MXPA99006583A - Proteinas de fusion para el transporte intracelular e intercelular y sus usos - Google Patents

Abstract

Se describen los polipéptidos acoplados y los polipéptidos de fusión para el transporte intracelular, y su preparación y uso, que incluyen (i) una secuencia de aminoácidos con la función de transporte de la proteína VP22 herpesviral (u homólogo, por ejemplo proveniente de VZV, BHV o MDV) y (ii) otra secuencia proteica seleccionada de (a) proteínas para el control del ciclo celular;(b) proteínas suicidas;(c) secuencias antigénicas o proteínas antigénicas provenientes de antígenos microbianos y virales y antígenos tumorales;(d) proteínas inmunomoduladoras;y (e) proteínas terapéuticas. Las proteínas acopladas pueden ser utilizadas para la distribución intracelular de secuencias proteicas (ii), para ejercer la función efectora correspondiente en la célula objetivo, y los polipéptidos de fusión pueden ser expresados a partir de polinucleótidos, vectores y células huésped correspondientes.

Description

PROTEÍNAS DE FUSIÓN PARA EL TRANSPORTE INTRACELULAR E INTERCELULAR Y SUS USOS Campo de la Invención La presente invención se refiere a los mejoramientos, modificaciones y desarrollos en relación a las proteínas de transporte, al transporte intracelular y a sus aplicaciones. En las modalidades particulares, la invención se refiérela las proteínas de fusión que comprenden proteínas de transporte que comprenden secuencias para el VP22 herpesviral o proveniente de homólogos o fragmentos del mismo junto con las secuencias provenientes de otras proteínas; y a los métodos para su preparación y uso. En las modalidades particulares, la invención se refiere a las proteínas de fusión para el control del ciclo celular, y a los materiales y métodos para su preparación y su uso. En los ejemplos particulares la invención se refiere a las proteínas de fusión que tienen funcionalidad de p53 de mamífero y funcionalidad de VP22 de herpesvirus. Otros aspectos de la invención serán aparentes a partir de la descripción y de las reivindicaciones.

Ref. 30689 Antecedentes de la Invención, y Técnica Anterior: Relevante a la presente solicitud es la solicitud de patente internacional previa de los propios inventores WO 97/05265 (O'Hare y Elliot) (publicada después de la fecha de prioridad reclamada para esta solicitud) , la cual se refiere a la proteína VP22 y sus propiedades y usos.

Similarmente, el documento de los inventores (Elliot and O'Hare (1997), en Cell. vol. 88 pp 223-233 (1997), se refiere al tráfico intercelular y a la distribución de proteínas por una proteína estructural de herpesvirus. Estos dos documentos son incorporados por referencia en la presente, en su totalidad, y forman una parte integral de esta descripción. Los inventores han mostrado que la proteína VP22 del virión de HSV-l posee un mecanismo de tráfico intercelular inusual, un efecto particularmente descrito en la especificación WO 97/05265. VP22 es una proteína de 38 kDa la cual en las células de mamífero transfectadas, de expresión primaria, está localizada predominantemente en el citoplasma donde ésta se asocia csn los microtúbulos celulares (ver el dibujo anexo, figura IB) . No obstante, una propiedad notable de VP22 es su habilidad para difundirse a todo lo largo de una monocapa de células de no expresión. VP22 es transportada desde el citoplasma de una célula de expresión hacia las células vecinas, donde ésta se acumula en el núcleo (Figura Ib) . El mecanismo de este transporte es todavía no completamente comprendido, pero ha mostrado que es realizado por medio de una ruta independiente del aparato de golgi, y puede utilizar el citoesqueleto de actina. HIV-1 Tat (Ensoli y colaboradores, 1993, Fawell y colaboradores, 1994) y un pequeño número de otras proteínas no virales (Jackson y colaboradores 1992) han sido atribuidas con propiedades de tráfico intercelular, pero ninguna parece demostrar este fenómeno tan impactantemente como VP22. Una propiedad importante adicional de VP22 es que cuando se aplica exógenamente al medio de una monocapa de células no transfectadas, ésta puede ser recogida por esas células no transfectadas, donde se acumula en el núcleo de la célula. La técnica anterior incluye en general una variedad de antígenos, proteínas de inmunomodulación, proteínas que son condicionalmente citotóxicas o letales después de la administración (para una célula que las contiene) de un fármaco o compuesto activador correspondiente, proteínas para el control del ciclo celular, y otras proteínas terapéuticas y de diagnóstico, especialmente en las formas de proteína y secuencias polinucleotídicas que hacen posible la manipulación genética por técnicas estándares. Las referencias a algunos ejemplos de estos materiales se dan enseguida. Por ejemplo, entre las proteínas para el control del ciclo celular, la proteína p53 es conocida como un supresor tumoral. p53 es una fosfoproteína nuclear de 53 kDa (Figura le) . Las proteínas p53 de tipo silvestre y mutantes han sido expresadas por medio de virus recombinantes de la vaccinia (Roñen y colaboradores, Nucleic Acids Research, 20:3435-3441, 1992). p53 funciona para regular la progresión del ciclo celular y bajo condiciones de daño al ADN a través de un mecanismo complejo de transducción de la señal puede inducir la detención del ciclo celular o la apoptosis (Levine 1997) . La incapacidad para sintetizar p53, o más comúnmente la síntesis de una forma mutada de la proteína puede dar como resultado la proliferación celular descontrolada y la formación de tumor. Ha sido mostrado por varios grupos gue la adición exógena de la p53 de tipo silvestre, funcional, puede promover la detención del ciclo celular y/o la apoptosis dando como resultado regresión del tumor con ejemplos que incluyen carcinomas cervicales (Hamada y colaboradores 1996) y xenoinjertos de cáncer de seno (Nielsen y colaboradores 1997). Un número de sistemas de distribución de p53 han sido utilizados in vivo e in vitro, tales como la inyección intravenosa de un complejo p53: liposoma (Kumar y colaboradores 1997), transfección directa (Zheng y colaboradores 1996) y transferencia mediada por adenovirus (Hamada y colaboradores, 1996, Sandig y colaboradores 1997) pero la distribución de la proteína funcional dentro de un porcentaje suficientemente alto de células sobrevivientes permanece siendo difícil. También conocido de la Patente Norteamericana No. 5,484,710 (La Jolla: JC Reed y colaboradores) son los elementos reguladores ligados a los genes involucrados en la muerte celular, como es regulada por la proteína supresora tumoral p53, y las proteínas adicionales y sus análogos para el control del ciclo celular.

Sigue siendo deseable el proporcionar construcciones de distribución de células adicionales, particulares para proteínas útiles.

