MXPA99003367A - Celulasa de chrysosporium y metodos de uso - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a novedosas composiciones de celulasa neutral y/o alcalina y métodos para obtener composiciones de celulasa neutral y/o alcalina de cultivos de Chrysosporium, en particular Chrysosporium lucknowense. Esta invención también proporciona mutantes y métodos para generar mutantes de Chrysosporium, capaces de producir celulasa neutral y/o alcalina. Esta invención también se refiere a los genes que codifican las enzimas comprendiendo la composición de celulasa neutral y/o alcalina. Además, esta invención proporciona métodos para cultivar Chrysosporium para producir celulasas neutrales y/o alcalinas. Las composiciones de celulasas neutrales y/o alcalinas de la presente invención pueden usarse en una variedad de procesos, incluyendo lavado conpiedras de ropa, procesos de detergente, des-entintado, abrillantamiento de color, depilling y bioblanqueo de papel y pulpa y tratamiento de corrientes de desechos. La presente invención también se refiere al aislamiento y purificación de enzimas de celulasa, que tienen actividad de glucanasa y celobiohidrolasa, y sonútiles para aplicaciones de lavado con piedras.

Description

CELULASA DE CHRYSOSPORIUM Y MÉTODOS DE USO CAMPO DE LA I NVENCIÓN Esta invención se refiere a celulasas neutrales y/o alcalinas y novedosos métodos para producir las mismas. De manera más específica, esta invención se refiere a celulasas producidas por hongos del género Chrysosporium, y cepas particulares de Chrysosporium lucknowense. Esta invención también se refiere a usos industriales para estas celulasas neutrales o alcalinas y composiciones que comprenden las mismas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La ropa hecha de tejidos celulósicos tales como algodón, lino, cáñamo, ramio, cupro, lyocell, newcell, rayón , polinósicos, son muy populares. Son de particular interés artículos de ropa tales como jeans hechos de telas de mezclilla teñidas color índigo hechas de algodón o mezclas de algodón. Normalmente, tales artículos de ropa se cosen a partir de tela aprestada y cortada y tienden a ser rígidos debido a la presencia de las composiciones de aprestado. En otros casos, las fibras o rollos de tela se tratan con enzimas antes de coserla prenda final. Después de un periodo de uso, los artículos de tela pueden desarrollar un cierto grado de suavidad , una reducción g lobal de matiz, así como áreas localizadas de variación de color. Adicionalmente, después de lavados repetidos, la prenda continua proporcionando un ajuste más confortable, un tacto más suave y una apariencia de usado. En años recientes, tales confort, tacto y apariencia se han vuelto populares en aumento.

Los métodos más esparcidos para producir este confort, tacto y apariencia involucran lavar los artículos de ropa con celulasas en grandes máquinas de lavado con piedra pómez u otros abrasivos. La piedra pómez ayuda a suavizar el tejido y ayuda a proporcionar la superficie desteñida similar a aquélla producida por el uso prolongado del tejido. Sin embargo, el uso de la piedra pómez tiene algunas desventajas. Por ejemplo, la piedra pómez debe ser removida manualmente de los artículos de ropa procesados debido a que tiende a acumularse en los bolsillos, en superficies interiores, en pliegues y en dobleces. Además, las piedras pómez pueden provocar daño por sobrecarga a motores eléctricos de máquinas de lavado con piedras, y obstrucción de pasos de drenaje de la máquina y líneas de drenaje. Estos problemas de equipo y procesamiento pueden afectar significativamente el costo de hacer negocios y el precio de compra de los productos. En vista de los problemas de usar piedra pómez, se han buscado métodos alternativos a usar piedra pómez u otros abrasivos en el proceso de lavado con piedras. Otra alternativa involucra el uso de tratamientos de enzimas, las cuales rompen la celulosa en los tejidos (patente estadounidense de Geller No. 4, 951 , 366; patentes estadounidenses de Olson Nos. 4, 832, 864, 4, 91 2, 056, patentes de Olson et al . Nos. 5,006, 1 26, 5, 1 22, 1 59 y 5, 21 3, 581 , patente estadounidense de Christner et al . No. 4,943, 530, patente estadounidense de Boegh et al. No. 4, 788,682). En la técnica se sabe que los métodos para tratar tejidos conteniendo celulosa con enzimas hidrolíticas, tales como celulasas, mejoran la suavidad o tacto de tales tejidos (Novo Brochure Cellulase SP 227 ; Novo Brochure Celluzyme; patente estadounidense de Murata No. 4,443, 355; patente estadounidense de Parslow No. 4,661 ,289; patente estadounidense de Tai No. 4,479,881 ; patente estadounidense de Barbesgaard No. 4,435,307; patente del Reino Unido de Browning No. 1 ,368,599). Las celulasas son conocidas en la técnica como sistemas de enzimas que hidrolizan la celulosa (enlaces ß-1 ,4-glucano) , resultando con ello en la formación de glucosa, ceiobiosa, celoligosacáridos y similares. Las composiciones de celulasas están comprendidas de varios componentes de enzimas diferentes, incluyendo aquéllas identificadas como exocelobiohidrolasas, endoglucanasas y ß-glucosidasas. Más aún, estas clases de enzimas pueden separarse adicionalmente en isoenzimas individuales. Se requiere el sistema de celulasas completo para convertir de manera eficiente la celulosa cristalina a glucosa. De manera general, si se necesita la hidrólisis total de un substrato de celulosa, la mezcla de celulasas debe contener ß-glucosidasas y celobiohidrolasas, así como endoglucanasas. Las endoglucanasas catalizan la hidrólisis aleatoria de ligaduras ß-1 ,4-glicosídicas entre unidades de glucosa de polímeros de celulosa. Tales componentes hidrolizan derivados de celulosa soluble, tales como carboximetilcelulosa , reduciendo con ello la viscosidad de tales solucio nes. Tales componentes de enzimas actúan en regiones internas del polímero, resultando en un rápido decremento en la longitud de cadena de pol ímero promedio junto con un lento incremento en el número de extremos de reducción . El rápido decremento en la longitud de cadena promedio del pol ímero de celulosa es evidenciado por el decremento en la viscosidad de una solución de celulosa. La especificidad de substrato y modo de acción de las diferentes celulasas varía entre cepas de organismos que producen las celulasas. Por ejemplo, el mecanismo actualmente aceptado de la acción de celulasa en celulasa del hongo Trichoderma reesei es que la actividad de endoglucanasa rompe primero las ligaduras ß-1 ,4-glucosídicas internas en regiones de baja cristlinidad de la celulosa (Ruohnen L. , et al. En: "Proceedings of de Second Tricel Symposium on Trichoderma Reesei Cellulases and Other Hydrolases", (ed. por P. Sudminen y T. Reinkainen. , Foundation for Biotechnology and I ndustrial Fermentation Research 8; (1 993) : 87-96) . La actividad de celobiohidrolasa se une, de preferencia, a las reg iones cristalinas del extremo no reductor de la celulosa para liberar celobiosa como el producto primario. Las actividades de ß-glucosidasa o celobiasa actúan entonces sobre celooligosacáridos, por ejemplo, celobiosa, para dar glucosa como el producto único. Las celulasas son producidas en hongos, bacterias y otros microbios. Normalmente, los hongos producen un sistema de celulasa completo capaz de degradar formas cristalinas de celulosa. Por ejemplo, el Trichoderma reesei produce y secreta todas las actividades de enzimas necesarias para la ruptura eficiente de celulosa cristalina, a saber, endo- 1 ,4-ß-D-glucanasas , celobiohidrolasas (exo-1 ,4-ß-D-glucanasas), y 1 ,4-ß- D-g lucanasas, o ß-g lucosidasas. Las celulasas fúngales tienen una ventaja agreg ada , ya que las celulasas en los hongos pueden producirse fácilmente en g randes cantidades vía procedimientos de fermentación.

Las celulasas, o los componentes de las mismas, son conocidos en la técnica por ser útiles en una variedad de aplicaciones textiles a nivel industrial, además del proceso de lavado con piedras. Por ejemplo, las celulasas se usan en composiciones de detergentes, para el fin de intensificar la capacidad de limpieza de la composición, tal como un agente de suavizado, para abrillantamiento de color, "depilling" u otros usos. Cuando se usa de esa manera, la celulasa degradará una porción del material celulósico, por ejemplo, tejido de algodón , en el lavado, lo cual facilita la limpieza y/o suavizado del tejido. También se han usado los componentes de endoglucanasa de celulasas fúngales para fines de intensificar la capacidad de limpieza de las composiciones de detergentes, para usarse como un agente de suavizado, y para usarse en el mejoramiento del tacto de tejidos de algodón , y similares. Sin embargo, existe un problema con el uso de la celulasa derivada de Trichoderma spp. y especialmente Tichoderma longibrachiatum en composiciones de detergentes. En general, tales componentes tienen su actividad más alta a pHs ácidos, mientras que la mayoría de las composiciones de detergente para ropa son formulados para usarse a condiciones neutrales o alcalinas.

Otras aplicaciones textiles en las cuales se han usado celulasas incluyen suavizado (Browning , patente del Reino U nido No. 1 ,368, 599, Parslow, patente estadounidense No. 4,661 , 289, Tai, patente estadoun idense No, 4,479, 881 y Barbesgaard , patente estadounidense No. 4,435, 307) , desfibrilación (Gintis, D. Mead, E .J . , Textile Research Journal, 29 , 1 959 : Cooke, W. D . , Journal Of The Textile Research I nstitute. 74, 3, 1 983; Boeg h, solicitud de patente europea No. 0 220 01 6) . Las celulasas también se han usado en combinación con un agente polimérico en un proceso para proporcionar variación localizada en la densidad de color de fibras. (WO/94/1 9528 y WP/94/1 529). Las celulasas son clasificadas en la prenda y la industria textil de acuerdo a su rango de pH de operación. Normalmente, las celulasas acidas tiene su actividad pico a valores de pH de aproximadamente 4.0 a 5.5 y menores, las celulasas neutrales a aproximadamente pH d3 5.5 a 7.5, y las celulasas alcalinas a aproximadamente pH de 7.5 a 1 1 .0. Algunas composiciones de enzimas pueden tener rangos más amplios de operación. Por ejemplo, las celulasas neutrales/alcalinas pueden operar a pH's neutrales y alcalinos entre aproximadamente 40°C hasta 60°C. Las celulasas acidas, neutrales y alcalinas se usan normalmente en el tratamiento de "lavado con piedras" de jeans de mezclilla, con o sin surfactantes, amortiguadores, detergentes, agentes anti-redepositación, agentes suavizantes, piedra pómez u otros abrasivos, agentes blanqueadores, tales como agentes blaqueadores ópticos, enzimas u otros medios. Si la composición de celulasa no se formula y/o pre-amortiguada entonces para celulasas acidas, el pH se ajusta normalmente entre pH 4.5-5.5, con por ejem plo, un amortiguador de ácido cítrico y citrato de sod io, y para celulasas neutrales o alcalinas entre 5.5-7.5 con, por ejemplo, un amortiguador de fosfato monosódico y disódico. Normalmente, las cel ulasas neutrales y alcalinas se usan como aditivos para detergentes para ropa, donde el pH de operación puede variar desde aproximadamente pH 7.0 a 1 1 .5. en las apl icaciones de lavado con piedra, las celulasas acidas normales proporcionan , en general , mayor retromanchado o redepositación del colorante índigo y mayor pérdida de fuerza del tejido, al tiempo que las celulasas neutrales y alcalinas normales proporcionan menos abrasión, menor retromanchado o redepositación y menos pérdida de fuerza del tejido. Las celulasas neutrales/alcalinas son el tipo más preferido de celulasas para la industria de lavado con piedra, debido a que provocan niveles menores de retromanchado o redepositación y menor pérdida de fuerza que las celulasas acidas (es decir, de Trichoderma sp.). Adicionalmente, las celulasas neutrales/alcalinas, a diferencia de sus contrapartes acidas, operan en un rango de pH mucho más amplio y son capaces de mantener mejor desempeño de lavado relativo dentro de un rango de pH más amplio (pH 5.0 - pH 8.0) en la industria de lavado con piedras. Por lo tanto, las celulasas neutrales/alcalinas proporcionan varias ventajas. Primero, el agua de alimentación entrante en instalaciones de procesamiento húmedo normalmente está dentro de este rango de pH , disminuyendo la necesidad de un control de pH preciso, comparado con las celulasas acidas. Esto hace al proceso de lavado con piedra más tolerante al descuido o error de pH del operador, dejando al procedimiento global más indulgente que los procedimientos que usan celulasas acidas. En seg undo lugar, se sabe que los tejidos de mezclilla son de naturaleza alcalina, debido a que el proceso de teñido utiliza sosa cáustica. Simplemente, lavar la mezcli lla libera esta substancia cáustica en el agua de lavado y ef pH del agua de lavado general mente aumenta. La alcalin idad puede superar los amortiguadores del baño, pero el efecto de pH i ncrementado es menos severo en las celulasas neutrales/alcalinas comparadas con las celulasas acidas, debido a que las celulasas neutrales7alcalinas operan no solo a un pH mayor, sino también sobre un rango de pH más amplio. El amplio espectro de usos industriales para celulasas o los componentes de celulasas, especialmente celulasas alcalinas y/o neutrales, establece una clara necesidad para celulasas que son operativas a pH neutral y/o alcalino. La presente invención proporciona un procedimiento para producir celulasas neutrales/alcalinas que tienen actividad enzimática a pH's neutrales y/o alcalinos y composiciones que comprenden las mismas.

BREVE DESCRI PCIÓN DE LA I NVENCI ÓN Esta invención se refiere, en general , a celulasas neutrales y/o alcalinas y novedosos métodos para producir las mismas. De manera más específica, la presente invención proporciona un método para producir composiciones de celulasas a partir de hongos del género Chrysosporium, y en particular Chrysosporium lucknowense, en donde las composiciones de celulasas tienen actividad enzimática a pH's neutrales y/o alcalinos.

También se proporcionan aplicaciones industriales para la composición de cel ulasas. U na mod alidad de esta invención se refiere a cultivos aislados y purificados de hongos de tipo natural y mutantes del género Chrysosporium capaces de producir composiciones de celulasas neutrales y/o alcalinas, en particular a la cepa Chrysosporium lucknowense - GARG 27 K y m utantes de la m isma.

Todavía otra modalidad de esta invención proporciona condiciones de cultivo para producir celulasas neutrales o alcalinas de hongos del género Chrysosporium. En una modalidad adicional, esta invención proporciona métodos para producir una composición de celulasa neutral y/o alcalina a través de tecnolog ía recombinante de hongos del género Chrysosporium. Todavía en una modalidad adicional de esta invención, se proporcionan métodos para generar y cultivar cepas mutantes de los hongos Chrysosporium capaces de producir celulasa neutral y/o alcalina. Otra modalidad de esta invención se refiere a las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las enzimas de composiciones de celulasas producidas por Chrysosporium o cepas genéticamente modificadas de Chrysosporium. Otra modalidad se refiere a las enzimas purificadas y aisladas de las composiciones de celulasas producidas por Chrysosporium o cepas genéticamente modificadas de Chrysosporium. Todavía en otra modalidad de esta invención, se proporcionan métodos de uso para celulasas alcalinas y/o neutrales producidas por Chrysosporium en aplicaciones textiles, tales como procedim ientos de suavizado, blanqueo y lavado con piedras, aplicaciones de teñido de prendas , desfibrilación o biopulido, abriflantamiento de color y depilling . Otra modalidad de esta invención se refiere a composiciones de detergentes comprend iendo celulasa de Chrysosporium en preparaciones de detergentes .

Otra modalidad de esta invención es proporcionar métodos de uso para las composiciones de celulasas en la sacarificación de biomasas de lignocelulosa de agricultura, productos forestales, desechos sólidos municipales y otras fuentes. Todavía otras modalidades de esta invención involucran el uso de las composiciones de celulasas para la producción de combustibles y otros químicos para el bioblanqueo de pulpa de madera, y para des-entintado de papel impreso reciclado.

