoplásmica . Se encontró que el lugar del gen que codifica el "antígeno JTT-1 de ratón" en el cromosoma de ratón, es el "1C3", que es la misma localización que aquella del ratón "CD28" y "CTLA-4" utilizando el método de hibridación de fluorescencia en el sitio (FISH) . En seguida, se examinó la efectividad de la terapia de las enfermedades autoinmunes y de las enfermedades alérgicas mediante la regulación de la función del "antígeno JTT-1", mediante experimentos en donde se administró el "anticuerpo JTT-2" mencionado anteriormente a ratas modelo para encefalomielitis alérgica experimental (EAE) , y nefritis de membrana de basamento glomerular (GBM) . Se encontró que se suprimían de una manera significativa los estados patológicos en ambos animales modelo de enfermedad, y que las enfermedades autoinmunes o las enfermedades alérgicas se pueden tratar mediante la regulación de las funciones del "antígeno JTT-1" . También se encontró que el anticuerpo monoclonal contra el "antígeno JTT-1 humano" proliferaba de una manera significativa los linfocitos de la sangre periférica humana, y que la proliferación se mejoraba adicionalmente en la co-presencia de un anticuerpo monoclonal contra CD3 que constituye un complejo TcR/CD3 sobre las células T, el cual recibe la señal primaria esencial para la activación de células T a partir de las células presentadoras de antígeno, indicando que el "antígeno JTT-1" era una molécula de superficie celular involucrada en la transmisión de señal hacia los linfocitos. Además, los presentes inventores tuvieron éxito en la producción de un polipéptido de fusión que comprende la región extracelular del "antígeno JTT-1 humano", y la región Fc de inmunoglobulina humana. El polipéptido de fusión es útil como producto farmacéutico para el tratamiento de enfermedades autoinmunes, enfermedades alérgicas, y enfermedades inflamatorias, mediante la regulación de las funciones del "antígeno JTT-1" y/o su ligando. Más aún, los presentes inventores tuvieron éxito en la preparación de un ratón transgénico en el que se introdujo un gen que codifica el "antígeno JTT-1" de otra especie animal. El ratón transgénico es útil para analizar las funciones detalladas del "antígeno JTT-1", y para desarrollar productos farmacéuticos para el tratamiento de enfermedades autoinmunes, enfermedades alérgicas, y enfermedades inflamatorias. Los inventores también produjeron un ratón knockout (con reducción genética) , en el que se inactivo el gen endógeno que codifica el "antígeno JTT-1 de ratón". Este ratón knockout también es útil para el propósito anteriormente mencionado. Las presentes invenciones se refieren a polipéptidos, genes, anticuerpos, vectores, transformantes, composiciones farmacéuticas, ratones transgénicos, ratones knockout, etcétera, que son pertinentes para un "antígeno JTT-1" de mamífero novedoso aislado e identificado como se mencionó anteriormente. Específicamente, la presente invención se describe en (1) a (36) en seguida. (1) Un polipéptido que constituye una molécula de superficie celular que tiene las siguientes características : (a) la molécula de superficie celular se expresa en cuando menos los timocitos y las células de linfoblasto estimuladas por mitógeno, (b) un anticuerpo que reacciona a la molécula de superficie celular induce la adhesión entre las células de linfoblasto estimuladas por mitógeno, (c) un anticuerpo que reacciona a la molécula de superficie celular induce proliferación de los linfocitos de la sangre periférica en la presencia de un anticuerpo contra CD3 , (d) la molécula de superficie celular tiene una secuencia de aminoácidos parcial representada por Phe-Asp-Pro-Pro-Pro-Phe en su región extracelular, y (e) la molécula de superficie celular tiene una secuencia de aminoácidos parcial representada por Tyr-Met- Phe-Met en su región citoplásmica. (2) El polipéptido de (1) , que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO : 2 , o la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO : 2 en donde uno o más aminoácidos están sustituidos, suprimidos, o agregados. (3) El polipéptido de (1) , el cual es codificado por un ADN que se hibrida con un ADN que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID N0:1, bajo condiciones astringentes. (4) El polipéptido de (1) que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene el 60 por ciento o más de homología con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO : 2. (5) El polipéptido de cualquiera de (1) a (4) , en donde la molécula de superficie celular se deriva de un ser humano . (6) Un gen que codifica el polipéptido de cualquiera de (1) a (5) . (7) El gen de (6) , en donde este gen es un ADNc . (8) El gen de (7) , en donde el ADNc tiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID N0:1. (9) El gen de 7) , en donde el ADNc comprende una secuencia de nucleótidos que corresponde a los residuos de nucleótidos 26 a 625 de la SEQ ID N0:3, a los residuos de nucleótidos 35 a 637 de la SEQ ID N0:4, a los residuos de nucleótidos 1 a 603 de la SEQ ID NO : 5 , o a los residuos de nucleótidos 35 a 685 de la SEQ ID NO: 6. (10) Un vector que comprende el gen de cualquiera de (6) a (9) . (11) Un transformante en donde se ha introducido el vector de (10) . (12) Un transformante identificado por un depósito internacional con número de acceso FERM BP-5725. (13) Un fragmento de polipéptido que comprende una región extracelular de un polipéptido de cualquiera de (1) a (5) . (14) El fragmento de polipéptido de (13) , en donde el polipéptido es un polipéptido derivado de un ser humano que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. (15) Un gen que codifica el fragmento de polipéptido de (13) ó (14) . (16) Una molécula de homodímero que comprende dos fragmentos de polipéptido, en donde cada uno de los fragmentos comprende una región extracelular del polipéptido de cualquiera de (1) a (5) , y los dos fragmentos de polipéptido están puenteados a través de enlaces de disulfuro uno con el otro. (17) La molécula de homodímero de (16) , en donde el polipéptido es un polipéptido derivado de un ser humano que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. (18) Una composición farmacéutica que comprende el fragmento de polipéptido de (14) , o bien la molécula de homodímero de (17) , o ambos, y un vehículo farmacéuticamente aceptable . (19) Un polipéptido de fusión que comprende una región extracelular del polipéptido de cualquiera de (1) a (5) , y una región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina humana (Ig) , o una porción de la región constante. (20) El polipéptido de fusión de (19) , en donde la inmunoglobulina es IgG. (21) El polipéptido de fusión de (19) , en donde la porción de la región constante comprende una región de articulación, un dominio C3 , y un dominio C3 de IgG. (22) El polipéptido de fusión de cualquiera de (19) a (21) , en donde el polipéptido es un polipéptido derivado de un ser humano que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. (23) Una molécula de homodímero que comprende dos polipéptidos de fusión de cualquiera de (19) a (22) , en donde los dos polipéptidos están puenteados a través de enlaces de disulfuro uno con el otro. (24) Una molécula de homodímero que comprende dos polipéptidos de fusión de (22) , en donde los dos polipéptidos están puenteados a través de enlaces de disulfuro uno con el otro. (25) Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de fusión de (22) , o bien la molécula de homodímero de (24), o ambos, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. (26) La composición farmacéutica de (25) , en donde la composición farmacéutica se utiliza para el tratamiento de enfermedades autoinmunes o enfermedades alérgicas, o para prevenir el síntoma de la enfermedad. (27) Un anticuerpo o una porción del mismo que reacciona al polipéptido de cualquiera de (1) a (5) , comprendiendo el fragmento de polipéptido de (13) ó (14), o la molécula de superficie celular, a dicho polipéptido. (28) El anticuerpo de (27) , o una porción del mismo, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. (29) Un anticuerpo monoclonal o una porción del mismo, que reacciona al polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO : 2 , comprendiendo el fragmento de polipéptido de (14) , o la molécula de superficie celular derivada de un ser humano, a dicho polipéptido. (30) Un anticuerpo monoclonal o una porción del mismo, que reacciona al polipéptido de cualquiera de (1) a (5) , o la molécula de superficie celular que comprende a este polipéptido, en donde el efecto del anticuerpo monoclonal sobre las células de linfoblasto estimuladas por mitógeno es sustancialmente igual al efecto de un anticuerpo monoclonal producido por un hibridoma identificado por el depósito internacional con número de acceso FERM BP-5707 sobre células de linfoblasto de rata estimuladas por mitógeno. (31) Un anticuerpo monoclonal o una porción del mismo, que reacciona al polipéptido de cualquiera de (1) a (5) , o la molécula de superficie celular que comprende a este polipéptido, en donde el efecto del anticuerpo monoclonal sobre las células de linfoblasto estimuladas por mitógeno es sustancialmente igual al efecto de un anticuerpo monoclonal producido por un hibridoma identificado por un depósito internacional con número de acceso FERM BP-5708 sobre células de linfoblasto de rata estimuladas por mitógeno. (32) Una composición farmacéutica que comprende al anticuerpo monoclonal de (29) , o una porción del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. (33) La composición farmacéutica de (32), en donde esta composición farmacéutica se utiliza para el tratamiento de enfermedades autoinmunes o enfermedades alérgicas, o para prevenir el síntoma de la enfermedad. (34) Un hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal de cualquiera de (28) a (31) . (35) Un ratón transgénico en el que se integra un gen que codifica el polipéptido de (1) que es un gen derivado de ser humano que comprende una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID N0:1, o un gen derivado de rata que comprende una secuencia de nucleótidos correspondiente a los residuos de nucleótidos 35 a 637 de la SEQ ID N0:4, en su gen endógeno. (36) Un ratón knockout en el que se inactiva su gen 'endógeno que codifica el polipéptido de ratón de la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de la SEQ ID NO: 5, de tal manera que no se produce el polipéptido de ratón. Como se describe anteriormente, la molécula de superficie celular de la presente invención ("antígeno JTT-1") está involucrada en la adhesión celular, en la transmisión celular hacia los linfocitos tales como células T, y en la regulación de la función de los linfocitos activados. El conocimiento general de las células linfocíticas, las moléculas de adhesión celular, y la relación entre ellas y las enfermedades, se describen más adelante justo para un entendimiento general de estos eventos biológicos, pero el siguiente conocimiento general no es para interpretar la presente invención de una manera limitada. Los linfocitos se clasifican ampliamente en dos clases, células T y células B. Después de la diferenciación de las células de tallo multipotentes en la médula ósea hasta las células de tallo linfoides, algunas de ellas fluyen hacia la sangre para llegar al timo. Los linfocitos diferenciados y madurados en el timo, que se denominan células T (células T derivadas del timo) , llegan a la sangre nuevamente, y circulan a través de todo el cuerpo. Las células T maduras tienen una molécula denominada CD3 sobre su superficie. La existencia de la molécula CD3 es un marcador para determinar si las células son células T maduras o no. CD3 es un marcador de células T convincente. En adición, las células T expresan CD4 ó CD8. Las células T se clasifican en células T auxiliares (células Th) que ayudan a la producción de anticuerpos mediante los linfocitos B, las células T citotóxicas (células T, CTL) o las células T aniquiladoras que se enlazan a las células objetivo para destruirlas directamente, las células T supresoras que suprimen la producción de anticuerpos por parte de los linfocitos B, y las células T efectoras que secretan sustancias efectoras tales como linfocinas, para ocasionar una alergia demorada . Las células B se derivan a partir de las células de tallo linfoides diferenciadas y maduradas en la médula ósea. Las células B son células precursoras productoras de anticuerpos, debido a que producen anticuerpos con un estímulo apropiado. Las células B tienen inmunoglobulinas sobre su superficie celular, que se produjeron en una célula. Estas inmunoglobulinas funcionan como receptores para antígenos. Las células B maduras tienen IgM como IgD sobre su superficie. Si las células B se diferencian con el estímulo de antígeno y las señales desde las células T, la producción de IgM se incrementa, y cambian sus regiones de enlace de membrana celular C-terminal para secretarse. Con suficiente estímulo, no solamente las inmunoglobulinas superficiales cambian hasta IgG, IgE, e IgA, sino que también se secretan las inmunoglobulinas de cada clase. La inmunoglobulina sobre la superficie de las células B algunas veces es representada como slg, la abreviatura de Ig superficial, o mlg, la abreviatura de Ig de membrana. Todas las Igs sobre la superficie de la misma célula B, tienen los mismos sitios de enlace de antígeno. Existen linfocitos denominados linfocitos granulares grandes (LGL) o células nulas, que no son células T ni células B. Estas células pueden destruir las células tumorales y las células infectadas por virus sin un estímulo previo con antígeno, lo cual es comparativo con el caso de las células T citotóxicas . De modo que también se denominan células aniquiladoras naturales (células NK) . Entre las células T mencionadas anteriormente, las células T positivas de CD4 secretan diferentes citoquinas, expresan por primera vez los receptores para estas citoquinas, agrandan su propio tamaño, inician la división celular, y se proliferan, cuando reaccionan con los antígenos presentados por las células presentadoras de antígeno. Antes de estas reacciones al nivel celular, el complejo de los péptidos de antígeno sobre las células presentadoras de antígeno y las moléculas MHC clase II, se enlaza con el receptor de antígeno de células T correspondiente (TCR) . Esto ocasiona diferentes cambios bioquímicos en las células, y la señal se transmite hasta los núcleos para iniciar la transcripción de los ADNs específicos, y para producir las proteínas respectivas. Como resultado, se elevan las reacciones al nivel celular. Por ejemplo, las células infectadas con un virus producen proteínas de virus, y se degradan en péptidos mediante los proteasomas en el citoplasma. Una parte de los péptidos entra al retículo endoplásmico a través de TAP, forma un complejo estable con las moléculas MHC clase I recién producidas, y se transfiere a la superficie celular. El péptido transferido a la superficie celular es reconocido específicamente por las células T positivas de CD8, pero las células T todavía no pueden destruir las células infectadas en esta etapa. Estas células T que reaccionaron con el antígeno que expresa el receptor de IL-2 (IL-2R) , se diferencian en la citotoxicidad celular de CTL sobre la acción de IL-2, y destruyen sus células objetivo para aniquilarlas en la siguiente vez en que encuentren el mismo complejo de péptido antígeno/MHC clase I. Las citoquinas requeridas para la diferenciación en CTL no son solamente IL-2, sino que también IFN? u otras citoquinas, que se piensa que tienen acciones similares. Por consiguiente, se necesitan las linfocinas secretadas por las células T para la diferenciación en CTL. Las linfocinas se producen como el resultado de que las células Thl positivas de CD4 (células T positivas de CD4 que secretan IL-2 ó IFN?) reconocen los péptidos de antígeno derivados a partir del mismo virus con moléculas clase II. En algunos casos, sin la ayuda de las células T positivas de CD4, las células T positivas de CD8 reaccionan con los antígenos, y producen IL-2 y otras citoquinas. Cuando se diferencian las células T positivas de CD8 en CTL, se incrementan los granulos en el citoplasma. Estos granulos comprenden diferentes proteínas de alto peso molecular, representadas por la perforina. La perforina se parece a un complejo de ataque de membrana (MAC) compuesto de los quinto a noveno componentes del éi complemento, y hace orificios en la membrana celular de las células objetivo. En adición, los granulos comprenden proteasas de serina, LT, proteoglicano, etcétera. Más aún, si las células positivas de CD8 di erenciadas en CTL reciben estímulo de antígeno, también secretan linfocinas, tales como IFN?, LT, TNF, ó IL-2. Más aún, las células T muestran un fenómeno de transformación de blasto, cuando reaccionan con la hemaglutinina (fitohemaglutinina, PHA) , o ConA. Las células T maduras no estimuladas totalmente, se denominan células T en reposo, y tienen un tamaño celular más pequeño y un tiempo de vida más corto, unos cuantos días. Cuando reciben estímulo, las células se agrandan como ya se mencionó anteriormente, y son aptas para reaccionar con diferentes clases de estímulo. Estas células T se denominan células T activadas. Una parte de las células T activadas llega a ser la de células T de memoria, que provocan una inmunorreacción secundaria si reciben el mismo estímulo de antígeno. Las células T de memoria se piensa que se mantienen en la circulación alrededor del cuerpo durante unos cuantos años o décadas. Las células B no estimuladas totalmente, se denominan células B en reposo, como en el caso de las células T, y las células B en proliferación estimuladas con antígenos multivalentes o CD40L, se denominan células B activadas. Debido a que las células B en reposo no tienen moléculas coestimulantes, que estimulen a las células señales a través de TCR, tales como B7-1 (CD80) ó B7-2 (CD86) , se piensa que la presentación de antígenos ante las células T en reposo solamente estimula el TCR, y es incapaz de expresar ligandos CD40 (CD40L) , o de producir linfocinas. Por consiguiente, se piensa que las células T auxiliares activadas estimuladas con antígeno presentado por otras células presentadoras de antígeno, reaccionan con el antígeno presentado por las células B en reposo. Es decir, si invade un antígeno, primero, las células dendríticas (células que tienen proyecciones extremadamente dendríticas) que expresan moléculas B7 o macrófagos activados mediante la reacción con microorganismos, presentan el antígeno y estimulan a las células T auxiliares en reposo para activarlas y expresar CD40L. Luego las células T auxiliares activadas se enlazan con las células B en reposo, presentando el mismo antígeno, y estimulan su CD40. Una vez que se activan las células B mediante el estímulo con antígenos multivalentes o CD40L, también expresan moléculas B7, activan las células T auxiliares mediante el estímulo de CD28 sobre su superficie con TCR, y permiten que las células T auxiliares expresen CD40L o produzcan linfocinas. Las células B que muestran cambios tales como la expansión del tamaño celular con el estímulo, pero que no muestran secreción de anticuerpos, se denominan células B activadas. Si las células B así maduradas encuentran antígenos, se incrementa la producción de IgM junto con el estímulo desde las células T, y las moléculas IgM así producidas se secretan convirtiéndose desde el tipo de membrana hasta el tipo secretor. Más aún, producen anticuerpos isotípicos diferentes de IgM, tales como IgG, sobre los factores humorales desde las células T. Esto se denomina cambio de isotipo o cambio de clase. Las células B que secretan anticuerpos se denominan células secretoras de anticuerpos. Una parte de ellas llegan a ser células morfológicamente características, y se denominan células de plasma (Knowledge of Immunology, Oh sha, (1996) ) . Incidentalmente, en diferentes reacciones del sistema inmune, la subpoblación de glóbulos blancos sanguíneos, es decir, linfocitos T, linfocitos B, NK, neutrófilos, etcétera, con frecuencia muestran una dinámica diferente unos de otros . Inclusive los mismos linfocitos mencionados anteriormente muestran una dinámica diferente unos de otros, dependiendo de si las células están activadas o en reposo. Estos hechos implican la existencia de un mecanismo de reconocimiento específico para la subpoblación de glóbulos blancos sanguíneos, y además un mecanismo de reconocimiento específico para el estado de las células, y en particular, las moléculas de adhesión celular (proteínas de adhesión celular) . Las moléculas de adhesión celular, o las proteínas de adhesión celular, en general, son las moléculas que adhieren las células unas a otras en el desarrollo y la diferenciación de individuos, o en la migración de las células hacia el sitio local, y se sabe que son moléculas esenciales para los contactos orgánicos y funcionales en un cuerpo vivo. Las moléculas de adhesión celular se clasifican ampliamente por sus características estructurales en cinco (5) familias, la superfamilia de inmunoglobulina, la familia de integrina, la familia de selectina, la familia de caderina, y la familia CD44. Las moléculas de adhesión pertenecientes a la superfamilia de inmunoglobulina se caracterizan por la existencia de dominios de tipo de ciclo repetidos formados con enlaces de disulfuro. Los ejemplos de las mismas son la molécula de adhesión intercelular-1 "ICAM-1", y la molécula de adhesión de células vasculares-1 "VCAM-1". En adición, las moléculas de adhesión pertenecientes a la familia de integrina se caracterizan por una estructura de heterodlmero oi/ß . Los ejemplos de las mismas son el antígeno muy tardío-1 a 6 "VLA-1 a 6", el antígeno asociado con la función del linfocito-1 "LFA-1", "Mac-1", y "pl50/90". Las moléculas pertenecientes a la familia de selectina tienen un dominio de tipo de lectina, un dominio de tipo de EGF, y un dominio de complemento en este orden desde el término N. Los ejemplos de las mismas son "E-selectina" y "P-selectina". Los ejemplos de la familia de caderina son "E-caderina" , "N-caderina" , y "P-caderina" , y un ejemplo de la familia CD44 es "CD44". La función específica de estas moléculas de adhesión se conoce como la adhesión de los glóbulos blancos sanguíneos a las células endoteliales vasculares, o de los linfocitos a las células presentadoras de antígeno. A partir de diferentes estudios recientes, se ha revelado gradualmente que las moléculas de adhesión están involucradas no solamente en estas funciones, sino que también en diferentes enfermedades. En particular, existen muchos reportes sobre enfermedades y la anormalidad de expresión de las moléculas de adhesión. Por ejemplo, como para la artritis reumatoide (RA) , como se reportó, la expresión de tanto "Mac-1" como "pl50/95" se reforzó en los sinoviocitos de artritis reumatoide (Alien, C. y colaboradores, Arthritis Rheum., Volumen 32, página 947 (1989) ) . También se ha reportado que diferentes células expresaron "ICAM-1" fuertemente y de una manera ectópica sobre la membrana sinovial de artritis reumatoide (Hale, L. y colaboradores, Arthritis Rheum., Volumen 32, página 22 (1989)) . Otro reporte implicó que "ELAM-1" también estaba involucrado en la adhesión de neutrófilos a las células endoteliales vasculares, y que las sobreexpresión de estas moléculas estaba involucrada en la infiltración de neutrófilos (especialmente en el fluido sinovial) , que se observa en el fluido sinovial de artritis reumatoide (Laffon, A. y colaboradores, Arthritis Rheum., Volumen 32, página 386 (1989)) . Se reportó una fuerte expresión de "CD44" en células endoteliales vasculares y en sinoviocitos tipo A sobre la membrana sinovial de artritis reumatoide (Heynes, B. y colaboradores, Arthritis Rheum., Volumen 34, página 1434 (1991)). Existen reportes sobre la relación entre el lupus eritematoso sistémico (SLE) y la anormalidad en la expresión de las moléculas de adhesión. Por ejemplo, la capacidad de adhesión de los linfocitos T a las células endoteliales vasculares cultivadas, como se reportó, bajó en los pacientes con lupus eritematoso sistémico, comparándose con los voluntarios sanos. En los linfocitos periféricos de los pacientes de lupus eritematoso sistémico, se expresaron fuertemente las moléculas de adhesión "ICAM-1" e "IFA-1" (Haskard, D.O. y colaboradores, Rheumatol. Int., Volumen 9, página 33 (1989) ) . En las enfermedades de tiroides autoinmune, se reportó que se expresó "ICAM-1" cuando se estimularon células foliculares de tiroides con interferón-?, interleucina-1, y factor de necrosis tumoral, y que se inhibió la formación de grupos de células foliculares y células mononucleares mediante el anticuerpo anti- "ICAM-1" (Weetman, A.P. y colaboradores, Eur. J. Immunol., Volumen 20, página 271 (1990)). En la hepatitis, se piensa que las oportunidades de adhesión entre los hepatocitos y las células inflamatorias se incrementan debido a que hay dos trayectorias de adhesión, "ICAM-l" y LFA-3", y "LFA-1" y "CD2", para promover de esta manera la presentación de antígenos y la activación de las células inflamatorias. En particular, en hepatitis B, las moléculas "LFA-3" se expresan fuertemente en los hepatocitos, en donde están proliferando activamente los virus, e "ICAM-1" se correlaciona bien con el grado de hepatitis. Por consiguiente, se implica que la "LFA-3" está involucrada en la exclusión de virus, e "ICAM-1" promueve las células T para presentar antígeno, y regula la reacción de inflamación. En los hepatocitos negativos en "ICAM-1" y positivos en antígeno HBc, se puede presentar una infección crónica del virus, una clase de inmunorresponsividad, debido a que no hay interacción entre los linfocitos y los hepatocitos. También se ha reportado que la "ICAM-1" en suero, en la enfermedad crónica del hígado, puede correlacionarse con el grado de daño de hepatocitos, debido a que las concentraciones de "ICAM-1" en suero en los pacientes con hepatitis aguda, en los pacientes con hepatitis activa crónica, y en los pacientes con cirrosis del hígado, fueron más altas que en los voluntarios sanos y en los pacientes con hepatitis persistente crónica, y la concentración fue alta en el caso de la hepatitis activa de progreso histológico (Mod. Phys., Volumen 15, Número 1, páginas 73-76 (1995) ) . En un modelo animal de arterieesclerosis, se observó la adhesión y la invasión de los monocitos y los linfocitos hacia el endotelio vascular en las etapas muy tempranas del establecimiento de la enfermedad. Por consiguiente, se piensa que la interacción de estos hemocitos con el endotelio es el primer paso del establecimiento de arterieesclerosis.

Diferentes reportes muestran la expresión de moléculas de adhesión en el nido de arterioesclerosis real, incluyendo la expresión de "ICAM-1" en el nido de arterioesclerosis humana (Poston, R.N. y colaboradores, Am. J. Pathol., Volumen 140, página 665 (1992) ) , y la expresión de "VCAM-1" en el nido de arterioesclerosis de un conejo con hipercolesterolemia (Cybulsky, M.I. & Gimbrone, M.A. Jr. , Science, Volumen 251, página 788 (1991) ) . Un reporte reciente reveló que se observaba la expresión de "VCAM-1" en el nido de arterioesclerosis humana, y en particular, una fuerte expresión en las células del músculo liso migrando hacia la íntima, y en los monocitos/macrófagos . En adición, la expresión de "MCP-1" se mejoró en el nido de arterioesclerosis de conejo y ser humano, sugiriendo que "MCP-1" promueve la formación del nido de arterioesclerosis a través de la migración de monocitos/macrófagos (Current Therapy, Volumen 12, Número 8, Páginas 1485-1488 (1994)). También se ha reportado la relación entre la metástasis tumoral y la anormalidad de la molécula de adhesión. Por ejemplo, las células de cáncer con disminución de E-caderina mostraron una fuerte invasividad, pero la invasividad fue inhibida mediante la introducción del ADNc de E-caderina en las células de cáncer, y la invasividad se recuperó cuando se agregó antisuero de E-caderina a las células. Esto sugiere la estrecha relación entre la disminución en la expresión de E-caderina y la invasividad de las células tumorales (Frixen, U.H. y colaboradores, Volumen 113, página 173 (1991)) . En los casos clínicos reales, la relación entre la disminución de la expresión de E-caderina y la metástasis se señala en diferentes clases de cáncer, tales como hepatoma, cáncer esofágico, cáncer gástrico, y cáncer del pecho. También se ha reportado que las moléculas "VLA-4", un ligando para "VCAM-1", se expresaban altamente en el melanoma metastásico, en el cáncer gástrico, y en el cáncer del pecho, sugiriendo que esta molécula se podría utilizar para la implantación en las células endoteliales vasculares en metástasis. En adición, basándose en experimentos que utilizan diferentes líneas de células tumorales, se ha reportado que el cáncer epitelial, tal como el cáncer gástrico, el cáncer del intestino grueso, el cáncer de pulmón, el hepatoma, o el cáncer pancreático, se adherían a las células endoteliales vasculares a través de E-selectina (Takada, A. y colaboradores, Cáncer Res., Volumen 53, página 354 (1993)). Por otra parte, se ha hecho el planteamiento terapéutico para tratar enfermedades dirigiendo estas moléculas de adhesión. Por ejemplo, se reportó que el anticuerpo anti-"ICAM-1" de rata inhibía fuertemente la reacción inflamatoria en el modelo de artritis autoinmune de rata. También se ha reportado que la administración del anticuerpo anti- " ICAM-1" inhibía el establecimiento de artritis en sinovitis auxiliar en uno de los modelos animales de artritis reumatoide (Nihon Rinsho Meneki Gakkai Kaishi, Volumen 14, Número 6, página 571-577 (1991) ) . Además se reportó que la formación de metástasis del tumor inoculado se inhibía notablemente si una gran cantidad de péptidos que tuvieran la secuencia RGE, que es una secuencia de aminoácidos en una proteína de matriz extracelular reconocida y enlazada por algunas integrinas, se administraban a un ratón con cáncer en la vesícula, y que los péptidos RGD del sistema in vi tro y el anticuerpo anti-subunidad ßl inhibía el movimiento y la infiltración de células tumorales (Yamada, K„M. y colaboradores, Cáncer Res., Volumen 50, página 4485, (1990) ) . En lo siguiente, se describe la presente invención con detalle aclarando los significados de los términos utilizados en la presente, y los métodos de producción generales de polipéptidos, polipéptidos de fusión, genes, anticuerpos, ratones transgénicos, y ratones knockout de la presente invención. Sin embargo, no es necesario decir que los significados de los términos no deben interpretarse de una manera limitada por la definición dada en la presente. "Mitógeno", utilizado en la presente, también se denomina factor mitogénico, y significa una sustancia que induce la división celular. Inmunológicamente, significa una sustancia que induce la blastogénesis de los linfocitos policlonalmente, y que induce división celular. Los ejemplos del mismo son lectinas, tales como PHA y PWM, Concanavalina A (ConA) , lipopolisacáridos, estreptolisina S, y anticuerpo anti-linfocitos. Se sabe que la Concanavalina A y el PHA actúan solamente sobre los linfocitos T, que los lipopolisacáridos actúan solamente sobre los linfocitos B, y que el PWM actúa sobre ambos linfocitos. El término "célula de linfoblasto" utilizado en la presente, también se denomina un linfocito grande, linfoblasto, o inmunoblasto, y significa un linfocito que pertenece a un linfocito grande entre los linfocitos que existen en los tejidos linfoides (nodos de linfa, bazo, timo, médula ósea, conducto de linfa, amígdalas, etcétera), y en la sangre. El término "linfocito activado", utilizado en la presente, significa, por ejemplo, un linfocito mencionado más adelante, pero no se limita al mismo. Por ejemplo, el término significa un linfocito activado por algún estímulo. Como se mencionó anteriormente, los linfocitos se clasifican en células T, células B, y células aniquiladoras naturales. Las células T se clasifican en células positivas en CD4 y células positivas en CD8. Por consiguiente, los "linfocitos activados" de la presente invención incluyen principalmente células T activadas, células B activadas, y células aniquiladoras activadas, y las células T activadas incluyen las células positivas en CD4 activadas y las células positivas en CD8 activadas.

