MXPA99007829A

MXPA99007829A - Metodo para la produccion de vacunas contra lasproteinas de superficie celular

Info

Publication number: MXPA99007829A
Application number: MXPA/A/1999/007829A
Authority: MX
Inventors: C Herr John; Naabyhansen Soren; J Flickinger Charles
Original assignee: University Of Virginia Patent Foundation
Priority date: 1997-02-25
Filing date: 1999-08-24
Publication date: 2000-04-24

Abstract

Un método para identificar el repertorio de proteínas expuesto en la superficie de un virus, bacteria o célula, y a la preparación de vacunas para las mismas. El método incluye marcar vectorialmente proteínas en la superficie de membrana;aislar s proteínas de superficie de membrana marcadas mediante electroforesis en gel de dos dimensiones;y secuenciar las proteínas de superficie de membrana aisladas, También se incluyen métodos para producir una vacuna contra el virus, bacteria o célula, métodos para detectar infertilidad, métodos para producir anticoncepción y las vacunas y anticonceptivos producidos por los métodos.

Description

MÉTODO PARA LA PRODUCCIÓN DE VACUNAS CONTRA LAS PROTEÍNAS DE SUPERFICIE CELULAR SOPORTE DEL GOBIERNO Este trabajo fue soportado en parte por otorgamiento N I H HD 29099 y P30-28934 de los National Institutes of Health. El gobierno puede tener ciertos derechos en la invención.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Campo de la invención La invención se refiere de manera general a un método para identificar el repertorio de proteínas expuesto en la superficie de una célula, y a la preparación de vacunas para las mismas. En particular, la invención se refiere a un método para identificar el repertorio de proteínas presente en la superficie de espermatozoides humanos, a las proteínas identificadas por el método, y a la producción de vacunas anticonceptivas de ellas.

Discusión de los antecedentes Es a través de sus superficies que los organismos vivos interactúan con sus ambientes. Es contra los epitopes presentes en las superficies celulares y virales que el sistema inmune dirige tanto respuestas inmunes mediadas por células T como anticuerpos Los métodos que permiten que las moléculas de su perficie en organismos vivos a ser identificadas, aisladas y genéticamente manipuladas, proporcionan un medio para desarrol lar vacunas , ya que es contra la superficie celular/vi ral que se dirigen las respuestas inmunes. Los espermatozoides de mam íferos es una célula altamente diferenciada. Es el producto de una serie compleja de cambios, los cuales están espacial y temporalmente organizados en un conjunto de asociaciones de células conocidas como el ciclo del epitelio seminífero ( 1 ) . Durante la espermatogénesis, los espermatogonios sin diferenciar redondos son transformados vía espermatocitos y espemátides en espermatozoides móviles y altamente asimétricos, y en los humanos, pueden reconocerse 12 pasos en la diferenciación de espermátides solos (2) . Como un resultado de estos numerosos casos de diferenciación, los espermatozoides son células inusuales en muchos aspectos. La cromatina nuclear se vuelve altamente condensada e inactiva en la síntesis de RNA, y aparecen componentes citoplásmicos únicos, tales como el acrosoma de la cabeza del esperma y las fibras densas exteriores y nervaduras fibrosas de la cola. Aunque no es aparente inmediatamente a partir de su apariencia microscópica, aún la membrana del plasma del esperma experimenta diferenciación extensiva durante la espermatogénesis. Los dominios de membranas diferentes se forman en la superficie del esperma (3) , como se muestra en preparaciones de fractura con congelación (4) y en estudios inm unocitoquímicos de diferencias en las distribuciones de los componentes de membrana del esperma (5) . Adicionalmente, la superficie del esperma no es estática después de dejar el epitelio semin ífero; sus componentes experimentan alteración y redistribución como un re sultado de maduración adicional en el epidídimo, y siguiendo la capacitación y la reacción de acrosoma en el tracto reproductor femenino (6 ,7) Es a través de sus superficies que el esperma interactúa con sus alrededores en los tractos femeninos y masculinos conforme pasan de los testítulos al oviducto Lo más importante, la membrana de plasma (piasmalema) del esperma se pone en contacto con las investiduras de los huevos, y se cree que la membrana que descansa sobre el segmento ecuatorial del acrosoma es el sitio inicial de la fusión con la membrana de plasma del huevo (8) Chong Xu et al (26) reportaron recientemente que pueden extraerse con detergente 64 proteínas manchadas con plata plasmalémicas a partir de vesículas de membranas de espematozoides aisladas mediante cavitación de nitrógeno, centrifugación diferencial, electroforesis I EF/PAGE Sin embargo, una desventaja de la técnica de cavitación de nitrógeno en el análisis de las proteínas de superficie de esperma es la necesidad de depositar muestras recolectadas sobres varias semanas para lograr suficiente material de inicio Además, existen mcertidumbres persistentes de si los métodos de cavitación producen proteínas de "membrana" , las cuales de seriven solo de la membrana del plasma (20). Aunque se ha empleado electroforesis de dos dimensiones en el estudio de proteínas de esperma humano en el pasado (1 8-26), la reconci liación de los patrones de prote ína entre estos reportes previos fue difícil debido a la carenci a de estandarización de procedimientos El amplio catalogam iento de las prote ínas de su perficie de esperma hu mano ha sido entorpecido debido a que los datos disponibles estaban limitados en una o más de las siguientes formas: 1 ) resolución , 2) reproducibilidad, 3) rango de pH , 4) especificidad de técnicas de marcado de superficie, o 5) procedimientos de purificación de membrana de plasma. En vista de las deficiencias antes mencionadas concomitantes con los métodos de la técnica anterior para analizar las proteínas de superficie celular, es claro que existe una necesidad en la técnica para un método estandarizado para análisis, identificación, caracterización , aislamiento y catalogamiento de proteínas de superficie celular en general , y proteínas de superficie de esperma en particular.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN De acuerdo a esto, un objetivo de esta invención es proporcionar un método novedoso para el análisis de proteínas de superficie de membrana incluyendo los pasos de a . marcar vectorialmente proteínas en la superficie de membrana; b. aislar las proteínas de superficie de membrana marcada por dos electroforesis en gel de dos dimensiones; y c. secuenciar las proteínas de superficie de membrana aisladas. Otro objetivo de la invención es proporcionar un método para producir una vacuna contra prote ínas de superficie de membrana, incluyendo los pasos de a . marcar vectorialmente proteínas en la superficie de membrana ; b. aislar las proteínas de superficie de membrana marcadas por electroforesis en gel de dos dimensiones; c . secuenciar las proteínas de superficie de mem brana aisladas; d clonar el DNA que codifica las prote ínas de superl icie de membrana , y e producir de manera recombmante las proteínas de supeificie de membrana usando el DNA aislado en el paso (d) 5 Todavía otro objetivo de la invención es proporcionar un método para diagnosticar infertilidad , incluyendo a marcar las proteínas de superficie de membrana obtenidas mediante el método antes descrito, b hacer reaccionar las proteínas de superficie de membrana 10 marcadas con suero de un paciente en el cual se va a diagnosticar la presencia o ausencia de infertilidad, y c detectar la formación de un complejo entre un anticuerpo presente en el s uero y la proteína de superficie de membrana marcada Todavía otro objetivo es proporcionar una vacuna producida p mediante el método antes descrito Un objetivo adicional de la invención es proporcionar un conjunto de prueba diagnóstica incluyendo las proteínas de superficie celular producidas mediante el método antes descrito Otro objetivo de la invención es proporcionar un método para inducir la anticoncepción en un paciente incluyendo adm inistrar a un paciente en necesidad de la misma , una cantidad de proteínas de superficie celular de esperma producidas mediante el método antes descrito, suficiente para preven ir la fertilización de un huevo en dicho paciente Un objetivo adicional de la invención es proporcionar un método para 2^ producir u n a nticonceptivo incluye ndo administrar a u n mam ífero las prote ínas recombinantes prod ucidas mediante el método antes descrito y aislar anticuerpos producidos por el mam ífero contra las proteínas recombinantes. Todavía otro objetivo de la invención es proporcionar un anticonceptivo producido por el método antes descrito. Con lo anterior y otros objetivos, se volverán evidentes las ventajas y características de la invención, la naturaleza de la invención puede entenderse más claramente por referencia a la siguiente descripción detallada de las modalidades preferidas de la invención y a las reivindicaciones anexas.

BREVE DESC RIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Una apreciación más completa de la invención y muchas de las ventajas concomitantes de la misma será obtenida fácilmente conforme la misma sea mejor entendida por referencia a la siguiente descripción detallada cuando se considera en conexión con los dibujos acompañantes, en donde: La Figura 1 muestra el análisis electroforético en gel de dos dimensiones de espermatozoides humanos manchados con plata [A&B] y proteínas de plasma seminal de un paciente azospérmico [C&D] solubilizado en amortig uador de lisis A (ver métodos) . Las prote ínas se separaron mediante I EF/PAGE (A&C) y mediante NEPHGE/PAG E (B&D), resulta ndo en resolución de aproximadamente 1300 manchas de proteínas de esperma. Los gradientes de pH de los geles de primera dimensión están i ndicados en la parte superior de la figura . Note la superposición en el rango de pH entre las dos técnicas de primera dimensión. La SDS-PAGE se realizó con el ánodo en el fondo de los geles. Los pesos moleculares (x 1 0~3) son indicados en el margen izquierdo. Existen relativamente pocas proteínas de peso molecular alto en el plasma seminal licuado (C&D) , al tiempo que son evidentes numerosas manchas de proteínas por debajo de 20 kDa. Los patrones de degradación de las proteínas de plasma seminal pueden seguirse por los rastros oblicuos vistos entre las proteínas básicas en D (flechas horizontales). La comparación por computadora de plasma sem inal y patrones de proteínas de esperma identificó 9 proteínas co-migradoras de forma similar (flechas negras y blancas). La flecha blanca en A y C indica la posición de albúmina, la cual aparentemente se adhiere a la superficie de esperma. La Figura 2 ilustra las variaciones en la cantidad de una proteína de 39.5 kDa en esperma obtenidas de tres hombres jóvenes saludables. Las 3 muestras se trataron idénticamente incluyendo la separación electroforética simultánea en el mismo tanque amortiguador. La figura muestra áreas alargadas de los 3 geles de IEF/PAGE. La proporción estimada de densidad de la prote ína de 39.5 kDa manchada con plata, indicada por flechas, varió desde 0.41 2 en A hasta 3.703 en C. Tal variación de concentración también se observó entre proteínas de superficie (Figura 7) . La Fig ura 3 es un estudio del curso de tiem po de la incorpora ción de radioyodo en proteínas de esperma humano. Se radiomarcaron cuatro al ícuotas de 30 x 1 0s esperma recolectado de Percoll del mismo donador, empleado 1 0 IODO-BEADS (perlas de yodo) y 1 50 µCi de Na125l e n 4 ml de PBS de Dulbecco por al ícuota La incorporación de yodo se paro después de 5, 1 0, 15 y 20 minutos mediante remoción de las células de las perlas catal íticas mediante pipeteo Los espermatozoides fueron peleteados mediante centrifugación y la cantidad de yodo incoroporada se comparó con la cantidad de yodo en el amortiguador de reacción mediante conteo en un contador Gamma La Figura 4 muestra una comparación de proteínas de esperma marcadas extraídas en amortiguador de lisis A sin pre-tratamiento (A) y después de una centrifugación de densidad de Percoll siguiendo marcado vectorial (B) El número de proteínas maracadas es disminuido en la muestra de esperma , que experimentó la segunda separación de Percoll (B) Las proteí nas marcadas en el panel A incluyeron la proteína mtra-acrosomal polimórfica SP-1 0 (cabezas de flechas horizontales) y actma (flecha blanca), indicando que había ocurrido el marcado de constituyentes citoplásmicos [Ver Figura 6 para una inmunomancha de SP-10] En contraste, los marcadores citoplasmicos de control no se marcaron en el panel B De esta manera , la centrifugación de Percoll siguiendo marcado de superficie se consideró esencial para asegurar que solo se analizaron las proteínas de superficie La Figura 5 i lustra la I EF PAG E de dos d i mensiones de prote ínas de esperma humano yodinadas verticalmente mostrando "western blots" compañeras que reaccionaron con anticuerpos monoclonales para componentes citoplasmicos El esperma de un donador simple fue radioyodinado, sometido a centrifugación de Percol l y solubi hzado en amortig uador A bajo cond iciones no red uctoras (A&B) o con agente reductor presente (DTT 1 00 m M) (C&D) Se usó una composi ción de anfolma de 28% pH 3-3 5, 20% pH 5-7, 7% pH 7-9 y 45% pH 3 5-10 para intensificar la resolución de proteínas acidas A Auto-radiograma de proteínas no reducidas inmovilizadas en la membrana NC La posición de actma en el patrón de radioyodmación es indicado por flechas B Western blot de las proteínas en A incubadas con un mAb para actma antes de la auto-radiografía Se resolvieron cuatro isoformas de actma en el MW esperado de 43 kDa y con pl 's entre 5 1 -5 2 En la inserción Bl , el auto-radiograma se colocó en la parte superior de la inmunomancha correspondiente La región espandida demuestra claramente que la actina monomérica no se yodinó Las flechas horizontales en B 1 y B2 indican la posición de dos proteínas de 51 y 52 kDa, inmunológicamente reactivas cruzadas con activa Las proteína fueron manchadas muy débilmente a una dilución 1 3000 del anticuerpo (Figura 5B) , pero se demostraron más claramente cuando el anticuerpo se usó a una dilución 1 1500 (inserción B2) C Auto-radiograma de proteínas reducidas inmovilizadas en la membrana NC Las flechas horizontales indican la posición de varias proteínas abundantes, las cuales participan en complejos de alto peso molecular estabilizados por puentes S-S D Western blot de C incubadas con mAb para ß-tubulina antes de la auto-radiografía Al menos se mmunomancharon siete isoformas de ß-tubulina en su MW esperado de 57 kDa y con pl's entre 4 6 y 5 4, siguiendo la extracción de proteínas de esperma en presencia de DTT La posición de ß-tubulina en e l auto-radiog rama es ind icada por flechas verticales en la Figura 5C Au nque la pos ición de alg unas de las isoformas de tubulina en el auto-rad iograma es cubierta por em isiones de proteínas yodmadas circundantes, la ß-tubulina por sí misma no fue radioyodmada por el procedimiento La Figura 6 muestra formación de imagen de proteína por absorbancia reflejada , que demuestra que la proteína intra-acrosomal polimórfica SP-1 0 no está vectopalmente yodmada Las proteínas radiomarcadas se solubilizaron con NP-40 y urea, separadas por I EF/PAGE, transferidas a papel NC e incubadas con el mAb MHS 1 0 Después del desarrollo colopmétpco con el substrato DAB, se obtuvo la imagen del producto de inmuno-reacción de SP-10 en el auto-radiograma [B] por reflectancia de una pantalla de intensificación de imagen, permitiendo visualizar la posición exacta de las formas SP-1 0 como una sombra El patrón SP-10 característico, en el cual las formas de mayor peso molecular son más acidas que las formas de peso molecular menor, iguala los datos publicados (32, 33) Aunque contiene 3 residuos de tirosina y 1 2 de histidina (32), los cuales pueden ser potenci almente yodmados, la proteína intra-acrosomal SP-1 0 no fue detectada como una protema radioyodinada siempre y cuando los espermatozoides que reaccionaron con acrosoma hayan sido removidos medíanl e una centrifugación de gradiente de Percoll después del marcado La Figura 7 compara auto-radiogramas de proteínas de esperma humano vectopalmente marcadas de dos donadores siguiendo la electroforesis 2-D y la transferencia a membranas NC muestra e ilustra la alta reproducibilidad global de los patrones de proteínas yodinadas de donador a don ador Un numero igual de células radioyodinadas de cada donador se sol ubilizo y se aplicaron vol úmenes iguales de sol ubilizado a I EG/PAGE (A&C) y NEPHGE/PAGE (B&D) . Ciertas proteínas de superficie yodinadas, tales como el g rupo de 89->95 kDa (flechas verticales), mostraron variaciones en concentración relativa como se juzgó mediante la densidad óptica integrada contra la densidad total de todas las proteínas en el auto-radiograma. La Figura 8 es un análisis electroforético en gel de dos dimensiones de proteínas de esperma humano marcadas con NHS-LC-Biotina solubilizadas por NP-40 y urea, y separadas por I EF/PAGE (A,C y E) o por NEPHGE/PAGE (B, D, F) antes de ser transferidas a membranas NC. A y B: las proteínas de esperma biotiniladas fueron visualizadas por ECL siguiendo incubación con avidina AP-conjugada. C y D: las proteínas de esperma no biotiniladas incubadas con AP-avidina sola demostraron cinco proteínas que ligan avidina endógenas con MW de 77 kDa y pl entre 6 y 6.5 (flechas verticales en C) . La posición de estas proteínas que ligan avidina endógenas en el patrón de biotinilación de superficie se indica mediante flechas similares en A. E y F: las proteínas de esperma biotiniladas se mancharon mediante oro coloidal siguiendo la transferencia a papel NC. Las proteínas en E fueron incubadas con el "antisern" policlonal R-1 0, cultivado contra PH-20 de macaco recombinante, una hialuronidasa de superficie de esperma. Se inmunomarcaron tres manchas de proteína PH-20 de MW aparente de 53 kDa (flechas apuntando hacia arriba en E) . El antígeno de 65 kDa (extremo ácido de gel) también se manchó con suero preinmune de conejo. Las tres manchas de 53 kDa se marcaron con biotina (flechas simi lares en A) , indicando que tres formas de PH20 son accesibles a biotinilación de superficie . En F, se utilizó el suero preinmune para PH20 La flecha abierta indica la posición de la forma básica de 53 kDa en el gel de NEPHGE La forma de 53 kDa de PH20 no fue inmunomanchada La Figura 9 muestra un análisis electroforético en gel de dos dimensiones de proteínas de esperma humano biotmiladas en amortiguador de lisis B (SDS, CHAPS, UREA) A y B Pr oteínas visualizadas por manchado con plata C y D Proteínas biotiniladas visualizadas con AP-avidma y ECL después de elctrotransferencia a papel NC E I nmunomancha mostrando la posición de ß-tubulma detectada por incubación con mAb TU27 La posición de ß-tubulma en el manchado con plata y los patrones de 2-D biotinizados (A & C) está indicada por flechas hacia a bajo idénticas Los complejos de alto peso molecular indicados por una flecha abierta en la Figura 9A mostraron contener a-tubuhna siguiendo inmunoblotting con un mAb Notar que no se biotinilaron ni a - ni ß-tubulma F I nmunoblot mostrando los antígenos de cubierta fibrosa detectados por mAb S69 La posición de los componentes de cubierta fibrosa en los patrones de 2-D biotmilados y manchados con plata es indicado por una flecha oblicua similar en B y D Las proteínas de cubierta fibrosa no se marcaron con biotina G y H Inmunoblot de lah ialuronidasa de superficie de esperma PH20 Se inmunomancharon dos isotipos de PH-20, a 64 kDa y a 53 kDa A un aumento mayor, la forma de 53 kDa podría resolverse en cinco isoformas La biotmilación más fuerte ocurrió de la isoforma más acida del componente de 53 kDa de PH-20 La mancha in mun o-reactiva débil de 65 kDa (indicada por una cabeza de flecha obl icua que apu nta hacia arriba en la Figura 9G y por flechas en las Figuras 8A & E) también estuvo presente en el control pre-inmune de conejo (datos no mostrados) La Figura 1 0 es una inmunoblot con el mAb RC-20 mostrando proteínas de esperma fosfopladas en residuos de tirosma Se solubilizó esperma humano fresco en amortiguador de tisis A, se separó por I EFFPAGE y se transfirió a una membrana PVDF Las fosfo-proteínas dominantes tuvieron un MW de 89-95 kDa y pl entre 5 5 y 5 8 También pueden verse varias proteínas manchadas más débilmente Las cabezas de flecha indican cinco grupos de fosfoproteínas, las cuales se marcaron vectopalmente (ver Tabla 1 ) La Figura 1 1 muestra una imagen de computadora compuesta de las 1 397 proteínas de espermatozoides humanos, las cuales podrían detectarse mediante manchado con plata siguiendo solubilización de NP-40/urea Noventa y cuatro de las noventa y ocho proteínas, las cuales fueron marcadas tanto por yodmación de superficie como biotmilación de superficie, podrían ser igualadas con proteínas manchadas con plata y están rodeadas Las características de estas proteínas están dadas en la Tabla 1 Esta Tabla es referida como el índice de Superficie de Esperma La Figura 1 2 muestra datos de microsecuencia de aminoácidos obtenidos por degradación de Edman y espectrometría de masa en tándem a partir de una proteína de esperma de 63 kDa , pl 4 3, eleg ida para diseño de ohgonucleótidos complementarios y complementarios inversos (SEQ I D NOS 1 6- 1 8, 1 2 , 1 9-20) A partir de esta información de microsecuencia se sintetizaron depósitos de iniciadores de oligonucleótidos degenerados para iniciar PCR [ver Fig 1 3] La Figura 1 3 muestra productos de PCR que resultan de la amplificación de RNA de testes humanos usando oligonucleótidos degenerados derivados de datos de microsecuencia de proteína de 63 kDa, pl 4.3 que revelan un producto de PCR prominente simple a aproximadamente 400 pb. La Figura 1 4 muestra una secuencia de DNA obtenida del clon derivado por RT-PCR, utilizando iniciadores degenerados, optim izados. Los números indican la posición de los pares de bases en el clon secuenciado y en el gene Calreticulin ; (c) designa el clon RT-PCR (SEQ ID NO: 25) al tiempo que (H) designa el cDNA de Calreticulin humano de GenBank (SEQ ID NO: 26) . La Figura 1 5 muestra microsecuencias derivadas por espectrometría de masa en tándem de proteína de superficie de esperma I-23 y oligonucleótidos complementarios y complementarios inversos (SEQ I D NO:27-40). La Figura 1 6 muestra una secuencia de DNA que codifica una porción de la proteína de superficie de esperma I-23 (SEQ I D NO:41 ). Esta secuencia de DNA fue obtenida a partir de la secuenciación de productos de PCR amplificados de DNA testicular humano usando depósitos de iniciadores degenerados sintetizados con base en las microsecuencias mostradas en la Figura 1 5. La Figura 1 7 es una Enciclopedia de 967 proteínas de esperma humano manchadas con plata en el rango de punto isoeléctrico de 3.5->6.5 , obtenidas por rastreo con láser y d igitalización por com putadora de electroforogramas de 2-D, en los cuales la primera dimensión fue enfoque iso-eléctpco La Figura 18 es una Enciclopedia de 435 proteínas de esperma humano manchadas con plata en el rango de punto isoeléctrico de 65->105 obtenidas por rastreo con láser y digitalización de electroforogramas de 2-D, en las cuales la primera dimensión fue electroforesis de gradiente de pH no de equilibrio DESCRIPCIÓN DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS De acuerdo con la presente invención pueden emplearse biología molecular convencional, microbiología, y química de proteínas y técnicas de DNA recombmante dentro de la habilidad de la técnica Tales técnicas se explican completamente en la literatura Ver, por ejemplo, Sambrook et al , "Molecular Cloning A Laboratory Manual" (Clonación molecular un manual de laboratorio) (1989), "Current Protocols in Molecular Biology" (Protocolos acutales en biología molecular) volúmenes l-lll [Ausubel, R M ed (1994)], "Cell Biology A Laboratory Handbook" (Biología celular un manual de laboratorio) Volúmenes l-lll [J E Celis, ed (1994))], "Current Protocols m Immunology" (Protocolos actuales en inmunología) Volúmenes l-lll [Coligan, J E , ed (1994)], "Oligonucleotíde Synthesis" (Síntesis de oligonucleótidos) (M J Gait ed 1984), "Nucleic Acid Hybpdization" [B D Hames & S J Higgins eds (1985)], "Transcpption and Translation" (Transcripción y traslación) [B D Hames & S J Higgins, eds (1984)], 'Animal Cell Culture' (Cultivo de células animales) [R I Freshney, ed (1986)] "Immobi zed Cells and Enzymes [IRL Press, (1986)] B Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (Una guía práctica para clonación molecular) ( 1 984) . Por lo tanto, si aparecen en la presente, los siguientes términos deben tener las definiciones expuestas a continuación. Un "replicón" es cualquier elemento genético (por ejemplo, plásmido, cromosoma, virus) que funciona como una unidad autónoma de replicación de DNA in vivo; es decir, capaz de replicación bajo su propio control . Un "vector" es un replicón, tal como plásmido, fago o cósmido, al cual puede unirse otro segmento de DNA con el fin de originar la replicación del segmento u nido. Una "molécula de DNA" se refiere a la forma polimérica de desoxiribonucleótidos (adenina, guanina, timina o citosina) ya sea en su forma de filamento simple, o como una hélice de doble filamento. Este término se refiere solo a la estructura primaria y secundaria de la molécula, y no la limita en cualquier forma terciaria particular. Así, este término incluye DNA de doble filamente encontrado, inter alia, en moléculas de DNA lineal (por ejemplo, fragmentos de restricción), virus, plásmidos y cromosomas. Al discutir la estructura de moléculas de DNA de doble filamento particulares, las secuencias pueden ser descritas en la presente de acuerdo a la convención ormal para dar solo la secuencia en la dirección 5' o 3' a lo largo del filamento no transcrito de DNA (es decir, el filamento teniendo una secuencia homologa al m RNA). U n "origen de replicación" se refiere a aquéllas secuencias de DNA que participan en la s intesis de DNA.