Breve descripción y descripción detallada de la invención De acuerdo a un aspecto de la presente invención, se proporcionan proteínas acopladas gue comprenden secuencias de la proteína de transporte que contienen secuencias del VP22 herpesviral y de homólogos o fragmentos de las mismas, junto con secuencias de otras proteínas seleccionadas de: (a) proteínas para el control del ciclo celular; (b) proteínas que con condicionalmente citotóxicas o letales después de la administración (para una célula que las contiene) de un fármaco, profármaco o compuesto activador correspondiente (de otro modo descritas en la presente como proteínas suicidas); (c) secuencias antigénicas o proteínas antigénicas (por ejemplo de más de 12 residuos de aminoácidos de longitud) provenientes de antígenos microbianos y virales y antígenos tumorales; (d) proteínas inmunomoduladoras; y (e) proteínas terapéuticas. Los ejemplos de estos tipos de proteínas se mencionan más adelante. De este modo, el acoplamiento o fusión a una secuencia de aminoácidos con la función de transporte de la proteína VP22 puede proporcionar una construcción de distribución celular útil para las proteínas de los tipos mencionados. (Donde el contexto lo admite 'productos de acoplamiento" y expresiones similares incluyen la referencia a las proteínas de fusión) . Preferentemente, las proteínas acopladas son proteínas de fusión, las cuales pueden ser convenientemente expresadas en células huésped conocidas, adecuadas. Las secuencias polinucleotídicas correspondientes pueden ser preparadas y manipuladas utilizando elementos de técnica de ADN recombinante conocida per se y estándar, y adaptaciones fácilmente disponibles de la misma. No obstante, los productos acoplados químicamente pueden, para ciertas aplicaciones, ser utilizados si se desea, y ser preparados a partir de los componentes de proteínas individuales de acuerdo a cualquiera de una variedad de técnicas de acoplamiento químico conocidas per se. VP22 o una subsecuencia funcional de la misma, opcionalmente con una cola polipeptídica adicional para el acoplamiento, puede ser ligada a otras proteínas o ácido nucleico mediante acoplamiento químico de cualquier manera estándar adecuada, conocida. También proporcionados por la invención están los polinucleótidos que codifican para las proteínas de fusión como se describe en la presente, incluyendo secuencias correspondientes a VP22 y otra proteína de uno de los tipos mencionados anteriormente, y casetes de expresión, plásmidos, vectores y células recombinantes que comprenden los polinucleótidos. Éstos pueden ser formados y utilizados en formas análogas o fácilmente adaptables a partir de la técnica de ADN recombinante, estándar. De este modo, los polinucleótidos correspondientes pueden codificar para un polipéptido de fusión que comprende una secuencia con la función de transporte de la proteína VP22 herpesviral y una secuencia con una de las funciones especificadas en la presente. El polinucleótido puede estar comprendido en una estructura de lectura abierta operablemente enlazada a una secuencia promotora adecuada, y puede, de acuerdo a los ejemplos de la invención, formar parte de un vector de expresión, por ejemplo que comprende el polinucleótido llevado en un plásmido. El vector de expresión puede ser por ejemplo un vector viral recombinante o un vector de transfección no viral. Los vectores pueden ser por ejemplo análogos o ejemplos de esos vectores mencionados o descritos en la Patente Internacional WO97/05265, o aquellos mencionados o descritos en las Patentes Internacionales WO 92/05263, WO 94/21807, o WO 96/26267. Para las secuencias nucleotídicas que son capaces de ser transcritas y traducidas para producir un polipéptido funcional, la degeneración del código genético da como resultado un número de secuencias nucleotídicas que codifican el mismo polipéptido. La invención incluye todas las secuencias tales. De este modo, los productos descritos en la presente pueden ser utilizados de acuerdo a la invención como proteínas transportables capaces de ser recogidas por una población objetivo de células, por ejemplo de modo que una función efectora correspondiente a la secuencia polipeptídica acoplada a VP22, proveniente de entre los tipos mencionados anteriormente, puede tener lugar dentro de las células objetivo que han captado el producto. De este modo, por ejemplo, las células objetivo pueden presentar epítopes de antígeno tumoral deseados, en un caso donde la secuencia polipeptídica es proveniente de un antígeno tumoral elegido, o llega a ser sujeta a los efectos del control del ciclo celular donde la secuencia polipeptídica es proveniente de una proteína de control de ciclo celular, o se vuelve en cierto grado susceptible a la muerte o daño celular después del tratamiento adicional con un profármaco donde la secuencia polipeptídica es proveniente de una "proteína suicida" correspondiente. En el uso, muchos de los productos descritos en la presente pueden ser expresados como ' proteínas de fusión en una primera parte de la población objetivo de células, exportada a partir de éstas, y recogida por una segunda parte de la población objetivo de células que no produce directamente la proteína. También dentro de la invención están las células huésped de mamífero y microbianas que comprenden tales vectores u otros polinucleótidos que codifican para las proteínas de fusión, y su producción y uso. Un polipéptido de fusión como se describe en la presente, puede ser transportado a una población objetivo de células, mediante la introducción de un polinucleótido u otro vector que codifica para el polipéptido de fusión dentro de una primera parte de la población objetivo de células, por ejemplo mediante transfección o microinyección; la expresión del polinucleótido de codificación para producir el polipéptido de fusión, con lo cual se provoca que éste sea exportado desde la primera parte de la población objetivo, y provoca que sea recogida por una segunda parte de la población objetivo de células, no produciendo directamente el polipéptido de fusión. Los productos de acoplamiento (incluyendo los productos químicamente acoplados) pueden también ser transportados hacia una población objetivo de células mediante la exposición directamente de las células a una preparación de los productos de acoplamiento, con lo cual se provoca que las células objetivo sean recogidas. En esta especificación, "?VP22" denota: la proteína VP22 de HSV, por ejemplo de HSV1, y los fragmentos activos de transporte y homólogos de la misma, incluyendo los homólogos activos de transporte provenientes de otros herpesvirus, incluyendo el virus de la varicela zoster VZV, el herpesvirus equino EHV y el virus bovino BHV; proteínas modificadas y mutantes y polipéptidos de fusión y productos de acoplamiento que tienen homología con éstas, y una función de transporte correspondiente a una función de transporte de VP22 de HSV1; y en el contexto también se refiere a las secuencias de ácido nucleico que codifican para cualquiera de las anteriores, ya sea en la forma de ADN o ARN desnudos, o de un vector, o de secuencias de ácido nucleico más grandes incluyendo secuencias tales como subsecuencias . Entre las subsecuencias de la proteína VP22 herpesviral con actividad de transporte se ha encontrado por ejemplo que la actividad de transporte está presente en los polipéptidos correspondientes a los aminoácidos 60-301 y 159-301 de la secuencia VP22 completa de HSV1 (1-301) . Para la secuencia, ver por ejemplo Figura 4 en la Patente Internacional WO 97/05265. Un polipéptido que consiste de los aminoácidos 175-301 de la secuencia VP22 tiene notablemente menor actividad de transporte, y es menos preferido en conexión con la presente invención. En consecuencia, la presente invención se relaciona en un aspecto a las proteínas acopladas y de fusión que comprenden una subsecuencia de VP22 que contiene una secuencia que comienza preferentemente desde aproximadamente el aminoácido 159 (o antes, hacia el extremo N, en la secuencia VP22 nativa) , hasta aproximadamente el aminoácido 301, y que tiene (con relación a la secuencia VP22 completa) al menos una supresión de al menos parte de la secuencia VP22 la cual puede extenderse por ejemplo desde el extremo N hacia el punto inicial citado, por ejemplo una supresión de toda o parte de la secuencia de aproximadamente los aminoácidos 1-158. (Menos preferentemente, tal supresión puede extenderse adicionalmente en la dirección C-terminal, por ejemplo hasta aproximadamente el aminoácido 175). Por ejemplo, las secuencias parciales en el intervalo de aproximadamente los aminoácidos 60 al 301 hasta aproximadamente los aminoácidos 159 al 301 son proporcionadas . Las secuencias VP22 como son contempladas en la presente, se extienden a las proteínas homologas y fragmentos basados en las secuencias de los homólogos de la proteína VP22 provenientes de otros herpesvirus, por ejemplo, la invención proporciona los derivados correspondientes y los usos de las secuencias conocidas homologas VP22 provenientes de VZV (por ejemplo, toda o partes homologas de la secuencia proveniente de los aminoácidos 1-302), proveniente de MDV (por ejemplo toda o parte de la secuencia proveniente de los aminoácidos 1-249) y proveniente de BHV (por ejemplo, toda o partes homologas de la secuencia proveniente de los aminoácidos 1-258) . Las secuencias de las proteínas correspondientes provenientes de HSV2, VZV, BHV y MDV son disponibles en bases de datos públicas de proteínas/secuencias de ácidos nucleicos. De este modo, por ejemplo, dentro de la base de datos EMBL/Genbank, una secuencia de VP22 proveniente de HSV2 es disponible como el gen artículo UL49 bajo el acceso No. Z86099, que contiene el genoma completo de HSV2 cepa HG52; el genoma completo de VZV incluyendo el gen homólogo/proteína, es disponible bajo los números X04370, M14891, M16612; la secuencia proteica correspondiente de BHV es disponible como la 'proteína del tegumento del virión de herpesvirus 1 bovi.no" bajo el número de acceso U21137; y la secuencia proveniente correspondiente de MDV es disponible como gen artículo UL49 bajo el número de acceso L10283 para los 'genes de la secuencia homologa de herpesvirus del tipo 1 gallid. En estas proteínas, especialmente aquellas provenientes de HSV2 y VZV, pueden ser realizadas supresiones correspondientes, por ejemplo de secuencias homologas a los aminoácidos 1-159 de VP22 provenientes de HSV1. Estas secuencias citadas son incorporadas por referencia en la presente. Las homologías entre éstas son fácilmente accesibles mediante el uso de algoritmos estándares y de dotación lógica informática (software), por ejemplo aquellas mencionadas en WO 95/12673, página 9. Además, las proteínas VP22 quiméricas y las secuencias proteicas son también útiles dentro del contexto de la presente invención, por ejemplo, una secuencia proteica proveniente de VP22 de HSV1 para parte de la cual ha sido sustituida una secuencia homologa proveniente del homólogo de VP22 correspondiente de otro herpesvirus. Por ejemplo, dentro de la secuencia del polipéptido 159-301 de VP22 de HSV1 , las secuencias C-terminal pueden ser sustituidas a partir de VP22 de HSV2 o a partir del homólogo VP22 de BHV. Se ha encontrado que la supresión de la secuencia C-terminal de 34 aminoácidos proveniente de VP22 de HSV1, suprime la actividad de transporte, de este modo, esta región secuencial contiene elementos esenciales para la actividad de transporte. De acuerdo a un aspecto adicional de la invención, se proporcionan los polipéptidos acoplados y de fusión que comprenden la secuencia C-terminal de 34 aminoácidos proveniente de VP22, o una variante de la misma, junto con una secuencia proveniente de otra proteína seleccionada de: (a) las proteínas para el control de ciclo celular; (b) las proteínas que son condicionalmente citotóxicas o letales después de la administración (para una célula que las contiene) de un compuesto activador o fármaco correspondiente; (c) las secuencias antigénicas o proteínas antigénicas (por ejemplo de más de 12 residuos de aminoácidos de longitud) provenientes de antígenos microbianos y virales y antígenos tumorales; (d) proteínas de inmunomodulación; y (e) proteínas terapéuticas. Éstas son proporcionadas por ejemplo para el uso mediante administración en la forma de proteína para células que las recogerán. Los productos acoplados de los fragmentos terminales modificados que tienen al menos una inserción o supresión mutacional con relación a la secuencia de 34 aminoácidos C-terminal de VP22 de HSV1, son también proporcionados. Se ha encontrado también que las secuencias necesarias para la actividad de transporte contienen una o una pluralidad de porciones de la secuencia de aminoácidos o sus homólogos provenientes de la secuencia C-terminal de VP22 de HSV1 u otros herpesvirus, las cuales pueden ser seleccionadas de RSASR, RTASR, RSRAR, RTRAR, ATATR, y en donde el tercero o cuarto residuo A puede estar duplicado, por ejemplo, en RSAASR. Los polipéptidos de fusión correspondientes, con las proteínas de los tipos mencionados en la presente, son también proporcionados . Además de sus usos como se indica en otros sitios en la presente, los polipéptidos acoplados y de fusión pueden también ser utilizados para producir anticuerpos que pueden ser utilizados en ensayos específicos de diagnóstico y de monitoreo como ensayos de enlace de una manera conocida per se, por ejemplo para la verificación periódica de la localización intracelular de las proteínas acopladas o de fusión mismas, o sus componentes. ('VP22 en la presente no se pretende que incluya la proteína VP22 no modificada, natural, o el gen correspondiente en su asociación natural y no modificada con el herpesvirus en sus diversas etapas del ciclo de vida natural, por ejemplo en asociación con herpesvirus que no ha sido sujeto a la alteración genómica. No obstante, 'VP22" sí se refiere por ejemplo a la proteína o gen correspondiente de un virus que ha sido por ejemplo alterado con respecto a su gen o función de UL49/VP22, o que ha tenido insertado en su genoma un gen VP22 adicional y/o híbrido ) .