Descripción detallada de la invención Como se utiliza en la presente, la referencia a una "celulasa neutral-alcalina" se refiere a una composición de celulasas la cual retiene la actividad enzimática significativa a valores de pH desde aproximadamente 5.5 y por encima. En una modalidad preferida, las composiciones de celulasas neutrales y/o alcalinas de la presente invención tienen actividad enzimática pico entre aproximadamente pH 5.5 hasta aproximadamente 7.5 a 40°C hasta aproximadamente 60°C. En el caso de que la actividad enzimática pico sea a un pH de menos de aproximadamente 5.5, la composición de celulasas neutrales-alcalinas tendrá al menos aproximadamente 50% de la actividad enzimática óptima hasta aproximadamente pH 6.0 hasta aproximadamente 7.0 a aproximadamente 40°C hasta aproximadamente 60°C. A manera de ejemplo, tales actividades pueden medirse mediante RBBCMCasa , CMCasa, Cellazyme, actividad de papel filtro (FPA) o endoviscosimétricor De esta manera, las com posiciones de cel u lasa de la presente invención tendrán actividad enzimática útil a pHs mayores que 5.5, de manera que la composición de enzimas puede usarse en lavado con piedra, detergente, des-entintado u otras aplicaciones donde se necesita la actividad de celulasa neutral y/o alcalina. La presente invención se refiere a composiciones de celulasas que tienen alta actividad a pH's neutrales o alcalinos y a métodos únicos para producir dichas composiciones de celulasas neutrales y alcalinas. Las composiciones neutrales/alcalinas de esta invención pueden obtenerse a partir de cualquier especie de Chrysosporium. En una modalidad particularmente preferida, las composiciones de celulasas de la presente invención se aislan de Chrysosporium lucknowense Garg 27K (designada aislado C1) depositado bajo el Tratado de Budapest con el International Depository en All-Russian Collection of Microorganisms of the Russian Academy of Sciences, Bakhrushina St. 8: Moscú, Rusia 113184, el 29 de agosto de 1996, y con número de acceso asignado VKM F-3500D. Las composiciones de celulasas de la presente invención son altamente convenientes, debido a que poseen actividad enzimática a pH neutral y/o alcalino, proporcionando con ello características de desempeño benéficas en aplicaciones industriales. Las composiciones de celulasa preparadas a partir de cepas fúngales de la presente invención exhiben actividad entre aproximadamente pH 5.0 hasta aproximadamente 12.0 entre aproximadamente 40°C hasta 60°C, como se determina mediante ensayos de Actividad de Papel Filtro (FPA) o endoviscosimétricos, Cellazyme, RBBCMCasa, CMCasa. En una modalidad preferida para un procedimiento de lavado con piedras, la com posición de celulasas puede tener actividad óptima entre aproximadamente pH 5.5 hasta 7.0, a aproximadamente 40°C hasta aproximadamente 60°C. Se ha demostrado buena actividad de desempeño a pH neutral y alcalino (es decir: 6.0, 7.0 & 8.0) para las celulasas neutrales y/o alcalinas de la presente invención en pruebas de aplicación de lavado con piedras y a pH 1 0.0 y superiores para pruebas de aplicación de detergente. Son conocidos en la técnica los procedimientos de fermentación para cultivar microorganismos celulolíticos para la producción de celulasa. Por ejemplo, los sistemas de celulasa pueden ser producidos ya sea mediante cultivo sólido o sumergido, incluyendo procesos de estado sólido, lote, alimentación por lote, y flujo continuo. La recolección y purificación de los sistemas de celulasas para el caldo de fermentación también pueden ser efectuados mediante procedimientos conocidos en la técnica. La composición de celulasas se aisla fácilmente a partir del cultivo fungal mediante, por ejemplo, pasos de centrifugación o filtración y concentración del filtrado vía equipo de ultrafiltración de fibras huecas o membrana. La cepa fungal Chrysosporium usada para producir las composiciones de celulasas de la presente invención pueden cultivarse de acuerdo a métodos estándares y condiciones conocidas en la técnica. En una modalidad preferida, la composición de celulasas de la presente invención se obtiene a partir de la cepa C1 . La cepa de Chrysosporium C1 puede hacerse crecer en un medio conteniendo sales inorgánicas, fuentes de nitrógeno orgánico , tales como, peptonas , harina de semilla de algodón desg rasada, licor de infusión de maíz, o extracto de levadura y fuente de carbono. Ejemplos de fuente de carbono incluyen, pero no están limitadas a, glucosa, lactosa, sacarosa, celulosa u otros carbohidratos. Más preferiblemente, la cepa fungal se hace crecer en medios conteniendo tanto lactosa como peptona o lactosa y extracto de levadura. A manera de ejemplo, los medios de fermentación pueden componerse de lactosa a aproximadamente 0.3% hasta aproximadamente 1 .0%, de preferencia aproximadamente 0.5% hasta aproximadamente 0.6%, peptona a aproximadamente 0.3% hasta aproximadamente 1 .0% , de preferencia aproximadamente 0.5% hasta aproximadamente 0.6%. Pueden usarse otras fuentes de nitrógeno y fuentes de carbohidratos conocidas en la técnica en los medios de crecimiento fúngales incluyendo, pero no limitando a, pulpa de remolacha dulce, malta de cebada, salvado de trigo, y otros conocidos en la técnica. A manera de ejemplo, puede usarse pulpa de remolacha du lce en un rango desde aproximadamente 1 5 hasta aproximadamente 30 gramos/litro (g/l) , de preferencia aproximadamente 20 hasta aproximadamente 25 g/l; puede usarse malta de cebada en un rango de aproximadamente 1 0 g/l hasta aproximadamente 20 g/l, de preferencia aproximadamente 14 g/l o aproximadamente 1 6 g/l; puede usarse salvado de trig o en un rango de aproximadamente 3 g/l hasta aproximadamente 8 g/l, de preferencia aproximadamente 5 g/l hasta aproximadamente 6 g/l. En una modalidad , la cepa C 1 es cultivada en matraces de agitación por rotació n en medio salino conteniendo pulpa de remolacha dulce, malta de cebada y salvado de trigo. Las com posiciones de cel ulasas pueden aislarse a partir de hongos cultivados aproximadamente 3 a 7 d ías en un medio de crecimiento mediante centrifugación y concentración por ultrafiltración del medio de cultivo celular. De manera alternativa, los cultivos de Chrysosporium pueden cultivarse a gran escala para uso comercial, al usar técnicas de fermentación convencionales. En este contexto, se usa ampliamente fermentación para referir cualquier condición de cultivo fungal controlado. Antes del crecimiento a gran escala, generalmente se cultiva un inoculo de dicho cultivo de crecimiento. El medio de inoculo puede contener ingredientes convencionales incluyendo, pero no limitando a, fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno orgánico y sales inorgánicas. Las fuentes de carbono puede incluir, pero no están limitadas a, glucosa, lactosa, glicerol y/o celulosa a concentraciones en el rango de aproximadamente 0.5 hasta 200 g/l , más preferiblemente en el rango desde aproximadamente 5 hasta 50 g/l . Las fuentes de nitrógeno orgánico pueden incluir, pero no están limitadas a, extracto de levadura, peptona o harina de semilla de algodón desgrasada a concentraciones en el rango de aproximadamente 0.5 hasta 30 g/l, más preferiblemente en el rango de 5 hasta 1 5 g/l . Las sales inorgánicas pueden incluir, pero no están limitadas a, fosfato de potasio , por ejem plo a aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 1 0 g/l , sulfato de magnesio, por ejemplo a aproximadamente 0.01 hasta 3.0 g/l , sulfato ferroso, por ejemplo a aproxim adamente 0.001 hasta 1 0 mg/l . U n inoculo o cultivo iniciador puede usarse para iniciar el cultivo de Chrysosporium para u n termentador mediante métodos conocidos en la técnica. Los medios usados para la fermentación pueden comprender ingredientes convencionales para cultivar hongos, incluyendo pero no limitando a, celulosa, fuentes de nitrógeno orgánico, cloruro de magnesio y cloruro de calcio. Ejemplos de fuentes de nitrógeno orgánico incluyen , pero no están limitadas a, peptona, harina de semilla de algodón desgrasada, tal como, Pharmamedla. A manera de ejemplo, - los medios pueden comprender aproximadamente 5 g/l hasta aproximadamente 20 g/l de peptona o harina de semilla de algodón desgrasada, aproximadamente 1 0 g/l hasta aproximadamente 30 g/l de celulosa, aproximadamente 0.03 g/l hasta aproximadamente 0.06 g/l de heptahidrato de sulfato de magnesio y aproximadamente 0.4 g/l hasta aproximadamente 0.8 g/l de dihidrato de cloruro de calcio. Un experto en la técnica apreciará que deben mantenerse durante la fermentación la temperatura, oxigenación, pH y niveles de nutrientes de la mezcla de fermentación. A manera de ejemplo, los niveles de oxígeno disueltos deben mantenerse a aproximadamente 1 0 hasta 60% de saturación de aire, de preferencia a aproximadamente 20 hasta 40% de saturación de aire. El pH debe mantenerse entre aproximadamente 5 y 8, de preferencia entre aproximadamente 6.5 y 7.5, muy preferiblemente entre 6.9 y 7.1 y la temperatura puede mantenerse entre aproximadamente 25°C hasta aproximadamente 40°C, de preferencia a aproximadamente 28°C hasta 35°C. La solución de alimentación puede comprender ing redientes similares al medio de fermentación pero a concentraciones mayores para m inimizar la dilución cuando se adiciona al medio de fermentación.

Las composiciones de celulasas producidas de acuerdo a los métodos de la presente invención son útiles para una variedad de otras aplicaciones, para las cuales se necesita la actividad de celulasa, en particular actividad de celulasa neutral y/o alcalina. En una modalidad de esta invención, las composiciones de celulasas neutrales y/o alcalinas pueden usarse en procedimientos de lavado de piedras para jeans de mezclilla. A manera de ejemplo, el rango de pH muy preferido de aplicaciones de lavado con piedras está entre aproximadamente 5.5 hasta 7.5, muy preferiblemente a aproximadamente pH 6 hasta aproximadamente 7. La composición de celulasas neutrales y/o alcalinas obtenida de aislados de Chrysosporium convenientemente tiene actividad enzimática significativa a o por encima del pH neutral o alcalino. Los procedimientos de lavado con piedras conducidos con celulasa neutral y/o alcalina corridos a pH's neutrales y/o alcalinos son particularmente ventajosos comparados con procedimientos tradicionales que usan celulasas acidas (por ejem plo: aquéllas de Trichoderma reesei) debido a niveles menores de retromanchado en las prendas, menos pérdida de fuerza para las prendas y la alcalinidad del ag ua que está presente de manera natural durante este proceso. Estos procedimientos de lavado con piedras resultan en jeans con tacto y apariencia altamente deseables. A manera de ejemplo, pueden usarse 0.02 a 1 0 g de preparación de celulasa 47.0528 descrita en la presente por 1 35 g de mezclilla. Alguien de habilidad en la técnica conocerá como regular la cantidad o concentración de la composición de cel ulasa producida mediante esta invención basada en tales factores como la actividad de la celulasa, y las condiciones de lavado, incluyendo pero no limitando a la temperatura y pH . Todavía otra modalidad de esta invención , las composiciones de celulasas de esta invención pueden usarse para reducir o eliminar la dureza asociada con tejidos hechos de celulosa mediante la adición de composiciones de detergente. A manera de ejem plo, el rango preferido para las composiciones de detergente a pH neutral y/o alcalino. Los ingredientes de detergente contemplados para usarse con la composición de celulasas de la presente invención incluyen cualquier ingrediente de detergente conocido en la técnica. Ejemplos de tales ingredientes incluyen, pero no están limitados a, detergentes, amortiguadores, surfactantes, agentes blanqueadores, suavizantes , solventes, agentes formadores de sólido, abrasivos, álcalis, electrolitos inorgánicos, activadores de celulasa, antioxidantes, formadores, silicatos, conservadores y estabilizantes y son conocidos en la técnica. Las composiciones de detergente de esta invención em plean , de preferencia, un agente de superficie activa, es decir, surfactante, incluyendo surfactantes aniónicos. no iónicos y anfolíticos bien conocidos por su uso en composiciones de detergente. Además de los componentes de celulasa y el agente de superficie activa, las composiciones de detergente de esta invención puede contener adicionalmente uno o más de los siguientes componentes; las enzimas amilasas, celulasas , protenasas , lipasas, oxido-reductasas, peroxid asas y otras enzimas; surfactantes catiónicos y ácidos grasos de cadena larga ; formadores; agentes anti-redepositación , agentes blanqueadores; agentes de azulado y colorantes fluorescentes; inhibidores de tortas; agentes enmascarantes para factores que inhiben la actividad de la celulasa; activadores de celulasa; antioxidantes; y solubilizantes. Además, pueden usarse, si se desea, perfumes, conservadores, colorantes y similares, con las composiciones de detergente de esta invención. Ejemplos de composiciones de detergente que emplean celulasas se ejemplifican en las patentes Nos. 4,435,30/, 4,443,355; 4,661 ,289; 4,479,881 ; 5, 1 20,463, las cuales se incorporan en la presente por referencia. Cuando una base de detergente usada en la presente invención está en la forma de un polvo, puede ser una la cual se prepara mediante cualquier método de preparación conocido incluyendo un método de secado por atomización y/o un método de g ranulación. Los métodos de granulación son los más preferidos debido a la naturaleza no polvosa de granulos comparada con productos secados por atomización . La base de detergente obtenida mediante el método de secado por atomización es de granulos huecos, los cuales son obtenidos al atomizar una pasta acuosa de ing redientes resistentes al calor, tales como agentes de superficie activa y formadores, en un espacio caliente. Los granulos tienen un tamaño desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 2000 micrómetros. Después del secado por atomización, pueden adicionarse perfumes, enzimas, agentes de blanqueo y/o formadores alcalinos inorgán icos. Con una base de detergente granular, altamente densa, obtenid a mediante tal método de granulación-secado por atomización, también pueden adicionarse varios ingredientes después de la preparación de la base. Cuando la base de detergente es un líq uido, puede ser ya sea una solución homogénea o una solución no homogénea. Las composiciones de celulasas de esta invención exhiben de preferencia altos niveles de actividad a pH's alcalinos o neutrales, pero también pueden exhibir actividad enzimática a pH's ácidos. En consecuencia, las composiciones de detergente que comprenden las celulasas de la presente invención pueden usarse en un amplio rango de pH desde pH ácido hasta alcalino. Otras aplicaciones textiles en las cuales pueden usarse estas composiciones de celulasas incluyen, pero no están limitadas a, aplicaciones de Teñido de Prendas incluyendo pero no limitando a Mercerizado Enzimático de viscosa, aplicaciones de Bio-Pulido, Pulido de Enzimático de Superficie; Biolavado (tratamiento de lavado o arrastre de materiales textiles) , Microfibrilación Enzimática, "algodonización" Enzimática de lino, ram io y cáñamo; y tratamiento de Lyocel o Newcell (es decir; "TENCEL" de Courtauld's) , Cupro y otras prendas o fibras celulósicas, remoción de colorante de substratos celulósicos teñidos, tales como algodón teñido (Leisola & Linko - (1 976) AnalytTcal Biochemistry, v. 70, p. 592. Determination Of The Solubilizing Activity Of A Cellulase Complex With Dyed Substrates; Blum & Stahl - Enzymic Degradation Of Cellulose Fibers; Reports of the St?izuoka Prefectural Hamamatsu Textile I ndustrial Research I nstitute No. 24 (1 985)) , como un agente blanqueador para hacer que la mezclil la teñida de color índigo nuevo se vea viejo (Fujikawa - sol icitud de patente japonesa Kokai No. 50-1 32269), para intensificar la acción de blanqueo de agentes blanqueadores (Suzuki - patente británica No. 2 094 826), y en un proceso para composiciones para desaprestado enzimático y blanqueo de textiles (Windbichtler et al. , patente estadounidense No. 2.974,001 ). Otro ejemplo de desaprestado enzimático usando celulasas se proporciona en Bhatawadekar (Mayo 1 983) Journal of the Textile Association, páginas 83-86. En otras modalidades industriales, las composiciones de celulasas pueden usarse en la sacarificación de biomasa de lignocelulosa de agricultura, productos forestales, desecho sólido municipal, y otras fuentes, para la producción de combustibles y otros químicos a través de la fermentación, para el bioblaqueo de pulpa de madera y para el desentintado de papel impreso reciclado, todo mediante métodos conocidos para alguien experto en la técnica. Todavía en otra modalidad de la presente invención, pueden aislarse varios componentes de las composiciones de celulasas neutrales y alcalinas y usarse independientemente uno de otro. Componentes específicos o composiciones de celulasas enriquecidas por ciertos componentes de celulasa pueden producirse o aislarse mediante medios químicos y físicos a partir de mutantes o producirse específicamente mediante métodos de i ngeniería genética. El sistema de celulasas puede purificarse en componentes separados mediante técnicas de separación reconocidas en la técnica incluyendo cromatografía de intercambio de iones a un pH adecuado, cromatografía por afinidad, cromatografía por exclusión de tamaño y similares. Por ejemplo , en cromatografía de intercam bio de iones, es posible separar los com ponentes de celulasa al levigar con un g radiente de pH , o un g radiente de sal , o ambos. Tales separaciones pueden hacerse por alguien experto en la técnica, teniendo el beneficio de las enseñanzas proporcionadas en la presente. Una vez que los componentes enzimáticos individuales de la composición de celulasa son fraccionados y aislados, pueden secuenciarse parcialmente o microsecuenciarse las proteínas para diseñar el DNA sintético o sondas para aislar el gene que codifica las proteínas enzimáticas de interés. De manera general, la secuencia amino terminal de la proteína se determina mediante métodos de secuenciación de proteínas convencionales o mediante secuencia automatizada (Ausubel et al., (1987) en "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Nueva York, Nueva York). De manera alternativa, otras regiones de la proteína pueden secuenciarse en combinación con corte químico o corte enzimático y técnicas de separación de proteínas. (Ausubel et al., (1987) en Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Nueva York, Nueva York). Alguien experto en la técnica entenderá que las sondas o clones de DNA sintético pueden usarse en técnicas de clonación de rutina para aislar los genes correspondientes a las enzimas presentes en las composiciones de celulasas neutrales/alcalinas producidas por Chrysosporium. Alguien experto en la técnica entenderá que las secuencias de ácidos nucleicos obtenidas mediante esta invención en la técnica pueden variar debido a la degeneración de las variaciones del código genético en la secuencia de DNA, pero todavía resultarán en una secuencia de DNA capaz de codificar los componentes enzimáticos de las composiciones de celulasas. En consecuencia, tales secuencias de DNA son funcionalmente equivalentes a las secuencias de ácidos nucleicos de la actual invención y pretenden ser abarcadas dentro de la presente invención. También se pretende abarcar dentro de esta invención las secuencias de ácidos nucleicos, las cuales son complementarias a las secuencias de ácidos nucleicos capaces de hibridar a la secuencia de ácido nucleico descrita bajo una variedad de condiciones. Esta invención incluye además, las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las enzimas de las composiciones de celulasas de esta invención y aquellas proteínas o péptidos que tienen substancialmente la misma función que los péptidos o proteínas enzimáticas de esta invención. Tales proteínas o polipéptidos incluyen , pero no están limitados a, un fragmento de la proteína, o un mutante de substitución, adición o supresión . Esta invención también abarca proteínas o péptidos que son substancialmente homólogos a las proteínas que codifican las enzimas comprendiendo la composición de celulasas de esta invención. El término "análogo" incluye cualquier polipéptido que tiene una secuencia de residuos de aminoácidos substancialmente idénticos a la secuencia específicamente en la cual uno o más residuos han sido substituidos de manera conservadora con un resid uo funcionalmente similar y el cual exhibe los aspectos funcionales de las proteínas como se describe en la presente. Ejemplos de substituciones conservadoras incluyen la substitución ~de un residuo no polar (hidrofóbico) , tal como isoleucina, valina, leucina o alanina por otro, la substitución de u n residuo polar (hidrof íli co9 por otro, tal como entre arginina y usina, entre glutamina y asparag ina , entre treonina y serina , la substitución de un residuo básico, tal como, Usina, arginina o histidina para otro, o la substitución de un residuo ácido, tal como ácido aspártico o ácido glutámico por otro. Las proteínas o polipéptidos de la presente invención también incluyen cualquier polipéptido que tiene una o más adiciones y/o supresiones o residuos con relación a la secuencia de un polipéptido, cuya secuencia está incluida en las proteínas de esta invención, siempre y cuando se mantenga la actividad requisito. Esta invención también proporciona una molécula de DNA recombinante comprendiendo todas o parte de las secuencias de ácidos nucleicos aisladas mediante esta invención y un vector. Los vectores de expresión adecuados para usarse en la presente invención comprenden al menos un elemento de control de expresión enlazado operacionalmente a la secuencia de ácido nucleico. Los elementos de control de expresión se insertan en el vector ara controlar y regular la expresión de la secuencia de ácido nucleico. Ejemplos de los elementos de control de expresión incluyen , pero no están limitados a, sistema lac, regiones operadoras y promotoras de fago lambda, levadura u otros promotores de hongos. Ejemplos de promotores que pueden usarse incluyen, pero no están limitados a, glucoamilasa. Los elementos operaciones requeridos o preferidos adicionales incluyen, pero están limitados a, secuencia líder, codones de terminación , señales de poliadenilación y cualquier otra secuencia necesaria o preferida para la transcripción apropiada y subsecuente traducción de la secuencia de ácido nucleico en el sistema huésped . Alguien experto en la técnica entenderá que la combinación correcta de elementos de control de expresión requeridos o preferidos dependerá en el sistema huésped elegido. Adicionalmente se entenderá que el vector de expresión deberá contener elementos adicionales necesarios para la transferencia y subsecuente replicación del vector de expresión conteniendo la secuencia de ácido nucleico en el sistema huésped. Ejemplos de tales elementos incluyen, pero no están limitados a, orígenes de replicación y marcadores seleccionables. Adicionalmente, alguien experto en la técnica entenderá que tales vectores son construidos usando métodos convencionales (Ausubel et al. , (1987) en "Current Protocols in Molecular Biology" , John Wiley and Sons, Nueva York, Nueva York) o pueden estar comercialmente disponibles. Otro aspecto de esta invención se refiere a un organismo huésped en el cual se ha insertado el vector de expresión recombinante que contiene toda o parte de la secuencia de ácido nucleico. Las células huésped transformadas con la secuencia de ácido nucleico de esta invención incluye eucariotes, tales como, células de animales, plantas o semillas, insectos y levaduras, células fúngales y procariotes, tales como, E. coli u otras bacterias. Ejemplos de células huésped fúngales incluyen, pero no están limitadas a, Aspergillus, Trichoderma, Humicola, Penicillium o Neurospora. Los medios mediante los cuales puede introducirse el vector que porta el gene en la célula incluyen , pero no están limitados a, transformación , microinyección , electroporación, transducción o transfección usando D EAE-dextrano, lipofección, fosfato de calcio u otros procedimientos conocidos por alg uien experto en la técnica (Sambrook et al. ( 1 989) en "Molecu lar Cloning . A Laboratory Manual" , Cold Spring Harbor Press, Plainview, Nueva York) . De manera alternativa, las células de Chrysosporium pueden transformarse con la secuencia de ácido nucleico de esta invención para amplificar la producción de celulasas por Chrysosporium. En una modalidad preferida, se usan los vectores de expresión que funcionan en células fúngales. Ejemplos de tales vectores incluyen, pero no están limitados a, plásmidos, descritos en las patentes (Ogawa; patente japonesa JP5095787 A 930420, Ozeki; patente japonesa JP7115976 A 950509, Murakami; patente japonesa JP3094690 A 910419, Ishida; patente japonesa JP3251175 A 911108, Uozumi; patente japonesa JP5268953 A 931019 DW9346 C12N-009/34 011pp, Gottschalk; patentealemana DE3908813 A 900920 DW9039000 pp, Gysler, patente europea EP-683228 A2 951122 DW9551 C12n-015/60 Eng 041 pp). Se prefiere que el vector de expresión de proteína recombinante se introduzca en células fúngales, para asegurar el procesamiento y modificación apropiados y la modificación de la proteína introducida. En una modalidad adicional, la proteína recombinante expresada por las células huésped puede obtenerse como un lisado crudo o puede purificarse mediante procedimientos de purificación de proteína estándares conocidos en la técnica, los cuales pueden incluir precipitación diferencial, cromatografía de tamiz molecular, cromatografía de intercambio de iones, enfoque isoeléctrico, electroforesis en gel, cromatografía por afinidad e inmunoafinidad y similares (Ausubel et. al., (1987) en "Current Protocols ¡n Molecular Biology" John Wiley and Sons, Nueva York, Nueva York). En el caso de cromatografía por inmunoafinidad, la proteína recombinante puede purificarse mediante el paso a través de una columna conteniendo una resina, la cual tiene ligados a ella anticuerpos específicos para la proteína de interés (Ausubel et. al., (1987) en "Current Protocols in Molecular Biology" John Wiley and Sons, Nueva York, Nueva York). También puede usarse todas o partes de las secuencias de ácidos nucleicos de esta invención como sondas para aislar otros homólogos en otros géneros o cepas. En una modalidad preferida, las secuencias de ácidos nucleicos son usadas para clasificar una genoteca de Chrysosporium; los clones positivos son seleccionados y secuenciados. Ejemplos de fuentes a partir de las cuales puede sintetizarse la genoteca incluyen, pero no están limitadas a, especies de Chrysosporium, Aspergillus, Penicillium, Humicola, Cephalosporium, Tricoderma o bacterias tales como Bacillus. Alguien experto en la técnica entenderá las condiciones de hibridación apropiadas a ser usadas para detectar los homólogos. Métodos convencionales para hibridación de ácidos nucleicos, construcción de genotecas y técnicas de clonación se describen en Sambrook et al., (eds) (1989) en "Molecular Cloning. A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Press, Plainview, Nueva York y Ausubel et al., (eds) en "Current Protocols in Molecular Biology" (1987), John Wiley and Sons, Nueva York, Nueva York. Esta invención también se refiere a cepas mutantes de Chrysosporium, en particular, cepas mutantes de Chrysosporium lucknowense capaces de producir celulasas neutrales y/o alcalinas. Los métodos de mutagénesis de DNA y clasificación de mutantes son bien conocidos para los expertos en la técnica e incluyen una variedad de métodos químicos y enzimáticos. Ejemplos de tales métodos incluyen, pero no están limitados a, exposición de los hongos a luz ultravioleta (UV) , ácido nitroso, N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NG), y 4-nitroquinolina-N-óxido (4NQO) . (Leninger (1972) Biochemistry, Worth Publishers I nc. , NY; Jeffrey H. Miller (1 972) "Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Springs Harbor, Nueva York). Los métodos preferidos, incluyen UV y NG. A manera de ejemplo, las cepas mutantes de Chrysosporium capaces de producir niveles incrementados de composiciones de celulasas exhibiendo actividad enzimática a pH's neutrales y/o alcalinos pueden generarse mediante mutagénesis de UV. A manera de ejemplo, pueden producirse mutantes mediante exposición de las esporas fúngales a la luz UV durante un periodo desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 180 segundos, de preferencia 45 hasta aproximadamente 90 segundos, y muy preferiblemente 65 hasta 75 segundos. La m utagénesis que involucra NG puede involucrar variar la concentración de la NG y tiempo de exposición. A manera de ejemplo de NG , a aproximadamente 1 3 miligramos/litro (mg/l) hasta aproximadamente 400 mg/l de NG pueden usarse durante un periodo de exposición desde aproximadamente 15 minutos hasta aproximadamente 120 minutos. Los métodos alternativos para generar mutahtes incluyen técnicas en el cam po de la biolog ía molecular. Ejemplos de tales técnicas incluyen. pero no están limitados" a, mutagénesis dirigida por oligonucleótidos, mutaciones de rastreo de enlazador o mutagénesis dirigida por oligonucleótidos usando reacción en cadena de polimerasa (Ausubel (1 987) Current Protocols in Molecular Biology) .

