MXPA99005780A - Composiciones de proteina de fusión ob y métodos para su preparación - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a composiciones de proteína de fusión Fc-OB, métodos de preparación de tales composiciones y uso de las mismas. En particular, la presente invención se relaciona con una proteína de fusión genética o química que comprende la región de inmunoglobulina Fc, un derivado o análogo fusionado a la porción N terminal de la proteína OB, un derivado o análogo.

Description

COMPOSICIONES DE PROTEICA DE FUSIÓN OB Y MÉTODOS PARA SU PREPARACIÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con composiciones de proteína de fusión Fc-OB y métodos para preparación y uso de las mismas.

ANTECEDENTES Aunque se desconoce en gran medida la base molecular para la obesidad, la identificación del "gen OB" y la proteína codificada ("proteína OB" o "leptina") ha proporcionado cierta claridad respecto a los mecanismos que utiliza el cuerpo para regular la deposición de grasa corporal. Véase, publicación PCT, WO 96/05309 (12/22/96), Friedman et al.; Zhang et al., Nature 372: 425-432 (1994) ; véase también, the Correction at Nature 374 : 479 (1995) . La proteína OB es activa in vivo tanto en ratones mutantes Ob/Ob (ratones obesos debido a un defecto en la producción del producto del gen OB) así como en ratones de tipo silvestre normales. La actividad biológica se manifiesta en si misma en, entre otras cosas, pérdida de peso. Véase de manera general, Barrinaga, "Obese" Protein Slims Mice, Science 269: 475-456 (1995) . La proteína OB, los derivados y uso de los mismos como moduladores para el control de peso y REF.: 30477 adiposidad de animales, incluyendo a mamíferos y humanos, se ha descrito con mayor detalle en la publicación PCT WO 96/05309 (12/22/96) , incorporada en la presente como referencia, incluyendo las figuras. Los otros efectos biológicos de la proteína OB no han sido bien caracterizados. Se sabe, por ejemplo, que en el ratón mutante ob/ob, la administración de proteína OB resulta en una disminución en las concentraciones séricas de insulina, y en las concentraciones séricas de glucosa. También se sabe que la administración de proteína OBV resulta en una disminución en la grasa corporal . Esto se observa tanto en ratones mutantes ob/ob, así como en ratones normales no obesos. Pelleymounter et al., Science 269 : 540-543 (1995); Halaas et al., Science 269: 543-546 (1995). Véase también, Campifield et al., Science 269 : 546-549 (1995) (la administración periférica y central de dosis de microgramos de proteínas OB reduce la ingestión de alimento y el peso corporal de ratones ob/ob obesos inducidos por dieta, pero no en ratones obesos db/db) . En ninguno de estos reportes se ha observado toxicidad, incluso las dosis más elevadas. Pese a lo promisorio de la aplicación clínica de la proteína OB, no se ha dilucidado claramente el modo de acción de la proteína OB in vivo. La información respecto al receptor OB, que muestra alta afinidad de unión de la proteína OB detectada en el hipotálamo de rata, lo cual indica la posición del receptor OB. Stephens et al., Nature 377: 530-532. El ratón db/db muestra el fenotipo idéntico al del ratón ob/ob, es decir, obesidad extrema y diabetes tipo II; se considera que este fenotipo se debe a un receptor ob defectuoso, particularmente puesto que los ratones db/db no responden a la administración de proteína OB . Véase Stephens et al., supra . Con los avances en la tecnologías de ADN recombinante, la disponibilidad de proteínas recombinantes para uso terapéutico ha generado avances en la formulación de proteínas y su modificación química. Un objetivo de tal modificación es la protección de proteínas y degradación disminuida. Las proteínas de fusión y las uniones químicas pueden bloquear efectivamente una enzima proteolítica impidiendo el contacto físico con la estructura principal proteínica misma, y por lo tanto evitan la degradación. Las ventajas adicionales incluyen, bajo ciertas circunstancias, incremento en la estabilidad, tiempo de circulación y la actividad biológica de la proteína terapéutica. Un artículo de revisión describe la modificación de proteína y proteínas de fusión es Francis, Focus on Growth Factors 3:4-10 (mayo 1992) (publicado por Mediscript , Mountview Court, Friern Barnet Lañe, Londres N20, OLD, UK) ) . Una de tales modificaciones es el uso de la región Fc de inmunoglobulinas. Los anticuerpos comprenden dos partes funcionalmente independientes, un dominio variable conocido como "Fab", el cual se une a antígeno, y un dominio constante, conocido como "Fc" el cual proporciona el enlace con las funciones efectoras tales como complemento o células fagocíticas. La porción Fc de una inmunoglobulina tiene una vida media plasmática prolongada, mientras Fab tiene una vida corta. Capón, et al., Nature 337: 525-531 (1989). Se han construido productos proteínicos terapéuticos utilizando el dominio Fc para proporcionar una vida media más prolongada o para incorporar funciones tales como unión a receptor Fc, unión a proteína A, fijación de complemento y transferencia placentaria, todas las cuales se encuentran en las proteínas Fc de inmunoglobulinas. Id. Por ejemplo, la región Fc del anticuerpo IgGl se ha fusionado al extremo N terminal de CD30-L, una molécula la cual se une a receptores CD30 expresados en células tumorales de enfermedad de Hodkin, células linfoma anaplástico, células de leucemia de célula T y otros tipos de células malignas. Véase, la patente de los Estados Unidos Número 5,480,981. IL-10 es un agente antiinflamatorio y contra rechazos que se ha fusionado a Fc?2a de ratón con el fin de incrementar la vida media en circulación breve de citocinas. Zheng, X. et al., The Journal of Immunology, 154 : 5590-5600 (1995) . Los estudios también han evaluado el uso de el receptor de factor de necrosis tumoral unido con la proteína Fc de IgGl humana para tratar pacientes con choque séptico. Fisher, C. et al.,N. Engl. J. Med., 334 : 1697-1702 (1996); Van Zee, K. et al., The Journal of Immunology, 156: 2221-2230 (1996) . También se ha fusionado Fc con el receptor CD4 para producir una proteína terapéutica para tratamiento de SIDA. Véase, Capón et al., Nature, 337:525-531 (1989) . Además, se ha fusionado la parte N terminal de interleucina 2 a la porción Fc de IgGl o IgG3 para prolongar la vida media breve de interleucina 2 y su toxicidad sistémica. Véase Harvill et al., Immunotechnology, 1: 95-105 (1995). Debido a la identificación de la proteína OB como una proteína terapéutica promisoria, existe la necesidad de desarrollo de composiciones análogas de OB para aplicación clínica junto con o en lugar de la administración de la proteína OB. Tal desarrollo incluiría posiciones análogas de OB en donde las formulaciones de proteína y las modificaciones químicas obtenidas disminuyen la degradación de proteína, presentan estabilidad aumentada y tiempo de circulación. La presente invención proporciona tales composiciones.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con composiciones de proteína de fusión Fc-OB, con métodos de preparación de tales composiciones y con uso de las mismas. En particular, la presente invención se relaciona con una proteína de fusión genética que comprende la región Fc o análogos de inmunoglobulina fusionadas a la porción N terminal de la proteína OB o de análogos. La proteína de fusión Fc-OB es capaz de dimerizar vía residuos cisteína de la porción Fc. Inesperadamente, la modificación por fusión genética con Fc en la parte N terminal de la proteína OB presenta ventajas en estabilidad, velocidad de aclaramiento y degradación disminuida las cuales no se observan en la proteína OB con fusión de Fc a la parte C terminal de la proteína OB. De manera sorprendente e importante, las modificaciones en la parte N terminal proporcionan una protección inesperada a la proteína contra la degradación, incrementa el tiempo de circulación y la estabilidad cuando se compara con la proteína OB o la modificación Fc a la parte C terminal de la proteína OB. Tales ventajas inesperadas a partir de la modificación Fc a la proteína OB serían ventajosas para consumidores de proteína OB, en la medida en que estos cambios contribuyen a que se necesiten dosis más bajas o se necesita una dosificación menos frecuente. Por lo tanto, como se describe a continuación con mayor detalle, la presente invención tiene numerosos aspectos relacionados con la modificación genética de proteínas vía la fusión de la región Fc a la proteína OB (o análogos de la misma) , así como a modificaciones específicas, preparaciones y métodos de uso de la misma. En consecuencia, en un aspecto, la presente invención proporciona una proteína de fusión Fc-OB en donde Fc se fusiona genéticamente a la parte N terminal de la proteína OB (o análogos de la misma) . Además, la porción Fc también se puede unir a la parte N terminal de la proteína OB (o análogos de la misma) por medio de enlazadores peptídicos o químicos, como se conocen en la técnica. Como se ha indicado antes y como se ha descrito con mayor detalle en lo siguiente, la proteína de fusión Fc-OB tiene protecciones inesperadas con respecto a la degradación y un tiempo de circulación y estabilidad aumentados cuando se compara con la proteína OB o con proteínas de fusión OB-Fc en la parte C terminal. Por lo tanto, los aspectos adicionales de la presente invención incluyen no solo las composiciones de proteína de fusión Fc-OB, sino también las secuencias de ADN que codifican para tales proteínas, vectores relacionados y células huésped que contienen ambos vectores, ambos útiles para producir proteínas de fusión de lá "presente invención. En un segundo aspecto, la presente invención proporciona la preparación de proteínas de fusión FC-OB. Tales métodos incluyen técnicas de ADN recombinante para preparación de proteínas recombinantes. Además, tales aspectos incluyen métodos de fermentación y purificación también. En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para tratar el exceso de peso en un individuo o en animales, que incluye la modulación y/o la deposición de grasa mediante la administración de proteínas de fusión Fc-OB. Debido a las características de la proteína de fusión Fc-OB, se contemplan métodos los cuales reducen la cantidad y/o frecuencia de dosificación en la proteína OB al utilizar un agente reductor de peso Fc-OB. En otro aspecto adicional, la presente invención proporciona terapias para el tratamiento de comorbilidades asociadas con exceso de grasa, tales como diabetes, dislipidemias o hiperlipidemias, esclerosis arterial, placas arteriales, reducción o prevención de formación de piedras en la vesícula, ataques y también incremento en la sensibilidad a insulina y/o un incremento en la masa de tejido magro. En otro aspecto, la presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas relacionadas de las proteínas Fc-OB, análogos y derivados de los mismos, para uso en las terapias anteriores.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1: Secuencia de ADN (cadena doble de metOB de ratón recombinante (SEC. DE IDENT. NO: 1 y 2) y secuencia de aminoácidos (SEC. DE IDENT. NO: 3) . Figura 2: Secuencia de ADN (cadena doble) análogo de metOB humano recombinante (SEC. DE IDENT. NO: 4 y 5) y secuencia de aminoácidos (SEC. DE I ENT. NO: 6) .

Figura 3 (A-C) : Secuencia de ADN (cadena doble) de metFc-OB humano recombinante (SEC. DE IDENT. NO: 7 y 8) y secuencia de aminoácidos (SEC. DE IDENT. NO: 9) . Figura 4 (A-C) : Secuencia de ADN (de cadena doble) pariente de metFc-OB humano recombinante (SEC. DE IDENT. NO: 10 y 11) y secuencia de aminoácidos (SEC. DE IDENT. NO: 12) . Figura 5 (A-C) : Secuencia de ADN (cadena doble) de variante de metFc-OB humano recombinante (SEC. DE IDENT. NO: 13 y 14) y secuencia de aminoácidos (SEC. DE IDENT. NO: 15) . Figura 6 (A-C) : Secuencia de ADN (cadena doble) de variante de metFc-OH humano recombinante (SEC. DE IDENT. NO: 16 y 17) y secuencia de aminoácidos (SEC. DE IDENT. NO: 18) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA La presente invención se relaciona con composiciones de proteína de fusión Fc-OB, métodos de preparación de tales composiciones y usos de las mismas. En particular, la presente invención se relaciona con la fusión genética o química de la región Fc de inmunoglobulinas a la porción N terminal de la proteína OB . Inesperadamente, la fusión de Fc en la parte N terminal de la proteína OB demuestra ventajas las cuales no se observan en la proteína OB o con la fusión de Fc en la parte C terminal de la proteína OB . Sorprendentemente, la proteína Fc-OB modificada en la parte N terminal proporciona protección inesperada a la proteína impidiendo la degradación, y aumentando el tiempo de circulación así como la estabilidad. En consecuencia, la proteína de fusión Fc-OB, y análogos o derivados de los mismos así como los métodos relacionados de uso y preparación, se describen con mayor detalle en lo siguiente .

