MXPA99006783A - Formulacion de particulas de agentes de transfeccion cationicos/acidos nucleicos estabilizados - Google Patents
Formulacion de particulas de agentes de transfeccion cationicos/acidos nucleicos estabilizadosInfo
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Abstract
La presente invención se refiere a una composición que comprende partículas de complejos de agente(s) de transfección catiónico(s) /ácidos nucléicos estabilizados, caracterizada porque la misma incorpora además de dicho agente de transfección y elácido nucléico, al menos un agente superficial no iónico en una cantidad suficiente para prevenir la agregación de las partículas en el transcurso del tiempo. Según un modo preferido de la invención, el agente superficial es o se deriva de un polioxialquileno.
Description
FORMULACIÓN DE PARTÍCULAS DE AGENTES DE TRANSFECCION CATIONICOS/ACIDOS NUCLEICOS ESTABILIZADOS
Campo de la Invención
La presente invención se refiere a las asociaciones de agente (s) de transfección catiónico (s) /ADN cuyas partículas son estabilizadas en su tamaño con la ayuda de un agente de superficie no iónico y a sus utilizaciones en terapia génica .
Antecedentes de la Invención
Numerosas enfermedades genéticas están asociadas con una falta de expresión y/o una expresión anormal, es decir deficiente o excesiva, de uno o varios ácidos nucleicos. La terapia génica tiene por objetivo principal corregir este tipo de anomalías genéticas por el cauce o desvío de la expresión celular in vivo o in vitro de los genes clonados. Hasta nuestros días, se han propuesto varios métodos para la liberación intracelular de este tipo de información genética. De entre ellas, una en particular está basada en el empleo de vectores químicos o Rßf.030646
bioquímicos. Los vectores sintéticos tienen dos funciones principales, forman un complejo con el ADN que se va a transfectar y promover su fijación celular así como su paso a través de la membrana plásmica y, llegado el caso, a través de las dos membranas nucleares. Entre los vectores sintéticos desarrollados, los polímeros catiónicos del tipo de la polilisina y del DEAE dextrano o aún los lipofectantes, son más ventajosos. Un progreso importante ha sido efectuado en este modo de transfección con el desarrollo de una tecnología basada en el empleo de agentes de transfección catiónicos del tipo de lipofectantes y de manera más precisa de los lípidos catiónicos. Así se ha puesto en evidencia que un lípido catiónico cargado positivamente, el cloruro de N- [1- (2, 3-dioleiloxi) propil] -N,N, N-trimetila onio (DOTMA), interfiere, bajo la forma de liposomas o de vesículas pequeñas, espontáneamente con el ADN, que está cargado negativamente, para formar complejos de lípidos-ADN, capaces de fusionarse con las membranas celulares, y permitiendo así la liberación intracelular del ADN. Después del DOTMA, se han desarrollado otros lípidos catiónicos sobre este modelo de la estructura: el grupo lipófilo asociado a un grupo amino por medio de un brazo llamado "espaciador". Entre ellos, se pueden citar
más particularmente aquellos que comprenden en calidad del grupo lipófilo dos ácidos grasos o un derivado del colesterol, y que lleva, además, llegado el caso, en calidad del grupo amino, un grupo de amonio cuaternario. Los DOTAP, DOBT o el ChOTB pueden ser citados especialmente en calidad de representativos de esta categoría de lípidos catiónicos. Otros compuestos, como los DOSC y ChOSC, se caracterizan por la presencia de un grupo de colina en lugar del grupo de amonio cuaternario. Otra categoría de lipofectantes, las lipopoliaminas, ha sido descrita igualmente. De manera general, se trata de una molécula anfifílica que comprende al menos una región hidrófila de poliamina asociada por una región llamada espaciadora con una región lipófila. La región de poliamina de las lipopoliaminas, cargada catiónicamente, es capaz de asociarse de manera reversible con el ácido nucleico, cargada negativamente. Esta interacción compacta fuertemente el ácido nucleico. La región lipófila hace a esta interacción iónica insensible al medio externo, recubriendo la partícula nucleolipídica formada de una película lipídica. En este tipo de compuestos, el grupo catiónico puede estar representado por el radical L-5-carboxiespermina que contiene cuatro grupos amonio, dos primarios y dos secundarios. Los compuestos DOGS y DPPES
forman una parte especial. Estas lipopoliaminas son todas particularmente eficaces para la transfección de las células endocrinas primarias. A título representativo de esta última familia de compuestos se pueden citar más particularmente las lipopoliaminas descritas especialmente en las solicitudes de patente WO 96/17823 y WO 97/18185. Sin embargo, la eficacia de estos vectores sintéticos todavía tiene que mejorar especialmente en el término de la formación del complejo con el ácido nucleico y más precisamente sobre el plano de la estabilidad de las partículas de estos complejos nucleolipídicos. En efecto, con las formulaciones clásicas de ácidos nucleicos/agente de transfección catiónica, se ayuda frecuente y rápidamente a un fenómeno de agregación de las partículas de los complejos. Tales agregados poseen evidentemente un tamaño difícilmente compatible con una transfección terapéutica. Una de las soluciones propuestas hasta aquí para prevenir este tipo de fenómeno de precipitación, consiste en introducir en la formulación, el agente de transfección catiónica, como por ejemplo el lipofectante, en una cantidad excesiva, es decir en una relación de la carga de lipofectante/ácidos nucleicos del orden de 10 veces más. Además del hecho de que una de tales soluciones no siempre es eficaz, la
misma no es totalmente satisfactoria sobre el plano de la inocuidad. Los agentes de transfección catiónicos como los lipofectantes y los polímeros catiónicos son por sí mismos compuestos los cuales, en cantidades importantes, tienen el riesgo de presentar una toxicidad relativa para las células en las cuales se incorporan. Será así particularmente interesante en el plano terapéutico de las formulaciones de agentes de transfección catiónicos/ácidos nucleicos que poseen relaciones de cargas reducidas y no obstante estabilizadas en el tiempo bajo la forma de partículas no agregadas. 0, como ya se anunció precedentemente, las zonas de concentración de los ácidos nucléicos/lipofectantes que responden a tales relaciones de la carga están asociadas generalmente con un estado físico inestable. Se ayuda rápidamente a un fenómeno de desagregación de las partículas nucleolipídicas . Lo que es más, se sabe igualmente que la presencia de una sal del tipo de NaCl, utilizada clásicamente en las formulaciones de agentes de transfección catiónicos/ácidos nucleicos, puede inducir a ciertas concentraciones, la precipitación de partículas nucleolipídicas. Así, la gama de concentración del agente de transfección para el cual se observa la precipitación,
será tanto más grande de lo que será elevada la concentración de la sal. La presente invención tiene precisamente por objetivo valorar estas zonas de concentraciones del agente de transfección catiónico/ácidos nucleicos, interesantes sobre el plano de inocuidad para sus cantidades reducidas en el vector e igualmente sobre el plano de interferencia con otras proteínas teniendo en cuenta su carga reducida. En efecto, cuando los complejos están relativamente poco cargados, el riesgo de que los mismos interfieran con las proteínas del suero in vivo es reducida significativamente. Esto es bien entendido y particularmente ventajoso para la transferencia de los ácidos nucleicos in vivo (Re y, J.S. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1995; 92, 1744-1748). Numerosos artículos fundamentan el estado de este tipo de interacciones entre las proteínas del suero y los liposomas (Sénior, J. H. et al. Biochi . Biophys. Acta 1991, 1070, 173-179; Hernandez-Caselles, T. et al. Molecular and Cellular Biochemistry 1993, 120, 119-126; Oku, N. et al. Biochim. Biophys. Acta 1996, 1280, 149-154) . Igualmente se han publicado datos sobre la activación del sistema de complemento por los complejos a base del ADN utilizados para la terapia génica. El grado de activación del complemento depende de la relación de catión/ADN (o
relación de la carga) . Este último fenómeno es verdadero sobre todo para los policationes como las polilisinas, las liposperminas (por ejemplo los DOGS) . La activación del complemento es menos sensible con respecto a la carga para los amonios cuaternarios como el DOTAP, el DC-Chol, o el DOTMA (Plank, C. et al. Human Gene Therapy 1996, 7, 1437-1446) . En consecuencia, será particularmente interesante disponer sobre el plano terapéutico de formulaciones en complejos de agentes de transfeccción catiónicos/ácidos nucleicos a una concentración elevada, de ácidos nucleicos y/o a relaciones de carga reducidas muy próximas de la nEutralidad y que son estabilizados además bajo una forma fluida del tipo coloidal, es decir no agregada, dos especificaciones aparentemente inconciliables de manera natural. De manera inesperada, el solicitante ha puesto en evidencia que la adición de un agente superficial no iónico a las partículas de los complejos de agente (s) de transfección catiónico (s) /ácidos nucleicos, inestables naturalmente, es decir susceptibles de cambiar rápidamente hacia la formación de agregados, permite oponerse eficazmente a este fenómeno y así estabilizar las partículas de los complejos a un tamaño de partícula inferior a, o del orden de, 160 nm.