Una "secuencia de codificación" de DNA es una secuencia de DNA de doble filamento, la cual es transcrita y trasladada en un polipéptido m vivo, cuando es colocada bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas Los límites de la secuencia de codificación se determinan mediante un codón de inicio en el extremo 5' (amino) y un codón de paro de traslación en el extremo 3' (carboxilo) Una secuencia de codificación puede incluir, pero no está limitada a, secuencias procarióticas, cDNA de mRNA eucapótico, secuencias de DNA genómico de DNA eucapótico (por ejemplo, mam ífero), e incluso secuencias de DNA sintético Una señal de poliadenilación y una secuencia de terminación de transcripción usualmente se ubicaran en 3' a la secuencia de codificación Las secuencias de control de transcripción y traslación son secuencias reg uladoras de DNA, tales como, promotores, intensificadores, señales de poliadenilación , terminadores, y sim ilares, que proporcionan la expresión de una secuencia de codificación en una célula huésped Una "secuencia promotora" es una región reguladora de DNA capaz de ligar polimerasa de RNA en una célula e in iciar la transcripción de una secuencia de codificación corriente abajo (dirección 3') Para fines de definir la presente invención, la secuencia promotora se liga a su extremo 3' mediante el sitio de in iciación de transcripción y se extiende corriente arriba (dirección 5') para incluir el numero mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables por encima del soporte Dentro de la secuencia promotora se encontrará un sitio de in iciación de transcripción (conven ientemente definido mediante mapeo con nucleasa S) as i como domi nios de ligadura de protei na (secuencias de consenso) responsables de la ligadura de polimerasa de RNA. Los promotores eucarióticos contienen frecuentemente, pero no siempre, casillas "TATA" y casillas "CAT". Los promotores procarióticos contienen secuencias de Shine-Daigarno además de las secuencias de consenso -1 0 y -35. Una "secuencia de control de expresión" es una secuencia de DNA que controla y regula la transcripción y traslación de otra secuencia de DNA. Una secuencia de codificación está "bajo el control" de las secuencias de control de transcripción y traslación en una célula cuando la polimerasa de RNA transcribe la secuencia de codificación en mRNA, que se traslada entonces hacia la proteína codificada por la secuencia de codificación. Una "secuencia de señal" puede ser incluida antes de la secuencia de codificación. Esta secuencia codifica un péptido de señal, N-terminal al polipéptido, que comunica a la célula huésped para dirigir el polipéptido a la superficie celular o secretar el polipéptido en el medio, y este péptido de señal es cortado por la célula huésped antes de que la proteína deje la célula. Las secuencias de señal pueden encontrarse asociadas con una variedad de proteínas naturales para procariotes y eucariotes. El término "oligonucleótido", como se usa en la presente para referirse a la sonda de la presente invención, se define como una molécula comprendida por dos o más ribo- o desoxiribo-nucleótidos, de preferencia más de tres. Su tamaño exacto dependerá de muchos factores, los cuales, a su vez , dependen de la última función y uso del oligon ucleótido.

El termino "iniciador" como se usa en la presente, se refiere a un o gonucleótido, ya sea que ocurre de manera natural como en una digestión de restricción purificada o producido sintéticamente, el cual es capaz de actuar como un punto de iniciación de síntesis cuando se coloca bajo condiciones en las cuales la síntesis de un producto de extensión de iniciador, el cual es complementario para un filamento de ácido nucleico, es inducido, es decir, en la presencia de nucleótidos y un agente inductor, tal como una pohmerasa de DNA y a una temperatura y pH adecuados El iniciador puede ser ya sea de filamento simple o de filamento doble y de be ser suficientemente largo para iniciar la síntesis del producto de extensión deseado en la presencia del agente inductor La longitud exacta del iniciador dependerá de muchos factores, incluyendo temperatura, fuente de iniciador y uso del método Por ejemplo, para aplicaciones de diagnóstico, dependiendo de la complejidad de la secuencia objetivo, el iniciador de oligonucleótido normalmente contiene 15-25 o más nucleotidos, aunque puede contener menos nucleótidos Los iniciadores en la presente son seleccionados por ser "substancialmente" complementarios a diferentes filamentos de una secuencia de DNA objetivo particular Esto significa que los iniciadores deben ser suficientemente complementarios para hibpdar con sus respectivos filamentos En consecuencia, la secuencia iniciadora no necesita reflejar la secuencia exacta de la plantilla Por ejemplo, un frag mento de nucleótido no complementario puede unirse al extremo 5' del iniciador, siendo complementario al filamento el resto de la secuencia iniciadora De manera alternativa , secuencias mayores o bases no complementarias pueden i ntercalarse en el iniciador, siempre que la secuencia i niciadora tenga suficiente complementaridad con la secuencia del filamento para hibridar con la misma y formar con ello la plantilla para la síntesis del producto de extensión. Como se usa en la presente, los término "endonucleasas de restricción" y "enzimas de restricción" se refiere a enzimas bacterianas, cada u na de las cuales corta DNA de doble filamento a o cerca de una secuencia de nucleótidos específica . Una célula ha sido "transformada" por DNA exógeno o heterólogo cuando tal DNA ha sido introducido dentro de la célula. El DNA de transformación puede o no integrarse (enlazado de manera covalente) en el DNA cromosomal formando el genoma de la célula. En células de procariotes, levadura y mam íferos, por ejemplo , el DNA de transformación puede ser mantenido en un elemento episomal, tal como un plásmido. Con respecto a células eucarióticas, una célula establemente transform ada en una en la cual el DNA de transformación se ha integrado en un cromosoma , de manera que es heredado a células hijas a través de la replicación de cromosomas. Esta estabilidad se demuestra por la capacidad de la célula eucariótica para establecer l íneas de células o clones comprendidos por una población de células hijas conteniendo el DNA de transformación. Un "clon" es una población de células derivadas de una célula simple o un ancestro común por mitosis . U na "línea de células" es un clon de una célula primaria q ue es capaz de un crecimiento estable i n vitro por m uchas generaciones.

Dos secuencias de DNA son "substancialmente homologas" cuando al menos aproximadamente 75% (de preferencia , al menos aproximadamente 80% , y muy preferiblemente al menos aproximadamente 90 o 95%) de los nucleotidos se igualan sobre la longitud definida de las secuencias de DNA Las secuencias que son substancialmente homologas pueden ser identificadas al comparar las secuencias usando programa de cómputo estándar disponible en bancos de datos de secuencias, o en un experimento de hibridación Southern bajo, por ejemplo, condiciones severas como se definió para ese sistema particular Definir las condiciones de hibridación apropiadas está dentro de la habilidad de la técnica Ver, por ejemplo, Maniatis et al , supra, DNA Cloning, Vols I & I I , supra, Nucleic Acid Hybpdization, supra Dos secuencias de aminoácidos son "substancialmente homologas" cuando al menos aproximadamente 70% de los residuos de aminoácidos (de preferencia al menos aproximadamente 80%, y muy preferiblemente al menos aproximadamente 90 o 95%) son idénticos, o representan substituiciones conservadoras Una región "heteróloga" del constructo de DNA es un segmento identificable de DNA dentro de una molécula de DNA más grande que no se encuentra en asociación con la molécula mayor en naturaleza Así, cuando la región heteróloga codifica un gene de mamífero, el gene usualmente será flanqueado por DNA que no flanquea el DNA genómico mamífero en el genoma del organismo fuente Otro ejemplo de una secuencia de codificación heteróloga es un constructo, donde la secuencia de codificación por si m isma no se encuentra en la naturaleza (por ejemplo, un cDNA donde la secuencia de codificación genómica contiene intrones, o secuencias sintéticas teniendo codones diferentes que el gene natural) Las variaciones alélicas o casos de mutación que ocu rren de manera natural no dan lugar a una región heteróloga de DNA como se define en la presente Un "anticuerpo" es cualquier inmunoglobulma, incluyendo anticuerpos y fragmentos de los mismos, que se unen a un epitope específico El término abarca anticuerpos policlonales, monoclonales y quiméricos, los últimos descritos con mayor detalle en las patentes estadounidenses nos 4,816, 397 y 4, 186,567 Un "sitio de combinación de anticuerpo" es esa porción estructural de una molécula de anticuerpo comprendida por regiones variables e hipervapables de cadena pesada y ligera, que une específicamente un antígeno La frase "molécula de anticuerpo" en sus diversas formas gramaticales, como se usa en la presente, contempla tanto una molécula de inmunoglobulina intacta y una porción inmunológicamente activa de una molécula de mmunoglobulina Moléculas de anticuerpos ejemplares son molécu las de inmunoglobulinas i ntactas y aq uellas porciones de una molécula de mmunoglobulina que contiene el paratope, incluyendo aq uellas por ciones conocidas en la técnica como Fab, Fab' , F(ab')2 y F(v), dichas porciones son preferidas para usarse en los métodos diagnósticos y terapéuticos descritos en la presente Las porciones Fab y F(ab')2 de moléculas de anticuerpo se preparan media nte la reacción proteolítica de papaína y pepsina, respectivamente, en moléculas de anticuerpo substancialmente intactas por métodos que son bien conocidos. Ver, por ejemplo, la patente estadounidense no. 4, 342 , 566 para Theofilopolous et al. Las porciones de molécula de anticuerpo Fab' también son bien conocidas y son producidas a partir de porciones F(ab')2 seguido por reducción de las uniones disulfuro enlazando las dos porciones de cadena pesada como con mercaptoetano, y seguido or alquilación del mercaptano de proteína resultante con un reactivo, tal como yodoacetamida. En la presente se prefiere un anticuerpo conteniendo moléculas de anticuerpo intactas. La frase "anticuerpo monoclonal" en sus diversas formas gramaticales se refiere a un anticuerpo que tiene solo una especie de sitio de combinación de anticuerpo capaz de inmuno-reaccionar con un antígeno particular. Un anticuerpo monoclonal exhibe así normalmente una afinidad de ligadura simple para cualquier antígeno con el cual inmuno-reacciona. Un anticuerpo monoclonal puede contener, por lo tanto, una molécula de anticuerpo teniendo una pluralidad de sitios de combinación de anticuerpo, cada uno inmunoespecífico para un antígeno diferente; por ejem plo, un anticuerpo monoclonal biespecífico (quimérico). La frase "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y com posiciones que son fisiológ icamente tolerables y que normalmente no producen una reacción alérgica o adversa similar, tal como molestias gástricas , vértigo y similares, cuando se admin istran a un humano .

La frase "cantidad terapéuticamente efectiva" como se usa en la presente significa una cantidad suficiente para prevenir, y de preferencia, reducir por al menos aproximadamente 30 porciento, más preferiblemente por al menos 50 porciento, m uy preferiblemente por al menos 90 porciento, un cambio clínicamente significativo en la actividad de fase S de una masa celular objetivo, u otra característica de patología tal como, por ejemplo, presión sangu ínea elevada, fiebre o cuenta de glóbulos blancos como puede atender su presencia y actividad Una secuencia de DNA está "enlazada operativamente" a una secuencia de control de expresión cuando la secuencia de control de expresión controla y regula la transcripción y traslación de esa secuencia de DNA El término "enlazado operativamente" incluye tener una señal de inicio apropiada (por ejemplo, ATG) en frente de la secuencia de DNA a ser expresada y mantener el marco de lectura correcto para permitir la expresión de la secuencia de Dna bajo el control de la secuencia de control de expresión y producción del producto deseado codificado por la secuencia de DNA Si un gene que uno desea insertar en una molécula de DNA recombmante no contiene una señal de inicio apropiada, tal señal de inicio puede ser insertada en frente del gene E l termi no "condiciones de h ibridació n estándares" se refiere a condiciones de temperatura y sal substancialmente equivalentes a 5 x SSC y 65°C tanto para h ibridación como lavado Sin embargo, un experto en la técnica apreciará que tales "condiciones de hibridación estándares" son depend ientes de las condiciones particulares incluyendo la concentración de sod io y magnesio en el amortiguador, concentración y longitud de la secuencia de n ucleótidos, porcentaje de desigualdad , porcentaje de formamida, y similares. También es importante en la determinación de las "condiciones de hibridación estándares" si las dos secuencias de hibridación son RNA-R NA, DNA-DNA O RNA-DNA. Tales condiciones de hibridación estándares se determinan fácilmente por alguien experto en la técnica de acuerdo a fórmulas bien conocidas, en donde la hibridación normalmente está 10-20°C por debajo de la Tm predicha o determinada con lavados de mayor severidad , si se desea . El conocimiento detallado de las moléculas de superficie de esperma es útil , no solo para ayudar al entendimiento de los complejos procesos de diferenciación y maduración, sino también porque la membrana de plasma es crítica para la función del esperma. La combinación de marcado vectorial y solubilízación de detergente en el método de la presente invención permite el análisis de relativamente pocas células , bacterias o virus, permitiendo variaciones día a día en patrones de prote ínas específica (inducidos fisiológica o experimentalmente) a ser estudiados en una m uestra o individuo simple. Además, las técnicas de marcado vectorial proporcionan información concerniente a la orientación exofacial de proteínas plasmalemales, lo cual no puede lograrse mediante la técnica de cavitación de nitrógeno sola. Por primera vez se analizan en un solo método tanto las proteínas de espermatozoides humanos acidas, neutrales y básicas , y se comparan dos métodos para marcar las proteínas de superficie expuestas. Puede establecerse una base de datos de 2-D extensa para proteínas de superficie de membrana , particularmente proteínas de espermatozoides humanos . Una manera en la cual puede ponerse un entendimiento extenso de la composición de la membrana de plasma de esperma para uso inmediato, está en el diseño de vacunas anticonceptivas. El conocimiento de las moléculas accesibles para anticuerpos y mediadores de células T en la superficie de un objetivo biológico proporciona una base racional para el desarrollo de vacunas. En el caso de vacunas anticonceptivas basadas en antígenos de espermas, se buscaron respuestas inmunes las cuales aglutinan, inmovilizan o romper esperma o interactúan con proteínas accesibles en la superficie para bloquear casos en el proceso de fertilización . Fueron las hembras las que desarrollaronn anticuerpos para proteínas de superficie de esperma en la secreciones de cerviz, útero y oviducto, el progreso del esperma a través del tracto genital femenino puede ser prohído a varios niveles anatómicos. La vacuna anticonceptiva ideal basada en esperma puede ser prevista para que contenga una mezcla de antígenos de esperma derivados de todos los principales dominios del plasmalema de esperma, incluyendo, cabeza, pieza central y cola , así como la membrana acrosomal interna, la cual forma la membrana limitante sobre la cabeza del esperma siguiendo ia reacción de acromosa (9) . Aunque los anticuerpos monoclonales o policlonales que bloquean funciones de esperma han conducido a la identificación de varios candidatos de inmunógenos de vacuna de esperma tanto en el plasmalema como asociados con la membrana acrosomoal interna ( 1 0), no se ha intentado hasta ahora un análisis extenso del rango completo de inmunógenos de superficie de esperma humano potenciales. La electroforesis en gel de dos dimensiones como se desarrolla por O'Farrell ( 1 1 , 1 2) , el cual es incorporado en la presente por referencia en su totalidad, en combinación con análisis en gel computarizado, puede usarse para análisis de mezclas complejas de polipéptidos. El programa de computadora especializado facilita el análisis cuantitativo de geles de dos dimensiones, incluyendo la capacidad para comparación de varias imágenes de computadora, lo cual permite una descripción detallada de alteraciones en patrones de proteína resultando de manipulaciones experimentales o estímulos ambientales cambiantes (1 3-17) . La presente invención identifica las principales proteínas de superficie mediante marcado vectorial seguido por extracción con detergente, electroforesis de 2-D y análisis de imagen en computadora. De la información obtenida usando este método, puede obtenerse un índ ice enciclopédico de proteínas de superficie celular, enciclopedia de proteína de superficie de membrana o enciclopedia de proteínas de esperma , que asigna números a las diversas proteínas ( 1 397 en total para proteínas de esperma) , define sus coordinados (Mr y pl) y lista su "intensidad integrada" , la cual es una medición de la intensidad de manchado con relación a las demás proteínas. La membrana celular o microbiana puede romperse usando cualquier método conocido en la técnica, incluyendo tratamiento con detergente, ru ptura usando mortero, sonicación y similares. Los detergentes pueden inclu ir Nonidet P-40 (NP-40) , TWEEN , SDS y similares. También pueden usarse desnaturalizantes, tales como urea, entre otros. El marcado puede realizarse usando cualquier marca adecuada para marcado de proteínas de superficie. Ejemplos de marcas incluyen yodo (I 125) y biotina. Son "objetivos primarios" para análisis adicional , incluyendo secuenciación, las proteínas que se marcan, de preferencia, usando más de un método. La separación de proteínas usando electroforesis en gel de dos dimensiones (2-D) es bien conocida en la técnica . Los geles de 2-D preparativos pueden correrse de manera que las cantidades importantes (secuenciables) de proteínas pueden obtenerse de manchas identificadas por el análisis en gel. Cuando es necesario, la separación electroforética de proteínas se logra al variar las concentraciones de anfolina de la primera dimensión, lo cual permite que un área restringida del mapa de 2-D sea expandida para llenar el formato de gel de 2-D completo. Esto permite una mayor separación de las proteínas dentro de una región dada del espectro de pl y Mr, incrementando así la resolución en regiones donde pueden amontonarse muchas proteínas, y permite mayores cargas de proteína, optimizando así el rendimiento. Las proteínas se manchan con Ponceau, Coomassie, plata u oro dependiendo de las características y usos subsecuentes de cada proteína. Después de l a electroforesis en geles de 2-D, las proteínas son "electroblotted" en soportes de membrana o digeridos en el gel de acrilamida con tripsina o l isil peptidasa para producir péptidos por degradación de Edman o espectrometría de masa en tándem .