Al reaccionar con los antígenos presentados por las células presentadoras de antígeno, las células T positivas en CD4 secretan diferentes citoquinas, expresan por primera vez receptores para estas citoquinas, agrandan su propio tamaño, inician la división celular, se proliferan, y se activan. Las células T positivas en CD4 activadas incluyen éstas en dicho estado. Las células T positivas en CD8 expresan IL-2R cuando reaccionan con antígenos. Cuando la IL-2 actúa sobre la IL-2R, las células se diferencian en CTL, que tiene citotoxicidad celular. La CTL destruye sus células objetivo para aniquilarlas cuando encuentran el mismo complejo de péptido de antígeno/MHC clase I. Cuando las células T positivas en CD8 se diferencian en CTL, se incrementan los granulos en el citoplasma. Estos granulos comprenden diferentes proteínas de alto peso molecular, representadas por perforina. La perforina se parece a MAC compuesta de los quinto a noveno componentes del complemento, y hace orificios en la membrana celular de las células objetivo. Los granulos también comprenden proteasas de serina, LT, y proteoglicano. Si las células positivas en CD8 reciben estímulo de antígeno, y se diferencian en CTL, también secretan linfocinas, tales como IFN?, LT, TNF, ó IL-2. Las células T positivas en CD8 activadas incluyen aquellas en dicho estado. Las células T muestran el fenómeno de formación de blasto cuando reaccionan con hemaglutinina, fitohemaglutinina, PHA) , o Concanavalina (ConA) . Las células T activadas incluyen aquellas en dicho estado. Las células B expresan las moléculas B7, activan las células T auxiliares mediante el estímulo de CD28 sobre su superficie con TCR, permiten con las células T auxiliares expresen CD40L o produzcan linfocinas. Cuando las células reciben estímulo, cambian para expandir su tamaño celular, o proliferan. Las células B activadas incluyen aquellas en dicho estado. En la presente invención, las células B activadas incluyen aquellas que secretan anticuerpos (células secretoras de anticuerpos y células de plasma) . Las células aniquiladoras naturales activadas significan aquellas que muestran acción citotóxica sobre las células tumorales o las células infectadas por virus mencionadas anteriormente. En la presente invención, los linfocitos activados incluyen células de timo estimuladas por Concanavalina A (ConA) . La "célula de linfoblasto activada" utilizada en la presente, incluye un "linfoblasto" activado que se genera cuando se estimula el linfoblasto mencionado anteriormente con el "mitógeno" mencionado anteriormente, tal como Concanavalina A. El término "linfocito en reposo" utilizado en la presente significa, en algún caso, un linfocito no activado, que no ha recibido el estímulo para activar células, en contraste con un linfocito activado mencionado anteriormente. El "gen" de la presente invención incluye un ADN genómico y un ADNc . La sustancia "derivada de un ser humano" de la presente invención incluye una sustancia natural aislada de un componente de un cuerpo humano (órgano, tejido, célula, fluido corporal, etcétera) , y la sustancia recombinante producida mediante tecnología de ADN recombinante . Cuando la sustancia es proteína o polipéptido, la sustancia incluye una proteína artificial y un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos en donde uno o más aminoácidos están sustituidos, suprimidos , o agregados . La "molécula de superficie celular" de la presente invención, es aquella derivada a partir de un mamífero, tal como un ser humano, rata, ratón, conejillo de indias, y conejo, de preferencia derivada de un ser humano, rata, o ratón, y más preferiblemente derivada de un ser humano. De una manera específica, la "molécula de superficie celular" de la presente invención es aquella caracterizada por tener cuando menos las propiedades descritas en seguida. (a) La molécula de superficie celular se expresa cuando menos en los timocitos y en las células de linfoblasto estimuladas por mitógeno; (b) un anticuerpo reactivo a la molécula de superficie celular induce la adhesión entre las células de linfoblasto estimuladas por mitógeno; (c) un anticuerpo reactivo a la molécula de superficie celular induce proliferación de los linfocitos sanguíneos periféricos en la presencia de un anticuerpo contra CD3; (d) la molécula de superficie celular tiene una secuencia parcial de aminoácidos representada por Phe-Asp-Pro-Pro-Pro-Phe en su región extracelular; (e) la molécula de superficie celular tiene una secuencia parcial de aminoácidos representada por Tyr-Met-Phe-Met en su región citoplásmica. De preferencia, la "molécula de superficie celular" comprende el siguiente "polipéptido" de la presente invención. El "polipéptido" de la presente invención es aquel que constituye la "molécula de superficie celular" anteriormente mencionada de la presente invención. Los ejemplos son como sigue. (1) Un polipéptido codificado por un ADN que se hibrida con un ADN que comprende una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID N0:1 bajo condiciones astringentes; (2) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene el 60 por ciento o más homología con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. (3) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, o una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual a la secuencia de aminoácidos (es decir, un polipéptido que constituye el "antígeno JTT-1 humano" y su derivado) ; (4) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos correspondiente a los residuos de nucleótidos 26 a 625 de la SEQ ID NO: 3, o una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual a la secuencia de aminoácidos (es decir, un polipéptido que constituye el "antígeno JTT-1 humano" y su derivado) ; (5) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos correspondiente a los residuos de nucleótidos 35 a 637 de la SEQ ID N0:4, o una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual a la secuencia de aminoácidos (es decir, un polipéptido que constituye el "antígeno JTT-1 de rata" y su derivado) ; (6) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos correspondiente a los residuos de nucleótidos 1 a 603 de la SEQ ID NO: 5, o una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual a la secuencia de aminoácidos (es decir, un polipéptido que constituye el "antígeno JTT-1 de ratón" y su derivado) ; (7) Un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos correspondiente a los residuos de nucleótidos 35 a 685 de la SEQ ID NO: 6, o una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual a la secuencia de aminoácidos (es decir, un polipéptido que constituye un "mutante de antígeno JTT-1 de rata" y su derivado) ; y (8) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por un ADN que codifica un polipéptido que constituye la molécula de superficie celular de la presente invención, en donde el ADN se introduce en el transformante identificado por un depósito internacional con número de acceso FERM BP-5725, o que tiene la secuencia de aminoácidos sustancialmente igual a la secuencia de aminoácidos (es decir, un polipéptido que constituye un "antígeno JTT-1 humano" y su derivado) . Los ejemplos de "condiciones astringentes" son como sigue. Cuando se utiliza una sonda con 50 o más nucleótidos, y se realiza hibridación en NaCl al 0.9 por ciento, se calcula el estándar de temperatura en donde se presenta un 50 por ciento de disociación (Tm) utilizando la siguiente fórmula, y se puede determinar la temperatura para la hibridación de acuerdo con la siguiente fórmula.

Tm = 82.3°C + 0.41 x (G+C) % - 500/n - 0.61 x (formamida) % (n significa el número del nucleótido de la sonda) Temperatura = Tm -25°C.

En adición, cuando se utiliza una sonda con 100 o más nucleótidos (G+C = 40 a 50 por ciento) , se debe considerar que Tm varía como (1) y (2) mencionados en seguida. (1) Tm desciende por aproximadamente 1°C por el 1 por ciento de mal acoplamiento. (2) Tm desciende por el 0.6°C a 0.7°C por el 1 por ciento de formamida. De conformidad con lo anterior, las condiciones de temperatura para la combinación de las cadenas completamente complementarias, se pueden establecer como sigue. (A) 65°C a 75 °C (formamida no agregada) . (B) 35°C a 45°C (en la presencia de formamida al 50 por ciento) . Las condiciones de temperatura para la combinación de las cadenas incompletamente complementarias se pueden establecer como sigue. (A) 45°C a 55°C (formamida no agregada) . (B) 35°C a 42°C (en la presencia de formamida al 30 por ciento) . Las condiciones de temperatura cuando se utiliza una sonda con 23 o menos nucleótidos, pueden ser de 37°C, o se puede calcular utilizando la siguiente fórmula. Temperatura = 2°C x (el número de A+T) + 4°C x (el número de C+G) -5°C. Aquí, "tener sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos" significa que incluye un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos en donde múltiples aminoácidos, de preferencia de 1 a 10 aminoácidos, de una manera particularmente preferible de 1 a 5 aminoácidos, en la secuencia de aminoácidos mostrada en el Listado de Secuencias, están sustituidos, suprimidos, y/o modificados, y un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos en donde se agregan múltiples aminoácidos, de preferencia de 1 a 10 aminoácidos, de una manera particularmente preferible de 1 a 5 aminoácidos a la secuencia de aminoácidos mostrada en el Listado de Secuencias, siempre que el polipéptido tenga sustancialmente las mismas propiedades biológicas que el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en el Listado de Secuencias. Esta sustitución, supresión, o inserción de aminoácidos se puede realizar mediante el método usual (Experimental Medicine: SUPLEMENTO, "Handbook of Genetic Engineering" (1992) ; etcétera) . Los ejemplos de los mismos son la mutagénesis sintética dirigida al oligonucleótido (método dúplex con hueco) , mutagénesis de punto mediante la cual se introduce una mutación de punto al azar mediante el tratamiento con nitrito o sulfito, el método mediante el cual se prepara un mutante de supresión con la enzima Bal31 y similar, mutagénesis de cásete, método de exploración de enlazador, método de mala incorporación, método de cebador de mal acoplamiento, método de síntesis de segmento de ADN, etcétera. La mutagénesis sintética dirigida al oligonucleótido (método dúplex con hueco) se puede realizar, por ejemplo, como sigue. La región que se desea mutagenizar se clona en el vector del fago M13 que tiene mutación ámbar, para preparar el ADN del fago de una sola cadena. Después de que se lineariza el ADN RF I del vector M13 sin mutación ámbar mediante tratamiento con enzima de restricción, se mezcla el ADN con el ADN del fago de una sola cadena mencionada anteriormente, se desnaturaliza, y se templa, formando de esta manera un "ADN dúplex con hueco" . Un oligonucleótido sintético en el que se introducen mutaciones se hibrida con el ADN dúplex con hueco, y los ADNs de doble cadena circulares cerrados se preparan mediante las reacciones con polimerasa de ADN y ligasa de ADN. Las células mutS de E. coli , deficientes en la actividad de reparación de mal acoplamiento, se transfectan con este ADN. Las células de E. coli sin actividad supresora se infectan con los fagos cultivados, y solamente se seleccionan los fagos sin mutación ámbar. El método mediante el cual se introduce una mutación de punto con nitrito utiliza, por ejemplo, el principio mencionado en seguida. Si se trata el ADN con nitrito, se desaminan las bases para cambiar la adenina a hipoxantina, las citosina a uracilo, y la guanina a xantina. Si se introduce el ADN desaminado en las células, "A:T" y G:C" son reemplazados con "G:C" y "A:T", respectivamente, debido a que la hipoxantina, el uracilo, y la xantina forman un par de bases con citosina, adenina, y timina, respectivamente, en la réplica del ADN. Realmente, los fragmentos de ADN de una sola cadena tratados con nitrito se hibridan con "ADN dúplex con hueco", y después las cepas mutantes se separan mediante una manipulación de la misma manera que la mutagénesis sintética dirigida al oligonucleótido (método dúplex con hueco) . Los códigos alfabéticos de letras triples o sencillas utilizados para representar los aminoácidos en la presente memoria descriptiva o en las figuras, significan aminoácidos, como sigue. (Gly/G) glicina, (Ala/A) alanina, (Val/V) valina, (Leu/L) leucina, (Ile/I) isoleucina, (Ser/S) serina, (Thr/T) treonina, (Asp/D) ácido aspártico, (Glu/E) ácido glutámico, (Asn/N) asparagina, (Gln/Q) glutamina, (Lys/K) lisina, (Arg/R) arginina, (Cys/C) cisteína, (Met/M) metionina, (Phe/F) fenilalanina, (Tyr/Y) tirosina, (Trp/W) triptófano, (His/H) histidina, (Pro/P) prolina. El "polipéptido" que constituye la "molécula de superficie celular" anteriormente mencionada, de la presente invención, es una proteína transmembrana, que penetra en la membrana celular, y la "molécula de superficie celular" se compone de uno o dos de estos polipéptidos transmembrana. Aquí, una "proteína transmembrana" significa una proteína que se conecta con la membrana a través de la región hidrofóbica del péptido, penetrando en la bicapa de lípido de la membrana una vez o varias veces, y cuya estructura, como un todo, se compone de tres regiones principales, es decir, la región extracelular, la región transmembrana, y la región citoplásmica, como se ve en muchos receptores o moléculas de superficie celular. Esta proteína transmembrana constituye cada receptor o molécula de superficie celular en la forma de un monómero, homodímero, heterodímero, u oligómero, teniendo otras cadenas la misma o diferente secuencia de aminoácidos. El "fragmento de polipéptido" de la presente invención es un fragmento a partir del "polipéptido" anteriormente definido de la presente invención, y de preferencia la región extracelular del polipéptido. Se pueden agregar de 1 a 5 aminoácidos, si se desea, al término N y/o al término C de esta región. Aquí, una "región extracelular" significa toda o una porción de la estructura parcial (región parcial) a partir de toda la estructura de la proteína transmembrana anteriormente mencionada, en donde la estructura parcial existe afuera de la membrana. En otras palabras, significa toda o una porción de la región de la proteína transmembrana, excepto la región incorporada en la membrana (región transmembrana) , y la región que existe en el citoplasma en seguida de la región transmembrana (región citoplásmica) .

"La región constante o una porción de la región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina humana (Ig)", utilizada en la presente, significa la región constante de la región Fc de la cadena pesada de inmunoglobulina derivada de un ser humano (cadena H) , como se describe, o una porción de la misma. La inmunoglobulina puede ser cualquier inmunoglobulina perteneciente a cualquier clase y a cualquier subclase.

Específicamente, los ejemplos de la inmunoglobulina son IgG (IgGil, IgG2, IgG3 , e IgG4) , IgM, IgA (IgAl e IgA2), IgD, e IgE. De preferencia, la inmunoglobulina es IgG (IgGl, IgG2, IgG3 , ó IgG4) , ó IgM. Los ejemplos de la inmunoglobulina particularmente preferible de la presente invención son aquellos que pertenecen a la IgG derivada de un ser humano (IgGl, IgG2, IgG3 , ó IgG4) . La inmunoglobulina tiene una unidad estructural en forma de Y, en donde se conectan cuatro cadenas compuestas de dos cadenas ligeras homologas (cadenas L) y dos cadenas pesadas homologas (cadenas H) , a través de enlaces de disulfuro (enlaces S-S) . La cadena ligera se compone de la región variable de cadena ligera (VL) y la región constante de cadena ligera (CL) . La cadena pesada se compone de la región variable de cadena pesada (VH) y la región constante de cadena pesada (CH) . La región constante de cadena pesada se compone de algunos dominios que tienen las secuencias de aminoácidos inherentes en cada clase (IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE) y cada subclase (IgGl, IgG2, IgG3 , e IgG4 , IgAl, e IgA2) . La cadena pesada de IgG ( ( IgGl , IgG2 , IgG3 , e IgG4 ) se compone de VH, el dominio CH1, la región de articulación, el dominio CH2 , y el dominio CH3 en este orden desde el término N. Similarmente, la cadena pesada de IgGl se compone de VH, el dominio C?-j_l, la región de articulación, el dominio C?-j_2, y el dominio C?-^3, en este orden desde el término N. La cadena pesada de IgG2 se compone de VH, el dominio C?2l, la región de articulación, el dominio C?22, y el dominio C?23, en este orden desde el término N. La cadena pesada de IgG3 se compone de VH, el dominio 07 1, la región de articulación, el dominio 0732, y el dominio 0733, en este orden desde el término N. La cadena pesada de IgG4 se compone de VH, el dominio C?4l, la región de articulación, el dominio C?42, y el dominio C?43, en este orden desde el término N. La cadena pesada de IgA se compone de VH, el dominio Cal, la región de articulación, el dominio Cc.2 , y el dominio Co.3 en este orden desde el término N. De una manera similar, la cadena pesada de IgAl se compone de VH, el dominio Cc.-^!, la región de articulación, el dominio Ca-¡_2 , y el dominio Co--]_3 , en este orden desde el término N. La cadena pesada de IgA2 se compone de VH, el dominio Cc^l, la región de articulación, el dominio Co.22, y el dominio Cc-23, en este orden desde el término N.

La cadena pesada de IgD se compone de VH, el dominio Cdl, la región de articulación, el dominio Cd2, y el dominio Cd3, en este orden desde el término N. La cadena pesada de IgM se compone de VH, el dominio Cµl, el dominio Cµ2 , y el dominio Cµ3 , y el dominio Cµ4 , en este orden desde el término N, y no tiene región de articulación, como se ve en IgG, IgA, e IgD. La cadena pesada de IgE se compone de VH, el dominio Cel, el dominio Ce2, el dominio Ce3, y el dominio Ce4, en este orden desde el término N, y no tiene región de articulación, como se ve en IgG, IgA, e IgD. Por ejemplo, si la IgG se trata con papaína, se disocia en el lado ligeramente N-terminal, más allá de los enlaces de disulfuro que existen en la región de articulación, en donde los enlaces de disulfuro conectan las dos cadenas pesadas para generar dos Fab homólogos, en donde un fragmento de cadena pesada compuesto de VH y CH1 se conecta con una cadena ligera a través de un enlace de disulfuro, y un Fc, en donde dos fragmentos de cadena pesada homólogos compuestos de la región de articulación, el dominio CH2 , y el dominio CH3 se conectan a través de enlaces de disulfuro (Ver "Immunology Illustrated" , 2 edición original, Nankodo, páginas 65-75 (1992); y "Focus of Newest Medical Science 'Recognition Mechanism of Immune System'", Nankodo, páginas 4-7 (1991); etcétera) .

Es decir, "una porción de una región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina" de la presente invención significa una porción de una región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina que tiene las características estructurales mencionadas anteriormente, y de preferencia, es la región constante sin el dominio Cl, o la región Fc. Específicamente, los ejemplos son la región compuesta de la región de articulación, el dominio C2, y el dominio C3 a partir de cada una de IgG, IgA, e IgD, y son la región compuesta del dominio C2 , el dominio C3 , y el dominio C4 de cada una de IgM e IgE. Un ejemplo particularmente preferible es la región Fc de la IgGl derivada de un ser humano . El "polipéptido de fusión" de la presente invención, es aquel compuesto de la región extracelular del "polipéptido" que constituye la "molécula de superficie celular" descrita anteriormente de la presente invención, y "una región constante o una porción de una región constante de la cadena pesada de inmunoglobulina humana (Ig) ". De preferencia, es un polipéptido de fusión compuesto de una región extracelular de un polipéptido de la presente invención, y una porción de una región constante de la cadena pesada de IgG humana, y de una manera particularmente preferible, es un polipéptido de fusión compuesto de una región extracelular de un polipéptido de la presente invención, y la región (Fc) compuesta de una región de articulación, el dominio CH2 , y el dominio CH3 de la cadena pesada de IgG humana. Más aún, la IgGl es preferible entre las IgG. En adición, es preferible un polipéptido derivado de ser humano, ratón, o rata (de preferencia de ser humano) como el polipéptido de la presente invención. El polipéptido de fusión de la presente invención tiene la ventaja de que el polipéptido de fusión se puede purificar de una manera extremadamente fácil mediante la utilización de cromatografía en columna de afinidad, utilizando la propiedad de la proteína A, que se enlaza específicamente con el fragmento de inmunoglobulina, debido a que el polipéptido de fusión de la presente invención tiene una porción de una región constante (por ejemplo Fc) de una inmunoglobulina, tal como IgG, como se mencionó anteriormente, como un socio de fusión. Más aún, debido a que están disponibles diferentes anticuerpos contra Fc de diferentes inmunoglobulinas, se puede realizar fácilmente un inmunoensayo para los polipéptidos de fusión, con los anticuerpos contra Fc. El polipéptido, el fragmento de polipéptido, y el polipéptido de fusión de la presente invención, se pueden producir no solamente mediante tecnología de ADN recombinante, como se menciona más adelante, sino también mediante un método bien conocido en la técnica, tal como un método sintético químico, y un método de cultivo celular, o un método modificado de los mismos. El "gen" de la presente invención, comprende un ADN que codifica el polipéptido o fragmento de polipéptido mencionados anteriormente de la presente invención, e incluye cualquier gen que tenga una secuencia de nucleótidos que codifique el polipéptido o el fragmento de polipéptido de la presente invención. Los ejemplos del gen son aquellos que codifican el polipéptido o el fragmento de polipéptido mencionado en seguida. (1) Un polipéptido codificado por un ADN que se hibrida con un ADN que comprende una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID N0:1 bajo condiciones astringentes; (2) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene el 60 por ciento o más homología con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. (3) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N0:2, o una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual a la secuencia de aminoácidos (es decir, un polipéptido que constituye el "antígeno JTT-1 humano" y su derivado) ; (4) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos correspondiente a los residuos de nucleótidos 26 a 625 de la SEQ ID NO: 3, o una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual a la secuencia de aminoácidos (es decir, un polipéptido que constituye el "antígeno JTT-1 humano" y su derivado) ,- (5) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos correspondiente a los residuos de nucleótidos 35 a 637 de la SEQ ID NO: 4, o una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual a la secuencia de aminoácidos (es decir, un polipéptido que constituye el "antígeno JTT-1 de rata" y su derivado) ,- (6) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos correspondiente a los residuos de nucleótidos 1 a 603 de la SEQ ID NO: 5, o una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual a la secuencia de aminoácidos (es decir, un polipéptido que constituye el "antígeno JTT-1 de ratón" y su derivado) ,- (7) Un pólipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos correspondiente a los residuos de nucleótidos 35 a 685 de la SEQ ID NO: 6, o una secuencia de aminoácidos sustancialmente igual a la secuencia de aminoácidos (es decir, un polipéptido que constituye un "mutante de antígeno JTT-1 de rata" y su derivado) ,- y (8) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por un ADN que codifica un polipéptido que constituye la molécula de superficie celular de la presente invención, en donde el ADN se introduce en el transformante identificado por un depósito internacional con número de acceso FERM BP-5725, o que tiene la secuencia de aminoácidos sustancialmente igual a la secuencia de aminoácidos (es decir, un polipéptido que constituye un "antígeno JTT-1 humano" y su derivado) . Aquí, "sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos" significa como se definió anteriormente. Los ejemplos específicos del gen de la presente invención son ADNs o sus fragmentos mencionados en seguida . (1) Un ADN que comprende una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:l, y un ADN que se hibrida con el ADN bajo condiciones astringentes; (4) un ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que corresponde a los residuos de nucleótidos 26 a 625 de la SEQ ID N0:3. (5) un ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que corresponde a los residuos de nucleótidos 35 a 637 de la SEQ ID NO: 4; (6) un ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que corresponde a los residuos de nucleótidos 1 a 603 de la SEQ ID NO: 5; (7) un ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que corresponde a los residuos de nucleótidos 35 a 685 de la SEQ ID NO: 6; (8) un ADN que codifica un polipéptido que constituye una molécula de superficie celular de la presente invención, en donde el ADN se introduce en un transformante identificado por un depósito internacional con número de acceso FERM BP-5725. El ADN que codifica una porción de una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que es una parte de un polipéptido de fusión de la presente invención, puede ser ADNc, o ADN genómico comprendido de intrones entre cada exón (el ADN que codifica, por ejemplo, el dominio CH1, la región de articulación, el dominio CH2, el dominio CH3 , el dominio CH4, etcétera) . El ADN de la presente invención incluye cualquier ADN comprendido de cualesquiera codones, siempre que los codones codifiquen los mismos aminoácidos. El ADN de la presente invención puede ser un ADN obtenido mediante cualquier método. Por ejemplo, el ADN incluye ADN complementario (ADNc) preparado a partir de ARNm, ADN preparado a partir de ADN genómico, ADN preparado mediante síntesis química, ADN obtenido mediante amplificación con reacción en cadena de polimerasa con ARN o ADN como plantilla, y ADN construido mediante la combinación apropiada de estos métodos. El ADN que codifica el polipéptido de la presente invención se puede obtener mediante el método usual, tal como un método para clonar ADNc a partir de ARNm que codifique el polipéptido de la presente invención, un método para aislar ADN genómico y luego empalmarlos, síntesis química, etcétera. (1) El ADNc se puede clonar a partir del ARNm que codifique el polipéptido de la presente invención mediante, por ejemplo, el método descrito en seguida. Primero, se prepara el ARNm que codifique una molécula de superficie celular (polipéptido) de la presente invención, a partir de tejidos o células (por ejemplo, células de timo, o células de linfoblasto derivadas del bazo estimuladas con ConA) , que exprese y produzca una molécula de superficie celular (polipéptido) de la presente invención. El ARNm se puede preparar aislando ARN total mediante un método conocido, tal como el método de tiocianato de guanidina (Chirgwin, J.M. y colaboradores, Biochemistry, Volumen 18, página 5294, 1979), el método de fenol caliente, el método de AGPC, y someterlo a cromatografía por afinidad utilizando celulosa de oligo-dT o Sefarosa de poli-U. Luego, con el ARNm obtenido como plantilla, se sintetiza el ADNc, por ejemplo, mediante un método bien conocido, utilizando transcriptasa inversa, tal como el método de Okayama y colaboradores (Mol. Cell. Biol. Volumen 2, página 161 (1982); ibid. Volumen 3, página 280 (1983)), o el método de Hoffman y colaboradores (Gene Volumen 25, página 263 (1983)), y se convierte en el ADNc de doble cadena. Se prepara una biblioteca de ADNc mediante la transformación de E. coli con vectores de plásmido, vectores de fago, o vectores de cósmido que tengan este ADNc, o mediante la transfección de E. col después del empaque in vi tro . Los vectores de plásmido utilizados en esta invención no están limitados, siempre que se repliquen y se mantengan en los anfitriones. También se pueden utilizar cualesquiera vectores de fago que puedan ser replicados en los anfitriones. Los ejemplos de los vectores de clonación usualmente utilizados son pMel8S, ?ZAPII (1ZAPII) , pUC19, ? gtlO, ? gtll, etcétera. Cuando se aplica el vector a la selección inmunológica como se menciona más adelante, se utiliza de preferencia el vector que tenga un promotor que pueda expresar un gen que codifique el polipéptido de la presente invención en un hospedero. El ADNc se puede insertar en un plásmido mediante, por ejemplo, el método de Maniatis y colaboradores (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory, página 1.53, 1989) . El ADNc se puede insertar en un vector fago mediante, por ejemplo, el método de Hyunh y colaboradores (DNA cloning, a practical approach, Volumen 1, página 49 (1985) ) . Estos métodos se pueden realizar simplemente utilizando un estuche de clonación comercialmente disponible (por ejemplo, un producto de Takara Shuzo) . El plásmido recombinante o el vector de fago así obtenido se introduce en células hospederas apropiadas, tal como un procariote (por ejemplo, E. coli , XLIBlue MRF' , DH5c., HB101, MC1061/P3, etcétera) . Los ejemplos de un método para introducir un plásmido en un hospedero son el método de cloruro de calcio, el método de cloruro de calcio/cloruro de rubidio descrito en Molecular Cloning, A Laboratory Manual (segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory, página 1.74 (1989)), y el método de electroporación. Los vectores de fago se pueden introducir en las células hospederas mediante, por ejemplo, un método en donde se introducen los ADNs del fago en hospederos cultivados después del empaque in vi tro. El empaque in vi tro se puede realizar fácilmente con un estuche de empaque in vi tro comercialmente disponible (por ejemplo, un producto de Stratagene o Amersham) . El ADNc que codifica el polipéptido de la presente invención se puede aislar a partir de la biblioteca de ADNc así preparada, de acuerdo con el método mencionado anteriormente, mediante la combinación de los métodos de selección de ADNc generales . Por ejemplo, se puede seleccionar un clon que comprende el ADNc deseado mediante un método de hibridación de colonias conocido (Crunstein y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, Volumen 72, página 3961 (1975)), o el método de hibridación de placas (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory, página 2.108 (1989) ) , utilizando oligonucleótidos químicamente sintetizados marcados con como sondas, que son correspondientes a la secuencia de aminoácidos del polipéptido de la presente invención. De una manera alternativa, se puede seleccionar un clon que tenga un fragmento de ADN que codifique una región específica adentro del polipéptido de la presente invención, mediante la amplificación de la región mediante reacción en cadena de polimerasa con cebadores sintéticos de reacción en cadena de polimerasa. Cuando se utiliza una biblioteca de ADNc preparada utilizando un vector de expresión de ADNc (por ejemplo, el vector del fago ?ZAPII) , el clon deseado se puede seleccionar mediante la reacción de antígeno-anticuerpo, utilizando un anticuerpo contra el polipéptido de la presente invención. De preferencia se utiliza un método de selección empleando el método de reacción en cadena de polimerasa cuando se someten muchos clones a selección. La secuencia de nucleótidos del ADN así obtenido, se puede determinar mediante el método de Maxam-Gilbert (Maxam y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, Volumen 74, página 560 (1977) ) , o el método de terminación de cadena sintética de didesoxinucleótido utilizando el fago M13 (Sanger y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, Volumen 74, páginas 5463-5467 (1977) ) . Todo o una porción del gen que codifica el polipéptido de la presente invención se puede obtener separando el clon obtenido como se mencionó anteriormente, con enzimas de restricción, etcétera. (2) El ADN que codifica el polipéptido de la presente invención, se puede aislar a partir del ADN genómico derivado de las células que expresan el polipéptido de la presente invención, como se mencionó anteriormente, mediante los siguientes métodos. Estas células se solubilizan de preferencia mediante SDS o proteinasa K, y los ADNs se desproteinizan mediante extracción repetida con fenol. Los ARNs se digieren de preferencia con ribonucleasa. Los ADNs obtenidos se digieren parcialmente con enzimas de restricción apropiadas, y los fragmentos de ADN obtenidos se amplifican con el fago o el cósmido apropiado, para generar una biblioteca. Luego se detectan los clones que tengan la secuencia deseada, por ejemplo, mediante la utilización de sondas de ADN radioactivamente marcadas, y se obtiene todo o una porción del gen que codifica el polipéptido de la presente invención a partir de los clones mediante separación con enzima de restricción, etcétera. El ADNc que codifica un polipéptido derivado de un ser humano, se puede obtener como sigue. Después de que se prepara una biblioteca de cósmido en la que se introduce un ADN genómico humano (ADN cromosomal) ("Laboratory Manual: Human Genome Mapping" , Maruzen press) , se obtienen clones positivos que comprenden al ADN de la región de codificación de la proteína deseada mediante la selección de la biblioteca del cósmido. Luego, se selecciona la biblioteca de ADNc mencionada anteriormente con el ADN de codificación separado del clon positivo como una sonda para preparar el ADNc humano. (3) El ADN de la presente invención también se puede sintetizar químicamente mediante el método usual, basándose en la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID N0:1, 3, 4 , 5, ó 6. La presente invención también se refiere a un vector recombinante que comprende el ADN que codifica una molécula de superficie celular anteriormente mencionada (polipéptido) de la presente invención. El vector recombinante de la presente invención no está limitado, siempre que se pueda replicar y mantener, o se pueda replicar de una manera autónoma en diferentes hospederos procarióticos y/o eucarióticos. El vector de la presente invención incluye vectores de plásmido y vectores de fago. El vector recombinante se puede preparar fácilmente ligando el ADN que codifica el polipéptido de la presente invención, con un vector para recombinación disponible en la técnica (ADN de plásmido y ADN de bacterióf go) mediante el método usual. Los ejemplos específicos de los vectores para recombinación utilizados son plásmidos derivados de E. coli , tales como pBR322, pBR325, pUC12, pUC13, y pUC19, plásmidos derivados de levadura, tales como pSH19 y pSH15, y plásmidos derivados de Bacillus subtilis, tales como pUBUO, pTP5, y pCl94. Los ejemplos de los fagos son un bacteriófago, tal como un fago ?, y un virus de animal o insecto (pVL1393, Invitrogen) , tal como un retrovirus, virus de vacuna, y virus de polihedrosis nuclear. Un vector de expresión es útil para expresar el ADN que codifica el polipéptido de la presente invención, y para producir el polipéptido de la presente invención. El vector de expresión no está limitado, siempre que exprese el gen que codifique el polipéptido de la presente invención en diferentes células hospederas procarióticas y/o eucarióticas, y que produzca esta proteína. Los ejemplos son pEFneo (Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, Volumen 91, páginas 158-162 (1994)), pEF-BOS (Nucleic Acids Res. Volumen 18, página 5322 (1990)), pME18S (Experimental Medicine: SUPLEMENTO, "Handbook of Genetic Engineering" (1992)), pMAL C2 , etcétera. Cuando se utilizan bacterias, particularmente E. coli , como células hospederas, un vector de expresión generalmente está comprendido de cuando menos una región de promotor/operador, un codón de iniciación, codificando el ADN al polipéptido de la presente invención, al codón de terminación, a la región terminadora, y al replicón. Cuando se utilizan levadura, células animales, o células de insectos como hospederas, un vector de expresión de preferencia está comprendido de cuando menos un promotor, un codón de iniciación, el ADN que codifique al polipéptido de la presente invención, y un codón de terminación. También puede comprender el ADN que codifique un péptido de señal, una secuencia mejoradora, la región 5'- y 3'- no traducida del gen que codifique al polipéptido de la presente invención, uniones de empalme, un sitio de poliadenilación, la región del marcador seleccionable, y el replicón. El vector de expresión también puede contener, si se requiere, un gen para la amplificación del gen (marcador) que se utiliza normalmente. Una región de promotor/operador para expresar el polipéptido de la presente invención en bacterias comprende un promotor, un operador, y una secuencia de Shine-Dalgarno (SD) (por ejemplo, AAGG) . Por ejemplo, cuando la hospedera es Escherichia, de preferencia comprende el promotor Trp, el promotor lac, el promotor recA, el promotor ?PL, el promotor lpp, el promotor tac, o similares. Los ejemplos de un promotor para expresar el polipéptido de la presente invención en levadura son el promotor PH05, el promotor PGK, el promotor GAP, el promotor ADH, etcétera. Cuando el hospedero es Bacillus, sus ejemplos son el promotor SL01, el promotor SP02, el promotor penP, etcétera. Cuando el hospedero es una célula eucariótica, tal como una célula de mamífero, sus ejemplos son el promotor derivado de SV40, el promotor de retrovirus, el promotor de choque por calor, el promotor EF, etcétera, y de preferencia SV40, SRo¿, y el derivado de retrovirus. Como un asunto de curso, el promotor no está limitado a los ejemplos anteriores. En adición, es efectivo utilizar un mejorador para la expresión. Un codón de iniciación preferible es, por ejemplo, un codón de metionina (ATG) . El codón de terminación comúnmente utilizado (por ejemplo, TAG, TGA, TAA, etcétera) se ilustra como un codón de terminación . Normalmente se utilizan terminadores naturales o sintéticos como una región terminadora. Un replicón significa un ADN que puede replicar toda la secuencia de ADN en las células hospederas, e incluye un plásmido natural, un plásmido artificialmente modificado (fragmento de ADN preparado a partir de un plásmido natural) , un plásmido sintético, etcétera. Los ejemplos de un plásmido preferible son pBR322 o sus derivados artificiales (fragmento de ADN obtenido mediante el tratamiento de pBR322 con enzimas de restricción apropiadas (para E. coli , plásmido 2 µ de levadura, o ADN cromosomal de levadura para levadura, y pEFneo, pME18S, pRSVneo ATCC 37198, pSV2dhfr ATCC 37145, pdBPV-MMTneo ATCC 37224, pSV2neo ATCC 37149, etcétera para células de mamífero. También se puede utilizar una secuencia mejoradora, un sitio de poliadenilación, y una unión de empalme que se utilizan normalmente en la técnica, tales como aquellos derivados a partir de SV40. Se puede utilizar un marcador seleccionable normalmente utilizado de acuerdo con el método usual. Los ejemplos son genes de resistencia para antibióticos, tales como tetraciclina, neomicina, ampicilina, o kanamicina, y el gen de quinasa de timidina. Los ejemplos de un gen para la amplificación genética son el gen de reductasa de dihidrofolato (DHFR) , el gen de quinasa de timidina, el gen de resistencia a la neomicina, el gen de sintasa de glutamato, el gen de desaminasa de adenosina, el gen de descarboxilasa de ornitina, el gen de B-fosfotransferasa de higromicina, el gen de transcarbamilasa de aspartato, etcétera. El vector de expresión de la presente invención se puede preparar mediante el enlace continuo y circular de cuando menos el promotor anteriormente mencionado, el codón de iniciación, el ADN (gen) que codifique al polipéptido de la presente invención, el codón de terminación, y la región terminadora, con un replicón apropiado. Si se desea, se pueden utilizar fragmentos de ADN apropiados (por ejemplo, enlazadores, sitios de restricción generados con otra enzima de restricción) , mediante el método usual, tal como digestión con una enzima de restricción, o ligamiento utilizando ligasa de ADN T4. Los transformantes de la presente invención se pueden preparar mediante la introducción del vector de expresión mencionado anteriormente en células hospederas.