La presente invención tiene como primer objeto una composición útil en terapia génica que comprende partículas de complejos de agente (s) de transfección catiónico (s) /ácidos nucleicos caracterizado porque las mismas incorporan además al menos un agente superficial no iónico en una cantidad suficiente para estabilizar el tamaño de dichas partículas a una dimensión inferior o igual a 160 nm. En el sentido de la invención, se entiende designar para las partículas estabilizadas, partículas cuyo tamaño no es susceptible de evoluciones o desarrollarse en el transcurso del tiempo, especialmente cuando estas partículas son mantenidas en dispersión en una solución. Contrariamente a las formulaciones clásicas, es decir exentas de un agente superficial no iónico, las composiciones reivindicadas pueden ser conservadas de manera más prolongada en el transcurso del tiempo sin que pueda ser notada alguna modificación, del tipo de agregación especialmente, al nivel de esta dispersión. El tamaño de las partículas así estabilizadas se desarrolla generalmente a entre 50 y 160 nm, de preferencia entre 75 y 150 nm. En la ausencia del agente superficial no iónico reivindicado, las partículas de los complejos presentes
en la composición reivindicada, conducen espontáneamente a los agregados particulares de tamaño superior a 160 nm. Por otra parte, el solicitante ha demostrado que las composiciones según la invención poseen una estructura laminar que tienen alternativamente bicapas de lípidos y capas del ADN intercaladas. Los agentes superficiales no iónicos, conforme a la presente invención, poseen de preferencia al menos un segmento hidrófobo y al menos un segmento hidrófilo. La parte hidrófoba también puede ser una cadena alifática, un polioxialquileno, un poliéster de dialquilideno, un polietilenglicol coronado con poliéter bencílico dendrítico, o el colesterol. En cuanto a la parte hidrófila, se puede tratar de un polioxialquileno, un alcohol polivinílico, una polivinilpirrolidona, o un polisacárido. De manera preferida, el agente superficial utilizado en el marco de la presente invención es o se deriva de un poliol no iónico y más particularmente de un polioxialquileno con grupos de alquileno de longitudes y/o conformaciones diferentes o no, en el seno del polímero. Más preferentemente, el mismo responde a la fórmula general siguiente:
HO ( CH2CH20) a (CH (CH3) CH20) b (CH2CH20) CH
con a, b y c que representan independientemente entre sí números enteros que pueden variar entre 20 y 100 inclusive. El agente no iónico está presente de preferencia en las composiciones según la invención a una concentración comprendida entre 0.01% y 10% en peso/volumen de dicha composición y más preferentemente entre 0.02% y 5% en peso/volumen. La presencia de uno de tales agentes superficiales no iónicos en asociación con los complejos es ventajoso a varias concentraciones: Según la invención, los agente (s) de transfección catiónico (s) y los ácidos nucleicos están presentes en la composición en una relación de carga que naturalmente es propicia para el desarrollo de un fenómeno de agregación. Se sobreentiende que las cargas positivas llevadas por el o los agente (s) de transfección catiónico (s) no están más que en un ligero exceso comparativamente con las cargas positivas llevadas por el ácido nucleico combinado en forma de complejo, incluso en el mejor de los casos las compensan totalmente. Una de tales relaciones de carga es particularmente ventajosa sobre punto de vista in vivo porque es menos perjudicial
en términos de la interacción con el suero o con otras proteínas como por ejemplo la albúmina y de manera más interesante sobre el plano de la inocuidad. A título ilustrativo, esta relación de carga se desarrolla de preferencia entre 1 y 6 y más preferentemente, la misma es inferior a 4. Además, este agente superficial es completamente compatible con una administración in vivo.
En el caso de las formulaciones según la invención no es necesario en efecto proceder a una eliminación de este agente superficial no iónico, previamente a su inyección en las células que van a ser tratadas. Por último, las composiciones según la invención pueden ser almacenadas ventajosamente. La presencia de un agente superficial no iónico se opone eficazmente a cualquier fenómeno de precipitación en el seno de dicha composición. En calidad de agente superficial preferido según la invención se citará muy particularmente el compuesto de la fórmula general :
OH (CH2CH20) a (CH (CH3) CH20) b (CH2CH20) CH
con a igual a 75, b a 30 y c a 75 .
Otros agentes superficiales no iónicos preferidos son el polietilenglicol coronado con poliéter bencílico dendrítico, los alcoholes polioxietilénicos, o el éter polioxietilen nonilfenílico. Por agente de transfección catiónico se designa de preferencia según la invención los polímeros catiónicos y los lipofectantes. Por lo que se refiere más particularmente a los lipofectantes, se entiende cubrir en el sentido de la invención, bajo está denominación, cualquier compuesto o mezcla con carácter lipídico y cargado positivamente, ya propuesto en calidad de agente activo en consideración de la transfección celular de los ácidos nucleicos. De manera general, se trata de moléculas anfifílicas que comprenden al menos una región lipófila asociada o no a una región hidrófila. A título representativo de la primera familia de compuesto, se pueden proponer especialmente mezclas lipídicas susceptibles de formar liposomas catiónicos. Estas formulaciones pueden contener así el POPC, fosfatidilserina, fosfatidilcolina, colesterol, lipofectamina o maleimidofenilbutirilfosfatidil-etanolamina asociada con un lípido catiónico tal como el definido posteriormente.