Las bases de datos para las proteí nas de superficie pueden servir como una referencia en un análisis futuro de proteínas de membrana de plasma y como una guía para la selección de objetivos para microsecuenciación o generación de anticuerpos Los antígenos que son candidatos para microsecuenciación incluyen aquéllos que son reactivos con suero infértil o vasectomía Otro candidato de microsecuenciación primario es antígeno que aglutina esperma 1 [SAGA-1 ] mAb MES-8 aglutina 1 00% del esperma en el semen humano, impide la penetración de esperma en la mucosa cervical, inhibe la penetración de óvulos de hámster por esperma humano, inhibe la fertilización in vitro de óvulos de ratón con esperma isólogo e inhibie la ligadura de esperma humano a zona pellucida humana por 70% El antígeno SAGA-1 está ubicado en la superficie del esperma completo Los métodos de purificación por afinidad también pueden ser usados para enriquecer proteínas de interés que están presentes en abundancia relativamente baja Células, bacterias o virus recolectados, lavados, pueden ser marcados vectopalmente con N H S-SS-Biotina (alternativamente con N HSO Immobiotina), una sonda de biotmilación con dis ulfuro reducible Las proteínas son solubi zadas bajo condiciones no red uctoras y los complejos de superficie biotinilada son precipitados con perlas recubiertas con estreptavidina inmovilizada Las proteínas preci pitadas pueden ser levigadas por reducción siguiendo lavado y se analizan med iante electroforesis de dos dimensiones La m icrosecuenciacion de prote í nas de superficie biotin ilada enriq uecidas con este método de perlas de afi nidad puede intentarse a partir de geles de 2- D preparativos pesadamente cargados o siguiendo la separación de H PLC de fase inversa. La secuenciación de manchas de proteína se realiza mediante cualquier método conocido en la técnica. De preferencia, la secuenciación se realiza por degradación de Edman y espectrometría de masa, de preferencia, espectrometrá de masa en tándem (TMS). Las manchas de proteína ensuciadas con Coomassie en membrana PVDF se cargan en un cartucho de mancha para análisis de secuencia. Para obtener una secuencia interna, las proteínas son digeridas en el gel en particular con lisil endopeptidasa u otras proteasas, y los péptidos se extraen y separan en una columna, particularmente una columna de C 1 8 de 1 mm de diámetro. La masa y pureza de los péptidos separados se determina por matriz asistida con desorción láser y tiempo de ionización de espectrometría de masa de vuelo usando un Finningan LaserMAT. La solución conteniendo el péptido separado de interés puede ser aplicado a un filtro de fibra de vidrio, el cual ha sido sometido a ciclos de acondicionamiento después de recubrimiento con Polybrene. La secuencia de aminoácidos NH-terminal del péptido del péptido se determina con un secuenciador de proteínas. Las proteínas intactas [enteras] pueden someterse a veinte a treinta ciclos de degradación de Edman, al tiempo que la secuenciación de péptidos ¡nternos procede tan lejos como sea apropiado basado en su masa , como se ca lculó a partir de la espectrometría de masa . El método de secuenciación puede emplear q u ímica de Edma n estándar, en la cual el a m inoácido NH-terminal es derivado con fenilisotiocianato y entonces se corta con ácido trifluoroacético para dar un aminoácido de anilinotiozolinona , el cual se convierte subsecuentemente con ácido a un aminoácid o de feniltiohidantoína (PTH). Los aminoácidos de PTH pueden ser identificados y cuantificados mediante una Applied Biosystems 1 40 HPLC, particularmente al usar una columna de C 1 8 de 2.1 mm de diámetro optimizada para análisis de aminoácidos de PTH . La secuenciación interna de alta sensibilidad puede realizarse por espectrometría de masa en tándem. Las manchas de prote ínas son reducidas y alquiladas en el gel de policarilam ida antes del tratamiento con proteasa (normalmente tripsina) en bicarbonato de amonio. Los péptidos producidos por este medio pueden extraerse entonces del poliacri lamida, particularmente con acetonitrilo al 50%/ácido fórmico al 5% , y el extracto se concentró entonces casi a sequedad y se reconstituyó, de preferencia, en ácido acético al 1 % . Los péptidos pueden ser analizados en un sistema de espectrometría de masa LC-electroatomización , particularmente usando 75 g de columna de H PLC capilar i.d . interfaseada a un espectrómetro de masa de cuadrupolo en tándem de ionización de electroatomización Finnigan MAT TSQ7000. Los resultados pueden ser analizados para determ inar los pesos moleculares de los péptidos, y la información utilizada para reprogramar el espectrómetro de masa en tándem para el análisis de disociación colisonalmente activada (CAD) de péptidos específicos . En el experimento de CAD, un ion de una proporción vaga dada (m/z) es seleccionada en masa por el primer analizador de masa. Este proceso selecciona el péptido para secuenciación basada en su peso molecu l ar y elimi na de manera efectiva del análisis los demás péptidos. El peptido seleccionado es fragmentado por colisión con átomos de argón y los productos de esas reacciones de fragmentación son analizadas por masa por el segundo analizador de masa del sistema de espectrómetro de masa en tándem Esto prod uce un espectro de masa de CAD de la secuencia de aminoácidos del péptido El proceso se repite bajo control de computadora para obtener la información de secuencia para cada péptido en la digestión La secuenciación por espectrometría de masa es muy sensible y puede producir datos de secuencias internas de muestras las cuales contienen 1 a 1 0 pico moles de material de inicio El uso del primer filtro de masa del espectrómetro de masa en tándem separa los diversos peptidos, lo cual resulta de la digestión de la proteína, evitando así el paso de cromatografía necesario para obtener péptidos puros en el método de secuenciación de Edman Sin embargo, la secuenciación de Edman puede obtener datos del extremo N de una proteína intacta (si el extremo NTH no está bloqueado) produciendo treinta, o en algunos casos, más residuos de aminoácidos Aunque menos sensible que la secuenciación de espectrometría de masa, la degradación de Edman puede secuenciar péptidos más largos que el espectrómetro de masa, y distingue fácilmente la leucma e isoleucma, donde el espectrómetro de masa no lo ha ce El método de Edman requiere purificación del péptido antes de ser cargado en el instrumento destacando la necesidad de separar y concentrar proteí nas cuidadosamente mediante electroforesis de 2-D preparativa El método de Edman req uiere aproximadamente 1 0 a 1 5 pmoles de material ~> de in icio para lograr secuencias internas de suficiente longitud para diseñar oligonucleótidos . Sin em bargo, tan poco como 2 pmoles son suficientes para análisis de secuencia amino terminal larga de proteínas de longitud completa. De la información de secuencia de aminoácidos obtenida , pueden diseñarse oligonucleótidos, de preferencia, oligonucleótidos degenerados representando todas las combinaciones de codones posibles de la secuencia (o de manera alternativa, usando inosina en la tercera posición en el codón) , y tales oligonucleótidos pueden ser usados para clonar por hibridación a genotecas conteniendo cDNA que codifica proteínas de superficie de membrana, o amplificación por reacción en cadena de polimerasa (PCR), de preferencia, RT-PCR. La aproximación de RT-PCR uti lizando dos iniciadores de anclaje tiene las ventajas de la simplicidad y velocidad del protocolo de PCR . Sin embargo, debido a que el código genético es degenerado, la selección de oligonucleótidos basada en secuencias de aminoácidos conocidos puede req uerir la síntesis de u n gran número de sondas correspondientes a una secuencia de aminoácidos dada. Se desean al menos dos secuencias de aminoácidos de 7 o más residuos en long itud de cada proteína. [Sin embargo, en aquéllos casos donde no se obtienen dos secuencias, puede usarse u na secuencia en conjunción con 5' y 3' RACE]. La longitud de iniciador óptima para PCR es 20 a 30 nucleótidos . Sigue que debe obtenerse un m ínimo de 7 aminoácidos contiguos de secuencia inequívoca de al menos 2 ubicaciones en una estructura primaria de prote ína dada con el fin de diseñar dos in iciadores , los cuales son de al menos 20 bases de long itud.

Una combinación de factores debe ser considerada para detectar la composición exacta de cada oligonucleótido , y cual porción de una secuencia de am inoácidos dada será elegida para enfocarse, incluyendo: el contenido de G-C del oligonucleótido propuesto, el número de residuos de aminoácidos confiables que han sido secuenciados, y la temperatura de fusión que es inherente a un depósito de oligonucleótidos propuesto. Con el fin de fabricar oligonucleótidos que caen dentro del tamaño óptimo de 20-30 bases en longitud , un tramo m ínimo de al menos 7 aminoácidos debe ser obtenido por microsecuenciación . Si pueden obtenerse secuencias de ami noácidos más largas existen más oportunidades para diseño de oligonucleótidos óptimos. U na secuencia de proteína N-terminal y una interna o dos secuencias de aminoácidos internas permitirán la creación de depósitos de oligon ucleótidos de regiones separadas del RNA a ser am plificadas con el fin de facilitar RT-PCR de un fragmento de cDNA de longitud adecuada. Las sondas pueden em plearse en varias formas: 1 ) dos conju ntos de oligonucleótidos anclados pueden usarse en reacciones de RT-PC R para amplificar un frag mento de cDNA, el cual a su vez: puede ser usado para clasificar genotecas de cDNA para obtener cDNAs de longitud completa, 2) u no o más conjuntos de oligonucleótidos pueden ser usados para anclar una reacción de PCR-RACE para amplificar un frag mento de cDNA 3' o 5' , el cual también puede ser usado para clasificar genotecas de cDNA; 3) una combinación de PC R y PCR-RACE puede ser usada para obtener cDNAs de long itud com pleta al j untar secuencias de reacciones de PCR por separado : y 4) pueden usarse oligonucleótidos para clasificar genotecas de cDNA directamente .

En circunstancias en la cuales se ha obtenido una secuencia de aminoácidos de la proteína desconocida, puede emplearse un protocolo RACE modificado usando un depósito de oligonucleótidos optimizado de "anclaje" simple para derivar ya sea secuencias 3' o 5' corriente arriba o corriente debajo de la secuencia conocida. En este método, puede usarse una secuencia de aminoácidos interna simple para diseñar oligonucleótidos complementarios inversos ya sea para filamentos de sentido (5'-RACE) o antisentido (3'-RACE) propuestos. El segundo oligonucleótido para anclar la reacción de amplificación se deriva de secuencias conocidas de enlazadores colocados en los extremos 5' o 3' de genotecas de cDNA comercialmente disponibles. Esta metodolog ía está disponible ahora en forma de conjunto (Marathon-Ready cDNAS R; Clonetech). Las genotecas de cDNA adecuadas incluyen: 1 ) 5'-Stretch (Clonetech) , 2) ?-zap y 3) ?-gt 1 1 genotecas de cDNA. Las tres genotecas han sido usadas para recuperar ORFs de longitud completa de varías proteínas de testes. La metodolog ía de sondear genotecas con sondas de cDNA amplificadas está bien documentada . Brevemente, los oligonucleótidos pueden ser marcados en el extremo con (?-32P)-rATP y cinasa de polinucléotido de acuerdo a las instrucciones de los fabricantes, purificarse y usarse para hibridación . Como un control positivo , pueden sondearse Northern Blots primero para establecer si el prod ucto de PCR reconocerá un mensaje de m RNA específico dentro del RNA total . La genoteca de cDNA de 5'-Stretch (Clonetech) puede platinarse de acuerdo a las i nstrucciones del fabricante e n 1 50 m m de agar y levantarse por d u plicado con filtros M S I (Fisher) Entonces , los filtros pueden reticularse con UV, prehibridarse e hibridarse en soluciones estándares durante la noche. Los filtros pueden ser expuestos a pel ícula de rayos X y los clones positivos resultantes pueden ser identificados de los filtros por duplicado para eliminar falsos positivos . Las pel ículas son realineadas entonces con las placas de cultivo original y se toman los núcleos. Las placas primarias pueden ser replatinadas y reclasificadas hasta que todas las placas en una placa dada dan una respuesta positva. Deben retenerse muestras del fago en cada paso de purificación a -20°C. Una vez aislados, los clones serán amplificados por PCR utilizando iniciadores fabricados para secuencias de fagos adyacentes al sitio de clonación tuilizado durante la fabricación de genoteca. Las inserciones de cDNA amplificadas por PCR pueden ser restringidos por enzima y los fragmentos resultantes se separan y dimensionan en geles de agarosa. El análisis de restricción de clones separados puede producir fragmentos de tamaño similar, prestando seguridad de que el oligonucleótido degenerado ha reconocido clones idénticos. Puede hacerse la clasificación directa de genotecas de cDNA con oligonucleótidos degenerados, pero generalmente solo se realiza si las aproximaciones basadas en PCR no han funcionado. Puede elegirse una mezcla de oligonucleótidos marcados en el extremo con 32P basado en codones predispuestos filogenéticamente que codifican la microsecuencia deaminoácidos. Los oligonucleótidos son d iseñados de acuerdo a los parámetros descritos antes con el énfasis colocado en desarrollar un depósito con tan poca degeneración como sea posible (<300) . Se han obtenido resultados positivos de depósitos de oligonucleótidos de 1 7- oligómeros. En el caso de que el depósito de oligonucleótido sea mayor que su corte, pueden usarse depósitos múltiples que contengan todas las posibilidades de combinación. Un experimento de control primario puede realizarse al hibridar primero el o los depósitos marcados en el extremo para Northern blots conteniendo poli-(A)" mRNA para determinar las condiciones de hibridación que producen bandas positivas sobre el lavado y exposición a películas de rayos X. Una vez que las condiciones de hibridación y lavado (sal y temperatura) están establecidas, las genotecas de cDNA listadas antes pueden platinarse por duplicado, levantarse y sondearse con los depósitos de oligonucleótidos marcados en condiciones como es sugerido por Ausubel. Los levantamientos por duplicado pueden comararse para eliminar falsos positivos y se puede realizar una clasificación secundaria y terciaria para asegurar la pureza y corrección del clon propuesto. Si está disponible, los mismos levantamientos de genoteca pueden ser reclasificados con una segunda mezcla de oligonucleótidos derivada de otra región de la proteína desconocida De manera alternativa, los anticuerpos para las proteínas de superficie de membrana pueden ser usados para clasificar genotecas de expresión . Los antisueros monoespecíficos pueden ser generados a manchas de proteínas aisladas de geles de 2-D. Pueden tomarse dos aproximadaciones: 1 ) los animales pueden inmunizarse con proteínas que contienen núcleos de gel de acrilamida , los cuales son emulsificados en auxiliar completo de Freu nd de acuerdo a inmunización intramuscular estándar; o 2) tiras de nitrocelulosa conteniendo proteínas de esperma transferidas específicas pueden implantarse su bcutánea e intrapeptonealmente después de sumergir la tira en auxiliar completo de Freund Alícuotas de los sueros monoespecíficos generados por estos métodos pueden ser Western blotted para determ inar un título de punto final y para verificar la especificidad para la mancha de proteína de interés Si un antisuero dado tiene un título bajo, pueden crearse soluciones de anticuerpo enriquecida usando la técnica de Olmstead, la cual emplea proteínas ligadas a nitrocelulosa de una banda de proteína específica o mancha para purificar por afinidad anticuerpos Las genotecas de expresión pueden ser platinadas en suficientes números para considerar los tres marcos de lectura en ambas direcciones (6 X la densidad usada para sondeo de nucleótidos) , hacerse crecer a 37°C durante 3-4 horas antes de la inducción con filtros empapados con I PTG 1 0 mM , e incubarse a 42°C El suero monoespecífico y el suero pre- inmune del animal idéntico pueden absorbidos dos veces durante la ñocha a 4°C con E coli ligada a Spharose activada con bromuro de cianógeno, con el fin de eliminar la reactividad con proteínas de E coli Los clones de fago que soportan cDNA conteniendo las inserciones más largas por análisis de restricción se convierten entonces a forma de plásmido El DNA de plásmido altamente purificado necesario para secuenciación precida de tramos largos puede prepararse mediante amplificación de bacterias q ue soportan el plasmido en cu ltivos a gran escala (>1 00 ml) , seguido por centpgufación de equilibrio con CsCI por metodolog í as estándares Los iniciadores estándares para secuencias de plasmido agrupando el sitio de clonación son fabricados para ser usados para secuenciación . La secuenciación se realiza de preferencia mediante el étodo de terminación de didesoxi-cadena utilizando un conjunto Sequenase®. La secuenciación procede en ambas direcciones y se fabrican nuevos iniciadores específicos de cDNA para secuencias internas y la secuenciación continúa hasta que las secuencias se traslapan . De manera alternativa, puede conducirse secuenciación de cuatro colores en un secuenciador de DNA automatizado Applied Biosystems Prism 377. Puede buscarse un marco de lectura abierto mediante análisis por computadora , así como un sitio de inicio putativo para determinar si el clon es de longitud completa. Además, la secuencia original de aminoácidos obtenidos por microsecuenciación debe ser identificada. En el caso de que las secuencias no puedan ser derivadas, con el fin de permitir derivación de RT-PCR "de doble ancla" de clones de cDNAs, oligo-d(T) puede usarse como el segundo oligonucleótido de "anclaje" . Ocasionalmente, algunas áreas de clones producen resultados ambiguos debido a las compresiones. En este caso las secuencias leíbles pueden ser obtenidas usando el conjunto de secuenciación TaqTrack® (Promega) que permite que se realicen reacciones de secuenciación a 72°C en lugar de a 37°C. Temperaturas mayores durante la etapa de reacción usualmente resultan en fusión más confiable de cualquier área potencial de filamento simple y producen secuencias lúcidas, confiables. Las secuencias también pueden ser comparadas con bancos de datos de genes para buscar la identidad u homolog ía con proteínas conocidas.

Para valorar la especificidad de tejido putativo de antigenos en modelos humanos y de primates, puede emplearse análisis de Northern blot de RNA de órganos humanos y de monos mayores El RNA total puede aislarse de varios tejidos almacenados a -70°C Se purifica pol?(A+) RNA de RNA total por cromatografía por ol?go-d(T) El RNA puede ser concentrado por precipitación con etanol antes de la resuspensión en ag ua destilada estéril (105 ml) La cantidad de poli A+ RNA en cada muestra puede cuantificarse al leer su densidad óptica a 260 nm [OD 1 0=40 mg/ml] Se separan cantidades iguales de muestras de poli A+ RNA de cada tejido a ser probado (por ejemplo, 2 mg) en un gel de agarosa/formaldeh ído desnaturalizante y el RNA se transfiere a nylon Después de enjuagar el nylon durante 5 min en 2X SSC, el RNA es reticulado al nylon con luz UV El nylon es preh ibpdado y entonces es hibpdado durante la noche a 65°C en amortiguador de hibridación fresco conteniendo 1 0 mg/ml de sonda marcada con 32P-dCTP Las sondas pueden consistir de cDNA para el antígeno bajo sondas de estudio o control de ß-actma o ciclofilina Las sondas pueden marcarse mediante iniciación aleatoria usando un protocolo y conjunto comprado a Promega Cuando es necesario , deben probarse tanto condiciones de baja severidad como de alta severidad Las auto-radiografías son expuestas usando una pantalla de intensificación Siguiendo la hibridación con una sonda de prueba las manchas de nylon son rayadas y resondeadas con u no de los controles (beta-actina o ciclofilma) para verificar una carga igual de RNA La especificidad de tejido de ant igenos tam bién puede ser valorada usando RNA de cada tej ido q ue se transcribe de manera inversa y los cDNAs resultantes son amplificados por la reacción en cadena de polimerasa (PCR). Pueden usarse iniciadores específicos para el RNA de interés, que mapean la iniciación y terminación de traslación , respectivamente. Un control positivo puede hacer uso de iniciadores específicos de beta-actina, seleccionados en base a las regiones conservadas en cDNAs de beta-actina y se separan por 1 98 nucleótidos de secuencia intermedia. Los productos de PCR son visualizados y sus tamaños estimados siguiendo manchado con bromuro de etidio. Si los productos de PCR corresponden actualmente al material de interés pueden determinarse por hibridación en southern blots con cDNAs específicos para el antígeno bajo estudio. La especificidad de tejido de antígenos puede valorarse todavía en otra manera mediante estudios inmunohistoqu ímicos, de preferencia empleando anticuerpos purificados por afinidad . Un banco de tejidos incrustados con parafina puede ser recolectado y mantenido Las proteínas pueden ser localizadas en el banco de tejidos mediante marcado con inmunoperoxidasa de secciones incrustadas con parafina. Los tejidos pueden ser fijados durante varias horas con 1 0% de formalina amortiguada neutral (Sigma). El tejido es deshidatado a través de una serie de etanol, incrustado en parafina , seccionado y montado en portaobjetos. Antes de usarse, a las secciones se les quita la cera, se rehidratan y se tratan con 0.25% de peróxido de hidrógeno para bloq uear la actividad de peroxidasa endógena . Los sitios de l igadura de proteín a no específicos pueden ser bloqueados al incubar los portaobjetos en PBS con 5% de suero de cabra normal (NGS). Los portaobjetos son incubados ya sea con anticuerpos policlonales de conejo purificados por afinidad generados para la proteína recombi nante, o suero pre-inmune de control diluido en PBS-NGS y lavado, y entonces incubados con lgG//lgM anti conejo de cabra conjugada con peroxidasa en PBS-NGS. Los portaobjetos se lavan con PBS t y las proteínas inmuno-reactivas pueden ser visualizadas por manchado con substrato de peroxidasa TrueBlu (KPL) o manchado intensificado con oro. La presencia de un precipitado azul o negro indica proteína(s) inmuno-reactiva(s). En el análisis de microsecuencia de proteína de superficie de esperma realizado a la fecha , se han encontrado homolog ías para proteína de choq ue con calor 90 alfa (82%), proteína que liga gastrina (94.7%), calreticulina humana ( 1 00% con 1 5 aminoácidos), proteína de cubierta fibrosa de ratón (64%) , y precursor de componente am íloide de suero. Aproximadamente 40% de las proteínas mícrosecuenciadas parecen ser novedosas . La Tabla I muestra los coordinados de las proteínas de superficie de esperma novedosas.

