MXPA99003318A - Purificacion de carbohidratos con empleo de ultrafiltracion, osmosis inversa y nanofiltracion - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a métodos para purificar carbohidratos que incluyen oligosacáridos, azúcares de nucleótidos y compuestos relacionados, mediante el uso de una ultrafiltración, nanofiltración y/u osmosis inversa. Los carbohidratos son purificados para eliminar los contaminantes no deseados como aquellos compuestos presentes en las mezclas de reacción después de llevarse a cabo una síntesis enzimática o una degradación de oligosacáridos.

Description

PURIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS CON EMPLEO DE ULTRAFILTRACION. OSMOSIS INVERSA Y NANOFILTRACIÓN REFERENCIA A SOLICITUDES RELACIONADAS La presente es una continuación en parte de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos de América Número 60/028,226, depositada el 10 de octubre de 1996, cuyo texto se incorpora aquí como material de referencia. CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a la síntesis de oligosacáridos. En particular se refiere a métodos mejorados para la purificación de oligosacáridos con el empleo de una ultrafiltración, nanofiltración y/u osmosis inversa. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Un mayor entendimiento del papel de los carbohidratos como elementos de reconocimiento en la superficie de células ha conducido a un creciente interés en la producción de moléculas de carbohidratos de una estructura definida. Por ejemplo, aquellos compuestos que comprenden la porción de oligosacáridos, lactosa de sialilo, han sido de interés, neutralizadores para las enterotoxinas de ciertas bacterias como por ejemplo Vijro cholerae, Escherichia coli , y Salmonella (véase por ejemplo, la Patente Norteamericana No. *»<^ 5,330,975). También se ha investigado la lactosa sialílica para el tratamiento de artritis y enfermedades relacionadas autoinmunes. En particular se cree que la lactosa sialílica inhibe o interrumpe el grado de ocupación del sitio de ligadura de carbohidrato Fc en IgG para impedir así la formación de complejos inmunes (véase la Patente Norteamericana 5,164,374). Recientemente han sido propuestas las sialil-a (2, 3) galactósidos, la lactosa sialílica y la lactosamina sialílica para el tratamiento de úlceras y se han iniciado ensayes clínicas de la Fase I para el uso del compuesto anterior en este carácter. Véase, Balkonen et al., FEMS Immunology and Medical Microbiology 7:29 (1993) y Bio World Today, p. 5, abril 4, de 1995. Como otro ejemplo se menciona que los compuestos que comprenden ligadurars de Lewis de sialilo, los Lewis* de sialilo y los Lewis3 están presentes en líneas de células de leucocíticas y no leucocíticas que se fijan a receptores como los receptores ELAM-1 y GMP 140. Polley et al., Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 88:6224 (1991) y Phillips et al., Science, 250:1130 (1990), véase también USSN 08/063,181. Debido al interés que existe para hacer ciertas estructuras deseadas de carbohidratos, actualmente se estudian ampliamente las glicosiltransferasas y su papel en la síntesis de carbohidratos, catalizada con enzimas. El uso de las s*¿ ^ glicosiltransferasas para la síntesis enzimática de carbohidratos ofrece ventajas sobre los métodos químicos debido a una estereoselectividad virtualmente completa y una especificidad de enlace ofrecida por las enzimas (Ito et al . , Puré Appl . Chem. , 65:753 (1993) U.S. Patents 5,352,670 y 5,374,541) . Por consiguiente se utilizan cada vez más las glicosiltransferasas como catalizadores enzimáticos en la síntesis de un número de carbohidratos utilizados para fines terapéuticos y otros. Los compuestos de carbohidratos producidos por síntesis enzimática o por otros métodos muchas veces se obtienen en la forma de mezclas complejas que no solamente incluyen al compuesto deseado sino también ciertos contaminantes como azúcares sin reaccionar, sales, piruvato, fosfato, PEP, nucleósidos, nucleótidos, y proteínas, entre otros . La presencia de estos contaminantes el inconveniente para muchas aplicaciones para las cuales son útiles los compuestos de carbohidratos . Los métodos previamente utilizados para purificar los oligosacáridos, como la cromatografía, es decir la cromatografía con intercambio de iones y con exclusión de tamaños conllevan diversas desventajas. Por ejemplo, los métodos de purificación cromatográficos no siempre conducen a purificaciones a gran escala y por lo tanto queda excluido su uso para la producción comercial de sacáridos . Además puede decirse que estos métodos cromatográficos de purificación son costosos. Por consiguiente existe una necesidad de contar con métodos de purificación que sean más rápidos, más eficientes y menos costosos que aquellos métodos utilizados anteriormente. La presente invención cumple con este cometido y atiende también otras necesidades. Técnica Anterior Un método para utilizar una combinación de membranas para retirar las impurezas inconvenientes de alguna solución que contiene azúcar, especialmente los iones formadores de melaza que inhiben la cristalización de azúcar, se describe en USPN 5,454,952. El método que implica la ultrafij ación seguida por una nanofiltración, se describe como un sistema útil para mejorar la recuperación de azúcar cristalino a partir de caña de azúcar o soluciones de la remolacha de azúcar. La Memoria USPN 5,403,604 describe la separación de azúcares de jugo de fruta mediante la nanofiltración para obtener un material retenido que posee un alto grado de azúcares y un permeato que tiene un nivel menor de azúcares. La Memoria Norteamericana USPN 5,254,174 describe el uso de cromatografía y/o nanofiltración para purificar compuestos de inúlidos de la fórmula GFn (en que G es glucosa y F es fructosa) mediante el retiro de sales y glucosa, fructosa y sucrosa de un jugo o jarabe que contiene a los compuestos de inúlidos. La Memoria USPN 4,956,458 describe el uso de una osmosis inversa, para retirar a partir de la polidextrosa, la cual es un polímero de glucano aleatoriamente entrelazado producido mediante la condensación de glucosa, catalizada con ácido, la mayor parte de los constituyentes que no son del sabor correspondiente, como anhidroglucosa y la polidextrosa de derivados de furaldehido. La Memoria USPN 4,806,244 describe el uso de un sistema combinado de membrana y sorción en que se retira sulfato de agua mediante nanofiltración, después de lo cual se retiró el nitrato, que pasó a través de la membrana, del permeato mediante absorción a una resina intercambiadora de iones. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos para purificar un compuesto de carbohidratos a partir de una solución alimentadora que contiene a un contaminante. Los métodos implican poner la solución alimentadora en contacto con una membrana de nanofiltración o de osmosis inversa bajo tales condiciones que la membrana retenga el compuesto de carbohidrato deseado en tanto que una mayor parte del contaminante pasará a través de la membrana. La invención &^^t^^. -. -. 1|r^f ] _LtUH Jpt¡]II proporciona métodos para purificar compuestos de carbohidratos como los lactósidos de sialilo, el ácido siálico, lacto-N- neotetraosa (LNnT) y GlcNAcßl, 3Galßl, 4Glc (LNT-2) , NeuAca (2?3) Galß (1?4) (Fucal-3) Glc (R1) ßl-OR2, en que R1 es OH o NAc; R2 es hidrógeno, un alcoxi, un sacárido, un oligosacárido, o bien un grupo de agíicón que posee por lo menos un átomo de carbono; y Gala (l-»3) Galß (1?4) Glc (R1) ß-O-R3, en que R1 es OH o NAc; R3 es -(CH2)n-COX, con X=OH, OR4, -NHNH2 siendo R4 un hidrógeno, un sacárido, un oligosacárido, o un grupo agíicón que tiene por lo menos un átomo de carbono y con n = a un número entero de 2 a 18. Igualmente se proporcionan métodos para purificar compuestos de carbohidrato que tienen una fórmula NeuAca(2?3)Galß(l?4)GlcN(R1)ß-OR2, NeuAca (2?3) Galß (1?4) GlcNÍR1) ß (1?3) Galß-OR2, NeuAca (2?3 ) Galß (1?4 ) (Fucal?SjGlcNÍR^ß-OR2, o NeuAca (2?3) Galß (1?4) (Fucal-?^GlcNÍR1) ß(l- 3) Galß-OR2, en que R1 es alquilo o acilo con 1 a 18 átomos de carbono, 5, 6, 7, 8-tetrahidro-2- naftamido; benzamido; 2-naftamido; 4-aminobenzamido; o bien 4- nitrobenzamido, y R2 es un hidrógeno, un sacárido, un oligosacárido, o bien un grupo agíicón que posee por lo menos un átomo de carbono.