Según un modo particular de la invención, el agente lipofectante utilizado posee una región catiónica. A título ilustrativo de este tipo de lípidos catiónicos construidos sobre el modelo de la estructura: grupo lipófilo asociado a un grupo amino por medio de un brazo llamado "espaciador"", se pueden citar particularmente el DOTMA e igualmente aquellos que comprenden a título de grupo lipófilo dos ácidos grasos o un derivado del colesterol, y que llevan, además, llegado el caso, a título de grupo amino, un grupo de amonio cuaternario. Los DOTAP, DOBT o el ChOTB pueden ser citados especialmente a títulos representativos de este categoría de lípidos catiónicos. Otros compuestos, como los DOSC y el ChOSC, se caracterizan por la presencia de un grupo de colina en lugar del grupo de amonio cuaternario. Ventajosamente, los lipofectantes que convienen a la invención pueden ser elegidos igualmente entre las lipopoliaminas cuya región de poliamina responde a la fórmula general :
H2N-(-(CH)m-NH-)n-H
en la cual m es un número entero superior o igual a 2 y n es un número entero superior o igual a 1, m puede variar
entre los diferentes grupos de carbono comprendidos entre 2 aminas, esta región de poliamina está asociada de manera covalente con una región lipófila del tipo de cadena de hidrocarburos, saturada o no, del colesterol, o un lípido natural o sintético capaz de formar fases laminares o hexagonales. Esta región de poliamina está representada más preferentemente por la espermina o uno de sus análogos que ha conservado sus propiedades de enlace con el ácido nucleico. La solicitud de patente EP 394 111 describe lipopoliaminas de esta familia susceptibles de ser utilizadas en el marco de la presente invención. A título representativo de estas lipopoliaminas se pueden citar más particularmente la dioctadecilamidoglicil espermina (DGOS) y la 5-carboxiespermilamida de la palmitoilfosfatidiletanolamina (DPPES) . Las lipopoliaminas descritas en la solicitud de patente WO 96/17823 pueden ser utilizadas igualmente de manera ventajosa según la invención. Las mismas están representadas por la fórmula general:
H2N-(-(CH)m-NH-)n-H R
en la cual R representa
en donde X y X' representan, independientemente entre sí, un átomo de oxígeno, un grupo metileno- (CH2)q- con q igual a O, 1, 2 o 3, o un grupo amino -NH- o -NR' -, con R' que representa un grupo alquilo con Ci a C4, Y e Y' representan independientemente entre sí un grupo metileno, un grupo carbonilo o un grupo C=S, R3, R4 y R5 representan independientemente entre sí un átomo de hidrógeno o un radical alquilo, substituido o no, con Ci a C4, con p que puede variar entre 0 y 5, Re representa un derivado del colesterol o un grupo . dialquilamino -NR!R2 con Ri y R2 que representan independientemente entre sí un radical alifático, saturado o no, lineal o ramificado con C12 a C22. A título representativo de estas lipopoliaminas se pueden citar muy particularmente el (dioctadecilcarbamoilmetoxi) -acetato de 2-5-bis- (3-amino-propilamino) -pentilo y el (dioctadecilcarbamoilmetoxi) -acetato de 1, 3-bis- (3-amino-propilamino) -2-propílo. Por último, más recientemente, las nuevas lipopoliaminas, valorables igualmente en el marco de la
presente invención, han sido descritas en la solicitud de patente WO 97/18185. Se trata de los compuestos de la fórmula general que se dan enseguida:
en la cual Ri, R2 y R3 representan independientemente entre sí un átomo de hidrógeno o un grupo -(CH2)q-NRR' con q que puede variar entre 1, 2, 3, 4, 5 y 6, esto de manera independiente entre los diferentes grupos Ri, R2 y R3 y R y R' representan independientemente entre sí un átomo de hidrógeno o un grupo - (CH2) q<-NH2, q' puede variar entre 1, 2, 3, 4, 5 y 6, esto de manera independiente entre los diferentes grupos R y R' , m, n y p que representan, independientemente entre sí, un número entero que puede variar entre 0 y 6 y cuando n es superior a 1, m puede tomar valores diferentes y R3 significados diferentes en el seno de la fórmula general y R4 representa un grupo de la fórmula general:
en la cual R6 y R7 representan independientemente entre sí un átomo de hidrógeno o un radical alifático, saturado o no, con Cío a C22 con al menos uno de dos grupos diferentes del hidrógeno, u es un número entero elegido entre 0 y 10 y cuando u es un número entero superior a 1, R5, X, y r pueden tener significados diferentes en el seno de las diferentes porciones [X- (CHR5) r-Y] , X representa un átomo de oxígeno, de azufre o un grupo amino monoalquilado o no, Y representa un grupo carbonilo o un grupo metileno, R5 representa un átomo de hidrógeno o una cadena lateral de aminoácido natural, llegado el caso substituido y r representa un número entero que varía entre 1 y 10 cuando r es igual a l, R5 representa una cadena lateral del aminoácido natural substituido o no y cuando r es superior a l, R5 representa un átomo de hidrógeno. A título representativo de estas lipopoliaminas se pueden mencionar más particularmente las que siguen:
{H2N ( CH2 ) 3}2N ( CH2 ) 4N{ ( CH2 ) 3NH2> ( CH2 ) 3NHCH2COGlyN [ ( CH2 ) ?7CH3] 2
H2N(CH2) 3NH (CH2) NH (CH2) 3NHCH2COGlyN[ (CH2) 17CH3]2
H2N ( CH2 ) 3NH ( CH2 ) 4NH ( CH2 ) 3NHCH2COArgN [ ( CH2 ) 17CH3] 2 •
De manera particularmente ventajosa, se pueden utilizar en el marco de la invención la lipofectamina, la dioctadecilamidoglicil espermina (DOGS), la 5-carboxi-espermilamida de la palmitoilfosfatidiletanolamina (DPPES), el (dioctadecilcarbamoilmetoxi) -acetato de 2-5-bis- (3-amino-?ropilamino) -pentilo, el
(dioctadecilcarbamoilmetoxi) acetato de 1, 3-bis- (3-aminopropilamino) -2-propilo, el
{H2N(CH2)3}2N(CH2)4N{(CH2)3NH2>(CH2)3NHCH2COGlyN[ (CH2) 17CH3] 2, el H2N(CH2)3NH(CH2) NH(CH2)3NHCH2C0GlyN[ (CH2) 17CH3] 2, y/o el H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COArgN[ (CH2)?7CH3]2. Se puede tratar igualmente de lípidos catiónicos que incorporan uno o varios grupos de guanidinio y/o amidinio, como más particularmente aquellos descritos por J.M. LEHN et al.
(Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A., 1996, 93, 9682-9686). Según la presente invención, el polímero catiónico susceptible de ser utilizado en calidad de agente de transfección catiónica es de preferencia un compuesto de la fórmula general (I) como sigue:
en la cual R puede ser un átomo de hidrógeno o un grupo de la fórmula:
n es un número entero comprendido entre 2 y 10, y P y Q son números enteros, sobreentendiéndose que la suma de p+q es tal que el peso molecular promedio del polímero está comprendido entre 100 y 107 Da. Se sobreentiende que, en la fórmula (I) anterior, el valor de n puede variar entre las diferentes porciones p. Así, la fórmula (I) reagrupa a la vez los homopolímeros y los heteropolímeros. Más preferentemente, en la fórmula (I), n está comprendido entre 2 y 5. En particular, los polímeros de la polietilen imina (PEÍ) y de la polipropilen imina (PPl) presentan propiedades completamente ventajosas. Los polímeros preferidos para la utilización de la presente invención son aquellos cuyo peso molecular está
comprendido entre 103 y 5.106. En calidad de ejemplo, se puede citar la polietilen imina de peso molecular promedio de 50 000 Da (PEI50K), la polietilen imina de peso molecular promedio de 22,000 Da (PEI22K) o la polietilen imina de peso molecular promedio de 800 000 Da (PEI800K) . Los PEI150K, el PEI122K y el PEI800K están accesibles comercialmente. En cuanto a los otros polímeros representados por la fórmula general (I), los mismos pueden ser preparados según el procedimiento descrito en la solicitud de patente FR 94/08735. En las composiciones de la presente invención, el ácido nucleico combinado como un complejo con el agente de transfección catiónico también puede ser tanto un ácido desoxirribonucléico como un ácido ribonucleico. Se puede tratar de secuencias de origen natural o artificial, y especialmente del ADN genómico, del ANDc, del ARNt, del ARNr, de secuencias híbridas o de secuencias sintéticas o semisintéticas de oligonucleótidos modificados o no. Estos ácidos nucleicos pueden ser de origen humano, animal, vegetal, bacteriano, viral, etc. Los mismos pueden ser obtenidos por cualquier técnica conocida por el experto en la técnica, y especialmente por el cernido de bancos, por síntesis química, o aún por métodos mixtos que incluyen la