Tabla I Proteínas de superficie m icrosecuenciadas de la Enciclopedia de Esperma [ver Tabla 1 1 para proteínas de superficie adicionales] E=deg radac?ón de Edman TMS=espectrometría de masa en tándem * # de secuencias de péptidos obtenidas , rango de longitud de las secuencias Las proteínas de superficie de membrana identificadas por el presente método tienen tanto usos diagnósticos como terapéuticos En casos donde se desea reducir o inhibir la ligadura de la proteína de superficie de membrana a u na célula u otro objetivo, un inhibidor apropiado, incluyendo anticuerpos para la proteína de superficie de membrana , podría ser introducido para bloquear la interacción de la proteína de superficie de membrana con un ligando o receptor para la misma. Los agentes que exhiben ya sea m ímica o antagonismo para las proteínas de superficie de membrana o controlan su producción, pueden prepararse en composiciones farmacéuticas, con un portador adecuado y a una fuerza efectiva para administración por varios medios, a un paciente que experimenta una condición médica adversa asociada con la presencia de la célula , bacteria o virus objetivo, para el tratamiento de la misma. Puede utilizarse una variedad de técnicas administrativas, entre ellas técnicas parenterales , tales como inyecciones subcutáneas, intravenosas e intraperitoneales, cateterizaciones y similares. Cantidades promedio de las proteínas de superficie de membrana o sus subunidades pueden variar, y en particular deben basarse en las recomendacionesy prescripción de un médico o veterinario calificado. En una modalidad preferida , la invención se dirige a la admin istración de las proteínas de superficie de membrana o anticuerpos para las mismas, para inhibir lainteracción de una célula de esperma con un huevo, para inhibir el transporte de esperma dentro del tracto reproductivo femenino , o para inmovilizar esperma, es decir, como un anticonceptivo. Las prote ínas de superficie de membrana y anticuerpos incluyendo tanto anticuerpos monoclonales como policlonales , pueden poseer ciertas aplicaciones diagnósticas y pueden, por ejemplo, ser utilizadas para el fin de detectar y/o medir condiciones tales como infección bacteriana o viral, inmunidad a células de esperma o similares Por ejemplo, las prote ínas de superficie de membrana o sus subunidades pueden usarse para producir tanto anticuerpos policlonales como monoclonales para ellos mismos en una variedad de medio celular, mediante técnicas conocidas, tales como la técnica de hibpdoma util izando, por ejemplo, Imfocitos de bazo de ratón fusionados y células de mieloma De igual manera, pueden descubrirse o sintetizarse pequeñas moléculas que imitan o antagonizan la o las activadades de las proteínas de superficie de membrana de la invención , y pueden ser usadas en protocolos doiagnósticos y/o terapéuticos Como una alternativa para generar anticuerpos policlonales para proteínas completas , pueden obtenerse suficientes secuencias de aminoácidos a partir de la microsecuenciación para perm itir el desarrollo de inmunógenos de péptidos sintéticos Estos inm unógenos de péptidos pueden ser usados como agentes inmunoanticonceptivos De manera alternativa, si no se logra clonar una proteína de interés usando RT-PCR, o sondeo de genoteca directo con oligonucleótidos o anticuerpos pohclonales como se preparó antes, pueden generarse antisueros anti-péptidos para péptidos quiméricos En esta estrategia, la secuencia de aminoácidos puede ser conjugada a un epitope de célula T promiscuo de toxoide de tétano, VD DALRNSTKI YSYFPSV (SEQ I D NO 1 ) , usando un enlazador, GPSL (SEQ I D NO 2) , intermedio El antisuero antipéptido puede ser usado entonces para clasificar genotecas de expresión de cDNA Para la generación de anticuerpos policlonales para antígeno recombinante, conejos hembras blancos de Nueva Zelanda pueden recibir antigeno recombinante (aproximadamente 500 µg) en auxiliar de Freund Completo (una vez) e Incompleto (cinco) para un total de seis inyecciones en intervalos de tres semanas. El suero puede ser obtenido semanalmente después de la segunda inyección. Para la generación de anticuerpos purificados por afinidad, puede usarse sepharose activada con bromuro de cianógeno (Sigma Chemical Co, St Louis MO) como la fase inmovilizante para el antígeno recombinante purificado. El anticuerpo policlonal se bombea sobre la columna de afinidad de antígeno para perm itir que se lig ue el anticuerpo. El anticuerpo ligado es levigado, y las fracciones son monitoreadas por absorbancia UV. Las fracciones pueden ser depositadas y entonces manchadas con reactivos de Ig anti-conejo para demostrar cuales de las bandas son Ig purificada. La titulación de punto final de ELISA de los diversos lotes de igG purificada puede correrse a concentraciones de proteína idénticas contra una cantidad constante de antígeno recombinante para demostrar la retención de ligadura de antígeno . En estudios de antígenos de esperma , anticuerpos purificados por afinidad para antígenos de esperma recombinantes pueden hacerse inmuno-reaccionar con Western blots de geles de 2-D cargados con extractos de membrana de esperma . Los ensayos funcionales de esperma pueden ser realizados para evaluar los anticuerpos purificados por afinidad al antígeno recombinante para reaccionar con el antígeno natural en la superficie de esperma y para afectar la o las funciones del esperma Estos ensayos pueden incluir localizacion de antigenos en el esperma por inmunofluorescencia y confirmación de ubicación de superficie por FACS, purebas de esperma/huevo [Ensayo de Penetración de Esperma] y esperma/zona de interacción [ensayo de Hemi-zona], aglutinación e inmovilización de esperma La metodología general para hacer anticuerpos monoclonales por hibpdomas es bien conocida También pueden crearse líneas de células productoras de anticuerpos, inmortales, mediante técnicas diferentes a la fusión, tal como transformación directa de linfocitos B con DNA oncogenico, o transfección con virus Epstem-Barr Ver, por ejemplo, M Schreier et al , "Hybpdoma Techniques" (Técnicas de hibpdomas) (1980), Hammerlmg et al, "Monoclonal Antibodies and T-cell Hybpdomas" (Anticuerpos monoclonales e hibpdomas de células T) (1981), Kennett et al, "Monoclonal Antibodies" (Anticuerpos monoclonales) (1980), ver también las patentes estadounidenses nos 4,341,761, 4,399,121, 4,427,783 4,444,887, 4,451,570, 4,466,917, 4,472,500, 4,491,632, 4,493,890 Los paneles de anticuerpos monoclonales producidos contra los péptidos de superficie de mebrana pueden ser clasificados por vanas propiedades, es decir, isotipo, epitope, afinidad, etc Son de interés particular los anticuerpos monoclonales que neutralizan la actividad de la proteina de superficie de membrana o sus subunidades Los anticuerpos de alta afinidad también son útiles cuando es posible la purificación por inmunoafinidad de proteínas de superficie de membrana naturales o recombinantes De preferencia, el anticuerpo usado en los métodos diagnósticos de esta invención es un anticuerpo policlonal purificado por afinidad Más preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal (mAb) Además, es preferible para las moléculas de anticuerpos usadas en la presente estar en la forma de porciones Fab, Fab', F(ab')2 o F(v) de moléculas de anticuerpos completos Como se sugirió antes, el método diagnóstico de la presente invención comprende exam inar una muestra o medio celular o de suero por medio de un ensayo incluyendo una cantidad efectiva de compañero de ligad ura a una proteína de superficie de membrana, tal como un anticuerpo, de preferencia un anticuerpo policlonal purificado por afinidad, y más preferiblemente un mAb Además, es preferible para Isa moléculas de anticuerpos usadas en la presente estar en la forma de porciones Fab, Fab', F(ab')2 o F(v) o moléculas de anticuerpos completos Como se discutió previamente, los pacientes capaces de beneficiarse de este método incluyen aquellos que sufren de infección bacteriana o viral, o aquéllos en los cuales se desea la anticoncepción Los métodos para aislar las prote ínas de superficie de membrana e inducir anticuerpos y para determinar y optimizar la capacidad de anticuerpos para ayudar en la exam inacion de las células objetivo son todas bien conocidas en la técnica Los métodos para producir anticuerpos anti-polipeptido policlona les son bien conocidos en la técnica Ver la patente estadounidense no 4 493,795 para Nestro et al Un anticuerpo monoclonal , conteniendo normalmente porciones Fab y/o F(ab')2 de moléculas de anticuerpos útiles, puede prepararse usando la tecnología de hibridoma descrita en Antibodies - A Laboratory Manual, (Anticuerpos - Un manual de laboratorio) Harlow y Lañe, eds. Cold Spring harbor Laboratory, Nueva York ( 1 988) , el cual se incorpora en la presente por referencia. Brevemente, para formar el hibridoma a partir del cual se produce la composición de anticuerpos monoclonales, un mieloma u otra l ínea celular que se perpetúa por sí sola, se fusiona con linfocitos obtenidos del bazo de un mamífero hiperinmunizado con las proteínas de superficie de membrana, o porciones de ligadura de las mismas. Normalmente se fusionan esplenocitos con células de mieloma usando polieti lenglicol (PEG) 6000. Los h íbridos fusionados se seleccionan por su sensibi lidad a HAT. Los hibridomas que producen un anticuerpo monoclonal útil para practicar esta invención son identificados por su capacidad para inmuno-reaccionar con las proteínas de su perficie de membrana y su capacidad para inhibir la actividad infectiva especificada o fertilización de células objetivo. Un anticuerpo monoclonal útile para practicar la presente invención puede ser producido al iniciar un cultivo de hibridoma monoclonal comprendiendo un medio nutriente conteniendo un hibridoma que secreta moléculas de anticuerpos de la especificidad de antígeno apropiado. El cultivo es mantenido bajo condiciones y duante un periodo suficiente para que el hibridoma secrete las moléculas de anticuerpos en el medio. Entonces se recolecta el medio conteniendo los anticuerpos. Las moléculas de anticuerpos pueden ser aisladas adicionalmente por técnicas bien conocidas. Los medios útiles para la preparación de estas composiciones son ambos bien conocidos en lá técnica y están comercialmente disponibles e incluyen medios de cultivó sintéticos, ratones innatos y sim ilares. Un medio sintético ejemplar es el medio esencial m ínimo de Dulbecco ( DMEM ; Dulbecco et al. , Virol. 8.396 ( 1 959) complementado con 4.5 g/l de gl ucosa, 20 mm glutamina y 20% de suero de ternera fetal . Una especie de ratón innato ejemplar es Balb/c. 10 Los métodos para producir anticuerpos monoclonales también son bien conocidos en la técnica. Ver Niman et al , Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 80:4949-4953 ( 1 983) . Normalmente, las proteínas de superficie de membrana o análogos de péptidos son usados ya sea solos o conjugados a un portador inmunogénico, como el inmunógeno en el procedimiento antes descrito para producir anticuerpos monoclonales. Los hibridomas son clasificados por la capacidad para producir un anticuerpo que inmuno- reacciona con las proteínas de superficie de membrana. La presente invención contempla además composiciones terapéuticas útiles para practicar los métodos terapéuticos de esta invención. Una composición terapéutica objetivo incluyen, en mezcla, un excipiente farmacéuticamente aceptable (portador) y una o más de una prote ína de superficie de membra na (es decir, de una célula, bacteria o virus) particularmente un polipéptido de antígeno de esperma , análogo del mismo o fragmento del mismo, como se describe en la presente , como un -> ingrediente activo. En u na modalidad preferida , la composición com prende un antígeno de esperma o mezcla del mismo capaz de inhi bir la concepción . La preparación de composiciones terapéuticas las cuales contiene polipéptidos, análogos o fragmentos activos como ingredientes activos, es bien entendida en la técnica. Normalmente, tales composiciones son preparadas como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas, sin embargo, también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para solución en , o suspensión en, líquido antes de la inyección . La preparación también puede ser emulsificada. El ingrediente terapéutico activo frecuentemente se mezcla con excipientes, los cuales son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa , glicerol , etanol o similares y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, la composición puede contener cantidades menores de substancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsificantes, y/o agentes amortiguadores de pH , los cuales intensifican la efectividad del ingrediente activo. U n polipéptido, análogo o fragmento activo puede ser formulado en la composición terapéutica como formas de sales farmacéutica mente aceptables neutralizadas. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres del polipéptido o molécula de anticuerpo) y las cuales se forman con ácidos inorgánicos, tales como, por ejem plo, ácidos clorh ídrico o fosfórico, o ácidos orgán icos , tales como, acético, oxál ico , tartárico, mandélico y sim i lares. Las sales formadas de los grupos carboxilo libres también pueden ser derivadas de bases inorgánicas, tales como, por ejemplo, hidroxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico, y bases orgánicas, tales como, isopropilamina, tpmetilamina, 2-et?lam?no etanol, histidma, procama, y similares Las composiciones terapéuticas conteniendo polipéptido, análogo o fragmento activo se administran convencionalmente de manera intravenosa, como por inyección de una dosis de unidad, por ejemplo El término "dosis de unidad" cuando se usa en referencia a una composición terapéutica de la presente invención se refiere a unidades físic amente discretas adecuadas como dosificación unitaria para humanos, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el diluyente requerido, es decir, portador o vehículo Las composiciones son administradas en una manera compatible con la formulación de dosificación, y en una cantidad terapéuticamente efectiva La cantidad a ser administrada depende del sujeto a ser tratado, la capacidad del sistema inmune del sujeto para utilizar el ingrediente activo, y el grado de capacidad de ligadura deseado Las cantidades precisas de ingrediente activo requeridas para ser adm inistradas dependen del J U I CIO del pacticante y son peculiares para cada individuo Sin embargo, las dosis adecuadas pueden variar desde aproximadamente 0 1 a 20, de preferencia aproximadamente 0 5 a aproximadamente 1 0, y más preferiblemente uno a varios miligrados de ingrediente activo por kil ogramo de peso corporal de individuo por día , y dependen de la ruta de administración Los reg ímenes adecuados para administración inicial y refuerzos también son variables, pero son tipificados por una administración inicial seg uida por dosis repetidas a intervalos de u na hora o más mediante una inyección subsecuente u otra administración De manera alternativa, se contempla una infusión intravenosa continua suficiente para mantener concentraciones de diez nanomoles a diez m icromoles en la sang re Las composiciones terapéuticas pueden incluir además una cantidad efectiva del antagonista o anticuerpo para las proteínas de superficie de membrana, y uno o más de los siguientes ingredientes activos un antibiótico, un esteroide Otra caractepsitca de esta invención es la expresión de las proteínas cod ificadas por las secuencias de DNA obtenidas siguiendo marcado, análisis y secuenciación Como es bien sabido en la técn ica, las secuencias de DNA pueden ser expresadas al enlazarlas operativamente a una secuencia de control de expresión en un vector de expresión apropiado y emplear ese vector de expresión para transformar un huésped unicelular apropiado Tal enlace operativo de una secuencia de DNA de esta invención a una secuencia de control de expresión incluye, por supuesto, si todavía no es parte de la secuencia de DNA, la condición de un codon de iniciación, ATG, en el marco de lectura correcto corriente arriba de la secuencia de DNA Puede emplearse una ampl ia variedad de combinaciones de huésped/vector de expresión para expresar las secuencias de DNA de esta invención Los vectores de expresión úti les, por ejemplo pueden c onsistir de segmentos de secuencias de DNA cromosómicas , no cromosómicas y sintéticas. Los vectores adecuados incluyen derivados de SV40 y plásmidos bacterianos conocidos, por ejem plo, plásmidos de E. coh col E 1 , pCR 1 , pBR322, pMB9 y sus derivados, plásmidos tales como RP4 ; DNAS de fagos , por ejemplo , los numerosos derivados de fago ?, por ejemplo, N M989, y otro DNA de fato, por ejemplo M 1 3 y DNA de fago de filamento simple filamentosos; plásmidos de levadura, tales como el plásmido 2µ o derivados del mismo; vectores útiles en células eucarióticas, tales como vectores útiles para células de insectos o mam íferos ; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y DNAs de fagos, tales como plásmidos q ue ha n sido modificados para emplear DNA de fago u otras secuencias de control de expresión; y similares. Cualquiera de una amplia variedad de secuencias de control de expresión - secuencias que controlan la expresión de una secuencia de DNA enlazada operativamente a ella, pueden usarse en estos vectores para expresar las secuencias de DNA de esta invención. Tales secuencias de control de expresión útiles incluyen , por ejemplo, los promotores tempranos o tardíos de SV40, CMV, vaccinia, polioma o adenovirus, el sistema lac, el sistema trp, el sistema TAC, el sistema TRC, el sistema L TR, las regiones promotoras y operadoras principales del fago ?, las regiones de control de proteína de cubierta fd, el promotor para 3-fosfog licerato cinasa u otras enzimas glicol íticas, los promotores de fosfatasa acida (por ejemplo, Pho5) , los promotores de los factores de acompañamiento a de levadura, y otras secuencias conocidas para controlar la expresión de genes de células procarióticas o ecuarióticas o sus virus, y varias combinaciones de los mismos. Una amplia variedad de células huésped unicelulares también son útiles para expresar las secuencias de DNA de esta invención. Estos huéspedes pueden incluir huéspedes eucarióticos y procarióticos bien conocidos, tales como cepas de E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, hongos tales como levaduras, y células an imales, tales como células C HO, R1 .1 , B-W y L-M , células de riñon de mono verde africano (por ejemplo, COS 1 , COS 7, BSC 1 , BSC40 y BMT10), células de insectos (por ejemplo, Sf9) , y células humanas y células de plantas en cultivos de tejidos. Se entenderá que no todos los vectores, secuencias de control de expresión y huéspedes funcional igualmente bien para expresar las secuencias de DNA de esta invención. Ninguno de los huéspedes funcionará igualmente con el mismo sistema de expresión . Sin embargo, un experto en la técnica será capaz de seleccionar los vectores apropiados, secuencias de control de expresión y huéspedes sin experimentación indebida para lograr la expresión deseada sin apartarse del alcance de esta invención . Por ejemplo, al seleccionar un vector, el huésped debe ser considerado dbido que el vector debe funcionar en él. El número de copias del vector, la capacidad para controlar el número de copias, y la expresión de cualquiera otra proteína codificada por el vector, tales como, ma rcadores antibióticos, también deben ser considerados . Para seleccionar u na secuencia de control de expresión, normalmente se considerará una varied ad de factores. Estos incluyen, por ejemplo, la fuerza relativa del sistema , su controlabilidad y su compatibilidad con el gene o secuencia de DNA particular a ser expresado, particularmente con respecto a las estructuras secundarias pote nciales Los huéspedes unicelulares adecuados serán seleccionados por consideración de, por ejemplo, su compatibilidad con el vector elegido, sus características de secreción , su capacidad para doblar proteínas conrrectamente, y sus requerimientos de fermentación , así como la toxicidad para el huésped del producto codificado por las secuencias de DNA a ser expresadas, y la facilidad de purificación de los productos de expresión Considerando estos y otros factores, una persona expert a en la técnica será capaz de construir una variedad de combinaciones vector/secuencia de control de expresión/huésped que expresará la proteína codificada por las secuencias de DNA de esta invención en fermentación o en cultivo animal a gran escala Los cDNAs son clonados, de preferencia, bajo el control de sistema promotor/RNA polimerasa de bacteriófago T7 en el vector de expresión de E coli pET22b(+) (Novagen, Madison, Wl) Si está presente, el péptido de señal endógeno puede ser reemplazado con la secuencia pelB de señal bacteriana Es esencial para la expresión en el vector pET q ue el gene extraño sea fusionado en marco con a) la secuencia pelB, en el extremo 5' (para facilitar la exportación de la proteína producida hacia el espacio pepplásmico) y b) un tramo de seis histidinas (his-tag) en el extremo 3' (para proporcionar un ancla para purificación mediante cromatografía por afinidad de iones inmovilizados) La estrategia de clonación con reacción en cadena de polimerasa (PCR) puede usarse para hacer los constructos de expresión de gene, de manera que las proteínas de longitud completa sean expresadas siempre que sea posible. Las inserciones pueden ser verificadas por secuenciación. Los clones que soportan las regiones de codificación de antígeno pueden hacerse crecer en caldo terrífico 3X complementado con ampicilina ( 100 µg/ml) a 37°C. Cuando las células alcanzan A60o de 0.6, pueden inducirse cultivos mediante la adición de I PTG 0.4 mM. Como un control negativo, el cultivo de células h uésped puede tratarse en una manera similar. Con el fin de optimizar el tiempo de recolección de la proteína expresada , los constructos pueden ser analizados por su curso en el tiempo de la inducción en E. coli. Para producción a gran escala de constructos recombinantes, pueden hacerse crecer cultivos de 14 litros en un fermentador New Brunswick ML410. Los 6 residuos de histidina en el extremo carboxilo facilitará el método de purificación de proceso usando resina de quelación de metal H is-BindM R. Para verificar la pureza final de los antígenos recombinantes aislados, pueden conducirse manchado con plata y azul Coomassie [Amido black] en geles de SDS-PAGE cargadso con concentraciones variantes del producto purificado. Los anticuerpos purificados por afin idad generados para la proteína recombinante pueden ser probados en inm unoblots 2-D para determinar si ia mancha de proteína idéntica seleccionada originalmente es inmuno-reactiva , proporcionando así una prueba adicional [identidad inmunológica] de q ue se ha obten ido el cDNA deseado. Al estudiar si estos anticuerpos se unen a la superficie del esperma en inmunofluorescencia y FACS y evaluar sus efectos en la función de proteína en una variedad de e nsayos in vitro, puede confirmarse un papel para una proteína dada en casos funcionales mediados en la superficie de la célula o virus. Se pretende además que los análogos de proteína de superficie de membrana pueden ser preparados a partir de secuencias de nucleótidos de las proteínas derivadas dentro del alcance de la presente invención. Pueden producirse análogos, tales como fragmentos, por ejemplo, por digestión de pesina de material separado por análisis en gel, o producirse de manera recombinante. Otros análogos, tales como muteínas, pueden ser producos mediante mutagénesis estándar de sitio dirigido de secuencias de codificación. Como se mencionó antes, una secuencia de DNA que codifica la proteína de superficie de membrana puede prepararse de manera sintética en lugar de clonarse. La secuencia de DNA puede ser diseñada con los codones apropiados para la secuencia de aminoácidos. En general , uno seleccionará los codones preferidos para el huésped pretendido si la secuencia será usada para expresión. La secuencia completa se monta de oligonucleótidos traslapados preparados mediante métodos estándares y montados en una secuencia de codificación completa . Ver, por ejemplo, Edge, Nature. 292:756 (1 981 ); Namba ir et al, science, 223: 1 299 ( 1 984); Jay et al, J. Biol. Chem. , 259: 631 1 ( 1 984) . Las secuencias de DNA sintéticas permiten la construcción conveniente de genes , los cuales expresarán los análogos de proteína de superficie demembran a o "mute ínas" . De manera alternativa , las m uteínas q ue codifican DNA pueden hacerse mediante mutagénesis de sitio dirig ido de genes naturales o cDNAs, y las muteínas pueden hacerse usando directamente s íntesis de polipéptidos convencional . La presente invención se extiende a la preparación de oligonucleótidos antisentido y ribozimas que pueden ser usados para interferir con la expresión de la proteína de superficie de membrana en el nivel de traslación. Esta aproximadamente utiliza el ácido nucleico antisentido y ri bozimas para bloquear la traslación de un mRNA específico, ya sea al enmascarar ese mRNA con un ácido nucleico antisentido o cortarlo con una ribozima. Los ácidos nucleicos antisentido son moléculas de DNA o RNA que son complemtarias al menos a una porción de una molécula de mRNA específica. (Ver Weintraub, 1990; Marcus-Sekura, 1988) . En la célula, ellos hibpdan a ese mRNA, formando una molécula de doble filamento. La cél ula no traslada un mRNA en su forma de doble filamento Por lo tanto, los ácidos nucleicos antisentido interfieren con la expresión de mRNA en la proteína . Los oligómeros de aproximadamente quince nucleól idos y moléculas que hibridan al codón de in iciación AUG serán particularmente eficiente, ya que son fáciles de sintetizar y probablemente poseen menos problemas que moléculas más grandes cuando se les introduce en las células . Los métodos antisentido han sido usados para inhibir la expresión de muchos genes in vitro (Marcus-Sekura, 1988; Hambor et al . , 1 988) . Las ribozimas son moléculas de RNA que poseen la capacidad de cortar específicamente otras moléculas de RNA de filamento sim ple en una manera un tanto análoga a las endonucleasas de restricción de DN A Las ribozimas fueron descubiertas de la observación de que ciertos mRNAs tienen la capacidad de cortar sus propios mirones Al modif icar la secuencia de nucleótidos de estos RNAs , los investigadores han sido capaces de diseñar moléculas que reconocen secuencias de nucleótidos específicas en una molécula de RNA y la cortan (Cech, 1 988) Debido a que las ribozímas son específicas de secuencias, solo se mactivan m RNAs con secuencias particulares Los investigadores han identificado dos tipos de ribozímas, el tipo Tetrahymena y el tipo de "cabeza de martillo" (Hasselhoff y Gerlach, 1 988) Las ribozímas de tipo Tetrahymena reconocen secuencias de cuatro bases , al tiempo q ue el tipo de "cabeza de martillo" reconoce secuencias de once a dieciocho bases Mientras más larga sea la secuencia de reconocimiento, es más probable que ocurra exclusivamente en la especie de mRNA objetivo Por lo tanto, las ribozímas de tipo de cabeza de martillo son preferibles a las ribozímas de tipo Tetrahymena para inactivar una especie de m RNA específica, y se prefieren secuencias de reconocimiento de dieciocho bases para acortar las secuencias de reconocimiento As i , las secuencias de DNA descritas en la presente pueden ser usadas para preparar moléculas antisentido contra, y ribozímas que cortan mRNAs para proteínas de superficie de membrana y sus gandos La presente invención también se refiere a una variedad de aplicaciones diagnostica , incluyendo métodos para detectar la presencia de cél ulas particu lares o agentes infecciosos, o anticuerpos para los mismos (es decir en suero de paciente) por referencia a su capacidad para l igarse a o competir con la ligadura de las proteínas de superficie de membrana . Como se mencionó antes, las proteínas de superficie de membrana pueden usarse para producir anticuerpos para ellas mismas mediante una variedad de técnicas conocidas, y tales anticuerpos podrían ser aislados y utilizados como en pruebas para la presencia de células objetivo particuares o agentes infecciosos. Tales anticuerpos pueden ser usados para analizar las proteínas de superficie celular, y particularmente en el caso de análisis de proteínas de esperma, pueden usarse para ensayos de aglutinación de esperma caracterizado, inmovilización de esperma, inmunofluorescencia de superficie, análisis FACS, ensayos de penetración de esperma , ensayos de hemi-zona, y ubicación en el m apa de superficie de 2-D. Como se describió en detalle antes, el o los anticuerpos pueden ser producidos y aislados mediante métodos estándares que incluyen las técnicas de hibridoma bien conocidas. Por conveniencia , el o los anticuerpos para la proteína de superficie de membrana serán referidos en la presente como Abi y los anticuerpos cultivados en otras especies como Ab2. La presencia de células o agentes infecciosos conteniendo el repertorio de proteínas de superficie de membrana puede ser indagada mediante los procedim ientos inmunológicos usuales aplicables a tales determinaciones. Se conoce un número de procedimientos útiles. Tres de tales procedim ientos, los cuales son especialmente útiles, util izan ya sea la proteína de superficie marcada con una marca detectable , anticuerpo Ab , marcado con una marca detectable , o anticuerpo Ab2 marcado con una marca detectable. Los procedimientos pueden ser resumidos mediante las siguientes ecuaciones, en donde el asterisco indica que la partícula está marcada, y "MPS" significa la proteína de su perficie de membrana: A. MSP* + Ab, = MSP*Ab, B . MSP + Ab* = MSPAb, * C. NSO + Ab, + Ab2 * = MS PAb1Ab2* Los procedimientos y su aplicación son todos familiares para aquéllos expertos en la técnica y de acuerdo a esto pueden ser utilizados dentro del alcance de la presente invención . El procedimiento "competitivo" , Procedimiento A, se describe en las patentes estadounidenses nos. 3,654,090 y 3, 850,752. El Procedimiento C, el procedimiento "sandwich", es descrito en las patentes estadounidenses nos. RE 31 ,006 y 4, 016, 043. Todavía se conocen otros procedimientos tales como el "anticuerpo doble" o procedimiento "DASP". En cada instante, la proteína de superficie de membrana forma complejos cono uno o más anticuerpos o compañeros de ligadura y un miembro del complejo se marca con una marca detectable. El hecho de que se ha formado un complejo y, si se desea, la cantidad del mismo, puede determinarse mediante métodos conocidos aplicables a la detección de marcas . Se verá de lo anterior, que una propiedad característica de Ab2 es que reaccionará con Abi . Esto es porque Ab, cultivado en una especie mam ífera ha sido usado en otra especie com o un a ntígeno para cultivar el anticuerpo Ab2. Por ejemplo , Ab2 puede ser cultivado en cabras usando anticuerpos de conejo como antígenos . Por lo tanto, Ab2 sería anticuerpo anti-conejo cultivado en cabras. Para fines de esta descripción y reivindicaciones , Ab, será referido como un anticuerpo de proteína de superficie anti-membrana o primario, y Ab2 será referido como un anticuerpo anti-Ab2 o secundario. Las marcas más comúnmente empleadas para estos estudios son elementos radioactivos, enzimas, químicos con fluorescencia cuando se exponen a luz ultravioleta y otros. Se conoce un número de materiales fluorescentes y pueden ser uti lizados como marcas. Estos incluyen, por ejemplo, fluoresceína, rodamina, auramina, Texas Red , azul AMCA y amarillo Lucifer. Un material de detección particular es anticuerpo anti-conejo preparado en cabras y conjugados con fluoresceína a través de un isotiocianato. La proteína de superficie de membrana o su(s) compañero(s) de ligadura también pueden ser marcados con un elemento rad ioactivo o con una enzima. La marca radioactiva puede ser detectada por cualq uiera de los procedimientos de conteo actualmente disponibles. El isótopo preferido puede ser seleccionado de 3H , 14C, 32P, 35S, 36CI , 51 Cr, 58Co, 59Fe, 90Y, 1 25l , 1 31 l y 1 86Re. Las marcas de enzimas son igualmente útiles, y pueden ser detectadas por cualquiera de las técnicas colorimétrica, espectrofotométrica, fluoroespectrofotométrica , amperométríca o gasométrica actualmente utilizadas. La enzima se conjuga con la partícula sel eccion ada por reacción con molécu las de puenteo, tales como carbodi imidas , diisocianatos, glutaraldeh ído y simi lares. Muchas enzimas, las cuales pueden ser usadas en estos procedimientos son conocidas y pueden ser utilizadas. Las preferidas son peroxidasa , ß-glucoronidasa , ß-D-glucosidasa, ß-D-galactosidasa, ureasa, glucosa oxidasa más peroxidasa y fosfatasa alcalina. Las patentes estadounidenses nos. 3,654, 090; 3, 850, 752; y 4,016, 043 son referidas a manera de ejemplo por su descripción de material y métodos de marcado alternativos. En una modalidad adicional de esta invención , pueden prepararse conjuntos de prueba comercial adecuados para ser usados por un médico especialista para determinar la presencia o ausencia del repertorio de proteínas de superficie de membrana en células objetivo sospechosas. De acuerdo con las técnicas de prueba discutidas antes , una clase de tales conjuntos contendrán al menos la o las proteínas de superficie de membrana marcadas o sus compañeros de ligadura, por ejemplo, un anticuerpo específico para ella, y direcciones, por supuesto, dependiendo del método seleccionado, por ejemplo, "competitivo" , "sandwich" , "DASP" y similares. Los conjuntos también pueden contener reactivos periféricos, tales como amortiguadores, estabilizantes, etc. De acuerdo a esto, un conjunto de prueba puede ser preparado para la demostración de la presencia o capacidad de células por la presencia de la célula o agente infeccioso, comprendiendo (a) una cantidad predeterminada de al menos un componente inmunoq u ímicamente reactivo marcado , obtenido por la unión directa o indirecta de la prote ína de superficie de membrana presente o un compañero de ligadu ra específico para ella , a una marca detectable; (b) otros reactivos y (c) direcciones para uso de dicho conjunto. De manera más específica, el conj unto de prueba diagnóstica puede comprender: (a) una cantidad conocida de la proteína de superficie de membrana como se describió antes (o un compañero de ligadura) generalmente unida a una fase sólida para formar un inmunoabsorbente, o en la alternativa, unida a un marbete adecuado, o productos finales tales plurales, etc. (o sus com pañeros de ligadura) u no de cada uno; (b) si es necesario, otros reactivos; y (c) direcciones para uso de dicho conjunto. En una variación adicional , el conjunto de prueba puede prepararse y usarse para los fines declarados antes, el cual opera de acuerdo a un protocolo predeterminado (por ejemplo, "competitivo" , "sandwich" , "anticuerpo doble" , etc. ) y comprende: (a) un componente marcado, el cual ha sido obtenido al acoplar la proteína de superficie de membrana a una marca detectable; (b) uno o más reactivos inmunoquímicos adicionales de los cuales al menos un reactivo es un ligando o un ligando inmovilizado, el cual es seleccionado del g rupo consistiendo de: ( i ) u n l igando capaz de l igad ura con el com onente marcado (a) ; (i i) u n l igando capaz de l igadura con un compañero de lig adura del componente marcado (a) ; (iii) un ligando capaz de ligadura con al menos uno del o los componentes a ser determinado; y (iv) un ligando capaz de ligadura con al menos uno de los compañeros de ligadu ra de al menos uno del o los componentes a ser determinados; y (c) direcciones para el desempeño de un protocolo para la detección y/o determinación de uno o más componentes de una reacción inmunoquímica entre la proteína de superficie de membrana y un compañero de ligadura específica para la misma . De acuerdo con lo anterior, puede prepararse un sistema de ensayo para clasificar medicamentos potenciales efectivos para modular la actividad o ligadura de la proteína de superficie de membrana. La proteína de superficie de membrana puede introducirse en un sistema de prueba, y el medicamento prospecto puede ser introd ucido en el cultivo celular resultante, y el cultivo se examinó posteriormente para observar cualquier cambio en la actividad de o para l igadura de las células, debido al efecto de cantidades adicionadas de la proteína de superficie de membrana conocida. Los ensayos adecuados pueden incluir ensayos de movilidad de esperma o fertilización in vitro. Además, modelos animales adecuados, particularmente para ensayos de fertilidad, incluyen ratón y macaco. Las proteínas de superficie de membrana también npueden ser usadas como vacunas , o en el caso de antígenos de esperma, como anticonceptivos. Una vez que se han identificado varios inmunógenos de superficie de esperma específicos de testículos, únicos, pueden moverse suave y eficientemente a través de la ruta de desarrol lo de anticonceptivo cuando un sistem a de "triage" . Las moléculas candidatas deben satisfacer los estrictos criterios de ubicación de superficie, especificidad de testes, y actividad en al menos una prueba funcional. Las proteínas, cuyos cDNAS han sido clonados y secuenciados, son probadas para especificidad de tejido. Si son específicas de testes, se expresarán como proteínas recombinantes y se generarán anticuerpos para la proteína recombínante. Estos anticuerpos serán usados para validar la ubicación de supe rficie y efectos biológicos de los epitopes inm unogénicos en ensayos funcionales.