Los productos de acoplamiento o proteínas de fusión basadas en VP22 pueden tener una gama de tamaños moleculares. Los productos en la práctica pueden ser por ejemplo de hasta aproximadamente 70 kDa o más, por ejemplo de 90 kDa o de 100 kDa o más, con respecto al tamaño de la proteína que va a ser acoplada o fusionada a VP22. Las modalidades de la invención incluyen los ejemplos donde el péptido de fusión es por ejemplo de al menos aproximadamente 13 residuos de longitud, o más de aproximadamente 12 residuos de aminoácidos de longitud, por ejemplo diferente de un péptido epítope antigénico de 12 residuos. Las proteínas que van a ser fusionadas pueden algunas veces ser mayores de aproximadamente 27 ó 32 kDa, por ejemplo éstas pueden ser diferentes de 27 kDa en tamaño. Por ejemplo, una de las proteínas que puede ser de este modo acoplada, p53, tiene por sí misma un tamaño de aproximadamente 53 kDa. El polipéptido acoplado o la proteína de fusión, incluyendo el componente VP22 puede tener un tamaño de hasta aproximadamente 120 kDa, por ejemplo de hasta aproximadamente 80 kDa o 100 kDa. Se prefiere algunas veces que la secuencia VP22 sea fusionada en su extremo N a la secuencia de la otra proteína elegida, de uno de los tipos mencionados en la presente. Las fusiones C-terminales pueden algunas veces ser correspondientemente menos preferidas. En los polipéptidos de la invención, las mutaciones de las secuencias de aminoácidos constituyentes (incluyendo aquellas de las proteínas inmunomoduladoras y otras proteínas mencionadas en la presente) pueden ser incorporadas en los polipéptidos de fusión y otras proteínas acopladas. Incluidas aquí están las proteínas que tienen secuencias mutadas tales que éstas permanecen homologas, por ejemplo en secuencia, función, y carácter antigénico u otra función, con una proteína que tiene la secuencia progenitura correspondiente. Tales mutaciones pueden preferentemente ser por ejemplo mutaciones que involucran cambios conservadores de aminoácidos, por ejemplo cambios entre aminoácidos de proteínas moleculares ampliamente similares. Por ejemplo, los intercambios dentro del grupo alifático alanina, valina, leucina e isoleucina pueden ser considerados como conservadores. Algunas veces la sustitución de la glicina por una de éstas puede ser considerada como conservadora. Los intercambios dentro del grupo alifático aspartato y glutamato pueden ser considerados como conservadores. Los intercambios dentro del grupo amida, asparagina y glutamina, pueden ser considerados como conservadores. Los intercambios dentro del grupo hidroxilo, serina y treonina pueden también ser considerados como conservadores. Los intercambios dentro del grupo aromático fenilalanina, tirosina y triptofano, pueden también ser considerados como conservadores. Los intercambios dentro del grupo básico, lisina, arginina e histidina pueden también ser considerados conservadores. Los intercambios dentro del grupo gue contiene azufre, metionina y cisteína, pueden también ser considerados como conservadores. Algunas sustituciones dentro del grupo metionina y leucina pueden también ser consideradas como conservadoras. Los grupos de sustitución conservadores, preferidos, son aspartato-glutamato; asparagina-glutamina ; valina-leucina-isoleucina; alanina-valina; fenilalanina-tirosina; y lisina-arginina . En otros aspectos, las secuencias mutadas pueden comprender inserciones y/o supresiones. Las secuencias proteicas mutadas pueden ser adicional o alternativamente codificadas por polinucleótidos que se hibridan bajo condiciones estrictas con la hebra apropiada del polinucleótido de origen natural que codifica para la proteína progenitura, y pueden ser probadas para resultados positivos en pruebas funcionales conocidas relevantes para la proteína progenitora. ('Condiciones estrictas" son dependientes de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. En general, las condiciones estrictas pueden ser seleccionadas de aproximadamente 5°C menor que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica definida y un pH definido. El Tm es la temperatura (bajo pH y fuerza iónica definidos) a la cual el 50% de la secuencia objetivo se hibrida a una sonda perfectamente acoplada. Típicamente, las condiciones estrictas serán aquellas en las cuales la concentración de sal sea al menos de aproximadamente 0.02 molar a pH 7, y la temperatura sea al menos de aproximadamente 60°C. Ya que otros factores pueden afectar la exigencia de hibridación, incluyendo, entre otros, la composición de bases y el tamaño de las hebras complementarias, la presencia de solventes orgánicos y el grado de mal acoplamiento de bases, la combinación de parámetros es más importante que la medida absoluta de cualquiera de ellas) .

Acoplamiento con proteínas de control del ciclo celular : En una clase útil de modalidades de la invención, VP22 puede acoplada con las proteínas del control del ciclo celular, conocidas per se. De este modo, en un ejemplo de la invención, relacionado con el control de ciclo celular, como se describe particularmente en un ejemplo más adelante, VP22 puede ser acoplada con proteína p53. Un propósito y uso aquí puede ser el bloquear la progresión del ciclo celular, especialmente en células malignas. VP22 puede también ser útilmente acoplada con los inhibidores de cinasa dependientes de la ciclina, por ejemplo plß, p21 o p27. La progresión normal del ciclo celular requiere estas proteínas; la ausencia de éstas puede desreprimir el ciclo celular, y los productos de acoplamiento correspondientes pueden ser utilizados para el tratamiento de las células cancerosas. Los productos de acoplamiento de VP22 pueden también ser usualmente utilizados en la modulación de la apoptosis, por ejemplo para inducir la muerte celular, del tipo de apoptosis, mediante la introducción dentro de una célula de un dominio apoptótico proteico acoplado a VP22, tal como por ejemplo la proteína de apoptosis bax, o su péptido inductor de apoptosis, identificado, conocido; o la proteína relacionada conocida bad o bak. Aquí también, el producto de acoplamiento puede ser aplicado ya sea en la forma de proteína o de ADN que la codifica. Los productos de acoplamiento de VP22 pueden ser utilizados en la forma de VP22 con proteínas conocidas de la familia bcl2, tales como bcl2 mismo, bcl-xL o bclw, para enmascarar o inhibir la apoptosis donde esto es deseado, por ejemplo, en el tratamiento de la neurodegeneración. Pueden ser utilizados otros productos de acoplamiento de VP22 para promover la apoptosis, que comprenden VP22 enlazado con proteasas conocidas similares a ICE. Los productos de enlace a VP22 con inhibidores de proteasa similares a ICE, por ejemplo pseudosubstratos, pueden ser utilizados para enmascarar o superar los efectos estimuladores de la apoptosis de las proteasas mismas. De este modo, de acuerdo a una modalidad de la invención, se proporciona un polipéptido de fusión que comprende una secuencia de aminoácidos con la función de transporte de la proteína VP22 herpesviral y una secuencia con la funcionalidad de control del ciclo celular de la proteína p53. El polipéptido de fusión puede incluir por ejemplo sustancialmente la secuencia p53 de longitud completa o sustancialmente la secuencia VP22 de longitud completa, o ambas. La fusión con VP22 puede de este modo ser utilizada para la distribución de un agente para el control del ciclo celular tal como p53. (Donde la descripción dada en la presente se refiere a p53 y péptidos relacionados, se entenderá que, donde el contexto lo admita, son también contemplados los agentes de control del ciclo celular, alternativos, tales como por ejemplo aquellos análogos de p53 y otras proteínas de control del ciclo celular mencionadas y referidas en la presente, como lo son, más en general, los socios de fusión o de acoplamiento alternativos para VP22, de cualguiera de los otros tipos mencionados en la presente) . Una vez expresada en una subpoblación de células de expresión, tal proteína de fusión puede ser transportada por el mecanismo de transporte de VP22 a partir de la célula de expresión dentro de una proporción significativa de células vecinas, y el polipéptido acoplado extraño, puede entonces ejercer su funcionalidad.