modificación química o enzimática de las secuencias obtenidas por el cernido de los bancos. Los mismos pueden ser modificados químicamente. Refiriéndose más particularmente a los ácidos desoxirribonucléicos, los mismos pueden ser de hebra sencilla o de doble hebra lo mismo que los oligonucleótidos cortos o las secuencias más largas. Estos ácidos desoxirribonucléicos pueden llevar genes terapéuticos, secuencias regulatorias de la transcripción o de la replicación, secuencias antisentido modificadas o no, regiones de enlace a otros componentes celulares, etc. En el sentido de la invención, se entiende por gen terapéutico especialmente cualquier gen que codifica para un producto proteico que tiene un efecto terapéutico. El producto proteico así codificado puede ser una proteína, un péptido, etc. Este producto proteico puede ser homólogo frente a la célula de blanco u objetivo (es decir un producto que normalmente está expresado en la célula de blanco u objetivo cuando la misma no presenta ninguna patología) . En este caso, la expresión de una proteína permite por ejemplo mitigar una expresión insuficiente en la célula o la expresión de una proteína inactiva o débilmente activa en razón de una modificación, o aún sobreexpresar dicha proteína. El gen
terapéutico también puede codificar para un mutante de una proteína celular, que tiene una estabilidad aumentada, una actividad modificada, etc. El producto proteico puede ser igualmente heterólogo frente a la célula de blanco u objetivo. En este caso, una proteína expresada puede completar o aportar por ejemplo una actividad deficiente en la célula, lo que permite luchar contra una patología, o estimular una respuesta inmunitaria. Entre los productos terapéuticos en el sentido de la presente invención, se pueden citar más particularmente las enzimas, los derivados sanguíneos, las hormonas, las linfocinas: las interleucinas, las interferonas, el TNF, etc., (FR 92/03120), los factores de crecimiento, los neurotransmisores o sus precursores o enzimas de síntesis, los factores tróficos: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/pleiotrofina, etc., la distrofina o una minidistrofina (FR 91/11947), la proteína CFTR asociada con la mucoviscidosa, los genes supresores de los tumores: p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc., (FR 93/04745), los genes que codifican para los factores implicados en la coagulación: los Factores VII, VIII, IX, los genes que intervienen en la reparación del ADN, los genes suicidas (timidina cinasa, citosina desaminasa) , los genes de hemoglobina o de otros
transportadores proteicos, los genes que corresponden a las proteínas implicadas en el metabolismo de los lípidos, del tipo apolipoproteína elegidos entre las apolipoproteínas A-I, A-II, A-IV, B, C-I, C-II, C-III, D, E, F, G, H, J y apo(a), las enzimas del metabolismo como por ejemplo la lipoproteína lipasa, la lipasa hepática, la lecitina colesterol aciltransferasa, la 7 alfa colecterol hidroxilasa, la ácido fosfatídico fosfatasa, o aún las proteínas de transferencia de los lípidos como la proteína de transferencia de los esteres del colesterol y la proteína de transferencia de los fosfolípidos, una proteína de enlace de los HDL o aún un receptor elegido por ejemplo entre los receptores LDL, los receptores de los fragmentos de quilomicras _y los receptores de los depuradores o purificadores, ec. El ácido nucleico terapéutico puede ser igualmente un gen o una secuencia antisentido, cuya expresión en la célula de blanco u objetivo permite controlar la expresión de los genes o la transcripción de los ARNm celulares. Tales secuencias, por ejemplo, pueden ser transcritas en la célula de blanco u objetivo en los ARN complementarios del ARNm celulares y bloquear así su traducción en la proteína, según la técnica descrita en la patente EP 140 308. Los genes terapéuticos comprenden igualmente las secuencias que codifican para las
ribozimas, que son capaces de destruir selectivamente los ARN de blanco u objetivo (EP 321 201). Como está indicado anteriormente, el ácido nucleico puede llevar igualmente uno o varios genes que codifican para un péptido antigénico, capaz de generar en el hombre o animal una respuesta inmunitaria. En este modo particular de utilización, la invención permite así la realización ya sea de vacunas o de tratamientos inmunoterapéuticos aplicados al hombre o al animal, especialmente contra los microorganismos, los virus o los cánceres. Se puede tratar especialmente de péptidos antigénicos específicos del virus de Epstein Barr, del virus de VIH, del virus de la hepatitis B (EP 185 573), del virus de la seudo-rabia, de los virus que forman sincitios, de otros virus o aún los específicos de los tumores (EP 259 212) . Preferentemente, el ácido nucleico comprende igualmente las secuencias que permiten la expresión del gen terapéutico y/o del gen que codifica para el péptido antigénico en la célula u órgano deseado. Se puede tratar de secuencias que son responsables naturalmente de la expresión del gen considerado cuando estas secuencias son susceptibles de funcionar en la célula infectada. Se puede tratar igualmente de secuencias de origen diferente (responsables de la expresión de otras proteínas, o
también sintéticas). Especialmente, se puede tratar de secuencias promotoras de los genes eucariotas o virales. Por ejemplo, se puede tratar de secuencias promotoras salidas del genoma de la células que se desea infectar. De la misma manera, se puede tratar de secuencias promotoras salidas del genoma de un virus. A este respecto, se pueden citar por ejemplo los promotores de los genes E1A, MLP, CMV, RSV, etc. Además, estas secuencias de expresión pueden ser modificadas por la adición de las secuencias de activación, de regulación, etc. También se puede tratar de promotores, inducibles o reprimibles. Por otra parte, el ácido nucleico puede llevar igualmente, en particular río arriba del gen terapéutico, una secuencia de la señal que dirige el producto terapéutico sintetizado en las vías de secreción de la célula de blanco u objetivo. Esta secuencia de la señal puede ser la secuencia de la señal natural del producto terapéutico, pero se puede tratar igualmente de cualquier otra secuencia de la señal funcional, o de una secuencia de la señal artificial. El ácido nucleico puede llevar igualmente una secuencia de la señal que dirige el producto terapéutico sintetizado hacia un compartimiento particular de la célula.
En otro modo de utilización, las composiciones reivindicadas pueden comprender además un adyuvante del tipo de la dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE) , la oleoilpalmitoilfosfatidiletanolamina (POPE) , las di-estearoil, -palmitoil, miristoil fosfatidiletanolaminas así como sus derivados N-metilados 1 a 3 veces, los fosfatidilgliceroles, los diacilgliceroles, los glicosildiacilgliceroles, los cerebrosidas (tales como especialmente los galactocerebrosidas) , los esfingolípidos (tales como especialmente las esfingomielinas) o aún las asialogangliosidas (tales como especialmente las asialoGMl y GM2 ) . Muy recientemente, el solicitante ha demostrado que ha sido igualmente ventajoso de manera particular emplear en calidad de adyuvante en estas composiciones transfectantes, un compuesto que interviene, directamente o no, al nivel de la condensación de los ácidos nucleicos. Este compuesto está constituido, parcialmente o en su totalidad, de porciones peptídicas (KTPKKAKKP) y/o (ATPAKKAA) , el número de porciones pueda variar entre 2 y 10. Uno de tales agentes se puede derivar igualmente de una' parte de una histona, de una nucleocolina, de una protamina y/o de uno de sus derivados (WO 96/25508). Uno de tales compuestos puede ser incorporado ventajosamente en la composición reivindicada.