Las células hospederas utilizadas en la presente invención no están limitadas, siempre que sean compatibles con un vector de expresión mencionado anteriormente, y se puedan transformar. Los ejemplos son diferentes células, tales como células naturales, o células recombinantes artificialmente establecidas normalmente utilizadas en el campo técnico de la presente invención (por ejemplo, bacterias Escherichia y Bacillus) , levadura (Saccharomyces , Pichia, etcétera) , células animales, o células de insectos. De preferencia se utilizan células de E. coli o de animales. Los ejemplos específicos son E. coli (DH5c., XLIBlue MRF' , TB1, HB101, etcétera), células derivadas de ratón (COP, L, C127, Sp2/0, NS-1, NIH 3T3, etcétera), células derivadas de rata, células derivadas de hámster (BHK, CHO-K1, CHO, etcétera), células derivadas de mono (COSÍ, COS3 , COS7, CV1, etcétera), y células derivadas de ser humano (HEK293, Hela, células derivadas de fibroblasto diploide, mieloma, Namalwa, etcétera) . Se puede introducir un vector de expresión (transformado (transducido) ) en células hospederas mediante el método conocido. La transformación se puede realizar, por ejemplo, de acuerdo con el método de Cohén y colaboradores (Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, Volumen 69, página 2110 (1972)), el método de protoplasto (Mol. Gen. Genet., Volumen 168, página 111 (1979)), o el método competente (J. Mol. Biol., Volumen 56, página 209 (1972)), cuando las hospederas son bacterias (E. coli , Bacillus subtilis, etcétera) , el método de Hinnen y colaboradores (Proc.

Nati. Acad. Sci. EUA, Volumen 75, página 1927 (1978)), o el método de litio (J. Bacteriol . , Volumen 153, página 163 (1983)), cuando el hospedero es Saccharomyces cerevisiae, el método de Graham (Virology, Volumen 52, página 456 (1973)), cuando los hospederos son células animales, y el método de Summers y colaboradores (Mol. Cell. Biol., Volumen 3, páginas 2156-2165 (1983)) cuando los hospederos son células de insecto. El polipéptido de la presente invención se puede producir mediante el cultivo de transformantes (en lo siguiente, este término incluye transductantes) que comprendan un vector de expresión preparado como se mencionó anteriormente en un medio nutriente. El medio nutriente de preferencia comprende una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno inorgánico, o una fuente de nitrógeno orgánico, necesaria para el crecimiento de las células hospederas (transformantes) . Los ejemplos de la fuente de carbono son glucosa, dextrano, almidón soluble, y sacarosa, y los ejemplos de la fuente de nitrógeno inorgánico u orgánico son sales de amonio, nitratos, aminoácidos, licor de maíz, peptona, caseína, extracto de carne, torta de frijol de soya, y extracto de papa. Si se desea, pueden comprender otros nutrientes (por ejemplo, una sal inorgánica (por ejemplo, cloruro de calcio, difosfato ácido de sodio, y cloruro de magnesio) , vitaminas, antibióticos (por ejemplo, tetraciclina, neomicina, ampicilina, kanamicina, etcétera) ) . El cultivo se realiza mediante un método conocido en la materia. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH del medio, y tiempo de cultivo, se seleccionan apropiadamente, de tal manera que se sobreproduzca el polipéptido de la presente invención. El medio específico y las condiciones de cultivo utilizadas que dependen de las células hospederas, se ilustran más adelante, pero no se limitan a los mismos. Cuando las hospederas son bacterias, son apropiados los actinomicetos, levaduras, hongos filamentosos, y el medio líquido que comprenda a la fuente de nutriente mencionada anteriormente. De preferencia se utiliza el medio con un pH de a 8. Cuando el hospedero es E. coli , los ejemplos del medio preferido son medio LB, y medio M9 (Miller y colaboradores, Exp. Mol. Genet., Cold Spring Harbor Laboratory, página 431 (1972) ) . Utilizando estos medios, se puede realizar el cultivo normalmente de 1 °C a 43 °C durante aproximadamente 3 a 24 horas con aireación y agitación, si es necesario. Cuando el hospedero es Bacillus, el cultivo se puede realizar normalmente de 30°C a 40°C durante aproximadamente 16 a 96 horas con aireación y agitación, si es necesario.

Cuando el hospedero es levadura, los ejemplos del medio son medio mínimo de Burkholder (Bostian, Proc. Nati.

Acad. Sci. EUA, Volumen 77, página 4505 (1980)). El pH del medio es de preferencia de 5 a 8. El cultivo se puede realizar normalmente de 20°C a 35°C durante aproximadamente 14 a 144 horas con aireación y agitación, si es necesario. Cuando el hospedero es una célula animal, los ejemplos del medio son medio MEM que contenga de aproximadamente el 5 al 20 por ciento de suero bovino fetal (Science, Volumen 122, Página 501 (1952)), medio de DMEM (Virology, Volumen 8, página 396 (1959)), medio RPMI1640 (J.

Am. Med. Assoc, Volumen 199, (1967)), y medio 199 (Proc. Soc.

Exp. Biol. Med., Volumen 173, página 1 (1950)) . El pH del medio de preferencia es de aproximadamente 6 a 8. El cultivo se puede realizar normalmente de aproximadamente 30°C a 40°C durante aproximadamente 15 a 72 horas con aireación y agitación, si es necesario. Cuando el hospedero es una célula de insecto, un ejemplo del medio es medio de Grace conteniendo suero bovino fetal (Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, Volumen 82, página 8404 (1985) ) . El pH del mismo de preferencia es de aproximadamente a 8. El cultivo se puede realizar normalmente de aproximadamente 20°C a 40°C durante 15 a 100 horas con aireación y agitación, si es necesario. El cultivo de los transformantes mencionados anteriormente, en particular de células animales, puede sobreexpresar el polipéptido de la presente invención sobre la superficie de las células. El polipéptido de la presente invención se puede producir como un fragmento de polipéptido soluble, tal como un fragmento de la región extracelular, mediante la preparación de los transformantes como se mencionó anteriormente, utilizando el ADN que codifique la región extracelular o cada dominio, y mediante el cultivo de los transformantes para permitirles secretar el polipéptido soluble en el sobrenadante de cultivo. En adición, de una manera similar se puede preparar un polipéptido de fusión de la presente invención. Es decir, se obtiene un filtrado de cultivo (sobrenadante) mediante el método, tal como filtración o centrifugación del cultivo obtenido, y se purifica y se aisla el polipéptido o el fragmento de polipéptido de la presente invención a partir del filtrado de cultivo mediante el método usual comúnmente utilizado, con el objeto de purificar y aislar una proteína natural o sintética. Los ejemplos del método de aislamiento y purificación son un método que utiliza la solubilidad, tal como el método de extracción de sal y precipitación en solvente, un método que utiliza la diferencia en el peso molecular, tal como diálisis, ultrafiltración, filtración de gel, y electroforesis en gel de sulfato dodecílico de sodio-amida poliacrílica, un método que utiliza cargas, tal como cromatografía de intercambio de iones y cromatografía de hidroxilapatita, un método que utiliza afinidad específica, tal como cromatografía por afinidad, un método que utiliza la diferencia en la hidrofobicidad, tal como cromatografía de líquido de alto rendimiento de fase inversa, y un método que utiliza la diferencia en el punto isoeléctrico, tal como enfoque isoeléctrico. Cuando el polipéptido o un fragmento de polipéptido de la presente invención existe en el periplasma o citoplasma de transformantes cultivados, primero se cosechan cuerpos de hongo o células mediante el método usual, tal como filtración o centrifugación, y se suspenden en un regulador apropiado. Después de que se altera la pared celular y/o la membrana celular de las células, etcétera, mediante el método tal como lisis con sonicación, lisozima, y congelación-descongelación, se obtiene la fracción de membrana que comprende al polipéptido de la presente invención mediante el método tal como centrifugación o filtración. La fracción de membrana se solubiliza con un detergente, tal como Triton-X-100, para obtener el extracto crudo. Finalmente, se aisla el polipéptido o el fragmento de polipéptido, y se purifica a partir del extracto crudo mediante el método usual como se ilustra anteriormente . El "ratón transgénico" de la presente invención es un ratón transgénico en donde el ADN (ADNc ó ADN genómico) preparado como se mencionó anteriormente, que codifica el polipéptido de la presente invención, derivado a partir de animales excepto ratones (polipéptido que no es del mismo) , se ha integrado en su lugar endógeno del ratón. El ratón transgénico expresa el polipéptido que no es del mismo, y secreta el polipéptido hacia su cuerpo. El ratón transgénico se puede preparar de acuerdo con el método normalmente utilizado para producir un animal transgénico (por ejemplo, ver "Newest Manual of Animal Cell Experiment", LIC press, Capítulo 7, páginas 361-408 (1990)). Específicamente, por ejemplo, las células de tallo embriónico (células ES) obtenidas de blastocitos de ratón normal, se transforman con un vector de expresión en el que se ha insertado operativamente el gen que codifica el polipéptido derivado de ser humano de la presente invención (es decir, "antígeno JTT-1 humano") . Las células de tallo embriónico en donde se ha integrado el gen que codifica el polipéptido derivado de ser humano de la presente invención en el gen endógeno, se seleccionan mediante el método usual. Luego, las células de tallos embriónico seleccionadas se microinyectan en un huevo fertilizado obtenido de otro ratón normal (blastocito) (Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, Volumen 77, Número 112, páginas 7380-7384 (1980) ,- Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,873,191) . El blastocito se trasplante al útero de otro ratón normal como la madre nutriente. Luego, nacen ratones fundadores (ratones de progenie) del ratón madre nutriente. Mediante el acoplamiento de los ratones fundadores con ratones normales, se obtienen ratones transgénicos heterogeneicos . Mediante el acoplamiento de los ratones transgénicos heterogeneicos unos con otros, se obtienen ratones transgénicos homogeneicos de acuerdo con las leyes de Mendel . "Ratón knockout" de la presente invención, es un ratón en el que se ha derribado (inactivado) el gen endógeno que codifica el polipéptido derivado de ratón de la presente invención (es decir, "antígeno JTT-1 de ratón") . Se puede preparar, por ejemplo, mediante el método de selección positiva-negativa, en donde se aplica la recombinación homologa (Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Número ,464,764; Número 5,487,992; Número 5,627,059; Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, Volumen 86, páginas 8932-8935 (1989); Nature, Volumen 342, páginas 435-438 (1989) ; etcétera) . El "anticuerpo" de la presente invención puede ser un anticuerpo policlonal (antisuero) , o un anticuerpo monoclonal, y de preferencia un anticuerpo monoclonal . Específicamente, es un anticuerpo que reacciona a (contra, que se enlaza con) el polipéptido o fragmento de polipéptido anteriormente mencionado de la presente invención. El anticuerpo de la presente invención puede ser de anticuerpos naturales obtenidos mediante la inmunización de mamíferos, tales como ratones, ratas, hámsteres, conejillos de indias, y conejos, con el antígeno, tal como células (células naturales, líneas celulares, células tumorales, etcétera) que expresen "moléculas de superficie celular" de la presente invención, transformantes que sobreexpresen el polipéptido o las moléculas de superficie celular de la presente invención sobre su superficie, preparados utilizando tecnología de ADN recombinante sobre la superficie celular, o "fragmentos de polipéptido" o "polipéptidos de fusión" de la presente invención. El anticuerpo de la presente invención también incluye anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados (anticuerpos injertados con CDR) , que se pueden producir mediante tecnología de ADN recombinante, y anticuerpos humanos que se pueden producir utilizando animales transgénicos que produzcan anticuerpos humanos. El anticuerpo monoclonal incluye aquellos que tienen cualquier isótopo de IgG, IgM, IgA, IgD, IgE. Es preferible IgG ó IgM. El anticuerpo policlonal (antisuero) o el anticuerpo monoclonal de la presente invención, se puede producir mediante los métodos conocidos. Es decir, se inmuniza un mamífero, de preferencia un ratón, rata, hámster, conejillo de indias, conejo, gato, perro, cerdo, cabra, caballo, o ganado, o más preferiblemente un ratón, rata, hámster, conejillo de indias, o conejo, por ejemplo con un antígeno mencionado anteriormente, con un auxiliar de Freund, si es necesario.

El anticuerpo policlonal se puede obtener a partir del antisuero obtenido del animal así inmunizado. En adición, los anticuerpos monoclonales se producen como sigue. Se preparan hibridomas a partir de las células productoras de anticuerpos obtenidas del animal así inmunizado, y células de mieloma que no son capaces de producir auto-anticuerpos. Los hibridomas se clonan, y se seleccionan los clones que produzcan los anticuerpos monoclonales que muestren la afinidad específica para el antígeno utilizado para inmunizar al mamífero. De una manera específica, el anticuerpo monoclonal se puede producir como sigue. Se realizan inmunizaciones mediante la inyección o la implantación una vez o varias veces del antígeno, como se mencionó anteriormente, como un inmunógeno, si es necesario, con auxiliar de Freund, subcutáneamente, intramuscularmente, intravenosamente, a través de la planta del pie, o intraperitonealmente en un mamífero no humano, específicamente un ratón, rata, hámster, conejillo de indias, o conejo, de preferencia un ratón, rata, o hámster (incluyendo un animal transgénico generado para producir anticuerpos derivados de otro animal, tal como el ratón transgénico que produce el anticuerpo humano mencionado más adelante) . Normalmente, las inmunizaciones se realizan de una vez a cuatro veces cada uno a catorce días después de la primera inmunización. Se obtienen células productoras de anticuerpos del mamífero así inmunizado en aproximadamente 1 a 5 días después de la última inmunización. La frecuencia y el intervalo de inmunizaciones pueden arreglarse apropiadamente, dependiendo de la propiedad del inmunógeno utilizado. Los hibridomas que secretan un anticuerpo monoclonal se pueden preparar mediante el método de Kóhler y Milstein (Nature, Volumen 256, páginas 495-497 (1975)), y mediante su método modificado. Es decir, se preparan hibridomas mediante la fusión de células productoras de anticuerpos contenidas en un bazo, nodo de linfa, médula ósea, o amígdala, obtenidos del mamífero no humano inmunizado como se mencionó anteriormente, de preferencia un bazo, con mielomas sin capacidad para producir auto-anticuerpos, que se deriven de, de preferencia, un mamífero, tal como un ratón, rata, conejillo de indias, hámster, conejo, o un ser humano, o más preferiblemente un ratón, rata, o un ser humano. Por ejemplo, se puede utilizar el mieloma derivado de ratón P3/X63-AG8.653 (653), P/NSl/l-Ag4-l (NS-1) , P3/X63-Ag8.Ul (P3U1) , SP2/0-Agl4 (Sp2/0, Sp2), PAI , FO, ó BW5147, el mieloma derivado de rata 210RCY3-Ag.2.3. , ó el mieloma derivado de ser humano U-266AR1, GM1500-6TG-A1-2 , UC729-6, CEM-AGR, D1R11, ó CEM-T15, como un mieloma utilizado para la fusión celular. Los clones de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales se pueden seleccionar mediante el cultivo de hibridomas, por ejemplo, en placas de microtitulación, y midiendo la reactividad del sobrenadante de cultivo en la cavidad en donde se observe el crecimiento del hibridoma, hay inmunógeno utilizado para la inmunización mencionada anteriormente, por ejemplo, mediante inmunoensayo enzimático, tal como RÍA y ELISA. Los anticuerpos monoclonales se pueden producir a partir de hibridomas mediante el cultivo de los hibridomas in vi tro ó in vivo, tal como en el fluido de ascitas de un ratón, rata, conejillo de indias, hámster, o conejo, de preferencia un ratón o una rata, más preferiblemente un ratón, y aislando los anticuerpos a partir del sobrenadante de cultivo resultante o del fluido de ascitas de un mamífero. El cultivo de hibridomas in vi tro se puede realizar dependiendo de la propiedad de las células que se vayan a cultivar, del objeto de un estudio de prueba, y de las diferentes condiciones de un método de cultivo, mediante la utilización de medios nutrientes conocidos, o cualquier medio nutriente derivado de un medio basal conocido para cultivar, mantener, y almacenar los hibridomas con el fin de producir anticuerpos monoclonales en un sobrenadante de cultivo. Los ejemplos del medio basal son un medio de baja concentración de calcio, tal como medio de Ham'F12, medio MCDB153, o un medio MEM con baja concentración de calcio, y un medio con alta concentración de calcio, tal como un medio MCDB104, medio MEM, medio D-MEM, medio RPMI1640, medio ASF104, o medio RD. El medio basal puede contener, por ejemplo, suero, hormonas, citoquinas, y/o diferentes sustancias inorgánicas u orgánicas, dependiendo del objetivo. Los anticuerpos monoclonales se pueden aislar y purificar a partir del sobrenadante de cultivo o del fluido de ascitas mencionado anteriormente, mediante precipitación con sulfato de amonio saturado, método de precipitación de euglobulina, método de ácido caproico, método de ácido caprílico, cromatografía de intercambio de iones (DEAE ó DE52) , cromatografía por afinidad utilizando una columna anti-inmunoglobulina, o una columna de proteína A. Los ejemplos preferibles de anticuerpos monoclonales de la presente invención son como sigue. (1) Un anticuerpo monoclonal que reacciona a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2, un fragmento de polipéptido derivado a partir del polipéptido, o una molécula de superficie celular derivada de ser humano compuesta del polipéptido; (2) un anticuerpo monoclonal que reacciona a un polipéptido de la presente invención, un fragmento de polipéptido derivado a partir del polipéptido, o una molécula de superficie celular compuesta del polipéptido, en donde el efecto del anticuerpo monoclonal sobre las células de linfoblasto estimuladas por mitógeno es sustancialmente igual al efecto de un anticuerpo monoclonal producido por un hibridoma identificado mediante el depósito internacional con número de acceso FERM BP-5707 sobre células de linfoblasto de rata estimuladas por mitógeno; y (3) un anticuerpo monoclonal que reacciona a un polipéptido de la presente invención, un fragmento de polipéptido derivado a partir del polipéptido, o una molécula de superficie celular compuesta del polipéptido, en donde el efecto del anticuerpo monoclonal sobre células de linfoblasto estimuladas por mitógeno es sustancialmente igual al efecto de un anticuerpo monoclonal producido por un hibridoma identificado mediante el depósito internacional con número de acceso FERM BP-5708 sobre células de linfoblasto de rata estimuladas por mitógeno. En adición, el anticuerpo monoclonal de la presente invención incluye aquel producido por el hibridoma identificado mediante el depósito internacional con número de acceso FERM BP-5707 o número FERM BP-5708. El "anticuerpo monoclonal quimérico" de la presente invención es un anticuerpo monoclonal preparado mediante ingeniería genética, y significa específicamente un anticuerpo quimérico tal como anticuerpo monoclonal quimérico de ratón/humano, cuyas regiones variables se derivan a partir de inmunoglobulina de un mamífero no humano (ratón, rata, hámster, etcétera) , y cuyas regiones constantes se derivan a partir de inmunoglobulina humana. La región constante derivada de inmunoglobulina humana tiene la secuencia de aminoácidos inherente en cada isotipo, tal como IgG (IgGl, IgG2 , IgG3 , IgG4) , IgM, IgA, IgD, e IgE. La región constante del anticuerpo monoclonal quimérico recombinante de la presente invención puede ser aquella de inmunoglobulina humana perteneciente a cualquier isotipo. De preferencia, es la región constante de IgG humana. El anticuerpo monoclonal quimérico de la presente invención se puede producir, por ejemplo, como sigue. No es necesario decir que el método de producción no se limita al mismo. Un anticuerpo monoclonal quimérico de ratón/humano se puede preparar, haciendo referencia a Experimental Medicine: SUPLEMENTO, Volumen 1.6, Número 10 (1988); y a la Solicitud de Patente Japonesa Publicada Examinada (JP-B) número Hei 3-73280. Es decir, se puede preparar mediante la inserción operativa del gen CH (el gen C que codifica la región constante de la cadena H) obtenido a partir del 7?DN que codifica inmunoglobulina humana corriente abajo de los genes VH activos (el gen VDJ reconfigurado que codifica la región variable de la cadena H) obtenidos a partir del ADN que codifica un anticuerpo monoclonal de ratón aislado a partir del hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal de ratón, y el gen CL (el gen C que codifica la región constante de la cadena L) obtenido a partir del ADN que codifica inmunoglobulina humana corriente abajo de los genes VL activos (el gen VJ reconfigurado que codifica la región variable de la cadena L) obtenidos a partir del ADN que codifica el anticuerpo monoclonal de ratón aislado a partir del hibridoma, en los mismos o en diferentes vectores para que ellos se expresen, siguiendo mediante la transformación de las células hospederas con el vector de expresión, y luego mediante el cultivo de los transformantes. Específicamente, primero se extraen los ADNs de los hibridomas productores de anticuerpo monoclonal de ratón mediante el método usual, se digieren con enzimas de restricción apropiadas (por ejemplo, EcoRI y HindIII) , se pasan por electroforesis (utilizando, por ejemplo, gel de agarosa al 0., 7 por ciento), y se analizan mediante mancha Southern. Después se tiñe un gel pasado por electroforesis, por ejemplo, con bromuro de etidio, y se fotografía, se dan al gel las posiciones de marcador, se lava dos veces con agua, y se remoja en HCl 0.25 M durante 15 minutos. Luego se remoja el gel en una solución de NaOH 0.4N durante 10 minutos con ligera agitación, los ADNs se transfieren a un filtro durante 4 horas mediante el método usual . El filtro se recupera y se lava dos veces con 2xSSC. Después de que se seca suficientemente el filtro, se hornea a 75°C durante 3 horas. Después de hornearse, el filtro se trata con 0.1 x SSC/SDS al 0.1 por ciento a 65°C durante 30 minutos. Luego se remoja en 3 x SSC/SDS al 0.1 por ciento. El filtro obtenido se trata con una solución de prehibridación en una bolsa de plástico a 65°C durante 3 a 4 horas.