También proporcionados por este aspecto de la invención están los polinucleótidos correspondientes, que codifican para un polipéptido de fusión que comprende una secuencia con la función de transporte de la proteína VP22 herpesviral y una secuencia con la función reguladora del ciclo celular de humano/mamífero, de la proteína p53. El polinucleótido puede estar comprendido en una estructura de lectura abierta operablemente enlazada a una secuencia promotora adecuada. El polinucleótido puede formar parte, de acuerdo a los ejemplos de la invención, de un vector de expresión, por ejemplo, que comprende el polinucleótido llevado en un plásmido. El vector de expresión puede ser por ejemplo un vector viral o un vector de transfección no viral. Los vectores pueden ser por ejemplo análogos o ejemplos de éstos, descritos y referidos en el documento WO 97/05265 o Elliott y O'Hare (1997) . Se proporcionan también por la invención los métodos para la inhibición de la división celular, los cuales comprenden el exponer la células que tienen p53 activa/libre insuficiente para detener su ciclo celular, para ponerse en contacto con un polipéptido de fusión como se describe en la presente . Entre los métodos de la invención está un método para inhibir la división de las células tumorales, el cual comprende el exponer una célula tumoral presente en una masa de células tumorales, comprendiendo dicha célula tumoral p53 activa/libre insuficiente para detener su ciclo celular, para ponerse en contacto con un vector como se describe en la presente, con lo cual se provoca que la célula exprese un polipéptido de fusión como se describe en la presente, y para exponer otras células de la masa celular tumoral al contacto con el polipéptido de fusión . Hemos mostrado (ver descripción más adelante) que VP22-p53 puede ser transportado a muchas células no transfectadas en una monocapa. La proteína de fusión puede ser funcional en la detención del ciclo celular y/o inducción de la apoptosis, por ejemplo las células de expresión primaria y en células que han recibido VP22 vía la dispersión célula a célula. Por ejemplo, la proteína de fusión puede ser aplicada a una línea de células de osteosarcoma negativas a p53, SAOS-2 (Diller y colaboradores, 1990) . La p53 funcional expresada en estas células provoca la detención del ciclo celular en el límite G?-S y al final la muerte de la célula, esto puede ser probado utilizando microscopía confocal y anticuerpos contra los marcadores específicos del ciclo celular. La función de la proteína de fusión p53 puede también ser utilizada y evaluada en otras líneas celulares tumorigénicas donde p53 está presente pero contiene mutaciones puntuales específicas y bien caracterizadas que conducen a la no funcionalidad. Un número de sistemas vectores tales como la infección retroviral o adenoviral o la inyección de complejos proteína-liposoma pueden ser fácilmente adaptados para formar ejemplos de esta invención para la administración de proteínas de control del ciclo celular, a células y tejidos de sujetos humanos y no humanos que van a ser tratados. Por ejemplo, en relación al trabajo sobre la proteína p53 sola, éstos han demostrado claramente que la adición de la proteína p53 de tipo silvestre puede reducir el desarrollo de las células cancerosas in vivo. Un número de aplicaciones terapéuticas de administración no invasora de productos de acoplamiento a VP22 con las proteínas de control de tipo celular será aparente para el lector experto.

Por ejemplo, el ADN desnudo para una fusión VP22-proteína con una proteína efectora tumoral tal como p53, puede ser inyectado dentro de un tumor, por ejemplo un tumor sólido, por ejemplo un tumor sólido seleccionado por diagnósticos moleculares para carecer de p53 funcional. Los virus recombinantes pueden ser utilizados como se mencionó, que codifican y son capaces de expresar VP22-p53 y las proteínas de fusión equivalente. Por ejemplo un adenovirus puede expresar VP22-p53 y puede ser hecho dependiente de un promotor específico de tumor, para promover un gen viral esencial tal como Ela. Más en general, un vector viral recombinante que posee tal fusión puede ser defectuoso, de no replicación o de replicación restringida, de modo que la replicación es dependiente de las condiciones que prevalecen en el tejido objetivo o en la célula objetivo, pero no en células normales o no objetivo. En ciertos ejemplos de la invención, la proteína que tiene funcionalidad p53 puede por ejemplo comprender variantes o mutantes de p53, por ejemplo aquellas variantes como se describe en la especificación WO 97/04092 (Rhone Poulenc Rorer SA: Braceo L, Conseiller E) ('las nuevas variantes de p53, por ejemplo con dominio de oligomerización reemplazado por la cremallera de leucina-útil para el tratamiento de desórdenes hiperproliferativos, especialmente cáncer y restenosis" ) , la cual describe entre otras cosas las siguientes proteínas variantes: (a) variantes de la proteína p53 que tienen al menos parte "del dominio de oligomerización suprimido y reemplazado por un dominio de cremallera de leucina; (b) variantes de p53 preferentemente activas en células transformadas, donde todo o parte de al menos un dominio funcional ha sido suprimido y reemplazado por un dominio heterólogo preferentemente activo en tales células; (c) variantes de p53 con una supresión en la parte C-terminal desde el residuo 366, seguido por una secuencia de 19 aminoácidos (codificada por un fragmento de 76 pares de bases reproducido en la especificación) que representa la última parte de la parte alternativamente empalmada de p53 murina; y (d) la proteína quimérica que contiene un dominio de transactivación, un dominio de enlace al ADN, un dominio de localización nuclear y un dominio de oligomerización, en el cual el domino de enlace al ADN y el dominio de localización nuclear comprenden los aminoácidos 75-325 o 75-336 de la p53 humana de tipo silvestre.

En ejemplos adicionales de la invención, los vectores y las proteínas de fusión pueden codificar o comprender los polipéptidos p53 variantes que comprenden secuencias de p53 quiméricas que incluyen dominios de tetramerización heterólogos, los cuales pueden ser adaptados de aquellos descritos en las especificaciones WO 96/16989 y US 5,573,925 (Wistar Institute of Anato y & Biology: Halazonetis TD) y usadas en formas correspondientes. En tales ejemplos de la invención, las secuencias de p53 pueden comprender la proteína p53 quimérica que tiene una secuencia p53 nativa y un dominio de tetramerización heterólogo que forma homotetrámeros tales que la proteína quimérica resultante no puede hetero-oligomerizarse con la p53 mutante derivada del tumor, o del tipo silvestre, y no interfiere con la funcionalidad supresora de tumores de p53 nativa. Las proteínas de fusión y los vectores de acuerdo a los ejemplos adicionales de la presente invención, pueden ser utilizados para el tratamiento de enfermedades hiperproliferativas , especialmente cáncer y enfermedades autoinmunes, por ejemplo, la restenosis, y particularmente para el tratamiento de células que tienen una mutación de p53, y las cuales también expresan la proteína MDM2 a alto nivel, incluyendo por ejemplo las células cancerosas relacionadas a HPV. Éstas pueden también ser utilizadas para matar las células en hiperproliferación in vitro. Tales variantes pueden involucrar los supresores tumorales activos y estables y los agentes inductores de apoptosis y se propone que son activos donde la proteína de tipo silvestre no está, por ejemplo, inactivada por los mutantes negativos u oncogénicos, dominantes, ni por otras proteínas celulares (debido a que el dominio de cremallera de leucina previene la formación de oligómeros mixtos inactivos) . Las proteínas de fusión y los vectores pueden también ser utilizados, de acuerdo a los ejemplos adicionales de la presente invención, en medicamentos para suprimir el fenotipo neoplástico de las células cancerosas que carecen de la proteína p53 del tipo silvestre, en formas por ejemplo que correspondan a uso del gen p53 de tipo silvestre como se describe en la especificación EP 0 710 722 (Univ California: Chen P, Lee W) , la cual describe los genes y los vectores retrovirales para fines, entre otras cosas, de suprimir el fenotipo neoplástico en células cancerosas tales como células de osteosarcoma, células de carcinoma del pulmón, células de carcinoma de colon, células de linfoma, células leucémicas, células de sarcoma de tejido suave o células de carcinoma de mama, de vejiga o de próstat . Las proteínas de fusión y los vectores pueden también ser utilizados de acuerdo a los ejemplos adicionales de la presente invención, por ejemplo, en formas que corresponden a aquellas descritas en la especificación WO 95/12660 (Univ Texas System: Roth JA y colaboradores), la cual describe el adenovirus recombinante que posee una construcción de vector adenoviral que comprende una región de expresión gue codifica para p53, y la cual es capaz de expresar la p53 por ejemplo en las células malignas humanas, y las cuales pueden ser utilizadas entre otras cosas para la distribución o administración regional del gen p53 supresor de tumores, a las células enfermas, ya sea para restaurar la función de p53 a las células deficientes en p53, o para suprimir el desarrollo tumoral en células que tienen p53 anormal, y de este modo para tratar malignidades humanas tales como cáncer de mama y de pulmón. Tales adenovirus pueden ser utilizados para análisis in vitro y estudios de mutagénesis de diversos genes de p53.

Se pueden utilizar también proteínas de fusión y vectores, de acuerdo a los ejemplos adicionales de la presente invención como inhibidores de la replicación del virus de la hepatitis B (HBV) , de formas correspondientes a aquellas descritas en la Patente Norteamericana US 5,635,473 y Patente Internacional WO 96/11017 (Mogan Biotechnology Research Institute: H-S Lee y colaboradores) . Los ensayos de selección para identificar agentes gue incrementen de manera efectiva el nivel de la muerte celular, y que puedan actuar como análogos de p53 y que puedan inducir apoptosis en células, se describen por ejemplo en la Patente Norteamericana US 5,484,710 (La Jolla: JC Reed y colaboradores), particularmente en el ejemplo IV de la misma. También contempladas como modalidades alternativas de la invención están las proteínas de fusión de los materiales relacionados que incorporan la funcionalidad VP22 y la funcionalidad de proteína Bax. En relación a la proteína Bax, se hace referencia a la Patente Norteamericana US 5,484,710 y referencias citadas en ésta, incorporadas por referencia en la presente.