Las composiciones según la invención pueden utilizar igualmente uno o varios elementos de blanco u objetivo que permiten dirigir los complejos nucleicos hacia los receptores o los ligandos en la superficie de las células. A título de ejemplo, la composición de la presente invención puede comprender uno o varios anticuerpos dirigidos contra las moléculas de la superficie celular, o aún uno o varios ligandos de los receptores membranarios como la insulina, la transferrina, el ácido fólico o cualquier otro factor de crecimiento, las citocinas o las vitaminas. Ventajosamente, la composición puede utilizar las lectinas, modificadas o no, a fin de ubicar como blanco u objetivo los polisacáridos particulares en la superficie de la célula o sobre la matriz extracelular vecina. Las proteínas con una porción RGD, los péptidos que contienen una serie de porciones de RGD, cíclicos o no, así como los péptidos de polilisina también pueden ser utilizados. Más recientemente, se han descrito igualmente péptidos de ligandos, naturales o sintéticos, interesantes especialmente por su selectividad frente a las células específicas y capaces de promover eficazmente la internalización al nivel de las células. (Bary et al. Nature Medicine, 2, 1996, 299-305) . Estos agentes de ubicación como blanco u objetivo son conjugados
generalmente con el agente de transfección catiónica considerado. La presente invención contempla igualmente un procedimiento de preparación de las composiciones reivindicadas. Más precisamente, la misma se refiere a un procedimiento de preparación de una composición que comprende partículas de complejos de agente (s) de transfección cationico (s) /ácidos nucleicos, estabilizados en su tamaño, caracterizado porque el agente transfectante y el ácido nucleico son puestos en contacto en la presencia de una cantidad suficiente del agente superficial no iónico para estabilizar las partículas de los complejos nucleicos así formadas a un tamaño inferior a aproximadamente 160 nm. De manera más precisa, uno de los compuestos, es decir el ácido nucleico o el lipofectante es mezclado previamente con el agente superficial no iónico antes de ser puesto en la presencia del segundo componente. Se previene así la manifestación de cualquier fenómeno de agregación que espontáneamente será manifestado en la ausencia de dicho agente superficial no iónico. Las composiciones según la invención pueden ser formuladas con miras a administraciones por la vía tópica, cutánea, oral, rectal, vaginal, parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutánea,
infraocular, transdérmica, etc. De preferencia, las composiciones farmacéuticas de la invención contienen un vehículo aceptable farmacéuticamente para una formulación inyectable, especialmente para una inyección directa al nivel del órgano deseado, o para una administración por la vía tópica (sobre la piel y/o la mucosa) . Se puede tratar en particular de soluciones estériles, isotónicas, o de composiciones secas, especialmente liofilizadas, las cuales, por adición según el caso de agua esterilizada o del suero fisiológico, permiten la constitución de soluciones inyectables. Las dosis del ácido nucleico utilizadas para la inyección así como el número de administraciones que pueden ser adaptadas en función de diferentes parámetros, y especialmente en función del modo de administración utilizado, de la patología relacionada, del gen que se va a expresar, o aún de la duración del tratamiento deseado. Por lo que se refiere más particularmente al modo de administración, se puede tratar ya sea de una inyección directa en el tejido o en las venas circulatorias, o de un tratamiento de las células en el cultivo seguido de su rei plante in vivo, por inyección o injerto. Las composiciones según la invención son particularmente ventajosas sobre el plano terapéutico. Se puede contemplar en lo sucesivo según la presente
invención, administrar eficazmente los complejos de ácidos nucleicos de un tamaño conveniente y la relación de la carga reducida, lo que es particularmente benéfico sobre el plan o consideración in vivo. Las interacciones de suero/complejos nucleicos observadas generalmente, son con las composiciones reivindicadas logradas significativamente . La presente invención será descrita más completamente con la ayuda de los ejemplos y las Figuras que siguen, que deben ser consideradas como ilustrativas y no como limitativas.
Figuras
La Figura 1 muestra el efecto del poloxalcol sobre la evolución del tamaño de los complejos de RPR 120535/ADN, a la relación de carga (+/-) 2.5, en función del tiempo. La Figura 2 muestra el efecto del poloxalcol sobre la evolución del tamaño de los complejos de RPR 120531/ADN, a la relación de la carga de (+/-) 2.5 en función del tiempo. La Figura 3 muestra el efecto del poloxalcol sobre las asociaciones de RPR 120535/ADN.
La Figura 4 muestra el efecto del poloxalcol sobre la actividad de la luciferasa (RLU/5µl del lisado) de los complejos de RPR 120535/ADN, a la carga de ( +/-) 2.5. La Figura 5: Parte A: representación esquemática de la estructura de los complejos de RPR 120535/ADN en la ausencia o presencia del poloxalcol. Parte B: representación esquemática de la estructura de los complejos de BGTC/ADN en la ausencia y en la presencia del poloxalcol.
Materiales
El agente superficial utilizado en los ejemplos posteriores es el poloxalcol de la fórmula OH(CH2CH2?) 5(CH(CH3)CH2?)3?(CH2CH2?)75H. El mismo es comercializado bajo la marca Pluronic F68®. La solución madre de poloxalcol utilizada en los ejemplos que siguen es al 10% (peso/volumen) en el agua. El ADN utilizado para realizar las muestras es el plásmido del pXL2774 descrito en la PCT/FR 96/01414. El mismo es utilizado a una concentración de 0.7 mg/ml en una solución amortiguadora de Tris/EDTA (10 mM/0.1 mM) de pH 7.5.
Los lípidos catiónicos utilizados son los siguientes : H2N ( CH2) 3NH (CH2 ) 4NH (CH2 ) 3NHCH2COGlyN [ (CH2 ) 17CH3] 2 (RPR 120535) (sal de acetato) y el H2N (CH2 ) 3NH (CH2) 4NH ( CH2 ) 4NH (CH2) 3NHCH2COArgN [ (CH2 ) ?7CH3] (RPR 120531) (sal del ácido trifluoroacético), los dos descritos en la PCT/FR 96/01774. Los mismos son utilizados a una concentración de 5 mM en agua o los mismos son solubilizados por calentamiento a 50 °C durante 25 minutos, las soluciones son enfriadas enseguida a la temperatura ambiente.
Métodos
La medida del diámetro hidrodinámico es realizada con un Coulter N4Plus, utilizando las cubas de plástico (cuatro caras transparentes) rellenas con 800 µl de las diferentes soluciones, la medición es realizada a
90 °C en un modo unimodal . Las mediciones de la fluorescencia son realizadas sobre un aparato Perkin Elmer LS50B, utilizando longitudes de onda de excitación y de emisión respectivamente de 260 nm y 590 nm. Las anchuras de las aberturas para la excitación y la emisión son reguladas a 5 nm. El valor de la fluorescencia es registrado después
de agregar 5 µg de Bromuro de etidio/ml en la concentración final. Las experiencias de la criomicroscopía electrónica de transmisión (crio-TEM) son realizadas con 7 µl de muestras preparadas a 0.5 mg del ADN/ml, que son colocadas sobre una rejilla de cobre carbonado recubierta con una membrana con aberturas. Las rejillas son sumergidas enseguida en etano líquido de manera que se transforme el agua líquida en agua vidriosa. Luego, esta rejilla es instalada en un portaobjetos enfriado con nitrógeno líquido, y se introduce en el microscopio (Philips CM12) para visualización. Los experimentos de difusión de rayos X a ángulos pequeños son realizados en un sincrotrón (LURE) de Orsay (Francia) sobre la línea D43. Los muestras son preparadas a 0.5 mg de ADN/ml, luego centrifugadas. Los tubos son colocados en una celda cuyas dos ventanas están constituidas de kaptón. Un monocromador de Germanio (111 de reflexión) permite la selección de la longitud de onda de 0.138 nm. Las transfecciones in vivo son realizadas inyectando 200 µl, en la vena de la cola de ratones de 30 días de edad, de una solución que contiene 0.2 mg de ADN/ml asociado con un vector lipídico catiónico. 24 Horas después de la inyección, los ratones son
eutanizados, luego se recuperan diferentes órganos (pulmón, hígado, corazón, riñon, bazo) . Estos órganos son triturados enseguida en una solución amortigudora de lisis con la ayuda de un ultraturax. Las sobstancias trituradas obtenidas son centrifugadas enseguida, luego 10 µl del sobrenadante son tomados a fin de dosificar la actividad de la luciferasa.
Ejemplo 1: Influencia del poloxalcol sobre el tamaño de los complejos del RPR 120535/ADN.