COMPOSICIONES La secuencia Fc de la secuencia Fc-OB humana recombinante que se establece en la SEC. DE IDENT. NO: 9 (véase la figura 3) se puede seleccionar a partir de la cadena pesada IgG-1 de inmunoglobulina humana, véase Ellison, J.W. et al., Nucleic Acids Res. 10_: 4071-4079 (1982), o cualquier otra secuencia de Fc conocida en la técnica (por ejemplo otras clases de IgG que incluyen pero que no se limitan a IgG-2, IgG-3 e IgG-4, u otras inmunoglobulinas). Se pueden construir variantes, análogos o derivados de la porción Fc, por ejemplo, al realizar diversas sustituciones de residuos o secuencias. Los residuos cisteína se pueden suprimir o sustituir con otros aminácidos para evitar la formación de reticulaciones disulfuro de las secuencias Fc . En particular, el aminoácido en la posición 5 de la SEC. DE IDENT. NO: 9 es un residuo cisteína. La secuencia Fc-OB recombinante de la SEC. DE IDENT . NO: 9 es una proteína Fc-OB de 378 aminoácidos (sin incluir el residuo metionina) . El primer aminoácido en la secuencia para la proteína Fc-OB recombinante de la figura 3 se denomina con +1 con la metionina en la posición -1. Se puede retirar el residuo cisteína en la posición 5 o sustituirlo con uno o más aminoácidos. Se puede sustituir un residuo alanina por el residuo cisteína en la posición 6, lo que proporciona la secuencia de aminoácidos variante de la figura 4 (SEC. DE IDENT. NO: 12) . La proteína Fc-OB recombinante de la figura 4 es una proteína Fc-OB de 378 aminoácidos (sin incluir el residuo metionina) . La primera secuencia de aminoácidos para la proteína Fc-OB recombinante de la figura 4 se denomina como +1 con la metionina en la posición -1. De igual manera, la cisteína en la posición 5 de la SEC. DE IDENT. NO: 9 puede ser sustituida con una serina u otro residuo aminoácido, o bien puede ser suprimida. También se puede preparar una variante o análogo por supresión de aminoácidos en las posiciones 1, 2, 3, 4 y 5 así como con la variante en la SEC. DE IDENT. NO: 15 (véase la figura 5) . También se pueden realizar sustituciones en estas posiciones y están dentro del alcance de esta invención. La proteína Fc-OB recombinante de la figura 5 es una proteína Fc-OB de 373 aminoácidos (sin contar el residuo metionina) . La primera secuencia de aminoácidos para la proteína Fc-OB recombinante de la figura 5 se denomina como +1 con la metionina en la posición -1. También se pueden realizar modificaciones para introducir cuatro sustituciones de aminoácidos para suprimir el sitio de unión de receptor Fc y el sitio de unión de complemento (Clq) . Estas modificaciones de variante de la SEC. DE IDENT. NO: 15 podrían incluir leucina en la posición 15 sustituida con glutamato, glutamato en la posición 98 sustituida con alanina, y lisinas en las posiciones 100 y 102 sustituidas con alaninas (véase la figura 6 y la SEC. DE IDENT. NO: 18) . La proteína Fc-OB recombinante de la figura 6 es una proteína Fc-OB de 373 aminoácidos (sin contar el residuo metionina) . La primera secuencia de aminoácidos para la proteína Fc-OB recombinante de la figura 6 se denomina como +1 con la metionina en la posición -1. De igual manera, se pueden sustituir uno o más rediduos tirosina por residuos fenilalanina también. Además, están contempladas otras variantes de inserciones, supresiones y/o sustituciones de aminoácidos y se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Además, las alteraciones pueden estar en forma de aminoácidos alterados tales como peptidomiméticos o D-aminoácidos . La proteína Fc también puede estar unida a las proteínas OB de la proteína Fc-OB por porciones "enlazadoras" ya sea químicos o aminoácidos de longitudes variables. Tales enlazadores químicos son bien conocidos en la técnica. Las secuencias enlazadoras de aminoácidos pueden incluir, pero no se limitan a: (a) ala, ala, ala; (b) ala, ala, ala, ala; (c) ala, ala, ala, ala, ala; (d) gly, gly; (e) gly, gly, gly; (f) gly, gly, gly, gly, gly; (g) gly, gly, gly, gly, gly, gly, gly; (h) gly-pro-gly; (i) gly, gly, pro, gly, gly; y (j) cualquier combinación de las subpartes (a) a (i) . La porción OB de la proteína de fusión Fc-OB se puede seleccionar de la parte de ratón recombinante que se" establece en la SEC. DE IDENT. NO: 3 (véase la figura 1) o la proteína humana recombinante como se establece en Zhang et al., Nature, supra, (incorporado en la presente como referencia) o aquellos que carecen de un residuo glutaminilo en la posición 28. (Véase Zhang et al, Nature, supra , en la página 428) . También se puede utilizar el análogo de proteína OB humana recombinante como se establece en la SEC. DE IDENT. NO: 6 (véase la figura 2), la cual contiene: (1) una arginina en lugar de lisina en la posición 35; y (2) una leucina en lugar de isoleucina en la posición 74. (Una abreviatura de escritura breve para este análogo es el recombinante humano R->L35, I->L74) . La secuencia de aminoácidos para las proteínas humanas recombinantes y de ratón recombinantes o análogos o sin la porción Fc fusionada en la parte N terminal de la proteína OB se establecen a continuación con un residuo metionilo en la posición -1; sin embargo, al igual que con cualquiera de las proteínas OB presentes y con sus análogos, el residuo metionilo puede estar ausente . La proteína de ratón es sustancialmente homologa a la proteína humana, particularmente como una proteína madura y, además, particularmente en la parte N terminal. Se puede preparar un análogo de la proteína humana recombinante al alterar (por ejemplo al sustituir residuos de aminoácidos) en la secuencia humana recombinante, los aminoácidos los cuales divergen de la secuencia de ratón. Debido a que la proteína humana recombinante tiene actividad biológica en ratones, probablemente tal análogo sería activo en humanos. Por ejemplo, al utilizar una proteína humana que tiene una lisina en el residuo 35 y una isoleucina en el residuo 74 de acuerdo con la numeración de la SEC. DE IDENT. NO: 6, en donde el primer aminoácido es valina, y el aminoácido en la posición 146 es cisteína, se puede sustituir con otro aminoácido uno o más aminoácidos en las posiciones 32, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 89, 97, 100, 105, 106, 107, 108, 111 118, 136, 138, 142 y 145. Se puede seleccionar el ami: cido en la posición correspondiente de la proteína de ratón (SEC. DE IDENT. NO: 3) , u otro aminoácido. Se pueden preparar moléculas de "consenso" basados en la secuencia de proteína OB de rata. Murakami et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 209: 944-952 (1995) incorporada en la presente como referencia. La proteína OB de rata difiere de la proteína OB humana en las siguientes posiciones (utilizando la numeración de la SEC. DE IDENT. NO: 6) : 4, 3_2, 33, 35, 50, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100/ 10 , 02, 105, 1£6, 101, 108, 111. 118 , 136 , 138 y 145. Se puede sustituir con otro aminoácido uno o más de los aminoácidos en estas posiciones divergentes. Las posiciones en impresión en negrillas son aquellas en las cuales la proteína OB de ratón así como la proteína OB de rata divergen de la proteína OB humana, y por lo tanto son particularmente adecuadas para alteración. En una o más de las posiciones, se puede sustituir un aminoácido de la proteína OB de rata correspondiente, u otro aminoácido. Las posiciones de la proteína OB tanto de rata como de ratón las cuales divergen de la proteína OB humana madura son: 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 y 145. También puede ser efectiva una proteína OB de acuerdo con la SEC. DE IDENT. NO: 6 que tenga uno o más de los aminoácidos anteriores sustituidos con otro aminoácido, tales como los aminoácidos que se encuentran en las secuencias correspondientes de rata o de ratón. Además, los aminoácidos que se encuentran en la proteína OB de monos rhesus los cuales divergen de la proteína OB humana madura son (con identidades indicadas en paréntesis con la abreviatura de aminoácidos de una letra) : 8 (S) , 35 (R) , 48 (V), 53 (Q), 60(1), 66 (I), 67 (N) , 68 (L) , 89 (L) , 100 (L) , 108 (E), 112 (D) y 118 (L) . Puesto que la proteína OB humana recombinante es activa en monos macacos, puede ser efectiva una proteína OB humana de acuerdo con la SEC. DE IDENT. NO: 6 (con lisina en la posición 35 e isoleucina en la posición 74) que tenga uno o más aminoácidos divergentes de mono rhesus con otro aminoácido tal como los aminoácidos en paréntesis. Se debe hacer notar que ciertos aminoácidos divergentes rhesus también son aquellos encontrados en las especies de ratón anteriores (posiciones 35, 68, 89, 100 y 112) . Por lo tanto, se puede preparar una molécula de consenso murina-rhesus-humana que tiene (utilizando la numeración de la SEC. DE IDENT. NO: 6 que tiene una lisina en la posición 35 y una isoleucina en la posición 74) que tiene uno o más de los aminoácidos en las posiciones sustituidas por otro aminoácido: 4, 8, 32, 33, 35. 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100. 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 y 145. Se pueden preparar otros análogos al suprimir una parte de la secuencia de aminoácidos de proteína. Por ejemplo, la proteína madura carece de una secuencia líder (-22 a -1) . Se pueden preparar las siguientes formas truncadas de moléculas de proteína OB humana (utilizando la numeración de la SEC. DE IDENT. NO: 6) : (a) aminoácidos 98-146 (b) aminoácidos 1-32 (c) aminoácidos 40-116 (d) aminoácidos 1-99 y (conectado a) 112-146 (e) aminoácidos 1-99 y (conectado a) 112-146 que tiene uno o más aminoácidos 100-111 colocados entre los aminoácidos 99 y 112. Además, las formas truncadas también pueden tener alterados uno o más de los aminoácidos los cuales son divergentes (en la proteína OB de rata, de ratón o de mono rhesus) en comparación con la proteína OB humana. Además, cualquier alteración puede estar en forma de aminoácidos alterados, tales como peptidomiméticos o D-aminoácidos . Por lo tanto, la presente invención abarca a una proteína de fusión Fc-OB en donde la proteína OB se selecciona de: (a) la secuencia de aminoácidos 1-146 como se establece en la SEC. DE IDENT. NO: 3 (abajo) o la SEC. DE IDENT. NO: 6; (b) la secuencia de aminoácidos 1-146 como se establece en la SEC. DE IDENT. NO: 6 que tiene un residuo lisina en la posición 35 y un residuo isoleucina en la posición 74; (c) la secuencia de aminoácidos de la subparte (b) que tiene un aminoácido diferente sustituido en una o más de las siguientes posiciones (utilizando la numeración de acuerdo con la SEC. DE IDENT. NO: 6 y que retiene la misma numeración incluso en ausencia de un residuo glutaminilo en la posición 28) : 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 y 145; (d) la secuencia de aminoácidos de la subpartes (a) , (b) o (c) que opcionalmente carece de un residuo glutaminilo en la posición 28; (e) la secuencia de aminoácidos de la subpartes (a) , (b) , (c) o (d) que tiene un residuo metionilo en la parte N terminal; (f) un análogo de proteína OB truncado que se selecciona de entre: (utilizando la numeración de la SEC. DE IDENT. NO: 6) : (i) aminoácidos 98-146 (ii) aminoácidos 1-32 (iii) aminoácidos 40-116 (iv) aminoácidos 1-99 y 112-146 (v) aminoácidos 1-99 y 112-146 que tiene uno o más aminoácidos 100-111 colocados entre los aminoácidos 99 y 112; y (vi) el análogo OB truncado o la subparte (i) que tiene uno o más aminoácidos 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 y 145 sustituidos con otro aminoácido. (vii) el análogo truncado de la subparte (ii) que tiene uno o más de los aminoácidos, 4, 8 y 32 sustituidos con otro aminoácido; (viii) el análogo truncado de la subparte (iii) que tiene uno o más de los aminoácidos 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111 y 112 sustituidos con otro aminoácido; (ix) el análogo truncado de la subparte (iv) que tiene uno o más aminoácidos 4, 8, 32, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 112, 118, 136, 138, 142 y 145 sustituidos con otro aminoácido; y (x) el análogo truncado de la subparte (v) que tiene uno o más de los aminoácidos 4, 32, 33, 35, 50, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 y 145 sustituidos con otro aminoácido; (xi) el análogo truncado de cualquiera de las subpartes (i) - (x) que tiene un residuo metionilo N terminal; y (g) la proteína OB o un derivado análogo de cualquiera de la subpartes (a) a (f) constituido de una porción química conectada con la poción proteínica; (h) un derivado o subparte (g) en donde la porción química es una porción de polímero soluble en agua; (i) un derivado de la subparte (h) en donde la porción de polímero soluble en agua es polietilenglicol; (j) un derivado de la subparte (h) en donde la porción de polímero soluble en agua es una porción poliaminoácido; (k) un derivado de la subparte (h) a (j) en donde la porción está unida en únicamente la parte N terminal de la porción de proteína; y (1) una proteína OB, un análogo o derivado de cualquiera de las subpartes (a) a (k) en un portador farmacéuticamente aceptable.

DERIVADOS Las presentes proteínas de fusión Fc-OB (en la presente, el término "proteína" se utiliza para incluir un "péptido" Fc-OB o análogos, tales como los mencionados antes, a menos que se indique de otro modo) se derivatizan (se forman derivados) por la unión de una o más porciones químicas a la porción de proteína de fusión Fc-OB. Estos derivados modificados químicamente pueden ser formulados adicionalmente para vía intraarterial intraperitoneal, intramuscular, subcutáneo, intravenosa, oral, nasal, pulmonar, tópica u otras vías de administración, como se discute en lo siguiente. Se ha encontrado que la modificación química de proteínas biológicamente activas proporciona ventajas adicionales bajo ciertas circunstancias, tales como incremento en la estabilidad y tiempo de circulación de la proteína terapéutica, e inmunogenicidad disminuida. Véase la patente de los Estados Unidos Número 4,179,337, Davis et al., otorgada el 18 de diciembre de 1979. Para una revisión véase Abuchowski et al., en Enzymes as Drugs. (J. S. Holcerberg y J. Roberts, eds. pp. 367-383 (1981)); Francis et al., supra . Las porciones químicas adecuadas para tal derivatización se pueden seleccionar de entre diversos polímeros solubles en agua. El polímero que se selecciona debe ser soluble en agua de manera que la proteína a la cual se una no precipite en un ambiente acuoso, tal como un ambiente fisiológico. Preferiblemente, para uso terapéutico de la preparación de producto final, el polímero será farmacéuticamente aceptable. Una persona familiarizada en la técnica será capaz de seleccionar el polímero deseado en base en consideraciones tales como por ejemplo si el conjugado de polímero/proteína se utilizará terapéuticamente, y en caso de ser así, se considerarán la dosificación deseada, el tiempo de circulación, la resistencia a proteólisis y otras consideraciones. Para las presentes proteínas y péptidos, se puede determinar la efectividad de la derivatización al administrar el derivado, en la forma deseada (es decir, por bomba osmótica, o más preferiblemente por inyección o infusión, o además, formulada para suministro oral, pulmonar o nasal, por ejemplo) y al observar los efectos biológicos como se describe en la presente. El polímero soluble en agua se puede seleccionar del grupo que consiste de, por ejemplo, polietilenglicol, copolímeros de e t i 1 eng 1 i c o 1 / p r op i 1 e ng 1 i c o 1 , carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, poli-1, 3 -dioxolano, poli-1, 3-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (ya sea homopolímeros o copolímeros aleatorios) , y dextrano o poli (N-vinilpirrolidona) polietilenglicol, homopolímeros de propilenglicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados y alcohol polivinílico. El polietilenglicolpropionaldehído puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua. También se pueden utilizar succinato y estireno. Las proteínas OB o Fc utilizadas para formular la proteína de fusión Fc-OB, se pueden preparar al unir poliaminoácidos o aminoácidos de punto de ramificación a la porción Fc o de proteína OB (o a análogos) . Por ejemplo, el poliaminoácido puede ser una proteína portadora adicional la cual, al igual que Fc fusionado a la proteína OB o al análogo OB de la presente invención, sirve también para incrementar la vida media de circulación de la proteína además de las ventajas que se obtienen vía la proteína de fusión Fc-OB anterior. Para el presente propósito terapéutico o cosmético de la presente invención, tales poliaminoácidos deben ser aquellos los cuales tienen o no generan respuesta antigénica neutralizante, u otras respuestas adversas. Tales poliaminoácidos se pueden seleccionar del grupo que consiste de albúmina sérica (tales como albúmina sérica humana) , un anticuerpo adicional o porción del mismo (por ejemplo, la región Fc) , u otros poliaminoácidos, por ejemplo usinas. Como se indica en lo siguiente, la posición de unión del poliaminoácido puede ser en la parte N terminal de la porción de proteína Fc-OB, o C terminal, u otros lugares entre los mismos, y también se puede conectar por una porción "enlazante" química a la proteína Fc-OB. El polímero puede ser de cualquier peso molecular, y puede estar ramificado o sin ramificar. Para polietilenglicol, el peso molecular preferido está entre aproximadamente 2 kDa y aproximadamente 100 kDa (el término "aproximadamente" indica que en preparaciones de polietilenglicol, algunas moléculas pesarán más, algunas menos al peso molecular establecido) para facilidad de manejo y fabricación. Se pueden utilizar otros tamaños, en base en el perfil terapéutico deseado (por ejemplo, la duración de la vibración sostenida deseada, los efectos, si cualquiera de la actividad biológica, la facilidad de manejo, el grado o carencia de antigenicidad u otros efectos conocidos del polietilenglicol respecto a la proteína o análogo terapéutico) .

El número de moléculas de polímero que se unen de este modo puede variar, y una persona familiarizada en la técnica será capaz de determinar el efecto en base a la función. Uno puede mono-derivatizar, o puede proporcionar una combinación de derivatización di-, tri-, tetra- o alguna otra combinación, con la misma o con diferentes porciones químicas (por ejemplo, polímeros tales como aquellos con pesos diferentes de polietilenglicloles) . La proporción de moléculas de polímero respecto a moléculas de proteína (o de péptido) variará, así como sus concentraciones en la mezcla de reacción. En general, la proporción óptima (en términos de eficiencia de reacción en donde no hay un exceso de proteína o polímero que no haya reaccionado) se determinará por factores tales como el grado deseado de derivatización (por ejemplo mono-, di-, tri-, etc.,), el peso molecular del polímero que se seleccione, si el polímero está ramificado o no ramificado, y las subcondiciones de reacción. Las porciones químicas se deben unir a la proteína con consideración de los efectos sobre los dominios funcional o antigénico de la proteína. Existen numerosos métodos de unión disponibles para aquellos familiarizados en la técnica, por ejemplo, el documento EP 0 401 384 incorporado en la presente como referencia (acoplamiento de PEG a G-CSF) , véase también Malik et al., Exp Hematol . 20: 1028-1035 (1992) (que presenta la pegilación de GM-CSF utilizando cloruro de tresilo) . Por ejemplo, el polietilenglicol se puede unir convalentemente a través de residuos aminoácidos vía un grupo reactivo, tal como un grupo amino o carboxilo libre. Los grupos reactivos son aquellos a los cuales se puede unir una molécula activada de polietilenglicol. Los residuos aminoácidos que tienen un grupo amino libre pueden incluir residuos lisina y el residuo aminoácido N terminal. Aquellos que tienen un grupo carboxilo libre pueden incluir residuos de ácido aspártico, residuos de ácido glutámico y el residuo de aminoácido C terminal. También se pueden utilizar grupos sulfhidrilo como un grupo reactivo para unir la molécula o moléculas de polietilenglicol. Lo que se prefiere para propósitos terapéuticos es la unión de un grupo amino, tal como la unión en la parte N terminal del grupo lisina. Se debe evitar la unión de residuos importantes para la unión del receptor, si se desea unión del receptor. Se puede desear específicamente una proteína de fusión Fc-OB modificada químicamente en la parte N terminal. Utilizando polietilenglicol como una ilustración de las presentes composiciones, se pueden seleccionar de una variedad de moléculas de polietilenglicol (por peso molecular, ramificación etc.). La proporción de moléculas de polietilenglicol respecto a moléculas de proteína (o péptido) en la mezcla de reacción, el tipo de reacción de pegilación que se va a realizar, y el método para obtener la proteína pegilada N terminalmente que se seleccione. El método para obtener la preparación pegilada en la parte N terminal (es decir, separación de esta porción de otras porciones monopegiladas si es necesario) puede realizarse por purificación del material pegilado en la parte N terminal a partir de una población de moléculas de proteína pegiladas. La modificación química N terminal selectiva se puede llevar a cabo por alquilación reductiva la cual aprovecha la reactividad diferencial de diferentes tipos de grupos amino primarios (lisina versus la parte N terminal) disponibles para derivatización en una proteína particular. Bajo las condiciones de reacción apropiadas, se obtiene una derivatización sustancialmente selectiva de la proteína en la parte N terminal con un grupo carbonilo que contiene polímero. Por ejemplo, uno puede pegilar de manera selectiva en la parte N terminal la proteína al realizar la reacción a un pH el cual permite aprovechar las diferencias de pKa entre el grupo e -amino de los residuos amina y el del grupo a-amino del residuo N terminal de la proteína. Mediante tal derivatización selectiva, se controla la unión de un polímero soluble en agua a una proteína: la conjugación con polímero tiene lugar predominantemente en la parte N terminal de la proteína y no hay modificación significativa de otros grupos reactivos, tales como la cadena lateral lisina de los grupos amino. Utilizando alquilación reductiva, el polímero soluble en agua puede ser del tipo descrito antes, y puede tener un solo aldehido reactivo para acoplamiento a la proteína. Se puede utilizar polietilenglicolpropionaldehído que contiene un solo aldehido reactivo. Se prefiere un derivado monopegilado en la parte N terminal para facilidad en la producción de una sustancia terapéutica. La pegilación N terminal asegura un producto homogéneo en la medida en que la caracterización del producto se simplifica en relación a los productos di-, tri- o multipegilados adicionales. El uso del proceso de alquilación reductiva anterior para preparación de un producto N terminal se prefiere para facilidad en la fabricación comercial.