Acoplamiento con la 'proteína suicida" : En una clase adicional de modalidades de la invención, VP22 o una subsecuencia funcional de la misma se puede acoplar útilmente o fusionarse por ejemplo con una 'proteína suicida" tal como por ejemplo la timidina-cinasa conocida, nitrorreductasa, u otra enzima o fragmento funcional de la misma conocido como aplicable para un propósito similar. El producto de acoplamiento puede penetrar dentro de las células que van a ser tratadas con (en el caso de la timidina-cinasa) ganciclovir u otro fármaco (profármaco) de la misma familia, de modo que el profármaco sea convertido en las células que contienen el producto 'gen suicida" a una forma activa para matar las células. Los ejemplos adecuados de genes suicidas conocidos, útiles y los profármacos correspondientes se dan y se refieren por ejemplo en la Patente Internacional WO 94/13824 (Univ Curie París: M Caruso y colaboradores WO 95/05835 (Baylor College: S Chen y colaboradores), y en WO 93/08288 (Cáncer Research Campaign Technology. G Anzelark y colaboradores), y WO 93/01281 (US DHHS : RM Blaese y colaboradores), e incluyen, además de la timidina-cinasa (gen suicida) y del ganciclovir/aciclovir (profármaco), nitrorreductasa (gen suicida) y CB1954 (profármaco), y citosina-desaminasa (gen suicida) y 5-fluorocitosina (profármaco) . Estas y otras proteínas suicidas y (pro) fármacos correspondientes son también revisados y sus usos se mencionan en 'Genetic Prodrug Activation Therapy", A Rigg y K Sikora, Molecular Medicine Today, Agosto de 1997, pp 359-366. Donde la fusión VP22-TK es presentada en la forma de ADN en cualquiera de las formas descritas en la Patente Internacional WO 97/05265 o Elliott y O'Hare (1997), una célula objetivo puede ser transfectada con el gen que codifica para esta fusión, y la fusión expresada puede ser luego translocada fuera de la célula en la cual ésta fue expresada y hacia las células circunvecinas, produciendo un efecto de muerte sobre tales células cuando son tratadas con ganciclovir, etc., un efecto que es diferente de, y puede se adicional a, los efectos esperados conocidos. Alternativamente, como con otras modalidades, tal fusión VP22-TK puede ser aplicada directamente como proteína.

Acoplamiento con antígenos: En modalidades adicionales, la invención se refiere por ejemplo a las proteínas de transporte relacionadas a VP22 o sus fragmentos activos fusionados en polipéptidos de fusión o de otro modo acoplados con secuencias antigénicas o proteínas antigénicas (por ejemplo de más de 12 residuos de aminoácidos de longitud) seleccionadas por ejemplo de cualquiera de los materiales antigénicos u otras proteínas y péptidos mencionados más adelante. Además de los polipéptidos de fusión y los productos de acoplamiento, la invención proporciona los híbridos de acoplamiento que comprenden VP22 acoplado a un ADN que puede por ejemplo comprender elementos reguladores adecuados, conocidos, de modo que éste puede ser transcrito y traducido, y que contiene una estructura abierta de lectura que codifica para cualquiera de las proteínas mencionadas más adelante. Acoplamiento con antígenos: VP22 puede ser útilmente acoplado con los ejemplos de antígenos microbianos y virales y de antígenos tumorales, tales como aquellos mencionados más adelante.

El tratamiento con productos de acoplamiento de VP22 que involucran antígenos patógenos como se proporciona por la presente, puede evocar la respuesta inmune útil contra los patógenos correspondientes. Los ejemplos de tales antígenos son las proteínas Ll y L2 del virus del papiloma, las proteínas de HIV, gag, pol, env y nef, antígenos de clamidia (tales como la Proteína de Membrana Exterior Mayor MOMP de Clamidia) y proteínas de choque térmico de clamidia. VP22 puede también ser útilmente acoplado con antígenos provenientes de micobacterias tales como el antígeno proveniente de Mycobacterium tuberculosis . Alternativamente, el antigeno puede ser un antígeno asociado al tumor, con lo cual la actividad antitumoral de los CTL asociados con la disminución de las células tumorales, es aumentada. Se ha encontrado que las citocinas específicas tales como el factor alfa de necrosis tumoral, el interferón gamma, la interleucina-2 , la interleucina-4 y la interleucina-7 son particularmente útiles en este contexto. Los antígenos asociados al tumor y su papel en la inmunobiología de ciertos cánceres, se discute por ejemplo por P van der Bruggen y colaboradores, Current Opinión in Immunology, 4(5) (1992) 608-612. Los ejemplos particulares de tales antígenos que son considerados para el uso en el contexto de la presente aplicación son los antígenos E6 y E7 del papilomavirus humano (especialmente por ejemplo de los tipos 6, 11, 16, 18, etc.); las proteínas derivadas del virus Epstein-Barr, por ejemplo aquellas identificadas en las referencias 24 y 25 en P van der Bruggen y colaboradores, citado anteriormente: los antígenos de la serie MAGE como se identifican en T. Boon, Adv Cáncer Res 58 (1992) pp 177-210 y/o MZ2-E y otros antígenos como se identifican en P van der Bruggen y colaboradores Science 254 (1991) 1643-1647; las proteínas de melanoma, por ejemplo la tirosinasa humana; y mucinas tales aquellas identificadas en P.O. Livingston, en Current Opinión in Immunology 4(5) (1992) pp 624-629: por ejemplo MUC1 como se identifica en J Burchell y colaboradores Int J Cáncer 44 (1989) pp 691-696. VP22 puede también ser útilmente acoplado con proteínas virales tales como los antígenos glucoproteicos , por ejemplo provenientes de los herpesvirus, tales como gH o gD o gB del virus del herpes simple; o gp50 del virus de la seudorrabia, como un ejemplo de un antígeno de un patógeno veterinario, en este caso un virus veterinario. VP22 puede ser de este modo exitosamente acoplado con los antigenos conocidos de la técnica anterior, del tratamiento de tumores malignos, incluyendo los estudios que han puesto a la luz el potencial para vacunación terapéutica contra tumores, utilizando material autólogo derivado del propio tumor del paciente. La teoría detrás de este enfoque es que las células tumorales pueden expresar una o más proteínas u otras macromoléculas biológicas que son distintas de las células saludables normales, y las cuales pueden por lo tanto ser utilizadas para dirigir una respuesta inmune, para reconocer y destruir las células tumorales. Estos objetivos tumorales pueden estar presentes ubicuamente en tumores de un cierto tipo. Un buen ejemplo de esto es el cáncer cervical, donde la mayor parte de los tumores expresan las proteínas E6 y E7 de papilomavirus humano. En este caso el objetivo tumoral no es una proteína misma, y por lo tanto es claro su potencial como un marcador único específico del tumor, para la inmunoterapia contra el cáncer .

Existe una evidencia creciente de que ciertas autoproteínas pueden también ser utilizadas como antígenos objetivo tumorales. Esto está basado en la observación de que éstas son expresadas consistentemente en células tumorales, pero no en células saludables normales. Los ejemplos de éstas incluyen la familia MAGE de proteínas. Se espera que más autoproteínas útiles como objetivos tumorales sigan siendo identificadas. Los antígenos asociados al tumor y su papel en la inmunobiología de ciertos cánceres se discuten por ejemplo por P van ser Bruggen y colaboradores, en Current Opinión in Immunology, 4(5) (1992) 608-612. Otros de tales antígenos, de la serie MAGE, son identificados en T. Boon, Adv Cáncer Res 58 (1992) pp 177-210, y MZ2-E y otros antígenos relacionados al tumor son identificados en P. Van der Bruggen y colaboradores, Science 254 (1991) 1643-1647; las mucinas asociadas al tumor son mencionadas en PO Livingston, en Current Opinión in Immunology 4 (5) (1992) pp 624-629: por ejemplo MUC1 como se menciona en J Burchell y colaboradores Int J Cáncer 44 (1989) pp 691-696.