El plásmido (10 µg/ml) se pone en una solución que contiene 150 mM de NaCl y diferentes concentraciones de poloxalcol. El lipofectante de RPR 120535 es agregado enseguida para obtener una relación de la carga (+/-) de 2.5. El tamaño de los complejos es medida enseguida por espectroscopia de correlación de los fotones según el protocolo descrito en los Métodos. Los resultados son presentados sobre la Figura 1. Se observa que en ausencia del poloxalcol (D) , el tamaño de las partículas evoluciona de 274 nm hasta un máximo de 1000 nm en algunas decenas de minutos. Luego se observa un precipitado después de algunas horas de incubación.
En cambio, en la presencia de 0.1% (+) de poloxalcol, se observa una disminución del tamaño de los complejos, tamaño que permanece estable para una concentración de 0.8% (O) y el 1 % (A) de poloxalcol y no evaluciona más allá de 150 nm. La incubación del lipofectante solo con el poloxalcol al 1% (peso/volumen) no forma más que partículas detectables por Difusión Casi Elástica de la Luz. De la misma manera, cuando el ADN es incubado con el poloxalcol al 1%, ninguna partícula puede ser detectada.
Ejemplo 2 : Influencia del poloxalcol sobre el -tamaño de los complejos de RPR 120531/ADN.
Para hacer esto, el ejemplo No. 1 ha sido repetido con el lípido catiónico RPR 120531. El plásmido (10 µg/ml) es puesto en una solución que contiene 150 nM de NaCl a diferentes concentraciones en poloxalcol. El RPR 120531 es agregado enseguida para obtener una relación de la carga (+/-) de 2.5. El tamaño de los complejos es medido por espectroscopia de correlación de los fotones (Coulter N4plus) . Los resultados son presentados sobre la Figura 2. Se nota que en la ausencia del poloxalcol, el tamaño de los complejos de RPR 120531/ADN evoluciona de
234 nm a 590 nm en algunas horas cuando la misma permanece estable en la presencia de 0.5% (A) y 0.9% (O) de poloxalcol.
Ejemplo 3: Control del grado de compactación del ADN/lipofectante en la presencia y en la ausencia del poloxalcol .
Se ha verificado que las partículas obtenidas en la presencia del poloxalcol son también las partículas salidas de la asociación del ADN con el lípido catiónico. Para estos fines, los experimentos de inserción de una sonda, que fluoresce cuando la misma es intercalada en el ADN, han sido realizadas. El nivel de fluorescencia es importante cuando el ADN está libre y al contrario reducida cuando el mismo es inaccesible porque se compactó en el lípido catiónico. La Figura 3 muestra los resultados obtenidos. Se observan los niveles de fluorescencia obtenidos después de la asociación del ADN con el lípido catiónico en la presencia y en la ausencia del poloxalcol. En primer lugar se nota que la fluorescencia del bromuro de etidio intercalado con el ADN no ha sido modificado por la presencia o ausencia del 1% de poloxalcol. Los niveles de fluorescencia de los complejos
de lípido catiónico/ADN (relación de la carga (+/-) de 2.5), en la presencia o ausencia del 1% del poloxalcol son en efecto del mismo orden. Este valor de fluorescencia residual indica que el ADN no está accesible por la sonda. En conclusión, el poloxalcol no impide así la asociación del ADN con el lípido catiónico de la manera en que se hace normalmente.
Ejemplo 4 : Transfección in vitro con el ADN o el RPR 120535 que contiene 1% del poloxalcol.
Se quiere verificar cual sería el efecto del poloxalcol cuando el mismo fuera mezclado con el ADN solo o con el lípido catiónico solo. Para esto se preparan las dos muestran siguientes:
Muestra 1: 10 µg de ADN/ml en un medio que contiene 300 mM de NaCl y 1% (peso/volumen) del poloxalcol. Muestra 2: 60 µM de RPR 120535 en un medio que contiene 300 mM de NaCl y 1% de poloxalcol.
Estas muestras son preparadas mezclando en el orden para la muestra 1: agua, NaCl, ADN y poloxalcol, y para la muestra 2: agua, NaCl, poloxalcol y RPR 120535 en
las cantidades que figuran en la tabla I que se da enseguida:
TABLA I
La actividad biológica de estas dos muestras es probada sobre las células NIH 3T3. Un volumen de 50 µl de diferentes muestras es depositado por cavidades sobre una placa de 24 cavidades. La transfección es realizada en la ausencia del suero de la vena fetal. Esta última es agregada 2 horas después de la adición de los complejos. Los resultados indican que ninguna transferencia del gen es observada con el ADN que no formó un complejo en la presencia de 1% de poloxalcol en la ausencia del 10% de suero de la vena fetal. Por otra parte la dosificación de las proteínas totales demuestra que no existe toxicidad aparente.
EJEMPLO 5 Transfección in vitro con soluciones de complejos lipofectantes RPR 120535/ADN estabilizados a di erentes concentraciones en poloxalcol .
Se ha buscado apreciar la incidencia de la estabilización de las partículas por el poloxalcol sobre la eficacia de la transfección. de estas partículas en la presencia del poloxalcol. Para hacer esto, las muestras que contienen diferentes concentraciones de ' poloxalcol han sido preparadas. Cuatro muestras de la relación de carga (+/-) 2.5 son preparadas en un medio que contiene 300 mM de NaCl a diferentes concentraciones de poloxalcol (0; 0.5%; 0.8% y 1%; peso/volumen):
Muestra 1: relación de carga (+/-) 2.5, 300 mM de NaCl. Muestra 2 : relación de carga (+/-) 2.5, 300 mM de NaCl, y 0.5% de poloxalcol. Muestra .3: relación de carga (+/-) 2.5, 300 mM de NaCl, y 0.8 % de poloxalcol. Muestra 4: relación de carga (+/-) 2.5, 300 mM de NaCl, y 1% de poloxalcol. Estas muestras han sido preparadas mezclando en el siguiente orden: agua, NaCl, ADN, poloxalcol y RPR
120535, en las cantidades que figuran en la tabla II que se da enseguida.
TABLA II
* La muestra 1 pertenece a una gama de concentración de los lípidos catiónicos en donde no se tiene estabilidad de las partículas en la solución, es decir que las partículas se agregan las unas a las otras para formar grandes paquetes de agregados que posean diámetros hidrodinámicos importantes (superiores a 1000 nm) .
* La muestra 2 tiene la misma relación de carga de lípido catiónico/ADN que la muestra 1, pero la mezcla es realizada en la presencia de 0.5% (peso/volumen) de poloxa?col. Sin embargo esta concentración no es suficiente para asegurar una estabilización completa de
las partículas (cotéjese el ejemplo No. 1: influencia de un polímero no iónico sobre el tamaño de las complejos de RPR 120535/ADN) .
* Las muestras 3 y 4 son estables, el diámetro hidrodinámico de las partículas permanece cerca de 150 nm.
La actividad biológica de las diferentes formulaciones es probada sobre las células de NIH 3T3. Un volumen de 50 µl de las diferentes muestras (a 10 µg de ADN/ml) es agregado por cavidad. La transfección es realizada en la ausencia del suero de la vena fetal. Esta última es agregada dos horas después de la adición de los complejos. Los resultados obtenidos son presentados sobre la Figura 4. Se nota en la Figura 4 que el poloxalcol, cualquiera que sea su concentración, no altera la transfección in vitro de las células de NIH 3T3. El poloxalcol no modifica las propiedades de transfección en la ausencia del suero de la vena fetal de los complejos de RPR 120535/ADN a la relación de carga (+/-) 2.5.
EJEMPLO Determinación de la estructura de los complejos de RPR 120535/ADN, BGTC/ADN, y BGTC/DOPE/ADN estabilizados por el poloxalcol .