En seguida, se agregan el ADN de sonda marcado con 32SP, y la solución de hibridación a la bolsa, y se hacen reaccionar a 65°C durante aproximadamente 12 horas. Después de la hibridación, el filtro se lava bajo una concentración de sal, temperatura de reacción, y tiempo apropiados (por ejemplo, 2 x SSC-SDS al 0.1 por ciento, temperatura ambiente, 10 minutos) . El filtro se pone en una bolsa de plástico con un poco de 2 x SSC, y se somete a autorradiografía después de que se sella la bolsa. El gen VDJ reconfigurado y el gen VJ que codifica la cadena H y la cadena L de un anticuerpo monoclonal de ratón, se identifican mediante mancha Southern mencionada anteriormente. La región que comprende el fragmento de ADN identificado se fracciona mediante centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa, y se inserta en un vector de fago (por ejemplo, Charon 4A, Charon 28, XEMBL3 , XEMBL4 , etcétera). Se transforma E. coli (por ejemplo, LE392, NM539, etcétera) con el vector de fago para generar una biblioteca genómica. La biblioteca genómica se selecciona mediante hibridación de placas, tal como el método de Benton-Davis (Science, Volumen 196, páginas 180-182 (1977) ) , utilizando sondas apropiadas (gen J de cadena H, gen J de cadena L ( n ) , etcétera) , con el fin de obtener clones positivos que comprendan al gen VDJ o al gen VJ reconfigurados . Al hacer el mapa de restricción, y al determinar la secuencia de nucleótidos de los clones obtenidos, se confirma que se obtienen genes que comprenden el gen VH (VDJ) o el gen VL (VJ) reconfigurados . Por separado, se aisla el gen CH humano y el gen CL humano utilizados para la quimerización. Por ejemplo, cuando se produce un anticuerpo quimérico con IgGl humana, se aisla el gen C?l como un gen CH, y el gen CK como un gen CL. Estos genes se pueden aislar a partir de la biblioteca genómica humana con el gen C?l de ratón y el gen C/e de ratón, correspondientes al gen C?l humano y al gen Cu humano, respectivamente, como sondas, sacando ventaja de la alta homología entre las secuencias de nucleótidos del gen de inmunoglobulina de ratón y aquel del gen de inmunoglobulina humana. De una manera específica, se aislan los fragmentos de ADN que comprenden el gen C. humano y una región mejoradora a partir de la biblioteca genómica HaelII-AluI de ? Charon 4A humano (Cell, Volumen 15, páginas 1157-1174 (1978)), por ejemplo, con un fragmento HindIII-BamHI de 3 kb del clon Igl46 (Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, Volumen 75, páginas 4709-4713 (1978)), y un fragmento EcoRI de 6.8 kb del clon MEP10 (Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, volumen 78, páginas 474-478 (1981)) como sondas. En adición, por ejemplo, después de que se digiere el ADN de hepatocito fetal humano con HindIII, y se fracciona mediante electroforesis en gel de agarosa, se inserta un fragmento de 5.9 kb en X788, y luego se aisla el gen C?l humano con las sondas mencionadas anteriormente.

Utilizando el gen VH de ratón, el gen VL de ratón, el gen CH humano, y el gen CL humano así obtenidos, y tomando en consideración la región promotora y la región mejoradora, se inserta el gen CH humano corriente abajo del gen VH de ratón, y se inserta el gen CL humano corriente abajo del gen VL de ratón, en un vector de expresión tal como pSV2gpt ó pSV2neo con enzimas de restricción apropiadas y ligasa de ADN mediante el método usual. En este caso, se pueden insertar respectivamente genes quiméricos del gen VH de ratón/gen CH humano y del gen VL de ratón/gen CL humano en el mismo vector de expresión o en diferentes vectores de expresión. Los vectores de expresión insertados en el gen quimérico así preparados se introducen en mielomas que no produzcan anticuerpos, por ejemplo, células P3X63»653 o células SP210, mediante el método de fusión de protoplasto, el método de DEAE-dextrano, el método de fosfato de calcio, o el método de electroporación. Los transformantes se seleccionan mediante cultivo en un medio que contiene un fármaco correspondiente al gen de resistencia a fármacos insertado en el vector de expresión, y luego se obtienen células que producen los anticuerpos monoclonales quiméricos deseados. Los anticuerpos monoclonales quiméricos deseados se obtienen a partir del sobrenadante de cultivo de las células productoras de anticuerpos así seleccionadas. El "anticuerpo monoclonal humanizado (anticuerpo injertado con CDR) " de la presente invención, es un anticuerpo monoclonal preparado mediante ingeniería genética, y significa específicamente un anticuerpo monoclonal humanizado en donde una porción o todas las regiones determinantes de complementariedad de la región hipervariable se derivan a partir de las regiones determinantes de complementariedad de la región hipervariable de un anticuerpo monoclonal de un mamífero no humano (ratón, rata, hámster, etcétera) , las regiones de estructura de la región variable se derivan a partir de las regiones de estructura de la región variable de inmunoglobulina humana, y la región constante se deriva a partir de una región constante humana de inmunoglobulina. Las regiones determinantes de complementariedad de la región hipervariable existen en la región hipervariable de la región variable de un anticuerpo, y significan tres regiones que se enlazan directamente y de una manera complementaria a un antígeno (residuos determinantes de complementariedad, CDR1, CDR2 , y CDR3) . Las regiones de estructura de la región variable significan cuatro regiones comparativamente conservadas que quedan corriente arriba, corriente abajo, o entre las tres regiones determinantes de complementariedad (región de estructura, FRl, FR2, FR3 , y FR4) . En otras palabras, un anticuerpo monoclonal humanizado significa que, la región entera, excepto una porción de todas las regiones determinantes de complementariedad de la región hipervariable de un anticuerpo monoclonal derivado de un mamífero no humano, ha sido reemplazada con sus regiones correspondientes derivadas de inmunoglobulina humana. La región constante derivada de inmunoglobulina humana tiene la secuencia de aminoácidos inherente en cada isotipo tal como IgG (IgGl, IgG2, IgG3 , IgG4) , IgM, IgA, IgD, e IgE. La región constante de un anticuerpo monoclonal humanizado en la presente invención puede ser aquella de inmunoglobulina humana perteneciente a cualquier isotipo. De preferencia, es la región constante de IgG humana. Las regiones de estructura de la región constante derivada de inmunoglobulina humana no están limitadas de una manera particular. El anticuerpo monoclonal humanizado de la presente invención se puede producir, por ejemplo, como sigue. No es necesario decir que el método de producción no está limitado al mismo . Por ejemplo, se puede preparar un anticuerpo monoclonal humanizado recombinante derivado a partir del anticuerpo monoclonal de ratón mediante ingeniería genética, haciendo referencia a la Publicación de Patente Japonesa no examinada (JP-WA) número Hei 4-506458, y la Publicación de Patente Japonesa no examinada (JP-A) número Sho 62-296890. Es decir, se aislan cuando menos un gen CDR de cadena H de ratón y cuando menos un gen CDR de cadena L de ratón correspondiente al gen CDR de cadena H de ratón a partir de hibridomas que produzcan el anticuerpo monoclonal de ratón, y se aislan un gen de cadena H humano que codifique todas las regiones, excepto el CDR de cadena H humano correspondiente al CDR de cadena H de ratón mencionado anteriormente, y un gen de cadena L humano que codifique toda la región, excepto el CDR de cadena L humano correspondiente al CDR de cadena L de ratón mencionado anteriormente, a partir de genes de inmunoglobulina humana. Los genes CDR de cadena H de ratón y los genes de cadena H humanos así aislados, se insertan operativamente en un vector apropiado, de tal manera que se puedan expresar. De una manera similar, los genes CDR de cadena L de ratón y los genes de cadena L humanos se insertan operativamente en otro vector apropiado, de tal manera que se puedan expresar. De una manera alternativa, los genes CDR de cadena H de ratón/los genes de cadena H humanos, y los genes CDR de cadena L de ratón/los genes de cadena L humanos se pueden insertar operativamente en el mismo vector de expresión, de tal manera que se puedan expresar. Las células hospederas se transforman con el vector de expresión así preparado, para obtener transformantes que produzcan anticuerpo monoclonal humanizado. Mediante el cultivo de los transformantes, se obtiene el anticuerpo monoclonal humanizado deseado a partir del sobrenadante de cultivo. El "anticuerpo monoclonal humano" de la presente invención es inmunoglobulina, en donde se derivan las regiones enteras que comprenden la región variable y constante de la cadena H, y la región variable y constante de la cadena L, que constituyen la inmunoglobulina, a partir del gen que codifica inmunoglobulina humana. El anticuerpo humano se puede producir de la misma manera que el método de producción de los anticuerpos policlonales o monoclonales mencionados anteriormente mediante la inmunización, con un antígeno, de un animal transgénico que, por ejemplo, se le hayan integrado cuando menos genes de inmunoglobulina humana en el lugar de un mamífero no humano, tal como un ratón, mediante el método usual. Por ejemplo, se prepara un ratón transgénico que produzca anticuerpos humanos mediante los métodos descritos en Nature Genetics, Volumen 7, páginas 13-21 (1994); Nature Genetics, Volumen 15, páginas 146-156 (1997), JP-WA Números Hei 4-504365 y Hei 7-509137; Nikkei Science, Número 6, páginas 40-50 (1995) ; Publicación de Patente Internacional Número W094/25585; Nature, Volumen 368, páginas 856-859 (1994); y JP-WA Número Hei 6-500233. En adición, también se puede aplicar la técnica recientemente desarrollada para la producción de una proteína derivada de ser humano a partir de la leche de una vaca o cerdo transgénico (Nikkei Science, páginas 78-84 (T?bril de 1997) ) . La "porción de un anticuerpo" utilizada en la presente invención significa una región parcial del anticuerpo monoclonal como se mencionó anteriormente, y específicamente, significa F(ab')2, FabY Fab, Fv (fragmento variable de anticuerpo) , sFv, dsFv (Fv estabilizado con disulfuro) , ó dAb (anticuerpo de un solo dominio) (Exp. Opin. Ther. Patents, Volumen 6, Número 5, páginas 441-456 (1996)) . "F(ab')2 y "Fab'" se pueden producir mediante el tratamiento de inmunoglobulina (anticuerpo monoclonal) con una proteasa, tal como pepsina y papaína, y significa un fragmento de anticuerpo generado mediante la digestión de inmunoglobulina cerca de los enlaces de disulfuro existentes entre las regiones de articulación en cada una de las dos cadenas H. Por ejemplo, la papaína disocia la IgG corriente arriba de los enlaces de disulfuro que existen entre las regiones de articulación en cada una de las dos cadenas H, para generar dos fragmentos de anticuerpo homólogos, en donde se conectan una cadena L compuesta de VL (región variable de cadena L) , y CL (región constante de cadena L) , y un fragmento de cadena H compuesto de VH (región variable de cadena H) y CH?l (región ?l en la región constante de la cadena H) , en sus regiones C-terminales, a través de un enlace de disulfuro. Cada uno de estos dos fragmentos de anticuerpo homólogos se denomina Fab' . La pepsina también disocia la IgG corriente arriba de los enlaces de disulfuro existentes entre las regiones de articulación en cada una de las dos cadenas H, para generar un fragmento de anticuerpo ligeramente mayor que el fragmento en donde se conectan los dos Fab' anteriormente mencionados en la región de articulación. Este fragmento de anticuerpo se denomina F(ab')2. La "composición farmacéutica" de la presente invención comprende cualquiera de los "polipéptidos" de la presente invención definidos anteriormente; la "molécula de homodímero", el "fragmento de polipéptido", el "polipéptido de fusión" que comprende al polipéptido; la "molécula de homodímero" que comprende a los polipéptidos de fusión, el "anticuerpo", o la "porción de un anticuerpo"; y un vehículo farmacéuticamente aceptable. El "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye un excipiente, un diluyente, un expansor, un agente de descomposición, un estabilizante, un conservador, un regulador, un emulsionante, un aromático, un colorante, un edulcorante, un agente incrementador de la viscosidad, un saborizante, un agente incrementador de la solubilidad, u otros aditivos. Utilizando uno o más de estos vehículos, se puede formular una composición farmacéutica en tabletas, pildoras, polvos, granulos, inyecciones, soluciones, cápsulas, trociscos, elíxires, suspensiones, emulsiones, o jarabes. La composición farmacéutica se puede administrar oralmente o parenteralmente. Otras formas para administración parenteral incluyen una solución para aplicación externa, un supositorio para administración rectal, un pesario, prescrito por el método usual, el cual comprenda uno o más ingredientes activos. La dosificación puede variar dependiendo de la edad, el sexo, el peso, y el síntoma de un paciente, el efecto del tratamiento, la vía de administración, el período de tratamiento, o la clase de ingrediente activo (polipéptido o anticuerpo mencionados anteriormente) contenido en la composición farmacéutica. Usualmente, la composición farmacéutica se puede administrar a un adulto en una dosis de 10 microgramos a 1,000 miligramos (o de 10 microgramos a 500 miligramos) por una administración. Dependiendo de diferentes condiciones, una dosificación menor que la mencionada anteriormente puede ser suficiente en algunos casos, y en otros casos, puede ser necesaria una dosificación mayor que la mencionada anteriormente. En particular, la inyección se puede producir disolviendo o suspendiendo el anticuerpo en un vehículo no tóxico farmacéuticamente aceptable, tal como suero fisiológico o agua destilada comercialmente disponible para inyección, con ajuste de la concentración a 0.1 microgramos de anticuerpo/mililitro de vehículo a 10 miligramos de anticuerpo/mililitro de vehículo. La inyección así producida se puede administrar a un paciente humano que necesite tratamiento en una dosis de 1 microgramo a 100 miligramos/kilogramo de peso del cuerpo, de preferencia de 50 microgramos a 50 miligramos/kilogramo de peso del cuerpo, una o más veces al día. Los ejemplos de la vía de administración son las vías de administración médicamente apropiadas, tales como inyección intravenosa, inyección subcutánea, inyección intradérmica, inyección intramuscular, o inyección intraperitoneal, de preferencia inyección intravenosa. La inyección también se puede preparar en un diluyente no acuoso (por ejemplo, glicol de propileno, glicol de polietileno, aceite vegetal tal como aceite de olivo, y alcohol tal como etanol) , suspensión, o emulsión. La inyección se puede esterilizar mediante filtración con un filtro no penetrado de bacterias, mediante la mezcla de un bacteriocida, o mediante irradiación. La inyección se puede producir en la forma que se prepare al usarse. Es decir, se seca por congelación para ser una composición sólida estéril, y se puede disolver en agua destilada estéril para inyección u otro solvente antes de usarse. La composición farmacéutica de la presente invención se puede aplicar para el tratamiento o la prevención de diferentes enfermedades autoinmunes, enfermedades alérgicas, o enfermedades inflamatorias ocasionadas por la activación de linfocitos, tales como células T, y la regulación de las funciones de los linfocitos activados. Los ejemplos de las enfermedades son artritis reumatoide, esclerosis múltiple, tiroiditis autoinmune, dermatitis por contacto alérgica, dermatosis inflamatoria crónica tal como lichen planus, lupus eritematoso sistémico, diabetes melitus dependiente de insulina, y psoriasis.

El efecto terapéutico de la composición farmacéutica de la presente invención para el síntoma de diferentes enfermedades se puede probar mediante el método usual, mediante su administración a un modelo de enfermedad animal conocido. Los ejemplos del modelo incluye (1) un ratón (NZB/NZW)F1, un modelo para lupus eritematoso sistémico humano (SLE) (Science, Volumen 125, página 1225-1227 (1994)), (2) encefalomielitis alérgica experimental (EAE) , un modelo para esclerosis múltiple (MS) (J. Clin. Invest., Volumen 95, páginas 2783-2789 (1995)), (3) un ratón NOD (diabetes que no es por obesidad) , un modelo para diabetes melitus dependiente de insulina (IDDM) (J. Exp. Med., Volumen 181, páginas 1145-1155 81995) ) , (4) un modelo de nefritis de rata por inmunidad de membrana de basamento glomerular renal, modelo de nefritis de Goodpasture (Eur. J. Immunol . , Volumen 24, Número 6, páginas 1249-1254 (1994) ) , y (5) un ratón DBA/l, un modelo para artritis reumatoide humana (Eur. J. Immunol . , Volumen 26, páginas 2320-2328 (1996) ) .

Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 son micrografías que muestran el estado de acumulación de células FTL435 inducidas por "anticuerpo JTT- 1", y el estado de inhibición de la acumulación celular por el "anticuerpo JTT-2". La subfigura (a) muestra el estado de las células en ausencia de cualquier sobrenadante de hibridoma, la subfigura (b) muestra el estado de la acumulación celular inducida por "anticuerpo JTT-1", la subfigura (c) muestra el estado de la acumulación celular en la presencia del "anticuerpo anti-ICAM-1" junto con el "anticuerpo JTT-1", y la subfigura (d) muestra el estado de la acumulación celular en la presencia del "anticuerpo JTT-2" junto con el "anticuerpo JTT-1". La Figura 2 son micrografías que muestran el estado de acumulación de células FTL435 y linfoblastos activados de rata inducidos por el "anticuerpo JTT-1", y el estado de inhibición de la acumulación celular por el "anticuerpo JTT-2". La subfigura (a) muestra el estado de las células FTL435 en ausencia de anticuerpo, la subfigura (b) muestra el estado de las células FTL435 en la presencia de PMA, la subfigura (c) muestra el estado de las células FTL435 en la-presencia del "anticuerpo JTT-1", la subfigura (d) muestra el estado de las células FTL435 en la presencia del anticuerpo anti-LFA-1, junto con el "anticuerpo JTT-1", la subfigura e) muestra el estado de las células FTL435 en la presencia del anticuerpo anti-CD18 junto con el "anticuerpo JTT-1", la subfigura (f) muestra el estado de las células FTL435 en la presencia del anticuerpo anti-ICAM-1 junto con el "anticuerpo JTT-1", la subfigura (g) muestra el estado de los linfoblastos activados en ausencia de anticuerpo, la subfigura (h) muestra el estado de linfoblastos activados en la presencia de PMA, la subfigura (i) muestra el estado de los linfoblastos activados en la presencia del "anticuerpo JTT-1", la subfigura (j) muestra el estado de los linfoblastos activados en la presencia del anticuerpo anti-LFA-1, junto con el "anticuerpo JTT-1", la subfigura (k) muestra el estado de los linfoblastos activados en la presencia del anticuerpo anti-CD18 junto con el "anticuerpo JTT-1", y la subfigura (1) muestra el estado de los linfoblastos activados en la presencia del anticuerpo anti-ICAM-l junto con el "anticuerpo JTT-1". La Figura 3 muestra el estado de expresión del "antígeno JTT-1" y del "antígeno JTT-2" en diferentes células, medido con un citómetro de flujo. La Figura 4 muestra el estado de expresión del "antígeno JTT-1" en diferentes células linfocíticas, medido con un citómetro de flujo. La Figura 5 es una fotografía que muestra el electroforetograma del "antígeno JTT-1", analizado mediante SDS-PAGE. La Figura 6 son micrografías que muestran el estado de adhesión de timocitos de rata a la placa de microtitulación recubierta con el "antígeno JTT-1" purificado, en donde la adhesión se induce en la presencia del "anticuerpo JTT-1", y el estado de inhibición de la adhesión celular por el "anticuerpo JTT-2" . La subfigura (a) muestra el estado de adhesión de las células a la placa que no se ha recubierto con el "antígeno JTT-1", la subfigura (b) muestra el estado de adhesión de las células a la placa recubierta con el "antígeno JTT-1" en ausencia de anticuerpo, la subfigura (c) muestra el estado de adhesión de las células a la placa recubierta con el "antígeno JTT-1" en la presencia de los fragmentos Fab del "anticuerpo JTT-1", y la subfigura (d) muestra el estado de adhesión de las células a la placa recubierta con el "antígeno JTT-1" en la presencia del "anticuerpo JTT-2", junto con los fragmentos Fab del "anticuerpo JTT-1" . La Figura 7 muestra el número de células relativo de timocitos que se adhieren a la placa recubierta con el "antígeno JTT-1" purificado, medido en términos de intensidad de fluorescencia. "Ag(-)" muestra el número de células relativo en la placa que no se ha recubierto con el "antígeno JTT-1", "Ag(+)" muestra el número de células relativo en la placa recubierta con el "antígeno JTT-1" en ausencia de anticuerpo, "Ag(+) + JTT-1 Fab" muestra el número de células relativo en la placa recubierta con el "antígeno JTT-1", en la presencia de los fragmentos Fab del "anticuerpo JTT-1", y "Ag(+) + JTT-1 Fab + JTT-2" muestra el número de células relativo en la placa recubierta con el "antígeno JTT-1" en la presencia del "anticuerpo JTT-2", junto con los fragmentos Fab del "anticuerpo JTT-1".

La Figura 8 muestra el estado de expresión del "antígeno JTT-1 de rata" y del "antígeno JTT-2 de rata" en células COS transformadas con el ADNc que codifica el "antígeno JTT-1 de rata" con un citómetro de flujo. La Figura 9 muestra las características estructurales de la secuencia de aminoácidos del "antígeno JTT-1", revelada mediante análisis de gráfica de hidropatía. La Figura 10 muestra la homología entre las secuencias de aminoácidos de "antígeno JTT-1" de rata y ratón y el mutante del "antigeno JTT-1 de rata" . La Figura 11 muestra la homología entre las secuencias de aminoácidos y el estado de conservación de los motivos en el "antígeno JTT-1 humano", la "molécula CD28 humana", y la "molécula CTLA-4 humana". La Figura 12 muestra esquemáticamente la estructura secundaria de proteína de, y su similitud entre, el "antígeno JTT-1 humano", la "molécula CD28 humana", y la "molécula CTLA-4 humana" . La Figura 13 muestra esquemáticamente la estructura del ADN genómico que codifica el "antígeno JTT-1 de ratón" . La Figura 14 muestra la diferencia entre las secuencias de aminoácidos entre el "antígeno JTT-1 de rata", y su mutante de empalme alternativo. La Figura 15 muestra el grado del crecimiento de los linfocitos de sangre periférica humana, inducido por el anticuerpo monoclonal contra el "antígeno JTT-1 humano", en donde se midió el grado del crecimiento mediante recuperación o de [ H] timidina. La ordenada muestra la cantidad de recuperación (dpm) de [ H] timidina en las células. La Figura 16 muestra el efecto terapéutico del anticuerpo monoclonal contra el "antígeno JTT-1" sobre encefalomielitis alérgica experimental (EAE) en una rata modelo de enfermedad. La ordenada muestra el grado marcado del síntoma de enfermedad, y la abcisa muestra los días después de la inmunización para la inducción de EAE. La Figura 17 muestra el efecto terapéutico del anticuerpo monoclonal contra el "antígeno JTT-1" sobre la glomerulonefritis en una rata modelo de enfermedad. La ordenada muestra la cantidad de excreción urinaria de proteínas, y la abcisa muestra el transcurso del tiempo (semana) después de la inmunización para la inducción de glomerulonefritis . La Figura 18 muestra un histograma de columna en la purificación del polipéptido de fusión entre la región extracelular del "antígeno JTT-1 de rata" y la IgFc humana (rJTT-1-IgFc) con una columna de Sefarosa de proteína A. La Figura 19 es una fotografía que muestra el electroforetograma de rJTT-1-IgFc analizado mediante SDS-PAGE.

La Figura 20 muestra un histograma de columna en la purificación del polipéptido de fusión entre la región extracelular del "antígeno JTT-1 humano" e IgFc humana (hJTT-1-IgFc) con una columna de Sefarosa de proteína A. La Figura 21 es una fotografía que muestra el electroforetograma de hJTT-1-IgFc analizado mediante SDS-PAGE. La Figura 22 muestra esquemáticamente la estructura del vector de transferencia genética (dirección) utilizado para la preparación de un ratón transgénico, en el que se ha introducido el ADNc que codifica el "antígeno JTT-1 de rata" .

Me or Modo para Implementar la Invención Las presentes invenciones se describen con mayor detalle con referencia a los siguientes ejemplos, pero no deben interpretarse como limitadas a los mismos.

Ei emplo 1 Preparación de anticuerpos monoclonales Se prepararon hibridomas productores de anticuerpos de acuerdo con el método de Kohler y colaboradores (Omori y colaboradores, Blood, Volumen 81, páginas 101-111 (1993)), y se prepararon anticuerpos monoclonales de acuerdo con el método de Kannagi y colaboradores (Handbook of Experimental Immunology, Volumen 4, 117.21-117.21 (1986)). Primero, se administraron células FTL435 de la línea celular de timoma de rata como un antígeno inmunizante a ratones B7ALB/c en la planta del pie, en una cantidad de 10 células/ratón, a intervalos de 0 , 7, 14, y 28 días. La mezcla del antígeno con auxiliar completo de Freund se administró solamente en la primera inmunización. Dos días después de la última inmunización, se sacaron los nodos de linfa de los ratones, y se fusionaron con células de mieloma de ratón PAI (JCR Número B0113, Stocker, J.W. y colaboradores, Res. Disclosure, Volumen 217, página 155 (1982) ) , mediante el método usual, para obtener muchos hibridomas productores de • 10 anticuerpos monoclonales.