Acoplamiento con proteínas de inmunomodulación Las modalidades de la invención de uso en la modulación inmune incluyen por ejemplo las siguientes. VP22 puede ser acoplado útilmente con ejemplos de citocinas u otros compuestos inmunomoduladores como se menciona más adelante. De este modo, VP22 puede ser también útilmente acoplado con proteínas inmunomoduladoras, por ejemplo aquellas que mejoran la respuesta inmune, incluyendo la citocina, la interleucina-1 , interleucina-2 y el factor de estimulación de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) . Tales productos pueden por ejemplo ser utilizados en formas análogas a aquellas mencionadas por ejemplo en las Patentes Internacionales WO 96/26267 o WO 97/14808, para alterar, por ejemplo, para incrementar, una respuesta inmune específica para una tipo de célula objetivo, por ejemplo un tipo de célula tumoral, la cual ha sido expuesta al producto ya sea in vitro o in vivo. Como se utiliza en la presente, la expresión 'proteína ínmunomoduladora" y términos relacionados incluye una proteína o proteínas que aumentan o suprimen una respuesta inmune del huésped para un virus mutante o proteína codificada por éste, o para un antígeno tal como un inmunógeno proveniente de un patógeno o una fuente exógena al virus, o un antígeno asociado al tumor. Las proteínas de inmunomodulación no son normalmente aquellas proteínas actualmente utilizadas como inmunógenos (antígenos) por sí mismas. Una proteína inmunomoduladora puede ser un miembro natural de un sistema inmune de un animal humano o no humano, por ejemplo de un sistema inmune de mamífero, con una capacidad de enlace funcional para otro constituyente natural de tal sistema inmune. Alternativamente, una proteína inmunomoduladora puede ser una proteína codificada con un patógeno, el cual tiene una capacidad de enlace funcional para un constituyente natural de tal sistema inmune. Alternativamente, una proteína inmunomoduladora puede ser una proteína artificial, por ejemplo un fragmento de una proteína inmunomoduladora natural, o una muteína de tal proteína o fragmento, o una proteína de fusión que incorpora cualquiera de éstas. Muchas de las proteínas inmunomoduladoras, y materiales genéticos que las codifican, y sus secuencias nucleotídicas y de aminoácidos, son conocidos en la literatura de esta materia, y disponibles en las bases de datos de secuencias genéticas tales como la base de datos EMBL, y varias son comercialmente disponibles en la forma de material manipulado mediante ingeniería genética, para la clonación y otra manipulación. Las proteínas inmunomoduladoras acopladas con VP22 como se describe en la presente, pueden por ejemplo ser útilmente de secuencias nativas para la especie, la cual va a recibir tratamiento con estos productos de acoplamiento o con ADN, por ejemplo, en la forma de virus recombinantes, por ejemplo una proteína inmunomoduladora del tipo humano para el tratamiento de un sujeto humano. Los ejemplos de proteínas inmunomoduladoras conocidas, útiles en este contexto incluyen citocinas, quimiocinas, componentes del complemento moléculas accesorias y de adhesión del sistema inmune y sus receptores de especificidad humana o no humana. Los ejemplos útiles incluyen genes GM-CSF, IL-2, IL-12, linfotactina, CD40 y CD40L. Los ejemplos adicionales útiles incluyen interleucinas, por ejemplo interleucinas 1 a la 15, interferones alfa, beta o gamma, factor de necrosis tumoral, factor de estimulación de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), factor de estimulación de colonias de macrófagos (M-CSF) , factor de estimulación de colonias de granulocitos (G-CSF) , quimiocinas tales como la proteína de activación de neutrófilos (NAP) , el factor quimioatrayente y de activación de macrófagos (MCAF) , RANTES, los péptidos inflamatorios de macrófagos MIP-1 y MlP-lb, componentes del complemento y sus receptores, como una molécula accesoria tales como B7.1, B7.2, ICAM-1, 2 ó 3 y receptores de citocinas. OX40 y el ligando OX40 (0X40L) (gp34) (ver por ejemplo WO 95/12673, WO 95/21251 y WO 21915) son ejemplos útiles adicionales de proteínas inmunomoduladoras. Las proteínas inmunomoduladoras pueden ser para varios fines, de especificidad animal humana o no humana, y pueden ser representadas para los presentes fines, como el caso pueda ser y como pueda ser conveniente, por dominios extracelulares y otros fragmentos con la actividad de enlace de las proteínas de origen natural, y las muteínas de las mismas, y sus proteínas de fusión con otras secuencias polipeptídicas, por ejemplo, con los dominios constantes de cadena pesada de inmunoglobulina. Donde las secuencias nucleotídicas que codifican para más de una proteína inmunomoduladora son insertadas, éstas pueden comprender por ejemplo más de una citocina o una combinación de citocinas y la o las moléculas accesorias/de adhesión. La respuesta inmune provocada por el uso de tales productos de acoplamiento a VP22 o por los vectores que los codifican, pueden incluir respuestas inmunes de una variedad de tipos, por ejemplo una respuesta contra una proteína viralmente codificada, y/o una respuesta contra un antígeno huésped, que es una respuesta estimulada por un vector viral o por la expresión de un gen heterólogo codificado por éste, por ejemplo, el producto de acoplamiento con VP22. Entre los usos de los vectores virales mutantes como se describe en la presente, está por ejemplo el proteger a un sujeto de una especie susceptible, contra la infección por un virus correspondiente de tipo silvestre cuando el sujeto es tratado con éste, por ejemplo, infectado con éste, por ejemplo mediante inmunización directa. Una proteína inmunomoduladora a ser acoplada con VP22 puede por sí misma ser una proteína híbrida o de fusión, la cual comprenda una región polipeptídica que tenga homología para y funcionalidad de una proteína inmunomoduladora, ligada a una región polipeptídica gue tenga otra homología y opcionalmente otra funcionalidad. Por ejemplo, la proteína inmunomoduladora puede ser, comprender, o corresponder en funcionalidad a la proteína gp34 identificada como un socio de enlace al Ox-40 humano (ver W Godfrey y colaboradores J Exp Med 180(2) 1994 pp 757-762, y referencias citadas en ésta, incluyendo S Miura y colaboradores Mol Cell Biol 11(3) 1991, pp 1313-1325) . La versión de esta funcionalidad de proteína que puede ser codificada en el genoma viral mutante puede corresponder a la secuencia gp34 natural misma, o a un fragmento de la misma, o a un producto de expresión híbrido, por ejemplo, basado en el dominio (de enlace) extracelular (C-terminal) de gp34 fusionado a otra proteína, por ejemplo a la región constante de una cadena pesada de inmnoglubulina, tal como IgGl, por ejemplo con el dominio extracelular de gp34 (una proteína membranal tipo 2) fusionada en su extremo N al extremo C del dominio constante de la inmnoglobulina . Otras de las proteínas inmunomoduladoras pueden también ser llevadas y expresadas en tales formas derivadas e híbridas, incluyendo las formas mutadas como se menciona en la presente. En ciertos ejemplos la proteína inmunomoduladora puede comprender una citocina, preferentemente el factor de estimulación de colonias de macrófagos y granulocitos (GM-CSF), por ejemplo GM-CSF murino o preferente humano. Los gene-s GM-CSF murinos y humanos son ambos conocidos: el gen de GM-CSF murino codifica para un polipéptido de 141 aminoácidos, teniendo la glucoproteína madura secretada un peso molecular de entre 14k y 30 kdaltones, dependiendo del grado de glucosilación. GM-CSF genéricamente es un miembro de la familia del factor de crecimiento hematopoyético y fue primeramente definido e identificado por su habilidad para estimular la formación de colonias in vitro en progenitores hematopoyéticos. GM-CSF es un potente activador de los neutrófilos, eosinófilos y de la función de los macrófagos-monocitos, el mejoramiento de la migración, la fagocitosis, la expresión del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) , y el inicio de una cascada de moléculas bioactivas las cuales estimulan además el sistema inmune. GM-CSF está siendo actualmente evaluado clínicamente para el tratamiento de la neutropenia después de la quimioterapia, y como un adyuvante en terapia contra el cáncer. La secuencia nucleotídica heteróloga empleada puede comprender un gen heterólogo, un fragmento génico o una combinación de genes con la condición de que codifique para una proteína inmunomoduladora como se define anteriormente. De acuerdo a los ejemplos de la invención, las combinaciones de dos o más proteínas inmunomoduladoras pueden ser utilizadas para los fines descritos en la presente. En los ejemplos particulares, dados para ilustración únicamente y no como limitación, pueden ser utilizadas combinaciones que involucran IL2, GMCSF, linfotactina y/o CD40L, uno con el otro, o con otras de las proteínas inmunomoduladoras citadas anteriormente. Cada una de las otras combinaciones binarias de las proteínas inmunomoduladoras mencionadas anteriormente, son también dadas por, y dentro del alcance de, esta descripción.