En este estudio, se ha determinado por difusión de los rayos X a ángulos pequeños y por microscopía electrónica de transmisión, la estructura de los complejos que transfectan el lípido catiónico/ADN. La Figura 5A se refiere a los complejos de RPR 120535/ADN. La estructura obtenida en la ausencia y en la presencia de poloxalcol es una estructura laminar en la cual el ADN es tomado en forma emparedada entre las bicapas lipídicas cuya periodicidad es de 8 nm. La presencia del poloxalcol permite obtener complejos de tamaño pequeño, mientras que en la ausencia del poloxalcol, se han obtenido precipitados cuyo tamaño es superior a 1000 nm. La Figura 5B representa las estructuras obtenidas con el lípido catiónico BGTC (descrito en la solicitud de patente WO 97/31935) . En este caso, se ha obtenido igualmente una estructura laminar cuya periodicidad es de 6.5 nm en la presencia o en la ausencia de poloxalcol. La presencia del poloxalcol permite igualmente en este caso disponer de complejos de tamaño pequeño. Los resultados son obtenidos
invariablemente por los complejos que contienen o no un adyuvante de DOPE. Se puede concluir así que la adición de un poloxalcol no perjudica la asociación del ADN con el lípido catiónico, sino que modifica el estado coloidal de este complejo.
EJEMPLO 7 : Transfección in vivo después de la inyección sistémica de los complejos de lipido catiónico/ADN estabilizados por el poloxalcol .
1) RPR 120535/ADN/F68®
Se han comparado las eficacias de transferencia de los genes después de las inyecciones sistémicas de los complejos de RPR 120535/ADN precipitados, y de estos mismos complejos estabilizados por la adición del
Pluronic F68®. La tabla III que se da enseguida indica que cuando los complejos son realizados en la ausencia de F68®, se recupera únicamente una expresión en los pulmones. Por el contrario, cuando las partículas son estabilizadas coloidalmente por la adición del F68®, la actividad de la luciferasa es aumentada en un factor de
en los pulmones, y se recupera una expresión en los otros tejidos (hígado, corazón) .
TABLA III
2) BGTC/DOPE/ADN/F68®
Experiencias idénticas a aquellas descritas anteriormente han sido realizadas utilizando otro lípido: el BGTC. Se han obtenido resultados similares, a saber una mejora de la transferencia de los genes en los pulmones ~ y una expresión medible en el hígado, el corazón, y los ríñones. Estos resultados han sido obtenidos con diferentes especies de ratón (balbc, C57B16, y C57B16 deficientes en Apolipoproteína E) . Es destacable que los niveles de transfección idénticos sean obtenidos con los ratones C57B16 normales o deficientes en Apolipoproteína E, aunque estos últimos poseen una tasa de lípidos muy importante, es decir diez veces más que un ratón normal. En efecto, dado que se han utilizado
vectores no virales lipidíeos, se podría esperar que estos complejos sean desestabilizados por la presencia de estos lípidos endógenos en gran cantidad. Los resultados de la transfección in vivo de los complejos de BGTC/DOPE/ADN en la ausencia o presencia de poloxalcol son mostrados en la tabla IV que se da enseguida:
T7ABLA IV
EJEMPLO 8 : Utilización de otros agentes superficiales no iónicos .
Otros agentes superficiales no iónicos han sido probados: dendrímero polietilenglicol, alcohol polioxietilénico, éter polioxietilen nonilfenílico. Los
mismos muestran la misma capacidad que el F68® para estabilizar los complejos de lípidos catiónicos/ADN. El lípido catiónico con el cual los estudios han sido realizados es el RPR 120535.
1) dendrímeros polietilenglicol
Se han utilizado un dendrímero que posee 1 una corona de poliéter bencílico de la generación 2 sobre el cual es injertado el polietilenglicol (PEG) de masa molecular 5000 Da (denominado SAS11), y otro dendrímero del mismo tipo, pero que contiene 2 coronas del poliéter bencílico injertado sobre un PEG de masa 11 000 Da
(denominado SAS9) . La tabla IV posterior indica que con estos dendrímeros, al 0.02 % (peso/volumen), se ha obtenido más precipitado micrónico de los complejos transfectantes, pero más bien partículas de diámetro inferior a, o del orden de 100 nm.
2) Alcohol polioxietilénico
Este producto aún denominado "Brij" que lleva 100 oxietilenos para la parte hidrófila, permite obtener al cabo de 1 hora los complejos de RPR 120535/ADN de un diámetro inferior a 100 nm.
3) Éter polioxietilen nonilfenílico
Este producto permite también estabilizar coloidalmente los complejos transfectantes RPR 120535/ADN. El diámetro de las partículas es igualmente del orden de 100 nm. La tabla V posterior representa el diámetro, en nm, de los complejos de RPR 12035/ADN, a la relación de la carga de 2.75 (+/-) a 0.25 mg de ADN/ml en 150 mM de NaCl, estabilizados por diferentes agentes superficiales no iónicos.
TABLA V
Para el agrupamiento de las formulaciones estabilizadas con estos diferentes agentes superficiales
no iónicos, se ha verificado el estado de condensación del ADN con el lípido catiónico por las mediciones de la fluorescencia. Los resultados han indicado que la presencia de estos agentes tensioactivos a la superficie de los complejos de lípido catiónico/ADN no modifican la condensación del ADN con los lípidos catiónicos (resultados no mostrados).
Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.
Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes
Claims (37)
1. Una composición útil en terapia génica, que comprende partículas de complejos de agente (s) de transfección catiónico (s) /ácidos nucleicos estabilizados, caracterizada porque se incorpora además al menos un agente superficial no iónico en una cantidad suficiente para estabilizar el tamaño de dichas partículas a una dimensión inferior o igual a 160 nm.
2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el agente de transfección catiónico y el ácido nucleico están presentes allí en una relación de la carga comprendida entre 1 y 6.
3. La composición de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizada porque el agente de transfección catiónico y el ácido nucleico están presentes allí en una relación de la carga inferior a 4.
4. La composición de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el agente superficial comprende al menos un segmento hidrófobo y al menos un segmento hidrófilo.
5. La composición de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque el segmento hidrófobo es elegido entre las cadenas alifáticas, los polioxialquilenos, los poliésteres de alquilideno, los polietilenglicoles coronados con poliéter bencílico, y el colesterol.
6. La composición de conformidad con las reivindicaciones 4 o 5, caracterizada porque el segmento hidrófilo es elegido entre los polioxialquilenos, los alcoholes polivinílicos, las polivinilpirrolidonas, o los sacáridos .
7. La composición de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el agente superficial es un poloxalquileno de la fórmula general: HO (CH2CH20) a (CH (CH3) CH20) b (CH2CH20) CH con a, b y c que representan independientemente uno de los otros números enteros que pueden variar entre 20 y 100.
8. La composición de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la misma contiene en calidad de agente superficial un compuesto de la fórmula general HO(CH2CH20)a(CH(CH3)CH2?)b(CH2CH2?)cH con a igual 75, b a 30 y c a 75.
9. La composición de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la misma contiene en calidad de agente superficial un compuesto de la familia del polietilenglicol coronado con poliéter bencílico dendrítico.
10. La composición de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la misma contiene en calidad de agente superficial un compuesto de la familia del alcohol polioxietilénico.
11. La composición de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la misma contiene en calidad de agente superficial el éter polioxietilen nonilfenílico.
12. La composición de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el agente superficial está presente allí a un concentración comprendida entre 0.01% y 10% en peso/volumen de dicha composición.
13. La composición de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el agente superficial está presente allí a una concentración comprendida entre 0.02% y 5% en peso/volumen de dicha composición.
14. La composición de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el agente de transfección catiónico es un lipofectante.
15. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el lipofectante es una molécula anfifílica que comprende al menos una región lipófila asociada o no con una región hidrófila.
16. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque se trata de una mezcla lipídica susceptible de formar liposomas catiónicos.