COMPLEJOS La proteína de fusión Fc-OB, análogo o derivado del mismo se puede administrar formando complejos a una composición de unión. Tal composición de unión puede tener el efecto de prolongar el tiempo de circulación incluso adicionalmente en comparación con lo que se obtiene con la proteína de fusión Fc-OB, análogo o derivado. Tal composición puede ser una proteína (o de manera análoga, un péptido) . Un ejemplo de proteína de unión es el receptor de proteína OB o una porción del mismo, tal como una porción soluble del mismo. Se pueden determinar otras proteínas de unión al examinar la proteína OB o la proteína Fc-OB en suero, o al analizar empíricamente en búsqueda de la presencia de unión. Las proteínas de unión utilizadas típicamente no interferirán con la capacidad de la proteína OB, las proteínas de fusión Fc-OB, o análogos o derivados de los mismos, para unirse a receptor de proteína OB endógeno y/o para llevar a cabo una transducción de señal.

COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS La presente invención también proporciona métodos de uso de composiciones farmacéuticas de las proteínas de fusión fc-OB y derivados. Tales composiciones farmacéuticas pueden ser para administración por inyección, o para administración por vía oral, pulmonar, nasal, transdérmica u otras formas de administración. En general, incluido por la invención están las composiciones farmacéuticas que comprenden cantidades efectivas de proteína o productos derivados de la invención junto con diluyentes, preservativos, solubilizantes, emulsificantes, adyuvantes y/o portadores farmacéuticamente aceptables. Tales composiciones incluyen diluyentes de diversos contenidos de amortiguador (por ejemplo Tris-HCl, acetato, fosfato), pH y fuerza iónica; aditivos tales como detergentes y agentes solubilizantes (por ejemplo Tween 80, Polysorbate 80), antioxidantes (por ejemplo ácido ascórbico, metabisulfito de sodio), preservativos (por ejemplo Thimersol, alcohol bencílico) y sustancias para carga (por ejemplo lactosa, manitol) ; incorporación del material en preparaciones particuladas de compuestos poliméricos tales como ácido poliláctico, ácido poliglicólico, etc., o en liposomas . También se puede utilizar ácido hialurónico y este puede tener el efecto de promover la duración sostenida en la circulación. Tales composiciones pueden influir en el estado físico, estabilidad, velocidad de liberación in vivo, y velocidad de aclaramiento in vivo de las proteínas presentes y los derivados. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18402) páginas 1435-1712, las cuales se incorporan en la presente como referencia. Las composiciones se pueden preparar en forma líquida, o pueden estar en forma de polvo seco, por ejemplo en forma liofilizada. También se contemplan formulaciones de liberación sostenida implantables, asi como formulaciones transdérmicas. Para uso en la presente se contemplan formas de dosificación sólida oral, las cuales se describen generalmente en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. 1990 (Mack Publishing Co . Easton PA 18042) en el capítulo 89, el cual se incorpora en la presente como referencia. Las formas de dosificación sólida incluye tabletas, cápsulas, pildoras, trosiscos o grageas, saquitos o granulos. También se puede utilizar encapsulación liposómica o proteinoide para formular las presentes composiciones (como, por ejemplo, microesferas proteinoides presentadas en la patente de los Estados Unidos número 4,925,673). Se puede utilizar la encapsulación liposómica y liposomas se pueden derivar con diversos polímeros (por ejemplo, la patente de los Estados Unidos número 5,013,556). Una descripción de las posibles formas de dosificación sólida para las sustancias terapéuticas se proporciona por Marshall, K. En: Modern Pharmaceuticals Editado por G. S. Banker y C. T. Rhodes capítulo 10, 1979, incorporado en la presente como referencia. En general, la formulación incluirá a la proteína de fusión Fc-OB (o análogo o derivado) , e ingredientes inertes los cuales permiten la protección contra el ambiente del estómago, y liberación del material biológicamente activo en el intestino. También se contempla específicamente formas de dosificación oral de las proteínas derivatizadas anteriores. La proteína de fusión Fc-OB puede ser modificada químicamente de manera que el suministro oral del derivado sea eficaz. Generalmente, la modificación química contemplada es la unión de por lo menos una porción a la molécula de proteína (o péptido) mismo, en donde la porción permite: (a) inhibición de proteolísis; y (b) captación en la corriente sanguínea desde el estómago o el intestino. También se desea el incremento de la estabilidad general de la proteína y un incremento en el tiempo de circulación en el cuerpo. Los ejemplos de tales porciones incluyen: polietilenglicol, copolímeros de etilenglicol y propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona y poliprolina. Abuchowski y Davis, Soluble Polymer-Enzyme Adducts. En: "Enzymes as Drugs", Hocenberg y Roberts, eds., Wiley-Interscience, New York, NY. (1981), pp. 367-383; Newmark et al., J. Appl. Biochem. 4: 185-189 (1982). Otros polímeros que pueden ser utilizados son poli-1, 3 -dioxolano y poli-1,3,6-tioxocano. Las porciones preferidas para uso farmacéutico, como se indica antes, son polietilenglicol. Para la proteína de fusión Fc-OB, análogo o derivado, la posición de liberación puede ser el estómago, el intestino delgado, por ejemplo el duodeno, jejuno o ileom) , o el intestino grueso. Una persona familiarizada en la técnica tiene formulaciones disponibles las cuales no se disolverán en el estómago, sino que liberarán el material en el duodeno o en alguna otra parte en el intestino. Preferiblemente, la liberación evitará los efectos dañinos del ambiente estomacal, ya sea por protección de la proteína de fusión Fc-OB, el análogo o derivado o bien por liberación del material biológicamente activo sobrepasando el ambiente estomacal, por ejemplo en el intestino. Para asegurar una resistencia gástrica completa, es esencial un recubrimiento impermeable a por lo menos pH 5.0. Los ejemplos de los ingredientes inertes más comunes que se utilizan como recubrimientos entéricos son trimelitato de acetato de celulosa (CAT) , ftalato de hidroxipropilmetil-celulosa (HPMCP) HPMCP 50, HPMCP 55, ftalato de acetato de polivinilo (PVAP) , Eudragit L30D, Aquateric, ftalato de acetato de celulosa (CAP) , Eudragil L, Eudragil S y Shellac (goma, laca) . Estos recubrimientos se pueden utilizar como películas mezcladas. También se puede utilizar sobre las tabletas un recubrimniento o mezcla de recubrimientos, los cuales no están diseñados para protección contra el estómago. Estos pueden incluir recubrimientos de azúcar o recubrimientos los cuales vuelven a la tableta más fácil de ingerir. Las cápsulas pueden consistir de una cubierta dura (tal como gelatina) para suministro de la sustancia terapéutica seca, es decir, del polvo; para formas líquidas se puede utilizar una cápsula de gelatina suave. El material de la cubierta o los saquitos pueden ser de almidón grueso u otro papel, estable. Para pildoras, grageas, tabletas moldeadas o triturados de tablera, se pueden utilizar técnicas de masificación en húmedo. La sustancia terapéutica se puede incluir en la formulación como particulados múltiples finos en forma de granulos o granalla de tamaño de partícula de aproximadamente 1 mm. La formulación del material para la administración en cápsula también puede ser como un polvo, tapones ligeramente comprimidos o incluso como tabletas . La sustancia terapéutica se puede preparar por comprensión.

Se pueden incluir colorantes y agentes saborizantes. Por ejemplo, se puede formular la proteína (o derivado) (por ejemplo por liposomas o encapsulación en microesferas) y después puede estar contenida adicionalmente dentro de un producto comestible, tal como una bebida refrigerada que contenga agentes colorantes y saborizantes. Se puede diluir o incremenatr el volumen de la sustancia terapéutica con un material inerte. Estos diluyentes pueden incluir carbohidratos, especialmente manitol, a-lactosa, lactosa anhidra, celulosa, sacarosa, dextranos modificados y almidón. También se pueden utilizar ciertas sales inorgánicas como materiales de relleno que incluyen trifosfato de calcio, carbonato de magnesio y cloruro de sodio. Algunos diluyentes disponibles comercialmente son Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress y Avicell. Se pueden incluir en la formulación desintegrantes de la sustancia terapéutica en forma de dosificación sólida. Los materiales utilizados como desintegrantes incluyen, pero no se limitan a almidón que incluye a desintegrantes comerciales basados en almidón, Explotab, glicoiato de almidón de sodio, Amberlite, carboximetilcelulosa de sodio, ultramilopectina, alginato de sodio, gelatina, cascara de naranja, carboximetilcelulosa acida, esponja natural y bentonita, pueden ser utilizados. Otra forma de los desintegrantes son las resinas de intercambio catiónico insolubles. Se pueden utilizar gomas en polvo como desintegrantes y aglutinantes y estas pueden incluir gomas pulverizadas tales como agar, caralla o tragacanto. El ácido algínico y su sal de sodio también son útiles como desintegrantes. Los aglutinantes se pueden utilizar para mantener al agente terapéutico junto para formar una tableta dura que incluyen materiales de productos naturales tales como acacia, tragacanto, almidón y gelatina. Otros incluyen metilcelulosa (MC) , etilcelulosa (EC) y carboximetilcelulosa (CMC) . Se pueden utilizar tanto polivinilpirrolidona (PVP) como hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) en soluciones alcohólicas para granular la sustancia terapéutica. Se puede incluir un agente contra la fricción en la formulación de la sustancia terapéutica para evitar la adherencia durante el proceso de formulación. Se pueden utilizar lubricantes como una capa entre la sustancia terapéutica y la pared de troquel, y estas pueden incluir, pero no se limitan a ácido esteárico, incluyendo sus sales de magnesio y calcio, politetrafluoroetileno (PTFE) , parafina líquida, aceites vegetales y ceras. También se pueden utilizar lubricantes solubles tales como laurilsulfato de sodio, laurilsulfato de magnesio, polietilenglicol de diversos pesos moleculares, Carbowax 4000 y 6000. Se pueden agregar agentes fluidizantes que pueden mejorar las propiedades de flujo del medicamento durante la formulación y ayudar al rearreglo durante la compresión. Los agentes fluidizantes pueden incluir almidón, talco, sílice pirogénica y silicoaluminato hidratado. Para ayudar en la disolución del agente terapéutico en un ambiente acuoso, se puede agregar un tensoactivo como un agente humectante. Los tensoactivos pueden incluir detergentes aniónicos tales como laurilsulfato de sodio, sulfosuccinato de dioctilsodio y sulfonato de dioctilsodio. Los detergentes catiónicos los cuales se pueden utilizar y se pueden incluir son cloruro de benzalconio o cloruro de benzetonio. La lista de detergentes no iónicos potenciales que se pueden incluir en la formulación como tensoactivos son lauromacrogol 400, estearato de polioxilo 40, polioxietileno hidrogenado de aceite de reciño 10, 50 y 60, monoestearato de glicerol, polysorbate 40, 60, 65 y 80, éster de ácido graso de sacarosa, metilcelulosa y carboximetilcelulosa. Estos tensoactivos pueden estar presentes en la formulación de la proteína o derivarse ya sea solos o como una mezcla en proporciones diferentes. Los aditivos los cuales mejoran potencialmente la captación de la proteína (o derivados) son, por ejemplo, los ácidos grasos como ácido oleico, ácido linoleico y ácido linolénico. Puede ser deseable una formulación de liberación controlada. El medicamento se puede incorporar en una matriz inerte la cual permite la liberación ya sea por mecanismos de difusión o lixiviado, por ejemplo goma. También se pueden incorporar matrices que se generen lentamente dentro de la formulación, por ejemplo alginatos, polisacáridos. Otra forma de liberación controlada de esta sustancia terapéutica es por un método basado en el sistema terapéutico Oros (Alza Corp.), es decir, el medicamento se incluye en una membrana semipermeable en la cual permite que entre agua y empuje el medicamento hacia afuera, a través de un pequeño orificio único, debido a efectos osmóticos. Algunos recubrimientos entéricos también tienen un efecto de liberación retardada. Se pueden utilizar para la formulación otros recubrimientos. Estos incluyen diversos azúcares los cuales se pueden aplicar en un recipiente de recubrimiento. El agente terapéutico también se puede suministrar en una tableta recubierta con película y los materiales utilizados en este caso se dividen en dos grupos. El primero son materiales no entéricos e incluyen metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, metilhidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, providona y los polietilenglicoles. El segundo grupo consiste de los materiales entéricos que con comúnmente esteres de ácido ftálico. Se puede utilizar una mezcla de materiales para proporcionar el recubrimiento óptimo de película. El recubrimiento de película se puede llevar a cabo en un recubridor de bandeja o en un lecho fluidizado o por recubrimiento por compresión. También se contempla en la presente el suministro pulmonar de la presente proteína (o derivados de la misma) . La proteína (o derivado) se suministra a los pulmones de un mamífero mientras inhala, y atraviesa el revestimiento epitelial pulmonar hacia la corriente sanguínea. (Otros informes de esto incluyen a Adjei et al., Pharmaceutical Research 7: 565-569 (1990); Adjei et al., International Journal of Pharmaceutics 63.: 135-144 (1990) (acetato de leuprolide) ; Braquet et al . , Journal of Cardiovascular Pharmacology 13 (suppl. 5): s.143-146 (1989) (endotelina-1) ; Hubbard et al., Annals of Infernal Medicine 3: 206-212 (1989) (al-antitripsina) ; Smith et al., J. Clin. Invest. 84 : ' 1145-1146 (1989) (a-1-proteinasa) ; Oswein et al., "Aerosolization of Proteins", Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, marzo de 1990 (hormona del crecimiento humano recombinante); Debs et al., The Journal of Immunology 140 : 3482-3488 (1988) (interferon-? y factor a de necrosis tumoral) y Platz et al., patente de los Estados Unidos número 5,284,656 (factor estimulador de colonias de granulocitos) . Se contempla para uso en la práctica de esta invención una amplia gama de dispositivos mecánicos diseñados para suministro pulmonar de productos terapéuticos, que incluyen, pero que no se limitan a nebulizadores, inhaladores de dosis medida e inhaladores de polvo, todos los cuales son familiares para aquellos relacionados con la técnica. Algunos ejemplos específicos de dispositivos disponibles comercialmente adecuados para la práctica de esta invención son el nebulizador Ultravent, fabricado por Mallinckrodt , Inc., St . Louis, Missouri; el nebulizador Acorn II, fabricado por Marquest Medical Products, Englewood, Colorado; el inhalador de dosis medidas Ventolín, fabricado por Glaxo, Inc., Research Triangle Park, North Carolina; y el inhalador de polvo Spinhaler fabricado por Fisons Corp., Bedford, Massachusetts . La totalidad de tales dispositivos requiere el uso de formulaciones adecuadas para el suministro de la proteína (o análogo o derivado) . Típicamente, cada formulación es específica para el tipo de dispositivo que se utiliza y puede involucrar el uso de un material propulsor apropiado, además de diluyentes, adyuvantes y/o portadores útiles en terapia. La proteína (o derivado) ventajosamente se debe preparar en forma particulada con un tamaño de partícula promedio menor de 10 µm (o micrómetros) , de manera más preferible de 0.5 a 5 µm, para un suministro más efectivo al pulmón distal . Los portadores incluyen carbohidratos tales como trehalosa, manitol, xilitol, sacarosa, lactosa y sorbitol.