La clasificación y selección de clones de Chrysosporium mutantes que exhiben producción de celulasa mejorada también puede realizarse mediante metodología convencional. Ejemplos de criterios de selección para clasificar mutantes incluyen, pero no se limitan a, la capacidad de la colonia fungal para romper celulasa como es evidenciado mediante la clarificación de celulosa por los hongos crecidos en placas de medio conteniendo celulosa y velocidad de crecimiento incrementada en medios conteniendo celulosa. A manera de ejemplo, después de la mutagénesis la muestra fungal puede colocarse en placas de agar conteniendo celulosa mediante metodología convencional. Pueden seleccionarse colonias que exhiben crecimiento incrementado y clarificación de celulosa (como es evidenciado por la clarificación del medio que rodea el aislado). Una vez que un mutante se aisla, el tallo o esporas derivadas del mutante puede mantenerse mediante metodolog ía convencional. Los mutantes aislados por este método pueden cultivarse o fermentarse bajo las condiciones descritas en la presente y por encima para las cepas de tipo natural de Chrysosporium. Los componentes enzimáticos individuales de la composición de celulasa producida por los mutantes pueden secuenciarse parcialmente o microsecuenciarse para el diseño sintético para aislar los genes q ue codifican las proteínas enzimáticas de interés. De esta manera, la invención se refiere a las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las enzimas de celu lasa producidas por los m utantes de Chrysosporium y a las enzimas por sí mismas. Todavía en otra modalidad de esta invención, los m utantes aislados pueden someterse a mutagénesis adicional y clasificarse mediante los métodos descritos antes en la presente.

La presente invención también se refiere a la producción, aislamiento y purificación de enzimas de celulasa, teniendo tanto actividad de endoglucanasa y/o celobiohidrolasa de organismos de Chrysosporium de cualquier especie y cepa deseada, y en donde la metodología de purificación no se limita a la especie del organismo. Tales fracciones de proteínas purificadas o parcialmente purificadas y enzimas preparadas a partir de las m ismas son, de acuerdo con la presente invención, altamente útiles en aplicaciones tales como, lavado con piedras, abrillantamiento de color, depilling y suavizado de tejido, así como otras aplicaciones bien conocidas en la técnica. Tales preparaciones de enzimas purificadas son fácilmente tratables para usarse como aditivos en detergente y otros medios usados para tales aplicaciones. Estos y otros métodos de uso se sugerirán fácilmente por sí mismos para aquéllos de habilidad en la técnica y no necesitan ninguna descripción detallada en la presente. Sin embargo, la descripción de los métodos normales para emplear estas preparaciones se proporciona en los ejemplos que sig uen. Todas las referencias de libros, patentes o artículos en la presente se incorporan por referencia. Los siguientes ejemplos ¡lustran varios aspectos de la invención pero no están incluidos para limitar la invención en ninguna m anera. Todos los porcentajes son en peso y todas las proporciones de mezclas de solventes son en volumen a menos que se indique de otra manera .

Materiales y métodos Ensayos de enzimas. El ensayo para CMCasa, usó carboximetilcelulosa como el substrato enzimático, midió la velocidad inicial de hidrólisis, y cuantificó la cantidad de azúcares reductores liberados de acuerdo con el método dé Somogyi y Nelson . El método es descrito en Methods in Enzymology, Vol. 160A, pp. 102-1 04. La actividad de endo-1 ,4-ß-glucanasa se ensayó de manera viscosimétrica, como una proporción de la disminución de viscosidad de CMC de substrato soluble de acuerdo a Bioorganicheskaya Khimia, Vol. 6, pp. 1225-1242 (ensayo endoviscosimétrico) . La actividad de papel filtro (FPA) o actividad de celulasa total usó papel filtro como el substrato y estimó la actividad requerida para liberar 2 mg de glucosa a partir de una muestra de 50 mg de papel filtro. El ensayo se pasa en la Commission on Biotechnology (I U PAC) para la medición de la actividad de celulasa total o celulasa verdadera y se describe en Methods in Enzymology, Vol. 1 60A, pp. 94-97. La actividad de avicelasa se estimó como la velocidad inicial para la formación de azúcares reductores durante la hidrólisis si es celulosa de Avicell (como se describe en Bioresource Technology, Vol. 52, pp. 1 1 9-124). El ensayo de ceíobiasa usó celobiosa como el substrato y midió la cantidad de g l ucosa liberada (descrita en Methods in Enzymology, vol. 160A, pp. 1 1 1 -1 1 2) . El ensayo de actividad de ß-glucosidasa usó p-nitrofenil-ß-D-glucósido como el substrato (descrito en Methods in Enzymology, Vol . 160A, pp. 1 09-1 1 00) . La proteína se determ inó mediante el método de Lowry (de acuerdo a Journal of Biological Chemistry, Vol. 1 93 , pp . 1 65-1 75) . El ensayo de RBB-CMCasa se basa en la determinación de la liberación de colorante de RBB-CMC de substrato soluble (CMC, teñida con Azul brillante remazol), referencia al ensayo -ver Megazyme (Australia) Ltd. , Product I nformation Bulletin, Abril, 1 995. La endo-celulasa también puede medirse usando el ensayo de Cellazyme con H E-celulosa reticulada con Azurine (ver Megazyme Product Bulletin CEL, Enero, 1996).

Ejemplo 1 - Aislamiento de la cepa C1 La cepa se aisló a partir de muestras de suelo alcalino de bosque de Sola Lake, Lejano Este de la Federación Rusa (costa del Pacífico de Rusia, aproximadamente a 8, 046.72 km al este de Moscú). Se recolectó una muestra de suelo mixto de 1 0 sitios diferentes. Se transfirió un g ramo de cada muestra en un matraz con 1 00 mil de ag ua corriente estéril y sonicada con un dispensador ultrasónico durante 1 minuto (0.44 Amp, 22 KHz) . La suspensión (diluida 1 :500) se inoculó en cajas petri con medio Czapek (pH 5.5-6.0) conteniendo 1 00 mg/l de estreptomicina. El estudio se cond ujo con tres réplicas. Las colonias de varios colores, formas y tamaños se identificaron para un segundo paso de aislamiento. El aislamiento adicional de la muestra se realizó en placas con medio Czapek, agar de malta , agar de dextrosa de papa , o medio de solución salina de Getchinson de pH 7.5 (Tabla 2). Las placas se incubaron a aproximadamente 28°C durante varios días. La selección para productores de celulasa se realizó en placas de agar de celulosa, las cuales contenían los componentes mostrados en la Tabla 1 . La preparación de celulosa amorfa se describe en Methods in Enzymology, vol . 1 60A.

Tabla 1. Placas de agar de celulosa Ingredientes g/? KH2P04 1 KCl 0.1 MgS04«7H20 0.3 NaCI 0.1 FeCI3 0.01 NaN03 2.5 Celulosa amorfa 5 Agar 15 PH 7.5 Las placas se incubaron durante 3-7 días a 28°c. La formación de halos de limpios alrededor de las colonias indicó la actividad de celulasas. Una cepa, designada en la presente como C1, que exhibió niveles significativos de actividad de celulasa se eligió para estudio adicional. La cepa se depositó en All-Russian Collection of Microorganisms of Russian Academy of Sciences, (VKM), abreviatura en inglés - RCM), Bakhrushina St. 8:Moscú, Rusia, 113184 bajo el Tratado de Budapest el 29 de agosto de 1996, como Chrysosporium lucknowense Garg 27K, VKM-F 3500 D).

Ejemplo 2 - Caracterización de la cepa C1 El crecimiento de la cepa C1 en agar de dextrosa de papa da colonias de 55-60 mm de diámetro después de 7 días. Las colonias C1 exhiben un color blanco-crema, la superficie es similar a terciopelo y tiene un centro ligeramente elevado. El borde de las colonias es plano, delgado y fibroso. El lado posterior de las colonias tiene un color crema claro. El micelio es vitreo y está ligeramente ramificado y suave. Las hifas son septado y forman esporas de 2.0-3.0 "micrómetros de ancho; las hifas de substrato son estériles. Los conidios son terminales y laterales. No se encontró ningún conidio intercalado. La mayoría de los conidios están conectados con las hifas a través de tallos cortos o ramificaciones laterales cortas. Los conidios están separados pero adyacentes. Los conidios son vitreos, de pared delgada, ovales o claviformes, y de célula simple. Su tamaño varía desde 4 hasta 1 0 micrómetros de diámetro. La cepa C 1 puede mantenerse en agar de extracto de malta (a 4°C), y se transfieren cada seis meses. El mantenimiento en nitrógeno líquido y mediante liofilización también es posible. La cepa C 1 es haploide, filamentosa, puede crecer en placas de agar con agentes de restricción de crecim iento como 'bovinebile' (1 .5%) y produce esporas.

Ejemplo 3 - Clasificación de la cepa C1 De acuerdo con l a clasificación de Sutton (Van Dorsch ot, C.A. N . [1 980] "A revisió n of Chrysosporium and al l ied g enera , " en Studies in Mycology, No. 20, Centraaddbureau voor Schimmelcultures, Baarn, Países Bajos, pp. 1 -36) , la ce pa C 1 de la presente invención pertenece al orden de Hyphomycetales, familia de Moniliaceae, género de Chrysosporium, especie de Chrysosporium lucknowense Garg 1 966. Esta clasificación se basó en la observación de las siguientes características de la cepa C1 : 1 . Signos del orden Hvphomycetales. Los conidios son producidos directamente en el micelio, en células esporógenas separadas o en conidioforos distintos. 2. Signos de la familia Moniliaceae. Tanto conidios como conidioforos (si están presentes) son vitreos o coloreados de manera brillante; los conidioforos son simples o en agrupamientos sueltos. 3. Signos del género Chrvsosporium Corda 1833. Las colonias usualmente están esparcidas, blancas, algunas veces de color crema, café pálido o amarillo, afieltradas y/o polvosas. Las hifas son en su mayoría vitreas y de pared suave, con ramificaciones irreg ulares, más o menos ortotópicas . Las hifas fértiles exhiben poca o ninguna diferenciación. Los conidios son terminales y laterales, tálicos, soportados por todas las hifas, sésiles o en salientes cortas o ramificaciones laterales, subvítreos o amarillo pálido, de pared delgada o gruesa, subg lobosos, claviformes, piriformes, orobovoides, de 1 célula, rara vez de 2 células, truncados. Los conidios intercalados están presentes algunas veces, son solitarios, ocasionalmente encadenados, sybvítreos o amarillo pálido, más amplios que las hifas de soporte, normalmente de 1 célula, truncados en ambos extremos . Las clamidosporas están presentes ocasionalmente. 4. Signos de la especie Chrysosporium lucknowense Garq 1 966. Las colonias alcanzan 55 m m de diámetro en agar de g lucosa de Sabou raud en 14 d ías , son de color crema, afieltrados y vellosos; densos y de 3-5 mm de alto; los márgenes son definidos, reg ulares y fimbriados; el reverso de color amarillo pálido a crema. Las hifas son vitreas, de pared suave y delgada, poco ramificadas. Las hifas aéreas son en su mayoría fértiles y casi septado, aproximadamente de 1 -3.5 mm de ancho. Las hifas sumergidas son infértiles, aproximadamente de 1 -4.5 mm de ancho estando retorcidas frecuentemente las hifas más delgadas. Los conidios son terminales y laterales, en su mayoría sésiles o en salientes cortas, frecuentemente cónicas, o ramificaciones laterales cortas. Los conidios son solitarios pero en estrecha proximidad uno con otro, desarrollando 1 -4 conidios en una célula hifal, subvítrea, de pared bastante delgada y suave, en su mayoría subglobosa, también claviforme, orobovoide, de 1 célula, 2.5-1 1 x 1 .5-6 mm , con cicatrices básales amplias ( 1 -2 mm). Los conidios intercalados están ausentes. Las clamidosporas están ausentes. 5. Descripción de la cepa C1 . Las colonias crecen hasta aproximadamente 55-60 mm de diámetro en tamaño en agar de dextrosa de papa en aproximadamente 7 d ías; son de color blanco-crema, afieltrados, de 2-3 mm de alto en el centro; los márgenes son definidos, regulares, fimbriados; el reverso de color crema, pálido. Las hifas son vitreas, de pared delgada y suave, poco ramificadas. Las hifas aéreas son fértiles, septado, de 2-3 mm de ancho. Las hifas sumergidas son infértiles. Los conidios son terminales y laterales; sésiles o en ramificaciones laterales cortas; ausentes; solitarios, pero en estrecha proximidad uno con otro, vitreos, de pared delgada y suave, subglobosos, claviformes u obovoides , de 1 célula , de 4-1 0 mm . Las clamidosporas están ausentes. Los conidios intercalados están ausentes.

Conclusión. La C1 es una cepa de Chrysosporium lucknowense Garg 1966. Para conveniencia, la celulasa hecha por esta cepa es referida en la presente como "C1 " o "celulasa C1 ".

Ejemplo 4 - Ensayo para actividad de celulasa La cepa C1 se hizo crecen en matraces de agitación de 800 mi girados a 220 rpm e incubados a 28°C. La cepa C1 se hizo crecer en medio de solución salina de Getchinson (Ver Tabla 2) (pH 7.5) conteniendo 5 g/l de varios nutrientes, y en algunos casos con 2 g/l de celulosa microcristalina . Se adicionaron cien mi de medio a cada matraz.

Tabla 2. Medio de Getchinson para matraces de agitación g/? KH2P04 1 KCl 0.1 MgS04«7H20 0.3 NaCl 0.1 FeCi3 0.01 NaNo3 2.5 Las com binaciones de glucosa y celulosa microcristalina, dextrosa y celulosa microcristalina , g licerol y celulosa microcristalina, lactosa y celulosa microcristalina resultaron en crecimiento muy bajo, formación de grandes agreg ados de micelio y en la ausencia de actividades de celulasa (ensayo de CMCasa) . Los resultados se presentan en la Tabla 3. Las adiciones de fuentes orgánicas de nitrógeno, es decir, peptona, licor de infusión de maíz, o extracto de levadura intensificaron el crecimiento y producción de celulasa y no resultaron en agregados de micelio. La lactosa y el extracto de levadura dieron la producción de celulasa más alta por C 1 . Se obtuvieron resultados similares cuando la lactosa y el extracto de levadura se substituyeron con 25 g/l de pulpa de remolacha dulce, 1 5 g/l de malta de cebada y 5 g/l de salvado de trigo.