17. La composición de conformidad con las reivindicaciones 14 o 15, caracterizada porque se trata de un lípido catiónico.
18. La composición de conformidad con las reivindicaciones 14 o 15, caracterizada porque se trata de un lipofectante que comprende al menos una región de poliamina de la fórmula general: H2N-(-(CH)B-NH-)a-H en la cual m es un número entero superior o igual a 2 y n es un número entero superior o igual a l, m puede variar entre los diferentes grupos de carbono comprendidos entre 2 aminas, asociadas de manera covalente a una- región lipófila del tipo de cadena hidrocarbonada, saturada o no, del colesterol, o un lípido natural o sintético capaz de formar fases laminares o hexagonales.
19. La composición de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque la región de poliamina está representada por la espermina o uno de sus análogos que tiene conservadas sus propiedades de enlace con el ácido nucleico.
20. La composición de conformidad con las reivindicaciones 14 o 15, caracterizada porque se trata de un lipofectante de la fórmula general: H2N-(-(CH)m-NH-)n-H R en la cual R que figura en la región lipofílica está representado por la fórmula general: en la cual X y X' representan, independientemente entre sí, un átomo de oxígeno, un grupo metileno -(CH2)q- con q igual a 0, 1, 2 o 3, o un grupo amino, -NH- o -NR' - con R' que representa un grupo alquilo con Ci a C4, Y e Y' representan independientemente entre sí un grupo metileno, un grupo carbonilo o un grupo C=S, R3/ R4 y R5 que representan independientemente entre sí un átomo de hidrógeno o un radical alquilo, substituido o no, con Ci a C4, con p que puede variar entre 0 y 5, R6 representa un derivado del colesterol o un grupo alquil amino -NR?R2 con Ri y R2 que representan independientemente entre sí un radical alifático, saturado o no, lineal o ramificado con C12 a C22.
21. La composición de conformidad con las reivindicaciones 14 o 15, caracterizado porque se trata de un lipofectante de la fórmula general: en la cual Ri, R2 y R3 representan independientemente entre sí un átomo de hidrógeno o un grupo -(CH2)q-NRR' con q que puede variar entre 1, 2, 3, 4, 5 y 6, esto de manera independiente entre los diferentes grupos Ri, R2 y P3. y R y R' representan independientemente entre sí un "átomo de hidrógeno o un grupo - (CH2) q' -NH2, q' que puede variar entre 1, 2, 3, 4, 5 y 6, esto de manera independiente entre los diferentes grupos R y R' , m, n y p representan, independiente entre sí, un número entero que puede variar entre 0 y 6, cuando n es superior a 1, con m que puede tener valores diferentes y R3 significados diferentes en el seno de la fórmula general precedente, y R4 representa un grupo de la fórmula general : en la cual Re y R7 representan independientemente entre sí un átomo de hidrógeno o un radical alifático, saturado o no, con Cío a C22 con al menos uno de los dos grupos que son diferentes del hidrógeno, u es un número entero elegido entre 0 y 10 con cuando u es un número entero superior a 1, R5, X, Y y r que pueden tener significados diferentes en el seno de las diferentes porciones [ X- (CHR5) r-Y] , X que representa un átomo de oxígeno, de azufre o un grupo amino monoalquilado o no, Y que representa un grupo carbonilo o- un grupo metileno, R5 representa un átomo de hidrógeno o una cadena lateral de aminoácido natural, llegado el caso substituido, y r representa un número entero que varía entre 1 y 10 con cuando r es igual a 1, R5 que representa una cadena lateral del aminoácido natural substituido o no, y cuando r es superior a l, R5 representa un átomo de hidrógeno.
22. La composición de conformidad con una de las reivindicaciones 14 o 15, caracterizada porque se trata de un lípido catiónico portador de uno o varios grupos de guanidinio y/o amidinio.
23. La composición de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque el agente de transfección catiónico es un polímero catiónico.
24. La composición de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque dicho polímero catiónico es un compuesto de la fórmula general (I) : en la cual R puede ser un átomo de hidrógeno o un grupo de la fórmula: n es un número entero comprendido entre 2 y 10, y p y q son números enteros, se sobreentiende que la suma de p+q es tal que el peso molecular promedio del polímero está comprendido entre 100 y 107 Da.
25. La composición de conformidad con las reivindicaciones 23 o 24, caracterizado porque se trata de la polietilen imina de peso molecular promedio de 50 000 Da (PEI50k), de la polietilen imina de peso molecular promedio de 22 000 Da (PEI22K), o de la polietilen imina de peso molecular promedio de 800 000 Da (PEI800K) .
26. La composición de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque el agente de transfección catiónica es elegido de preferencia entre la lipofectamina, la dioctadecilamidoglicil espermina (DOGS), la 5-carboxiespermilamida de la palmitoilfosfatidiletanolamina (DPPES), el (dioctadecil-carbamoilmetoxi) -acetato de 2-5-bis- (3-amino-propilamino) -pentilo o el (dioctadecilcarbamoilmetoxi) -acetato de 1, 3-bis- (3-amino-propilamino) -2 propilo, el {H2N(CH2)3}2N(CH2)4N{(CH2)3NH2>(CH2)3 HCH2COGlyN[(CH2)17CH3]2, el H2N(CH2)3NH(CH2) NH(CH2)3NHCH2COGlyN[ (CH ) ?7CH3] 2, y el H2N(CH2) 3NH (CH2) 4NH (CH2) 3NHCH2COArgN[ (CH2) ?7CH3] 2 •
27. La composición de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el ácido nucleico es un ácido desoxirribonucléico.
28. La composición de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el ácido nucleico es un ácido ribonucleico.
29. La composición de conformidad con las reivindicaciones 27 o 28, caracterizada porque el ácido nucleico es modificado químicamente.
30. La composición de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 26, caracterizado porque el ácido nucleico es antisentido.
31. La composición de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el ácido nucleico lleva un gen terapéutico.
32. La composición de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la misma comprende además un adyuvante del tipo de la dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE) , la oleoil-palmitoilfosfatidiletanolamina (POPE), las di-estearoil, -palmitoil, -miristoil fosfatidiletanolaminas así como sus derivados N-metilados 1 a 3 veces; los fosfatidilgliceroles, los diacilgliceroles, los glicosildiacilgliceroles, las cerebrosidas (tales como especialmente las galactocerebrosidas) , los esfingolípidos (tales como especialmente las esfingomielinas) o aún las asialogangliosidas .
33. La composición de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la misma asocia además un agente de transfección catiónico de un elemento de ubicación como blanco u objetivo.
34. La composición de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque este elemento de ubicación como blanco u objetivo se elige entre los anticuerpos dirigidos contra las moléculas de la superficie celular, los ligandos de los receptores membranarios como la insulina, la transferrina, el ácido fólico o cualquier otro factor de crecimiento, citocinas o vitaminas, las lectinas, modificadas o no, las proteínas con porciones de RGD, los péptidos que contienen en serie las porciones de RGD, cíclicos o no, los péptidos de polilisina así como los péptidos de ligandos naturales o sintéticos.
35. El procedimiento de preparación de una composición que comprende partículas de complejos de agente (s) de transfección catiónico (s) /ácidos nucleicos, caracterizado porque el agente transfectante y el ácido nucleico son puestos en contacto, en la presencia de una cantidad suficiente de un agente superficial no iónico para estabilizar las partículas de los complejos nucleicos así formados a un tamaño inferior a aproximadamente 160 nm.
36. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque uno de los compuestos elegido entre el ácido nucleico o el lipofectante, es mezclado previamente con el agente superficial no iónico antes de ser puesto en la presencia del segundo compuesto.
37. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 35 o la reivindicación 36, caracterizado porque el agente superficial de allí está definido según las reivindicaciones 4 a 13.
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| FR97/01467 | 1997-02-10 |
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