Ejemplo 2 Selección de hibridomas y caracterización de anticuerpos monoclonales Los hibridomas preparados en el Ejemplo 1 se seleccionaron mediante el análisis del efecto de los anticuerpos producidos en el sobrenadante de cultivo de los hibridomas sobre células FTL435, que se utilizaron como el inmunógeno. Se sembraron células FTL435 (5 x 10 células/mililitro, 0.1 mililitros) en cada cavidad de una placa de microtitulación de 96 cavidades, y se cultivaron a 37°C durante 1 hora en la presencia del sobrenadante de cultivo de cada hibridoma (10 microgramos/mililitro cada uno) . Los resultados obtenidos para los clones de hibridoma "JTT-1 y JTT- 2" se muestran en la Figura 1 y en la Figura 2. 25 Se reveló que un anticuerpo monoclonal producido por el clon de hibridoma "JTT-1" ("anticuerpo JTT-1") aglutinaba fuertemente las células FTL435 (Figura 1 (b) y Figura 2 (c) ) , y que adición del "anticuerpo JTT-2" inhibía fuertemente la acumulación de células FTL435 inducida por* el estímulo del "anticuerpo JTT-1" (Figura 1 (d) ) . Los ensayos, en donde no se agregó sobrenadante de hibridoma, se utilizaron como controles (Figura 1 (a) y Figura 2 (a) ) . Con el objeto de determinar si la acumulación de las FTL435 inducida por el estímulo del "anticuerpo JTT-1" era ocasionada por la adhesión celular entre la molécula de adhesión intercelular-1 (ICAM-1) y el antígeno asociado con la función de linfocitos-1 (LFA-1) , que es una trayectoria conocida representativa de adhesión celular, las células FTL435 se cultivaron a 37°C durante 1 hora en la presencia de anticuerpo anti-ICAM-1 de rata 1A29 (10 microgramos/mililitro; IgGl) , o anticuerpo anti-LFA-1 de rata (10 microgramos/mililitro; IgG2a) , junto con el "anticuerpo JTT-1". La acumulación de células FTL435 mediante el estímulo del "anticuerpo JTT-1" no fue inhibida por el anticuerpo anti-ICAM-1 ni por el anticuerpo anti-LFA-1 (anticuerpo anti-ICAM-1, Figura 1 (c) y Figura 2 (f) ,- anticuerpo anti-LFA-1, Figura 2 (d)) . Con el objeto de analizar adicionalmente la capacidad de aglutinación celular del "anticuerpo JTT-1", se analizó la capacidad para aglutinar células de linfoblasto de rata activadas con estímulo de concanavalina A de la misma manera que se mencionó anteriormente. Los resultados se muestran en la Figura 2. De una manera similar al efecto sobre las células FTL435, se indujo la acumulación de células de linfoblasto activadas mediante el estímulo del "anticuerpo JTT-1" (Figura 2 (i) ) . La acumulación de células de linfoblasto activadas mediante el estímulo del "anticuerpo JTT-1" fue en su mayor parte inhibida por el anticuerpo anti-LFA-1 (Figura 2 (j) , y el anticuerpo anti-ICAM-1 (Figura 2 (1) ) . (Sin embargo, se presentó una acumulación parcial) . Como se entiende a partir del ensayo de control (Figura 2 (g) ) , en donde no se agregó anticuerpo, los linfocitos activados, tales como linfoblastos activados, no mostraron acumulación a través de adhesión celular, a menos que recibieran el estímulo como acetato de miristato de forbol (PMA, que activa LFA-1) (Figura 2 (h) ) , o "anticuerpo JTT-1" (Figura 2 (i) ) . Por consiguiente, el hecho de que el anticuerpo anti-LFA-1 inhibiera parcialmente la acumulación celular mediante el estímulo del "anticuerpo JTT-1", indica que el LFA-1 en las células de linfoblasto activadas se activó mediante el estímulo del "anticuerpo JTT-1" . Esto también indica que las moléculas reconocidas por el "anticuerpo JTT-1" están involucradas en alguna transmisión de señal. Los clones de hibridoma "JTT-1" y "JTT-2" se han depositado de acuerdo con el Tratado de Budapest, con la autoridad depositarla internacional, el National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japón (1-1-3, Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japón), desde el 11 de octubre de 1996, con los números de acceso internacionales FERM BP-5707 y FERM BP-5708, respectivamente. El análisis utilizando el estuche de identificación de isotipo de anticuerpo monoclonal de ratón (Amersham) , determinó que el isotipo de los anticuerpos monoclonales producidos a partir de cada hibridoma (anticuerpo JTT-1 y anticuerpo JTT-2) era en ambos IgGl .

Ejemplo 3 Reactividad del "anticuerpo JTT-1" y del "anticuerpo JTT-2" a diferentes células Con el objeto de analizar el patrón de expresión de las moléculas reconocidas por el "anticuerpo JTT-1" y el "anticuerpo JTT-2" en diferentes células, se examinaron las reactividades de los anticuerpos a las diferentes células. Las moléculas reconocidas por el "anticuerpo JTT-1" o por "anticuerpo JTT-2" se designan como "antígeno JTT-1" o "antígeno JTT-2", respectivamente. Una rata Wistar de 5 a 10 semanas de edad (de 150 a 250 gramos) se sacrificó mediante anestesia con éter dietílico. Se sacaron el timo y el bazo de su pecho y abdomen, respectivamente, mediante celiotomía, y se homogeneizaron para preparar la suspensión celular. Las células de bazo resultantes se cultivaron en un medio RPM1640 conteniendo 2 microgramos/mililitro de concanavalina A, y FCS al 10 por ciento a 37°C durante 3 días, para preparar los linfoblastos activados . Las células FTL435, los timocitos, las células del bazo, y los linfoblastos activados (5 x 105 células cada uno) , se hicieron reaccionar con el "anticuerpo JTT-1" o con el "anticuerpo JTT-2", y luego con la IgG anti-ratón marcada con FITC (Cappel) . Se midió la intensidad de fluorescencia de las células teñidas con el citómetro de flujo EPICS-Elite. Los resultados se muestran en la Figura 3. En las células FTL435, se observó una fuerte expresión de cada uno del "antígeno JTT-1" y el "antígeno JTT-2". Aunque los antígenos se expresaron en los timocitos, se expresaron solamente un poco en las células del bazo. Sin embargo, en los linfoblastos activados obtenidos mediante el estímulo de células de bazo con canavalina A, el "antígeno JTT-1" y el "antígeno JTT-2" se expresaron fuertemente. En adición, en cada clase de células, el patrón de expresión del "antígeno JTT-1" y del "antígeno JTT-2" coincidió uno con el otro. Estos resultados indican que el "antígeno JTT-1" y el "antígeno JTT-2" son moléculas iguales .

Ejemplo 4 Reactividad del "anticuerpo JTT-1" a diferentes células linfocíticas Con el objeto de analizar el patrón de expresión de las moléculas ("antígeno JTT-1") reconocidas por el "anticuerpo JTT-1" en diferentes células linfocíticas, se analizó la reactividad del "anticuerpo JTT-1" a los nodos de linfa, los linfoblastos T derivados del bazo, y los linfoblastos B derivados del bazo de dos clases de ratas (rata Wistar y rata F344) . Una rata Wistar y una rata F344 de 5 a 10 semanas de edad (de 150 a 250 gramos) , se sacrificaron mediante anestesia con éter dietílico. Los nodos de linfa y el bazo se sacaron de cada rata mediante celiotomía, y se homogeneizaron para preparar la suspensión celular. La suspensión celular resultante del bazo se cultivó en un medio RPMI1640 conteniendo 2 microgramos/mililitro de concanavalina A (ConA) y FCS al 10 por ciento a 37°C durante 3 días. Se obtuvieron linfoblastos T activados y linfoblastos B activados de cada rata después de 1 día y de 3 días de cultivo. En adición, se utilizaron como controles los linfoblastos T y los linfoblastos B derivados del bazo obtenidos antes de que se agregaran las células de los nodos de linfa y ConA. Cada una de las células (5 x 10 células cada uno) se hizo reaccionar con anticuerpo anti-células T de rata marcado con biotina, o anticuerpo anti-células B de rata marcado con biotina (10 microgramos/mililitro, Seikagaku Corporation) , y subsecuentemente con estreptavidina marcada con ficoeritrina. Luego las células se hicieron reaccionar con 10 microgramos/mililitro de "anticuerpo JTT-1" marcado con FITC-La intensidad de fluorescencia de las células teñidas se midió con el citómetro de flujo EPICS-Elite. Los resultados se muestran en la Figura 4. Tanto en los linfoblastos T activados como en los linfoblastos B activados a partir de rata Wistar y de rata F344, se observó una fuerte expresión del "antígeno JTT-1" desde el día 1 de la activación con el estímulo de ConA. En adición, el patrón de expresión del "antígeno JTT-1" en cada clase de células coincidió casi perfectamente uno con el otro.

Ej emplo 5 Caracterización del "antígeno JTT-1" y del "antígeno JTT-2" mediante inmunoprecipitación El "antígeno JTT-1" y el "antígeno JTT-2" se caracterizaron mediante inmunoprecipitación utilizando células FTL435. (1) Preparación de moléculas de superficie celular solubles biotiniladas . Las células FTL435 se lavaron con PBS, se suspendieron en suero fisiológico que contenía 100 microgramos/mililitro de NHS-biotina, y HEPES 0.1M (pH de 8.0) para ajustar a 1 x 10 células/mililitro, y se incubaron a la temperatura ambiente durante 40 minutos. Las células se lavaron tres veces con PBS, se agregó regulador de lisis (NP40 al 1 por ciento, Tris-HCl 10 mM (pH de 7.4), NaCl 0.15M) , para ajustar a 5 x 10 células/mililitro, y la mezcla se dejó reaccionar a 4°C durante 30 minutos para lisar las células. El lisado celular obtenido se centrifugó, y el sobrenadante que comprendía las moléculas de superficie celular solubles biotiniladas, se almacenó a -80°C. (2) Inmunoprecipitación y análisis de SDS-PAGE La muestra purificada del "anticuerpo JTT-1" purificada mediante el método usual a partir del sobrenadante de cultivo del clon de hibridoma "JTT-1" preparado en el Ejemplo 1, se mezcló con granulos de Sefarosa de proteína G para ajustar a 2 miligramos/mililitro, y se dejó reaccionar a 4°C durante 1 hora para enlazar el anticuerpo con los granulos. Después de que se lavaron los granulos, se agregaron 500 microlitros del lisado celular FTL435 biotinilado a 10 microlitros de los granulos, y la mezcla se dejó reaccionar a 4°C durante 2 horas. Después de que se lavaron los granulos con regulador de lisis tres veces, se agregaron 50 microlitros de regulador de glicanasa (regulador de fosfato de sodio (pH de 7.0) conteniendo SDS al 0.15 por ciento) a los granulos, y la mezcla se hirvió para eluir las moléculas enlazadas atrapadas por los granulos enlazados con anticuerpo. Se agregaron NP40 al 1.25 por ciento y 20 unidades/mililitro de N-glicanasa a una fracción de la muestra así eluida, y la mezcla se dejó reaccionar durante la noche para digerir las cadenas de azúcar N-enlazadas . Se agregó un volumen igual de regulador de muestra (Enprotech) para SDS-PAGE a 5 microlitros de la muestra eluida en la presencia o en ausencia de 2-mercaptoetanol, y se hirvió la mezcla. Después de la electroforesis, el gel se transfirió a una membrana PVDF. La membrana se bloqueó con BSA-PBS al 3 por ciento, y se hizo reaccionar con estreptavidina marcada con peroxidasa, para detectar las moléculas de superficie celular solubles biotiniladas atrapadas por el "anticuerpo JTT-1", con el sistema ECL (Amersham), como se describe en el manual. Los resultados se muestran en la Figura 5. La molécula reconocida por el "anticuerpo JTT-1" ("antígeno JTT-1") sobre las células FTL435, mostró el peso molecular de aproximadamente 47 kD bajo las condiciones no reducidas ("(-)" en la Figura 5) , y de aproximadamente 24 kD y 28 kD bajo las condiciones reducidas (" (+) " en la Figura 5) . Como resultado de la digestión de las cadenas de azúcar N-enlazadas ("+N-gly" en la Figura 5) , el "antígeno JTT-1" se convergió sobre una sola banda de aproximadamente 36 kD bajo las condiciones no reducidas, y de aproximadamente 20 kD bajo las condiciones reducidas. Estos resultados sugieren que el "antígeno JTT-1" forma un dímero en donde las mismas proteínas del núcleo tienen diferentes cadenas de azúcar. Se obtuvieron completamente los mismos resultados en el experimento realizado como se mencionó anteriormente, utilizando el "anticuerpo JTT-2". Considerando estos resultados, junto con los resultados del Ejemplo 3 y del Ejemplo 7 más adelante, se ha pensado que el "antígeno JTT-1" (molécula reconocida por el "anticuerpo JTT-1") y el "antígeno JTT-2" (molécula reconocida por el "anticuerpo JTT-2") son idénticos uno al otro.

Ej emplo 6 Experimento de adhesión de timocitos de rata al "antígeno JTT-1" purificado, y análisis de aminoácidos N-terminal Los siguientes experimentos se realizaron para analizar si la molécula que reconoce el "anticuerpo JTT-1" ("antígeno JTT-1") funciona como una molécula de adhesión. También se realizó el análisis de aminoácidos N-terminal. (1) Preparación de la columna de afinidad del "anticuerpo JTT-1"" La muestra purificada (2 miligramos en 2 mililitros) del "anticuerpo JTT-1", purificada, mediante el método usual a partir del sobrenadante de cultivo del clon de hibridoma "JTT-1", preparado en el Ejemplo 1, se mezcló con 1 mililitro de resina de Sefarosa de proteína G, y la mezcla se dejó reaccionar a 4°C durante 1 hora. La resina se lavó tres veces con amina trietanólica 200 mM (pH de 8.2) . Luego la resina se incubó en amina trietanólica (pH de 8.2) conteniendo pimelimidato de dimetilo 10 mM (DMP) a la temperatura ambiente durante 1 hora, para enlazar de una manera covalente el "anticuerpo JTT-1" a la resina. (2) Purificación del "antígeno JTT-1" Las células FTL435 se cultivaron en un medio RPMI1640 conteniendo FCS al 10 por ciento. Las células se cosecharon mediante centrifugación para obtener un granulo, y se lavaron con PBS tres veces. Se agregó un regulador de lisis (NP40 al 1 por ciento, Tris-HCl 10 mM (pH de 7.4), NaCl 0.15 M) al granulo lavado, para ajustar a 5 x 10 células/mililitro, y la mezcla se dejó reaccionar a 4°C durante 30 minutos para lisar las células. El lisado celular obtenido se centrifugó, y el sobrenadante que contenía las moléculas de superficie celular solubles se almacenó a -80 °C. El lisado (400 mililitros) se cargó en una columna de afinidad de I"anticuerpo JTT-1" . Después de que se lavó la columna con 50 mililitros de regulador de lisis y 20 mililitros de PBS, se eluyó el "antígeno JTT-1" con regulador de glicina 0.2 M (pH de 2.8) . Se agregó regulador Tris 1M al "antígeno JTT-1" así eluido para la neutralización. El "antígeno JTT-1" obtenido se almacenó a -80°C. (3) Determinación de la secuencia de aminoácidos N-terminal Después de que el "antígeno JTT-1" purificado se sometió a SDS-PAGE, se determinó la secuencia de aminoácidos N-terminal mediante el método usual. El resultado reveló que el "antígeno JTT-1" contenía una secuencia de aminoácidos Glu-Leu-Asn-Asp-Leu-Ala-Asn-His-Arg. (4) Experimento de adhesión Una rata Wistar de 5 a 10 semanas de edad (de 150 a 250 gramos) se sacrificó mediante anestesia con éter dietílico. Se sacó el timo de su pecho mediante celiotomía, y se homogeneizó para preparar la suspensión de timocitos. Se agregaron lOµM de éster tetra-acetoximetílico de 2 ',7'-bis (carboxietil) carboxifluoresceína (BCECF-AM; Molecular Probes) a la suspensión, y la mezcla se incubó a 37°C durante 30 minutos para marcar de una manera fluorescente los timocitos. Las células se lavaron con PBS, y se suspendieron en un medio RPMI1640 conteniendo FCS al 10 por ciento para ajustar a 2 x 107 células/mililitro. El "antígeno JTT-1" purificado obtenido en (2) se recubrió sobre una placa ELISA de 96 cavidades en una concentración de 10 microlitros/cavidad durante la noche. Después de que se lavó la placa con PBS, se agregaron 200 microlitros/cavidad de PBS conteniendo BSA al 3 por ciento a la placa, y se realizó el bloqueo durante 2 horas. Después de que se lavó la placa con PBSA, (1) solamente los timocitos marcados con fluorescencia (2 x 10 células/mililitro, 0.1 mililitros), (2) los timocitos marcados con fluorescencia (la misma concentración) y los fragmentos Fab de "anticuerpo JTT-1" preparados mediante el método usual (5 microgramos/mililitro) , ó (3) los timocitos marcados con fluorescencia (la misma concentración) , los fragmentos Fab del "anticuerpo JTT-1" (la misma concentración), y el "anticuerpo JTT-2" (10 microgramos/mililitro) , se agregaron a cada cavidad, y se cultivaron a 37°C durante 1 hora. Con el objeto de remover las células no enlazadas, cada cavidad se lavó una vez con medio RPMI1640 conteniendo FCS al 10 por ciento. Cada cavidad se observó con un microscopio de luz. Luego, se agregaron 100 microlitros de NP40 al 0.1 por ciento a cada cavidad, y se lisaron las células adheridas a la placa. El número de células relativo de timocitos marcados con fluorescencia adheridos a cada cavidad se contó midiendo la intensidad de fluorescencia a 538 nanómetros (excitada a 485 nanómetros) con el Fluorómetro de Microplaca Fluoroscan II (Flow Laboratories) . El ensayo en el que no se recubrió una placa con el "antígeno JTT-1" purificado, se utilizó como un control. Los resultados de la observación en el microscopio de luz se muestran en la Figura 6. Los timocitos se adhirieron de una manera significativa al "antígeno JTT-1" purificado solamente en la presencia de los fragmentos Fab del "anticuerpo JTT-1" (Figura 6 (c) ) . La adhesión fue significativamente inhibida por el "anticuerpo JTT-2" (Figura 6 (d) ) . La Figura 7 muestra el número de células relativo de timocitos adheridos al "antígeno JTT-1" recubierto sobre cada cavidad en términos de intensidad fluorescente. A partir de estos resultados, se reveló que el "antígeno JTT-1" funciona como una molécula de adhesión.

Ejemplo 7 Clonación del ADNc que codifica el "antígeno JTT-1" de rata 1. Preparación de la biblioteca del ADNc 1- (1) Extracción de ARN poli (A) + a partir de linfoblastos de rata estimulados con ConA. Los linfoblastos estimulados con ConA (blasto ConA) derivados de bazo de rata (aproximadamente 1 x 106 células/mililitro) se centrifugaron (2000 x g) a 4°C durante 5 minutos. Las células precipitadas se suspendieron con ISOGEN (Nippon Gene) , y se extrajeron con cloroformo, con agitación para recolectar el sobrenadante . Después de que se agregó isopropanol al sobrenadante obtenido, la mezcla se dejó reposar a la temperatura ambiente durante 10 minutos, y se centrifugó a 12,000 x g a 4°C durante 10 minutos para precipitar el ARN. El ARN precipitado se lavó con etanol y se disolvió en regulador TE. El ARN Poli (A) + se purificó a partir del ARN total así obtenido, con el "Estuche de Purificación de ARNm" (Pharmacia) . 1- (2) Preparación del ADNc Con 5 microgramos del ARN poli (A) + preparado anteriormente como plantilla, se sintetizó el ADNc con el "Estuche de Síntesis de ADNc Ahorrador de Tiempo" (Pharmacia) . Se utilizó el "cebador oligo dT" (Pharmacia) que tiene el sitio Notl, para incrementar la eficiencia de la selección. Se agregó el adaptador EcoRI, y se realizó la digestión con Notl para obtener el ADNc con unidireccionalidad. Luego se realizó el fraccionamiento por tamaños con la Columna Spun (Pharmacia) . 1- (3) Inserción en un vector El ADNc obtenido, que tiene los extremos EcoRI y Notl, se ligó con pME18S (Hará, T. y Miyajima, A., EMBO J., Volumen 11, páginas 1875-1884 (1992) ) digerido con EcoRI y Notl. Se utilizó el "Estuche de Ligamiento de ADN" (Takara Shuzo) para el ligamiento. Las células DH5 de E. coli (Toyobo) se transformaron con el producto de reacción así obtenido. Los transformantes se cultivaron hasta que el valor OD (a 600 nanómetros) llegó a 0.6, y se cosechó para recuperar los ADNs del plásmido con una biblioteca. Se utilizó la Punta QUIAGEN (QUIAGEN) para la purificación de los ADNs del plásmido. 2. Selección de la biblioteca de ADNc La selección se realizó de acuerdo con el método panorámico (Seed, B. y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, Volumen 84, páginas 3365-3369 (1987)). 2- (1) Transferencia del gen hacia las células COS La biblioteca así obtenida se introdujo en células COS 7 mediante electroporación (Potter, H. y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, Volumen 85, páginas 2288-2292) . Los transformantes se cultivaron durante 60 horas después de la introducción, se removió el sobrenadante, y el granulo se lavó con PBS tres veces . Después de que se trató el granulo con PBS (conteniendo EDTA 0.5 mM) a 37°C durante 30 minutos, las células se removieron pasándolas por pipeta. Luego se recolectaron solamente las células vivas con "Lymphprep" (NYCOMED) . 2- (2) Concentración de las células que expresan el gen mediante panorama. Las células vivas obtenidas anteriormente, se suspendieron en PBS (conteniendo FCS al 5 por ciento y EDTA 0.5 mM) . La suspensión celular se transfirió a un plato de cultivo recubierto con el "anticuerpo JTT-1", y se incubó a la temperatura ambiente durante 3 horas . Después se removieron las células que no se enlazaron al plato de cultivo, y el plato de cultivo se lavó con PBS tres veces, se recolectaron los ADNs del plásmido a partir de las células que se enlazaron al plato de cultivo mediante el método de Hirt (Hirt, B., J. Mol. Biol., Volumen 26, páginas 365-369) . Se transformó DH10B de E. coli (GIBCO BRL) con el ADN del plásmido así obtenido. Los ADNs del plásmido se amplificaron y se purificaron con los transformantes como en l-(3) mencionado anteriormente. Luego se repitieron dos veces los procedimientos descritos en (1) y 2) . 2- (3) Aislamiento del clon positivo Después de la tercera panorámica, las células DH10B de E. coli transformadas se cultivaron durante la noche sobre placas de LB conteniendo ampicilina para obtener colonias. Se cultivaron 20 colonias resistentes al fármaco, se recolectaron los ADNs del plásmido mediante el método miniprep alcalino (Maniatis, T. y colaboradores, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York) , y se analizó el ADN del inserto. La electroforesis en gel de agarosa reveló que se concentró el clon que tenía el ADNc de aproximadamente 0.9 kb (designado como "T132A7"). El "T132A7" se expresó transitoriamente en células COS7 nuevamente con el método descrito en (1) . Después las células con el "1T132A7" introducido se hicieron reaccionar con el "anticuerpo JTT-1" o con el "anticuerpo JTT-2", y luego con la IgG anti-ratón marcada con FITC (Cappel) , se midió la intensidad de fluorescencia de las células teñidas con el fitómetro de flujo EPICS-Elite (Coulter) . El "anticuerpo JTT-1" y el "anticuerpo JTT-2" reconocieron fuertemente al producto del gen "T132A7". Los resultados se muestran en la Figura 8. 3. Determinación de la secuencia de nucleótidos y de la secuencia de aminoácidos . La secuencia de nucleótidos del clon "T132A7" se determinó mediante el método de didesoxi con el "Estuche de Secuenciamiento de Auto-lectura" (Pharmacia) y el "secuenciador de ADN A.L.F." (Pharmacia) . En adición, se analizó la secuencia de aminoácidos deducida del "antígeno JTT-1 de rata" codificado por la secuencia de nucleótidos, con el software de análisis genético "GENEWORKS" (IntelliGenetics) . La secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida se muestran en la SEQ ID N0:4. La secuencia de aminoácidos (compuesta de 200 residuos de aminoácidos) deducida del gen clonado comprende la misma secuencia de aminoácidos que la secuencia de aminoácidos N-terminal determinada en el Ejemplo 6- (3) . Considerando que las células con el clon "T132A7" introducido reaccionan fuertemente con el "anticuerpo JTT-1", se puede concluir que el clon "T132A7" comprende el ADNc que codifica el "antígeno JTT-1 de rata" . . Análisis por computadora El análisis de hidropatía de la estructura primaria de la secuencia de aminoácidos deducida del ""antígeno JTT-1" se realizó de acuerdo con el método de Kite y Doolittle (Kite, J. y Doolittle, R.F., J. Mol. Biol. Volumen 157, páginas 105-132 (1982)) (Figura 9). Los resultados revelaron que el "antígeno JTT-1" es una proteína transmembrana que tiene una secuencia de señal en el término N. En adición, los resultados del análisis del motivo revelaron que el "antígeno JTT-1" tiene dos sitios de enlace de cadena de azúcar enlazados con Asn en el dominio extracelular, y dos sitios de fosforilación de quinasa de caseína y un sitio de fosforilación de quinasa C de proteína en el dominio citoplásmico. En la Figura 9, "CHO" significa el sitio de enlace de la cadena de azúcar N-enlazada; "P", el sitio de fosforilación; "CKII", la quinasa de caseína II; y "PKC", la quinasa C de proteína.

Ej emplo 8 Clonación del ADNc gue codifica el "antígeno JTT-1 humano" 1. Preparación de una sonda. Se generó el ADNc (de aproximadamente 0.9 kb) que codifica el "antígeno JTT-1 de rata", digiriendo el clon "T132A7" obtenido en el Ejemplo 7, con las enzimas de restricción EcoRI y Notl, y se separó mediante electroforesis en gel de agarosa. Los fragmentos de ADN separados se purificaron con el "estuche de extracción de gel QUIAEX" (QUIAGEN) , y los fragmentos de ADN obtenidos se marcaron con P, utilizando el "estuche de marcado de ADN listo para salir" (Pharmacia) . Estos fragmentos de ADN marcados se utilizaron como sondas para la hibridación de placas . 2. Preparación de la biblioteca del ADNc 2-(l) Extracción del ARN poli (A) + El ARN poli (A) + se extrajo de los linfoblastos estimulados con ConA (blasto ConA) derivados a partir de sangre periférica humana, de la misma manera que en el Ejemplo 7-1- (1) - 2- (2) Preparación del ADNc Con 5 microgramos del ARN poli (A) + así preparado como plantilla, se sintetizaron los ADNcs con el "cebador oligo dT" (Pharmacia) , y el "Estuche de Síntesis de ADNc Ahorrador de Tiempo" (Pharmacia) . Luego se agregó el adaptador EcoRI, y se realizó el fraccionamiento por tamaños con la Columna Spun (Pharmacia) . 2- (3) Inserción en un vector y empaque Los ADNcs así obtenidos, que tienen los extremos EcoRI, se ligaron con el vector "?ZAPII" (Stratagene) digerido con EcoRI . Se utilizó el "Estuche de Ligamiento de ADN" (Takara Shuzo) para el ligamiento. Después de que se realizó el empaque in vi tro del ADN ligado con "GIGA PACK II GOLD" (Stratagene), las células XLIBlue MRF' de E. coli (Stratagene) se transfectaron con la partícula del fago obtenido para generar una biblioteca de ADNc compuesta de placa que comprendía el fago recombinante . 3. Selección de la biblioteca de ADNc. La biblioteca de ADNc se selecciona mediante el método de hibridación de placas (Maniatis, T. y colaboradores, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York) , con el "regulador de hibridación Rapid" (Amersham) . Primero, la biblioteca de ADNc así obtenida (1 x 10 ) se recubrió sobre placas de ágar, y se produjo la réplica con la "membrana de nylon Hybond-N" (Amersham) . La hibridación de placas se realizó en el "regulador de hibridación Rapid" (Amersham) utilizando la réplica y la sonda marcada con P preparada en el Ejemplo 8-1. Se realizaron primera y segunda selecciones para obtener ocho clones positivos. Se aislaron placas sencillas de cada clon, y se sometieron a separación en vivo de acuerdo con el manual (Stratagene) , y se recolectaron siete clones positivos como el ADN del plásmido. . Determinación de la secuencia de nucleótidos Las secuencias de nucleótidos de los siete clones se determinaron mediante el método de didesoxi con el "Estuche de Secuenciamiento de Auto-lectura" (Pharmacia) , y el "secuenciador de ADN A.L.F." (Pharmacia) . Los siete clones comprenden la misma secuencia de nucleótidos. Se encontró que el clon "pBSh41" codifica el "antígeno JTT-1 humano" de longitud completa. La secuencia de ADNc correspondiente al marco de lectura abierta (ORF) del "antígeno JTT-1 humano" se muestra en la SEQ ID NO:l, la longitud completa de la secuencia de aminoácidos deducida del "antígeno JTT-1 humano" se muestra en la SEQ ID NO: 2, y la secuencia de nucleótidos que comprende las secuencias 5' y 3' se muestra en la SEQ ID NO : 3 (el marco de lectura abierta corresponde a los residuos de nucleótidos 26 a 525) . Se entiende que la secuencia de nucleótidos contenida en el clon codifica la longitud completa del "antígeno JTT-1 humano", debido a que la secuencia de aminoácidos (compuesta de 199 residuos de aminoácidos) deducida de la secuencia de nucleótidos muestra una homología significativa con la secuencia de aminoácidos del "antígeno JTT-1 de rata" (Figura 10) . Como se muestra en la Figura 10, la homología entre las secuencias de aminoácidos del "antígeno JTT-1" humano y de rata es del 60 por ciento o más. El DH10B de E. coli (GIBCO BRL) transformado con el clon "pBSh41" se ha depositado de acuerdo con el Tratado de Budapest, con la autoridad depositaría internacional, el National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japón (1-1-3, Higashi, Tsukuda-shi, Ibaraki, Japón) desde el 25 de octubre de 1996 (depósito internacional con el número de acceso FERM BP-5725) . 5. Características estructurales y función biológica del "antígeno JTT-1" Los resultados de la búsqueda de motivos para la secuencia de aminoácidos deducida del "antígeno JTT-1 humano" en proteínas humanas conocidas, revelaron que el "antígeno JTT-1 humano" tiene similitud estructural con las proteínas de membrana celular derivadas de ser humano "CD28" y "CTLA-4" pertenecientes a la superfamilia de inmunoglobulina, mencionada con detalle anteriormente (Figuras 11 y 12) . Como se mencionó anteriormente, "CD28" y "CTLA-4" son moléculas extremadamente importantes que regulan la activación y la inhibición de las células T en el sistema inmune.