Otros ingredientes para uso en las formulaciones pueden incluir DPPC, DOPE, DSPC y DOPC. Se pueden utilizar tensoactivos naturales o sintéticos. Se puede utilizar polietilenglicol (incluso separado de su uso en la derivatización de la proteína o análogo) . Se pueden utilizar dextranos, tales como ciclodextrano. Se pueden utilizar sales biliares y otros mejoradores relacionados. Se puede utilizar celulosa y derivados de celulosa. Se pueden utilizar aminoácidos, tales como los que se utilizan en una formulación de amortiguador. Además, se contempla el uso de liposomas, microcápsulas o microesferas, complejos de inclusión u otros tipos de portadores. Las formulaciones adecuadas para uso con un nebulizador, ya sea de chorro o ultrasónico, típicamente comprenderán la proteína Fc-OB, análogos o derivados de la misma, disueltos en agua a una concentración de aproximadamente 0.1 a 25 mg de proteína biológicamente activa por ml de solución. La formulación también puede incluir un amortiguador y un azúcar simple (por ejemplo, para estabilización de proteínas y regulación de la presión osmótica. La formulación de nebulizador también puede contener un tensoactivo, para reducir o evitar la agregación inducida en la superficie de la proteína causada por atomización de la solución al formar el aerosol .

Las formulaciones para uso con un dispositivo inhalador de dosis medida generalmente comprenderán un polvo finamente dividido que contiene a la proteína (o derivado) suspendido en propelente con la ayuda de un tensoactivo. El propelente puede ser cualquier material convencional utilizado para este propósito, tal como un fluorocarburo, un hidroclorofluorocarburo, un hidrofluorocarburo o un hidrocarburo, que incluye triclorofluorometano, diclorodifluorometano, diclorotetrafluoroetanol y 1,1,1,2-tetrafluoroetano, o combinaciones de los mismos. Los tensoactivos adecuados incluyen trioleato de sorbitán y lecitina de soya. El ácido oleico también puede ser útil como un tensoactivo. Las formulaciones para suministro desde un dispositivo inhalador de polvo comprenderán un polvo seco finamente dividido que contiene proteína (o un derivado) y también pueden incluir un agente para carga, tal como lactosa, sorbitol, sacarosa, manitol, trehalosa o silitol en cantidades las cuales faciliten la dispersión del polvo desde el dispositivo, por ejemplo 50 a 90% en peso de la formulación. También se contempla el suministro nasal de la proteína (o análogo o derivado) . El suministro nasal permite el paso de la proteína a la corriente sanguínea después de administración del producto terapéutico, la nariz, sin necesidad de deposición del producto en el pulmón. Las formulaciones para suministro nasal incluyen aquellas con dextrano o ciclodextrano. También se contempla el suministro vía transporte a través de otras membranas mucosas.

DOSIFICACIÓN Una persona familiarizada en la técnica será capaz de determinar las dosificaciones efectivas por administración y observar el efecto terapéutico deseado. Debido a la modificación en la parte N terminal de la proteína OB, la presente invención proporciona una protección inesperada a la proteína impidiendo la degradación, e incrementa el tiempo de circulación y la estabilidad, cuando se compara con una proteína OB o con una modificación en parte C terminal de la proteína OB . Una persona familiarizada en la técnica, por lo tanto será capaz de determinar a partir de estos cambios que una dosificación efectiva puede requerir dosis más bajas o una dosificación menos frecuente. Preferiblemente, la formulación de la molécula será tal que entre aproximadamente 0.10 µg/kg/día y 10 mg/kg/día proporcionarán el efecto terapéutico deseado. Se pueden determinar las dosificaciones efectivas utilizando herramientas diagnósticas con respecto al tiempo. Por ejemplo, un diagnóstico para medir la cantidad de proteína OB o la proteína de fusión Fc-OB en la sangre ' (o plasma o suero) debe ser utilizada primero para determinar las concentraciones endógenas de proteína. Tales herramientas de diagnóstico pueden estar en forma de un ensayo de anticuerpos, tal como un ensayo de interposición de anticuerpos. Inicialmente se cuantifica la cantidad de proteína OB endógena, y se determina la línea de base. Las dosificaciones terapéuticas se determinan como la cuantificación de proteína OB o de proteína de fusión Fc-OB endógena y exógena (esto es, proteína, análogo o derivado encontrado dentro del cuerpo, ya sea producido por el mismo cuerpo o bien administrado) y se continúa durante el curso de la terapia. Por lo tanto, las dosificaciones pueden variar sobre el curso de la terapia, con una dosificación relativamente elevada utilizada inicialmente, hasta que se observe un beneficio terapéutico, y se utilizan dosificaciones menores para mantener los beneficios terapéuticos. Idealmente, en situaciones en donde únicamente se desea la reducción en las concentraciones de lípidos en sangre, en donde se desea el mantenimiento de reducción de las concentraciones de lípidos en sangre, o en donde se desea un incremento en la masa corporal magra, la dosificación será suficiente para que resulte en perdida de peso. Por lo tanto, durante un curso inicial de terapia de una persona obesa, las dosificaciones se pueden administrar en donde se obtenga una perdida de peso y una disminución concomitante en la concentración de lípidos en sangre o una disminución del tejido graso con comitante/incremento de la masa magra. Una vez que se obtiene suficiente pérdida de peso, se puede administrar una dosificación suficiente para evitar la ganancia nuevamente de peso, aunque suficiente para mantener las concentraciones de lípidos en sangre deseadas o el incremento de masa magra, o bien, prevención de supresión de masa magra) . Estas dosificaciones se pueden determinar empíricamente, pues los efectos de la proteína OB o Fc-OB son reversibles (por ejemplo Campfield et al., Science 269: 546-549 (1995) en 547). Por lo tanto, si una dosificación resulta en una pérdida de peso que se observa cuando no se desea pérdida de peso, se puede administrar una dosis más baja con el fin de obtener las concentraciones deseadas de lípidos en sangre o un incremento en la masa tisular magra, y al mismo tiempo mantener el peso deseado. Para incrementar la sensibilidad individual a insulina, se pueden tomar en consideración las consideraciones de dosificación similares. Se puede obtener un incremento en la masa magra sin pérdida de peso suficiente para disminuir la cantidad de insulina (o, potencialmente, amilina, tiazolidinadionas u otros medicamentos potenciales para tratar diabetes) que se administrarían a un individuo para el tratamiento de diabetes. Para incrementar la resistencia general, pueden hacerse consideraciones similares respecto a la dosificación.

Un incremento en la masa magra con un incremento con comitante en la resistencia general se puede obtener con dosis insuficientes que resultan en pérdida de peso. Otros beneficios, tales como un incremento en células sanguíneas rojas (y oxigenación en la sangre) y una disminución en la resorción ósea o osteoporosis también se pueden obtener en ausencia de pérdida de peso.

COMBINACIONES Los presentes métodos se pueden utilizar junto con otros medicamentos, tales como aquellos útiles para el tratamiento de diabetes (por ejemplo insulina, posiblemente tiazolidinadionas, amilina o antagonistas de los mismos) , medicamentos que disminuyen el colesterol y la presión sanguínea (tales como aquellos los cuales reducen las concentraciones de lípidos en sangre u otros medicamentos cardiovasculares) , y medicamentos que incrementan la actividad (por ejemplo anfetaminas) . También se pueden utilizar supresores del apetito (tales como aquellos que afectan las concentraciones de serotonina o neuropéptido Y) . Tal administración puede ser simultánea o puede ser consecutivo. Además, los presentes métodos se pueden utilizar junto con procedimientos quirúrgicos, tales como las cirugías cosméticas diseñadas para alterar la apariencia general del cuerpo (por ejemplo liposucción o cirugías láser diseñadas para reducir la masa corporal) . Los beneficios en cuanto a la salud de las cirugías cardíacas, tales como cirugías de derivación u otras cirugías diseñadas para aliviar una condición dañina causada por bloqueo de los vasos sanguíneos por depósitos grados, tales como placa arterial se pueden incrementar con el uso con comitante de las composiciones y métodos actuales. Los métodos para eliminar cálculos biliares, tales como métodos ultrasónicos o láser, también se pueden utilizar, ya sea antes de, durante o después del curso de los presentes métodos terapéuticos. Además, los presentes métodos se pueden utilizar como un adyuvante a cirugías o terapias para huesos rotos, músculo dañado u otras terapias las cuales se mejoraría con un incremento en la masa tisular magra. Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar de manera más completa la invención, pero no se consideran como limitantes de alcance de la misma.

Eiemplo 1: Uso de proteína Fc-OB de ratón vía invección subcutánea Este ejemplo demuestra que la inyección subcutánea de proteína Fc-OB de ratón resulta en una pérdida de peso en ratones normales. Se les administró a ratones CDl normales (no obesos) proteína Fc-OB de ratón vía inyecciones subcutáneas durante un período de tiempo de 22 días. Una dosificación de 10 mg de proteína/kg de peso corporal/día resultó en una pérdida de 14% (+/- 1.1%) a partir del peso de línea de base a los 22 días de inyecciones. Una dosificación de PBS resultó en una pérdida de 3.9% (+/- 3.3%) a partir del peso de línea de base al día 22 de inyecciones. La pérdida de peso con el uso de 10 mg de proteína/kg de peso corporal/día de proteína Fc-OB en ratones CDl obesos resultó en una pérdida de 10% (+/- 4.3%) a partir del peso de línea de base y una dosificación de PBS resultó en una pérdida de 8.7% (+/- 1.3%) a partir del peso de línea de base, ambos al día 22 de inyecciones. A continuación se presenta el por ciento (%) de diferencias del peso de línea de base en ratones CDl (de 8 semanas de edad) : Tabla 1 Pérdida de peso ante inyección subcutánea Como se puede observar, al finalizar el régimen subcutáneo en el día 22, los animales que recibieron proteína Fc-OB perdieron más de 14.1% de peso corporal en la parte magra y 10% de peso corporal en los obesos, en comparación con los animales que únicamente recibieron vehículo PBS y en comparación con la línea de base. Sorprendentemente, los animales que recibieron la proteína Fc-OB hasta los 22 días continuaron perdiendo peso hasta los 28 días, 4 días después de la última inyección. A ratones CDl normales (no obesos) se les administró 10 mg de proteína/kg de peso corporal/día de proteína Fc-OB de ratón por medio de inyecciones subcutáneas que finalizaron el día 22, lo que resultó en una pérdida de 21% a partir del peso de línea de base en el día 28, en comparación con una pérdida de 14% en el día 22. De igual manera, los ratones CDl obesos se les administró 10 mg de proteína/kg de peso corporal/día de proteína Fc-OB de ratón y que finalizó en el día 22, resultó en una pérdida de 13% a partir del peso de línea de base en el día 28, en comparación con 10% de pérdida en el día 22. En el día 34, la pérdida de peso se mantenía a 10% de pérdida en ratones obesos, en donde los ratones magros recuperaron 5% de pérdida. Los controles en cada sistema desde el día 22 hasta el día 34 promediaron 4% en ratones obesos y 7% de ganancia en ratones magros .

EJEMPLO 2 : Uso de proteína Fc-OB humana vía invección subcutánea en ratones C57 Este ejemplo demuestra que la inyección subcutánea de proteína Fc-OB humana resulta en pérdida de peso en ratones normales. A ratones C57 normales (no obesos) se les administró proteína Fc-OB humana vía inyecciones subcutáneas durante un período de tiempo de 7 días. Una dosificación de 10 mg de proteína/kg de peso corporal/día resulta en una pérdida de 12% (+/- 1.3%) a partir del peso de línea de base al séptimo día de inyecciones. Una dosificación de 1 mg de proteína/kg de peso corporal/día resulta en una pérdida de 8.9% (+/- 1.5%) a partir del peso de línea de base al séptimo día de inyección. Las pérdidas de peso con el uso de 10 mg de proteína/kg de peso corporal/día de proteína OB humana en ratones C57 obesos resulta en una pérdida de 1.1% (+/- 1.1%) del peso de línea de base, y una dosificación de 0.1 mg de proteína/kg de peso corporal/día resulta en una pérdida de 2,5% (+/- 1.1%) a partir del peso de línea de base, ambos al séptimo día de inyecciones.

RESULTADOS A continuación se presentan las diferencias en por ciento (%) a partir del peso de línea de base en ratones C57 (de 8 semanas de edad) .

Tabla 2 Pérdida de peso ante inyección subcutánea Como se puede ver, al finalizar el día 17 después de un régimen subcutáneo de 7 días a 10 mg/kg/día, los animales que recibieron la proteína Fc-OB recuperaron hasta 8% de su peso corporal. Los animales que recibieron dosificaciones de 1 mg/kg/día después de un régimen subcutáneo de 7 días regresaron a 6.4% de peso corporal después de 12 días. Estos estudios también muestran que durante los períodos de recuperación desde el día 7 hasta el día 22, después de la última inyección en el día 7, la recuperación de peso corporal es más lenta en los ratones C57 tratados con Fc-OB en comparación con los ratones tratados con OB. Esto sugiere que la proteína Fc-OB no se aclara tan rápidamente como la proteína OB, por lo que provoca un efecto extendido de pérdida de peso.

EJEMPLO 3 : Respuesta a la dosis er. ratones CF7 tratados con proteína de fusión Fc-OB Un estudio adicional demostró que existe una respuesta relacionada con la dosis a la administración continua de proteína Fc-OB. En este estudio, a ratones CF57 obesos, que pesan 35-40 g se les administró proteína Fc-OB humana recombinante utilizando métodos similares a los del ejemplo anterior. Los resultados se presentan en la tabla 3 a continuación (con % de peso corporal perdido en comparación con la línea de base, medido como en lo anterior) : Tabla 3 Respuesta a la dosis con administración continua Dosis Tiempo % de reducción en el peso corporal 0.25 mg/kg/día día 5 0.5 mg/kg/día día 5 12 1 mg/kg/día día 5 16 Como se puede ver, un incremento de la dosis desde 0.25 mg/kg/día a 1 mg/kg/día incrementa la pérdida de peso de 4% a 16%. También es notable que en el día 5, la dosificación de 1 mg/kg/día resulta en una reducción de 16% en el peso corporal. Estos estudios también muestran velocidades lentas de recuperación de peso hasta 0%, lo que sugiere que la proteína Fc-OB no es aclarada rápidamente, por lo que provoca un efecto prolongado de pérdida de peso.

EJEMPLO 4 : Farmacocinética de Fc-OB humana recombinante en ratones CDl y en perros Este estudio demuestra las propiedades farmacocinéticas de la proteína met Fc-OB humana recombinante en ratones CDl y perros. Después de la dosificación intravenosa o subcutánea, a 1 mg/kg/día, se determinaron las concentraciones séricas de proteína met Fc-OB humana recombinante y proteína met OB humana mediante un ensayo inmunosorbente unido a enzima (ELISA) . En ambas especies, se observó un incremento en la exposición, cuantificado por concentraciones séricas pico más elevadas y áreas más grandes bajo la curva de la concentración sérica (AUC) , cuando se comparación con la proteína OB met-humana recombinante. Fc-OB tiene un aclaramiento sistémico menor en comparación con la proteína OB met-humana recombinante. Esto se observa en el aclaramiento más lento y la vida media más prolongada de Fc-OB con respecto a la proteína OB . El incremento en el tamaño provoca no solo un incremento en la estabilidad de la proteína, sino también una disminución en la eficiencia de aclaramiento renal. Como resultado, Fc-OB se aclara más lentamente de la circulación sistémica. Los incrementos en el tiempo pico, las concentraciones séricas pico y la AUC para la proteína Fc-OB son consistentes con un aclaramiento menor. La proteína Fc-OB producirá una exposición sistémica sustancialmente mayor cuando se compara con la proteína OB. Los resultados se muestran en la tabla 4 a continuación: Tabla 4 Propiedades Farmacocinéticas EJEMPLO 5: Este ejemplo demuestra que en ratones normales los cuales no son obesos y no tienen concentraciones elevadas de lípidos en sangre, la administración que la proteína Fc-OB recombinante humana resulta en una disminución de las concentraciones de colesterol, glucosa y triglicéridos. Además, este ejemplo demuestra que estas concentraciones permanecen bajas durante un período de recuperación de tres días. A ratones CDl normales se les administró proteína Fc-OB humana recombinante vía inyecciones subcutáneas. Se tomaron muestras de sangre 24 horas después del día 23, el último día de inyección. Como se discute en lo anterior, los animales perdieron pesos a las dosificaciones administradas. Como se muestra en la tabla 5, los ratones presentaron una reducción sustancial del colesterol sérico, glucosa y triglicéridos de una manera dependiente de la dosis cuando se comparan con los controles: Tabla 5 Estos datos demuestran que la proteína Fc-OB o análogos o derivados de la misma son agentes efectivos para disminuir los lípidos en sangre.