Tabla 3. Efecto de fuentes de carbono y nitrógeno en la actividad de CMCasa de C 1 (resultados de matraces de agitación) Substrato Actividad de CMCasa (unidades/ml) a pH 7.0 Días 3 5 7 Glucosa + celulosa 0 0 0 Dextrosa+celu losa 0 0 0 Glicerol+celulosa 0 0 0 Lactosa + celulosa 0 0 0 Lactosa + licor de infusión de maíz 0 0 0.9 Lactosa + peptona 1 0.7 7.4 14.8 Lactosa + extracto de levadura 0 1 8.5 1 0.0 Celulosa + peptona 0.3 1 .2 1 .6 Celulosa + licor de infusión de maíz 1 .9 2.8 5.5 Ejemplo 5 - Producción de celulasa para pruebas de lavado con piedras 1 . Producción en matraces de agitación. La cepa C 1 se hizo crecer en matraces de agitación de 800 mi girados a 220 rpm e incubados a 28°C durante siete días. El medio de crecimiento, 100 mi por matraz, fue medio de solución salina de Getchinson (ver Tabla 2) (pH 7.5) conteniendo 25 g/l de pulpa de remolacha dulce, 1 5 g/l de malta de cebada y 5 g/l de salvado de trigo. La masa celular se separó mediante centrifugación y el sobrenadante libre de células se liofilizó y se almacenó para pruebas adicionales. Se produjeron de esta manera preparaciones de celulasa C1 #s 47.1 .1 a 47.15.1 . La preparación de C1 # 47.16.1 se produjo mediante la misma manera, pero el sobrenadante libre de células después de la centrifugación fue sometido a ultrafiltración usando una membrana de corte de 1 0 kDa antes de la liofilización. Las preparaciones de C1 #'s 47. 1 8.1 a 47.22.1 se produjeron mediante la misma manera en matraces de agitación con medio de Getchinson, pero conteniendo lactosa (0.5% p/v) y peptona (0.5% p/v) en lugar de pulpa de remolacha dulce, malta de cebada y salvado de trigo. La masa celular se separó mediante centrifugación y el sobrenadante libre de células se liofilizó y almacenó para pruebas adicionales. Las preparaciones #'s 47.1000, 47.1 001 , 47.2000 & 47.2001 se produjeron en matraces de agitación mediante la misma manera que las preparaciones #'s 47. 1 .1 - 47.1 5.1 excepto que se produjeron usando otras cepas de Chrysosporium. De manera específica, 47.2001 fue producida por Chrysosporium pannorum, la preparación 47.2000 fue producida por Chrysosporium pruinosum~ la preparación 47.1 001 fue producida por Chrysosporium keratinophilim y la preparación 47.1000 fue producida por Chrysosporium queenslandicum (ver Ejemplo 8) . El contenido de proteína y las huellas de actividad de estas preparaciones de C1 se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4. Contenido de proteína y huellas de actividad de preparaciones de C1 y preparaciones #'s 47.1 000 , 47.1001 , 47.2000 & 47.2001 , las cuales se prepararon a partir de otras especies de Chrysosporium sp. Prepara- Proteína, FPA, CMCasa, Endo Avicelasa, ß-gluco ción # % FPU/g U/g (vise), U/g U/g sidasa, U/g 47.1.1 22 13 170 120 23 135 47.2.1 26 14 137 110 22 190 47.3.1 15 19 140 128 18 198 47.4.1 18 23 150 133 55 220 47.5.1 16 20 179 120. 81 185 47.6.1 17 22 224 134 82 280 47.7.1 8 4 75 123 10 22 47.8.1 22 14 168 123 19 124 47.9.1 28 15 204 174 23 151 47.10.1 24 11 181 185 16 147 47.11.1 28 16 234 191 25 269 4712.1 26 14 167 138 20 178 47.13.1 25 9 137 110 13 141 47.14.1 15 6 39 33 9 59 47.15.1 14 6 95 44 10 75 47.16.1 16 10 146 39 15 107 47.17.1 7 3 100 34 5 29 47.18.1 10 30 120 38 10 42 47.19.1 14 4 28 10 4 11 47.20.1 14 6 17 5 1 9 47.21.1 13 3 34 5 3 9 47.22.1 14 5 35 6 3 10 47.1000 18 4 31 35 6 89 47.1001 13 6 103 38 10 66 47.2000 10 3 78 31 7 67 47.2001 13 3 45 39 7 4 47.0325 50 155 4965 964 184 248 47.0528 67 111 13500 1782 232 423 2. Producción en termentadores. La celulasa C1 se produjo en un termentador "ANKUM-1M" de 10 I con medio Getchinson, lactosa (0.5% p/v) , peptona (0.5% p/v) y cloranfenicol (50 mg/ml) . Ei volumen inicial del medio de nutrición fue 7.0 I, el volumen final después de la fermentación fue 7.3 I. La concentración de oxígeno disuelto (DO), velocidad de agitación, nivel de aereación, temperatura y pH fueron controlados. La fermentación se realizó como un modo de lote. La temperatura de la fermentación se controló a 28°c. El pH inicial fue 7.5 y posteriormente se mantuvo a 4-5 I/minuto y una agitación a 400-500 rpm. La DO se mantuvo por encima de 50% . Se tomaron muestras (30 mi) para análisis cada 8 horas. Al final de la fermentación, la biomasa fungal se separó mediante centrifugación (1 0, 000 g , temperatura ambiente, 20 minutos) , y el filtrado del cultivo se lioflilizó y almacenó para pruebas adicionales. Los resultados se muestran en la Tabla 5. La preparación de celulasa # 47. 1 7.1 fue producida en esta manera. El contenido de proteína y huellas de actividad de esta preparación de C1 se muestra en la Tabla 4.

Tabla 5. Producción de celulasa C 1 en el termentador de 1 0-1 Tiempo (h) DO (%) Azúcares reductores (g/l) CMCasa (U/ml) 0 1 00 4.8 0 8 90 4.7 0 16 54 4.4 0 24 66 1 .2 4 32 70 0.4 1 0 40 73 0.3 1 1 .5 48 70 0.1 5 56 70 0 1 3. Producción de las preparaciones de C 1 #'s 47.0325 y 47.0528. La preparación de celulasa C 1 # 47.0325 se produjo usando la cepa C 1 de tipo natural , la preparación # 47.0528 se produjo usando un mutante mejorado obtenido a partir de la cepa C1 de tipo natural. Estas preparaciones se hicieron crecer en termentadores bajo las condiciones descritas en los Ejemplos 1 3 y 1 5. La preparación 47.0325 se produjo usando una fermentación por lote y 47.0528 se produjo usando un protocolo de fermentación por lote alimentado. 4. Preparación de las preparaciones de tipo natural Humicola #'s 14.22.1 & 14.23.1 . La preparación de Humicola grísea var. thermoidea de tipo natural # 14.221 se produjo a partir de la cepa de ATCC 1 6453 y la preparación de Humicola insolens de tipo natural # 14.23.1 se produjo a partir de la cepa ATCC 1 6454. Estas preparaciones de tipo natural de Humicola se produjeron en matraces de agitación usando el mismo método como se describió antes para (Producción en matraces de agitación) de las preparaciones de C1 #'s 47. 1 .1 - 47.15.1 .

Ejemplo 6 - Comparación de C 1 con otras celulasas neutrales Las actividades de FPA, CMCasa y endoglucanasa de la preparación de enzima C 1 # 47.0528 se compararon con las celulasas neutrales de _ Humicola insolens comercial (Denimax XT) , y a Humicola de tipo ATCC natural (preparaciones #'s 14.221 Humic.ola grísea var. ihermoidea (ATCC 1 6453) & 14.23.1 Humicola insolens (ATCC 1 6454) . Los resultados se dan en la Tabla 6. Las actividades totales de C 1 # 47.0528 son claramente mayores que aquéllas de celulasas neutrales de Humicoia tipo natural y de la preparación comercial de Humicola insolens. Las actividades de CMCasa y endoglucanasa específicas (como unidades por g ramo de preparación seca o unidades por gramo de proteína) de C1 47.0528 son mayores que aquéllas de todas las preparaciones de Humicola probadas listadas en la Tabla 6. La FPA específica de C-1 # 47.0528 es mayor que la FPA específica de las preparaciones de tipo natural de Humicola # 14.221 & 14.23 y ligeramente menor que la FPA específica del producto comercial de Humicola insolens, producto de Denimax XT. El pH y estabilidad térmica de la celulasa C 1 fue similar a Denimax XT.

Tabla 6. Comparación de celulasas de C1 y Humicola Proteína % FPA CMCasa Endo (vise) FPA CMCasa Endo (vise) Unidades/1 gramo de preparación seca Unidades/1 gramo de proteína C1 67 111 13,500 1782 165 20,115 2,655 (47.0528) Humicola 10 28 30 20 280 300 sp. (# 14.23.1 ) Humicola 10 11 19 10 110 190 sp. (# 14.23.1 ) Denimax 13 25 450 99 192 3,460 761 XT (comercial) (*) Las actividades se midieron a pH 5.0 y 50°C Ejemplo 7 - el efecto de pH y temperatura sobre la actividad y estabilidad de las actividades de FPA y CMCasa de C 1 Las actividades de FPA y CMCasa de C1 exhiben óptima estabilidad y actividad a aproximadamente pH 6-7 y aproximadamente 50-60°C; el pH óptimo para la actividad de CMCasa es aproximadamente 6.5, y la temperatura óptima es aproximadamente 55°C (ver Tablas 8,9) . A pH 8.0 (50°C), la CMCasa posee 80% de actividad, y FPA - 78% de actividad, a pH 9.0 (50°C), la CMCasa posee 65% de actividad , y FPA - 52% de actividad (ver Tabla 7).

Tabla 7. El efecto de pH en las actividades de FPA y CMCasa de celulasa C 1 (#47. 1 9.1 ) a 50°C pH (50°C) FPA (%) CMCasa (%) 4.0 50 60 4.5 68 70 5.0 75 78 5.5 80 80 6.0 92 90 6.5 1 00 1 00 7.0 95 95 7.5 90 92 8.0 78 80 8.5 60 75 9.0 52 65 El tiempo de incubación para el ensayo fue 60 minutos, el tiempo de incubación para el ensayo de CMCasa fue 5 minutos.

Tabla 8. El efecto de temperatura en las actividades de FPA y CMCasa de celulasa de C1 (#47.19.1 ), a pH 7.0 Temperatura (°C) FPA (%) CMCasa (%) 40 45 50 45 60 55 50 70 65 55 100 1 00 60 70 60 65 40 30 70 20 25 El tiempo de incubación para el ensayo de FPA fue 60 minutos, el tiempo de incubación para el ensayo de CMCasa fue 5 minutos.

Tabla 9. Estabilidad de CMCasa de celulasa C1 (#47.1 9.1 ) a 50°C Actividad de CMCasa restante (%) pH 5.1 pH 7.2 pH 7.7 pH 8.5 0 100 100 100 100 0.5 100 98 95 85 1 100 95 93 55 2 100 82 75 32 3 100 78 65 25 5 100 75 45 15 La CMCasa de C1 exhibe alta estabilidad a pH óptimo y temperatura: Por ejemplo, a pH 7.2 y 50 °C, la CMCasa posee 95% de actividad después de 1 hora y 75% de actividad después de 5 horas, a pH 7.7 y 50°C, la CMCasa posee 93% de actividad después de 1 hora y 45% de actividad después de 5 horas (Ver Tabla 9).

Ejemplo 8 - Actividad/desempeño de celulasa neutral y/o alcalina demostrada en otras cepas del mismo género de Chrysosporium Se probaron varias cepas del género de Chrysosporium para la producción de celulasa. Los nombres completos y orígenes de estas especies se describen más adelante. Las cepas obtenidas de la American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, incluyen: 1. ATCC 44006 Chrysosporium lucknowense 2. ATCC 34151 Chrysosporium pannorum 3. ATCC 24782 Chrysosporium pruinosum Las cepas obtenidas de la Russian Collection of licroorganisms (VKM) incluyen: 1. VKMF-2119 Chrysosporium keratinophilum 2. VKMF-2875 Chrysosporium keratinophilum 3. VKMF-2120 Chrysosporium lobatum 4. VKMF-2121 Chrysosporium merdarium 5. VKMF-2116 Chrysosporium queenslandicum 6. VKMF-2117 Chrysosporium queenslandicum 7. VKM F-2877 Chrysosporium tropicum Dos tipos de medios de crecimiento se usaron en este estudio: medio A - Getchinson con prensa de remolacha, malta de cebada y salvado de trigo; y medio B - Getchinson con peptona y lactosa. Las composiciones de los medios se describen en la Tabla 1 1 .

Tabla 1 1 . Med ios para esti dios de matraz Medio A g/? Medio B g/? K2H P04 1 K2HP04 1 KCl 0. 1 KCl 0. 1 MgS04«7H20 0.3 MgS04«7H2 :O 0.3 NaCI 0. 1 NaCI 0. 1 FeCI3 0.01 FeCI3 0.01 NaN03 2.5 NaN03 2.5 Pulpa de remolacha du [ I ce 25 Lactosa 5 Malta de cebada 1 5 Peptona 5 Salvado de trigo 5 PH 7.5 pH 7.5 Las cepas se hicieron crecer en matraces de agitación a 220 rpm y a 28°C . Las muestras de cada cepa que crecieron en Medio A, se tomaron para an álisis después de 6 y 7 días de cultivo. Las muestras de las cepas que crecieron en Medio' B, se tomaron después de 5 días en cultivo. Todas las muestras se ensayaron para actividad de CMCasa a pH 5 y 7. Los resultados del ensayo de CMCasa se muestran en la Tabla 1 2.

Tabla 1 2. P roducción de celulasa por diferentes cepas de Chrysosp orium Cepas Medio A (6 días) M e d io A (7 d ías) M edio B (5 d ías) RS CMCasa RS CMCasa RS CMCasa pH 5 pH 7 pH 5 pH 7 pH 5 pH 7 1. VK F 2117 2.7 0 0.46 2.6 0.00 0.00 2.3 0.21 0.09 2. VKMF 2116 1.1 0.22 0.04 0.2 0.38 0.61 4.0 0.58 0.59 3. VKMF 2121 1.9 0 0.57 1.1 0.25 0.10 2.5 0.25 0.09 4. ATCC 24782 3.4 0.33 1.40 1.9 1.85 .011 3.0 1.10 0.06 . ATCC 34151 1.0 1.54 0.90 0.9 0.17 0.20 4.3 0.81 0.90 6. ATCC 44006 4.4 0.21 0.49 2.0 0.68 0.34 2.5 1.29 0.06 7. VKMF 21 19 4.1 0 0.08 2.7 0.29 0.00 3.8 0.95 0.04 8. VKMF 2120 4.5 0 0.17 2.3 0.23 0.00 2.3 0.12 0.00 9. VKMF 2875 1.6 0 1.01 1.7 0.00 0.00 3.8 1.96 0.05 . VKMF 2877 2.4 0 0.03 0.8 0.22 0.00 5.0 0.43 0.00 11. C1 (VKMF 2.9 1.70 1.65 nt nt nt 0.1 0.89 0.80 3500D) RS = concentración de azúcares reductores en el medio de fermentación al final de la fermentación, g/l (Método de Nelson-Somogyi) pH 5, pH 7 = los valores de pH bajo los cuales se ensayó la actividad de CMCasa del caldo de fermentación . Actividad de CMCasa en U/ml. nt = no probado En los casos de las cepas de ATCC 341 51 Chrysosporium pannorum, ATCC 24782 Chrysosporium pruinosum, VKMF-2875 Chrysosporium keratinophilum, VKMF 2116 Chrysosporium queenslandicum, la masa celular se separó mediante centrifugación y el sobrenadante libre de células se concentró de 5 litros a 0.5 litro mediante ultrafiltración usando una membrana de corte de 10 kDa. Entonces se liofilizó el concentrado ultrafiltrado y se almacenó para las pruebas. Se usaron los siguientes números de preparaciones secas de celulasa: 47.2001 - ATCC 34151 Chrysosporium pannorum, 47.2000 - ATCC 24782 Chrysosporium pruinosum, 47.1001 - VKMF-2875 Chrysosporium keratinophilum, 47.1000 -VKMF 2116 Chrysosporium queenslandicum. El contenido de proteína y huellas de actividad de estas preparaciones se dan en la Tabla 4.

Ejemplo 9 - Pruebas de lavado con piedras A. Pruebas con una máquina de lavado especial de 2 I. Este sistema valora las características de desempeño de lavado con piedras en relación a la abrasión y retromanchado usando solo pequeñas cantidades de enzima. Desaprestado. Cuarenta piezas (30 g cada una, 25 x 20 cm) de tejido de mezclilla (rollo) (1.2 kg) se aprestaron en una lavadora casera a 60°C durante 20 minutos, usando una proporción de tejido:licor de 1:6 (7.2 I) y 0.5 g/l (3.6 g) de líquido Sandoclean PC (lavado no iónico y agente humectante en base de alcoholes grasos etoxilados con un promedio de 6 moles de óxido de etileno, 1 g/l (7.2 g) de Sirrix 2UD (secuestrante amortiguado ácido) y 1 g/l (7.2 g) de líquido Bactosol TK (alfa-amilasa estable a alta temperatura) a un pH de aproximadamente 5 a 6. Después de 20 minutos, el licor se drenó y las piezas se lavaron durante 5 minutos con una proporción de agua fría (14 I) líquido 1:10. Las piezas se secaron a 40°C y se usaron como un surtido de muestras comparables para la determinación de actividad de celulasa. El tratamiento de celulasa de las piezas de prenda se realizó en una máquina de lavado consistiendo de un tambor interno de tambor de 29 cm de diámetro - 10.61 de volumen total (el tambor gira a 20 rpm - cinco vueltas a la izquierda - cinco vueltas a la derecha). Cada pieza de tejido se cosió junto con 4 tapones de goma antes del tratamiento de celulasa para dar un empaque a la prenda que asegurara que el efecto mecánico ocurrió principalmente en el lado exterior más obscuro de la prenda. Cada tambor se llenó con un empaque y 10 tapones de goma adicionales. Las condiciones generales de lavado fueron: 30 g de tejido de jeans de mezclilla desaprestado, celulasa en amortiguador de citrato 0.02 M, 50°C, 60 minutos, proporción prenda:licor 1:4. Después del tratamiento de celulasa, el empaque se lavó con agua caliente (50°C) (proporción prenda:líquido 1:20) durante 5 minutos y se secó para la evaluación. Las pruebas de aplicación se condujeron usando varias preparaciones de celulasa C1 junto con otras preparaciones de celulasa preparadas a partir de diferentes especies de Chrysosporium, así como los productos comerciales de celulasas neutrales de Novo Nordisk, Denimax XT (patente estadounidense # 4,435,307) y Ultra MG (WPO 91/17243). Estas pruebas de aplicación se establecieron para evaluar las características del desempeño de lavado con piedras de C-1 , así como otras diversas especies de celulasas de Chrysosporium vs celulasas neutrales comerciales de Novo. Las pruebas se corrieron a pH's neutrales y alcalinos (6.5, 6.7, 7.0 y 9-0). Los resultados se presentan en la Tabla 13. Las prendas tratadas con varias preparaciones de C1 y otras celulasas de Chrysosporium mostraron características de desempeño de lavado similares a aquéllas de las celulasas neutrales comerciales Denimax XT y Denimax Ultra MG. Las preparaciones de C-1 y otras celulasas de Chrysosporium mostró buen efecto de suavizado, reducción de matiz global/blanqueo, niveles de abrasión así como bajos valores de retromanchado cuando se corrieron bajo condiciones de pH neutrales y alcalinos. La medición Datacolor se basa en el grado de luminosidad de la muestra (reflectancia) . La muestra se expone a luz blanca (2 lámparas de flash Xenón de pulsos) y la remisión se detectó entre 400 y 700 nm con 16 diodos. A mayor valor de la reflectancia del lado frontal , mayor abrasión. A mayor valor de la reflectancia del lado posterior, mayor retromanchado. 1 13 to 0.02MP = sistema amortiguador de fosfato 0.01 CA = sistema amortiguador de ácido cítrico T. reesei CO = producto comercial de celulasa acida producido a partir de Trichoderma reesei. Abrasión datacolor = reflectancia del lado frontal, a mayores valores, mayor la abrasión, blanco = 9.1 Retrom. Datacolor = reflectancia del lado posterior, a menores valores, menor el retromanchado %OWG = por ejemplo, para 1 % OWG, se usó 0.4536 kg de enzima en 45.36 kg de prenda B. Pruebas con máquina de lavado de 1 5.87 kg . Las pruebas de aplicación se corrieron en una máquina de lavado de 1 5.87 kg (la marca de la máquina de lavado de 1 5.87 kg es Milnor - las RPM de la lavadora son 30). El tamaño de la carga es 2400 g (3 prendas), las prendas usadas son jeans Levi's 505. El nivel de agua para el baño de celulasa es 1 5 I para una proporción de licor de 6.25: 1 (baja). El nivel de agua para todos los demás baños es 24 I para una proporción de licor de 1 0: 1 (Med) . El sistema amortiguador usado es MAP - fosfato de monoamonio y DAP -fosfato de diamonio para mantener el pH de 6.7 durante el baño de celulasa. En las Pruebas 4, 5, 6 & 7, se adicionó u n detergente no iónico al baño de celulasa, se sabe que adicionar un detergente al baño de celulasa ayudará a reducir el retromanchado en las prendas. Zeke es un producto de desaprestado. SSCE es Superscour, un detergente no iónico (Zeke y Super Scour son productos químicos comerciales de especialidades textiles ofrecidos por CPN International, Ltd. , Inc. de Júpiter, Florida). Un ejemplo de las fórmulas de lavado usado en estas pruebas es la Prueba 2 a continuación; Fórmula de lavado - Prueba 2 (C-1 47.0528) En el ejemplo anterior, y en uso comercial, alguien experto en la técnica apreciará que el uso de piedra pómez en el proceso de lavado con piedras intensificará el efecto de lavado con piedras global en las prendas.