La similitud estructural es como sigue. 1. Se conservan altamente 20 o más residuos de aminoácidos, incluyendo los residuos de cisteína. 2. Se conserva la secuencia de repetición de prolina, "Pro-Pro-Pro (PPP)", que es esencial como la región de enlace de ligando en CD28 y CTLA-4. 3. Se conserva la secuencia "Tyr-Xaa-Xaa-Met (YxxM) " (Xaa y x representan cualquier aminoácido) como la región de transmisión de señal en CD28 y CTLA-4, en la región citoplásmica. A partir del hecho de que la misma estructura con la estructura específica de "CD28" y "CTLA-4", que tienen un papel importante en la regulación de la activación de las células T, son un actor principal en el mecanismo inmune, se infiere que el "antígeno JTT-1" de la presente invención tiene un papel importante igual que esas moléculas en la regulación de la activación de los linfocitos, tales como las células T, que son un actor principal en la respuesta inmune.

Ej emplo 9 Clonación del ADNc que codifica el "antígeno JTT-1 de ratón" . 1. Preparación de una sonda. El ADNc (de aproximadamente 0.9 kb) que codifica el "antígeno JTT-1 de rata" se obtuvo digiriendo el clon "T132A7", clonado en el Ejemplo 7, con las enzimas de restricción EcoRI y Notl, y se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa. Los fragmentos de ADN así separados se purificaron con el "estuche de extracción de gel QUIAEX" (QUIAGEN) , y los fragmentos de ADN se marcaron con P utilizando el "estuche de marcado con ADN listo para salir" (Pharmacia) . Estos fragmentos de ADN marcados se utilizaron como sonda para la hibridación de placas . 2. Preparación de la biblioteca del ADNc. 2- (1) Extracción del ARN poli (A) + Como en el Ejemplo 7-1- (1) , los ARNs de poli (A) + se extrajeron a partir de linfoblastos estimulados con ConA derivados de bazo de rató *n (aproximadamente 1 x 106s células/mililitro) . 2- (2) Preparación de la biblioteca de ADNc. Con 5 miligramos de los ARNs poli (A) + preparados anteriormente como plantilla, se sintetizaron los ADNcs con el cebador oligo dT (Pharmacia) , y el "Estuche de Síntesis de ADNc Ahorrador de Tiempo" (Pharmacia) . Después de que se agregó el adaptador EcoRI al ADNc, se realizó el fraccionamiento por tamaños con la Columna Spun (Pharmacia) . 2- (3) Inserción del ADNc en un vector, y empaque. El ADNc así obtenido, que tenía los extremos EcoRI, se ligó con el vector 1ZAPII (Stratagene) digerido con EcoRI .

Se utilizó el "Estuche de Ligamiento de ADN" (Takara Shuzo) para el ligamiento. Después se realizó el empaque in vi tro del ADN ligado con GIGA PACK II GOLD (Stratagene) , las células XLIBlue MRF' de E. coli (Stratagene) se transfectaron con la partícula del fago así obtenido, para generar una biblioteca de ADNc compuesta de placa que comprendía el fago recombinante . 3. Selección de la biblioteca del ADNc. La selección se realizó mediante el método de hibridación de placas (Maniatis, T. y colaboradores, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York) , utilizando el regulador de hibridación Rapid (Amersham) . La biblioteca de ADNc anteriormente obtenida (1 x ) se recubrió sobre placas de ágar, y se produjo la réplica utilizando la membrana de nylon Hybond-N (Amersham) . La hibridación de placa se realizó en el regulador de hibridación Rapid (Amersham) , utilizando la réplica y la sonda marcada con P preparada en el Ejemplo 9-1. Se realizaron primera y segunda selecciones para obtener cinco clones positivos. « Después de que se aisló la placa sencilla de cada clon, se realizó la separación en vivo de acuerdo con el Manual de Instrucciones (Stratagene) , y se recolectaron cinco clones positivos como el ADN del plásmido. 4. Determinación de la secuencia de nucleótidos. Las secuencias de nucleótidos de cada uno de los cinco clones se determinaron mediante el método de didesoxi con el "Estuche de Secuenciamiento de Auto-lectura" (Pharmacia) y el "secuenciador de ADN A.L.F." (Pharmacia) . Los cuatro de los cinco clones comprenden la misma secuencia de nucleótidos . La secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica la longitud completa del "antígeno JTT-1 de ratón", y la secuencia de aminoácidos deducida, se muestran en la SEQ ID NO: 5. Como se entiende a partir de la Figura 10, el "antígeno JTT-1 de ratón" está compuesto de 200 residuos de aminoácidos, como el "antígeno JTT-1 de rata". La homología entre las secuencias de aminoácidos de los "antígeno JTT-1" de ratón, de rata, y humano, es significativa (60 por ciento o más) . 5. Análisis del lugar del gen del "antígeno JTT-1 de ratón" . El lugar del gen que codifica el "antígeno JTT-1 de ratón" se analizó mediante el método de hibridación en el sitio con fluorescencia. El ADNc así obtenido, que codifica el "antígeno JTT-1 de ratón", se marcó con P para preparar las sondas de hibridación mediante el método usual. Utilizando estas sondas, se seleccionó la biblioteca de ADN genómica de ratón 129 SVJ (Stratagene) , con el fin de obtener los clones de ADN genómico de ratón que comprendían los exones que codificaban el "antígeno JTT-1 de ratón" . La estructura del ADN genómico se muestra esquemáticamente en la Figura 13. Los clones del ADN genómico anteriormente obtenidos, se marcaron con digoxigenina dUTP mediante traducción nick para preparar sondas . Las sondas marcadas se enlazaron con el ADN de ratón disociado, y se hibridaron con los cromosomas de metafase normales derivados a partir de fibroblastos embriónicos de ratón, en la solución que contenía el 50 por ciento de formaldehído, el 10 por ciento de sulfato de dextrano, y 2 x SSC. Después de que se incubó un portaobjetos para la hibridación en anticuerpo anti-digoxigenina marcado con fluorescencia, se detectó la señal de hibridación específica mediante teñido con DAPI . En la primera prueba, se pensó que la parte cerca del cromosoma más grande era el cromosoma 1, juzgando, a partir del tamaño del ADN y de la banda que surgió, que estaba marcado específicamente. Basándose en esta información, el clon del ADN genómico anteriormente descrito se co-hibridó con sondas específicas para la región del centrómero del cromosoma 1. Como resultado, se marcó específicamente la región del centrómero del cromosoma 1 y las regiones cerca de ella. Se analizaron 10 muestras del cromosoma 1 que mostraba hibridación específica, y se reveló que el clon del ADN genómico anteriormente mencionado estaba localizado en la posición del 33 por ciento de la distancia desde el límite entre la heterocromatina y la eucromatina para el telómero del cromosoma 1, es decir, sobre la misma banda "1C3" que el lugar de los genes "CD28" y "CTLA-4" de ratón. Como el resultado de que se analizaron 80 células en metafase, se identificó un marcado específico en esa posición para 79 células. Estos resultados, y los resultados obtenidos en el Ejemplo 8, que indican la similitud estructural del "antígeno JTT-1" con "CD28" y "CTLA-4", sugieren que el "antígeno JTT-1", como el "CD28" y el "CTLA-4", es una molécula importante involucrada en la regulación de la transmisión de la señal coestimulante y/o la activación de los linfocitos.

Ejemplo 10 Clonación del ADNc que codifica un mutante del "antígeno JTT-1 de rata". Otro ADNc que se piensa que codifica la variante de empalme alternativa del "antígeno JTT-1 de rata" clonada en el Ejemplo 7, se clonó como sigue. 1. Preparación de una sonda . El ADNc (de aproximadamente 0.9 kb) que codifica el "antígeno JTT-1 de rata", se generó digiriendo el clon "T132A7", obtenido en el Ejemplo 7, con las enzimas de restricción EcoRI y Notl, y se separó mediante electroforesis en gel de agarosa. Los fragmentos de ADN separados se purificaron con el "estuche de extracción de gel QUIAEX" (QUIAGEN) , y los fragmentos de ADN obtenidos se marcaron con 3 o P utilizando el "estuche de marcado de ADN listo para salir" (Pharmacia) . Estos fragmentos de ADN marcados se utilizaron como sondas para la hibridación de placas . 2. Preparación de la biblioteca del ADNc. 2-(l) Extracción del ARN poli (A) Como en el Ejemplo 7-1- (1) , se extrajo el ARN poli (A) + a partir de la línea celular de timoma de rata FTL435 (aproximadamente 1 x 10 células/mililitro) . 2- (2) Preparación de la biblioteca del ADNc. Con 5 miligramos del ARN poli (A) + preparado como se mencionó anteriormente, como plantilla, se sinterizaron los ADNcs utilizando el cebador oligo dT (Pharmacia) y el "Estuche de Síntesis de ADNc Ahorrador de Tiempo" (Pharmacia) . Después de que se agregó el adaptador EcoRI al ADNc, se realizó el fraccionamiento por tamaños con la Columna Spun (Pharmacia) . 2- (3) Inserción del ADNc en un vector, y empaque. El ADNc que tiene el extremo EcoRI obtenido anteriormente, se ligó con el vector 1ZAPII (Stratagene) digerido con EcoRI . Se utilizó el "estuche de ligamiento de ADN" (Takara Shuzo) para el ligamiento. Después de que se realizó el empaque in vi tro del ADN ligado con GIGA PACK II GOLD (Stratagene) , se transfectó XLIBlue MRF' de E. coli (Stratagene) con la partícula del fago obtenido, para generar una biblioteca de ADNc compuesta de placa que comprende al fago recombinante . 3. Selección de la biblioteca de ADNc. La selección se realizó mediante el método de hibridación de placas (Maniatis, T. y colaboradores, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York) , con regulador de hibridación Rapid (Amersham) . La biblioteca de ADNc anteriormente preparada (1 x 10 ) se recubrió sobre placas de ágar, y se reprodujo la réplica con la membrana de nylon Hybond-N (Amersham) . La hibridación de placas se realizó en regulador de hibridación Rapid (Amersham) , utilizando la réplica y la sonda marcada con P preparada en el Ejemplo 10-1. Se realizaron primera y segunda selecciones para obtener dos clones positivos. Después de que se aisló la placa sencilla de cada clon, se realizó la separación en vivo de acuerdo con el Manual de Instrucciones (Stratagene) , y se recolectaron dos clones positivos como el ADN del plásmido. 4. Determinación de la secuencia de nucleótidos. Las secuencias de nucleótidos de los dos clones se determinaron mediante el método de didesoxi con el "Estuche de Secuenciamiento de Auto-lectura" (Pharmacia) y el Secuenciador de ADN A.L.F. (Pharmacia) . Los dos clones comprenden la misma secuencia de nucleótidos. La secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica la longitud completa del "antígeno JTT-1 de rata" obtenido, y la secuencia de aminoácidos deducida, se muestran en la SEQ ID NO: 6. La secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 6) deducida a partir de la secuencia de ADNc obtenida, se comparó con la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 4) deducida a partir de la secuencia de ADNc obtenida que codifica el "antígeno JTT-1 de rata" clonado en el Ejemplo 7 (Figura 14) . Como se muestra en la Figura 14, la secuencia de aminoácidos codificada por el ADNc clonado en esta prueba fue completamente el mismo que aquel codificado por el ADNc que codifica el "antígeno JTT-1 de rata" obtenido en el Ejemplo 7, excepto que (1) tres residuos de aminoácido continuos C-terminales (Met-Thr-Ser) cambian a Thr-Ala-Pro, y que (2) subsecuentemente a Thr-Ala-Pro, se agregan 16 residuos de aminoácidos continuos (Leu-Arg-Ala-Leu-Gly-Arg-Gly-Glu-His-Ser-Ser-Cys-Gln-Asp-Arg-Asn) . Esto indica que el ADNc clonado en esta prueba codifica la variante de empalme alternativa del "antígeno JTT-1 de rata" obtenido en el Ejemplo 7.

Ejemplo 11 Preparación de células que expresan el "antígeno JTT-1 humano" recombinante. El clon del plásmido pBSh41 obtenido en el Ejemplo 8, se digirió con una enzima de restricción EcoRI, y se separó un fragmento de ADN que comprendía el ADNc que codificaba la longitud completa del "antígeno JTT-1 humano". Este fragmento de ADN se insertó con el Estuche de Ligamiento de ADN (Takara Shuzo) en un plásmido pEFneo (Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, Volumen 91, páginas 158-162 (1994) ) tratado con la misma enzima de restricción EcoRI, para preparar el vector de expresión. Se transformaron células CHO-K1 (ATCC: CCL-61) con el vector mediante electroporación. Mediante el cultivo de las células en un medio RPMI1640 conteniendo 0.8 miligramos/mililitro de Geneticina (GIBCO BRL) , y suero fetal de becerro al 10 por ciento, durante aproximadamente dos semanas, se seleccionaron los transformantes resistentes a la Geneticina. La expresión del "antígeno JTT-1 humano" recombinante se confirmó mediante mancha Northern mediante el método usual .

Ejemplo 12 Preparación de anticuerpos monoclonales contra el "antígeno JTT-1 humano". Los transformantes que expresan el "antígeno JTT-1 humano" recombinante preparados en el Ejemplo 11, se homogeneizaron y se ultracentrifugaron (100,000 x g) . El granulo que contenía la fracción de membrana celular, se recolectó y se suspendió en PBS. La suspensión resultante que comprendía la fracción de membrana celular, se inyectó en la planta del pie de un ratón BALB/c, con auxiliar completo de Freund para la primera inmunización (día 0) . El antígeno de la fracción de membrana celular se administró adicionalmente en la planta del pie a intervalos de 7, 14, y 28 días. Dos días después de la última inmunización, se sacaron las células de los nodos de linfa. Las células de los nodos de linfa y las células de mieloma de ratón PAI (JCR Número B0113; Res. Disclosure, Volumen 217, página 155 (1982) ) se mezclaron en una proporción de 5:1, y se fusionaron utilizando glicol de polietileno 4,000 (GIBCO) , como un agente de fusión, para preparar los hibridomas productores de anticuerpo monoclonal . Los hibridomas se seleccionaron mediante su cultivo en un medio ASF104 que contenía HAT (Ajinomoto) complementado con suero fetal de becerro al 10 por ciento y aminopterina. El sobrenadante de cultivo de cada hibridoma se hizo reaccionar_ con los transformantes que expresan el "antígeno JTT-1 humano" recombinante preparados en el Ejemplo 11, y se midió la intensidad de fluorescencia de las células teñidas mediante su reacción con IgG anti-ratón marcada con FITC (Cappel) , con el citómetro de flujo EPICS-Elite, para confirmar la reactividad del anticuerpo monoclonal generado en cada sobrenadante de cultivo para el "antígeno JTT-1 humano" . Se ha confirmado que se obtuvieron 10 o más clases de hibridomas productores de anticuerpos monoclonales que reaccionan al "antígeno JTT-1 humano" . Cada una de dos clases (designadas como clon SA12 Y SG430) entre estos hibridomas (106 a 107 células/0.5 mililitros/ratón) se inyectaron en un ratón ICR nu/nu (hembra, de 7 a 8 semanas de edad) intraperitonealmente. Después de 10 a 20 días, se realizó la celiotomía de los ratones con anestesia, y se prepararon las dos clases de anticuerpos monoclonales (SA12 y SG430) que reaccionan con el "antígeno JTT-1 humano" en una gran cantidad, a partir del fluido de ascitas extraído mediante el método usual .

Ejemplo 13 Efecto de los anticuerpos monoclonales contra el "antígeno JTT-1 humano" sobre linfocitos de sangre periférica humana. Como se mencionó en el Ejemplo 8, se piensa que el "antígeno JTT-1" puede estar involucrado en la regulación de la activación de los linfocitos en una reacción inmune, como "CD28" y "CTLA-4". Con el objeto de probar esto, se analizó el efecto de los anticuerpos monoclonales contra el "antígeno JTT-1 humano" sobre linfocitos humanos a la luz del crecimiento celular como una indicación. A cada cavidad de una placa de microtitulación de 96 cavidades, se le agregaron (1) cualquiera de SA12 ó SG430 (1 microgramo/mililitro) , el anticuerpo monoclonal contra el "antígeno JTT-1 humano" preparado en el Ejemplo 12, o (2) una mezcla de cualquier anticuerpo monoclonal SA12 ó SG430 (1 microgramo/mililitro) con el anticuerpo monoclonal anti-CD3 OKT-3 (1 microgramo/mililitro, Orthodiagnostic Systems) , que se utiliza para agregar la señal primaria en la activación de los linfocitos. La placa se incubó a 37°C durante 1 hora para recubrir cada cavidad con el anticuerpo. Después de que se lavó la placa con un medio RPMI1640, se agregaron linfocitos de sangre periférica humana normales (1 x 10 células/cavidad) a cada cavidad, y se incubaron en un medio RPMI1640 que contenía suero fetal de becerro al 10 por ciento, durante 3 días. Si era necesario, se agregaba 1 nanogramo/mililitro de acetato de miristato de forbol (PMA) . Luego se agregó [3H] timidina (3.7 µkBq/cavidad) a cada cavidad, y la placa se incubó a 37°C durante 6 horas. Las células se cosecharon, y se midió la cantidad de [°H] timidina incorporada en el ADN con un contador de cintilación de líquido (Beckman) . El ensayo sin anticuerpo se utilizó como un control. Los resultados se muestran en la Figura 15. En el ensayo que utiliza las placas recubiertas con anticuerpo monoclonal SA12 ó SG430, se comparó el número de linfocitos incrementados aproximadamente 10 veces, con el control. En la co-presencia de 0KT3 , el número de linfocitos se incrementó aproximadamente 100 veces con cualquier anticuerpo monoclonal SA12 ó SG430. Estos resultados indican que el "antígeno JTT-1" funciona en la regulación de la activación de los linfocitos. El hecho de que se incrementara la velocidad del crecimiento celular mediante la utilización junto con 0KT3 , indica que el "antígeno JTT-1" está involucrado en la transmisión de la señal coestimulante, como "CD28" y "CTLA-4".

Ej emplo 14 Efecto del "anticuerpo JTT-2" sobre encefalomielitis alérgica experimental (EAE) . Como se mencionó anteriormente con detalle, recientemente se han hecho muchos intentos por tratar diferentes enfermedades autoinmunes (artritis reumatoide, esclerosis múltiple, tiroiditis autoinmune, dermatitis por contacto alérgica, dermatosis inflamatoria crónica tal como lichen planus, lupus eritematoso sistémico, diabetes melitus dependiente de insulina, psoriasis, etcétera) , mediante la regulación de la transmisión entre CD28/CTLA-4 y CD80/CD86. El efecto ya se ha confirmado en diferentes animales modelo de enfermedades autoinmunes ((1) un modelo para lupus eritematoso sistémico humano (LE) , (2) encefalomielitis alérgica experimental (EAE) , un modelo para esclerosis múltiple (MS) , (3) un modelo para diabetes melitus dependiente de insulina (IDDM) , (4) el modelo de nefritis de Goodpasture, y (5) artritis reumatoide humana) . Con el objeto de determinar si el "antígeno JTT-1" de la presente invención es una molécula involucrada en la activación o en la inhibición de los linfocitos, tales como "CD28" y "CTLA-4", se produjeron ratas modelo para encefalomielitis alérgica experimental (EAE) , un modelo para esclerosis múltiple (MS) , y se analizó el efecto del anticuerpo monoclonal titulado sobre el "antígeno JTT-1" en el modelo. Se preparó una emulsión para utilizarse como inmunógeno, mezclando homogenato cerebroespinal de conejillo de indias Hartley (800 miligramos/mililitro de suero fisiológico) , con la misma cantidad de auxiliar completo de Freund. La inmunización se realizó inyectando intradérmicamente la emulsión en las plantas de los pies izquierdo y derecho de 15 ratas Lewis (hembras, de 6 semanas de edad) , en una cantidad de 0.25 mililitros por planta del pie. La administración (inmunización) se ajustó para las dosificaciones del homogenato preparado, para quedar en 200 miligramos por rata. Esta inmunización induce de esta manera la encefalomielitis alérgica experimental (EAE) . Las ratas así inmunizadas, se dividieron en tres grupos de cinco ratas cada uno, y se inyectó intravenosamente cualquiera de (1) a (3) más adelante en los ratones de cada grupo, inmediatamente después de la inmunización (día 0), y 3, 6, 9, y 12 días después de la inmunización. (1) Anticuerpo monoclonal "anticuerpo JTT-2" contra el "antígeno JTT-1 de rata" preparado en el Ejemplo 2 (dosificación: 2 miligramos/mililitro de PBS, 5 miligramos/kilogramo) . (2) Prednisolona, agente esteroidal (dosificación: 4 miligramos/mililitro de PBS, 10 miligramos/kilogramo) . (3) Anticuerpo de control no reactivo al "antígeno JTT-1 de rata" (dosificación: 2 miligramos/mililitro de PBS, 5 miligramos/kilogramo) . Se observó el síntoma en el transcurso del tiempo después de la inmunización. Después de que se encontró el establecimiento de EAE, se estimó el grado del síntoma calificando el síntoma basándose en los siguientes criterios. (Calificación 1) . Desaparición de la tensión de la cola. (Calificación 2) . Arrastre de las patas ocultas, y ligera parálisis. (Calificación 3) . Arrastre de las patas ocultas, y parálisis seria. (Calificación 4) . Parálisis de todo el cuerpo, o muerte. Los resultados se muestran en la Figura 16. En el grupo al que se administró el anticuerpo de control, el síntoma de EAE alcanzó el pico (máxima calificación) en el día 11 a 15 después de la inmunización, y luego se recuperó gradualmente. En contraste, en el grupo al que se le administró el "anticuerpo JTT-2" , el síntoma de EAE en el día 11 después de la inmunización se inhibió de una manera significativa. Este efecto inhibidor fue significativamente más alto que aquel en el grupo al que se administró prednisolona. Estos resultados indican que el "antígeno JTT-1" es una molécula que funciona en la inducción de la respuesta inmune, tal como la activación de linfocitos inducida mediante la inmunización mediante antígenos extraños, y que la regulación de la función del "antígeno JTT-1" o sus ligandos puede inhibir el síntoma de diferentes enfermedades autoinmunes .

Ejemplo 15 Efecto del "anticuerpo JTT-2" sobre la glomerulonefritis . Para el mismo propósito que en el Ejemplo 14, se produjeron ratas modelo de nefritis de membrana de basamento glomerular (GBM) , y se analizó el efecto del anticuerpo monoclonal titulado sobre el "antígeno JTT-1" en el modelo. Después de que se diluyó la membrana de basamento glomerular bovina (Shigei Medical Institute) digerida con colagenasa, con suero fisiológico hasta 200 microgramos/mililitro, la dilución se mezcló con auxiliar completo de Freund para preparar una emulsión para utilizarse como el inmunógeno. La inmunización se realizó mediante la inyección intradérmica de la emulsión en ambas plantas ocultas de 48 ratas Wister Kioto (de aproximadamente 200 gramos) bajo anestesia, en una cantidad de aproximadamente 0.2 mililitros por planta del pie (dosificación: aproximadamente 15 microgramos) . Esta inmunización induce de esta manera la nefritis de membrana de basamento glomerular (GBM) . Las ratas inmunizadas se dividieron en ocho grupos de seis ratas cada uno, y se inyectó cualquiera de (1) a (3) más adelante en las ratas de cada grupo, inmediatamente después de la inmunización (día 0) , y tres veces a la semana durante cinco semanas consecutivas. (1) Anticuerpo monoclonal "anticuerpo JTT-2" contra el "antígeno JTT-1 de rata" preparado en el Ejemplo 2 (dosificación: 3 miligramos/kilogramo (2 mililitros de PBS/kilogramo) , inyección intravenosa) . (2) Prednisolona, agente esteroidal, como un control positivo (suspendido en celulosa carboximetílica al 0.5 por ciento (CMC) ) (dosificación: 3 miligramos/kilogramo (5 mililitros/kilogramo) , administración oral) . (3) Celulosa carboximetílica al 0.5 por ciento como un control negativo (dosificación: 5 mililitros/kilogramo, administración oral) . Después de la administración de un sustrato de prueba, se administró oralmente agua esterilizada (25 mililitros/kilogramo) a cada rata de una manera forzada, y se recolectó la orina durante 5 horas de cada rata que se había mantenido en una jaula de metabolismo sin comer ni beber. Después de que se midió el volumen de la orina recolectada, se midió la concentración de proteína urinaria utilizando Tonein TP-II (Otuka) , y se calculó la excreción urinaria de proteína durante 5 horas (unidad: miligramos de proteína/5 horas) . La recolección urinaria anteriormente mencionada, y la medición de proteína urinaria, se realizaron de la misma manera a las 1, 2, 3, y 4 semanas después de la inmunización (día 0) . Los resultados se muestran en la Figura 17. Comparándose con el grupo de control , la excreción urinaria de proteína a las tres semanas después de la inmunización se redujo de una manera significativa en el grupo al que se le administró el "anticuerpo JTT-2". Estos resultados indican que el "antígeno JTT-1" es una molécula que induce la respuesta inmune, tal como la activación de linfocitos inducida mediante inmunización mediante antígenos extraños, y que la regulación de la función del "antígeno JTT-1" o sus ligandos, puede inhibir el síntoma de diferentes enfermedades autoinmunes.

Ejemplo 16 Preparación de la proteína de fusión entre el "antígeno JTT-1" e IgFc. Como se mencionó en los Ejemplos 8, y 13 a 15, el "antígeno JTT-1" de la presente invención se piensa que es una molécula tal como "CD28" y "CTLA-4", involucrada en la transmisión de la señal coestimulante involucrada en la regulación de la activación de los linfocitos. En adición, como se menciona en el Ejemplo 14, como se reportó, una proteína de fusión (CTLA-4-IgFc) compuesta del dominio extracelular de "CTLA-4" y la región Fc de la IgGl de inmunoglobulina humana, tiene efectos terapéuticos sobre diferentes enfermedades autoinmunes. En este ejemplo, se preparó una proteína de fusión compuesta de la región extracelular del "antígeno JTT-1" e IgFc humana como sigue, con el objeto de examinar si el antígeno JTT-1 soluble, como CTLA-4-IgFc se podría aplicar a la terapia de diferentes enfermedades autoinmunes . (1) Preparación de la proteína de fusión entre el "antígeno JTT-1 de rata" e IgGl-Fc humana (rJTT-1-IgFc) . Con el objeto de amplificar el ADNc que codifica la región extracelular del "antígeno JTT-1 de rata" mediante reacción en cadena de polimerasa, se diseñaron el cebador 5' que tiene el sitio de restricción Xhol (5'-CTGCTCGAGATGAAGCCCTACTTCTCG-3' , SEQ ID NO: 7), y el cebador 3' que tiene el sitio de restricción BamHl (ACCCTACGGGTAACGGATCCTTCAGCTGGCAA-3' , SEQ ID NO: 8), en su término, y se sintetizaron. Utilizando el clon del ADNc "T132A7" obtenido en el Ejemplo 7, que codifica la longitud completa del "antígeno JTT-1 de rata" como plantilla, se realizó la reacción en cadena de polimerasa con los cebadores para preparar el ADNc que comprende el ADNc que codifica la región extracelular del "antígeno JTT-1 de rata" que tiene los sitios de restricción Xhol y BamHl en ambos extremos . Los productos de la reacción en cadena de polimerasa así obtenidos se digirieron con Xhol y BamHl, y se separaron mediante, electroforesis en gel de agarosa, para aislar una banda de aproximadamente 450 pares de bases predicha como el fragmento de ADNc que codifica una región extracelular deseada. El fragmento de ADNc aislado se subclonó en pBluescript II SK (+) (Stratagene) disociado con Xhol y BamHT. El análisis de secuencia con un secuenciador de ADN de fluorescencia automatizado (Applied Biosystems) reveló que el fragmento de ADNc comprende la región que codifica la secuencia de aminoácidos correspondiente a los residuos de aminoácidos 1 a 141 del "antígeno JTT-1 de rata" (SEQ ID NO:4) . Por otra parte, se cortó el ADN que codifica el Fc de IgGl humana como el socio de fusión, como un fragmento de ADN BamHl-Xbal de 1.3 kb, digiriendo el plásmido (ver Cell, Volumen 61, páginas 1303-1313 (1990), preparado por B. Seed y colaboradores (Massachussetts General Hospital) ) , con BamHl y Xbal. Este fragmento comprende los exones que codifican la región de articulación de IgGl humana, C?-j_2 y C?-¡_3. El fragmento Xhol-BamHl que codifica la región extracelular del "antígeno JTT-1 de rata" y el fragmento BamHl-Xbal que comprende los exones que codifican el Fc de la IgGl humana ("IgFc"), ambos preparados como se mencionó anteriormente, se subclonaron en Pbluescript II SK (+) (Stratagene) disociado con Xhol y Xbal. Luego se digirió el plásmido con Xhol y Xbal, y se cortó un fragmento de ADN de aproximadamente 1.8 kb que comprendía el ADN de fusión que comprendía la región extracelular del "antígeno JTT-1 de rata" e IgFc humana. Este fragmento de ADN de la fusión se insertó en los sitios Xhol y Xbal del vector de expresión pME18S (Medical Immunology, Volumen 20, Número 1, páginas 27-32 (1990)); Experimental Medicine: SUPLEMENTO, "Handbook of Genetic Engineering", Yodosha, páginas 101-107 (1992)) con ligasa de ADN T4, para construir el plásmido prJTT-1-IgFc .