Otros productos de acoplamiento: En ciertas - modalidades la invención puede ser útil en aplicaciones de terapia con genes: de este modo, por ejemplo, VP22 puede también ser útilmente acoplado con ejemplos de genes utilizados o propuestos para ser utilizados en terapia génica, incluyendo: el gen para la adenosina-desaminasa humana (ADA), como se mencionó por ejemplo en WO 92/10564 (KW Culver y colaboradores: US Secretary for Commerce & Célico Inc) , WO 89/12109 y EP 0 420 911 (1H Pastan y colaboradores) : el gen de la fibrosis quística y variantes descritas en WO 91/02796 (L-C Tsui y colaboradores: HSC Research & University of Michigan), en WO 92/025273 ( FS Collins & JM Wilson: University of Michigan y en WO 94/12649 (RJ Gregory y colaboradores: Genzyme Corp) . VP22 puede también ser útilmente acoplado con las proteínas reguladoras transcripcionales , conocidas tales como NF-AT, la cual se llega a activar mediante traslocación al núcleo e induce la transcripción de la interleucina, por ejemplo de IL-1. El acoplamiento con VP22 puede ser utilizado aquí para evitar la retención del producto acoplado en el citoplasma . La invención también incluye las proteínas acopladas y de fusión en las cuales se proporciona una secuencia ligadora que hace posible que la proteína de fusión sea dividida intracelularmente para hacer posible la separación de la parte antigénica, tal como aquella mencionada anteriormente, de la parte de la proteína de transporte. Una secuencia inductora de la escisión puede comprender por ejemplo la subsecuencia de aminoácidos RVCSNPPCETHETGTTNTATATSN u otras secuencias de escisión indicadas por ejemplo en AC Wilson y colaboradores en Genes and Development 9 (1995) 2445-2458. También proporcionados por la presente invención están los procesos para el tratamiento de las células con productos de acoplamiento como se describen en la presente, . para producir efectos inmunogénicos, inmunomoduladores, citotóxicos/letales o terapéuticos. Los ejemplos de materiales y procesos como se describen en la presente, son útiles en la modulación de la actividad celular, por ejemplo, con el objetivo y efecto de producir o alterar respuestas inmunes, por ejemplo para la profilaxis o terapia de la enfermedad, por ejemplo la producción de respuestas inmunes contra patógenos o tumores. Otros usos para algunos de los materiales y procesos de la presente incluyen la regulación de la expresión del gen en células, por ejemplo, para fines de terapia génica correctiva y/o para reducir o controlar el desarrollo de las células tumorales y la actividad de las mismas. Los tratamientos celulares de acuerdo a la invención pueden ser in vitro, ex vivo o in vivo . Entre los derivados del VP22 que pueden ser utilizados de acuerdo a los aspectos de la invención como substancias activas de transporte y para el acoplamiento con materiales que van a ser transportados, para los fines descritos más adelante en la presente, están los péptidos que comprenden una secuencia funcional activa de transporte proveniente de la sección C-terminal de VP22. Los ejemplos no limitantes de los métodos de tratamiento que utilizan los materiales descritos en la presente, comprenden el tratamiento de las células presentadas de antígeno o preparaciones celulares que las contienen, con una fusión de VP22 y un antígeno, por ejemplo, uno de aquellos antígenos mencionados anteriormente (o con un vector, por ejemplo un vector viral, que codifica para tal fusión) , para procurar el procesamiento del antígeno y la presentación por la ruta MHCl para producir una respuesta de CTL al antígeno. Los métodos proporcionados así incluyen el aprestamiento y la expansión de células T y la inmunoterapia adoptiva utilizando los materiales así obtenidos, de una manera de otro modo análoga al aprestamiento conocido, a la expansión y los métodos de inmunoterapia adoptiva. Un número de sistemas vectores tales como la infección retroviral o adenoviral o la inyección de complejos proteína-liposoma, así como los sistemas de vector herpesviral, pueden ser fácilmente adaptados para formar los ejemplos de esta invención. Por ejemplo, el ADN desnudo para una fusión VP22-proteína con una proteína de uno de los tipos mencionados en la presente, puede ser inyectado dentro de un tejido que va a ser tratado, de acuerdo a la naturaleza y al propósito de la proteína que va a ser administrada. Pueden ser utilizados virus recombinantes, como se mencionó, que codifican y hacen posible el expresar las proteínas de fusión VP22. Un vector viral recombinante que posee tal fusión puede ser defectuoso, de no replicación o de replicación restringida, de modo que la replicación sea dependiente de las condiciones que prevalecen en el tejido objetivo o en la célula objetivo, pero no en las células normales o no objetivo. Los vectores y proteínas de fusión de los ejemplos de la invención pueden ser útiles en terapia génica, y para tratar o proteger contra la proliferación anormal de células, especialmente células cancerosas pero también psoriasis ateroesclerosis y restenosis arterial, y para inducir la apoptosis por ejemplo de los linfocitos proliferantes, por ejemplo para inducir tolerancia, por ejemplo para prevenir el rechazo al trasplante o para el tratamiento de enfermedades autoinmunes, tales como el lupus eritematoso sistémico o la artritis reumatoide. Además de las aplicaciones terapéuticas médicas, el efecto mostrado en la presente puede también ser explotado por ensayos, proporcionados por la invención, los cuales confían en interacciones substrato-enzima o la interacción de proteínas expresadas en diferentes poblaciones celulares. Una modalidad de la invención es además descrita, sin pretender limitar la invención, con referencia a los dibujos anexos y a los materiales y métodos descritos más adelante: En los dibujos anexos: — La figura 1 ilustra que: Las células cos-1 pseudotransfectadas fueron marcadas mediante inmunofluorescencia indirecta con anticuerpos para VP22 (Figura la), p53 (Figura le) y el epítope de CMV (Figura Id) para establecer los niveles de marcador antecedente. Las células transíectadas con pc49epB (Figura lb) y marcadas para VP22 demuestran un patrón citoplásmico VP22 típico con difusión clara hacia los núcleos de las células adyacentes. Las células transfectadas con la construcción p4953ep+10 de la proteína de fusión VP22-p53 se marcaron para VP22 y p53 (Figuras le y lf ) o VP22 y epítope (Figuras lg y lh) ; la proteína de fusión puede ser detectada en los núcleos de las células adyacentes a las células de expresión primaria .

— La Figura 2 es un mapa plasmídico para ilustrar p4953ep+10, que codifica para una proteína de fusión que comprende las secuencias VP22, p53 y un marcador epítope.

— La Figura 3 ilustra que Los estados proteicos provenientes de las células cos-1 transfectadas con una gama de construcciones plasmídicas, fueron analizados mediante manchado de western. El panel mostrado a la extrema izquierda ha sido sondeado con un anticuerpo contra VP22 y demuestra que los plásmidos pUL49epB y pc49epB que codifican para VP22 solo, generan una proteína de 38 kDa, la proteína de fusión VP22-p53 expresada a partir de p4953ep+10 produce una proteína de aproximadamente 90 kDa con muy poca degradación. El panel mostrado a la extrema derecha ha sido sondeado con un anticuerpo contra p53 y demuestra que las células transfectadas con los plásmidos que codifican ya sea para p53 solo (pcB6+p53) o la construcción de la proteína de fusión p4953ep+10, producen la proteína p53 a 53 kDa. La construcción de p4953ep+10 también sintetiza la proteína de fusión VP22-p53 a 90 kDa, el p53 en esta muestra puede ser un producto de degradación o más probablemente p53 endógenamente inducido.

Materiales y Métodos Cultivo celular y transfección Las células cos-1 fueron desarrolladas en MEM modificada con Dulbecco, suplementado por 10% de suero de ternera neonata, a 37°C con 5% de C02. Se realizaron transfecciones utilizando el método de BES/CaCl2 (Elliott y O'Hare, 1997) con 200 ng de plásmido de prueba con 1800 ng de pUB19. Las transfecciones se dejaron proceder por 48 horas, punto en el cual las monocapas fueron cosechadas para inmunofluorescencia o análisis de manchado de western .

Inmunofluorescencia y anticuerpos Las monocapas celulares sobre cubreobjetos fueron fijadas con metanol al 100% por 15 minutos a temperatura ambiente y se marcaron como se describe en Elliott y O'Hare (1997) . Todos los anticuerpos fueron diluidos en PBS + 10% de suero. VP22 se detectó utilizando un anticuerpo policlonal de conejo AGV30 (1:500), p53 se detectó utilizando un anticuerpo monoclonal de ratón, DO-1 (Santa Cruz Ltd) , el epítope CMV fue detectado utilizando un anticuerpo monoclonal de ratón, CMV LNA (Capricorn Ltd) . Las imágenes fueron obtenidas utilizando un microscopio confocal Bio-Rad MRC600.

Construcciones de Plásmido La construcción de la proteína de fusión VP22-p53 fue generada mediante la clonación de un fragmento de PCR para p53, de longitud completa, C- terminal a VP22 en un sitio Bam único, manteniendo VP22 y el epítope CMV en la estructura.

Análisis de manchado de western Los manchados de western se sondearon con anti-VP22 (1:10,000), anti-p53 (1:1000) .

Se construyó una proteína de fusión VP22-p53 dentro de la estructura, de longitud completa, marcada con epítope, (Figura 2) . Este vector genera una proteína de fusión de aproximadamente 90 kDa cuando se expresa en células Cos-1, con muy poca degradación de proteína como se juzga mediante el análisis de manchado de western (Figura 3) . Cuando se probó para la distribución por tráfico intercelular, la proteína de fusión parece funcionar exactamente como VP22 solo. Ésta se localiza en el citoplasma de células transfectadas primarias como se muestra por la inmunofluorescencia utilizando las monocapas de células Cos-1 fijadas con metanol, marcadas con anticuerpos anti-VP22 (Figuras le y Ig), -p53 (Figura lf) o epítope (Figura lh) y es capaz de moverse muy eficientemente hacia los núcleos de las células vecinas. La eficiencia relativa del transporte no ha sido empíricamente determinado, pero parece solo significativamente menor que VP22 solo. En experimentos adicionales, se transfectaron células de osteosarcoma negativas a p53 (utilizando la técnica de fosfato de calcio) con el ADN desnudo que codifica expresablemente ya sea (a) VP22 de tipo silvestre, (b) p53 de tipo silvestre o (c) la proteína de fusión VP22-p53 descrita anteriormente. Las células transfectadas (b) y (c) mostraron habilidad para sufrir apoptosis, de manera contraria a las células control (a), indicando que la proteína de fusión VP22-p53 conserva la funcionalidad de p53. En las variantes del ejemplo dado aquí, las construcciones de supresión VP22 con el tamaño de la proteína de fusión disminuido pueden ser elaboradas si se desea, por ejemplo para mejorar la velocidad o grado de transporte, y sin pérdida de la función proteica . En variantes adicionales, puede ser variado el orden de los componentes de la fusión, por ejemplo las secuencias p53 y VP22 pueden ser fácilmente incluidas en el orden opuesto al orden involucrado en el plásmido mostrado en la Figura 2, con resultados satisfactorios.