Los resultados en la Tabla 14 muestran que las preparación de celulasas C1 # 47.0325 y # 47.0325 se desempeñaron mejor en términos del nivel global de abrasión lograda en las prendas y bien dentro del rango del nivel de retromanchado de los demás productos comerciales de celulasas neutrales probados.

Tabla 14. Comparación de preparaciones de celulasa C-1 47.0325 & 47.0528 con celulasas neutrales comerciales Denimax XT & BTU 202 - 318 (que contiene Denimax XT) Prueba Celulasa %OWG Peso(g) Detergente T(°C) pH t(min) 1 Denimax XT 0.50 12.0 No 54.44 6.7 75 2 C-1 47.0528 0.05 1 .2 No 51 .67 6.7 75 3 C-1 47.0325 0.1 0 2.4 No 51 .67 6.7 75 4 Denimax XT 0.50 12.0 Si 54.44 6.7 75 C-1 47.0528 0.05 1 .2 Si 51 .67 6.7 75 6 C-1 47.0325 0.10 2.4 Si 51 .67 6.7 75 7 BTU 202-31 8 2.50 60.0 Si 54.44 S B 75 ABRASIÓN RETROMANCHADO (Más a menos) (Menos a más) Prueba 5 Prueba 4 Prueba 6 Prueba 5 Prueba 2 Prueba 6 Prueba 3 Prueba 3 Prueba 4 Prueba 1 Prueba 1 Prueba 2 Prueba 7 Prueba 7 Leyenda de figura para la Tabla 14. Todas las pruebas en la Tabla 14 se limpiaron con Super Scour (detergente no iónico) a 1 .0% OWG, 71 .1 1 °C durante 5 minutos. SB = amortiguado por sí mismo - el producto comercial "ROCKSOFT" BTU 202-31 8 contiene Denimax XT, detergente y un sistema amortiguador, así como otros aditivos para ayudar a intensificar el desempeño de lavado con piedras de este producto comercial.

C. Pruebas con máquina de lavado especial de 60 1. Las prendas de denim completas se desaprestaron como se describe para las pruebas de máquina de lavado de 2 I . Cada prueba de lavado se h ico con 1 par de jeans (700 g) , 2.8 l de l íquido (proporción tejido: ! íquido 1 :4) . Todos los jeans fueron del mismo lote de teñido. Se prelavaron usando un método de oxidación durante 1 5 mi nutos, entonces se secaron. Los jeans azules se lavaron a pH neutral con preparaciones de celulasa C 1 formuladas 47.0325 usando 2.4 g ramos por prueba, y 47.0528 usando 1 .5 g ramos para una prueba y usando 1 .0 gramo para una segunda prueba, se compararon directamente contra jeans azules lavados bajo condiciones de pH neutral y formulaciones similares usando Denimax XT a 12 gramos por prueba y otras dos celulasas neutrales comerciales, Bactosol J E usando 2.0% OWG y BTU 202-318 usando 2.0% OWG (Bactosol JE y BTU 202-318 contienen Denimax XT, amortiguador, detergente, así como otros aditivos para intensificar su desempeño de lavado). La Tabla 1 5 muestra que los jeans azules de las tres pruebas de C-1 sobredesempeñaron los tres productos comerciales de celulasa neutral en términos del nivel de abrasión alcanzado, así como la reducción de color global de las prendas. El nivel de retromanchado en los jeans azules de las seis pruebas fue muy bueno, fueron muy similares uno a otro, y lo que uno esperaría y vería al usar celulasa neutral de Novo Denimax XT. Los valores de retromanchado para los tres de estas pruebas de C-1 estuvieron dentro del rango de los valores de retromanchado mostrados en la Tabla 1 3. Las prendas acabadas de estas pruebas y las pruebas como se evaluaron y mostraron en la Tabla 14 anterior, se evaluaron en un estudio a ciegas por cuatro grupos independientes, de tres o más gentes por grupo. La gente que formó cada uno de estos grupos son considerados a ser expertos en la técnica de lavado con piedras. Se les pidió que colocaran cada una de las prendas en el sig uiente orden: ( 1 ) La mayor abrasión global y reducción de color a la menor abrasión g lobal y reducción de color; y (2) en cuanto al retromanchado, el nivel más bajo de retromanchado al nivel más alto de retrolavado (Ver Tabla 1 5) . _ Tabla 1 5 PRUEBA ENZIMA DOSIFICAAMORTIGUA DETERGENABRASIÓN/ RETRO- CIÓN -DOR TE REDUCCIÓN MANCHADO DE COLOR Prueba A C-1 47.0528 1.5 gramos Fosfato Si ++++++ 5 Prueba B C-1 47.0528 1.0 gramos Fosfato Si +++++ 2 Prueba C C-1 47.0325 2.4 gramos Fosfato Si +++++ 4 Prueba D Denimax XT 12.0 gramos Fosfato Si ++++ 3 Prueba E BTU 202-318 2.0% OWG Fosfato Si +++ 6 Prueba F Bactosol JE 2.0% OWG Citrato Si +++ 1 Leyenda para la Tabla 1 5: Abrasión/Reducción de color - ++++++ (+6) mejor (=>++++ (4) es considerado bueno y fue comparable con las celulasas neutrales comerciales (por ejemplo, Denimax XT) Retromanchado - El número menor es el mejor (todos los jeans fueron considerados por estar dentro del rango de retromanchado, como el encontrado cuando se usa Denimax XT de Novo). La celulasa neutral disminuyó significativamente el retromanchado comparado con celulasas acidas tradicionales, tales como Trichoderma (ver Ejemplo 1 3) %OWG - % de peso de la prenda (por sus siglas en inglés), por ejemplo 45.36 kg de peso seco de jeans a 1 % OWG , se usa 0.4536 kg de enzima.

D. Reflectancia de luz. Otra prueba para evaluar el retromanchado es medir la reflectancia de luz de un tejido tratado. Al final del tratamiento de lavado, se analizaron muestras de jeans usando un reflectómetro a dos diferentes longitudes de onda: (1 ) mientras mayor sea la señal detectada a 680 nm (medida en el exterior de los jeans), menor será el retromanchado; y (2) mientras mayor sea la señal detectada a 420 nm (medida en el interior de los jeans), menor será el retromanchado. La Tabla 16 compara los valores de reflectancia de jeans de mezclilla después de tratamiento con celulasas comerciales de Novo Nordisk y Genencor International con la preparación de C-1 # 47.6. 1 .

Tabla 1 6 Enzima 680 nm 420 nm Denimax L (celulasa neutral, Novo) 23 20 Primafast 100 (celulasa acida, Genencor) 20 1 3 C 1 47.6. 1 (celulasa neutral/alcalina) 22 1 8 Los valores de reflectancia de luz para la celulasa C1 fueron similares a aquellos obtenidos con el producto comercial Denimax L de Novo Nordisk, una celulasa neutral, tanto a 680 como 420 nm y los valores de reflectancia de luz para la celulasa C 1 fueron significativamente mejores que los obtenidos con el producto comercial Primafast 100 de Genecor, una celulasa acida, tanto a 680 como 420 nm .

E . Pruebas en la máquina de lavado semi-industrial. Prueba #1 . 2 jeans , peso 1 343 g Proporción de agua 6: 1 pH 5.5 Temp. 54°C Enzima: C1 (preparación # 47.6.1) 12 g (0.9%) Tiempo de abrasión 90 minutos Tirar baño Enjuagar 5 minutos con 1% de detergente no iónico a 66°C Tirar baño Enjuagar en frío Tirar baño Suavizar durante 5 minutos con suavizante catiónico a 49°C Extraer y secar.

Prueba #2. El mismo procedimiento como la Prueba #1 anterior, excepto que se usó enzima Denimax 700 T (2% OWG 28.9 g9 y las condiciones de lavado fueron conducidas a pH 7.0, 54°C. La celulasa C1 se comparó con Denimax 700 T, un producto comercial de celulasa neutral hecho por Novo. Todos los jeans fueron del mismo lote de teñido. Se prelavaron durante 15 minutos usando un método de oxidación y después se secaron. ~ Los jeans tratados con preparación de celulasa C1 # 47.6.1 mostraron ligeramente menos abrasión y menor retromanchado que los jeans tratados con celulasa Denimax 700T.

Ejemplo 10 - Celulasa C1 como un aditivo para detergente para ropa A. Liberación de manchas del algodón El desempeño de lavado de la preparación de celulasa C1 # 47.9.1 se probó usando el procedimiento de desempeño de lavado PW 9406 (Solvay). La liberación de manchas (tinta) del tejido de algodón se probó mediante Reflectancia Delta (%). La prueba comparó una preparación de celulasa C 1 (# 47.9.1 ) a Celluzyme 0.7 T de Novo Nordisk en la presencia y ausencia de proteasa alcalina Opticlean L500. Los resultados de esta prueba se muestran en la Tabla 17. La celulasa tiene propiedades de liberación de manchas de algodón manchado con tinta a pH neutral en un detergente para color como la enzima de celulasa de Humicola insolens.

Tabla 1 7. Prueba de lavado de detergente con celulasa C 1 (*) Enzima probada (pH 7.0) Dosificación Datos de Reflectancia (%) de CMCasa 1 2 (U/l) Celluzyme 0.7 T 200 3.68 4.75 Celluzyme 0.7 T 500 2.68 4.07 Celluzyme 0.7 T + 5000 DU/I (**) 200 2.07 3.13 Celluzyme 0.7 T + 5000 DU/I (**) 500 2.08 3.22 C 1 # 47.9.1 200 21.8 2.88 C 1 # 47.9. 1 500 2.77 3.72 C1 # 47.9.1 + 5000 DU/I (**) 200 1.15 1.91 C 1 # 47.9.1 + 5000 DU/I (* *) 500 2.81 3.30 Ning una (control) ninguna AADU = Du = unidad Delft, Du/I = u nidad Delft por litro (*) 40°C, 45 min, secado a 68°C , 75 mi n (**) proteasa alcalina Opticlean L500 B. La estabilidad de celulasa C1 con proteasas de serina Se usaron como proteasas de serina, una tripsina (3.2 µM , de páncreas de bovino, actividad 10, 000-1 3,000 N-bencil-L-argina etiléster (BAEE)/mg , Sigma T-8253) y una a-quimotripsina (8 µM, de páncreas de bovino, 40-60 U/mg , sigma C-41 29) . Las proteasas se incubaron con celulasa C1 a 20°C y pH 7.0. La qulmotripsina no disminuyó la actividad de C1 durante 1 2 horas y la tripsina condujo a un ligero decremento (alrededor de 20%) de actividad de C1 , ver Tabla 1 8. La tripsina y quimotripsina no cambió significativamente la estabil idad de CMCasa de C1 a pH-s 4.5 y 7.0 a 50°C y 57°C, ver Tabla 1 8.

Tabla 18. El efecto de proteasas en la actividad de CMCasa de celulasa C1 (#47.9.1) Proteasa Temperatura pH Tiempo de Actividad de (°C) incubación (h) CMCasa restante (%) Ninguna (control) 20 7.0 12 70 + quimotripsina 20 7.0 12 70 + tripsina 20 7.0 12 50 Ninguna (control) 50 4.5 3 100 + quimotripsina 50 4.5 3 100 + tripsina 50 4.5 3 100 Ninguna (control) 50 7.0 3 78 + quimotripsina 50 7.0 3 60 + tripsina 50 7.0 3 68 Ninguna (control) 57 4.5 3 62 + quimotripsina 57 4.5 3 60 + tripsina 57 4.5 3 62 Ninguna (control) 57 7.0 3 30 + quimotripsina 57 7.0 3 30 + tripsina 57 7.0 3 30 C. El efecto de citrato, EDTA, Tween-80 y Persulfato sobre la actividad de CMCasa Cambiar de amortiguador de acetato a citrato (un agente quelante) no tuvo efecto sobre la actividad de CMCasa de C 1 (molaridad de los amortiguadores - 0.1 M, pH 4.5, 50 y 57°C), ver Tabla 1 9. El EDTA (ácido etilen diamino tetraacético) (5 mM) como un agente quelante a pH 4.5 y 50°C no cambió la actividad de CMCasa. A pH 4.5 (57°C) y a pH 7.0 50°C, el EDTA provocó ligeras disminuciones en la actividad de CMCasa. A pH 7.0 y 57°C, el EDTA provocó un ligero incremento en la actividad de CMCasa, ver Tabla 1 9. El detergente no iónico Tween-80 (3 g/l , monooleato de sorbitan de polioxietileno), no cam bió la actividad de CMCasa de C 1 (a pH-s 4.5 y 7.0 y a 50 y 57°C, ver Tabla 1 9. El agente oxidante persulfato (3 g/l) no cambió la actividad de CMCasa de C1 (a pH-s 4.5 y 7.0 ya 50 y 57°C), ver Tabla 19. La CMCasa C 1 es resistente a proteasas de serina (tripsina y quimotripsina) , agentes quelantes (EDTA, citrato) , detergente no iónico (Tween-80) y a agente oxidante (persulfato).

Tabla 19. El efecto de citrato, EDTA, Tween-80 y persulfato sobre la actividad de celulasa C 1 (#47.9.1 ). Tiempo de incubación - 3 horas Efector Concentración Temperatura PH Actividad de (°C) CMCasa restante (%) Ninguno (control) -- 50 4.5 1 00 Citrato 0.1 M 50 4.5 1 00 EDTA 5 mM 50 4.5 1 00 Tween-80 3 g/l 50 4.5 1 00 Persulfato 3 g/l 50 4.5 97 Ninguno (control) 57 4.5 62 Citrato 0.1 M 57 4.5 62 EDTA 5 mM 57 4.5 60 Tween-80 3 g/l 57 4.5 68 Persulfato 3 g/l 57 4.5 65 Ninguno (control) --- 50 7.0 78 EDTA 5 m M 50 7.0 50 Tween-80 3 g/l 50 7.0 52 Persulfato 3 g/l 50 7.0 50 Ning uno (control) --- 57 7.0 30 EDTA 5 m M 57 7 0 38 Tween-80 3 g/l 57 7.0 25 Persu lfato 3 g/l 57 7.0 30 Ejemplo 1 1 - Pruebas de lavado con piedras de muestras de celulasa producidas por diferentes cepas de Chrysosporium Las preparaciones #-s 47.1000, 47.1 001 , 47.2000 y 47.2001 producidas por diferentes cepas de Chrysosporium se usaron para prueba de lavado con una máquina de lavado especial de 2 I a pH 6.5, 50°C, durante 60 min con 1 35 g de tejido de jeans de mezclilla desaprestado. La cantidad total de actividad de CMCasa por prueba fue constante e igual a 336 U/corrida. Después del secado, se evaluaron la abrasión y retromanchado mediante medición Datacolor. Los resultados se presentan en la Tabla 20. Los resultados muestran que las celulasas producidas a partir de diferentes cepas de Chrysosporium demuestran desempeño de lavado similar a pH neutral en términos de niveles de abrasión y retromanchado con las celulasas producidas por la especie C1 de Chrysosporiu lucknowense Garg 1966.

Tabla 20. Actividad de lavado con piedras de preparaciones de celulasa de diferentes cepas de Chrysosporium Preparación # Abrasión (*) Retromanchado (**) 47. 1 000 1 2.3 1 .6 47. 1 001 1 2. 1 1 .6 47.2000 1 4.2 1 .7 47.2001 1 4.6 1 .6 (*) - reflectancia del lado frontal , a mayor valor, mayor abrasión, bl a nco = 9. 1 (**) - reflectancia del lado posterior, a mayor valor, mayor retromanchado Ejemplo 12 - Purificación de componentes de celulasa 1. Selección de las muestras de C1 para la purificación. La preparación de celulasa C1 #47.11.1 se eligió para purificación adicional en vista del hecho de que 47.11.1 poseía (i) alto contenido de proteína; (ii) alta actividad de FPA y CMCasa (ver Tabla 4). 2. Aislamiento y purificación del componente del complejo de C1. El primer paso de purificación incluyó cromatografía de intercambio de iones en una columna DEAE-Toyopearl (TosoHaas, Japón). La preparación de celulasa C1 seca (1.5 g) se disolvió en 15 mi de amortiguador de fosfato de Na 0.01 M, pH 7. La solución se centrifugó y el sobranadante desalado usando una columna Acrylex P-2. La muestra desalada se aplicó entonces a la columna de DEAE-Toyopearl (1.5 x 30 cm) en amortiguador de fosfato 0.03 M, pH 4.7 y las proteínas adsorbidas se levigaron en gradiente de NaCI 0 - 0.2 M con velocidad de flujo de 1 ml/min. Se obtuvieron tres fracciones extraídas - la fracción no ligada (NB) se levigó en el amortiguador de inicio, Fracciones I y II se levigaron a través de un gradiente de NaCI 0 - 0.2 M. Todas las fracciones poseían actividades celulolíticas. 3. SDS-PAGE de fracciones de proteínas. Después de electroforesis 'en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE), la fracción NB incluyó proteínas con pesos moleculares de 30 y 70 kD. La Fracción I incluye proteínas con pesos moleculares de 25 a 100 kD y la Fracción II contenía proteínas con pesos moleculares de 35 y 100 kD. Se realizó la SDS-PAGE con un gel separador al 10% (100 X 80 X 0.75 mm) bajo condiciones desnaturalizantes. Los reactivos y conjuntos se obtuvieron de Bio-Rad (Estados U nidos) . Se usó azul brillante de Coomassie R-250 en 25% de ácido tricloroacético para manchado de proteína. 4. I EF de fracciones de proteína. Después del enfocado isoeléctrico (I EF) , la Fracción N B incluye proteínas con puntos isoeléctricos (pl's) desde 4.6 hasta 8.0. La fracción I contiene proteínas con valores de pl desde 3.2 hasta 5.5, y la Fracción I I contiene proteínas con pl desde 3.0 hasta 5.5. El enfocado isoeléctrico se realizó con 7% PAAG en mini-IEF Modelo 1 1 1 (de Bio-Rad). Los reactivos y conjuntos se obtuvieron de Bio-Rad (Estados Unidos). Se usó azul brillante de Coomassie R-250 en 25% de ácido tricloroacético para manchado de proteína. 5. Dependencias de pH de actividad de CMCasa de fracciones de proteína. La Tabla 21 representa las dependencias de pH de actividades de CMCasa y RBB-CMCasa de Fracciones NB, I y I I de celulasa C1 . Se usaron los siguientes sistemas amortiguadores: amortiguador de acetato (pH 4-5) , amortiguador de fosfato (pH 6-8) , y amortiguador de carbonato (pH 8.5-10). Además, se usó un sistema amortiguador universal el cual consistió de acetato, borato y fosfato (pH 4-1 0).