Las proteínas mostradas repetidamente por métodos de marcado vectorial a ser expuestas en las proteínas de superficie de esperma humano incluyen isoantígenos definidos por suero infértil, autoantígenos definidos por suero de hombres con vasectom ía, y antígenos, los cuales inducen aglutinación de esperma. Estas proteínas son candidatos para inmunoanticoncepción. Con el fin de evitar complicaciones autoínm unes es particularmente importante que las moléculas seleccionadas para desarrollo inmunoanticonceptivo exhiben especificidad de tej ido, es decir, que sean expresadas solamente en el tejido objetivo pretendido, el testes, y en esperma. Es prudente dirigir la especificidad de tejido a la fase de decubrimiento de vacunógeno en lugar de después durante los estudios de seguridad toxicológ ica y teratológica . Esta estrategia m inim iza el gasto innecesario de tiempo y recursos en inm unógenos, los cuales son distribuidos ampliamente en tejidos y as í, son potencialmente capaces de inducir patolog ías inmunes. Las complicaciones potenciales de la inmunización con vacunas anticonceptivas incluyen: 1 ) hepersensibilidad inmed iata y respuestas anafilácticas ; 2) respuestas de hipersensíbilidad retardadas, y 3) respuesta autoinmune y enfermedad autoinmune debido a la reacción inmune con antígenos endógenos de los sujetos inmunizados. Muchos de estos aspectos pueden ser contrarrestados mediante selección de inmunógenos no reactivos cruzados específicos para el teste y esperma. Estudios inmunohistoquímicos, Northern y RT-PCR de especifidad de tejido de inmunógenos anticonceptivos propuestos proporcionan evidencia de soporte importante Los métodos de Northern blots y RT-PCR, auqnue proporcionan evidencia para especifidad de tejido en el nivel de mRNA, pueden no detectar epitopes presentes en un vacunógeno seleccionado que pueden estar presentes en otra molécula no relacionada [debido a doblamiento conformacional u otros tipos de m ímica molecular] De esta manera, las pruebas inmunohistoquím icas complementan los métodos moleculars y pueden revelar epitopes de reactivos cruzados, los cuales no pueden ser predichos únicamente en base a comparaciones de secuencia primaria de aminoácidos. La combinación de métodos Northern blot, RT-PCR e inmunohistoqu ímicos puede identificar antígenos de gametos específicos que portan menos nesgo de enfermedad autoinm une. Esto proporciona información como para el paso de espermatogénesis, en el cual una proteína dada es expresada primero, proporcionando un gene de penetración -específico de testes dado- activo antes y siguiendo la meiosis Tal conocimiento es pertinente para identificar genes post-meióticos para estudio de regulación de transcripción, una posi ble ruta para descubrir un medio para regul ar la espermatogénesis, y para desarrollar un a nticonceptivo masculino Con el fin de proceder con ensayos de fertil idad e inmunogenicidad de inm u nógenos de esperma candidatos, sus homólogos pueden ser clonados en ratones y monos y las proteínas recombinantes pueden ser expresadas y purificadas Pueden clonarse tanto homólogos de mono y de ratón usando genotecas de testes repartidas previamente en la literatura [Proc Nati Acad Sci USA 84 531 1 -5315 ( 1 984), Mol Repd Dev 34 140- 148 ( 1 993)] Pueden inmunizarse ratones B6AF 1 hembras, de 6-8 semanas de edad, con aproximadamente 20 ug del inmunógeno recombinante homólogo El inmunógeno puede ser emulsificado con un volumen igual de auxiliar completo de Freund (CFA) para un volumen final de 1 00 ul Los animales en el grupo de control recibirán PBS/CFA Cada animal puede ser inyectado en dos sitios en la base de la cola Pueden darse dos a tres inmunizaciones de refuerzo en auxiliar incompleto de Freund en intervalos de dos semanas Se recolecta sangre mediante sangrados de cola antes de la inmunizado, dos semanas post-inmunización y 7- 1 0 días después de cada refuerzo El suero es ensayado para anticuerpos mediante ELISA usando extracto de esperma e inmunógeno recom bmante como objetivos. El suero puede ser probado adicionalmente por reactividad para proteína natural mediante análisis de i nmunofluorescencia e i nmunoblot de esperma de ratón y extractos de esperma, respectivamente Empezando una semana después del último refuerzo con inm unógeno recombmante, cada ratón hembraes halojado continuamente con un ratón macho de fertilidad com probada Las hem bras serán checadas cada mañana por la presencia de un conector vagina l i ndicando que ha ocu rrido el acoplamiento En el d ía 1 5 después de la introducción de los machos, las hembras son sacrificadas y se contaron los embriones. Los macacos pueden ser inyectados intramuscularmente con 500 ug en "squalene-arlacel A" seguido por inmunizaciones de refuerzo en intervalos de tres semanas con 200 ug de squalene de control. Pueden recolectarse suero, mucosa cervical y fluido de oviducto (recolectado vía una cánula de oviducto implantada quirúrgicamente pueden ser recolectados antes de la inmunización a intervalos semanales. Los anticuerpos pueden ser valorados por ELISA tanto en objetivos de extractos de esperma naturales e inmunógeno recombinante. El suero será probado adicionalmente por reactividad a proteína natural mediante análisis de inmunoblot e inmunofluorescencia con esperma de mono y humano y extractos de esperma. El suero puede ser probado entonces adicionalmente por su capacidad para exhibir pruebas funcionales de esperma. Los inmunógenos que evocan altos títulos de anticuerpos para ell inmunógeno recom binante que también reaccionan cruzado con la superficie de esperma y bloquean al menos una prueba funcional, proceden para ensayos de fertilidad . Para el ensayo de fertilidad , los macacos son inmunizados como antes con inmunógeno recombinante (1 5 animales) o squalene de control ( 1 5 an imales) . El suero es recolectado antes de la inmunizaci ón y a intervalos semanales . Los anticuerpos son valorados por análisis ELI SA, Western y de inmunofluorescencia . Siguiendo la última inm u nización , cada hembra se haces co-habitar durante cinco días con un macho de fertilidad probad a durante el periodo fértil de su ciclo em pezando tres d ías antes de la ovulación esperada . Los acoplamientos empiezan durante el tercer ciclo después de la inmunización inicial y continúan durante nueve ciclos consecutivos o hasta que se confirme que está preñada . Los embarazos son terminados mediante la dministración del agente anti-progestacional, sulprostona. Se hacen observaciones diariamente para detectar abortos antes de las seis semanas de em barazo. En el ensayo de fertilidad , la prueba de importancia entre proporciones de fertilidad para los animales vacunados y de control , puede depender principalmente de procedimientos aleatorios no paramétricos. Pueden emplearse la prueba exacta de Fisher y pruebas basadas en proporción binomial . Además, la importancia de la diferencia entre grupos vacunados y de control en números de animales fértiles y no fértiles puede determinarse mediante análisis tradicional de cuadrados Chi. El tiempo para embarazarse puede ser analizado usando una variedad de métodos de tablas de vida, incluyendo comparaciones no paramétricas de curvas de supervivencia , la prueba de Mantel-Haenszel , varios modelos de probabilidad y modelos de regresión de riesgo proporcional. Pueden utilizarse procedimientos similares para examinar la asociación entre títulos de anticuerpos y el tiempo para resultado de fertilidad. Dependiendo del resultado del estudio, por ejemplo, puede provar instructivo para comparar los niveles de anticuerpos anti-esperma de animales fértiles vacu nados con animales no fértiles vacunados . De manera alternativa, pueden compararse los niveles de anticuerpo anti-esperma de an imales q ue se vuelven fértiles en diferentes momentos. Para respuestas en grupo , las cuales involucran resultados continuos , pueden hacerse comparaciones de dos muestras usando la prueba de suma de hilera de Wilcox no paramétrica y la usual prueba t de dos muestras. En algunos casos, pueden examinarse modelos de regresión (incluyendo análisis de varianza y covarianza) junto con pesado y transformación de datos para mejorar el ajuste del modelo y optimizar la estimación estadística e inferencia. Si la inmunización ya sea de ratones o monos provoca un alto grado de infertilidad, el resultado soporta la investigación continuada del inmunógeno. Si la eficacia es alta en primates, indica que el inmunógeno humano sería útil en una formulación para probar la inmunogenicidad humana (Fase I). Si el efecto en la fertilidad es modesta, soportaría la inclusión del inmunógeno como un componente de una formulación de vacuna anticonceptiva multi-determinante. Si un inmunógeno dado no muestra efecto, el resultado indicaría que el inmunógeno debería, ya sea , 1 ) ser descartado de estudio adicional, o 2) volverse a probar en un sistema de entrega alternativo, el cual pudiera inducir mayores títulos o más sostenidos de anticuerpos en el tracto reproductivo femenino. Si se log ra el 75% de infertilidad o mejor para un inmunógeno dado en el grupo experimental, dos posibles opciones son : 1 ) continuar el acoplam iento de los an imales infértiles y empiezan un estu dio de infertilidad continuada/reversibilidad, o 2) realizar hisopatolog ía . Si se el ige la última , pueden obtenerse tejidos en la conclusión del ensayo de fertilidad de hembras vacunadas y se sumerge en fijador. La fijación estándar con formaldeh ído , incrustación de parafina y manchado con H&E pueden realizarse en el cerebelo, cerebro (regiones frontales y temporatles) , base del cerebro, músculo card iaco, aorta dorsal, músculo esquelético, páncreas, bazo, "letter", adrenal , estómago, ves ícula biliar, duodeno, yeyuno, colon, riñon , vejiga, ovario, útero, glándula m amaria , cordón umbilical y glándula parótida. Una vacuna anticonceptiva efectiva contra antígenos de esperma requiere una respuesta inmune que produce títulos de anticuerpos máximos en el tracto reproductor femenino. La inmunización sistémica con el antígeno de esperma SP-1 0 origina respuestas de anticuerpos IgG en los fluidos de oviducto y la inmunización intracervical proporciona una ruta de inmunización alternativa efectiva. Si la inmunización sistémica sola resulta en cantidades insuficientes de anticuerpos antiesperma en el fluido de tracto reproductor durante ensayos de inmunogenicidad , pueden probarse los reg ímenes de inmun ización que incluyen inmunización intracervical para aumentar selectivamente la cantidad de anticuerpos IgA e IgG en los fluidos de tracto reproductor femenino de macaco. Habiendo descrito de manera general esta invención, puede obtenerse un entendimiento adicional por referencia a ciertos ejemplos específicos, los cuales son proporcionados en la presente para fines de ilustración solamente y no pretenden ser lim itantes a menos q ue se especifique de otra manera.

EJ EMPLOS Procedimientos experimentales Materiales Se obtuvieron de Sigma persulfato de amonio, BSA, ácido cítrico, PMSF (dietanolamina de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, glicero, urea (Sigma Ultra) , Tpzma Base (Sigma Ultra) , Non idet P40, CHAPS , PDA (N , N'-d?acplo?lp?peraz?na) , DTT, yodoacetamida, leupeptina y pepstatina A. Se compró EDTA de J T. Baker, El nitrato de plata fue de Mallinckrodt Chemicals. El bicarbonato de sodio, cloruro de sodio e hidróxido de sodio (todos de grado ACS) fueron de Fisher. SDS (dodecilsulfato de sodio, Ultrapuro), glicina (grado de electroforesis) y fosfato de sodio se obtuvieron de I CN, Percoll , Ampholmes pH 3 5-5, pH 5-7, pH 7-9 y pH 3.5-10, Pharmalyte pH 6 5-9, pH 5-8 y pH 8-1 0 5 y un conjunto de calibración carbamilado para electroforesis 2D se compraron a Pharmacia biotech . Se obtuvieron conjuntos de quimiolummiscencia intensificada (ECL.) para análisis de Western blot de Amersham Corp. (para detección de conjugados de peroxidasa) y de Tropix (para detección de conjugados de fosfatasa alcal ina). Se compró Protogold para maculado de proteínas manchadas de Goldmark. TLCK (N-p-tosil-L-lisma clorometil cetona) y TEMED fueron de boehpnger Mannheim Los conjugados de lectina fueron de Vector Na 1 5l libre de portador fue de Amersh am corp Las pantallas de intensificación N EF-490 Y N E F-491 se com praron a Du Pont Los estánd ares de SDS-PAG E 2D y avidina HRP-co nj ugada se obtuvieron de BIO-RAD N HS-LC-Biotma, perlas de yodo y avidma AP-conjugada fueron de Pierce. Todos los anticuerpos secundarios usados en Western blotting fueron obtenidos de Jackson I mmunoResearch Lab.

Ejemplo 1 Preparación de espermatozoides Los especímenes de semen fueron obtenidos de hombres jóvenes normales, saludables mediante masturbación . Solo se usaron en este estudio eyaculaciones con parámetros de semen normales (28). Se permitió que muestras individuales de semen se licuaran a temperatura ambiente (normalmente durante 1 /2 a 3 horas) y el esperma maduro se separó de plasma sem inal, células germinales inmduras y células no de esperma (principalmente glóbulos blancos y células epiteliales) por centrifugación de gradiente de densidad de Percoll . El semen licuado se cargó cuidadosamente sobre un gradiente de densidad de Percoll de dos capas consistiendo de 80% (capa inferior de 1 ml) y 55% (capa superior de 2 ml) de solución isotónica de Percoll preparada en medio F-1 0 de Ham . Después de la centrifugación a 300 x g durante 1 8 minutos a temperatura ambiente, la pella de esperma en el fondo del 80% de la capa se recolectó y lavó tres veces en medio F-1 0 de H am por centrifugación a 450 x g . Las células se contaron antes de la última centrifugación , y la pella se usó para marcado vectorial . Se usó evaluación m icroscópica ligera para confirmar el en riq uecimiento de espermatozoides maduros móviles, y todas las muestras mostraron < 90% de movilidad.

Eiemplo 2 Análisis de plasma seminal Muestras de plasma seminal de dos pacientes que habían experimentado vasectom ía fueron analizados mediante electroforesis en gel de 2D Siguiendo la recolección de las muestras, se permitió que se licuaran a temperatura ambiente, se examinaron por microscopía para verificar la ausencia de espermatozoides o células germinales inmaduras, se centrifugaron a 1 0, 000 x g durante 5 minutos para remover las células no germinales y cristales prostáticos, y se almacenaron en alícuotas a -70°C hasta usarse.

Ejemplo 3 Radioyodinación Se suspendieron espermatozoides purificados con Percoll en medio F- 1 0 de Ham a una concentración final de 20 x 106/ml. Se adicionaron a la muestra perlas de yodo lavadas (u na perla por 8 x 106 espermatozoides) y Na 25l libre de portador (1 0 uCi por 1 06 espermatozoides) El radiomarcado se realizó al incubar la muestra durante 1 0 minutos a 20°C en una tabla mecedora Las célu las se removieron de las perlas de yodo mediante pipeteo e inmediatamente se sometieron a una segunda centrifugación de gradiente de densidad de Percoll , antes de lavar tres veces en medio F- 10 de Hamm Las células se contaron antes del lavado final y la pella resultante se usó para extracción de prote ínas de esperma (ver m ás adelante) Se realizó la a uto-radiog rafía usando un emparedado de com ponentes en orden pantal la de intensificación , mancha, do s capas de película y pantalla de intensificación. Se expusieron rutinariamente pel ículas de rayos X durante 3 semanas.