EJEMPLO 6: A un paciente humano obeso se administra proteína Fc-OB humana o un análogo o derivado con el propósito de reducción de peso. El paciente obeso también presenta concentraciones elevadas de lípidos en sangre, que • incluyen concentraci?mes elevadas de colesterol, superiores a 200 mg/100 ml . El paciente obtiene una reducción de peso satisfactoria durante el curso de la terapia con Fc-OB. Una dosis de mantenimiento de proteína Fc-OB o análogo o derivado, se administra al paciente no obeso para mantener concentraciones disminuidas de lípidos sanguíneos, incluyendo concentraciones disminuidas de colesterol, inferiores a 200 mg/100 ml . La dosis administrada es insuficiente para que resulte en pérdida de peso adicional. La administración es crónica. Se pueden monitorear las concentraciones de proteína Fc-OB circulante o análogo o derivado utilizando un equipo de diagnóstico, tal como un ensayo de anticuerpo contra la proteína OB (u otra fuente antigénica, si es aplicable) .

EJEMPLO 7 Un paciente humano no obeso experimenta cirugía de derivación coronaria u otro tratamiento invasivo para aliviar etapas avanzadas de formación de placa arterial. Después de la cirugía se administra al paciente una dosis de mantenimiento de proteína Fc-OB o un análogo o derivado con el fin de evitar la formación nuevamente de placa arterial . La dosis administrada es insuficiente para que resulte en pérdida de peso. La administración es crónica. Las concentraciones de proteína Fc-OB circulante o análogo o derivado se pueden monitorear utilizando un equipo de diagnóstico, tal como un ensayo de anticuerpos contra la proteína OB (u otra fuente antigénica, sí es aplicable) .

EJEMPLO 8: Un paciente humano no obeso experimenta hipertensión debido a flujo sanguíneo restringido de arterias obturadas. Al paciente se le administra una dosis de proteína Fc-OB o un análogo o derivado del mismo suficiente para reducir la placa arterial que resulta en arterias obturadas. Posteriormente, se monitorea al paciente para formación posterior de placa arterial, e hipertensión. Si vuelve a aparecer la condición, se vuelve a administrar al paciente una cantidad efectiva de proteína Fc-OB, análogo o derivado suficiente para restablecer el flujo sanguíneo, aunque insuficiente para que resulte en pérdida de peso. Las concentraciones de proteína Fc-OB circulante o análogo o derivado se pueden monitorear utilizando un equipo de diagnóstico, tal como un ensayo de anticuerpos contra la proteína Fc-OB (u otra fuente antigénica, si es aplicable) .

EJEMPLO 9: Un paciente humano presenta cálculos biliares. Los cálculos biliares no se remueven y se busca evitar la formación de cálculos biliares adicionales, o los cálculos biliares se remueven, pero permanece la vesícula biliar (por ejemplo, utilizando cirugía láser o ultrasónica) y se busca evitar la formación de cálculos biliares . adicionales . Al paciente se le administra una cantidad efectiva de proteína Fc-OB, análogo o derivado del mismo que resulta en la prevención de acumulación de cálculos biliares adicionales o reacumulación de cálculos biliares. Se pueden monitorear las concentraciones de proteína Fc-OB circulante o análogo o derivado, utilizando un equipo de diagnóstico, tal como un ensayo de anticuerpo contra la proteína Fc-OB (u otra fuente antigénica, si es aplicable) .

EJEMPLO 10: Un paciente humano diabético desea utilizar dosificaciones disminuidas de insulina para tratamiento de diabetes. Al paciente se le administra una cantidad efectiva de proteína Fc-OB análogo o derivado del mismo que resulta en un incremento en la masa tisular magra. Se incrementa la sensibilidad del paciente a la insulina y disminuye la dosificación de insulina necesaria para aliviar los síntomas de diabetes, ya sea en términos de una disminución en las unidades de insulina necesaria, o en términos de una disminución en la cantidad de inducciones de insulina necesarias por día. Se pueden monitorear las concentraciones de proteína Fc-OB circulante o análogo o derivado utilizando un equipo de diagnóstico, tal como un ensayo de anticuerpo contra la proteína OB (u otra fuente antigénica, si es aplicable) .

EJEMPLO 11: Un paciente humano no obeso desea un incremento en la masa tisular magra para propósitos terapéuticos, tales como recuperación de una enfermedad en la cual se ha suprimido la masa tisular magra. Al paciente se le administra una cantidad efectiva de proteína Fc-OB, análogo o derivado del mismo, que resulta en un incremento deseado en la masa tisular magra. El incremento en la masa tisular magra se monitorea utilizando exploración DEXA. Se pueden monitorear las concentraciones de proteína Fc-OB circulante o análogo derivado utilizando un equipo de diagnóstico, tal como un ensayo de anticuerpo contra la proteína OB (u otra fuente antigénica, si es aplicable) .

MATERIALES Y MÉTODOS Animales . Se utilizaron para los ejemplos anteriores ratones CDl tipo silvestre y ( +/+) C57B16. La edad de los ratones en el punto del tiempo inicial es de 8 semanas, y los animales estaban estabilizados en cuanto a peso.

Alimentación y medición de peso. A los ratones se les proporcionó alimento de roedor triturado (PMI Feeds, Inc.) en suministradores de alimento en polvo (Allentown Caging and Equipment) lo cual permite una medición más precisa y sensible en comparación con el uso de comida en bloque regular. Se mide el peso al mismo tiempo cada día (2:00 p.m.), durante el período deseado. El peso corporal en el día anterior a la inyección se define como el peso de línea de base. Los ratones utilizados pesan 18-22 gramos.

Alojamiento. Los ratones fueron alojados por separado y se mantienen bajo condiciones agradables.

Administración de proteína o vehículo. Se administró proteína (como se describe en lo siguiente) o vehículo (solución salina amortiguada cor fosfato, pH 7.4) por inyecciones subcutáneas o intravenosamente.

Controles. Los animales control fueron aquéllos a los que se les inyectó con el vehículo únicamente sin la proteína de fusión Fc-OB o la proteína OB agregada al vehículo.

Proteína. Las secuencias ID Nos, 1, 2 y 3 se establecen para el ADN y la proteína de OB recombinante de ratón (figura 1), y las secuencias ID. Nos. 4, 5 y 6 se establecen para un ADN y proteína de análogo de OB humano recombinante (Figura 2) . Como se indica en tío anterior, la proteína OB humana recombinante como la de la SEC. DE IDENT. NO: 6 tiene un residuo lisina y la posición 35 y un residuo isoleucina en la posición 74. Además, la proteína humana recombinante que se establece en Zhang et al . , Nature, supra , y en la publicación PCT WO 96/05309 (12/22/96) (ambas incorporadas como referencia, incluyendo las figuras) , y las proteínas recombinantes análogas de ratón y humanas de las figuras 1 y 2 son ilustrativas de la proteína OB la cual puede ser utilizada para formar la proteína de fusión Fc-OB de los presentes métodos de tratamiento y fabricación de un medicamento. También se pueden utilizar otras proteínas OB o Fc, o análogos o derivados de los mismos para formar la proteína de fusión Fc-OB. En la presente, el primer aminoácido de la secuencia de aminoácidos para la proteína OB recombinante se denomina como +1, y es valina, y el aminoácido en la posición -1 es metionina. El aminoácido C terminal es el número 146 (cisteína) (véanse las figuras 1 y 2) . La primera secuencia de aminoácidos para la proteína Fc-OB humana recombinante de la figura 3 se denomina como +1, y es glutamato, y el aminoácido en la posición -1 es metionina. El aminoácido en la parte C terminal es el número 378 (cisteína) . La primera secuencia de aminoácidos para la variante de proteína Fc-OB humana recombinante en la figura 4 se denomina como +1, y es glutamato, y el aminoácido en la posición -1 es metionina. El aminoácido en la parte C terminal es el número 378 (cisteína) . La primera secuencia de aminoácidos para la variante de proteína Fc-OB humana recombinante de la figura 5 se denomina como +1 y es ácido aspártico, y el aminoácido en la posición -1 es metionina. El aminoácido C terminal es el número 373 (cisteína) . La primera secuencia de aminoácidos para la variante de proteína Fc-OB humana recombinante de la figura 6 se denomina como +1 y es ácido aspártico, y el aminoácido en la posición -1 es metionina. El aminoácido C terminal es el número 373 (cisteína) .

Vector de expresión y cepa huésped El vector de expresión plasmídico utilizado es p/AMG21 (ATCC número de acceso 98113) , el cual es un derivado de pCFM1656 (ATCC número de acceso 69576) y contiene sitios de restricción apropiados para inserción de genes hacia el extremo 3 ' a partir del promotor lux PR (véase la patente de los Estados Unidos No. 5,169,318 para una descripción del sistema de expresión lux. El ADN para Fc-OB descrito en lo siguiente y mostrado en las figuras 3-6, se genera y liga en el vector de expresión pAMG21 linearizado con endonucleasas de restricción Ndel y BamHl, y se transforma en la cepa huésped E. coli, FM5. Las células E. coli FM5 se derivan en Amgen Inc., Thousand Oaks, CA a partir de la cepa E. coli K-12 (Bachmann, et al . , Bacterial. Rev. 40= 116-167 (1976)) y contiene el gen represor del fago lamda integrado cI857 (Sussman et al . , C. R. Acad. Sci. 254: 1517-1579 (1962)). La producción de vector, la transformación celular y la selección de colonia se realiza por métodos estándar (por ejemplo, Sambrook, et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a. Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) . Las células huésped se hacen crecer en medio LB .

Construcción del ADN para Fc-OB El plásmido pFc-A3 (descrito posteriormente) sirve como la fuente de la secuencia para la cadena pesada de IgG-1 de inmunoglobulina humana desde el aminoácido número 99 (Glu) hasta la parte carboxi terminal natural. La secuencia IgG-1 humana se puede obtener de Genebank (P01857) .

La secuencia OB humana se describe en lo anterior así como Zhang et al . , Nature supra , y la publicación PCT WO 96/05309, ambas incorporadas como referencia, incluyendo los dibujos. El ADN para OB se liga en el vector de expresión pCFM1656 linealizado con endonuclesas de restricción Xbal y BamHl utilizando procedimientos de clonación estándar, por ejemplo, Sambrook, et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a. Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.. El plásmido pCFM1656 que presenta la secuencia de ADN para OB sirve como la fuente de secuencia para el gen OB humano recombinante. La fusión genética de estas dos secuencias se lleva a cabo por el método de extensión de superposición por PCR (Ho, S.N., et al . , Site Directed Mutaaenesis Bv Overlap Extensión Usina The Polymerase Chain Reaction, Gene 77:51-59 (1989)). El producto de la PCR se separa con endonucleasa de restricción Ndel para generar un extremo 5 ' cohesivo y con endonucleasa de restricción BamHl para crear una parte 3' terminal cohesiva. El vector, pAMG21, se separa de manera similar. Se realiza una ligación con el fragmento de fusión y el vector linealizado. El ADN ligado se transforma por electroporación en la cepa huésped de E. coli . Se verificaron clonas supervivientes en cajas de ágar de selección con canamicina (50 µg/ml) para determinar la expresión de proteína dimensionada en Fc-OB. Se aislan plásmidos de clonas individuales y se verifica la secuencia de la región codificante del gen. Cuando se desean modificaciones adicionales del gen para Fc-OB, se utiliza nuevamente la técnica PCR para realizar los cambios. Se realizaron dos conjuntos de cambios en la parte N terminal de la porción Fc de la proteína de fusión (SEC. DE IDENT. NO: 9) para generar las variantes SEC. DE IDENT. NO: 12 y 15. Se construye otra variante para introducir cuatro sustituciones de aminoácidos para suprimir el sitio de unión de receptor Fc (leucina en la posición 15 sustituida con glutamato) y el sitio de unión de complemento (Clq) (glutamato en la posición 98 sustituido con alanina, lisina en la posición 100 sustituido con alanina, y lisina en la posición 102 sustituido con alanina (véase Xin Xiao Zheng et . al, J. Immunol . 154 : 5590-5600 (1995) ) . La plantilla para esta construcción es la SEC. DE IDENT. NO: 15 y la variante que resulta en la SEC. DE IDENT. NO: 18.

Construcción del vector pFC-A3 Un plásmido, pFc-A3, que contiene la región que codifica para la porción Fc de la cadena pesada de IgG-1 de inmunoglobulina humana (véase Ellison, J. W. et al, Nucleic Acids Res. 10.:4071-4079 (1982)), a partir del primer aminoácido Glu- 9 del dominio de bisagra, hacia la parte carboxilo terminal más un sitio de fusión 5 ' -Notl y sitios 3 ' -Salí y Xbal, se fabrica por amplificación por PCR de la biblioteca de ADNc de bazo humano. Las reacciones por PCR se realizaron en un volumen final de 100 ml y se utilizan dos unidades de ADN polimerasa Vent en Tris-HCl 20 mM (pH 8.8), KCl 10 mM, (NH4)2S04 10 mM, MgS04 2 mM, Tritón X-100 0.1% con 400 mM de cada uno de dNTP y 1 ng de la biblioteca de ADNc que se va a amplificar junto con 1 µM de cada cebador. Las reacciones se inician por desnaturalización a 95 °C durante 2 min, seguido por 30 ciclos de 95°C durante 30 s, 55°C durante 30 s, y 73 °C durante 2 min. El cebador 5' incorporada un sitio Notl inmediatamente 5' respecto al primer residuo (Glu- 99) del dominio de bisagra de IgG-1. El cebador 3' incorpora los sitios Salí y Xbal. El producto de PCR de 717 pares de base se digiere con Notl y Salí, el fragmento de ADN resultante se aisla por electroforesis a través de agarosa 1% y se purifica y clona en vector KS pBluescript II digerido con Notl, Salí (Stratagene) . Se establece la secuencia del inserto en el plásmido resultante, pFc-A3, para confirmar la fidelidad de la reacción por PCR.

Métodos para producción Se han utilizado los oiétodos siguientes para producción, para producir metionilraurina recombinante biológicamente activo o proteína OB análoga humana y proteínas de fusión Fc-OB. Se pueden utilizar métodos similares para preparar proteína OB humana metionilo biológicamente activa.

Proceso de fermentación Se utiliza un proceso de fermentación en lotes. Las composiciones del medio se establecen a continuación. Se esteriliza una porción del medio que consiste principalmente de fuentes de nitrógeno (al incrementar la temperatura a 120~123°C durante 25~35 minutos) en un recipiente de fermentación. Al dejar enfriar, se agregan asépticamente, carbono, fosfato de magnesio y fuentes de metales en trazas.

Se agrega al fermentador un cultivo durante la noche de las bacterias productoras de proteínas de ratón recombinantes anteriores de 500 ml (que crecieron en caldo LB) . Cuando la densidad óptica del cultivo (medida a 600 nm como un indicador para la densidad celular) alcanza 15~25 unidades de absorción, se agrega una solución autoinductora (0.5 mg/ml de homoserina lactona) (1 ml/l) al cultivo para inducir expresión del gen recombinante. Se permite que continúe el proceso de fermentación durante 10 a 16 horas adicionales, seguido por recolección del caldo por centrifugación.

Composición del medio: Lote: 34 g/l Extracto de levadura 78 g/l Peptona soya 0.9 g/l Cloruro de potasio 5.0 g/l Hexafos 1.7 g/l Ácido cítrico 120 g/l Glicerol 0.5 g/l MgS04-7H20 0.2 ml/l Solución de metales en trazas 0.5 ml/l Antiespumante P2000 Solución de metales en trazas: Cloruro férrico (FeCl3 • 6H20) : 27 g/l Cloruro de zinc (ZnCl2-4H20) : 2 g/l Cloruro de cobalto (CoCl2 • 6H20) : 2 g/l Molibdato de sodio (NaMo04 • 2H20) : 2 g/l Cloruro de calcio (CaCl2-2H20) : 1 g/l Sulfato cúprico (CuS04 • 5H20) : 1.9 g/l Ácido bórico (H3B03) : 0.5 g/l Cloruro de manganeso (MnCl2 -4H20) : 1.6 g/l Citrato de sodio dihidratado: 73.5 g/l Proceso de purificación para la proteína de fusión Fc- OB humana La purificación para la proteína de fusión Fc-OB humana se lleva a cabo por las etapas a continuación (a menos que se indique de otra manera, las siguientes etapas se realizaron a 4°C). La purificación de proteína OB de ratón y humana se describe en la publicación CPT WO 96/05309, supra , incorporado en la presente como referencia. 1. Pasta celular. Se suspende la pasta de células E. coli en 5 veces el volumen de agua destilada. Las células en el agua se rompen adicionalmente por dos pasos a través de un microfluidizador . Las células rotas se centrifugan a 4.2k rpm durante 1 hora en una centrífuga Beckman JB-6 con un rotor J5-4.2. 2. Lavado de cuerpos de inclusión. El sobrenadante de lo anterior se remueve y el sedimento se resuspende con 5 volúmenes de agua destilada. La mezcla se centrifuga como en la etapa 1. 3. Solubilización. El sedimento se solubiliza con 10 volúmenes de Tris 50 mM, pH 8.5, clorhidrato de guanidina 8 M, ditiotreitol 10 mM y se agita durante 1 hora a temperatura ambiente. La solución se vuelve con diclorhidrato de cistamina 40 mM y se agita durante 1 hora. 4. La solución de la etapa 3 se agrega a 20 a volúmenes de la siguiente solución de repliegue: Tris 50 mM, pH 8.5, arginina 0.8 M, urea 2 M y cisteína 4 mM. El repliegue se agita durante 16 horas a 8°C.