Tabla 21. El efecto de pH sobre actividades de CMCasa y RBB-CMCasa de fracciones de proteína de C1 Actividad de CMCasa, 50°C (%) PH Fracción NB Fracción l Fracción il 4.0 85 70 95 4.5 95 85 100 5.0 100 90 95 5.5 90 100 90 6.0 80 90 80 6.5 70 85 80 7.0 65 85 80 7.5 60 65 75 8.0 50 60 60 8.5 45 50 50 9.0 30 45 40 9.5 10 40 32 Actividad de RBB-CMCasa, 50°C (%) pH Fracción NB Fracción I Fracción II 4.5 65 95 100 5.0 100 100 95 5.5 95 100 90 6.0 95 95 90 6.5 80 87 90 7.0 80 85 87 7.5 60 65 85 8.0 50 60 70 8.5 45 60 60 9.0 30 50 40 9.5 1 0 40 32 Las actividades de CMCasa y RBB-CMCasa de las Fracciones NB, I y I I siguiendo la cromatografía de intercambio de iones en DEAE-Toyopearl tuvieron un perfil de pH de tipo campana no simétrico. La actividad de CMCasa de la Fracción N B mostró un máximo a pH 4.5 - 5.5 y 50% de actividad máxima a pH 8.0. La actividad de RBB-CMCasa de la Fracción N B tuvo un máximo a pH 5.0 - 6.0 y 50% de actividad máxima a pH 8.0. La actividad de CMCasa de Fracción l tuvo un máximo a pH 5.0 - 6.0 y 50% de actividad máxima a pH 8.5. la actividad de RBB-CMCasa de Fracción I tuvo un máximo a pH 4.5 - 7.0 y 505 de actividad máxima a pH 8.5. La actividad de CMCasa de la Fracción I I tuvo un máximo a pH 4.0 -5.5 y 505 de actividad máxima a pH 8.5. La actividad de RBB-CMCasa de la Fracción I I tuvo un máximo a pH 4.5 - 7.5 y 505 de actividad máxima a aproximadamente pH 8.5. 6. Estabilidad de CMCasa de Fracción de proteína I (después de DEAE-Toyopearl) . La Tabla 22 muestra curvas de actividad de CMCasa temporal de Fracción i después de la cromatog rafía de intercambio de iones DEAE-Toyopearl a diferente pH (5.2-8.7) y 50°C. La actividad de CMCasa de la Fracción I fue m uy estable a pH 5.2-7.2 (entre aproximadamente 30% y 45% de actividad se perdió sobre 3 horas). A pH 7.7, se perdió el 60% de actividad después de aproximadamente 1 hora, mientras que a pH 8.3 y 8.7, el 50% de actividad se perdió después de aproximadamente 0.5 hora. A pH 8.3, se perdió el 100% de actividad de CMCasa después de 3 horas, y a pH 8.7, se perdió el 1 00% de actividad después de 2 horas.

Tabla 22. Estabilidad de CMCasa de una fracción de proteína I después de DEAE-Toyopearl a 50°C Actividad de CMCasa rest :ante (%) pH 5.2 pH 7.2 pH 7.7 pH 8.3 pH 8.7 0 1 00 1 00 1 00 1 00 1 00 0.5 97 75 65 50 50 1 0 55 40 25 1 5 2 40 50 35 1 0 0 3 30 45 25 0 0 7. Propiedades de fracciones después de la cromatografía de intercam bio de iones en DEAE-Toyopearl. Los experimentos de adsorción usando Avicel (celulosa m icrocristalina) como un substrato, demostró que las fracciones I y I I no se unen a un substrato cristalino y la Fracción Nb unida a Avicel con un coeficiente de distribución de 0.2 l/g. Las actividades específicas de las Fracciones N B, I y I I hacia diferentes substratos se presentan en la Tabla 23. Las tres fracciones poseían actividades de CMCasa . endoglucanasa, avicelasa, ß-glucanasa y xilanasa, pero la Fracción N B n o tuvo actividad de ß-g lucosidasa, contrario a las Fracciones 1 y I I . La prueba de Micro lavado de mezclilla para las Fracciones N B, I y I I mostraron que las Fracciones I y I I poseían aproximadamente igual actividad en la mezclilla a pH 7, mientras que la Fracción NB mostró menor actividad (de acuerdo a la prueba de Micro lavado de mezclilla).

Tabla 23. Actividades específicas de las fracciones después de la cromatografía de intercambio de iones en DEAE-Toyopearl Actividades específicas , U/mg de proteína Fracciones CMCasa Endoglu Avicelasa ß-glucosi- ß-gluca- Xilanasa Prueba de Micro lavado -canasa dasa nasa de mezclilla N B 9.9 6.2 0.1 8 0.0 1 1 .0 5.3 + I 3.7 2.3 0.02 3.6 1 .9 0.7 + + I I 0.8 0.2 0.02 0.02 1 .2 0.04 + + 8. Prueba de Micro lavado de mezclilla. Esta prueba se realizó usando 20 mi de solución amortiguada de enzima, teniendo un nivel preestablecido de- actividad de CMCasa. Se trataron m uestras manchadas de mezclilla con índigo real a 50°C durante 60 minutos en las condiciones de tensión mecánica excesiva (abrasión) . El nivel de desempeño de celulasa se evaluó mediante registro de panel de acuerdo a la reducción de color después de que las muestras se secaron . También podrían usarse instrumentos de medició n de color y programa de cómputo. Más valores " + " indicaron mejor abrasión . 9. Purificación adicional de proteínas de la Fracción 1 después de cromatografía de intercambio de iones en DEAE-Toyopearl. La Fracción I desalada (25 mi, 0.8 g/l de proteína) se sometió a cromatografía de intercambio de iones Macro Prep Q. La columna MacroPrep Q (1 .5x10 cm) se equilibró con amortiguador de acetato 0.03 M, pH 4.7, y las proteínas adsorbidas se levigaron en un gradiente de concentración de NaCI 0 - 0.1 M. Se recolectaron tres fracciones, 1.1 , 1.2 y 1.3. La Fracción 1.2 mostró la actividad de Micro lavado de mezclilla más alta a pH 7 y la fracción 1.3 mostró la más baja. Los resultados de SDS-PAGE mostraron que las Fracciones 1.1 y 1.2 difirieron por la presencia de una proteína de peso molecular bajo (25 kD) en la Fracción 1.2, la cual responde por la actividad de lavado con piedras. La Fracción 1.1 tuvo un pl de 4.2 como se mostró por mediciones de I EF. Las Fracciones 1.1 y 1.3 tuvieron un contenido de proteína demasiado bajo para permitir estudio adicional. En consecuencia, la Fracción 1.2 se usó en purificación adicional. El siguiente paso de purificación involucró cromatoenfocado sobre una columna Mono P. La Fracción 1.2 se equilibró con amortiguador de imidazol 0.03 M , pH 6.8, y aplicó a la columna. Las proteínas adsorbidas se levigaron con Polybuffer 74 (1 : 8), pH 4.0, sobre lo cual se observaron 2 picos principales en los perfiles de actividad y proteína. El primer pico, designado Pico A, mostró actividad de CMCasa específica menor (2.5 Unidades/mg) , comparado con el Pico B (3.6 Unidades/mg) . La electroforesis en gel de poliacrilamida natural mostró la presencia de 2 bandas de proteína en el Pico A, estando activa la banda de proteína de mayor peso molecular hacia CMC manchada con Rojo Congo. Se observó una banda de proteína activa bajo condiciones naturales en el Pico B. Los datos de SDS-PAGE mostraron que el Pico A incluyó 2 proteínas principales (60 kD y 70 kD) y el Pico B contenía una proteína principal (25 kD) y una proteína menor (27 kD). La fracción recolectada dentro del Pico B se designó como 25 kD-endoC1 y se usó en estudios adicionales. La Tabla 24 muestra las actividades específicas de 25 kD-endoC1 hacia diferentes substratos. La 25 kD-endoC1 tuvo actividades de CMCasa, RBB-CMCasa, endo-glucanasa, FPA, avicelasa, ß-glucanasa y xilanasa, pero no mostró actividad de ß-glucosidasa. Esta combinación de diferentes actividades muestra que 25 kD-endoC1 es una endoglucanasa. El pH óptimo de las actividades CMCasa y RBB-CMCasa es aproximadamente 6.0 (Tabla 24). La 25 kD-endoC 1 poseía alta actividad de lavado con piedras (de acuerdo a una prueba de Micro Lavado de Mezclilla usando muestras de algodón) (ver Tabla 24). Durante la levigación de Pico A de la columna Mono P, se recuperó un número de fracciones que difirieron en la proporción de proteínas de 60 kD a 70 kD, especialmente una fracción designada 70(60) kD-C 1 , que incluyó predominantemente una proteína de 60 kD y una fracción designada 70 kD-endoC 1 , predominantemente con una proteína de 70 kD. Las actividades específicas de estas fracciones hacia diferentes substratos se presentan en la Tabla 24. Como se ve en la presente, la fracción 70(60) kD-C1 poseía baja endoglucanasa específica (0.5 U/mg) y una alta avicelasa específica (0.31 U/mg), comparada con la fracción 70 kD-endoC1 (2.8 U/mg de endoglucanasa y 0.1 8 U/mg de avicelasa) y tenía muy baja activid ad de ß-g lucosidasa. Las actividades específicas hacia FP, ß- glucano y xilano de la fracción 70(60) kD-C1 fueron bajas (ver Tabla 24) y solo se formó celobiosa como un producto de hidrólisis de avicel. La actividad de lavado con piedras (de acuerdo a una prueba de Micro lavado de mezclilla usando muestras de algodón) de la fracción 70(60) kD-C1 fue baja. Estos datos muestran que puede designarse la proteína de 60 kD de la Fracción I después de la cromatografía de intercambio de iones en DEAE-Toyopearl como una celobiohidrolasa. El pH óptimo de 70(60) kD-C1 (hacia CMC y RBB-CMC) fue aproximadamente 5.0 (Tabla 24) . La 70 kD-endoC 1 tuvo altas actividades de CMCasa, RBB-CMCasa, endoglucanasa, FPA, ß-glucanasa y xilanasa específicas y poseía alguna actividad de avicelasa y ß-glucosidasa (Tabla 24). La 70 kD-endoC1 también poseía actividad de lavado con piedras relativamente alta (de acuerdo a la prueba de Micro lavado de mezclilla usando muestras de algodón) (ver Tabla 24) . La 70kD-endoC 1 de la Fracción I después de cromatografía de intercambio de iones en DEAE-ToyopearI parece ser una endoglucanasa. Como se ve a partir de la Tabla 24, el pH óptimo para 70 kD-endoC1 es aproximadamente 6.0 tanto para las actividades de CMCasa y RBB-CMCasa. 1 0. Purificación adicional de proteínas de la Fracción I I después de la cromatog rafía de intercambio de iones en DEAE-Toyopearl. La Fracción I I , obtenida como un resultado de la cromatografía en DEAE, se dividió en 3 fracciones (Fracción 11.1 , I I .2 y I I .3, respectivamente) usando un gradiente de NaCI 0-0.2 M más largo (sobre un periodo de 8 h) en una columna de DEAE-Toyopearl. Los resultados de SDS-PAG E mostraron que la Fracción 11.1 incluyó 2 proteínas principales de peso molecular de 60 kD y 100 kD, la Fracción II.2 incluyó 3 proteínas principales de 35 kD, 60 kD y 100 kD, y la Fracción II.3 incluyó 2 proteínas principales de 43 kD y 60 kD. La Fracción II.3 demostró la actividad de CMCasa más alta (10 unidades/mg de proteína), pero mostró la actividad de lavado baja (usando una prueba de Sub-micro lavado de mezclilla) y actividad de CMCasa específica de 1 unidad/mg. La Fracción II.2 no mostró nada de la actividad de lavado (pero la actividad de CMCasa fue 0.7 U/mg). De esta manera, se purificaron adicionalmente las Fracciones 11.1 y II.3.

Tabla 24. Propiedades de enzimas de C1 pH 25 kD 70(60) kD 70 kD 60 kD 100 kD 43 kD 60 kD endo endo endo (11.1) endo endo (11.1) (II.3) (H-3) Actividad de CMCasa (U/mg) 5.0 4.6 1.10 3.5 0.70 0.03 1.02 1.32 6.0 5.0 0.83 3.8 0.52 0 1.01 1.07 7.0 3.9 0.65 3.0 0.42 0 0.90 1.03 RBB-CMCasa (U/mg) 5.0 8.2 0.12 1.5 0.90 0 0.82 1.21 6.0 8.8 0.10 2.7 0.854 0 0:75 1.14 7.0 6.6 0.07 2.4 0.68 0 0.73 1.12 FPA (U/mg) 5.0 1.0 0.17 0.61 0.31 0.45 0.52 Endoglucanasa (viscosimétrica) (U/mg) 5.0 2.26 0.50 2.8 0.21 0 0.15 0.27 Avicelasa (U/mg) 5.0 0.16 0.31 0.18 0.03 0.01 0.01 Tabla 24 (continuación) ß-glucosidasa (U/mg) 5.0 0 0.02 0.16 0.'02 0.02 ß-glucanasa 5.0 0.66 0.07 2.4 1 .3 3.9 4.4 Xilanasa (U/mg) 5.0 0.40 0.16 0.50 0.06 0.01 0.07 0.01 Actividad de Micro lavado de mezclilla 5.0 +++ - ++ n.d. n.d. n.d. n.d. 7.0 +++ - ++ n.d. n.d. n.d. n.d.

Actividad de Sub-micro lavado de mezclilla 5.0 n.d. n.d. n.d. +++ - + 7.0 n .d . n .d. n.d. +++ - +++ ++ n.d . no determinado 1 1 . Prueba de sub-micro lavado de mezclilla. Esta prueba se realizó en fragmentos de mezclilla manchada con índigo real en 2 mi de solución amortiguada de enzima (2 unidades de actividad de CMCasa) a 50°C durante 2 horas, en las condiciones de tensión mecánica excesiva. El nivel de desempeño de celulasa se evaluó mediante registro de panel de acuerdo a la reducción de color después de que se secaron las muestras. 12. Purificación de Fracción 11.1 . La Fracción II .1 se aplicó a una columna de Macro prep Q equilibrada con amortiguador de acetato 0.03 M, pH 4.75, y las proteínas adsorbidas se levigaron en un gradiente de NaCI (0 - 0.3 M). Se obtuvieron los dos picos de proteína pero el primero mostró actividad de CMCasa. La SDS-PAGE del material del primer pico mostró que las proteínas con 60 kD y 1 00 kD se aislaron en un estado homogéneo. De acuerdo a los datos de I EF, las proteínas de 60 kD y 100 kD poseían un pl ácido de aproximadamente 3. Las actividades de las proteínas de 60 kD y 1 00 kD hacia diferentes substratos se muestran en la Tabla 24. Se encontró que la proteína de 60 kD designada como 60 kD(ll.1 )-endoC1 que posee actividades de endoglucanasa, CMCasa, RBB-CMCasa, FPA y ß-glucanasa a pH 5 (0.2, 0.7, 0.9, 0.3, y 1 .3 unidades/mg de proteína, respectivamente, como se muestra en la Tabla 24) . Las actividades de avicelasa, ß-glucosidasa y xilanasa fueron bastante bajas. Esta combinación de actividades muestra que la 60kD(l l .1 )-endoC 1 es una endog lucanasa. La 60kD(l l .1 )-endoC1 también posee alta actividad de lavado (por la prueba de sub-micro lavado de mezclilla) tanto a pH 5 como a pH 7 (por la Tabla 24) . La dependencia de pH de las actividades de CMCasa y RBB-CMCasa para esta proteína mostró sus máximos a pH 4.0 - 4.5, con 50% de actividad máxima hacia CMC y 85% de actividad máxima hacia RBB-CMC retenida a pH 6, y 1 5-20% de ambas actividades retenidas a pH 9 y 1 0 (ver Tabla 25). La proteína de 1 00 kD de la Fracción 11.1 se designó como proteína 100kD(l l .1 ) y casi no mostró actividad de celulasa (Tabla 24). Esta proteína poseía solo actividades de CMCasa (0.3 U/mg) y xilanasa (0.008 U/mg) muy bajas y no podría ser determinada por ser una enzima celulítica. De acuerdo a la prueba de sub-micro lavado de mezclilla, la proteína 100 kD (11.1 ) no mostró ninguna actividad de lavado con piedras (Tabla 24) y también falló para mostrar alguna actividad de proteasa ya sea a pH 5 o pH 7. 1 3. Purificación de Fracción I I.3. La Fracción I I .3 también se purificó mediante cromatografía Macro Prep Q. Las proteínas adsorbidas se levigaron en g radiente de NaCI 0.2 - 0.6 M (el amortiguador de inicio fue acetato 0.03 M , pH 4.75) . La SDS-PAGE de las fracciones obtenidas después de la cromatografía de Macro Prep Q mostró que las proteínas 43 kD y 60 kD se obtuvieron en forma homogénea. El isoelectroenfocado de estas fracciones mostraron que tanto las proteínas de 43 kD y 60 kD tuvieron valores de pl de aproximadamente 3. Las proteínas de 43 kD y 60 kD se desig naron 43kD(l l .3)-endoC 1 y 60kD(l l .3)-endoC 1 , respectivamente. Las actividades de estas enzimas hacia diferentes substratos (ver Tabla 24) mostraron que tenían actividades de CMCasa, FPA, avicelasa y xilanasa específicas similares. La 60kD(l l .3)-endoC1 poseía activid ades de RBB-CMCasa, endoglucanasa y FPA específicas mayores (Tabl a 24) . Al mismo tiem po, debería ser tensionante que la 43kD(I I .3)-endoC1 y 60kD(l l .3)-endoC 1 poseían muy poca actividad de lavado con piedras a pH 5 (usando la prueba de sub-micro lavado de mezclilla). Sin embargo, tanto 43kd(l l .3)-endoC1 como 60kD(l l .3)-endoC 1 demostraron actividad de lavado con piedras remarcable a pH 7, y al mismo tiempo la 43kD(l l .3)-endoC 1 tuvo mayor actividad de lavado con piedras comparado con la 60kD(l l .3)-endoC1 . Como se ve a partir de las dependencias de pH en la Tabla 24, 43kD(ll .3)-endoC1 mostró un pH óptimo amplio (desde pH 4.5 hasta 8) en el caso de ambas actividades de CMCasa y RBB-CMCasa. La 43kD(l l .3)-endoC1 poseía 50% de actividad de CMCasa y 70% de actividad de RBB-CMCasa desde un máximo a pH 9 y 20% tanto de CMCasa y RBB-CMCasa a pH 1 0. En contraste, 60kD(l l .3)-endoCI tuvo un pH óptimo estrecho a pH 4 - 4.5 hacia CMC, y un pH óptimo amplio (de pH 4 a 8) hacia RBB-CMC y reteniéndose 30% de actividad de RBB-CMCasa a pH 9. Debe notarse que en todos los casos de proteínas purificadas descritas en la presente, se determinaron los pesos moleculares usando electroforesis en gel (especialmente SDS-PAGE) y proteínas de referencia de peso molecular conocido como estándares. Como con todos los análisis usando tales métodos, los resultados son solo aproximados y puede observarse alguna variación en peso molecular, ya que se corren diferentes geles por d iferentes trabajadores, usando diferentes conjuntos de estándares de peso molecular como referencias. Tales preparaciones de enzimas purificadas y parcialmente purificadas, son altamente útiles como componentes de detergente, suavizado de tejido, depilling , abrillantamiento de color y composiciones de lavado con piedras. De esta manera, las preparaciones de enzimas antes aisladas y purificadas encuentran utilidad en tales aplicaciones de acuerdo a la presente invención. Así, métodos para lavado con piedras, suavizado de tejido, depilling, abrillantamiento de color y limpieza como se declararon hasta ahora en la presente, así como métodos típicos para lograr tales aplicaciones como los ya descritos en la literatura, emplearán fácilmente tales preparaciones de enzimas purificadas o parcialmente purificadas, y composiciones conteniendo tales, como agentes principales o aditivos para efectuar las metas de tales procedimientos. Es conocido en la literatura el uso de otras y diferentes preparaciones de enzimas purificadas o parcialmente purificadas en tales aplicaciones con muchas enzimas en uso comercial .