Ejemplo 4 Biotinilación Se suspendieron espermatozoides purificados de Percoll en solución salina amortiguada de fosfato en Dulbecco conteniendo 3 mg/ml de NHS-LC-Bíotin (~5mM), a una concentración final de 50 x 106 espermatozoides por ml . La biotinilación de la superficie de esperma se realizó al incubar la muestra durante 10 minutos a 37°C en una tabla mecedora Los espermatozoides se sometieron entonces a una segunda centrifugación de gradiente de densidad de Percoll seguida por tres lavados en medio F-1 0 de Ham . Las células se contaron antes del lavado final y l a pella resultante se usó para solubilización o se almacenó a -70°C. Después de estudios preliminares para optimizar la detección de proteínas biotiniladas, el procedimiento para detectar proteínas de esperma biotiniladas siguiendo electrotransferencia a membranas NC fue como sigue: western blots de 2D se enjuagaron dos veces en PBS pH 7.4 y entonces se bloq uearon los sitios de ligadura en exceso en membrana de nitrocelulosa por incu bación en PBS conteniendo 5% de gelatina y 0.1 % de Tween 20 durante 1 h a 20°C (29) . Esto fue seguido por un lavado de 5 m inutos en PBS e incu bación con avidi na conj ugada con fosfatasa alcalina (50 µl en 250 m l de PBS conteniendo 0.5% de gelatina y 0.01 % de Tween 20) durante 1 h a 20°C. La detección de quim iol uminiscencia de fosfatasa alcalina con el su bstrato de CSPD se realizó de acuerdo a las direcciones del fabricante (TROPIX) La detección colopmétpca de AP se realizó con los substratos de BCI P y NBT como se describió previamente ( 1 7) Las muestras de 5 donadores (incluyendo muestras de 2 de los 4 donadores examinadas por radioyodmación) se examinaron mediante esta técnica de marcado vectorial Eiemplo 5 Procedimientos de solubilización Los espermatozoides se solubilizaron rutinariamente en un amortig uador de lisis (A) conteniendo 2% (v/v) de N P-40, urea 9 8M, DTT 1 00 m M, 2% (v/v) de anfolmas pH 3 5-1 0, y los inhibidores de proteasa PMSF 2 mM, yodoacetamida 5 mM , EDTA 5 mM , 3 mg/ml de TLCK, Pepstatina A 1 46 µM y Leupeptina 2 1 µM Se solubilizaron 5 x 108 células por ml mediante agitación constante a 4°C durante 60 minutos Se removió el material insoluole por centrifugación a 1 0,000 x g durante 2 minutos, y el sobrenadante se aplicó a la primera dimensión electroforética Las muestras de plasma seminal congeladas de pacientes con vasectom ía se descongelaron mediante adición de cuatro volúmenes de amortiguador de sis A conteniendo los inhibidores de proteasa antes mencionados Otros experimentos emplearon un amortiguador de tisis aniónico/zwittepónico (B) [como es dado por Hochstrasser (30)], consistiendo de 2% (p/v) de SDS , 3% (p/v) de CHAPS , urea 7 2 M, DTT 100 mM 4% de anfolinas pH 3 5- 1 0 e inhibidores de proteasa La solubilizacion tiene lugar a 22°C durante 45 min con una concentración de esperma de 3.5 x 108 células por ml. Las muestras se agitaron cada cinco minutos por inversión de los tubos de microcentrífuga, para minimizar el desdoblamiento de DNA, porque la agitación constante o calentamiento en presencia de SDS y agentes reductores conduce a solubilización de la envoltura nuclear y el desdoblamiento del DNA superembobinado (Naaby-Hansen y Bjerrum, resultados sin publicar). Las concentraciones de proteína se determinaron al usar el método de ácido biocinconínico de Pierce de acuerdo a las especificaciones del fabricante, empleando albúmina de suero boviono (BSA) como un estándar.

Ejemplo 6 Electroforesis Se realizó enfoque isoeléctrico (IEF) en barras de acrilamida de 15 x 0.15 cm, usando ya sea la composición de gel propuesta por Hochstrasser et al (30) o por Cells et al (16). Las composiciones de anfolina portadoras fueron ya sea 20% pH 5-7, 20% pH 7-9 y 60% pH 3.5-10 o 28% pH 3.5-5, 20% pH 5-7, 7% pH 7-9 y 45% pH 3.5-10.65 µl de extracto de esperma (aprox. 0.15 mg de proteína) o 35 µl de muestra de plasma seminal (aprox. 0.15 mg de proteína) se aplicaron por barra. Los tubos se llenaron al echar encima suavemente la muestra con un amortiguador conteniendo 5% de NP-40, 1% de anfolina pH 3.5-10, urea 8 M y DTT 100 mM. El enfoque se condujo por un total de 19,300 volt-horas usando escalonamiento de voltaje: 2 h a 200 V, 5 h a 500 V, 4 h a 800 V, 6 h a 1200 V y 3 h a 2000 V.

Se realizó una electroforesis de gradiente de pH no en equilibrio (NEPHGE) en 14 x 0.15 cm de barras de acrilamida usando la composición de gel descrita por Celis et al ( 16) . La composición de anfolita portadora fue 37% pH 5-8, 1 3% pH 6.5-9, 37% pH 8- 1 0.5 y 1 3% pH 3.5-1 0. Se aplicaron 55 ul (aprox. 0. 13 mg de proteína) de extracto de espermatozoides o 30 ul de muestra de plasma seminal (aprox. 0.13 mg de proteína) por barra. Estas concentraciones de proteína dieron tamaños de manchas similares en geles de NEPHGE como se alcanzaron por concentraciones ligeramente mayores en geles de I EF usando el protocolo de Hochstrasser. La electroforesis fue conducida por un total de 9800 volt-horas, 400 volts por 1 1 horas y 600 volts por 9 horas. La SDS-PAGE de seguna dimensión se realizó en geles de plancha de 16 x 1 6 cm o 1 6 x 20 cm usando geles de gradiente lineal (T=7.5-1 5% o 9- 1 5%) en un aparato protean I I xi Mu ltiCell (Bio-Rad) . El manchado con plata se realizó de acuerdo a Hochstrasser et al (30) . La electrotransferencia a membranas de nitrocelulsa se logró como se describió previamente (23). La electrotransferencia a membranas PVDF (0.2 µm de tamaño de poro, Pierce) se realizó como se describió por Herizel et al . (31 ) usando la composición de amortiguador de transferencia de Matsudaira (32) (ácido 3-[ciclohexilamino]-1 -propanosulfónico 1 0 mM, 1 05 metanol , pH 1 1 ) . Rutinariamente, se transfirieron seis gels de 2-D simultáneamente a una corriente constante de 0.5A durante 2 horas usando tres células "transblot" (Bio-Rad) conectadas al mismo suministro de energ ía.

Ejemplo 7 Análisis de inmunoblotting Siguiendo la transferencia electroforética de los polipéptidos separados de 2-D, se enjuagaron las membranas de inmovilización dos veces durante 5 m inutos en PBS pH 7 4 y los sitios de ligadura en exceso se bloq uearon mediante incubación durante 30 min utos a temperatura am biente en PBS pH 7 4 conteniendo 5% de leche deshidratada y 0 05% de Tween 20 Se incubaron manchas de 2-D con 1 00 ml de anticuerpo primario durante 2 horas a 22°C o durante la noche a 4°C, bajo constante mecido lento Se emplearon los siguientes anticuerpos antiactma (clon de mAb de ratón C4, Boehpnger Mannheim , 0 3 µg/ml) , anti-ß-tubulma (tu de mAb de ratón 27BC, sobrenadante de hibpdoma, regalo del Dr Robert Bloodgood , University of Virginia, diluida 1 5), anti-a-tubulma (mAb de ratón , clon DM-1 A, Sigma , diluida 1 1 0,000), ant?-SP-10 (mAb de ratón MHS- 10, diluido 1 5,000) , proteínas de cubierta anti-fibrosa (mAb de ratón S69, regalo del Dr C G Lee, University of Vancouver, BC, diluida 1 1 , 000) y ant?-PH-20 (Ab policlonal de conejo R-1 0, regalo del Dir Paul Pp makoff, UC Davis, diluida 1 3,000) Los anticuerpos conjugados con enzima secundarios (Ig anti-ratón de cabra e Ig anti-conejo de cabra) se diluyeron 1 5000 en PBS más 0 05% de Tween 20, y las manchas se incubaron durante 1 5 h a 20°C Ninguno de los anticuerpos secundarios se ligo a las proteínas de esperma humano manchadas Se visua lizaron conjugados de peroxidasa de rábano picante de manera calorimétrica usando DAB como un su bstrato o por ECL usando el protocolo del fabricante (Amersham Corp ) Para detectar los residuos de tirosina fosfoplados se empleó mAb RC-20 (Transduction Laboratories) Las manchas se bloquearon por incubación en 1 % de BSA en Tris 10 mM, pH 7 5, NaCI 0 1 M , 0 1 % de Tween 20, durante 20 minutos a 7°C Se diluyó mAb RC-20 conjugado con peroxidasa de rábano picante 1 .2500 en el amortiguador anterior, las manchas se incubaron durante 20 minutos a 37°C, y se detectó la ligadura por ECL Con el fin de identificar la ubicación exacta de un antígeno inmuno-reactivo en el patrón de proteína de 2-D complejo, en algunos experimentos se precedieron incubaciones de anticuerpos por manchado con oro con Protogold (Goldmark Biologicals) Se siguió el protocolo del fabricante, con la modificación de que el bloqueo de la membrana se realizó en 0 0% de Tween 20 durante 30 minutos Esta concentración de Tween 20, en lugar del 3% de Tween 20 recomendado, resultó en mejor resolución de manchas con patrones de manchado menos confluente en áreas con alta densidad de polipéptidos Ejemplo 8 Rastreo en gel y análisis por com putadora Los geles manchados fueron rastreados en un estado húmedo con una cámara Kodak de alta resolución , y la información se digitalizó en una computadora SUN Las películas de rayos X de experimentos auto-radiog ráficos y de quimiolumin iscencia se rastrearon ya sea con la cámara Kodak o un scanner de láser scanmaster 3+ H owtek Las imágenes de 2-D resultantes se analizaron con un programa de Bioimagen "2D Analyzer" Las muestras de esperma de 40 donadores se analizaron sobre 500 geles de 2-D con el fin de optimizar los procedim ientos Siguiendo el establecimiento de un protocolo confiable, las muestras de esperma de 8 donadores se analizaron repetidamente en geles de 2-D y los patrones de proteína fueron comparados con el fin de reducir la semejanza de catalogar manchas de artefactos Las manchas que aparecieron en dos o más análisis de cada donador fueron consideradas válidas La igu alación de manchas en diferentes imágenes de gel se realizó mediante el programa de computadora después de que se habían igualado manualmente por el operador tantas manchas de referencia como fue posible (para geles manchados con plata el máximo de 100 permitido por el programa) Los puntos isoeléctricos y pesos molecu lares de manchas desconocidas fueron interpolados por el programa de computadora en la base de la posición de estándares internos de co-migración, y además, los resultados de peso molecular fueron verificados manualmente mediante cálculos en gráficas semilogarítmicas Los estándares internos (BIO-RAD) fueron conalbúmina de clara de huevo de gallina tipo I , MW 76,000, pl 6 0, 6 3 y 6 6, albúmina de suero bovino, MW 66,200 pl 5 4, 5 5 y 5 6, actina de músculo bovino, MW 43,000 pl 5 0 y 5 1 gl?ceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de músculo de conejo (GAPDH ) , MW 36,000, pl 8 3 y 8 5, anhidrasa carbónica de bovino, MW 31 ,000, pl 5 9 y 6 0; inhibidor de tripsina de soya, MW 21 ,500, pl 4 5, y mioglobina equina , MW 1 7 , 500, pl 7 0 Se aplicaron creati na fosfocmasa carmailada (MW 40,000 y ra ngo de pl aparente de 4 9-7 1 ) y GAPDH carbamilad a (MW 36 000 y rango de pl aparente de 4 7-8 3) (Pharmacia) como marcadores de pl Resultados Geles de 2-D manchados con plata (20 x 1 6 cm) de prote ínas de esperma humano solubilizados en detergene no iónico/urea resolvieron 1397 diferentes manchas de proteína (963 por lEF/PAGE y 434 por NEPHGE/PAGE) (Figura I A&B) 1345 de las 1397 proteínas fueron identificadas en muestras de al menos dos de los donadores 191 proteínas (838 por l E F/PAGE y 353 por NEPHGE/PAGE) se resolvieron cuando se empleó el amortiguador de lisis aniónico/zwittepónico para la solubilización de esperma (Figura 9 A&B) El patrón de proteína fue altamente reproducible, aunque se observaron variaciones menores entre donadores Por ejemplo, la Figura 2 ilustra diferencias en la abundancia de una proteína de 39 5 kDa entre 3 donadores El patrón de 2-D de proteínas de esperma humano difiere significativamente del patrón de 2-D de proteínas de plasma seminal humano (HSP) (Figura 1 ) Más de 300 proteínas de plasma seminal fueron visualizadas mediante manchado conplata siguiendo separación electroforética de 2-D (Figura 1 , C&D) Los polipéptidos de plasma sem inal, los cuales co-m igraron con proteínas de esperma fueron identificados mediante igua lación por computadora de geles man chados con plata conteniendo prote ínas de esperma, proteínas de plasma seminal, o una mezcla de ambas, lo cual aseguró una comparación precisa Mediante esta aproximación se identificaron nueve proteínas con MW por encima de 20 kDa como proteínas de recubrimiento de esperma derivadas del plasma sem i nal (indicadas por flechas en la Figura 1 ) Las nu eve se marcaron vectopalmente ya sea con radioyodo o biotina o ambos (ver Figuras 7, 8 y 1 1 ) En general , la identificación de proteínas de recubrimiento de esperma del plasma seminal con masas moleculares por debajo de 20 kDa fue difícil debido a una abundancia de productos de degradación de plasma seminal, especialmente en el rango de pH básico (Figura 1 D), de acuerdo con las observaciones por Edwards et al (33) En un experimento, se compararon geles manchados con plata conteniendo esperma recolectado después de 1 hora con geles cargados con proteínas de la m isma muestra que se permitió que licuara durante 3 horas. No pudo detectarse ning una diferencia significativa, indicando que no se indujeron mayores modificaciones de las proteínas de superficie de esperma por enzimas de plasma sem inal siguiendo la licuefacción (datos no mostrados) Ejemplo 9 Radioyodinación de proteínas de superficie de espermatozoides humanos La cinética de incorporación de 125l en proteínas de esperma humano se examinó con y sin catálisis de Perlas de Yodo El tiempo de reacción óptimo fue de 1 0 minutos, después de lo cual la velocidad de incorporación de radioyodo en la pella de esperma declinó, indicando que los fenoles accesibles de la superficie estaban saturados (Figura 3) En la ausencia de perlas recubiertas con N-clorobencenosulfoamida catalíticas , menos de 1 % del 1 25l se incorporó en las células Aunque el radioyodo fue incorporado a una velocidad mayor con concentraciones más altas de perlas , el uso de mas perlas resu lto en destrucción progresiva de membrana , radiomarcado de estándares de proteínas internas, y movilidad del esperma disminuida. Por lo tanto, se redujo adicionalmente el número de las perlas oxidantes a una perla por 8 x 106 espermatozoides. Esto redujo la cantidad de incorporación de radioyodo a 50% comparado con la proporción anterior de perla/células, pero conservó la movilidad del esperma después del marcado. Para determinar si la radioyodinación ocurrió solo en la superficie del esperma, se realizó una auto-radiografía a partir de nitrocelulosa o manchas de PVDF, las cuales habían sido ¡nmunomanchadas con anticuerpos para proteínas intra-acrosomales y citoesqueléticas (Figuras 4, 5 y 6) . Para eliminar las células dañadas o que reaccionaron en acrosoma del análisis, la población de esperma se separó por centrifugación de gradiente de densidad de Percoll inmediatamente después de la radioyodinación. La comparación del espermayodinado con [Fig 4B] y sin [Fig 4A] la centrifugación de densidad de Percoll mostró que, aunque los extractos de esperma que experimentaron la segunda centrifugación de gradiente de densidad tuvieron menos proteínas marcadas, hubo una mayor resolución de proteínas individuales, y nada de marcado de las proteínas marcadoras de control intracelular (la proteína acrosomal, SP-1 0, Figuras 4 y 6; actina, Figuras 4 y 5; componentes de cubierta fibrosa , Figura 9; y tubulina, Figura 5). Esto soporta fuertemente la especificidad de superficie del procedimiento de radioyodinación modificado. Cuando se com pararon extractos de esperma radioyodinados en presencia y ausencia de agentes red uctores , se identificaron varias proteínas de superficie participando en complejos de peso molecular alto, estabilizados por puentes disulfuro entre cadenas (Figura 5). Las muestras de espermatozoides de 4 donadores se analizaron después de la radioyodinación, separación de gradiente de densidad de Percoll post-marcado, y extracción con NP-40 yurea. El patrón de proteínas radioyodinadas fue altamente reproducible de donador a donador como se puede apreciar al comarar dos de los donadores, Figuras 7A+B a 7C + D. El análisis de imagen por computadora de geles de los cuatro donadores mostraron radioyodinación consistente de 181 proteínas de superficie de esperma (103 lEF/PAGE y 78 NEPHGE/PAGE) con Mr entre 5 y 150 Kd y pl variando de pH 4 a 11. Se notaron variaciones menores entre donadores en la carga, así como en la concentración relativa de algunas de las proteínas marcadas, según fue estimado por densidad óptica; por ejemplo, los complejos de proteína de 90-95 Kd indicados por las flechas en la figura 7. El alto nivel de reproducibilidad de experimento a experimento puede ser apreciados adicionalmente al comparar proteínas yodinadas en las Figura 4 y 7.