Las células HEK293 (ATCC CRL1573) cultivadas de una manera subconfluente como una monocapa en un medio DMEM que contenía suero fetal de becerro al 10 por ciento y ampicilina, se transformaron con prJTT-1-IgFc mediante electroporación, para obtener transformantes. Los transformantes se cultivaron en un medio ASF104 exento de suero durante 72 horas para expresar rJTT-1-IgFc. Utilizando una columna de afinidad de Sefarosa de proteína G (Pharmacia), se purificó el rJTT-1-IgFc como sigue. El sobrenadante obtenido mediante la centrifugación del medio de cultivo mencionado anteriormente, se cargó sobre una columna de afinidad de Sefarosa de proteína G previamente equilibrada con regulador de enlace. Después de que se lavó la columna con el regulador de enlace, se realizó la elución, con el regulador de elución. El eluato se recolectó y se dializó contra un regulador de fosfato, intercambiando la solución externa dos veces o más para obtener el rJTT-1-IgFc puro. El resultado de la cromatografía por afinidad se muestra en la Figura 18, y el resultado de SDS-PAGE del rJTT-1-IgFc puro así obtenido en la Figura 19. (2) Preparación de la proteína de fusión entre el "antígeno JTT-1 humano" e IgGl-Fc humana (hJTT-1-IgFc) Se preparó hJTT-1-IgFc como se mencionó anteriormente en (1) , excepto porque se utilizó ADNc como plantilla y cebador para la reacción en cadena de polimerasa. Esta prueba, se utilizó el clon "pBSh41" que comprendía el ADNc que codificaba la longitud completa del "antígeno JTT-1 humano" preparado en el Ejemplo 8, como plantilla, y se utilizaron 5'-TAACTGTTTCTCGAGAACATGAAGTCAGGC-3' (SEQ ID NO: 9) y 5'-ATCCTATGGGTAACGGATCCTTCAGCTGGC-3' (SEQ ID NO: 10) como cebadores . El resultado de la cromatografía por afinidad se muestra en la Figura 20, y el resultado de SDS-PAGE de hJTT-1-IgFc puro así obtenido en la Figura 21.

Ejemplo 17 Preparación de un ratón transgénico en el que se ha integrado el ADNc que codifica el "antígeno JTT-1 de rata" . El ADNc que codifica la longitud completa del "antígeno JTT-1 de rata" obtenido en el Ejemplo 7, se insertó en el vector de expresión pCAGGS (Gene, Volumen 108, páginas 193-200 (1991)), que tenía al promotor de /3-actina de pollo, utilizando el Estuche para Hacer Romo el ADN (Takara) , con el fin de obtener el plásmido prJTT-1. Con el objeto de preparar un ratón transgénico, el prJTT-1 se linearizó mediante tratamiento con enzima de restricción. Se utilizó un ratón ICR hembra que tenía un tapón vaginal, obtenido mediante el acoplamiento de un ratón ICR blanco (Nihon LSC) con un ratón ICR blanco macho vasoligado (Nihon SLC) , como un ratón madre nutriente. Se preparó un ratón para obtener huevos fertilizados para introducir el gen del "antígeno JTT-1 de rata" en el mismo, cruzando un ratón BDF-1 hembra (Nihon SLC) que se había hecho superovular administrándole PEAMEX (5 unidades, Sankyo Zoki) y Pregnil (5 unidades, Organon) , con un macho BDF-1 (Nihon SLC) . Después de cruzarse, se separó el oviducto del ratón BDF-1 hembra, y solamente se obtuvieron los huevos fertilizados mediante tratamiento con hialuronizada, y se almacenaron en un medio. El gen del "antígeno JTT-1 de rata" se introdujo en el huevo fertilizado bajo el microscopio utilizando un manipulador de acuerdo con el método usual . El huevo fertilizado se fijó con una aguja de retención. Se diluyó una solución que contenía el gen linearizado anteriormente mencionado que codifica el "antígeno JTT-1 de rata", con el regulador Tris-EDTA, y se microinyectó en el pronúcleo macho de los huevos fertilizados con una aguja de introducción de ADN a 37°C. Después de la introducción del gen, solamente se seleccionaron los huevos fertilizados que mantenían un estado normal, y luego, el huevo fertilizado así seleccionado en el que se introdujeron los genes del "antígeno JTT-1 de rata" se insertó en la fimbria del ovario de un ratón madre nutriente (ratón ICR blanco) . Se cortó la cola de un ratón de progenie (ratón fundador) nacido del ratón madre nutriente, y se recolectó el gen genómico de ella. Se confirmó, mediante reacción en cadena de polimerasa, que el gen del "antígeno JTT-1 de rata" se integraba en el genoma del ratón. Luego, se prepararon ratones transgénicos heterocigóticos que expresaban altamente el "antígeno JTT-1 de rata", cruzando este ratón fundador con un ratón normal. Los ratones transgénicos homocigóticos se pueden preparar cruzando los ratones heterocigóticos unos con otros. La construcción microinyectada que comprende al gen del "antígeno JTT-1 de rata" se muestra esquemáticamente en la Figura 22.

Ejemplo 18 Preparación de un ratón knockout cuyo gen endógeno que codifica el "antígeno JTT-1 de ratón" se ha inac ivado. (1) Construcción de un vector de dirección. Se preparó un vector de dirección para inactivar (derribar) el gen endógeno que codifica el "antígeno JTT-1 de ratón", a través de recombinación homologa (Nikkei Science, páginas 52-62, Mayo de 1994) como sigue. El fragmento PstI-HindIII ("ADN homólogo (1)") obtenido mediante la digestión del clon del ADN genómico del ratón que comprendía la región que codificaba el "antígeno JTT-1 de ratón" clonado en el Ejemplo 9-5, con PstI y HindIII, se subclonó en pGEM-3 (Promega) . Luego se linearizó el pGEM-3 con Xhol, y se separó el gen de resistencia a la neomicina ("neo") a partir de pMCl-neo-poliA (Stratagene) , mediante su tratamiento con Xhol y Salí, y se insertó corriente arriba del "ADN homólogo" (1) , y luego se ligaron. El clon del ADN genómico de ratón anteriormente mencionado se digirió con Xhol y Notl, para cortar un gen de aproximadamente 5.5 kb ("ADN homólogo (2)") localizado corriente arriba del "ADN homólogo (1) " anteriormente mencionado. Por separado, el pGEM-3 anteriormente mencionado, en el que se había insertado el "ADN neo-homólogo (1)", se digirió con Xhol y HindIII, para cortar el "ADN neo-homólogo (1)". El "ADN homólogo (2)" y el "ADN neo-homólogo (1) " así obtenidos, se subclonaron en pSEAP-2-CONT (Clontech) linearizado con Notl y HindIII. Después de que se digirió el plásmido obtenido, en el que se había insertado el "homólogo (2) -neo-homólogo (1)", y de que se linearizó corriente abajo del "ADN homólogo (1) " con NruI, se insertó el gen de quinasa de timidina ("TK") obtenido mediante la digestión de pMCl-TK (Stratagene) con PvuII, corriente abajo del "ADN homólogo (1)", para obtener un vector de dirección, en el que se insertó el "ADN homólogo (2) -neo-homólogo (1) " . (2) Introducción del vector de dirección en las células ES. Las células de tallo embriónico de ratón (Nature, volumen 362, páginas 255-258 (1993)); Nature, Volumen 326, páginas 292-295 (1987)), cultivadas en un medio DMEM, conteniendo suero fetal de becerro al 15 por ciento, se trataron con tripsina para ser células sencillas, y las células se lavaron tres veces, seguido por la adición de un regulador de fosfato a las mismas para ajustar a 1 x 10 células/mililitro. Se agregó el vector de dirección mencionado anteriormente (25 microgramos por 1 mililitro de la suspensión celular) a la suspensión celular, y se aplicó un impulso eléctrico una vez bajo la condición de 350 voltios/centímetro (25 µF) . Luego se recubrieron 1 x 10 células ES sobre un plato de 10 centímetros, y se cultivaron en un medio de mantenimiento durante 1 día, y el medio se cambió a un medio de selección (que contenía 250 microgramos/mililitro de G418, y 2 µM de ganciclovir) . Las células se cultivaron con el medio cambiado cada dos días . Al décimo día desde la introducción del vector de dirección, se obtuvieron 573 clones de células ES resistentes a la neomicina bajo el microscopio con una micropipeta. Cada uno de los clones de células ES así obtenidos se cultivó de una manera independiente sobre una placa de 24 cavidades recubierta por células Feeder, para obtener 768 réplicas de células ES resistentes a la neomicina. (3) Selección de células ES knockout. Se confirmó, mediante reacción en cadena de polimerasa, si el gen endógeno que codificaba el "antígeno JTT-1 de ratón" se alteraba (derribaba) a través de la recombinación homologa en cada una de las células ES resistentes a la neomicina. Para la reacción en cadena de polimerasa, se utilizaron (1) los cebadores diseñados y sintetizados basándose en la secuencia del gen resistente a neomicina anteriormente mencionado ("neo") (5 ' -CGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGC-3 ' , SEQ ID NO: 11) y (2) los cebadores diseñados y sintetizados basándose en la secuencia del "ADN homólogo (1) " anteriormente mencionado (5' -CATTCAAGTTTCAGGGAACTAGTCCATGCGTTTC-3 ' , SEQ ID NO: 12) . Cada ADN genómico se extrajo de cada una de las células ES resistentes a la neomicina, y se realizaron reacciones en cadena de polimerasa utilizando los cebadores con el ADN genómico como plantilla. La reacción en cadena de polimerasa se realizó a un ciclo de reacción a 94°C durante 3 minutos, 30 ciclos de reacción a 94°C durante 1 minuto, a 60°C durante 1 minuto, y a 72°C durante 3.5 minutos, y un ciclo de reacción a 72 °C durante 10 minutos, y los productos resultantes se almacenaron a 4°C. Cuando se amplificó un fragmento menor de aproximadamente 4 kb mediante esta reacción en cadena de polimerasa, se pudo juzgar que el gen endógeno que codificaba el "antígeno JTT-1 de ratón" se alteraba (se derribaba) a través de la recombinación homologa en el clon de las células ES. Se obtuvo un producto de reacción en cadena de polimerasa deseado a partir de tres de los 768 clones de células ES probados. Se realizaron manchas Southern genómicas para estos tres clones, para una selección y confirmación adicional. Después de que se extrajo el 7?DN genómico de los tres clones, y se digirió con la enzima de restricción BamHl, los productos digeridos se sometieron a electroforesis en gel de agarosa. Los ADNs resultantes se transfirieron a una membrana de nylon, y se realizó la hibridación con una sonda preparada a partir de la secuencia del ADN genómico que comprendía "JTT-1 de ratón" . La sonda se diseñó basándose en la secuencia afuera del sitio en donde se presentó la recombinación homologa, que hace posible distinguir el genoma de tipo mutante del genoma de tipo normal en su tamaño. Como resultado, se observaron dos bandas correspondientes al tipo mutante y al tipo normal en uno de los tres clones. Este clon de células ES se utilizó para la preparación de un ratón knockout descrito más adelante . (4) Preparación de un ratón knockout. Las células ES anteriormente obtenidas (15 células ES por blastocito) cuyo gen endógeno que codifica el "antígeno JTT-1 de ratón" se había inactivado (derribado) a través de recombinación homologa, se mieroinyectaron en blastocitos, los cuales se obtuvieron cruzando un ratón C57BL6 hembra (Nihon Charles River) con uno macho. Inmediatamente después de la microinyección, los blastocitos (aproximadamente 10 blastocitos por un lado del útero) se trasplantaron en el útero de un ratón ICR madre nutriente (CLEA Japón), que era un ratón de 2.5 días desde el tratamiento de seudo-embarazo. Como un resultado, se obtuvieron 38 ratones de progenie en total, y 18 de ellos eran los ratones quiméricos deseados. Once (11) de los ratones quiméricos eran los ratones quiméricos en los que la contribución al color del pelo era del 80 por ciento o más. Los ratones quiméricos así obtenidos se cruzaron luego con ratones C57BL6 normales para obtener ratones agouti cuyo color se deriva del gen de color de pelo de las células ES.

Ejemplo 19 Preparación de una composición farmacéutica que comprende al anticuerpo. Cada uno de los anticuerpos monoclonales (50 a 150 microgramos/mililitro) , el "anticuerpo JTT-1" y el "anticuerpo JTT-2" contra el "antígeno JTT-1 de rata", preparado en el Ejemplo 1, y los anticuerpos monoclonales "SA12" y "SG430" contra el "antígeno JTT-1 humano", preparados en el Ejemplo 12, se agregó a agua destilada inyectable (10 mililitros) para preparar la inyección.

Aplicabilidad Industrial Las moléculas de superficie celular novedosas (denominadas "antígeno JTT-1") de la presente, derivadas de mamíferos, tales como seres humanos, ratones, y ratas, se caracterizan como sigue. (1) El "antígeno JTT-1" tuvo la siguiente similitud con "CD28", una molécula de superficie celular sobre los linfocitos, tales como células T, que transmiten la señal coestimulante importante para la activación de células T a través de la adhesión celular, y "CTLA-4", una molécula de superficie celular sobre los linfocitos, tales como las células T, que regula la función de los linfocitos activados, tales como células T activadas, cooperando con la señal. (i) 20 o más residuos de aminoácidos, incluyendo los residuos de cisteína, están altamente conservados; (ii) la secuencia de repetición de prorina, "Pro-Pro-Pro (PPP)", que es esencial como la región de enlace del ligando, se conserva en la región extracelular; (iii) La secuencia "Tyr-Xaa-Xaa-Met (YxxM) " (Xaa y x representan cualquier aminoácido) , esencial como la región de transmisión de señal, se conserva en la región citoplásmica; y (iv) El lugar del gen que codifica el "antígeno JTT-1 de ratón" sobre el cromosoma del ratón, es "lc3", como "CD28" y "CTLA-4". (2) El "antígeno JTT-1" puede mediar la adhesión celular de los timocitos, linfoblastos estimulados con mitógeno tal como ConA, timomas, como "CD28" y "CTLA-4" que median la adhesión celular. (3) El "antígeno JTT-1" se expresa fuertemente cuando menos en los timocitos, las células de linfoblasto estimuladas con el mitógeno tal como ConA (células de linfoblastos T activadas, y células de linfoblastos B activadas, etcétera) , los linfocitos de la sangre periférica, y los timomas . (4) El anticuerpo contra el "antígeno JTT-1" prolifera de una manera significa los linfocitos de la sangre periférica humana, y la proliferación se mejora más en la presencia de un anticuerpo monoclonal contra CD3 que constituye el complejo TcR/CD3 sobre las células T, que reciben la señal primaria esencial para la activación de las células T desde las células presentadoras de antígeno. (5) La administración del anticuerpo contra el "antígeno JTT-1" inhibe de una manera significativa el síntoma de la encefalomielitis alérgica experimental (EAE) . (6) La administración del anticuerpo contra el "antígeno JTT-1" a una rata modelo para nefritis de membrana de basamento glomerular (GBM) , inhibe de una manera significativa el síntoma de esta enfermedad. El "antígeno JTT-1" de la presente invención, como "CD28" y "CTLA-4", se piensa que es una molécula que transmite la señal secundaria (señal coestimulante) esencial para la activación de los linfocitos, tales como células T, y que regula la función de los linfocitos activados, tales como las células T activadas, cooperando con la señal.

Por consiguiente, los péptidos que constituyen estas moléculas de superficie celular, su fragmento de polipéptido, y los polipéptidos de fusión de los mismos, y los anticuerpos para los mismos de la presente invención, pueden proporcionar productos farmacéuticos extremadamente útiles para terapia o prevención de diferentes enfermedades autoinmunes, enfermedades alérgicas, o enfermedades inflamatorias, específicamente artritis reumatoide, esclerosis múltiple, tiroiditis autoinmune, dermatitis por contacto alérgica, dermatosis inflamatoria crónica, tal como lichen planus, lupus eritematoso sistémico, diabetes melitus dependiente de insulina, y psoriasis, ocasionadas por la activación de los linfocitos, tales como las células T, y la anormalidad de la regulación de las funciones de los linfocitos activados. De una manera similar, los genes que codifican polipéptido o fragmentos de polipéptido de la presente invención, se pueden utilizar, no solamente en terapia genética de diferentes enfermedades como se mencionó anteriormente, sino también para la preparación de productos farmacéuticos anti-sentido. Entre los anticuerpos de la presente invención, los anticuerpos monoclonales humanos y sus composiciones farmacéuticas tienen un valor farmacéutico dramáticamente incrementado de los fármacos de anticuerpo, debido a que no tienen antigenicidad contra el ser humano, el cual ha sido un serio problema (efecto secundario) de los productos farmacéuticos de anticuerpo que contienen anticuerpos derivados de mamíferos no humanos, tales como anticuerpos derivados de ratón. Los genes (ADN) , polipéptidos, fragmentos de polipéptido, y anticuerpos de la presente invención, son útiles no solamente como productos farmacéuticos, sino también como reactivos para la búsqueda de moléculas (ligandos) que interactúen con las moléculas de superficie celular de la presente invención, aclarando la función del ligando, y desarrollando fármacos que se dirigen a los ligandos . Además, el ratón transgénico de la presente invención es extremadamente útil no solamente como un animal modelo para estudiar la función fisiológica del "antígeno JTT-1", que es una molécula de superficie celular de la presente invención, sino también como una herramienta para seleccionar diferentes fármacos (compuestos de bajo peso molecular, anticuerpos, sustancias anti-sentido, polipéptido, etcétera) que tienen actividad reguladora (inhibición, supresión, activación, estímulo, etcétera) de la función del "antígeno JTT-1" . De una manera específica, estas sustancias de prueba se pueden administrar al ratón transgénico para medir y analizar diferentes parámetros fisiológicos, biológicos, o farmacológicos generados en el ratón, evaluando de esta manera la actividad de las sustancias de prueba administradas.

En adición, el ratón knockout de la presente invención puede aclarar la función de las moléculas de superficie celular de la presente invención, mediante el análisis de las características del ratón desde diferentes puntos de vista (punto de vista fisiológico, biológico, farmacológico, patológico, y genético) .