Tabla 25. El efecto de pH sobre actividades de CMCasa y RBB-CMCasa de enzimas de celulasa C1 Actividad de CMCasa, 50°C (%) pH II.3)--endo 6 0kD(ll.3).-_endo 3.5 85 80 85 4.0 100 100 100 5.0 65 100 85 6.0 50 100 70 7.0 45 90 65 8.0 25 70 45 9.0 17 30 30 10.0 15 20 10 11.0 15 5 5 Actividad de RBB-CMCasa, 40°C (%) PH . 60kD(ll.1)-endo 43k II.3)-endo 60kD (II.3)-endo 3.5 85 85 80 4.0 100 100 100 5.0 90 100 100 •6.0 85 95 95 7.0 70 90 90 8.0 50 80 85 9.0 20 70 70 10.0 15 20 30 11.0 15 15 15 Se debe entender que las celulasas neutrales y/o alcalinas hasta ahora descritas pueden tener diferente actividades enzimáticas dependiendo de la estructura química del substrato usado para medir la actividad y el método de ensayo particular empleado para medir la actividad. De esta manera, las celulasas neutrales y/o alcalinas purificada o parcialmente purificadas, mostrarán diferentes perfiles de pH/actividad dependiendo en el método de ensayo y substratos empleados. Para resolver cualquier confusión en cuanto a la naturaleza de las actividades y propiedades de las enzimas de celulasa substancialmente purificadas preparadas mediante los métodos de este ejemplo, lo siguiente es una descripción de las actividades y propiedades medidas para las celulasas de las fracciones purificadas. Las celulasas purificadas, o parcialmente purificadas, preparadas en la presente, mostraron tanto actividad de endoglucanasa y/o celobiohidrolasa cuando se empleó el substrato apropiado. De esta manera , las preparaciones de celulasa que mostraron actividades de endoglucanasa tuvieron, todas, valores de pl entre aproximadamente 3 y aproximadamente 4.5. De manera más específica, estas fracciones incluyeron celulasas (endoglucanasas) teniendo pesos moleculares y valores de pl como sigue: MW (peso molecular) aproximadamente de 25 kD (pl de aproximadamente 4.0) , MW de aproximadamente 70 kD (pl de aproximadamente 4.2) , MW de aproximadamente 60 kD (pl de aproximadamente 3.0) y MW de aproximadamente 43 kD (pl de aproximadamente 3. 1 ) . Estas fracciones de celulasa también contenían proteínas que muestran una actividad de celobiohidrolasa. De manera más específica, las últimas tuvieron una MW de aproximadamente 60 kD y pl de aproximadamente 4.2. Los métodos para usar las composiciones y enzimas purificadas de acuerdo a la presente invención han sido bien descritos en la literatura, incluyendo muchas patentes, cuyas descripciones se incorporan en la presente por referencia. Estas incluirían Clarkson (patente estadounidense 5,290,474), la cual describe el uso de enzimas de celulasa y composiciones que contienen enzimas de celulasa, incluyendo surfactantes y otros aditivos, para usarse en medios de lavado acuosos, composiciones de detergente, medios designados para intensificar la retención y/o restauración de color, así como para impartir propiedades mejoradas de tacto y suavizado, especialmente a tejidos que contienen algodón. Las enzimas de celulasa y composiciones que contienen celulasa de acuerdo a la presente invención , también se pretenden usar en las mismas aplicaciones, de las cuales se dan descripciones específicas en m uchas, si no es que en todas, las referencias citadas. Además, la utilidad de las enzimas de celulasa y composiciones para aplicaciones tales como reducción de aspereza, o suavizado de tejido, también se muestra en Barbesgaard et al (patente estadounidense 4,435,307), describiendo específicamente el uso de celulasas fúngales, pero no aquéllas del género Chrysosporium, a rangos de pH alcalinos e incluyendo varios agentes aditivos, tales como aquéllos empleados en conjunción con la novedosa celulasa y composiciones de celuiasa de la presente invención , para reducción de aspereza, o suavizado de tejido, y lavado como una operación simple. De manera similar, las celulasas y composiciones de celulasás de la presenté invención son útiles y las enseñanzas de Barbesgaard con respecto a tales aplicaciones se incorporan específicamente en la presente. Además, el uso de enzimas de celulasa y composiciones de celulasa, diferentes a las novedosas celulasas y composiciones de celulasa de la presente invención, para aplicaciones de abrillantamiento de color, se describen de manera específica en Boegh (patente europea EP 0 220 016), cuya enseñanza se incorpora específicamente en la presente. Por supuesto, los expertos en la técnica entenderán que las novedosas enzimas de celulasa y composiciones de celulasa de la presente invención son altamente útiles para las mismas aplicaciones como se describe en las referencias anteriores, haciendo innecesaria de esta manera la aclaración de cualquier detalle adicional de tales aplicaciones. Sin embargo, tales composiciones que contienen enzimas y enzimas purificadas, o parcialmente purificadas, también son útiles en tales aplicaciones como des-entintado y bioblanqueo de materiales de papel o pulpa y método para hacerlas, se sugerirán fácilmente por ellas mismas para aquéllos de habilidad en la técnica, especialmente después de revisar las enseñanzas en la presente.

Ejemplo 1 3 - Producción de celulasa C-1 en un termentador por lote de 60 litros 1 . Preparación de inoculo Se prepararon como sigue las preparaciones de inoculo o cultivos iniciadores para la fermentación por lote. Se usó un mililitro (1 mi) de cultivo de esporas de C-1 para inocular cada uno de dos matraces, para generar un total de 2.0 litros de inoculo. El cultivo iniciador se incubó a 150 rpm , a 30°C durante 56 horas.

Medio para preparación de inoculo* K2HP04 0.5 g/? MgS04»7H20 0.1 5 KCl 0.05 FeS04»7H20 0.007 Extracto de levadura (ohly KAT) 1 .0 Peptona (Hormel PSR 5) 1 0.0 Lactosa 10.0 Glucosa 1 0.0 * El pH del medio de inoculo se ajustó a pH 7.0 con NaOH, el medio se introdujo entonces en una autoclave durante 35 minutos a 1 21 °C en dos matraces con deflectores de seis litros, conteniendo cada uno un litro de medio. 2. Producción de celulasa en un termentador por lote de 60 litros (Preparación de 47.0325) Se usó el cultivo de inoculo de matraz con agitador de dos litro preparado antes, para inocular 40 litros de medio contenido en un termentador de 60 litros. El medio para la fermentación fue como sigue: Medio de fermentación* K2HP04 0.22 g/ KH2P04 0.08 g/ (NH4)2SO4 4.0 g Citrato de Na3«2H20 4.0 g MgS04»7H20 0.03 g/ CaCI2.2H20 0.4 g/ FeSO4»7H2O 0.5 mg/l MnS04«7H20 0.5 mg/l ZnSO4«7H2O 0.2 mg/l CoCI2«6H2O 0.24 mg/l Lactosa 5.0 g/i Extracto de levadura (ohly 0.05 g/? KAT) Harina de semilla de algodón 5.0 g/? desgrasada (Pharmamedia) Celulosa (Sigmacell 50) 20.0 g/? PH 7.0 * Los 40 litros de medio estaban en ag ua desionizada, y se esterilizaron durante 45 minutos a 1 21 °C.

Después de la inoculación del medio de fermentación, el pH se mantuvo por encima de 6.9 por adición de N H3 y por debajo de 7.1 mediante adición de H2S04. El termentador se incubó durante 64 horas con agitación y aeración según sea necesario para mantener el oxígeno disuelto a más de 30% de saturación. 3. Recuperación de actividad de celulasa Los sólidos suspendidos del cultivo fermentado se removieron mediante filtración en un embudo de Buchner grande, usando papel filtro Whatman 54 y 10 g/l de Celite 503 como auxiliar de filtración. Se recolectó el filtrado, y la celulasa se concentró mediante ultrafiltración usando de filtro de fibra hueca de corte de 1 0,000 MW. El concentrado se secó por congelación. El concentrado seco se designó como la preparación de celulasa 47.0325. La actividad de esta preparación está dada en la Tabla 4.

Ejemplo 14 - Procedimiento de mutación usado para generar la cepa mutante de C-1 Se preparó una suspensión de esporas usando una placa de agar Pridham (4 g/l de extracto de levadura, 1 0 g/l de extracto de malta, 1 0 g/l de glucosa, 1 5 g/l de agar) conteniendo un cultivo esporulado de cepa C 1 . La placa se in undó con 1 0 mi de 0.05% de Tween 80. La suspensión se transfirió a un tubo estéril de tapa de tornillo y se agitó en forma de remolino en alto durante 1 minuto. Entonces se filtró la suspensión a través de una columna para remover el micelio. Las esporas se contaron y se diluyeron a 7 x 1 05 esporas por m i en agua. Se transfirieron diez mililitros de la suspensión de esporas a una caja de petri de vidrio estándar. Las esporas se irradiaron durante 75 seg undos a 720µWatts/cm2 usando un bulbo de Pen-Ray UV. La suspensión de esporas se agitó suavemente a lo largo de la irradiación usando una pinza de papel estéril como una barra de agitación magnética. Siguiendo la irradiación, la suspensión de esporas se pasó a un tubo envuelto en papel aluminio, se diluyó en agua y se platinó en luz débil a medio mínimo de NH4 como se define más adelante. Después de incubar 20 días a 30 grados C, se identificó una colonia como una colonia grande con una gran zona de clarificación de celulosa alrededor de la colonia.

Medio mínimo de NH4, pH 7.5 1 g/l de K2HPO4 0.1 g/l de KCl 0.3 g/l de MgS04«7H20 0.1 g/l de NaCI 1 6 mg/l de FeCI3«6H20 1 .92 g/l de (N H4)2S04 15 g/l de agar Difco Noble 2.5 g/l de celulosa hinchada acida (adicionada como un soporte al 1 .25% después de la autoclave) 0.5 g/l de desoxicolato de sodio (adicionado después de la autoclave) Ejemplo 1 5 - Producción de celulasa mutante de C-1 en matraces de fermentación por lote de 60 litros (Preparación de 47.0528) Preparación de inocu lo Las preparaciones de cultivos iniciadores para la fermentación por lote alimentado se prepararon como se describió en el Ejemplo 1 3 (sección 1 ) . 2. Producción de celulasa en fermentación por lote de 60 litros Se usaron 2 litros de inoculo para inocular 40 litros de medio de fermentación como se describe a continuación.

Medio de fermentación* K2HP04 0.44 g/? KH2P04 0.16 g/? (N H4)2S04 3.0 g/? Citrato de Na2»2H20 4.0 g/? MgS04-7H20 0.06 g/? CaCI2-2H20 0.8 g/? FeS04«7H20 0.1 mg/l MnS04»7H20 0.04 mg/l ZnS04»7H20 0.04 mg/l CoS04»6H20 0.048 mg/l Lactosa 5.0 g/i Extracto de levadura (ohly KAT) 0.1 g/? Harina de semilla de algodón 10.0 g/i desgrasada (Pharmamedia) Celu losa (Sig macell 50) 20.0 g/? * Los 40 litros de medio estaban en agua desionizada, y se esterilizaron mediante autoclave durante 45 minutos a 1 21 °C. 3. Condiciones de fermentación El pH se mantuvo a alrededor de 7.0 y se controló mediante la adición de NH3 a pH por encima de 6.9, y la adición de H2S04 a pH por debajo de 7.1 . El tiempo de incubación fue de 87 horas, la agitación y aereación fueron según era necesario para mantener el oxígeno disuelto a más de 30% de saturación. A las 40 horas, se adicionaron 3.0 litros de solución de alimentación como se describe más adelante, a una velocidad de 5.0 mi cada 5 minutos.

Solución de alimentación para el termentador K2HPO4 0.88 g/? KH2PO4 0.32 g/i (NH4)2S04 4.0 g/? Citrato de Na2»2H20 4.0 g/? MgS04»7H20 0.12 g/? CaCI2»2H20 0. 1 3 g/? FeS04«7H20 0.2 mg/l M nS04«7H20 0.08 mg/l ZnS04»7H20 0.08 mg/l CoCI2»6H20 0.096 mg/l Lactosa 20.0 g/? Extracto de levadura (ohly KAT) 0.2 g/? Pharmamedia 20.0 g/? Celulosa (Sigmacell 50) 20.0 g/? 4. Recuperación de actividad de celulasa Los sólidos suspendidos se removieron mediante filtración en un embudo de Buchner grande usando papel filtro Whatman 54 y 1 0 g/l de Celite 503 como auxiliar de filtración. El filtrado se recolectó y se concentró la celulasa mediante ultrafiltración usando un filtro de fibra hueva de corte de 10,000 MW. El concentrado se secó mediante secado por congelación. El concentrado se designó como la preparación de celulasa 47.0528 (la actividad se da en la Tabla 4) .

Ejemplo 16 - Ensayo de actividad de celulasa usando un ensayo de Cellazyme Este ensayo se realizó usando tabletas de Cellazyme C y el conjunto de ensayo obtenido de Megazyme (Aust) Pty. Ltd. , Sidney, NSW 21 01 , Australia. El substrato usado es H E-celulosa reticulada con Azurine (AZCL-Cellulose) suministrada comercialmente como tabletas de Cellazyme C, listas para usarse. Brevemente, se equilibran alícuotas de 0.5 m i de preparación de enzjma (diluida si es necesario) en amortig uador de acetato 0.025 M (pH 4.5) a 40°C durante 5 minutos en tubos de prueba de vidrio (16 X 122 mm). La reacción de prueba se inició entonces mediante la adición de una tableta de Cellazyme C (sin agitación) . ' Exactamente después de 1 0 minutos a 40°C, la reacción se termina mediante la adición de solución de Trizma Base (10.0 mi, 2% p/v, de Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) y entonces se agita como remolino. Se permite entonces que los tubos permanezcan durante aproximadamente 5 minutos a temperatura ambiente, sobre lo cual se agita nuevamente la pasta, se filtra a través de un círculo de filtro Whatman No. 1 (9 cm) y se mide la absorbancia del filtrado a 590 nm. Las mediciones de absorbancia se leen contra un blanco conteniendo tanto substrato como enzima, pero preparado al adicionar Trizma Base a la solución de enzima antes de la adición de la tableta de Cellazyme C. Esta pasta se deja a temperatura ambiente en lugar de a 40°C. Se usa un blanco simple para cada conjunto de determinaciones y se usó para centrar el espectrofotómetro. En este ensayo, una unidad de actividad de enzima es definida como la cantidad de enzima requerida para liberar un micromol de equivalentes de azúcares reductores de glucosa por minuto bajo las condiciones definidas del ensayo. Entonces se determinó la actividad de endo-celulasa por referencia a una curva estándar (una curva de muestra se suministró con el conjunto, pero podría generarse fácilmente en el laboratorio, si se van a emplear una enzima particular, condiciones y dilución de enzimas diferentes para un conjunto dado de experimentos). Usando este ensayo para nuestra propia actividad de enzima neutral/alcalina, se encontró que la actividad de endo-celulasa (tomando la actividad a pH 7 como 100%) era 92.4% (a pH 6), 75.6% (a pH 5.0) y 69.7% (a pH 4.0).

Ejemplo 17 - Prueba de lavado de detergente para depilling y abrillantamiento de color (anti-matizado) Se realizaron pruebas de acuerdo a la monografía de AATCC "Standardization of Home Laundry Test Conditions" (Estandarización de condiciones de prueba de lavado casero de ropa) en el AATCC Technical Manual, 1 997 (revisado en 1 995), usando una lavadora casera de carga en la parte superior Kenmore regular, usando una secadora de tambor casera Kenmore. Se usaron tres diferentes estilos de calcetines rojos para dulto (88%> de algodón, 1 0% de poliéster, 2% de licra) como prendas de prueba (tejido acanalado simple, tejido de acanalado pesado y trama en forma de wafle). Los calcetines se dividieron en 3 grupos con un número igual de cada estilo en cada grupo, con una prenda no lavada de cada estilo usada como una referencia. El peso aproximado de cada grupo fue 1 kg . Las muestras de detergente se prepararon antes de cada lavado como sigue: a) Cheer Triple Guard (como se compra en Estados Unidos y comúnmente a pH alcalino) como es (para demostrar las propiedades de cuidado de color y depilling de las celulasas presentes originalmente en Cheer, b) tratar térmicamente la muestra de Cheer para inactivar todas las enzimas originalmente presente en el detergente (para limitar el desem peño de Cheer a sus componentes diferentes a las enzimas). Para la inactivación térmica, se suspendió una muestra de 40 g de Cheer en 200 mi de agua y se calentó en alto (1 000 W) en un microondas casero durante 5 minutos, siendo la temperatura final alcanzada 95°C. Entonces, repetir los mismos pasos (a) y (b) anteriores , pero adicionar 5 g de C1 a la preparación .