Ejemplo 10 Biotinilación de proteínas de superficie de esperma humano Los patrones de 2-D de proteínas biotiniladas de muestras de espermatozoides incubados con la NHS-LC-biotina sulfonada durante 10, , 30 y 45 minutos se compararon usando el método de detección de ECL (datos no mostrados). No se observó ninguna diferencia entre el número de proteínas marcadas después de una exposición a biotina de 10 o 20 minutos Sin em bargo, tiempos de incubación mayores (30-45 minutos) resultó en marcado prog resivo de prote ínas citoesquelél icas e intraacrosomales, asi , se usó un periodo de biotinilación de 10 minutos en estudios subsecuentes Debido a la adición de 1 % de albúm ina de suero bovino al primer amortiguador de lavado para reaccionar con la biotina residual (según se recomienda en muchos protocolos de biotinilación), resultó en adherencia de cantidades importantes de BSA biotm ilado a la superficie del espermatozoide, muestras de esperma se sometiero n en su lugar a centrifugación de gradiente de densidad de Percoll siguiendo el marcado Las Figuras 8A & B exh iben películas quim iolum iniscentes de geles de dos dimensiones conteniendo proteínas de espermatozoides biotm ildas solubil izadas por el amortiguador de lisis no iónico A Las muestras de esperma biotmiladas de 5 donadores se separaron mediante I EF y N EPHG E y las imágenes fueron comparadas mediante análisis por computadora Se resolvieron y catalogaron doscientas veintiocho manchas de proteínas biotmi ladas con Mr entre 5 y 1 20 Kd y pH variando desde pH 4 hasta pH 1 0 De manera i nteresante, cuando se incubaron proteínas de esperma no biotmiladas con AP-avidina sola como un control (Figuras 8C y 8D), un racimo de cinco prote ín as de espermatozoides con Mr de 76 kDa y pl entre 6 y 6 5 se unieron a la avidina m arcada La naturaleza de estas proteínas endógenas que ligan avidma esta siendo investigada en la actua lidad No se detecto ninguna actividad de fosfatasa alcalina endógena en estas u otras proteínas cuando se desarrollaron manchas de control sin exposición anterior a AP-avidina (datos no mostrados) Cuando se empleo el amortiguador de 11 sis anionico/zwittepónico B para extrar proteína de esperma (Figuras 9A & B), pudieron resuolverse 208 proteínas biotmiladas (Figuras 9C & C) Pudieron reconocerse vanas constelaciones de proteínas en el patrón de biotma a partir del patrón logrado siguiendo la extracción con detergente no iónico (comparar Figuras 9C y 9D con Figuras 8A y 8B) Para validar la especificidad de la biotmilación y métodos de extracción para la superficie del esperma, se inmunolocalizaron proteínas citoplásmicas de control y su estado de biotinilación se determinó por comparación con la película ECL Ninguno de los controles internos, actina, tubulma, componentes de cubierta fibrosa o SP-10 fueron biotmilados (Figura 9) En contraste con los resultados con proteínas citoplásmicas conocidas, las mmunomanchas en las Figuras 9G y H muestran la posición de la hialurolidasa de superficie de esperma PH-20 después de la extracción SDS/CHAPS e inmunoblottmg con el antisuero de conejo policlonal R-10 Se extrajeron dos formas de peso molecular de PH-20 a 64 y 53 kDa mediante SDS/CHAPS (flechas en las Figuras 9G y H) El antígeno de 53 kDa pudo ser resulto en 3 isoformas siguiendo solubilización con NP-40/urea (Figura 8E) y en 5 isoformas siguiendo la solubihzación con SDS/CHAPS/urea (Figura 9G) La posición exacta de los antigenos de PH-20 en los patrones de 2-D biotinilados y manchados con plata se muestra en las Figuras 9A y 9C La biotinilacion de PH-20 una protema de superficie conocida (34) sirve como un control positivo para la especificidad de superficie del procedimiento de marcado Ejemplo 11 Demostración de proteínas de superficie fosforiladas en residuos de tirosina El Mab anti-fosfotirosina, RC-20 se unió a fosfoproteínas de esperma reción eyaculado (Figura 10) Las proteínas, las cuales estaban más pesadamente fosfopladas en residuos de tirosma, tuvieron masas moleculares de 89-95 Kda (flechas en la Figura 10A) El análisis por computador reveló cinco grupos de proteínas de superficie fosfopladas en residuos de tirosma Las 22 isoformas de proteínas de estos grupos están indicadas por una estrella en la Tabla III Ejemplo 12 Análisis por computadora de resultados de 2-D La Figura 11 presenta una imagen generada por computadora de las proteínas de espermatozoides humanos visualizada por manchado con plata siguiendo solubilizacion con NP-40 y UREA Noventa y cuatro de las noventa y ocho proteínas las cuales fueron marcadas tanto por yodinación de superficie como por biotmilacion de superficie y que pudieron ser igualdas con proteínas manchadas con plata, están encerradas en la figura 11 El Mr, Pi y abundancia relativa (basada en cuantificación gaussiana) están registrados en la Tabla III para las proteínas de superficie doblemente marcadas Las manchas de las proteínas marcadas fueron expuestas durante varias longitudes de tiempo para asegurar la detección óptima tanto de señales fuertes como débiles Para elim inar la posibilidad de que las variaciones en migración entre proteínas marcadas y no marcadas afectara el análisis , se igualaron auto-radiog ramas y pel ículas de ECL de biotina con los geles manchados con plata o manchas maculadas con oro correspondientes Estas imágenes compuestas se igualaron entonces con imágenes compuestas de geles manchados con plata de proteínas no marcadas La presente invención adelanta el entendimiento de la composición de las proteínas de membrana, particularmente de esperma humano al establecer una base de datos de gel de 2-D extensa incluyendo 1 397 proteínas, las cuales fueron solubilizadas por N P-40/UREA y 1 1 91 proteínas las cuales se resolvieron siguiendo el tratamiento de SDS/C HAPS/U REA Para generar esta base de datos, se desarrollaron técnicas para log rar un a alta resolución y para permitir la detección de un rango de proteínas de esperma acidas, neutrales y básicas usando tanto I EF como N EPHGE para separación electroforética de una primera dimensión Un reporte reciente describió la resolución de 680 proteínas de esperma humano en un gel de 2-D (26) , al tiempo que la presente invención utiliza condiciones por las cuales más de 1000 manchas de proteínas fueron res ultas en un gel La resolución mejorada se logró media nte modificación de los procedim ientos de purifica ción y solubilización de esperma , ajuste de la composición de anfolma , y optim izacion de los tie m pos de corrida y esca lonamiento de volta|e tanto para I E F como N E PHG E [ver métodos] En particular, el voltaje incrementado durante N EPHGE tuvo un profundo efecto en la resolución de proteínas solubilizadas por SDS/CHAPS, provocando menos veteado horizontal que cuando se usan tiempos de enfoque más cortos y menos voltaje La comparación del repertorio de proteínas de esperma solubilizadas por los dos amortiguadores de lisis empleados en el presente método mostró importantes diferencias Por ejemplo, se req uirió que el amortiguador de lisis aniónico/zwittepónico/urea alcanzara la solubilización de varios componentes citoesqueléticos Además, este método de extracción condujo a la resolución de cinco isoformas de 53 kDa de la hialuronidasa de superficie de esperma PH-20 , mientras que solo tres isoformas de PH20 de 53 kDa fueron resueltas usando un amortiguador de 11 sis no iónico/urea No obstante, el método de solubilzación no lónicoa/urea fue el método de elección para este estudio porque solubilizó fácilmente la membrana de plasma con m ínima contaminación de las estructuras citoesqueleticas y porque resultó en la determ inación de pl más confiable (por ejemplo, comparar la m igración de ß-tubulina en las Figuras 5 y 9) Se analizaron cuarenta y cuatro geles manchados con plata representando diferentes m uestras de esperma de 8 donadores mediante el programa de cóm puto "2-D Analyzer" Se observaron variaciones menores entre i ndividuos en la abu ndancia y/o la mig ración electroforética de algun as proteínas Variaciones en la expresión de genes , heterogeneid ad genéti ca y variacion es en l as mod ificaciones post-traslacionales podrían contar por esta s diferen ci a s U n ejem plo de lo último es la fosforilación en residuos de tirosma del grupo heterogéneo de proteínas de superficie con MW entre 89-95 kDa Se ha mostrado recientemente que una proteína fosfoplada de ti rosma de tamaño similar posee actividad de cmasa de proteína (35), lo cual fue estimulado por ZP-3 humana, sugependo que esta proteína podría estar involucrada en la lig adura de zona pellucida e iniciación de la reacción de acrosoma Aunque pueden considerarse variaciones en la fosforilación y g licosilación para algunas de las variaciones entre individuos en la mig ración electroforética observada , se necesitan estudios adicionales , tales como análisis de cambios de superficie durane la capacitación, anál isis de cadena latera l de carbohidratos , m icrosecuenciación de proteínas y clonación de cDNA, antes de que puedan sacarse conclusiones definitivas sobre la naturaleza e importancia funcional de las variaciones Se sabe que las proteínas de "recubrim iento de esperma" derivadas de secreciones del epid íd imo, próstata o vesículas seminales se adhieren a la su perficie de los espermatozoides eyaculados (36, 37) La migración de varias prote ínas de plasma seminal fue similar a aquélla de proteínas de espermatozoides en geles de 2-D y se identificaron 9 proteínas de superficie de esperma que parecieron ser de origen de plasma sem inal También se contemplan análisis adicionales por la presente invención , incluyendo aná lisis de prote ínas de pl asma sem ina l no l icuadas (33 , 38), procedimientos de recolección y lavado diferentes , análisis del fluido del epid idimo y es perma, y m icrosecuenciación de las prote ínas separadas de ma nera electroforetica para confi rmar el origen de estas proteínas de s u perficie Algunas de las manchas de proteínas en los patrones de 2-D fueron identificadas a través de inmunoblotting o análisis de comigración (por ejemplo, albúmina y anhidrasa carbónica) La preparación de reactivos inmunológicos para prote ínas de esperma permitió la identificación de muchas de las proteínas en la enciclopedia de proteínas de superficie de esperma por immunoblotting La identificación tentativa de algunas proteínas de esperma también ha sido hecha por comparación de la base de datos de esperma con otras bases de datos de prote ínas de gel de 2-D ( 1 6, 39) Más aún, pueden microsecuenciarse proteínas de superficie seleccionadas siguiendo la purificación por electroforesis en gel de 2-D, degradación de Edman y espectrometría de masa en tándem Se han obten ido exitosamente secuencias de proteínas previamente desconocidas media nte esta aproximación (N aaby-Hansen et al , en preparación) As í, la actualización de la enciclopedia de proteínas de esperma en una base continuada puede ser usada para monitorear el progreso en el entend im iento de la identidad molecular de prote ínas de esperma y para servir como gu ía a las prote ínas que todavía van a ser caracterizadas La base de datos de proteínas de mem brana también es útil en el est udio de desordenes cl ínicos, genéticos y toxicológ icos que afectan el gameto masculino y/o gametogénesis Se resolvieron 1 81 manch as de prote ínas de esperma radioyodinadas siguiendo solubilización en N P-40/UREA, y se marcaron 228 prote ínas med iante biotinilación de su perficie Se marcaron 98 portemas medi ante ambas técnicas Una explicación para los resultados q ue difieren entre rad ioyod inacion y biotin i lacion es q ue se enfocan diferentes residuos de am inoácidos por los agentes de marcado. En la radioyodinación , el marcado ocurre mediante adición electrofílica de 1 25l catiónico a residuos de tirosina y a un grado menor a los otros fenoles, histidina y triptófano (40) , al tiempo que N HS-LC-biotina reacciona con grupos amino primarios (por ejemplo, residuos de lisina o grupos amino libres en carbohidratos o l ípidos) (41 ) . Además, la obstrucción esteárica or cadenas laterales de carbohidratos puede i nterferir con la biotinilación o su subsecuente detección por ligadura de avidina . Si se considera que solo el 60% de las proteínas en el esperma son detectadas por manchado con plata como se mostró previamente para una l ínea de células somáticas (42) , se deduce un estimado de aproximadamente 2300 proteínas de esperma. El número deducido se aproxima al número de proteínas marcadas con [35S] metion ina (>3000) encontradas en células somáticas ( 16, 29) mediante técnicas de separación similares. Así, las 31 1 proteínas de superficie marcadas por uno u otro método representan aproxi madamente 1 2% de las prote ínas de esperma totales. Las 98 proteínas marcadas tanto por yod inación como por biotinilación com prenden un subconjunto de prote ínas, las cuales son consideradas candidatos primarios para microsecuenciación . Las preocupaciones principales en procedimientos para marcar prote ínas de superficie celular con radioyodo o bioti na incluyen : 1 ) estabil izar la especificidad de la superficie (por ejemplo , poco o nada de ma rcado de compone ntes citoplásm icos) ; y (2) log rar suficiente marcado específico en residuos accesibles de su perficie (43 , 44) . Se ha reportado previamente el marcado específico de superficie con yodo usando N- clorobencenosu lfonamida como el reactivo oxid ante en perlas de poliestireno [Perlas de Yodo] (45) y con formas de éster de N-hidroxisuccinimida sulfonadas de biotma (41 ,46,47) En el método actual , las prote ínas intracel ulares conocidas, actina , tubuli na , prote ína de cubierta fibrosa y la proteína intra-acrosomal , SP-1 0, carecen todas de marcado por ambos métodos, pero fue im portante remover células dañadas y que reaccionaron con acrosoma con centrifugación de gradiente de densidad de Percoll siguiendo los procedimientos de marcado, para aseg urar ia especificidad de superficie del aná lisis Ejemplo 1 3 Se separo una proteína de esperma con una masa aparente de 63 kDa y un punto isoeléctrico de 4 3 de otras proteínas de esperma usando el amortiguador de lisis A [MP-40/Urea] y electroforesis en gel de 2 dimensiones preparativa usando geles de 23 x 23 cm La proteína fue transferida a membrana PVDF y la membrana se manchó con azul Coomassie y la mancha de proteína de interés se cortó para m icrosecuenciacion de Edman Para espectrometría de masa, la mancha de prote i na de 60 kDa se hizo núcleo directamente fuera del gel de acplamida preparativo usando un "scaple' fi no y la proteína se digirió como mas adelante Se utilizaron dos métodos de secuenciación , deg radación de Edma n y Espectrometrí a de M asa en Tándem Degradación de Edman La mancha de proteína en la membrana PVDF fue secuenciada en un secuenciador de proteína Applied Biosystems 470A operado de acuerdo a las especificaciones del fabricante, usando un cartucho y ciclos para membranas PVDF Análisis de espectrometría de masa La mancha se cortó del gel tan cerca como fue posible, minimizando extra poliacplamida y se dividió en un número de piezas más pequeñas Las piezas se lavaron y desmancharon en 500 µl de metanol al 50% durante la noche Las piezas en gel fueron deshidratadas en acetonitrilo, se rehidrataron en 50 µl de ditioltreitol 10 mM en bicarbonato de amonio 0 1 M y se redujeron a 55°C durante 1 h La solución de DTT se removió y la muestra se alquiló en 50 µl de yodoacetamida 50 mM/bicarbonato de amonio 01 M a temperatura ambiente durante 1 h en la obscuridad El reactivo se removió y las piezas en gel se lavaron con 100 µl de bicarbonato de amonio 01 M y se deshidrataron en 100 µl de acetonitplo durante 5 min el acetonitplo se removió y las piezas de gel se rehidrataron en 100 µl de bicarbonato de amonio 01 M Las piezas se deshidrataron en 100 µl de acetonitplo, el acetonitplo se removió y las piezas se secaron completamente por centrifugación a vacío Las piezas de gel se rehidrataron en 125 ng/µl de tripsina [bloqueado por autodigesttón] en bicarbonato de amonio 50 mM y se incubaron en hielo durante 45 mm Cualquier exceso de solución de tripsina se removió y se adicionaron 20 ul de bicarbonato de amonio 50 M La muestra se digirió durante la noche a 37°C y los peptidos formados se extrajeron de la poliacplamida en 200 µl de 50% de aceton?tr?lo/5% de ácido fórmico Estos extractos se combinaron y se evaporaron a <20 µl durante el análisis de LC-MS El sistema LC-MS consistió de sistema Fmningan-MAT TSQ7000 con una fuente de iones de electroatomización interfaseada a una columna capilar de fase inversa POROS 1 0 RC de 1 0 cm x 75 um id Se inyectaron vol úmenes de 1 µl del extracto y los péptidos se levigaron de la columna mediante un gradiente de acetonitplo/ácido acético 0 1 M a una velocidad de flujo de 0 6 ul/mm La fuente de iones de electroatomización s e operó a 4 5 kV con un flujo l íq uido de cubierta coaxial de 1 2 µl/mín de 70% de metanol/30% de ag ua/0 1 25% de ácido acético y un flujo de nitrógeno coaxial se ajusto según fue necesario para sensi bilidad óptima La digestión se a nalizó por espectrometría de masa de LC-electroatom ización ca pilar para medir el peso molecular de los péptidos presentes en la digestión Las secuencias de péptidos para los péptidos detectados se determ inaron por disociación activada de forma de colisión usando espectrometría de masa en tándem de LC-electroatomización con argón como el gas de colisión Res ultados Degradación de Edman Se determ inaron 1 5 aminoácidos N-termma les por degradación de Ed man La secuencia obtenida EPAVYFKEQF LDGDG (SEQ I D No 3) revelo 1 00% de identidad para calreticuli na h um an (Gen Pep Acceso # M 84739 ) Espectrometría de masa Los pesos moleculares determinados mediante análisis de LC-MS y secuencias de am inoácidos determinadas por MS en tándem de LC de péptidos en esta digestión se muestran en la Tabla 1 Se observaron nueve péptidos y la información de secuencia se obtuvo para seis de los péptidos Las búsquedas de bases de datos usando información de espectro CAD (MSTag ) y secuencias de péptido parciales (BLAST) identificaron cinco de estos peptidos en la secuencia de calrel icuhna humana (Tabla 2) Tabla 2 Secuencias de péptidos (SEQ ID NOS 4-14) obtenidas por espectrometría de masa de mancha de proteína de masa 63, pl 4.3. Número Peso molecular Secuencia de péptido Secuencia de péptido de medido por CAD1 de número de acceso péptido (M + H + , Da) (MW calculado, M + H + , r31 proteína suiza Da) P27797 1 8528 PAGAVYFK VAEPAVYFK (8530) 2 10196 VHVXFNYK VHVIFNYK (1020.2) 3 11054 t d n n g 4 11480 KVHVXFNYK KVHVIFNYK (11484) 5 12200 GQTXVVQFTVK GQTLVVQFTVK (12205) 6 1351 0 Ininterpretable 7 1411.4 EQFXDGDGWTSR EQFLDGDGWTSR (1411 5) 8 1681 6 Ininterpretable 9 2871 8 Ininterpretable 1X designa I o L, que no pudo distinguirse por CAD de energía baja, las letras inferiores de casila designas asignaciones tentativas, - - - designa un número desconocido de aminoácidos desconocidos.

Diseño de oligonucleotidos degenerados Se eligieron dos secuencias de péptidos como plantillas para el diseño de oligonucleótidos degenerados la Secuencia de Péptido #1 -EPAVYFKEQFLD (SEQ ID NO 15) y la Secuencia de Péptido #2 -KVHVIFNYK (SEQ ID NO 11) Ver figura 12 La Figura 12 muestra datos de microsecuencia de aminoácidos obtenidos por degradación de Edman y espectrometría de masa en tándem de una proteína de esperma de 63 kDa, pl 43 elegida para diseño de oligonucleótidos complementarios y complementarios inversos A partir de esta información de microsecuencia se sintetizaron depósitos de iniciadores de oligonucleótidos degenerados para comenzar PRC [ver fig 13] La secuencia de proteína #1 y su oligonucleótido de sentido se muestra a continuación (SEQ ID NOS 16-18) Extremo N-E P A V Y F 5'-GA(A/G)-CC(T/C/AG)-GC(T/C/A/G)-GT(T/C/A/G)-TA(T/C)-TT(T/C)- O go optimizado 5'-GC(T/C)- GT(C/G)- TAC- TTC- K E Q F L -Extremo C AA(A7G)-GA(A/G)-CA(A/G)-TT(T/C)-CT(T/C/A/G) AAG- GAG- CAG- TTC- CT-3 La secuencia de proteína #2 y su ohgonucleotido de sentido se muestra a continuación (SEQ ID NOS 12 19 20) Extremo N-K V H V I F 5'-AA(A/G)-GT(T/C/A/G)-CA(T/C)-GT(T/C/A/G)-AT(T/C)-TT(T/C)-O go optimizado 5'-AG- -GTG-CA(T/C)-GTG- ATC- TTC- N Y K AA(T/C)-TA(T/C)-AA(A/G)-3' AAC- TAC- AAG-3' Debido a la degeneración del código genético, el uso de codón óptico (Lathe, 1 985) se empleó para diseñar "oligonucleótidos optim izados" Los parámetros adicionales que tocaron en el diseño fueron q ue A) se utilizaron áreas de secuencia de proteína con la menor degeneración para dism inuir la complejidad del diseño de ohgonucleótido, B) se fabricaron ohgonucleótidos degenerados con el fin de cubrir todas las permutaciones de secuencia razonables, y C) se fabricaron o gonucleótidos con longitudes de 20-30 nucleótidos (Ausubel et al, 1 996) depend iendo del contenido de G-C del oligonucleótido propuesto, el nu mero de resid uos de am i noácidos confiables que fueron secuenciados y la temperatura de fusión que es inherente a ese depósito de ol igonucleotido particular La secuencia de proteína #1 (EPAVYFKEQFLDG D) (SEQ I D NO 21 ) dio lugar a la secuencia de ol igon ucleotido posible 5'-GA/A/G)-CC(T/C/A/G)-GC(T/C/A/G)- GT(T/C/A/G)-TA(T/C)-TT(T/C)-AA(A/G)-GA(A/G)-CA(A/G)-TT(T/C)-CT T/C/A/G) o (SEQ I D NO 1 7) TT(A/G)-GA(T/C)-GG(T/C/A/G)-GA( T/C)-3' (S EQ I D NO 22) Apl icando el codon optim izado el uso y los otros parámetros descritos antes, se derivó una secuencia de ohgonucleótido final como sigue: 5'-GC(T/C)-GC(C/G)-TAC-TTC-AAG-GAG-CAG-TTC-CT-3' (SEQ ID NO:23). De igual manera, la secuencia de proteína #2 (KVHV(I/L)FNYK)(SEQ ID NO:7) cuando se optimizó y se tomó el complemento inverso, dio lugar a la secuencia de oligonucleótido 5'-CTT-GTA-GTT-GAA-GAT-CAC-(A/G)TG-CAC-CT-3' (SEQ ID NO:24). La fabricación de sondas de oligonucleótidos fue realizada por la Universíty of Virginia Core Group Facilities. Clonación de RT-PCR usando depósitos de oligonucleótidos degenerados La clonación de PCR se realizó al transcribir de manera inversa primero 0.05 µg poli-(A)+ RNA en una reacción de 20 µl al combinar 0.5 µg de oligo-d(T)12.,8 RNA y agua tratada con dietilpirocarbonato (DEPC) antes de calentar a 65°C durante 10 min. Subsecuentemente, se adicionaron 2 µl de amortiguador RT 10X, 05 µl de inhibidor de ribonucleasa de placenta (36 U/µl, Promega), 1 µl de 4dNTPs 10 mM y 1 µl de AMV transcriptasa inversa (23 U/µl); Stratagene), se agitaron y la mezcla se incubó durante 60 mm a 42°C Después de la adición de 80 µl de H2O tratada con DEPC, se amplificaron alícuotas de 1 µl de la solución de cDNA durante 40 ciclos (94°C durante 45 s, 38/44/50/56°C durante 45 s, 72°C durante 2 min) como se especificó por el fabricante de Taq polimerasa (Promega o Perkin elmer) La separación y aislamiento de los productos de PCR se logró mediante electroforesis de alícuotas de reacción en geles de 24% de agarosa hechos 1X en amortiguador TAE (Tris-acetato 40 mM, EDTA 1 mM) y recolección de fragmentos específicos Después de la precipitación y cuantificación, los fragmentos de PCR se ligaron en vectores pCR-Script de acuerdo a las instrucciones de los fabricantes (Stratagene) y se secuenciaron . Los oligonucleótidos optimizados degenerados se emplearon en reacciones de PCR con cDNA testicular fabricado por transcripción inversa de poli-(A)+ RNA testicular humano. Las reacciones se PCR se analizaron en geles de agarosa [Fig ura 1 3] para demostrar un producto de PCR prominente simple a aproximadamente 400 pb de las reacciones con las temperaturas de templado de 38, 44 y 50°C (Fig . 1 3, campos 5, 8, 1 1 ) contra los controles negativos realizados a las mismas temperaturas (Fig. 13 , campos, 3,4,6,7,9, 10, 1 2 , 13) . La electrolevigación de la banda de 400 pb, clonación en el vector pCR-Script, secuenciación y anál i sis por computadora revelaron que la secuencia de la banda fue idéntica a cDNA de calreticulina somática (Gen Bank acceso #m84739) y por lo tanto, la mancha de gel de 2-D de la cual se derivaron los iniciadores de oligonucleótidos, fue una forma testicular de calreticulína (Figura 14). La Figura 1 4 muestra la secuencia de DNA (S EQ I D NO:25) obten ida del clon derivado por RT-PCR utilizando iniciadores optimizados, degenerados. Los números indican posición de pares de bases en clon secuenciado y en el gene de calreticu lina; (c) designa el clon de RT-PCR (SEQ I D NO:25) al tiempo q ue (H) desig na el cDNA de calreticulina hu mana de Gep Bank (SEQ I D NO: 26) .

TTCCCGCTGGATCGAATCCAAACACAAGTCAGATITTGGCAAATTCGTTCTCAGTTCC(JG 80C rrCCCGCTGGATCGAATCCAAACACAAGTCAGAT rrGGCAAATTCGTTCTCAGTTCCGG 269H CAAGTTCTACGÍ3TGACAGAGNAAAANATAAAGGTTTGCAGACAAGCCAGGATGCACGCTT 140c I lll CAAGT CTACGOTGACGAGGAGAAAGATAAAGGTTTGCAGACAAGCCAGGATGCACGCTT 329H TTATGCTCTGTCGGCCAGTTGCGAGCCTTTCAGCAACAAAGGCCAAACGCTGGTGGTGCA 200C TTATGCTCTGp^3GCCAGTITCGAGC(2TrTCAGCAACAAAGGCCAGACGCrGGTGGTGCA 389H GTTCACGGTGAAACATGAGCAGAACATCGACTGTGGG ?jCGGC ATGTGAAGCTGTTl"CC 260c GTTCACGGTGAAACATGAGCAGAACATCGACTGTGGGGGCGGCTATGTGAAGCTGTp,CC 449H TAATAGTTTGGACCAGACAGACATGCACGGAGACTCAGAATACAACATCATGTTTGGTCC 320c IIHI TAATAGTTTGGACCAGACAGACATGCACGGAGACTCAGAATACAACATCATGTTTGGTCC 509H CGACATCTGTGGCCCTGGCACCAAAAAGGTC :ATGTGATCTTCAACTACAAG 372c lllll lllll CGACATCGGTGGCCCTGGCACCAAGAAGGTTCATGTCATCTTCAACTACAAG 561H Este ejemplo demuestra el exitoso aislamiento de cDNA testicular humano em pleando los datos de secuencia de aminoácidos obtenidos mediante microsecuenciación de una mancha de proteína de gel de 2-D Ejemplo 14 Se separó una proteína de esperma , I-23, de la enciclopedia {índice] de superficie de esperma [Tabla III] con una masa aparente de 54 kDa y un punto isoeléctrico de 5 3 de otras proteínas de esperma usando amortig uador de l isis A [NP-40/Urea] y electroforesis en gel de 2 dimensiones preparativa usando geles de 23 x 23 cm Esta proteína se sel eccionó com o un ejem plo de una m olécula de su perficie celular marcada vectorial m ente dos veces Para espectrometría de masa , la mancha de 10 proteína 1-23 se hizo núcleo directamente fuera del gel de acrilamida preparativo usando un scaple fino y la proteína se digirió en e l gel de acrilam ida y se procesó para espectrometría de masa en tándem como se describió antes en el Ejemplo 1 3. La Figura 1 5 muestra las microsecuencias de proteína derivadas por espectrometría de masa en tándem de la proteína de superficie de esperma I-23. La Figura 1 5 muestra microsecuencias obtenidas de la Proteína I-23 en el í ndice de Superficie de Esperma. A) Las secuencias son una compilación tanto de anál isis CAD y análsis CAD de derivado N-terminal. X designa I o L , que no puede distinguirse por CAD de baja energ ía. (-) designa un aminoácido desconocido, el cual req uiere análisis adicional. (Y/Z) designa dos posibles aminoácidos alternativos para esa posición , lo cual requiere análisis adicional . Las letras menores de casilla designan asignaciones preliminares de secuencia. B) Diseño de oligonucleótidos complementarios y complementarios inversos.