. Amortiguador de intercambio. La solución de la etapa 4 se concentra y se somete a vía filtración en Tris 10 mM, pH 8.5. 6. Precipitación acida. Se ajusta la solución de la etapa 5 a pH 4.75 con ácido glacial 50% y se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente. La solución se filtra. 7. Cromatografía de intercambio catiónico. La solución de la etapa 6 se ajusta a pH 7.0 y se carga en una columna de flujo rápido de Sepharose CM a 10°C. Se realiza un gradiente de 30 volúmenes de columna a fosfato 10 mM, pH 7.0, NaCl 0 a 0.1 M. 8. Cromatografía de intercambio aniónico. El acumulado de elusión CM de la etapa 7 se diluye 5 veces con Tris 5 mM, pH 7.5, y se carga en flujo rápido de Sepharose Q a 10 °C. Se realiza un gradiente de 20 volúmenes de columna a Tris 10 mM, pH 7.5, NaCl 0 a 0.2 M. 9. Cromatografía de interacción hidrofóbica. El acumulado de Sepharose Q se realiza con sulfato de amonio 0.75 M y se carga en una columna de interacción hidrofóbica metil Macroprep a temperatura ambiente. Se realiza un gradiente de 20 volúmenes de columna a fosfato 10 mM, pH 7.0, sulfato de amonio 0.75 M a 0 M. 10. Intercambio de amortiguador, se concentra el acumulado de la etapa 9 según sea necesario y se dializa contra amortiguador PBS.

Aunque la presente invención se ha descrito en término de las modalides preferidas, se entiende que se le pueden ocurrir variaciones y modificaciones a aquéllos familiarizados con la técnica. Por lo tanto, se pretende que las reivindicaciones anexas abarquen la totalidad de tales variaciones equivalentes las cuales se encuentren dentro del alcance de la invención como se reivindica.

LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: Mann, Michael B. Hecht, Randy I. (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: COMPOSICIONES DE PROTEÍNA DE FUSIÓN OB Y MÉTODOS (iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 18 (iv) DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO: Amgen Inc. (B) CALLE: 1840 DeHavilland Drive (C) CIUDAD: Thousand Oaks (D) ESTADO: CA (E) PAÍS: EUA (F) Zona Postal: 91320-1789 (v) FORMA LEÍBLE DE LA COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disco flexible (B) COMPUTADORA: IBM PC Compatible (C) SISTEMA OPERANTE: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE O PROGRAMA: Patent In Reléase #1.0, Versión #1.30 (vi) DATOS DE SOLICITUD ACTUALES: (A) NUMERO DE SOLICITUD: US 08/770,973 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 20 DE DICIEMBRE DE 1996 (C) CLASIFICACIÓN: (viii) ABOGADO/INFORMACIÓN DEL AGENTE: (A) NOMBRE: Knight , Matthew W. (B) NÚMERO DE REGISTRO: 36,846 (C) REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: A-416 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO : 1 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 491 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE : misc_feature (B) LOCALIZACIÓN: 41 (D) OTRA INFORMACIÓN: /note= "Met = ATG" (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO : 1 : TCTAGATTTG AGTTTTAACT TTTAGAAGGA GGAATAACAT ATGGTACCGA TCCAGAAAGT 60 TCAGGACGAC ACCAAAACCT TAATTAAAAC GATCGTTACG CGTATCAACG ACATCAGTCA 120 CACCCAGTCG GTCTCCGCTA AACAGCGTGT TACCGGTCTG GACTTCATCC CGGGTCTGCA 180 CCCGATCCTA AGCTTGTCCA AAATGGACCA GACCCTGGCT GTATACCAGC AGGTGTTAAC 240 CTCCCTGCCG TCCCAGAACG TTCTTCAGAT CGCTAACGAC CTCGAGAACC TTCGCGACCT 300 GCTGCACCTG CTGGCATTCT CCAAATCCTG CTCCCTGCCG CAGACCTCAG GTCTTCAGAA 360 ACCGGAATCC CTGGACGGGG TCCTGGAAGC ATCCCTGTAC AGCACCGAAG TTGTTGCTCT 420 GTCCCGTCTG CAGGGTTCCC TTCAGGACAT CCTTCAGCAG CTGGACGTTT CTCCGGAATG 480 TTAATGGATC C . (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO : 2 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 491 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO : 2 : AGATCTAAAC TCAAAATTGA AAATCTTCCT CCTTATTGTA TACCATGGCT AGGTCTTTCA 60 AGTCCTGCTG TGGTTTTGGA ATTAATTTTG CTAGCAATGC GCATAGTTGC TGTAGTCAGT 120 GTGGGTCAGC CAGAGGCGAT TTGTCGCACA ATGGCCAGAC CTGAAGTAGG GCCCAGACGT 180 GGGCTAGGAT TCGAACAGGT TTTACCTGGT CTGGGACCGA CATATGGTCG TCCACAATTG 240 GAGGGACGGC AGGGTCTTGC AAGAAGTCTA GCGATTGCTG GAGCTCTTGG AAGCGCTGGA 300 CGACGTGGAC GACCGTAAGA GGTTTAGGAC GAGGGACGGC GTCTGGAGTC CAGAAGTCTT 360 TGGCCTTAGG GACCTGCCCC AGGACCTTCG TAGGGACATG TCGTGGCTTC AACAACGAGA 420 CAGGGCAGAC GTCCCAAGGG AAGTCCTGTA GGAAGTCGTC GACCTGCAAA GAGGCCTTAC 480 AATTACCTAG G 491 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO : 3 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 147 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: desconocido (D) TOPOLOGÍA: desconocido (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: Proteína (B) LOCALIZACIÓN: 1 (C) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Met (ATG) empieza en -1" (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO : 3 : Met Val Pro lie Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu lie Lys 1 5 10 15 Thr lie Val Thr Arg lie Asn Asp lie Ser His Thr Gln Ser Val Ser 20 25 30 Ala Lys Gln Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe lie Pro Gly Leu His Pro 35 40 45 lie Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val Tyr Gln Gln 5 50 55 60 Val Leu Thr Ser Leu Pro Ser Gln Asn Val Leu Gln lie Ala Asn Asp 65 70 75 80 lOLeu Glu Asn leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala Phe Ser Lys Ser 85 90 95 Cys Ser Leu Pro Gln Thr Ser Gly Leu Gln Lys Pro Glu Ser Leu Asp 100 105 110 15 Gly Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser 115 120 125 Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp lie Leu Gln Gln Leu Asp Val Ser 20 130 135 140 Pro Glu Cys 145 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO : 4 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 454 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE : misc_feature (B) LOCALIZACIÓN: 4 (C) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Met = ATG" (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. ÑO:4: CATATGGTAC CGATCCAGAA AGTTCAGGAC GACACCAAAA CCTTAATTAA AACGATCGTT 60 ACGCGTATCA ACGACATCAG TCACACCCAG TCGGTGAGCT CTAAACAGCG TGTTACAGGC 120 CTGGACTTCA TCCCGGGTCT GCACCCGATC CTGACCTTGT CCAAAATGGA CCAGACCCTG 180 GCTGTATACC AGCAGATCTT AACCTCCATG CCGTCCCGTA ACGTTCTTCA GATCTCTAAC 240 GACCTCGAGA ACCTTCGCGA CCTGCTGCAC GTGCTGGCAT TCTCCAAATC CTGCCACCTG 300 CCATGGGCTT CAGGTCTTGA GACTCTGGAC TCTCTGGGCG GGGTCCTGGA AGCATCCGGT 360 TACAGCACCG AAGTTGTTGC TCTGTCCCGT CTGCAGGGTT CCCTTCAGGA CATGCTTTGG 420 CAGCTGGACC TGTCTCCGGG TTGTTAATGG ATCC 454 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO : 5 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 454 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO : 5 : GTATACCATG GCTAGGTCTT TCAAGTCCTG CTGTGGTTTT GGAATTAATT TTGCTAGCAA 60 TGCGCATAGT TGCTGTAGTC AGTGTGGGTC AGCCACTCGA GATTTGTCGC ACAATGTCCG 120 GACCTGAAGT AGGGCCCAGA CGTGGGCTAG GACTGGAACA GGTTTTACCT GGTCTGGGAC 180 CGACATATGG TCGTCTAGAA TTGGAGGTAC GGCAGGGCAT TGCAAGAAGT CTAGAGATTG 240 CTGGAGCTCT TGGAAGCGCT GGACGACGTG CACGACCGTA AGAGGTTTAG GACGGTGGAC 300 GGTACCCGAA GTCCAGAACT CTGAGACCTG AGAGACCCGC CCCAGGACCT TCGTAGGCCA 360 ATGTCGTGGC TTCAACAACG AGACAGGGCA GACGTCCCAA GGGAAGTCCT GTACGAAACC 420 GTCGACCTGG ACAGAGGCCC AACAATTACC TAGG 454 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO : 6 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 147 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: desconocido (D) TOPOLOGÍA: desconocido (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: Proteína (B) LOCALIZACIÓN: 1 (C) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Met (ATG) empieza en -1" (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT . NO : 6 : Met Val Pro lie Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu lie Lys 1 5 10 15 Thr lie Val Thr Arg lie Asn Asp lie Ser His Thr Gln Ser Val Ser 20 25 30 Ser Lys Gln Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe lie Pro Gly Leu His Pro 35 40 45 lie Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val Tyr Gln Gln 50 55 60 lie Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val Leu Gln lie Ser Asn Asp 65 70 75 80 Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser 85 90 95 Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly 100 105 110 Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser 115 120 125 Arg Leu Gln Gly Ser leu Gln Asp Met Leu Trp Gln Leu Asp Leu Ser 130 135 140 Pro Gly Cys 145 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO : 7 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1150 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) LOCALIZACIÓN: 4 (C) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Met = ATG" (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO : 7 : CATATGGAAC CCAAATCTTG TGACAAAACT CACACATGCC CACCGTGCCC AGCACCTGAA 60 CTCCTGGGGG GACCGTCAGT CTTCCTCTTC CCCCCAAAAC CCAAGGACAC CCTCATGATC 120 TCCCGGACCC CTGAGGTCAC ATGCGTGGTG GTGGACGTGA GCCACGAAGA CCCTGAGGTC 180 AAGTTCAACT GGTACGTGGA CGGCGTGGAG GTGCATAATG CCAAGACAAA GCCGCGGGAG 240 GAGCAGTACA ACAGCACGTA CCGTGTGGTC AGCGTCCTCA CCGTCCTGCA CCAGGACTGG 300 CTGAATGGCA AGGAGTACAA GTGCAAGGTC TCCAACAAAG CCCTCCCAGC CCCCATCGAG 360 AAAACCATCT CCAAAGCCAA AGGGCAGCCC CGAGAACCAC AGGTGTACAC CCTGCCCCCA 420 TCCCGGGATG AGCTGACCAA GAACCAGGTC AGCCTGACCT GCCTGGTCAA AGGCTTCTAT 480 CCCAGCGACA TCGCCGTGGA GTGGGAGAGC AATGGGCAGC CGGAGAACAA CTACAAGACC 540 ACGCCTCCCG TGCTGGACTC CGACGGCTTC TTCTTCCTCT ACAGCAAGCT CACCGTGGAC 600 AAGAGCAGGT GGCAGCAGGG GAACGTCTTC TCATGCTCCG TGATGCATGA GGCTCTGCAC 660 AACCACTACA CGCAGAAGAG CCTCTCCCTG TCTCCGGGTA AAGTACCGAT CCAGAAAGTT 720 CAGGACGACA CCAAAACCTT AATTAAAACG ATCGTTACGC GTATCAACGA CATCAGTCAC 780 ACCCAGTCGG TGAGCTCTAA ACAGAAAGTT ACAGGCCTGG ACTTCATCCC GGGTCTGCAC 840 CCGATCCTGA CCTTGTCCAA AATGGACCAG ACCCTGGCTG TATACCAGCA GATCTTAACC 900 TCCATGCCGT CCCGTAACGT TATCCAGATC TCTAACGACC TCGAGAACCT TCGCGACCTG 960 CTGCACGTGC TGGCATTCTC CAAATCCTGC CACCTGCCAT GGGCTTCAGG TCTTGAGACT 102 CTGGACTCTC TGGGCGGGGT CCTGGAAGCA TCCGGTTACA GCACCGAAGT TGTTGCTCTG 108 TCCCGTCTGC AGGGTTCCCT TCAGGACATG CTTTGGCAGC TGGACCTGTC TCCGGGTTGT 114 TAATGGATCC 115 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO : 8 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1150 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO : 8 GTATACCTTG GGTTTAGAAC ACTGTTTTGA GTGTGTACGG GTGGCACGGG TCGTGGACTT 6 GAGGACCCCC CTGGCAGTCA GAAGGAGAAG GGGGGTTTTG GGTTCCTGTG GGAGTACTAG 12 AGGGCCTGGG GACTCCAGTG TACGCACCAC CACCTGCACT CGGTGCTTCT GGGACTCCAG 18 TTCAAGTTGA CCATGCACCT GCCGCACCTC CACGTATTAC GGTTCTGTTT CGGCGCCCTC 24 CTCGTCATGT TGTCGTGCAT GGCACACCAG TCGCAGGAGT GGCAGGACGT GGTCCTGACC 30 GACTTACCGT TCCTCATGTT CACGTTCCAG AGGTTGTTTC GGGAGGGTCG GGGGTAGCTC 36 TTTTGGTAGA GGTTTCGGTT TCCCGTCGGG GCTCTTGGTG TCCACATGTG GGACGGGGGT 42 AGGGCCCTAC TCGACTGGTT CTTGGTCCAG TCGGACTGGA CGGACCAGTT TCCGAAGATA 48 GGGTCGCTGT AGCGGCACCT CACCCTCTCG TTACCCGTCG GCCTCTTGTT GATGTTCTGG 54 TGCGGAGGGC ACGACCTGAG GCTGCCGAGG AAGAAGGAGA TGTCGTTCGA GTGGCACCTG 60 TTCTCGTCCA CCGTCGTCCC CTTGCAGAAG AGTACGAGGC ACTACCTACT CCGAGACGTG 66 TTGGTGATGT GCGTCTTCTC GGAGAGGGAC AGAGGCCCAT TTCATGGCTA GGTCTTTCAA 72 GTCCTGCTGT GGTTTTGGAA TTAATTTTGC TAGCAATGCG CATAGTTGCT GTAGTCAGTG 78 TGGGTCAGCC ACTCGAGATT TGTCTTTCAA TGTCCGGACC TGAAGTAGGG CCCAGACGTG 84 GGCTAGGACT GGAACAGGTT TTACCTGGTC TGGGACCGAC ATATGGTCGT CTAGAATTGG 90 AGGTACGGCA GGGCATTGCA ATAGGTCTAG AGATTGCTGG AGCTCTTGGA AGCGCTGGAC 96 GACGTGCACG ACCGTAAGAG GTTTAGGACG GTGGACGGTA CCCGAAGTCC AGAACTCTGA 102 GACCTGAGAG ACCCGCCCCA GGACCTTCGT AGGCCAATGT CGTGGCTTCA ACAACGAGAC 108 AGGGCAGACG TCCCAAGGGA AGTCCTGTAC GAAACCGTCG ACCTGGACAG AGGCCCAACA 114 ATTACCTAGG 115 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO : 9 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 379 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: desconocido (D) TOPOLOGÍA: desconocido iii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína i ix) CARACTERÍSTICAS : (A) NOMBRE/CLAVE: Proteína (B) LOCALIZACIÓN: 1 (C) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Met (ATG) empieza en -1" (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO : 9 : Met Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 20 25 30 Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 35 40 45 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 50 55 60 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 65 70 75 80 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 85 90 95 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 100 105 110 Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gln 115 120 125 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 130 135 140 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 5145 150 155 160 Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 165 170 175 lOTyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 180 185 190 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 195 200 205 15 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 210 215 220 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Val Pro lie Gln Lys Val Gln 20225 230 235 240 Asp Asp Thr Lys Thr Leu lie Lys Thr lie Val Thr Arg lie Asn Asp 245 250 255 25Ile Ser His Thr Gln Ser Val Ser Ser Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu 260 265 270 Asp Phe lie Pro Gly Leu His Pro lie Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp 275 280 285 Gln Thr Leu Ala Val Tyr Gln Gln lie Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg 290 295 300 Asn Val lie Gln lie Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu 305 310 315 320 His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly 325 330 335 Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr 340 345 350 Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp 355 360 365 Met Leu Trp Gln Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cys 370 375 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO: 10 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1150 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) LOCALIZACIÓN: 4 (C) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Met = ATG" (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT . NO:10: CATATGGAAC CAAAATCTGC TGACAAAACT CACACATGTC CACCTTGTCC AGCTCCGGAA 60 CTCCTGGGGG GTCCTTCAGT CTTCCTCTTC CCCCCAAAAC CCAAGGACAC CCTCATGATC 120 TCCCGGACCC CTGAGGTCAC ATGCGTGGTG GTGGACGTGA GCCACGAAGA CCCTGAGGTC 180 AAGTTCAACT GGTACGTGGA CGGCGTGGAG GTGCATAATG CCAAGACAAA GCCGCGGGAG 240 GAGCAGTACA ACAGCACGTA CCGTGTGGTC AGCGTCCTCA CCGTCCTGCA CCAGGACTGG 300 CTGAATGGCA AGGAGTACAA GTGCAAGGTC TCCAACAAAG CCCTCCCAGC CCCCATCGAG 36 AAAACCATCT CCAAAGCCAA AGGGCAGCCC CGAGAACCAC AGGTGTACAC CCTGCCCCCA 42 TCCCGGGATG AGCTGACCAA GAACCAGGTC AGCCTGACCT GCCTGGTCAA AGGCTTCTAT 48 CCCAGCGACA TCGCCGTGGA GTGGGAGAGC AATGGGCAGC CGGAGAACAA CTACAAGACC 54 ACGCCTCCCG TGCTGGACTC CGACGGCTCC TTCTTCCTCT ACAGCAAGCT CACCGTGGAC 60 AAGAGCAGGT GGCAGCAGGG GAACGTCTTC TCATGCTCCG TGATGCATGA GGCTCTGCAC 66 AACCACTACA CGCAGAAGAG CCTCTCCCTG TCTCCGGGTA AAGTACCGAT CCAGAAAGTT 72 CAGGACGACA CCAAAACCTT AATTAAAACG ATCGTTACGC GTATCAACGA CATCAGTCAC 78 ACCCAGTCGG TGAGCTCTAA ACAGAAAGTT ACAGGCCTGG ACTTCATCCC GGGTCTGCAC 84 CCGATCCTGA CCTTGTCCAA AATGGACCAG ACCCTGGCTG TATACCAGCA GATCTTAACC 90 TCCATGCCGT CCCGTAACGT TATCCAGATC TCTAACGACC TCGAGAACCT TCGCGACCTG 96 CTGCACGTGC TGGCATTCTC CAAATCCTGC CACCTGCCAT GGGCTTCAGG TCTTGAGACT 102 CTGGACTCTC TGGGCGGGGT CCTGGAAGCA TCCGGTTACA GCACCGAAGT TGTTGCTCTG 108 TCCCGTCTGC AGGGTTCCCT TCAGGACATG CTTTGGCAGC TGGACCTGTC TCCGGGTTGT 114 TAATGGATCC 115 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT . NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1150 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 11: GTATACCTTG GTTTTAGACG ACTGTTTTGA GTGTGTACAG GTGGAACAGG TCGAGGCCTT 6 GAGGACCCCC CAGGAAGTCA GAAGGAGAAG GGGGGTTTTG GGTTCCTGTG GGAGTACTAG 12 AGGGCCTGGG GACTCCAGTG TACGCACCAC CACCTGCACT CGGTGCTTCT GGGACTCCAG 18 TTCAAGTTGA CCATGCACCT GCCGCACCTC CACGTATTAC GGTTCTGTTT CGGCGCCCTC 24 CTCGTCATGT TGTCGTGCAT GGCACACCAG TCGCAGGAGT GGCAGGACGT GGTCCTGACC 30 GACTTACCGT TCCTCATGTT CACGTTCCAG AGGTTGTTTC GGGAGGGTCG GGGGTAGCTC 3 TTTTGGTAGA GGTTTCGGTT TCCCGTCGGG GCTCTTGGTG TCCACATGTG GGACGGGGGT 4 AGGGCCCTAC TCGACTGGTT CTTGGTCCAG TCGGACTGGA CGGACCAGTT TCCGAAGATA 4 GGGTCGCTGT AGCGGCACCT CACCCTCTCG TTACCCGTCG GCCTCTTGTT GATGTTCTGG 5 TGCGGAGGGC ACGACCTGAG GCTGCCGAGG AAGAAGGAGA TGTCGTTCGA GTGGCACCTG 6 TTCTCGTCCA CCGTCGTCCC CTTGCAGAAG AGTACGAGGC ACTACGTACT CCGAGACGTG 6 TTGGTGATGT GCGTCTTCTC GGAGAGGGAC AGAGGCCCAT TTCATGGCTA GGTCTTTCAA 7 GTCCTGCTGT GGTTTTGGAA TTAATTTTGC TAGCAATGCG CATAGTTGCT GTAGTCAGTG 7 TGGGTCAGCC ACTCGAGATT TGTCTTTCAA TGTCCGGACC TGAAGTAGGG CCCAGACGTG 8 GGCTAGGACT GGAACAGGTT TTACCTGGTC TGGGACCGAC ATATGGTCGT CTAGAATTGG 9 AGGTACGGCA GGGCATTGCA ATAGGTCTAG AGATTGCTGG AGCTCTTGGA AGCGCTGGAC 9 GACGTGCACG ACCGTAAGAG GTTTAGGACG GTGGACGGTA CCCGAAGTCC AGAACTCTGA 10 GACCTGAGAG ACCCGCCCCA GGACCTTCGT AGGCCAATGT CGTGGCTTCA ACAACGAGAC 10 AGGGCAGACG TCCCAAGGGA AGTCCTGTAC GAAACCGTCG ACCTGGACAG AGGCCCAACA 114 ATTACCTAGG 115 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO:12: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 379 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: desconocido (D) TOPOLOGÍA: desconocido (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE : Proteína (B) LOCALIZACIÓN: 1 (C) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Met (ATG) empieza en -1" (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 12: Met Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 20 25 30 Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 35 40 45 5 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 50 55 60 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 1065 70 75 80 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 85 90 95 15Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 100 105 110 Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gln 115 120 125 20 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 130 135 140 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 25145 150 155 160 Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 165 170 175 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 5 180 185 190 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 195 200 205 lOPhe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 210 215 220 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Val Pro lie Gln Lys Val Gln 225 230 235 ' * 240 Asp Asp Thr Lys Thr Leu lie Lys Thr lie Val Thr Arg lie Asn Asp 245 250 255 He Ser His Thr Gln Ser Val Ser Ser Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu 20 260 265 270 Asp Phe He Pro Gly Leu His Pro He Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp 275 280 285 25Gln Thr Leu Ala Val Tyr Gln Gln He Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg 290 295 300 Asn Val He Gln He Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu 305 310 315 320 His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly 325 330 335 Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr 340 345 350 Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp 355 360 365 Met Leu Trp Gln Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cys 370 375 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1135 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE : misc_feature (B) LOCALIZACIÓN: 4 (C) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Met = ATG" (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO:13: CATATGGACA AAACTCACAC ATGTCCACCT TGTCCAGCTC CGGAACTCCT GGGGGGTCCT 6 TCAGTCTTCC TCTTCCCCCC AAAACCCAAG GACACCCTCA TGATCTCCCG GACCCCTGAG 12 GTCACATGCG TGGTGGTGGA CGTGAGCCAC GAAGACCCTG AGGTCAAGTT CAACTGGTAC 18 GTGGACGGCG TGGAGGTGCA TAATGCCAAG ACAAAGCCGC GGGAGGAGCA GTACAACAGC 24 ACGTACCGTG TGGTCAGCGT CCTCACCGTC CTGCACCAGG ACTGGCTGAA TGGCAAGGAG 30 TACAAGTGCA AGGTCTCCAA CAAAGCCCTC CCAGCCCCCA TCGAGAAAAC CATCTCCAAA 36 GCCAAAGGGC AGCCCCGAGA ACCACAGGTG TACACCCTGC CCCCATCCCG GGATGAGCTG 42 ACCAAGAACC AGGTCAGCCT GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTATCCCAG CGACATCGCC 48 GTGGAGTGGG AGAGCAATGG GCAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACGCC TCCCGTGCTG 54 GACTCCGACG GCTCCTTCTT CCTCTACAGC AAGCTCACCG TGGACAAGAG CAGGTGGCAG 60 CAGGGGAACG TCTTCTCATG CTCCGTGATG CATGAGGCTC TGCACAACCA CTACACGCAG 66 AAGAGCCTCT CCCTGTCTCC GGGTAAAGTA CCGATCCAGA AAGTTCAGGA CGACACCAAA 72 ACCTTAATTA AAACGATCGT TACGCGTATC AACGACATCA GTCACACCCA GTCGGTGAGC 78 TCTAAACAGA AAGTTACAGG CCTGGACTTC ATCCCGGGTC TGCACCCGAT CCTGACCTTG 84 TCCAAAATGG ACCAGACCCT GGCTGTATAC CAGCAGATCT TAACCTCCAT GCCGTCCCGT 90 AACGTTATCC AGATCTCTAA CGACCTCGAG AACCTTCGCG ACCTGCTGCA CGTGCTGGCA 96 TTCTCCAAAT CCTGCCACCT GCCATGGGCT TCAGGTCTTG AGACTCTGGA CTCTCTGGGC 102 GGGGTCCTGG AAGCATCCGG TTACAGCACC GAAGTTGTTG CTCTGTCCCG TCTGCAGGGT 108 TCCCTTCAGG ACATGCTTTG GCAGCTGGAC CTGTCTCCGG GTTGTTAATG GATCC 113 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1135 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (Ü) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 14: GTATACCTGT TTTGAGTGTG TACAGGTGGA ACAGGTCGAG GCCTTGAGGA CCCCCCAGGA 6 AGTCAGAAGG AGAAGGGGGG TTTTGGGTTC CTGTGGGAGT ACTAGAGGGC CTGGGGACTC 12 CAGTGTACGC ACCACCACCT GCACTCGGTG CTTCTGGGAC TCCAGTTCAA GTTGACCATG 18 CACCTGCCGC ACCTCCACGT ATTACGGTTC TGTTTCGGCG CCCTCCTCGT CATGTTGTCG 24 TGCATGGCAC ACCAGTCGCA GGAGTGGCAG GACGTGGTCC TGACCGACTT ACCGTTCCTC 30 ATGTTCACGT TCCAGAGGTT GTTTCGGGAG GGTCGGGGGT AGCTCTTTTG GTAGAGGTTT 36 CGGTTTCCCG TCGGGGCTCT TGGTGTCCAC ATGTGGGACG GGGGTAGGGI CCTACTCGAC 42 TGGTTCTTGG TCCAGTCGGA CTGGACGGAC CAGTTTCCGA AGATAGGGTC GCTGTAGCGG 48 CACCTCACCC TCTCGTTACC CGTCGGCCTC TTGTTGATGT TCTGGTGCGG AGGGCACGAC 54 CTGAGGCTGC CGAGGAAGAA GGAGATGTCG TTCGAGTGGC ACCTGTTCTC GTCCACCGTC 60 GTCCCCTTGC AGAAGAGTAC GAGGCACTAC GTACTCCGAG ACGTGTTGGT GATGTGCGTC 66 TTCTCGGAGA GGGACAGAGG CCCATTTCAT GGCTAGGTCT TTCAKGTCCT GCTGTGGTTT 72 TGGAATTAAT TTTGCTAGCA ATGCGCATAG TTGCTGTAGT CAGTGTGGGT CAGCCACTCG 78 AGATTTGTCT TTCAATGTCC GGACCTGAAG TAGGGCCCAG ACGTGGGCTA GGACTGGAAC 84 AGGTTTTACC TGGTCTGGGA CCGACATATG GTCGTCTAGA ATTGGAGGTA CGGCAGGGCA 90 TTGCAATAGG TCTAGAGATT GCTGGAGCTC TTGGAAGCGC TGGACGACGT GCACGACCGT 96 AAGAGGTTTA GGACGGTGGA CGGTACCCGA AGTCCAGAAC TCTGAGACCT GAGAGACCCG 102 CCCCAGGACC TTCGTAGGCC AATGTCGTGG CTTCAACAAC GAGACAGGGC AGACGTCCCA 108 AGGGAAGTCC TGTACGAAAC CGTCGACCTG GACAGAGGCC CAACAATTAC CTAGG 113 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 374 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: desconocido (D) TOPOLOGÍA: desconocido (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína ( ix) CARACTERÍSTICAS : (A) NOMBRE/CLAVE : Proteína (B) LOCALIZACIÓN: 1 (C) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Met (ATG) empieza en -1 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 15: Met Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 1 5 10 15 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 20 25 30 Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 35 40 45 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 50 55 60 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 65 70 75 80 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 85 90 95 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 100 105 110 He Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 115 120 125 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 130 135 140 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val 145 150 155 160 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 165 170 175 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 180 185 190 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly As±. Val Phe Ser Cys Ser Val 195 200 205 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 210 215 220 Ser Pro Gly Lys Val Pro He Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr 5225 230 235 240 Leu He Lys Thr He Val Thr Arg He Asn Asp He Ser His Thr Gln 245 250 255 lOSer Val Ser Ser Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe He Pro Gly 260 265 270 Leu His Pro He Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val 275 280 285 15 Tyr Gln Gln He Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val He Gln He 290 295 300 Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe 20305 310 315 320 Ser Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp 325 330 335 25Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val 340 345 350 Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln Leu 355 360 365 Asp Leu Ser Pro Gly Cys 370 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1135 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (íx) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) LOCALIZACIÓN: 4 (C) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Met = ATG" (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT . NO: 16: CATATGGACA AAACTCACAC ATGCCCACCG TGCCCAGCTC CGGAACTCGA AGGTGGTCCG 6 TCAGTCTTCC TCTTCCCCCC AAAACCCAAG GACACCCTCA TGATCTCCCG GACCCCTGAG 12 GTCACATGCG TGGTGGTGGA CGTGAGCCAC GAAGACCCTG AGGTCAAGTT CAACTGGTAC 18 GTGGACGGCG TGGAGGTGCA TAATGCCAAG ACAAAGCCGC GGGAGGAGCA GTACAACAGC 24 ACGTACCGTG TGGTCAGCGT CCTCACCGTC CTGCACCAGG ACTGGCTGAA TGGCAAAGCT 30 TACGCATGCG CGGTCTCCAA CAAAGCCCTC CCAGCCCCCA TCGAGAAAAC CATCTCCAAA 36 GCCAAAGGGC AGCCCCGAGA ACCACAGGTG TACACCCTGC CCCCATCCCG GGATGAGCTG 42 ACCAAGAACC AGGTCAGCCT GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTATCCCAG CGACATCGCC 48 GTGGAGTGGG AGAGCAATGG GCAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACGCC TCCCGTGCTG 54 GACTCCGACG GCTCCTTCTT CCTCTACAGC AAGCTCACCG TGGACAAGAG CAGGTGGCAG 60 CAGGGGAACG TCTTCTCATG CTCCGTGATG CATGAGGCTC TGCACAACCA CTACACGCAG 66 AAGAGCCTCT CCCTGTCTCC GGGTAAAGTA CCGATCCAGA AAGTTCAGGA CGACACCAAA 72 ACCTTAATTA AAACGATCGT TACGCGTATC AACGACATCA GTCACACCCA GTCGGTGAGC 78 TCTAAACAGA AAGTTACAGG CCTGGACTTC ATCCCGGGTC TGCACCCGAT CCTGACCTTG 84 TCCAAAATGG ACCAGACCCT GGCTGTATAC CAGCAGATCT TAACCTCCAT GCCGTCCCGT 90 AACGTTATCC AGATCTCTAA CGACCTCGAG AACCTTCGCG ACCTGCTGCA CGTGCTGGCA 96 TTCTCCAAAT CCTGCCACCT GCCATGGGCT TCAGGTCTTG AGACTCTGGA CTCTCTGGGC 102 GGGGTCCTGG AAGCATCCGG TTACAGCACC GAAGTTGTTG CTCTGTCCCG TCTGCAGGGT 108 TCCCTTCAGG ACATGCTTTG GCAGCTGGAC CTGTCTCCGG GTTGTTAATG GATCC 113 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1135 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 17: GTATACCTGT TTTGAGTGTG TACGGGTGGC ACGGGTCGAG GCCTTGAGCT TCCACCAGGC 6 AGTCAGAAGG AGAAGGGGGG TTTTGGGTTC CTGTGGGAGT ACTAGAGGGC CTGGGGACTC 12 CAGTGTACGC ACCACCACCT GCACTCGGTG CTTCTGGGAC TCCAGTTCAA GTTGACCATG 18 CACCTGCCGC ACCTCCACGT ATTACGGTTC TGTTTCGGCG CCCTCCTCGT CATGTTGTCG 24 TGCATGGCAC ACCAGTCGCA GGAGTGGCAG GACGTGGTCC TGACCGACTT ACCGTTTCGA 30 ATGCGTACGC GCCAGAGGTT GTTTCGGGAG GGTCGGGGGT AGCTCTTTTG GTAGAGGTTT 36 CGGTTTCCCG TCGGGGCTCT TGGTGTCCAC ATGTGGGACG GGGGTAGGGC CCTACTCGAC 42 TGGTTCTTGG TCCAGTCGGA CTGGACGGAC CAGTTTCCGA AGATAGGGTC GCTGTAGCGG 48 CACCTCACCC TCTCGTTACC CGTCGGCCTC TTGTTGATGT TCTGGTGCGG AGGGCACGAC 54 CTGAGGCTGC CGAGGAAGAA GGAGATGTCG TTCGAGTGGC ACCTGTTCTC GTCCACCGTC 60 GTCCCCTTGC AGAAGAGTAC GAGGCACTAC GTACTCCGAG ACGTGTTGGT GATGTGCGTC 66 TTCTCGGAGA GGGACAGAGG CCCATTTCAT GGCTAGGTCT TTCAAGTCCT GCTGTGGTTT 72 TGGAATTAAT TTTGCTAGCA ATGCGCATAG TTGCTGTAGT CAGTGTGGGT CAGCCACTCG 78 AGATTTGTCT TTCAATGTCC GGACCTGAAG TAGGGCCCAG ACGTGGGCTA GGACTGGAAC 84 AGGTTTTACC TGGTCTGGGA CCGACATATG GTCGTCTAGA ATTGGAGGTA CGGCAGGGCA 90 TTGCAATAGG TCTAGAGATT GCTGGAGCTC TTGGAAGCGC TGGACGACGT GCACGACCGT 96 AAGAGGTTTA GGACGGTGGA CGGTACCCGA AGTCCAGAAC TCTGAGACCT GAGAGACCCG 102 CCCCAGGACC TTCGTAGGCC AATGTCGTGG CTTCAACAAC GAGACAGGGC AGACGTCCCA 108 AGGGAAGTCC TGTACGAAAC CGTCGACCTG GACAGAGGCC CAACAATTAC CTAGG 1135 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO: 18: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 374 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: desconocido (D) TOPOLOGÍA: desconocido (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: Proteína (B) LOCALIZACIÓN: 1 (C) OTRA INFORMACIÓN: /nota= "Met (ATG) empieza en -1" (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO:18: Met Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Glu 1 5 10 15 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 20 25 30 Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 35 40 45 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tvr Val Asp Gly Val Glu 50 55 60 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 65 70 75 80 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn 85 90 95 Gly Lys Ala Tyr Ala Cys Ala Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 100 105 110 He Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 115 120 125 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 130 135 140 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val 5145 150 155 160 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 165 170 175 0Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 180 185 190 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 195 200 205 5Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 210 215 220 Ser Pro Gly Lys Val Pro He Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr 225 230 235 240 0 He He Lys Thr He Val Thr Arg He Asn Asp He Ser His Thr Gln 245 250 255 Ser Val Ser Ser Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe He Pro Gly 5 260 265 270 Leu His Pro He Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val 275 280 285 Tyr Gln Gln He Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val He Gln He 5 290 295 300 Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe 305 310 315 320 lOSer Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp 325 330 335 Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val 340 345 350 15Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln Leu 355 360 365 Asp Leu Ser Pro Gly Cys 370