LISTADO DE SECUENCIAS (1) Nombre de la solicitante: JAPAN TABACCO INC. (2) Título de la invención: MOLÉCULA DE SUPERFICIE CELULAR MEDIADORA DE ADHESIÓN CELULAR Y DE TRANSMISIÓN DE SEÑALES. (3) Número de referencia: J1-802PCT (4) Número de solicitud: (5) Fecha de presentación: (6) País en donde se presentó la solicitud de prioridad, y número de solicitud: Japón, Número Hei 9-062290 Japón, Solicitud de Patente presentada el 26 de febrero de 1998 (número de referencia: J1-802DP1) (7) Fecha de prioridad: 27 de febrero de 1S97. (8) Número de secuencias: 12 SEQ ID NO:l: LONGITUD DE SECUENCIA: 600 TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico TOPOLOGÍA: lineal TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm FUENTE ORIGINAL: ORGANISMO: Homo sapiens CARACTERÍSTICAS : NOMBRE/CLAVE : CDS LOCALIZACION: 1..600 METODO DE IDENTIFICACIÓN: E DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 1 ATG AAG TCA GGC CTC TGG TAT TTC TTT CTC 30 Met Lys Ser Gly Leu Trp Tyr Phe Phe Leu 1 5 10 TTC TGC TTG CGC ATT AAA GTT TTA ACÁ GGA 60 Phe Cys Leu Arg lie Lys Val Leu Thr Gly 15 20 GAA ATC AAT GGT TCT GCC AAT TAT GAG ATG 90 Glu lie Asn Gly Ser Ala Asn Tyr Glu Met 25 30 TTT ATA TTT CAC AAC GGA GGT GTA CAÁ AIT 120 Phe lie Phe His Asn Gly Gly Val Gln lie 35 40 TTA TGC AAA TAT CCT GAC ATT GTC CAG CAÁ 150 Leu Cys Lys Tyr Pro Asp He Val Gln Gln 45 50 TTT AAA ATG CAG TTG CTG AAA GGG GGG CAÁ 180 Phe Lys Met Gln Leu Leu Lys Gly Gly Gln 55 60 ATA CTC TGC GAT CTC ACT AAG ACÁ AAA GGA 210 He Leu Cys Asp Leu Thr Lys Thr Lys Gly 65 70 AGT GGA AAC ACÁ GTG TCC ATT AAG AGT CTG 240 Ser Gly Asn Thr Val Ser He Lys Ser Leu 75 ao AAA TTC TGC CAT TCT CAG TTA TCC AAC AAC 270 Lys Phe Cys His Ser Gln Leu Ser Asn Asn 85 90 AGT GTC TCT TTT TTT CTA TAC AAC TTG GAC 300 Ser Val Ser Phe Phe Leu Tyr Asn Leu Asp 95 100 CAT TCT CAT GCC AAC TAT TAC TTC TGC AAC 330 His Ser His Ala Asn Tyr Tyr Phe Cys Asn 105 110 CTA TCA ATT TTT GAT CCT CCT CCT TTT AAA 360 Leu Ser He Phe Asp Pro Pro Pro Phe Lys 115 120 GTA ACT CTT ACÁ GGA GGA TAT TTG CAT ATT 390 Val Thr Leu Thr Gly Gly Tyr Leu His He 125 130 TAT GAA TCA CAÁ CTT TGT TGC CAG CTG AAG 420 Tyr Glu Ser Gln Leu Cys Cys Gln Leu Lys 135 140 TTC TGG TTA CCC ATA GGA TGT GCA GCC TTT 450 Phe Trp Leu Pro He Gly Cys Ala Ala Phe 145 150 GTT GTA GTC TGC ATT TTG GGA TGC ATA CTT 480 Val Val Val Cys He Leu Gly Cys He Leu 155 160 ATT TGT TGG CTT ACÁ AAA AAG AAG TAT TCA 510 He Cys Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser 165 170 TCC AGT GTG CAC GAC CCT AAC GGT GAA TAC 540 Ser Ser Val His Asp Pro Asn Gly Glu Tyr 175 180 ATG TTC ATG AGA GCA GTG AAC ACÁ GCC AAA 570 Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys 185 190 AAA TCT AGA CTC ACÁ GAT GTG ACC CTA TAA 600 Lys Ser Arg Leu Thr Asp Val Thr Leu 195 IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA NO : 2 LONGITUD DE LA SECUENCIA: 199 TIPO DE SECUENCIA: aminoácido TOPOLOGÍA: 1ineal TIPO DE MOLÉCULA: proteína FUENTE ORIGINAL: ORGANISMO: Homo sapiens DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 2 Met Lys Ser Gly Leu Trp Tyr Phe Phe Leu 1 5 10 Phe Cys Leu Arg He Lys Val Leu Thr Gly 15 20 Glu He Asn Gly Ser Ala Asn Tyr Glu Met 25 30 -Phe He Phe His Asn Gly Gly Val Gln He 35 ' 40 Leu Cys Lys Tyr Pro Asp He Val Gln Gln 45 50 Phe Lys Met Gln Leu Leu Lys Gly Gly Gln 55 60 He Leu Cys Asp Leu Thr Lys Thr Lys Gly 65 70 Ser Gly Asn Thr Val Ser He Lys Ser Leu 75 80 Lys Phe Cys His Ser Gln Leu Ser Asn Asn 85 90 Ser Val Ser Phe Phe Leu Tyr Asn Leu Asp 95 100 His Ser His Ala Asn Tyr Tyr Phe Cys Asn 105 110 Leu Ser He Phe Asp Pro Pro Pro Phe Lys 115 120 Val Thr Leu Thr Gly Gly Tyr Leu His He 125 130 Tyr Glu Ser Gln Leu Cys Cys Gln Leu Lys 135 140 Phe Trp Leu Pro He Gly Cys Ala Ala Phe 145 150 Val Val Val Cys ile Leu Gly Cys He Leu 155 160 He Cys Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser 165 170 Ser Ser Val His Asp Pro Asn Gly Glu Tyr 175 180 Met Phe Met Arg Ala Val Asn Thr Ala Lys 185 190 Lys Ser Arg Leu Thr Asp Val Thr Leu 195 IDENTIFICACIÓN DE LA SECUENCIA NO: 3: LONGITUD DE LA SECUENCIA: 2610 TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico TOPOLOGÍA: lineal TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos (ADNc que contiene las secuencias no traducidas 3' y 5') FUENTE ORIGINAL: ORGANISMO: Homo sapiens CARACTERÍSTICAS : NOMBRE/CLAVE : CDS LOCALIZACION: 26..625 METODO DE IDENTIFICACIÓN: E DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 3 GGACTGTTAA CTGTTTCTGG CAAAC 25 ATG AAG TCA GGC CTC TGG TAT TTC TTT CTC 55 Met Lys Ser Gly Leu Trp Tyr Phe Phe Leu 5 10 TTC TGC TTG CGC ATT AAA GTT TTA ACÁ GGA 85 Phe Cys Leu Arg He Lys Val Leu Thr Gly 15 20 GAA ATC AAT GGT TCT GCC AAT TAT GAG ATG 115 Glu He Asn Gly Ser Ala Asn Tyr Glu Met 25 30 TTT ATA TTT CAC AAC GGA GGT GTA CAÁ ATT 145 Phe He Phe His Asn Gly Gly Val Gln He 35 40 TTA TGC AAA TAT CCT GAC ATT GTC CAG CAÁ 175 Leu Cys Lys Tyr Pro Asp He Val Gln Gln 45 50 TTT AAA ATG CAG TTG CTG AAA GGG GGG CAÁ 205 Phe Lys Met Gln Leu Leu Lys Gly Gly Gln 55 60 ATA CTC TGC GAT CTC ACT AAG ACÁ AAA GGA 235 He Leu Cys Asp Leu Thr Lys Thr Lys Gly 65 70 AGT GGA AAC ACÁ GTG TCC ATT AAG AGT CTG 265 Ser Gly Asn Thr Val Ser He Lys Ser Leu 75 80 AAA TTC TGC CAT TCT CAG TTA TCC AAC AAC 295 Lys Phe Cys His Ser Gln Leu Ser Asn Asn 85 90 AGT GTC TCT TTT TTT CTA TAC AAC TTG GAC 325 Ser Val Ser Phe Phe Leu Tyr Asn Leu Asp 95 100 CAT TCT CAT GCC AAC TAT TAC TTC TGC AAC 355 His Ser His Ala Asn Tyr Tyr Phe Cys Asn 105 110 CTA TCA ATT TTT GAT CCT CCT CCT TTT AAA 385 Leu Ser He Phe Asp Pro Pro Pro Phe Lys 115 120 GTA ACT CTT ACÁ GGA GGA TAT TTG CAT ATT 415 Val Thr Leu Thr Gly Gly Tyr Leu His He 125 130 TAT GAA TCA CAÁ CTT TGT TGC CAG CTG AAG 445 Tyr Glu Ser Gln Leu Cys Cys Gln Leu Lys 135 140 TTC TGG TTA CCC ATA GGA TGT GCA GCC TTT 475 Phe Trp Leu Pro He Gly Cys Ala Ala Phe 145 150 GT.T GTA GTC TGC ATT TTG GGA TGC ATA CTT 505 Val Val Val Cys He Leu -Gly Cys He Leu 155 160 ATT TGT TGG CTT ACÁ AAA AAG AAG TAT TCA 535 He Cys Trp Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser 165 170 TCC AGT GTG CAC GAC CCT AAC GGT GAA TAC 565 Ser Ser Val His Asp Pro Asn Gly Glu Tyr 175 180 ATG TTC ATG AGA GCA GTG AAC ACÁ GCC AAA 595 Met Phe Met Arg Ala V*».l Asn Thr Ala Lys 185 190 AAA TCT AGA CTC ACÁ GAT GTG ACC CTA TAA 625 Lys Ser Arg Leu Thr Asp Val Thr Leu 195 TATGGAACTC TGGCACCCAG GCATGAAGCA CGTTGGCCAG TTTTCCTCAA 675 CTTGAAGTGC AAGATTCTCT TATTTCCGGG ACCACGGAGA GTCTGACTTA 725 ACTACATACA TCTTCTGCTG GTGTTTTGTT CAATCTGGAA GAATGACTGT 775 ATCAGTCAAT GGGGATTTTA ACAGACTGCC TTGGTACTGC CGAGTCCTCT 825 CAAAACAAAC ACCCTCTTGC AACCAGCTTT GGAGAAAGCC CAGCTCCTGT 875 GTGCTCACTG GGAGTGGAAT CCCTGTCTCC ACATCTGCTC CTAGCAGTGC 925 ATCAGCCAGT AAAACAAACA CATTTACAAG AAAAATGTTT TAAAGATGCC 975 AGGGGTACTG AATCTGCAAA GCAAATGAGC AGCCAAGGAC CAGCATCTGT 1025 CCGCATTTCA CTATCATACT ACCTCTTCTT TCTGTAGGGR TGAGAATTCC 1075 TCTTTTAATC AGTCAAGGGA GATGCTTCAA AGCTGGRGCT ATTTTATTTC 1125 TGAGATGTTG ATGTGAACTG TACATTAGTA CATACTCAGT ACTCTCCTTC 1175 AATTGCTGAA CCCCAGTTGA CCATTTTACC AAGACTTTAG ATGCTTTCTT 1225 GTGCCCTCAA TTTTCTTTTT AAAAATACTT CTACATGACT GCTTGACAGC 1275 CCAACAGCCA CTCTCAATAG AGAGCTATGT CTTACATTCT TTCCTCTGCT 1325 GCTCAATAGT TTTATATATC TATGCATACA TATATACACA CATATGTATA 1375 TAAAATTCAT AATGAATATA TTTGCCTATA TTCTCCCTAC AAGAATATTT 1425 TTGCTCCAGA AAGACATGTT CTTTTCTCAA ATTCAGTTAA AATGGTTTAC 1475 TTTGTTCAAG TTAGTGGTAG GAAACATTGC CCGGAATTGA AAGCAAATTT 1525 AWWTTATTAT CCTATTTTCT ACCATTATCT ATGTTTTCAT GGTGCTATTA 1575 ATTACAAGTT TAGTTCTTTT TGTAGATCAT ATTAAAATTG CAAACAAAAT 1625 CATCTTTAAT GGGCCAGCAT TCTCATGGGG TAGAGCAGAA TATTCATTTA 1675 GCCTGAAAGC TGCAGTTACT ATAGGTTGCT GTCAGACTAT ACCCATGGTG 1725 CCTCTGGGCT TGACAGGTCA AAATGGTCCC CATCAGCCTG GAGCAGCCCT 1775 CCAGACCTGG GTGGAATTCC AGGGTTGAGA GACTCCCCTG AGCCAGAGGC 1825 CACTAGGTAT TCTTGCTCCC AGAGGCTGAA GTCACCCTGG GAATCACAGT 1875 GGTCTACCTG CATTCATAAT TCCAGGATCT GTGAAGAGCA CATATGTGTC 1925 AGGGCACAAT TCCCTCTCAT AAAAACCACA CAGCCTGGAA ATTGGCCCTG 1975 GCCCTTCAAG ATAGCCTTCT TTAGAATATG ATTTGGCTAG AAAGATTCTT 2025 AAATATGTGG AATATGATTA TTCTTAGCTG GAATATTTTC. TCTACTTCCT 2075 GTCTGCATGC CCAAGGCTTC TGAAGCAGCC AATGTCGATG £AACAACATT 2125 TGTAACTTTA GGTAAACTGG GATTATGTTG TAGTTTAACA TTTTGTAACT 2175 GTGTGCTTAT GTTTACAAG TGAGACCCGA TATGTCATTA TGCATACTTA 2225 TATTATCTTA AGCATGTGTA ATGCTGGATG TGTACAGTAC AGTACWTAAC 2275 TTGTAATTTG AATCTAGTAT GGTGTTCTGT TTTCAGCTGA CTTGGACAAC 2325 CTGACTGGCT TTGCACAGGT GTTCCCTGAG TTGTTTGCAG GTTTCTGTGT 2375 GTGGGGTGGG GTATGGGGAG GAGAACCTTC ATGGTGGCCC ACCTGGCCTG 2425 GTTGTCCAAG CTGTGCCTCG ACACATCCTC ATCCCAAGCA TGGGACACCT 2475 CAAGATGAAT AATAATTCAC AAAATTTCTG TGAAATCAAA TCCAGTTTTA 2525 AGAGGAGCCA CTTATCAAAG AGATTTTAAC AGTAGTAAGA AGGCAAAGAA 2575 TAAACATTTG ATATTCAGCA ACTGAAAAAA AAAAA 2610 SEQ ID NO : 4 : LONGITUD DE LA SECUENCIA : 2072 TIPO DE SECUENCIA : ácido nucleico TOPOLOGÍA: lineal TIPO DE MOLÉCULA : otros ácidos nucleicos (ADNc que contiene las secuencias no traducidas 3 ' y 5 ' ) FUENTE ORIGINAL : ORGANISMO : Rattus CARACTERÍSTICAS : NOMBRE /CLAVE : CDS LOCALIZACION : 35 . . 637 METODO DE IDENTIFICACIÓN : E DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEQ ID NO : 4 CTGGAGGGGA AGAGTGCAGC TGTTCCTGGC AGAC 34 ATG AAG CCC TAC TTC TCG TGC GTC TTT GTC 64 Met Lys Pro Tyr Phe Ser Cys Val Phe Val 1 5 10 TTC TGC TTC CTA ATC AAA CTT TTA ACÁ GGA 94 Phe Cys Phe Leu He Lys Leu Leu Thr Gly 15 20 GAA CTC AAT GAC TTG GCC AAT CAC AGG ATG 124 Gl u Leu Asn Asp Leu Ala Asn Hi s Arg Met 25 30 TTT TCG TTT CAC GAT GGA GGT GTA CAG ATT 154 Phe Ser Phe His Asp Gly Gly Val Gln He 35 40 TCT TGT /.AC TAC CCT GAG ACT GTC CAG CAG 184 Ser Cys Asn Tyr Pro Glu Thr Val Gln Gln 45 50 TTA AAA ATG CAG TTG TTC AAA GAC AGA GAA 214 Leu Lys Met Gln Leu Phe Lys Asp Arg Glu 55 60 GTC CTC TGC GAC CTC ACC AAG ACC AAG GGA 244 Val Leu Cys Asp Leu Thr Lys Thr Lys Gly 65 70 AGC GGA AAC ACC GTG TCC ATC AAG AAT CCG 274 Ser Gly Asn Thr Val Ser He Lys Asn Pro 75 80 ATG TCC TGT CCA TÁT CAG CTG TCC AAC AAC 304 Met Ser Cys Pro Tyr Gln Leu Ser Asn Asn 85 90 AGT GTC TCT TTT TTC CTA GAC AAC GCA GAC 334 Ser Val Ser Phe Phe Leu Asp Asn Ala Asp 95 100 AGC TCC CAG GGC AGC TAC TTT TTA TGC AGC 364 Ser Ser Gln Gly Ser Tyr Phe Leu Cys Ser 105 110 CTG TCG ATT TTC GAC CCA CCC CCT TTT CAÁ 394 Leu Ser He Phe Asp Pro Pro Pro Phe Gln 115 120 GAA AAG AAC CTT AGT GGA GGA TAT TTG CTT 424 Glu Lys Asn Leu Ser Gly Gly Tyr Leu Leu 125 130 ATT TAT GAA TCC CAG CTT TGT TGC CAG CTG 454 He Tyr Glu Ser Gln Leu Cys Cys Gln Leu 135 140 AAG CTT TGG TTA CCC GTA GGG TGT GCA GCT 484 Lys Leu Trp Leu Pro Val Gly Cys Ala Ala 145 150 TTT GTG GCA GCG CTC CTT TTT GGA TGC ATA 514 Phe Val Ala Ala Leu Leu Phe Gly Cys He 155 160 TTT ATC GTC TGG TTT GCA AAA AAG AAG TAC 544 Phe He Val Trp Phe Ala Lys Lys Lys Tyr 165 170 AGA TCC AGT GTG CAC GAC CCT AAT AGC GAG 574 Arg Ser Ser Val His Asp Pro Asn Ser Glu 175 180 TAC ATG TTC ATG GCG GCA GTC AAC ACÁ AAC 604 Tyr Met Phe Met Ala Ala Val Asn Thr Asn 185 190 AAA AAG TCC AGA CTT GCA GGT ATG ACC TCA 634 Lys Lys Ser Arg Leu Ala Gly Met Thr Ser 195 200 TAA 637 TCTGGAACAC GGGAACCCAT GGAGGAACTA CACTGTCTAG TTCCCCTGAA 687 ACTTGAATGG AGAAAGTCTT CTATTTTCTG GACCACAGGG CATCTGACTT 737 GATTAACTAC TGATACCTCC TTTTGGKGTT TTGTTTGTCT GGATCAGTGA 787 CTATCAGTCA CTCGGAATTT CAGCAGACTG CCCTGGGTTT GCTGAGTCCT 837 TTTAAGGCAA ACCCCTTCTT ATAGAAGACC CGGCTCATAT GTATTCAACA 887 AACAGACCTC ACTGGGATAC AATCCCCTCT TTCTGCGCCT GCTTCTAGCT 937 ATGCACCGGC CAGCAAGACA AACATATCTC CAGCATTTTT ACAAAAATGC 987 CAGGGTATGA ATCTGTAAAG TACACAGGCA GCCATTGACC ACCGTCTGTC 1037 CTCGTTTTTT CAGATTCTAT TTTTTTCCAT AGAGATCAGC ATTCCTTCTA 1087 GAATCAGACA GTAGAGGGAG ATGCTTCACA ACAGAAGCTC TTATGTTTCT 1137 GAGATGTTGA TGAATTCATG CTTTAGTACC ACCATGTTCT CTAACAACTT 1187 CTATATTCCA GCTGATCACT GCTTCAGGGC TTAGATGCCT GCTTTTGCCT 1237 TCAAGTCTCC CCTTAAAGAT ACTCCCACAG GTCTACTTGG TGGCCTGCAG 1287 CCACTCTGAA TAGGAAGTTT GGTCTACAAT TTCCCCCCTC TGCTGCTCAA 1337 AAAAAAAAAT TAGTAGATAT GATTTTCCCA TATTCTCCCT GCCAAAGTAA 1387 TTTTTTCCAG CAAAGACATC TAAATTCAGT TAATATGGTT TACTGTGTTG 1437 ATATTAGTGG CAGTAAACAT TTCTCAGAAT CAAAAGCAAA TTAATTTTGC 1487 GGTGGTGTTT TTCTACCATT ATCTTGGGTT TCCATGGTGC TATTACTCAC 1537 AAGTTTAGCT ATTTTTTTAT GCATCATATT AAAGTTGCAA GCAAGCAGAG 1587 CAACCCTCGG TTAATGGGCA AACATTCTCC TGGGGTAGAA TGAATTGTCT 1637 ATTTAGCCCG AAAACTGCAG TTTCTGTGGG TGGCTGCCAG ACTACAGCCG 1687 TGCTTTGCTC TGGCTTTGAC AGGTTGAAAT AGYCCCCATG ASCSTGGAAC 1737 AGWACTCCAG ACTGTGCTGG AGTCCCAAAG TTAGGAGGGC CATGGAGCCT 1787 GGGACAGGCT GCTGCTTTGG TCTTTAGGAT CTAGGAAR TTACAGAGGG 1837 GCCAAGAC?G AGTTCCCTCC CCTAGAAACT GTGCAGCCTG GAAGTCAGCC 1887 CTGGCACTTT AAGATAGCCT TCTTTAGAAC ATGAGTTAGT TGGTAGTATT 1937 CTGACGTGTA AACAGCCTAT KGTTGCTCGG AGCTGGACCA TTTTCTCCAC 1987 TTCCCTGTCT GCATGCCTAA GACTTCTAGA GCAGCCAACG TATATGCAAC 2037 ATTAAAGAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAA 2072 SEQ ID NO : 5 : LONGITUD DE LA SECUENCIA : 603 TIPO DE SECUENCIA : ácido nucleico TOPOLOGÍA: lineal TIPO DE MOLÉCULA : ADNc a ARNm FUENTE ORIGINAL : ORGANISMOS : Mus CARACTERÍSTICAS : NOMBRE/CLAVE : CDS LOCALIZACION : 1 . . 603 METODO DE IDENTIFICACIÓN : E DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 5 ?TG AAG CCG TAC TTC TGC CAT GTC TTT GTC 30 Met Lys Pro Tyr Phe Cys His Val Phe Val ' 1 5 10 TTC TGC TTC CTA ATC AGA CTT TTA ACÁ GGA 60 Phe Cys Phe Leu He Arg Leu Leu Thr Gly 15 20 GAA ATC AAT GGC TCG GCC GAT CAT AGG ATG 90 Glu He Asn Gly Ser Ala Asp Hi s Arg Met 25 30 TTT TCA TTT CAC AAT GGA GGT GTA CAG ATT 120 Phe Ser Phe His Asn Gly Gly Val Gln H e 35 40 TCT TGT AAA TAC CCT GAG ACT GTC CAG CAG 150 Ser Cys Lys Tyr Pro Glu Thr Val Gln Gln 45 50 TTA AAA ATG CGA TTG TTC AGA GAG AGA GAA 180 Leu Lys Met Arg Leu Phe Arg Glu Arg Glu 55 60 GTC CTC TGC GAA CTC ACC AAG ACC AAG GGA 210 Val Leu Cys Glu Leu Thr Lys Thr Lys Gly 65 70 AGC GGA AAT GCG GTG TCC ATC AAG AAT CCA 240 Ser Gly Asn Ala Val Ser He Lys Asn Pro 75 80 ATG CTC TGT CTA TAT CAT CTG TCA AAC AAC 270 Met Leu Cys Leu Tyr His Leu Ser Asn Asn 85 90 AGC GTC TCT TTT TTC CTA AAC AAC CCA GAC 300 Ser Val Ser Phe Phe Leu Asn Asn Pro Asp 95 100 AGC TCC CAG GGA AGC TAT TAC TTC TGC AGC 330 Ser Ser Gln Gly Ser Tyr Tyr Phe Cys Ser 105 110 CTG TCC ATT TTT GAC CCA CCT CCT TTT CAÁ 360 Leu Ser He Phe Asp Pro Pro Pro Phe Gln 115 120 GAA AGG AAC CTT AGT GGA GGA TAT TTG CAT 390 Glu Arg Asn Leu Ser Gly Gly Tyr Leu His 125 130 ATT TAT GAA TCC CAG CTC TGC TGC CAG CTG 420 He Tyr Glu Ser Gln Leu Cys Cys Gln Leu 135 14Q AAG CTC TGG CTA CCC GTA GGG TTG CCA GCT 450 Lys Leu Trp Leu Pro Val Gly Leu Pro Ala 145 150 TTC GTT GTG GTA CTC CTT TTT GGA TGC ATA 480 Phe Val Val Val Leu Leu Phe Gly Cys He 155 160 CTT ATC ATC TGG TTT TCA AAA AAG AAA TAC 510 Leu He He Trp Phe Ser Lys Lys Lys Tyr 165 170 GGA TCC AGT GTG CAT GAC CCT AAT AGT GAA 540 Gly Ser Ser Val His Asp Pro Asn Ser Glu 175 180 TAC ATG TTC ATG GCG GCA GTC AAC ACÁ AAC 570 Tyr Met Phe Met Ala Ala Val Asn Thr Asn 185 190 AAA AAG TCT AGA CTT GCA GGT GTG ACC TCA 600 Lys Lys Ser Arg Leu Ala Gly Val Thr Ser 195 200 TAA 603 SEQ ID NO: 6: LONGITUD DE LA SECUENCIA: 836 TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico TOPOLOGÍA: lineal TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos (ADNc que contiene las secuencias no traducidas 3' y 5') FUENTE ORIGINAL: ORGANISMO : Rattus CARACTERÍSTICAS : NOMBRE/CLAVE : CDS LOCALIZACION: 35..685 METODO DE IDENTIFICACIÓN: E DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 6 CTGGAGGGGA AGAGTGCAGC TGTTCCTGGC AGAC 34 ATG AAG CCC TAC TTC TCG TGC GTC TTT GTC 64 Met Lys Pro Tyr Phe Ser Cys Val Phe Val 1 5 10 TTC TGC TTC CTA ATC AAA CTT TTA ACÁ GGA 94 Phe Cys Phe Leu He Lys Leu Leu The Gly 15 20 GAA CTC AAT GAC TTG GCC AAT CAC AGG ATG 124 Glu Leu Asn Asp Leu Ala Asn His Arg Met 25 30 TTT TCG TTT CAC GAT GGA GGT GTA CAG ATT 154 Phe Ser Phe His Asp Gly Gly Val Gln He 35 40 TCT TGT AAC TAC CCT GAG ACT GTC CAG CAG 184 Ser Cys Asn Tyr Prc Glu Thr Val Gln Gln 45 50 TTA AAA ATG CAG TTG TTC AAA GAC AGA GAA 214 Leu Lys Met Gln Leu Phe Lys Asp Arg Glu 55 60 GTC CTC TGC GAC CTC ACC AAG ACC AAG GGA 244 Val Leu Cys Asp Leu Thr Lys Thr Lys Gly 65 70 AGC GGA AAC ACC GTG TCC ATC AAG AAT CCG 274 Ser Gly Asn Thr Val Ser He Lys Asn Pro 75 80 ATG TCC TGT CCA TAT CAG CTG TCC AAC AAC 304 Met Ser Cys Pro Tyr Gln Leu Ser Asn Asn 85 90 AGT GTC TCT TTT TTC CTA GAC AAC GCA GAC 334 Ser Val Ser Phe Phe Leu Asp Asn Ala Asp 95 100 AGC TCC CAG GGC AGC TAC TTT TTA TGC AGC 364 Ser Ser Gln Gly Ser Tyr Phe Leu Cys Ser 105 110 CTG TCG ATT TTC GAC CCA CCC CCT TTT CAÁ 394 Leu Ser He Phe Asp Pro Pro Pro Phe Gln 115 120 GAA AAG AAC CTT AGT GGA GGA TAT TTG CTT 424 Glu Lys Asn Leu Ser Gly Gly Tyr Leu Leu 125 130 ATT TAT GAA TCC CAG CTT TGT TGC CAG CTG 454 lie Tyr Glu Ser Gln Leu Cys Cys Gln Leu 135 140 AAG CTT TGG TTA CCC GTA GGG TGT GCA GCT 484 Lys Leu Trp Leu Pro Val Gly Cys Ala Ala 145 150 TTT GTG GCA GCG CTC CTT TTT GGA TGC ATA 514 Phe Val Ala Ala Leu Leu Phe Gly Cys He 155 160 TTT ATC GTC TGG TTT GCA AAA AAG AAG TAC 544 Phe He Val Trp Phe Ala Lys Lys Lys Tyr 165 170 AGA TCC AGT GTG CAC GAC CCT AAT AGC GAG 574 Arg Ser Ser Val His Asp Pro Asn Ser Glu 175 180 TAC ATG TTC ATG GCG GCA GTC AAC ACÁ AAC 604 Tyr Met Phe Met Ala Ala Val Asn Thr Asn 185 190 AAA AAG TCC AGA CTT GCA GGT ACÁ GCA CCC 634 Lys Lys Ser Arg Leu Ala Gly Thr Ala Pro 195 200 CTT AGG GCT TTG GGG AGA GGA GAA CAC TCT 664 Leu Arg Ala Leu G?y Arg Gly Glu His Ser 205 210 TCA TGT CAÁ GAC CGG AAT TAA 685 Ser Cys Gln Asp Arg Asn 215 TTTGTTTATT TCTATTTTAA AAGAAAGACA TTTTTTCCCC TAAAGATAAT 735 TTTTGTATTT TTATGTGAAA GTCTGAATCT TCATTTTAAC TCGACTTATA 785 TACTCTGTGG TATATTAAAA ATAATGTTTG TGAAAAAAAA AAAAAAAAAA 835 A 836 SEQ ID NO : 7 : LONGITUD DE LA SECUENCIA: 27 TIPO DE SECUENCIA : ácido nucleico TOPOLOGÍA : lineal TIPO DE MOLÉCULA : otros ácidos nucleicos (ADN sintético) CARACTERÍSTICAS : NOMBRE /CLAVE : enlace de cebador LOCALIZACION : 1 . . 27 METODO DE IDENTIFICACIÓN : E DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 7 CTGCTCGAGA TGAAGCCCTA CTTCTCG 27 SEQ ID NO : 8 : LONGITUD DE LA SECUENCIA: 32 TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico TOPOLOGÍA: lineal TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos (ADN sintético) CARACTERÍSTICAS : NOMBRE/CLAVE : enlace de cebador LOCALIZACION: 1..32 METODO DE IDENTIFICACIÓN: E DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 8 ACCCTACGGG TAACGGATCC TTCAGCTGGC AA 32 SEQ ID NO : 9 : LONGITUD DE LA SECUENCIA: 30 TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico TOPOLOGÍA: lineal TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos (ADN sintético) CARACTERÍSTICAS : NOMBRE/CLAVE : enlace de cebador LOCALIZACION : 1..30 METODO DE IDENTIFICACIÓN: E DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 9 TAACTGTTTC TCGAGAACAT GAAGTCAGGC 30 SEQ ID NO: 10 LONGITUD DE LA SECUENCIA: 30 TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico TOPOLOGÍA: lineal TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos (ADN sintético) CARACTERÍSTICAS : NOMBRE/CLAVE : enlace de cebador LOCALIZACION: 1..30 METODO DE IDENTIFICACIÓN: E DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10 ATCCTATGGG TAACGGATCC TTCAGCTGGC 30 SEQ ID NO: 11 LONGITUD DE LA SECUENCIA: 35 TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico TOPOLOGÍA: lineal TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos (ADN sintético) CARACTERÍSTICAS: NOMBRE/CLAVE : enlace de cebador LOCALIZACION: 1..35 METODO DE IDENTIFICACIÓN: E DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11 CGTGATATTG CTGAAGAGCT TGGCGGCGAA TGGGC 35 SEQ ID NO: 12 LONGITUD DE LA SECUENCIA: 34 TIPO DE SECUENCIA: ácido nucleico TOPOLOGÍA: lineal TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos (ADN sintético) CARACTERÍSTICAS : NOMBRE/CLAVE : enlace de cebador LOCALIZACION: 1..34 METODO DE IDENTIFICACIÓN: E DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12 CATTCAAGTT TCAGGGAACT AGTCCATGCG TTTC 34

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido que constituye una molécula de superficie celular que tiene las siguientes características: (a) la molécula de superficie celular se expresa en cuando menos los timocitos y las células de linfoblasto estimuladas por mitógeno; (b) un anticuerpo que reacciona a esta molécula de superficie celular induce la adhesión entre las células de linfoblasto estimuladas por mitógeno; (c) un anticuerpo que reacciona a esta molécula de superficie celular induce la proliferación de los linfocitos de la sangre periférica en la presencia de un anticuerpo contra CD3 ; (d) la molécula de superficie celular tiene una secuencia de aminoácidos parcial representada por Phe-Asp-Pro- ro-Pro-Phe en su región extracelular; y (e) la molécula de superficie celular tiene una secuencia de aminoácidos parcial representada por Tyr-Met- Phe-Met en su región citoplásmica.

2. El polipéptido de la reivindicación 1, el cual comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, o la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 en donde uno o más aminoácidos están sustituidos, suprimidos, o agregados.

3. El polipéptido de la reivindicación 1, el cual es codificado por un ADN que se hibrida con un ADN que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID N0:1, bajo condiciones astringentes . .

El polipéptido de la reivindicación 1, el cual comprende una secuencia de aminoácidos que tiene el 60 por ciento o más de homología con una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO : 2.

5. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la molécula de superficie celular se deriva de un ser humano .

6. Un gen que codifica el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. El gen de la reivindicación 6, en donde este gen es un ADNc .

8. El gen de la reivindicación 7, en donde el ADNc tiene una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID N0:1.

9. El gen de la reivindicación 7, en donde el ADNc comprende una secuencia de nucleótidos correspondiente a los residuos de nucleótidos 26 a 625 de la SEQ ID NO: 3, los residuos de nucleótidos 35 a 637 de la SEQ ID N0:4, los residuos de nucleótidos 1 a 603 de la SEQ ID NO: 5, o los residuos de nucleótidos 35 a 685 de la SEQ ID NO : 6.

10. Un vector que comprende al gen de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9.

11. Un transformante en el que se ha introducido el vector de la reivindicación 10.

12. Un transformante identificado mediante el depósito internacional con número de acceso FERM BP-5725.

13. Un fragmento de polipéptido que comprende una región extracelular del polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

14. El fragmento de polipéptido de la reivindicación 13, en donde este polipéptido es un polipéptido derivado de un ser humano que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO : 2.

15. Un gen que codifica el fragmento de polipéptido de la reivindicación 13 ó 14.

16. Una molécula de homodímero que comprende dos fragmentos de polipéptido, en donde cada uno de los fragmentos comprende una región extracelular del polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, y estos dos fragmentos de polipéptido están puenteados a través de enlaces de disulfuro uno con el otro .

17. La molécula de homodímero de la reivindicación 16, en donde el polipéptido es un polipéptido derivado de un ser humano que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.

18. Una composición farmacéutica que comprende ya sea al fragmento de polipéptido de la reivindicación 14, o bien a la molécula de homodímero de la reivindicación 17, o ambos, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

19. Un polipéptido de fusión que comprende una región extracelular del polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, y una región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina humana (Ig) , o una porción de la región constante.

20. El polipéptido de fusión de la reivindicación 19, en donde la inmunoglobulina es IgG.

21. El polipéptido de fusión de la reivindicación 19, en donde la porción de la región constante comprende una región de articulación, un dominio C2, y un dominio C3 de IgG.

22. El polipéptido de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, en donde este polipéptido derivado de un ser humano que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO : 2.

23. Una molécula de homodímero que comprende dos polipéptidos de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22, en donde los dos polipéptidos están puenteados a través de enlaces de disulfuro uno con el otro.

24. Una molécula de homodímero que comprende dos polipéptidos de fusión de la reivindicación 22, en donde los dos polipéptidss están puenteados a través de enlaces de disulfuro uno con el otro.

25. Una composición farmacéutica que comprende a cualquiera del polipéptido de fusión de la reivindicación 22, 0 la molécula de homodímero de la reivindicación 24, o ambos, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

26. La composición farmacéutica de la reivindicación 25, en donde la composición farmacéutica se utiliza para el tratamiento de enfermedades autoinmunes o enfermedades alérgicas, y para prevenir el síntoma de la enfermedad.

27. Un anticuerpo o una porción del mismo, que reacciona al polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, el fragmento de polipéptido de la reivindicación 13 ó 14, o la molécula de superficie celular que comprende a este polipéptido .

28. El anticuerpo de la reivindicación 27, o una porción del mismo, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal .

29. Un anticuerpo monoclonal, o una porción del mismo, que reacciona al polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO : 2 , el fragmento de polipéptido de la reivindicación 14, o la molécula de superficie celular derivada de un ser humano que comprende a este polipéptido.

30. Un anticuerpo monoclonal, o una porción del mismo, que reacciona al polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o a la molécula de superficie celular que comprende a este polipéptido, en donde el efecto de este anticuerpo monoclonal sobre las células de linfoblasto estimuladas por mitógeno es sustancialmente igual al efecto de un anticuerpo monoclonal producido por un hibridoma identificado mediante el depósito internacional con número de acceso FERM BP5707 sobre células de linfoblasto de rata estimuladas por mitógeno.

31. Un anticuerpo monoclonal, o una porción del mismo, que reacciona al polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o a la molécula de superficie celular que comprende a este polipéptido, en donde el efecto del anticuerpo monoclonal sobre las células de linfoblasto estimuladas por mitógeno es sustancialmente igual al efecto de un anticuerpo monoclonal producido por un hibridoma identificado mediante el depósito internacional con número de acceso FERM BP5708 sobre células de linfoblasto de rata estimuladas por mitógeno.

32. Una composición farmacéutica que comprende al anticuerpo monoclonal de la reivindicación 29, o una porción del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

33. La composición farmacéutica de la reivindicación 32, en donde esta composición farmacéutica se utiliza para el tratamiento de enfermedades autoinmunes o enfermedades alérgicas, o para prevenir el síntoma de la enfermedad.

34. Un hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal de cualquiera de las reivindicaciones 28 a 31.

35. Un ratón transgénico, en el que se integra un gen que codifica el polipéptido de la reivindicación 1 en su gen endógeno, en donde este gen es un gen derivado de un ser humano que comprende una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID N0.-1, o un gen derivado de rata que comprende una secuencia de nucleótidos correspondiente a los residuos de nucleótidos 35 a 637 de la SEQ ID NO : 4.

36. Un ratón knockout, en el que se inactiva su gen endógeno que codifica el polipéptido de ratón de la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de la SEQ ID NO: 5, de tal manera que no se produce este polipéptido de ratón.