La presente descripción se extiende a las modificaciones y variaciones de la descripción dada en la presente, inclusive de las reivindicaciones anexas que serán aparentes para el lector experto en la técnica. La descripción de la presente, que incorpora WO 97/05265 y de Elliott y O'Hare (1997) que son hechas una parte integral de la presente, se pretende que se extienda en particular a las clases y subclases de los productos y en general a las combinaciones y subcombinaciones de las características mencionadas, descritas y referidas en la descripción. Los documentos citados en la presente, incluyendo las referencias siguientes, se incorporan por referencia en la presente, en su totalidad, para todos los fines.

Referencias adicionales Diller, L., Kassel, J. Nelson, C.E., Cryka, M.A., Litwak, G., Gebhardt, M. Bressac, B., Oztuk, M., Baker, S.J., Vogelstein, B. y S.H. Friend, (1990) p53 functions as a cell cycle control protein in osteosarcomas, Mol. Cell. Bio. 10:5772-5781.

Elliott G. y P. O'Hare (1997) Intercellular and protein delivery by a herpesvirus structural protein. Cell 88:223233. Ensoli, B., Buonaguro, L., Barillari, G., Fiorelli, V., Gendelman, R., Morgan, R.A. Wilfgield, P. Y R.C. Gallo (1993) Reléase, uptake and effects of extracellular human immunodeficiency virus Tat protein on cell growth and viral transactivation, J. Virol. 67:277-287. Fawell, S., Seery, J., Daikh, Y., Moore. C, Chen, L.L., Pepinsky, B. and J. Barsoum. (1994) Tat-mediated delivery of heterologous proteins into cells, Proc. Nati. Acad. Sci. 91:664-668. Hamada, K., Alemany, R., Zhang, W-W, Hittelman, W.N., Lotan, R., Roth, J.A. and M.F.

Mitchell. (1996) Adenovirus- ediated transfer of a wild-type p53 gene and induction of apoptosis in cervical cáncer. Cáncer Research 56:3047-3054. Jackson, A., Friedman, S., Zhan, X., Engleka, K.A., Forough R. and T. Maciag. (1992) Heat shock induces the reléase of fibroblast growth factor 1 from NIH3T3 ,cells. Proc. Nati. Acad. Sci. 89:10691- 10695. Kumar, X, M., Srinivas, S., Detolla, E. J., Yu S.F., Stass, S.A. and A. J. Mixson. (1997) Parenteral gene therapy with p53 inhibits human breast cáncer tumors in vivo through a bystander effect without evidence of toxicity. Hum Gene Therapy 8 : 177-185. Levine, A.J., (1997) p53, the cellular gatekeeper for growth and división. Cell 88:323-331. Nielsen, L.L., Dell, J., Maxwell, E., Armstrong, L., Maneval, D. and J.J. Catino. (1997) Efficacy of p53 adenovirus-mediated gene Therapy against human breast cáncer xenograts. Cáncer Gene Therapy 4:129-138. Sandig, V., Brand, K, Hewig, S., Lukas J., Bartek, J. and M. Strauss. (1997) Adenoviral transfected pl6 and p53 genes cooperate to induce apoptotic tumor cell death. Nature Med. 3:313-319. Zheng, P.S., Iwasaka, T., Ouchida, M., Fukuda, K., Yokoyama, M. and H. Sugimori . (1996) Growth suppression of a cervical cáncer cell line (TMCC-1) by the human wild type p53 gene. Gynecol Oncol. 60:245-250.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:

Claims (23)

REIVINDICACIONES

1. Los péptidos acoplados y los polipéptidos de fusión s caracterizados porque comprenden (i) una secuencia de aminoácidos con la función de transporte de la proteína VP22 herpesviral y (ii) otra secuencia proteica seleccionada de (a) proteínas para el control del ciclo celular; (b) proteínas suicidas (proteínas que son condicionalmente citotóxicas o letales después de la administración, a una célula que las contiene, de un profármaco correspondiente o compuesto activador); (c) secuencias antigénicas o proteínas antigénicas (por ejemplo, de más de 12 residuos de aminoácidos de longitud) provenientes de antígenos microbianos y virales y antígenos tumorales; (d) proteínas de inmunomodulación; y (e) proteínas terapéuticas.

2. Un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la otra secuencia de proteína es proveniente de una proteína para el control del ciclo celular en mamíferos (por ejemplo, humanos).

3. Un polipéptido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la otra secuencia proteica es proveniente de una proteína de mamífero (por ejemplo humano) para incrementar o inducir la apoptosis celular o para conferir a una célula la habilidad para sufrir apoptosis.

4. Un polipéptido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la otra secuencia proteica es proveniente de una proteína de mamífero (por ejemplo humano) para el control del ciclo celular seleccionada de la proteína p53, los inhibidores de cinasa dependientes de la ciclina, y proteínas de las familias bcl2 y bax.

5. Un polipéptido de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque es un polipéptido de fusión y comprende una secuencia proveniente de una proteína p53.

6. Un polipéptido de fusión de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque comprende sustancialmente una secuencia de VP22 de longitud completa y sustancialmente una secuencia p53 de longitud completa.

7. Un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la otra secuencia proteica es proveniente de una proteína suicida .

8. Un polipéptido de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque dicha proteína suicida se selecciona de timidina-cinasa y nitrorreductasa .

9. Un polipéptido de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque comprende sustancialmente la secuencia de VP22 de longitud completa .

10. Un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porgue es un polipéptido de fusión y comprende una secuencia ligadora inductora de escisión, localizada entre la secuencia VP22 y la otra secuencia proteica.

11. Un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una subsecuencia de HSV VP22 comenzando desde aproximadamente el aminoácido 159 y extendiéndose hasta aproximadamente el aminoácido 301, y que tiene (con relación a la secuencia VP22 completa) al menos una supresión de al menos parte de la secuencia VP22 que se extiende por ejemplo desde el extremo N hacia la secuencia de aproximadamente los aminoácidos 1-158.

12. Un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una secuencia correspondiente a los aminoácidos 60-301 ó 159-301 de la secuencia HSV VP22 de longitud completa .

13. Un polinucleótido gue codifica para un polipéptido de fusión que comprende una secuencia de aminoácidos con la función de transporte de la proteína VP22 herpesviral y una secuencia proveniente de otra proteína, caracterizada porque se selecciona de (a) secuencias antigénicas o proteínas antigénicas provenientes de antígenos microbianos y virales y antígenos tumorales; (b) proteínas inmunomoduladoras; (c) proteínas que son condicionalmente citotóxicas o letales después de la administración (a una célula que las contiene) de un fármaco correspondiente o compuesto activador; (d) proteínas para el control del ciclo celular; (e) proteínas terapéuticas; y (f) proteínas de diagnóstico.

14. Un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la secuencia proveniente de otra proteína tiene la función reguladora del ciclo celular en humano/mamífero de la proteína p53.

15. Un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque está comprendido en una estructura de lectura abierta que está operablemente enlazada a una secuencia promotora .

16. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 15.

17. Un vector de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque comprende un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 15 portado en un plásmido.

18. Un vector de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque comprende un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 15 portado en un vector viral o en un vector de transfección no viral.

19. Un método para inhibir la división celular, caracterizado porque comprende el exponer una célula que comprende p53 activa/libre insuficiente, para detener su ciclo celular, para ponerse en contacto con un polipéptido de fusión de conformidad con la reivindicación 5.

20. Un método para inhibir la división de las células tumorales, caracterizado porque comprende el exponer una célula tumoral presente en una masa celular tumoral, la célula tumoral comprende p53 activa/libre insuficiente para detener su ciclo celular, para ponerse en contacto con un vector de conformidad con la reivindicación 9 que codifica para un polipéptido de fusión de conformidad con la reivindicación 2, con lo cual se provoca que la célula exprese un polipéptido de fusión de conformidad con la reivindicación 2 y para exponer otras células de la masa celular tumoral al contacto con un polipéptído de fusión de conformidad con la reivindicación 2.

21. Una célula huésped de mamífero o microbiana, caracterizada porque comprende un vector de conformidad con la reivindicación 16 u otro polinucleótido de conformidad con la reivindicación 15.

22. Un método para el transporte de un polipéptido de fusión de conformidad con la reivindicación 1 a una población objetivo de células, caracterizado porque comprende: el introducir un polinucleótido u otro vector que codifica para el polipéptido de fusión dentro de una primera parte de la población objetivo de células, por ejemplo mediante transfección o microinyección; con lo cual se expresa el polinucleótido de codificación para producir el polipéptido de fusión, con lo cual se provoca que el polipéptido de fusión sea exportado desde la primera parte de la población objetivo, y provoque que éste sea recogido por una segunda parte de la población objetivo de células, que no producen directamente el polipéptido de fusión.

23. Un método para el transporte de un polipéptido acoplado o un polipéptido de fusión de conformidad con la reivindicación 1, dentro de una población de células objetivo, caracterizado el método porque comprende el exponer directamente las células a una preparación del polipéptido, para provocar que las células objetivo lo recojan.