A) Secuencias de péptidos- (SEQ ID NOS:27-35) Péptido #1 - SPXXSXK Péptido #7 - VTNSTGGSpxk Péptido #2 - XQANNA— K Péptido #8 - ininterpretable Péptido #3 - VATEFAFR Péptido #9 - -PEVD-tR Péptido #4 XSXNXR Péptido # 1 0 - ininterpretable Péptido #5 - -SMXXDTK Péptido #1 1 - -QAENA— K Péptido #6 -MET(x/n)(e/q)XDR B) Secuencia de proteína #3 se muestra ohgonucleótido de sentido (SEQ ID NOS 29, 36, 37) Extremo N-V A T E F 5'-GT(C/T/A/G)-GC(C/T/A/G)-AC(C/T/A/G)-GA(A/G)-TT(T/C)-Ohgo optimizado 5'-GTG-G(C/T)C- AC(A C)- GAG- TT(T/C)- A F R-Extremo C GC(CTAG)-TT(TC)-CG(CTAG)[AG(A/G)]-3' G(CT)C- TTC- (C/A)G-3' Secuencia de proteína #7. se muestra oligonucleótido de sentido (SEQ ID NOS 38-40) Extremo N-V T N S T 5'-GT(CTAG)-AC(CTAG)-AA(TC)-AG(TC)-AC(CTAG)- TC(C/T/A/G) Oligo optimizado 5'-GT(G/C)-ACC- AAC- (A/T)(G/C)C-ACC G G-Extremo C GG(C/T/A/G)-GG(C/T/A/G)-3' GGC- GCC-3' Se rea lizó RT-PCR co m o se d escribió e n el ejem plo 1 3 y los productos se analizaron en geles de agarosa como se muestra en el ejem plo 1 3 El producto de PC R princi pal fue aproximadamente 1000 pb Este se clonó el vectro pCR-Script y se secuenció. La secuencia de esta novedosa proteína de superficie de esperma se muestra en la figura 1 6. La Figura 1 6 muestra una secuencia de DNA de 1 01 1 pb (SEQ ID NO:41 ) obtenida del clon derivado por RT-PCR utilizando iniciadores degenerados, optimizados para la proteína de superficie de esperma I-23. 1 TCNNCGNNGG GGGGNNANGC GCGGNANA N GGCTANNNAG GCGGNGANNC 51 NGAGCAGNNC ATTCGCGGGN GAGGCNNTNN TANA AAANAC NNNTGNANCC 101 NNAATANGCC AAACGCCANA GGAGGGGNNG NAAANCGGCN NAANNCNCCN 151 NAAAAAANAN NTNCNAANCN CGGNTGGGGA GAAAATNCCC ATTACAGGNC 201 NTCTNCCCAN NCAGTTTTTT CCAATTACA A GGNGGGGGGN NGGGNTTTTC 251 N AA AAANGCG CGTTCCCNTT CNGGGGNTNA A AAAAAANAG GGNNGCCTTT 301 TCCAAGACTN NGCGGGCCCC TTTGGNCTGC ACNANCACGC GGGTCAAAGG 351 CTNNACCGNA AGGGGG AACC CTAAN AGTTT TTCAAGGCCC CAGGGGGNNC 401 GGCCCNGGCT TC AA A A A AGN CTTGCCAGN A ATGN AGATTC N A ACATNN AG 451 AGGAAGNCCA NCCAGGNCCN TCGGGTAAGA TTAAAAGGGA GGTTTGTTTT 501 CCAAGTTCCN ACGGCCGGCA AGA AAAGGCT NAGGGGCNCN TGAGNNCCCC 551 CTGGGAGGGG NCCGAAGCCG GCNNGAGGTC ATCCCGGAAA TGGGGGTNGN 601 AGAGCNGGNA ACAGCAGTGG GNTGAGGCAG GNAGGCAGGG GCCAGCANCA 651 ACAGCAGGAC AGACTTGANG GCCTCGGGCG NGACAGGGAA GAGGCCCAGC 701 ATGGAGGCGA AGCTGAGGAA GGCCACGGNA CAGTAGAGGA GCCCGTCTGA 751 GAAGATGANN NAGGCCACGT GCCTNACCAT GGNGCAGTCC GANAACGGCT 801 TCAA AGTNGC CCCGCGGN AN GTNACAGTAN AATTTGAN AT AGGCACCGGC 851 CACGACCAGG A AACAGAAGG AGNTNATNAT NACCAGGGCC ACGGTGAAGC 901 CCAGGGATGN NGGCTGACCC TNAGGTGGGG CGTAGGGCAN GNAGAATNGG 951 GNGNCNCAGT ATTCTCCNAT CTGAGTCCAG GGTATGTGTC NGCCTCCATA 1001 TCCTCCCNGT T Este ejemplo dem uestra el proceso para identificar y aislar cDNAs de novedosos vaunógenos de superficie celular empezando con prote ínas de superficie celu lar m arcadas dualmente en geles de 2-D seg uido por microsecuenciació , diseño de oligon ucleótido optim izado y RT-PCR . Este proceso combinado crea, de esta manera , un procedimiento racional para diseño de vacu nas pa ra antígenos de superficie en cualq uier objetivo biológ i co y con respecto al esperma , prepara el camino para d iseño de vacuna anticonceptiva para antígenos de superficie relevantes que puede evocar anticuerpos inmovilizadores o aglutinantes La siguiente es una lista de documentos relacionada con la descripción anterior y particularmente, a discusiones y procedimientos experimentales Los documentos deben ser considerados como incorporados por referencia en su totalidad Referencias 1 Clermont, Y (1963) Amer J Anat 112, 35-45 2 Clermont, Y (1955) Amer, J Anat 96, 229-253 3 Myles, D G y Ppmakoff, P (1985) pp 239-250 en "Hybpdoma technology m the biosciences" (Tecnología de hibpdomas en las biociencias), Ed Sppnger, T A , Plenum Press, Nueva York 4 Fpend, D S (1982) J Cell Biol , 93, 243-249 5 Myles, D G , PpmakoffP , y Bellve, A R (1981) Cell, 23, 433-439 6 Myles, D G , y PpmakoffP 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York 37 Boue, F Lassalle, B , Duquenne, C , Villaroya, S Testart, J Lefevre, A y Fmaz, C (1992) 38 Lee, C , Keefer, M , Zhao, Z W , Kroes, R , Berg, L , Liu, X , y Sensibar, J (1989) J Androl 10(6), 432-438 39 Celis, J E , et al (1991) Electrophoresis, 12, 765-801 40 Seevers, R H , y Counsell, R E (1982) Chem Rev 82, 575-590 41 Colé, S R , Ashman, L K , y Ey, P L (1987) Mol immunol 24(7), 699-705 42 Patton, W F , Pluskat, M G , Skea, W M , Buecher, J L , López, M F , Zimmermann, R , Belanger, L M , y Hatch, P D (1990) Biotechniques 8, 518-527 43 Markwell, M A K , y fox, C F (1978) Biochemistry 17(22), 4807-4817 44 Hubbard, A , y Cohn, Z (1975) J Cell Biol 64, 438-460 45 Richardson, K , y Parker, C D (1985) Infecí Immun 48, 87-93 46 Hurley, W L , Finkelstem, E , y Holst, B D (1985) J Immun Meth 85 195-202 47 Ingalls, H M , Goodloe-Holland, C M , y Luna, E J (1986) Proc Nati Acad Sci , USA 834779-4783 Habiendo descrito completamente la invención, sera evidente para alguien de habilidad ordinaria en la técnica que pueden hacerse muchos cambios y modificaciones a la misma , si n apartarse del espíritu o alcance de la invención como se expuso en la presente. 14 LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL (i) SOLICITANTE HERR, JOHN C NAABY-HANSEN, SOREN FLICKENGER, CHARLES J WOLKOWICZ, MICHAEL J (II) TITULO DE LA INVENCIÓN MÉTODO PARA LA PRODUCCIÓN DE VACUNAS CONTRA PROTEÍNAS DE SUPERFICIE CELULAR (ni) NUMERO DE SECUENCIAS 41 (?v) DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA (A) DESTINATARIO OBLON, SPIVAK, MCCLELLAND, MAIER & NEUSTADT, P C (B) CALLE 1755 S JEFFERSON DAVIS HIGHWAY, SUITE 400 (C) CIUDAD ARLINGTON (D) ESTADO VA (D) PAÍS EU (E) CÓDIGO POSTAL 22202 (v) FORMA LEGIBLE DE COMPUTADORA (A) TIPO DE MEDIO DISCO FLEXIBLE (B) COMPUTADORA IBM PC compatible (C) SISTEMA OPERATIVO PC-DOS/MS-DOS (D) PAQUETERÍA Patente en liberación #1 0, Versión #1 30 (vi) DATOS DE SOLICITUD ACTUAL (A) NUMERO DE SOLICITUD US 08/806,174 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN 25 de febrero de 1997 (C) CLASIFICACIÓN (vip) INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE (A) NOMBRE KELBER, STEVEN B (B) NUMERO DE REGISTRO 30073 (C) NUMERO DE REFERENCIA/CASO 7762-002-27 (ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES (A) TELEFONO 703-413-3000 (B) TELEFAX 703-413-2220 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO 1 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD 18 aminoácidos (B) TIPO aminoácido 15 (C) FILAMENTO simple (D) TOPOLOGÍA lineal (11) TIPO DE MOLÉCULA péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA SEQ ID NO 1 Val Asp Asp Ala Leu Arg Asn Ser Thr Lys lie Tyr Ser Tyr Phe Pro 1 5 10 15 Ser Val (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO 2 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD 4 aminoácidos (B) TIPO aminoácido (C) FILAMENTO simple (D) TOPOLOGÍA lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA SEQ ID NO 2 Gly Pro Ser Leu 1 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO 3 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD 15 aminoácidos (B) TIPO aminoácido (C) FILAMENTO simple (D) TOPOLOGÍA lineal (II) TIPO DE MOLÉCULA peptido (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA SEQ ID NO 3 Glu Pro Ala Val Tyr Phe Lys Glu Gln Phe Leu Asp Gly Asp Gly 1 5 10 15 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 8 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 4: Pro Ala Gly Ala Val Tyr Phe Lys 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 8 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 5: Val His Val Xaa Phe Asn Tyr Lys 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 6: Thr Asp Asn Asn Gly 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (íi) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 7: Lys Val His Val Xaa Phe Asn Tyr Lys 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 11 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FILAMENTO- simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 8: Gly Gln Thr Xaa Val Val Gln Phe Thr Val Lys 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9" (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD 12 aminoácidos (B) TIPO aminoácido (C) FILAMENTO simple (D) TOPOLOGÍA lineal (II) TIPO DE MOLÉCULA péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA SEQ ID NO 9 Glu Gln Phe Xaa Asp Gly Asp Gly Trp Thr Ser Arg 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO 10 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD 9 aminoácidos (B) TIPO aminoácido (C) FILAMENTO simple (D) TOPOLOGÍA lineal (n) TIPO DE MOLÉCULA péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA SEQ ID NO 10 Val Ala Glu Pro Ala Val Tyr Phe Lys 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO 11 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD 8 aminoácidos (B) TIPO aminoácido (C) FILAMENTO simple (D) TOPOLOGÍA lineal (II) TIPO DE MOLÉCULA péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA SEQ ID NO 11 Val His Val lie Phe Asn Tyr Lys 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO 12 (?) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD 9 aminoácidos (B) TIPO aminoácido (C) FILAMENTO simple (D) TOPOLOGÍA lineal (11) TIPO DE MOLÉCULA péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA SEQ ID NO 12 Lys Val His Val lie Phe Asn Tyr Lys 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO 13 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD 11 aminoácidos (B) TIPO aminoácido (C) FILAMENTO simple (D) TOPOLOGÍA lineal (II) TIPO DE MOLÉCULA péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA SEQ ID NO 13 Gly Gln Thr Leu Val Val Gln Phe Thr Val Lys 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO 14 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD 12 aminoácidos (B) TIPO aminoácido (C) FILAMENTO simple (D) TOPOLOGÍA lineal (II) TIPO DE MOLÉCULA peptido (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA SEQ ID NO 14 Glu Gln Phe Leu Asp Gly Asp Gly Trp Thr Ser Arg 1 5 10 1 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO 15 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD 12 aminoácidos (B) TIPO aminoácido (C) FILAMENTO simple (D) TOPOLOGÍA lineal (II) TIPO DE MOLÉCULA péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA SEQ ID NO 15 Glu Pro Ala Val Tyr Phe Lys Glu Gln Phe Leu Asp 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO 16 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD 11 aminoácidos (B) TIPO aminoácido (C) FILAMENTO simple (D) TOPOLOGÍA lineal (n) TIPO DE MOLÉCULA péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA SEQ ID NO 16 Glu Pro Ala Val Tyr Phe Lys Glu Gln Phe Leu 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO 17 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD 33 pares de bases (B) TIPO acido nucleico (C) FILAMENTO simple (D) TOPOLOGÍA lineal (n) TIPO DE MOLÉCULA otro acido nucleico (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 17: GADCCNGCNG TNTAYTTYAA RGARCARTTY CTN 33 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 18: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD. 26 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 18: GCYGTSTACT TCAAGGAGCA GTTCCT 26 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 19: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD- 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 19: AARGTNCAYG TNATYTTYAA YTAYAAR 27 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 20: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD 26 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO simple (D) TOPOLOGÍA- lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA otro ácido nucleico (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA SEQ ID NO 20 AGGTGCAYGT GATCTTCAAC TACAAG 26 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO 21 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD 14 aminoácidos (B) TIPO- aminoácido (C) FILAMENTO simple (D) TOPOLOGÍA lineal (n) TIPO DE MOLÉCULA péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA SEQ ID NO 21 Glu Pro Ala Val Tyr Phe Lys Glu Gln Phe Leu Asp Gly Asp 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO 22 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD 12 pares de bases (B) TIPO ácido nucleico (C) FILAMENTO simple (D) TOPOLOGÍA lineal (n) TIPO DE MOLÉCULA otro ácido nucleico (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA SEQ ID NO 22 TTRGAYGGNG AY 12 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO 23 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD 26 pares de bases (B) TIPO ácido nucleico (C) FILAMENTO simple (D) TOPOLOGÍA lineal (n) TIPO DE MOLÉCULA otro ácido nucleico (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA SEQ ID NO 23 GCYGCSTACT TCAAGGAGCA GTTCCT 26 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO 24 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD 26 pares de bases (B) TIPO ácido nucleico (C) FILAMENTO simple (D) TOPOLOGÍA lineal (II) TIPO DE MOLÉCULA otro ácido nucleico (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA SEQ ID NO 24 CTTGTAGTTG AAGATCACRT GCACCT 26 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO 25 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD 352 pares de bases (B) TIPO ácido nucleico (C) FILAMENTO simple (D) TOPOLOGÍA lineal (ll) TIPO DE MOLÉCULA cDNA (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA SEQ ID NO 25 TTCCCGCTGG ATCGAATCCA AACACAAGTC AGATTTTGGC AAATTCGTTC TCAGTTCCGG 60 CAAGTTCTAC GGTGACAGAG NAAAANATAA AGGTTTGCAG ACAAGCCAGG ATGCACGCTT 120 TTATGCTCTG TCGGCCAGTT TCGAGCCTTT CAGCAACAAA GGCCAAACGC TGGTGGTGCA 180 GTTCACGGTG AAACATGAGC AGAACATCGA CTGTGGGGGC GGCTATGTGA AGCTGTTTCC 240 TAATAGTTTG GACCAGACAG ACATGCACGG AGACTCAGAA TACAACATCA TGTTTGGTCC 300 CGACATCTGT GGCCCTGGCA CCAAAAAGGT GCATGTGATC TTCAACTACA AG 352 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO 26 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD 352 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 26: TTCCCGCTGG ATCGAATCCA AACACAAGTC AGATTTTGGC AAATTCGTTC TCAGTTCCGG 60 CAAGTTCTAC GGTGACGAGG AGAAAGATAA AGGTTTGCAG ACAAGCCAGG ATGCACGCTT 120 TTATGCTCTG TCGGCCAGTT TCGAGCCTTT CAGCAACAAA GGCCAGACGC TGGTGGTGCA 180 GTTCACGGTG AAACATGAGC AGAACATCGA CTGTGGGGGC GGCTATGTGA AGCTGTTTCC 240 TAATAGTTTG GACCAGACAG ACATGCACGG AGACTCAGAA TACAACATCA TGTTTGGTCC 300 CGACATCTGT GGCCCTGGCA CCAAGAAGGT TCATGTCATC TTCAACTACA AG 352 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 27: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD 7 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 27: Ser Pro Xaa Xaa Ser Xaa Lys 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 28: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA- (A) LONGITUD 9 aminoácidos (B) TIPO aminoácido (C) FILAMENTO simple (D) TOPOLOGÍA lineal (n) TIPO DE MOLÉCULA péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA SEQ ID NO 28 Xaa Gln Ala Asn Asn Ala Xaa Xaa Lys 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO 29 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD 8 aminoácidos (B) TIPO aminoácido (C) FILAMENTO péptido (D) TOPOLOGÍA lineal (n) TIPO DE MOLÉCULA péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA SEQ ID NO 29 Val Ala Thr Glu Phe Ala Phe Arg 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO 30 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD 8 aminoácidos (B) TIPO aminoácido (C) FILAMENTO simple (D) TOPOLOGÍA lineal (II) TIPO DE MOLÉCULA péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA SEQ ID NO 30 Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Asn Xaa Arg 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO 31 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD 9 aminoácidos (B) TIPO aminoácido (C) FILAMENTO simple (D) TOPOLOGÍA lineal (11) TIPO DE MOLÉCULA péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA SEQ ID NO 31 Xaa Xaa Ser Met Xaa Xaa Asp Thr Lys 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO 32 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD 8 aminoácidos (B) TIPO aminoácido (C) FILAMENTO simple (D) TOPOLOGÍA lineal (II) TIPO DE MOLÉCULA péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA SEQ ID NO 32 Met Glu Thr Xaa Xaa Xaa Asp Arg 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO 33 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD 11 aminoácidos (B) TIPO aminoácido (C) FILAMENTO simple (D) TOPOLOGÍA lineal (II) TIPO DE MOLÉCULA péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA SEQ ID NO 33 Val Thr Asn Ser Thr Gly Gly Ser Pro Xaa Lys 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO 34 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD 10 aminoácidos (B) TIPO aminoácido (C) FILAMENTO simple (D) TOPOLOGÍA lineal (II) TIPO DE MOLÉCULA péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA SEQ ID NO 34 Xaa Xaa Pro Glu Val Asp Xaa Xaa Thr Arg 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO 35 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD 11 aminoácidos (B) TIPO aminoácido (C) FILAMENTO simple (D) TOPOLOGÍA lineal (n) TIPO DE MOLÉCULA péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA SEQ ID NO 35 Xaa Xaa Gln Ala Glu Asn Ala Xaa Xaa Xaa Lys 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO 36 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD 27 pares de bases (B) TIPO acido nucleico (C) FILAMENTO simple (D) TOPOLOGÍA lineal (n) TIPO DE MOLÉCULA otro acido nucleico (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA SEQ ID NO 36 GTNGCNACNG ARTTYGCNTT YCGNAGR 27 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 37: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 37: WCBVMYRMRS BSYYMCSSKM GTNWY 25 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 38: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 7 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA- lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 38: Val Thr Asn Ser Thr Gly Gly 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 39: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO simple (D) TOPOLOGÍA- lineal (n) TIPO DE MOLÉCULA- otro ácido nucleico (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA SEQ ID NO' 39: GTNACNAAYA GYACNGGNGG N 21 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 40: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 40: GTSACCAACW SCACCGGNGG N 21 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 41: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1011 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 41: TCNNCGNNGG GGGGNNANGC GCGGNANANN GGCTANNNAG GCGGNGANNC NGAGCAGNNC 60 ATTCGCGGGN GAGGCNNTNN TANAAAANAC NNNTGNANCC NNAATANGCC AAACGCCANA 120 GGAGGGGNNG NAAANCGGCN NAANNCNCCN NAAAAAANAN NTNCNAANCN CGGNTGGGGA 180 GAAAATNCCC ATTACAGGNC NTCTNCCCAN NCAGTTTTTT CCAATTACAA GGNGGGGGGN 240 NGGGNTTTTC NAAAAANGCG CGTTCCCNTT CNGGGGNTNA AAAAAAANAG GGNNGCCTTT 300 TCCAAGACTN NGCGGGCCCC TTTGGNCTGC ACNANCACGC GGGTCAAAGG CTNNACCGNA 360 AGGGGGAACC CTAANAGTTT TTCAAGGCCC CAGGGGGNNC GGCCCNGGCT TCAAAAAAGN 420 CTTGCCAGNA ATGNAGATTC NAACATNNAG AGGAAGNCCA NCCAGGNCCN TCGGGTAAGA 480 TTAAAAGGGA GGTTTTTTTT CCAAGTTCCN ACGGCCGGCA AGAAAAGGCT NAGGGGCNCN 540 TGAGNNCCCC CTGGGAGGGG NCCGAAGCCG GCNNGAGGTC ATCCCGGAAA TGGGGGTNGN 600 AGAGCNGGNA ACAGCAGTGG GNTGAGGCAG GNAGGCAGGG GCCAGCANCA ACAGCAGGAC 660 AGACTTGANG GCCTCGGGCG NGACAGGGAA GAGGCCCAGC ATGGAGGCGA AGCTGAGGAA 720 GGCCACGGNA CAGTAGAGGA GCCCGTCTGA GAAGATGANN NAGGCCACGT GCCTNACCAT 780 GGNGCAGTCC GANAACGGCT TCAAAGTNGC CCCGCGGNAN GTNACAGTAN AATTTGANAT 840 AGGCACCGGC CACGACCAGG AAACAGAAGG AGNTNATNAT NACCAGGGCC ACGGTGAAGC 900 CCAGGGATGN NGGCTGACCC TNAGGTGGGG CGTAGGGCAN GNAGAATNGG GNGNCNCAGT 960 ATTCTCCNAT CTGAGTCCAG GGTATGTGTC NGCCKCCATA TCCTCCCNGT T 1011

Claims

REIVINDICACIONES

1 . Un método para el análisis de proteínas de superficie de membrana comprendiendo los pasos de a. marcar vectorialmente proteínas en la superficie de membrana ; b. aislar las proteínas de superficie de membrana marcadas mediante electroforesis en gel de dos dimensiones; y c. secuenciar las proteínas de superficie de membrana aisladas .

2. El método de la reivindicación 1 , en donde la membrana está presente en un virus , bacteria o célu la.

3. El método de la reivindicación 2 , en donde la membrana está presente en una célula de esperma.

4. El método de la reivind icación 1 , en donde las prote ínas de membrana se marcan con yodo o biotina , o una mezcla de los mismos.

5. Un método para producir una vacuna contra proteínas de superficie de membrana comprendiendo los pasos de a. marcar vectorialmente proteínas en la superficie de membrana; b. aislar las proteínas de superficie de mem brana marcadas mediante electroforesis en gel de dos dimensiones; c. secuenciar las proteínas de superficie de membrana aisladas; d . clonar el DNA que codifica las prote ínas de superficie de mem bra na ; e. producir de manera recombinante las proteínas de superficie de mem brana usando el DNA aislado e n el paso (d) para usarse como inm u nógenos de péptido . 6 El método de la reivindicación 5, en donde la membrana está presente en un virus, microbactepa o célula 7 El método de la reivindicación 5, en donde la mem brana está presente en una célula de esperma 8 El método de la reivindicación 5, en donde las proteínas de membrana se marcan con yodo o biotma, o una mezcla de los mismos 9 Un método para diagnosticar infertil idad comprendiendo a marcar las proteí nas de superficie de membrana obten idas en la reivindicación 5, b hacer reaccionar las proteínas de superficie de membrana marcadas con suero de un paciente en el cual se va a diag nosticar la presencia o au sencia de infertil idad , y c detectar la formación de un complejo entre un anticuerpo presente en el suero y la proteína de superficie de membrana marcada 1 0 Un conju nto diagnóstico com prendiendo las proteínas de superficie celular producidas en la reivindicación 5 1 1 Un método para inducir la anticoncepción en un paciente comprendiendo administrar a un paciente en necesidad de la misma una cantidad de las proteínas de superficie celular producidas en la reivindicación 5, suficiente para prevenir la fertilización de un huevo en dicho paciente 1 2 Un método para producir un anticonceptivo comprendiendo administrar a un mam ífero las proteínas recombinantes producidas en la reivindicación 5 y aislar a nticuerpos contra las proteí nas recombinantes producidas por el mam ífero 1 3. El anticonceptivo producido mediante el método de la reivindicación 1 2. 14. Una vacuna producida mediante el método de la reivindicación 2. RES U MEN Un método para identificar el repertorio de proteínas expuesto en la superficie de un virus , bacteria o célula , y a la preparación de vacunas para las mismas El método incluye marcar vectopalmente proteínas en la superficie de membrana, aislar las proteínas de superficie de membrana marcadas mediante electroforesis en gel de dos dimensiones, y secuenciar las proteínas de superficie de membrana aisladas También se incluyen métodos para producir una vacuna contra el virus, bacteria o célula, métodos para detectar infertilidad , métodos para producir anticoncepción y las vacunas y anticonceptivos producidos por los métodos