Claims (19)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Una proteína, caracterizada porque tiene una fórmula que se selecciona del grupo que consiste de : Rx -R2 y R-L - L - R2, en donde Rx es una proteína Fc o un análogo de la misma, R2 es una proteína OB o un análogo de la misma, y L es un enlazador. 2. La proteína de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque en el Fc, el análogo o derivado se selecciona del grupo que consiste de : (a) la secuencias de aminoácidos de Fc como se establecen en las SEC. DE IDENT. NO: 9, 12, 15 y 18; (b) la secuencia de aminoácidos de la subparte (a) que tiene un aminoácido diferente sustituido o suprimido en una o más de las siguientes posiciones (utilizando la numeración de acuerdo con la SEC. DE IDENT.

NO: 9) : (i) uno o más residuos cisteína sustituidos por un residuo alanina o serina; (ii) uno o más residuos tirosina sustituidos por un residuo fenilalanina; (iii) el aminoácido en la posición 5 sustituido con una alanina; (iv) el aminoácido en la posición 20 sustituido con glutamato; (v) el aminoácido en la posición 103 sustituido con una alanina; (vi) el aminoácido en la posición 105 sustituido con una alanina; (vii) el aminoácido en la posición 107 sustituido con una alanina; (viii) los aminoácidos en las posiciones 1, 2, 3, 4 ó 5 suprimidos ; (ix) uno o más residuos sustituidos o suprimidos para eliminar el sitio de unión de receptor de Fc; (x) uno o más residuos sustituidos o suprimidos para eliminar el sitio de unión de complemento (Clq) ; y (xi) una combinación de las subpartes i-x; (c) la secuencia de aminoácidos de las subpartes (a) o (b) que tienen un residuo metionilo en la parte N terminal; (d) la proteína Fc, análogo o derivado de cualquiera de las subpartes (a) a (c) comprendida de una porción química conectada a la porción de proteína; (e) un derivado de la subparte (d) en donde la porción química es una porción de polímero soluble en agua; (f) un derivado de la subparte (e) en donde la porción de polímero soluble en agua es polietilenglicol; (g) un derivado de la subparte (e) en donde la porción de polímero soluble en agua es una porción de poliaminoácido; y (h) un derivado de la subparte (e) en donde la porción de polímero soluble en agua se une a únicamente la parte N terminal de la porción de proteína.

3. La proteína de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína OB, análogo o derivado, se selecciona del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácidos 1-146 como se establece en la SEC. DE IDENT. NO: 3 o SEC. DE IDENT. NO: 6; (b) la secuencia de aminoácidos 1-146, como se establece en la SEC. DE IDENT. NO: 6 que tiene un residuo lisina en la posición 35 y un residuo isoleucina en la posición 74; (c) la secuencia de aminoácidos de la subparte (b) que tiene un aminoácido diferente sustituido en una o más de las siguientes posiciones ( itilizando la numeración de acuerdo con la SEC. DE IDENT. NO: 6) : 4, 8, 32, 33, 35,. 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 y 145; (d) la secuencia de aminoácidos de las subpartes (a) , (b) o (c) , que opcionalmente carece de un residuo glutaminilo en la posición 28; (e) la secuencia de aminoácidos de la subpartes (a) , (b) , (c) o (d) que tiene un residuo metionilo en la parte N terminal; (f) un análogo de proteína OB truncado que se selecciona de entre: (utilizando la numeración de la SEC. DE IDENT. NO: 6 que tiene un residuo lisina en la posición 35, y un residuo isoleucina en la posición 74) : (i) aminoácidos 98-146 (ii) aminoácidos 1-32 (iii) aminoácidos 40-116 (iv) aminoácidos 1-99 y 112-146 (v) aminoácidos 1-99 y 112-146 que tiene uno o más aminoácidos 100-111 colocados secuencialmente entre los aminoácidos 99 y 112; y (vi) el análogo OB truncado o la subparte (f) (i) que tiene uno o más aminoácidos 100, -102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 y 145 sustituidos con otro aminoácido; (vii) el análogo truncado de la subparte (f) (ii) que tiene uno o más de los aminoácidos, 4, 8 y 32 sustituidos con otro aminoácido; (viii) el análogo truncado de la subparte (f) (iii) que tiene uno o más de los aminoácidos 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111 y 112 sustituidos con otro aminoácido; (ix) el análogo truncado de la subparte (f) (iv) que tiene uno o más aminoácidos 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 112, 118, 136, 138, 142 y 145 sustituidos con otro aminoácido; (x) el análogo truncado de la subparte (f) (v) que tiene uno o más de los aminoácidos 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 y 145 sustituidos con otro aminoácido; (xi) el análogo truncado de cualquiera de las subpartes (f) (i)-(x) que tiene un residuo metionilo N terminal; (g) la proteína OB o un derivado análogo de cualquiera de la subpartes (a) a (f) que comprende una porción química conectada con la poción proteínica; (h) un derivado o subparte (g) en donde la porción química es una porción de polímero soluble en agua; (i) un derivado de la subparte (h) en donde la porción de polímero soluble en agua es polietilenglicol; (j) un derivado de la subparte (h) en donde la porción de polímero soluble en agua es una porción poliaminoácido; y (k) un derivado de la subparte (h) a (j) en donde la porción está unida en únicamente la parte N terminal de la porción de proteína.

4. La proteína de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia enlazadora es uno o más aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste de: lisina, asparagina, serina, treonina y alanina.

5. La proteína de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el enlazador se selecciona del grupo que consiste de: (a) ala, ala, ala; (b) ala, ala, ala, ala; (c) ala, ala, ala, ala, ala; (d) gly, gly; (e) gly, gly, gly; (f) gly, gly, gly, gly, gly; (g) gly, gly, gly, gly, gly, gly, gly; (h) gly-pro-gly; (i) gly, gly, pro, gly, gly; (j) una porción química; y (k) cualquier combinación de las subpartes (a) a (j).

6. Una proteína de fusión, caracterizada porque comprende una proteína Fc, un análogo o derivado de la misma, fusionado a la parte N terminal de una proteína OB, análogo o derivado de la misma .

7. Una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína que tiene la fórmula que se selecciona del grupo que consiste de: R? " R2 y R? ~ L ~ R2, en donde Rx es una proteína Fc o un análogo de la misma, R2 es una proteína OB o un análogo de la misma, y L es un enlazador.

8. La secuencia de ácido nucleico, de conformidad con la reivindicación 7, que codifica para una proteína que tiene una porción Fc, el análogo o derivado de la misma, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de: (a) la secuencias de aminoácidos de Fc como se establecen en las SEC. DE IDENT. NO: 9, 12, 15 y 18; (b) la secuencia de aminoácidos de la subparte (a) que tiene un aminoácido diferente sustituido o suprimido en una o más de las siguientes posiciones (utilizando la numeración de acuerdo con la SEC. DE IDENT. NO: 9) : (i) uno o más residuos cisteína sustituidos por un residuo alanina o serina; (ii) uno o más residuos tirosina sustituidos por un residuo fenilalanina; (iii) el aminoácido en la posición 5 sustituido con una alanina; (iv) el aminoácido en la posición 20 sustituido con glutamato; (v) el aminoácido en la posición 103 sustituido con una alanina; (vi) el aminoácido en la posición 105 sustituido con una alanina; (vii) el aminoácido en la posición 107 sustituido con una alanina; • •• (viii) los aminoácidos en las posiciones 1, 2, 3, 4 0 5 suprimidos ; (ix) uno o más residuos sustituidos o suprimidos para eliminar el sitio de unión de receptor de Fc; (x) uno o más residuos sustituidos o suprimidos para eliminar el sitio de unión de complemento (Clq) ; y (xi) una combinación de las subpartes i-x; (c) la secuencia de aminoácidos de las subpartes (a) o (b) que tienen un residuo metionilo en la parte N terminal; (d) la proteína Fc, análogo o derivado de cualquiera de las subpartes (a) a (c) comprendida de una porción química conectada a la porción de proteína; (e) un derivado de la subparte (d) en donde la porción química es una porción de polímero soluble en agua; (f) un derivado de la subparte (e) en donde la porción de polímero soluble en agua es polietilenglicol; (g) un derivado de la subparte (e) en donde la porción de polímero soluble en agua es una porción de poliaminoácido; y (h) un derivado de la subparte (e) en donde la porción de polímero soluble en agua se une a únicamente la parte N terminal de la porción de proteína.

9. La secuencia de ácido nucleico, de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque codifica para una proteína que tiene una proteína OB, análogo o porción de derivado, que se selecciona del grupo que consiste de: (a) la secuencia de aminoácidos 1-146 como se establece en la SEC. DE IDENT. NO: 3 o SEC. DE IDENT. NO: 6; (b) la secuencia de amieoácidos 1-146, como se establece en la SEC. DE IDENT. NO: 6 que tiene un residuo lisina en la posición 35 y un residuo isoleucina en la posición 74; (c) la secuencia de aminoácidos de la subparte (b) que tiene un aminoácido diferente sustituido en una o más de las siguientes posiciones (utilizando la numeración de acuerdo con la SEC. DE IDENT. NO: 6): 4, 8, 32, 33, 35,. 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 y 145; (d) la secuencia de aminoácidos de las subpartes (a) , (b) o (c) , que opcionalmente carece de un residuo glutaminilo en la posición 28; (e) la secuencia de aminoácidos de la subpartes (a) , (b) , (c) o (d) que tiene un residuo metionilo en la parte N terminal; (f) un análogo de proteína OB truncado que se selecciona de entre: (utilizando la numeración de la SEC. DE IDENT. NO: 6 que tiene un residuo lisina en la posición 35, y un residuo isoleucina en la posición 74) : (i) aminoácidos 98-146 (ii) aminoácidos 1-32 (iii) aminoácidos 40-116 (iv) aminoácidos 1-99 y 112-146 (v) aminoácidos 1-99 y 112-146 que tiene uno o más aminoácidos 100-111 colocados secuencialmente entre los aminoácidos 99 y 112; (vi) el análogo OB truncado o la subparte (f) (i) que tiene uno o más aminoácidos 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 118, 136, 138, 142 y 145 sustituidos con otro aminoácido; (vii) el análogo truncado de la subparte (f) (ii) que tiene uno o más de los aminoácidos, 4, 8 y 32 sustituidos con otro aminoácido; (viii) el análogo truncado de la subparte (f) (iii) que tiene uno o más de los aminoácidos 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111 y 112 sustituido con otro aminoácido; (ix) el análogo truncado de la subparte (f) (iv) que tiene uno o más aminoácidos 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 112, 118, 136, 138, 142 y 145 sustituido con otro aminoácido; (x) el análogo truncado de la subparte (f) (v) que tiene uno o más de los aminoácidos 4, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 y 145 sustituido con otro aminoácido; (xi) el análogo truncado de cualquiera de las subpartes (f) (i)-(x) que tiene un residuo metionilo N terminal; (g) la proteína OB o un derivado análogo de cualquiera de la subpartes (a) a (f) constituido de una porción química conectada con la porción proteínica; (h) un derivado o subparte (g) en donde la porción química es una porción de polímero soluble en agua; (i) un derivado de la subparte (h) en donde la porción de polímero soluble en agua es polietilenglicol; (j) un derivado de la subparte (h) en donde la porción de polímero soluble en agua es una porción poliaminoácído; y (k) un derivado de la subparte (h) en donde la porción de polímero soluble en agua se une únicamente en la parte N terminal de la porción de proteína.

10. La secuencia de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque codifica para una proteína con una secuencia enlazadora es uno o más aminoácidos que se seleccionan del grupo que consiste de: Gly, Asn, Ser, Thr y Ala.

11. La secuencia de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque codifica para una proteína con un enlazador que se selecciona del grupo que consiste de: (a) ala, ala, ala; (b) ala, ala, ala, ala; (c) ala, ala, ala, ala, ala; (d) gly, gly; (e) gly, gly, gly; (f) gly, gly, gly, gly, gly; (g) gly, gly, gly, gly, gly, gly, gly; (h) gly-pro-gly; (i) gly, gly, pro, gly, gly; (j) una porción química; y (k) cualquier combinación de las subpartes (a) a (j).

12. Una secuencia de ácido nucleico caracterizada porque codifica para una proteína de fusión que tiene una proteína Fc, un análogo o derivado de la misma, fusionado a la parte N terminal de una proteína OB, análogo o derivado del mismo.

13. Un vector, caracterizado porque contiene una secuencia de ácido nucleico de conformidad con las reivindicaciones 7 ó 12.

14. El vector de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el vector es pAMG21 y la secuencia de ácido nucleico de conformidad con las reivindicaciones 7 ó 12.

15. Una célula huésped procariótica o eucariótica, caracterizada porque contiene el vector de conformidad con la reivindicación 13.

16. Un proceso para producir una proteína, de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 6, caracterizado porque comprende las etapas de cultivar, bajo condiciones adecuadas, la célula huésped de conformidad con la reivindicación 15, y aislar la proteína producida.

17. El proceso de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque comprende además la etapa de purificar la proteína producida.

18. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una cantidad efectiva de una proteína de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 6 , - en un diluyente, adyuvante o portador farmacéuticamente aceptable .

19. Un método de tratamiento de un trastorno que se selecciona del grupo que consiste de exceso de peso, diabetes, concentración elevada de lípidos en sangre, esclerosis arterial, placa arterial, la reducción o prevención de formación de cálculos biliares, masa tisular magra insuficiente, sensibilidad insuficiente a insulina, y ataque, en donde el método está caracterizado porque consiste en administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 6.