Los ciclos de lavado/secado se realizaron 25 veces para cada grupo. Cada grupo se lavó a lo largo de 25 ciclos de lavado usando 1 kg de prendas para 20 litros de licor de lavado (el nivel de agua en la lavadora fue bajo) y 40 g solo de una de las preparaciones de detergente antes mencionadas. La temperatura se estableció en caliente-caliente, la duración de lavado fue 30 minutos, seguido por centrifugación regular, de alta velocidad. La temperatura de la secadora se estableció en alto y ei ciclo de secado duró 45 minutos. La prueba se completó después de 25 lavados, cuando se evaluaron las prendas, por varios grupos/paneles diferentes expertos en la técnica para depilling y abrillantamiento de color. Un resumen del procedimiento es como sigue: Preparaciones I nactivación de enzimas Adición de enzimas originales de Cheer de AARL a. Cheer (completo) No No b. Cheer (sin enzimas) Si No c. Cheer + C 1 s i Si (5 g de C1 ) Los resultados de la clasificación para cada grupo de lavado fueron como sigue (donde los 3 estilos de calcetines se clasificaron igual): Cheer Cheer Cheer + C 1 (completo) (enzimas inactivadas) Depilling ++ + + + + + Abrillantamiento + + +++ + de color Se debe entender que los ejemplos y modalidades descritas en la presente pretenden ser con fines ilustrativos solamente y que se sugerirán fácilmente por sí mismas varias modificaciones o cambios a la luz de los mismos, para personas expertas en la técnica, y están incluidos dentro del espíritu y competencia de esta aplicación y el alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims (10)

1. Reivindicaciones 1 . Un cultivo aislado de Chrysosporium lucknowense Garg 27K teniendo número de acceso VKM F-3500D.
2. 2. Una composición qu tiene actividad de celulasa neutral y/o alcalina, obtenida mediante un método que comprende hacer crecer un hongo de tipo natural o mutante del género Chrysosporium en cultivo en un medio adecuado, en donde ei hongo es Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium pannorum, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lobatum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium queenslandicum, o Chrysosporium tropicum.
3. 3. Una composición de acuerdo a la reivindicación 2, en donde el hongo es Chrysosporium lucknowense.
4. 4. Una composición que tiene actividad de celulasa neutral y/o alcalina, obtenida mediante un método que comprende hacer crecer un hongo mutante del género Chrysosporium en cultivo en un medio adecuado.
5. 5. Una composición de acuerdo a la reivindicación 2, en donde el hongo es Chrysosporium lucknowense Garg 27K, número de acceso VKM F-3500D.
6. 6. Una composición de acuerdo a la reivindicación 2, en donde el hongo es una cepa m utante de Chrysosporium lucknowense Garg 27K.
7. 7. Una composición de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 2-6 que tiene una actividad de celulasa a una temperatura desde aproximadamente 40°C hasta aproximadamente 60°C, a un pH desde aproxi madamente 5.0 hasta aproximadamente 1 1 .0.
8. 8. Una composición de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 2-6 que tiene al menos 50% de la actividad de celulasa óptima, a un pH desde aproximadamente 6.0 hasta aproximadamente 7.0, a una temperatura desde aproximadamente 40°C hasta aproximadamente 60°C.
9. 9. Una composición de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 2-6, en donde dicha actividad de celulasa se ensaya mediante cualquiera de los ensayos de actividad de CMCasa, RBBCMCasa, endoviscosimétrico o de papel filtro.
10. 10. Una fracción de proteína substancialmente purificada y aislada, obtenida a partir de una composición de acuerdo a la reivindicación 2 o reivindicación 4, y que tiene al menos 50% de su actividad de celulasa máxima a un pH entre aproximadamente 6.0 y aproximadamente 7.0, como J se mide mediante cualquiera de los ensayos de actividad de CMCasa, RBBCMCasa, endoviscosimétrico o de papel filtro. 1 1 . U na endoglucanasa obtenida de una fracción de acuerdo a la reivindicación 1 0, que tiene un peso molecular de aproximadamente 25 kD y pl de aproximadamente 4. 1 2. Una endoglucanasa obtenida de una fracción de acuerdo a la reivindicación 10, que tiene un peso molecular de aproximadamente 70 kD y un pl de aproximadamente 4. 1 3. Una endoglucanasa obtenida de una fracción de acuerdo a la reivindicación 10, que tiene un peso molecular de aproximadamente 60 kD y un pl de aproximadamente 3. 22. Una composición de detergente que contiene una o más enzimas purificadas aisladas de una fracción de proteína de acuerdo a la reivindicación 1 0, y que comprende además un surfactante. 23. Una composición suavizante de tejido que contiene una o más enzimas purificadas obtenidas de la fracción de proteína de acuerdo a la reivindicación 1 0. 24. Una composición para el tratamiento enzimático de fibras celulósicas o tejidos celulósicos, que comprende una celulasa cuya secuencia de aminoácidos es codificada por una secuencia de ácido nucleico de un hongo de tipo natural o mutante del género Chrysosporium, teniendo dicha composición un pH entre aproximadamente 8.0 y aproximadamente 1 2.0. 25. La composición de la reivindicación 24, en donde el hongo se selecciona del grupo que consiste de Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium pannorum, Chrysosporium pruinosum, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lobatum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium queenslandicum, o Chrysosporium tropicum. 26. La composición de la reivindicación 25, en donde el hongo es Chrysosporium lucknowense. 27. Una composición de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 24-26, en donde la celulasa se aisla u obtiene de un hongo de tipo natural o mutante del género Chrysosporium. 28. Una composición de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 24-26, que comprende además uno o más componentes seleccionados del grupo que consiste de piedra pómez, abrasivos, suavizantes, solventes, conservadores, agentes blanqueadores, agentes de azulado, colorantes fluorescentes, antioxidantes, solubilizantes, detergentes, surfactantes, enzimas, formadores, agentes anti-redepositación, amortiguadores, inhibidores de torta, agentes enmascarantes para factores que inhiben la actividad de celulasa, y activadores de celulasa. 29. La composición de la reivindicación 28, en donde la celulasa se aisla u obtiene de un hongo de tipo natural o mutante del género Chrysosporium. 30. La composición de la reivindicación 24, en donde el pH está entre 10.0 y aproximadamente 1 1 .0. 31 . La composición de la reivindicación 25, en donde el pH está entre 10.0 y aproximadamente 1 1 .0. 32. La composición de la reivindicación 26, en donde el pH está entre 1 0.0 y aproximadamente 1 1 .0. 33. La composición de la reivindicación 27, en donde el pH está entre 10.0 y aproximadamente 1 1 .0. 34. La composición de la reivi ndicación 28, en donde ei pH está entre 1 0.0 y aproximadamente 1 1 .0. 35. La composición de la reivindicación 29, en donde el pH está entre 10.0 y aproximadamente 1 1 .0. 36. U na composición para el tratamiento enzimático de fibras celulósicas o tejidos celulósicos, que comprende una celulasa cuya secuencia de aminoácidos se codifica mediante una secuencia de ácido nucleico a partir de un hongo de tipo natural o mutante del género Chrysosporium, com prendiendo además dicha composición .uno o más componentes fluorescentes, antioxidantes, solubilizantes, detergentes, surfactantes, enzimas, formadores, agentes anti-redepositación, amortiguadores, inhibidores de torta, agentes enmascarantes para factores que inhiben la actividad de celulasa, y activadores de celulasa. 29. La composición de la reivindicación 28, en donde la celulasa se aisla u obtiene de un hongo de tipo natural o mutante del género Chrysosporium. 30. La composición de la reivindicación 24, en donde el pH está entre 1 0.0 y aproximadamente 1 1 .0. 31 . La composición de la reivindicación 25, en donde el pH está entre 10.0 y aproximadamente 1 1 .0. 32. La composición de la reivindicación 26, en donde el pH está entre 10.0 y aproximadamente 1 1 .0. 33. La composición de la reivindicación 27, en donde el pH está entre 10.0 y aproximadamente 1 1 .0. 34. La composición de la reivindicación 28, en donde el pH está entre 1 0.0 y aproximadamente 1 1 .0. 35. La composición de la reivindicación 29, en donde el pH está entre 1 0.0 y aproximadamente 1 1 .0. 36. Una composición para el tratamiento enzimático de fibras celulósicas o tejidos celulósicos, que comprende una celulasa cuya secuencia de aminoácidos se codifica mediante una secuencia de ácido nucleico a partir de un hongo de tipo natural o mutante del género Chrysosporium, com prendiendo además dicha composición .uno o más componentes seleccionados del grupo que consiste de proteinasas, detergentes y surfactantes. 37. La composición de la reivindicación 36, en donde el hongo se selecciona del grupo que consiste de Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium pannorum, Chrysosporium pruinosum, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lobatum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium queenslandicum, o Chrysosporium tropicum. 38. La composición de la reivindicación 37, en donde el hongo es Chrysosporium lucknowense. 39. U na composición como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 36-38, en donde la celulasa se aisla u obtiene de un hongo de tipo natural o mutante del género Chrysosporium. 40. U na composición para el tratamiento enzimático de fibras celulósicas o tejidos celulósicos, teniendo al menos 1 24 unidades de actividad de endo-1 ,4-ß-glucanasa por gramo de composición seca, como se mide mediante un ensayo endoviscosimétrico, de una celulasa cuya secuencia de aminoácidos es codificada por una secuencia de ácido nucleico de un hongo de tipo natural o mutante del género Chrysosporium. 41 . La composición de la reivindicación 40, en donde el hongo es seleccionado del grupo que consiste de Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium pannorum, Chrysosporium pruinosum, Chrysosporium keratinophilum. Chrysosporium lobatum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium queenslandicum, o Chrysosporium tropicum. 42 La com posición de la reivindicación 41 , en donde el hongo es Chrysosporium lucknowense. 43. Una composición para el tratamiento enzimático de fibras celulósicas o tejidos celulósicos, que tiene al menos 1 24 unidades de actividad de endo-1 ,4-ß-glucanasa por gramo de composición seca, como se mide mediante un ensayo endoviscosimétrico, de una celulasa aislada u obtenida de un hongo de tipo natural o mutante del género Chrysosporium. 44. La composición de la reivindicación 43, en donde el hongo es seleccionado del grupo que consiste de Chrysosporium lucknowense,'' Chrysosporium pannorum, Chrysosporium pruinosum, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lobatum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium queenslandicum, o Chrysosporium tropicum. 45. La composición de la reivindicación 44, en donde el hongo es Chrysosporium lucknowense. 46. Una composición para el tratamiento enzimático de fibras celulósicas o tejidos celulósicos, que tiene al menos 191 unidades de actividad de endo-1 ,4-ß-glucanasa por gramo de composición seca, como se mide mediante un ensayo endoviscosimétrico, de una celulasa cuya secuencia de aminoácidos es codificada por una secuencia de ácido nucleico de un hongo de tipo natural o mutante del género Chrysosporium. 47. La composición de la reivindicación 46, en donde el hongo es seleccionado del grupo que consiste de Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium pannorum, Chrysosporium pruinosum, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lobatum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium queenslandicum, o Chrysosporium tropicum. 48. La composición de la reivindicación 47, en donde el hongo es Chrysosporium lucknowense. 49. Una composición para el tratamiento enzimático de fibras celulósicas o tejidos celulósicos, que tiene al menos 191 unidades de actividad de endo-1 ,4-ß-glucanasa por gramo de composición seca, como se mide mediante un ensayo endoviscosimétrico, de una celuiasa aislada u obtenida de un hongo de tipo natural o mutante del género Chrysosporium. 50. La composición de la reivindicación 49, en donde el hongo se selecciona dei grupo que consiste de Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium pannorum, Chrysosporium pruinosum, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lobatum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium queenslandicum, o Chrysosporium tropicum. 51 . La composición de la reivindicación 50, en donde el hongo es Chrysosporium lucknowense. 52. Una composición para el tratamiento enzimático de fibras celulósicas o tejidos celulósicos, que tiene al menos aproximadamente 964 unidades de actividad de endo-1 ,4-ß-glucanasa por gramo de composición seca, como se mide mediante un ensayo endoviscosimétrico, de una celulasa cuya secuencia de aminoácidos es codificada por una secuencia de ácido nucleico de un hongo de tipo natural o mutante del género Chrysosporium. 53. La composición de la reivindicación 52, en donde el hongo es seleccionado del grupo q ue consiste de Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium pannorum, Chrysosporium pruinosum, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lobatum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium queenslandicum, o Chrysosporium tropicum. 54. La com posición de la reivindicación 54, en donde el hongo es Chrysosporium lucknowense. 5 55. Una composición para ei tratamiento enzimático de fibras celulósicas o tejidos celulósicos, que tiene al menos aproximadamente 964 unidades de actividad de endo-1 ,4-ß-glucanasa por gramo de composición seca, como se mide mediante un ensayo viscosimétrico, de una celulasa aislada u obtenida de un hongo de tipo natural o mutante del género Chrysosporium. 56. La composición de la reivindicación 55, en donde el hongo es seleccionado del grupo que consiste de Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium pannorum, Chrysosporium pruinosum, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lobatum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium queenslandicum, o Chrysosporium tropicum. 57. La composición de la reivindicación 57, en donde ei hongo es Chrysosporium. 58. Una composición de detergente para ropa, que comprende una celulasa cuya secuencia de aminoácidos es codificada por una secuencia de ácido nucleico de un hongo de tipo natural o mutante del género Chrysosporium, comprendiendo además uno o más surfactantes. 59. La composición de la reivindicación 58, en donde el hongo se selecciona del g rupo que consiste de Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium pannorum, Chrysosporium pruinosum, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lobatum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium queenslandicum, o Chrysosporium tropicum. 60. La composición de la reivindicación 59, en donde el hongo es Chrysosporium lucknowense. 61 . Una composición de detergente para ropa, que comprende una celulasa aislada u obtenida de un hongo de tipo natural o mutante del género Chrysosporium, comprendiendo además uno o más surfactantes. 62. La composición de la reivindicación 61 , en donde el hongo es seleccionado del grupo que consiste de Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium pannorum, Chrysosporium pruinosum, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lobatum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium queenslandicum, o Chrysosporium tropicum. 63. La composición de la reivindicación 62, en donde el hongo es Chrysosporium lucknowense. 64. Una composición de celulasa que tiene actividad de celulasa a pH neutral y/o alcalino, obtenida de un hongo de tipo natural o mutante del género Chrysosporium. 65. Una composición de celulasa de acuerdo a la reivindicación 64, en donde el hongo es de la especie Chrysosporium lucknowense. 66. U na composición de celulasa de acuerdo a la reivindicación 65, en donde el hongo es Chrysosporium lucknowense Garg 27K, número de acceso VKM F-3500D . 67. Un método para producir una composición que tiene actividad de celulasa neutral y/o alcalina, comprendiendo dicho método hacer crecer un hongo de tipo natural o mutante del género Chrysosporium en cultivo en un medio adecuado. 68. El método, de acuerdo a la reivindicación 67 , en donde el hongo es Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium pannorum, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lobatum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium queenslandicum, o Chrysosporium tropicum. 69. El método, de acuerdo a la reivindicación 68, en donde el hongo es Chrysosporium lucknowense. 70. El método de acuerdo a la reivindicación 69, en donde el hongo es Chrysosporium lucknowense Garg 27K, número de acceso VKM F-3500-D. 71 . El método de acuerdo a la reivindicación 67, en donde el hongo es una cepa mutante del género Chrysosporium. 72. El método de acuerdo a la reivindicación 71 , en donde el hongo es una cepa mutante de Chrysosporium lucknowense Garg 27K. 73. Un método de lavar con piedras tejido de mezclilla o jeans de mezclilla, comprendiendo dicho método tratar dicho tejido de mezclilla o jeans de mezclilla con una celulasa, cuya secuencia de aminoácidos es codificada por una secuencia de ácido nucleico de un hongo de tipo natural o mutante del género Chrysosporium. 74. Un método de biopulido, desfibrilación, blanqueo, teñido o desaprestado de textiles que comprende tratar dichos textiles con una celulasa, cuya secuencia de aminoácidos es codificada por una secuencia de ácido nucleico de un hongo de tipo natural o mutante del género Chrysosporium. 75. U n método de des-entintado o bioblanqueo de papel o pulpa, comprendiendo dicho método tratar dicho papel o pulpa con una celulasa, cuya secuencia de aminoácidos es codificada por una secuencia de ácido nucleico de un hongo de tipo natural o mutante del género Chrysosporium. 76. Un método para intensificar la suavidad o tacto de tejido conteniendo celulosa o algodón, que comprende tratar dicho tejido con una celulasa, cuya secuencia de aminoácidos es codificada por una secuencia de ácido nucleico de un hongo de tipo natural o mutante del género Chrysosporium. 77. Un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 73-76, en donde la celulasa se aisla u obtiene de un hongo de tipo natural o mutante del género Chrysosporium. 78. Un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 73-76, en donde el hongo es Chrysosporium lucknowense. 79. U n método de acuerdo a la reivindicación 77 , en donde el hongo es Chrysosporium lucknowense. 80. Un método para generar cepas mutantes del género Chrysosporium, las cuales producen actividad de celulasa intensificada a pH's neutrales y/o alcalinos, comprendiendo (a) someter a mutación esporas de un hongo del género Chrysosporium; (b) cultivar las esporas del paso (a); y (c) clasificar los cultivos del paso (b) para niveles intensificados de actividad de celulasa neutral y/o alcalina. 81 . El método de la reivindicación 80, en donde el paso de mutación comprende exponer las esporas a luz ultravioleta o un mutágeno químico. 82. El método de la reivindicación 81 , en donde el mutágeno qu ímico es ácido nitroso, N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina, o 4-nitroquinolona-N- óxido. 83. Una cepa mutante del género Chrysosporium obtenida mediante el método de cualquiera de las reivindicaciones 80-82. 84. Un método para aislar genes que codifican enzimas de celulasa de Chrysosporium, comprendiendo: a) aislar una proteína de una composición de celulasa neutral y/o alcalina producida por un Chrysosporium de tipo natural o mutante; b) secuenciar toda o parte de la proteína aislada en el paso (a); c) producir una sonda de ácidos nucleicos derivada de la secuencia del paso (b); d) clasificar una genoteca de Chrysosporium de tipo natural o mutante con la sonda de ácidos nucleicos del paso (c); e) aislar una secuencia de ácido nucleico reconocida por la sonda; y f) secuenciar la secuencia de ácido nucleico en el paso (e). 85. U na secuencia de ácido nucleico obtenida mediante el método de la reivindicación 84. 86. U n ácido nucleico aislado cuya secuencia codifica una enzima de celulasa, en donde la enzima de celulasa es aislada u obtenida de un hongo de tipo natural o mutante del género Chrysosporium. 87. U n ácido nucleico aislado, cuya secuencia codifica una celulasa de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 1 -21 . 88. U n vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 85-87. 89. U na célula huésped que contiene un vector de expresión recombi nante de la reivindicación 88. 90. U na célula huésped de acuerdo a la reivindicación 89, en donde la célula huésped es seleccionada del grupo que consiste de células de levadura, células fúngales, células de plantas y células bacterianas. 91 . U na célula huésped de acuerdo a la reivindicación 90, en donde la célula huésped es una célula fungal seleccionada del grupo que consiste de Trichoderma, Aspergillus, Humicola, Penicillium, Chrysosporium y Neurospora. 92. U n método para cultivar un hongo del género Chrysosporium, en donde el hongo se hace crecer en un medio que contiene sales inorgán icas, fuentes de carbono y fuentes de nitrógeno orgánico, a un pH entre aproximadamente 5 y 8. 93. Un método para cultivar un hongo del género Chrysosporium de acuerdo a la reivindicación 92, en donde el pH está entre aproximadamente 6.5 y 7.5. 94. U n método para cultivar un hongo del género Chrysosporium de acuerdo a la reivindicación 92, en donde el pH está entre aproximadamente 6.9 y 7.1 . 95. Un método para cultivar un hongo del género Chrysosporium de acuerdo a la reivindicación 92, en donde el pH es mantenido a 7.5.