En otra forma de realización proporciona la invención métodos para purificar un compuesto de carbohidrato de una solución alimentadora que comprende una mezcla de reacción utilizada para sintetizar el compuesto de carbohidrato. La síntesis puede ser enzimática o química, o puede ser una combinación de estos tipos. Los métodos implican el retiro de cualquier proteína presente en la solución alimentadora poniendo la solución alimentadora en contacto con una membrana de ultrafiltración de manera que las proteínas son retenidas por la membrana en tanto que el compuesto de carbohidrato pasa a través de la membrana como un permeato. Luego se pone el permeato procedente del paso de ultrafiltración en contacto con un sistema de nanofiltración o una membrana de osmosis inversa bajo tales condiciones que la membrana de la nanofiltración o de la osmosis inversa retenga al compuesto de carbohidrato en tanto que una mayor parte de un contaminante no deseado pasa a través de la membrana. Otra forma de realización del invento proporciona métodos para purificar nucleótidos, nucleósidos y azúcares de nucleótidos mediante la puesta en contacto de una solución alimentadora que contiene al nucleótido o al compuesto relacionado con una membrana de nanofiltración o de osmosis inversa bajo tales condiciones que la membrana retenga al nucleótido o al compuesto relacionado en tanto que una mayor parte del contaminante pasa a través de la membrana. La presente invención proporciona igualmente métodos para retirar uno ó varios contaminantes de una solución que contiene a un carbohidrato de interés. Los métodos implican la puesta en contacto de la solución con un primer lado de una membrana semipermeable que tiene coeficientes de rechazo de tal índole que retiene al carbohidrato en tanto que permite que el contaminante pasa a través de la membrana. Esta membrana es seleccionada del grupo compuesto por una membrana de ultrafiltración, una membrana de nanofiltración y una membrana de osmosis inversa según el tamaño y la carga del carbohidrato de interés en relación a aquellos de los contaminantes. La membrana separa una solución alimentadora que contiene a un carbohidrato en una porción de material retenido y una porción de permeato. Cuando el coeficiente de rechazo de la membrana es mayor para el carbohidrato que para el contaminante, la porción retenida tendrá una concentración menor del contaminante en relación a la concentración de contaminante en la solución alimentadora y también tendrá en términos generales una proporción mayor del carbohidrato al contaminante no deseado. Viceversa, una membrana que tiene un coeficiente de rechazo para el carbohidrato que es menor que aquel para el contaminante efectuará una separación en que la concentración del contaminante es menor en el permeato que en la solución alimentadora y el permeato tendrá una proporción mayor de carbohidrato a contaminante que la solución alimentadora. Si así es deseado se puede reciclar aquella fracción que contiene al carbohidrato a través del sistema de membrana para una purificación mayor. Ejemplos de contaminantes que pueden ser retenidos de las soluciones que contienen al compuesto de interés con el empleo de los métodos de acuerdo con la invención incluyen, sin carácter limitativo, los azúcares sin reaccionar, iones inorgánicos, piruvato, fosfato, fosfoenolpiruvato y proteínas . DESCRIPCIÓN DE LAS FORMAS DE REALIZACIÓN PREFERIDAS Definiciones En este texto se utilizan las siguientes abreviaturas: Ara = arabinosilo; Fru = fructosilo; Gal = galactosilo; GalNAc = N-acetilgalacto; Glc = glucosilo; GlcNAc = N-acetilgluco; Man = manosilo; y NeuAc = sialilo (N-acetilneuraminilo) . ^Él»&.

El término de "carbohidrato" abarca aquellos compuestos químicos que tiene la fórmula general (CH20)n e incluye los monosacáridos, disacáridos, oligosacáridos y polisacáridos. El término "oligo", como se utiliza en este 5 texto, se refiere a una molécula polimérica que consta de 2 hasta aproximadamente 10 residuos, como por ejemplo, los aminoácidos (oligopéptido) , monosacáridos (oligosacáridos) , y los ácidos nucleicos (oligonucleótido) . El término "poli" se refiere a una molécula polimérica que comprende una cantidad mayor de alrededor de 10 residuos. Se considera que los oligosacáridos tienen un extremo reductor y un extremo no reductor, no importa si el sacárido presenta en el extremo reductor sea de hecho un azúcar reductor. De acuerdo con la nomenclatura aceptada, se describen aquí los oligosacáridos con el extremo no reductor en el lado izquierdo y el extremo reductor en el lado derecho. Todos los oligosacáridos aquí descritos se señalan con el nombre o la abreviatura para el sacárido no reductor (por ejemplo, gal) ; seguida por la configuración del enlace glucosídico (a o ß) , el enlace de anillo, la posición anular del sacárido reductor en cuestión dentro del enlace y luego el nombre o la abreviatura del sacárido reductor (por ejemplo, GlcNAc) . El enlace entre dos azúcares puede ser expresado por ejemplo, como 2,3, 2-»3, ó (2,3). ^gí^^^^^^^^g?^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^? Un compuesto está "virtualmente purificado" de un componente no deseado en una solución cuando la concentración del componente no deseado después de purificar no es mayor al 40% de la concentración del componente antes de la purificación. De preferencia la concentración después de purificar del componente no deseado será menor a un 20% en peso, más preferentemente menor a un 10% aproximadamente de la concentración antes de purificar. El término "farmacéuticamente puro", como se utiliza en este texto, se refiere a un compuesto que se encuentra lo suficientemente puro de contaminantes no deseados que el compuesto será útil para administrarse como un agente farmacéutico. De preferencia está purificado el compuesto en tal grado que el contaminante no deseado está presente después de purificar en una cantidad que es de 5% en peso o menos de la concentración antes de purificar del contaminante presente en la solución alimentadora. Con mayor preferencia asciende la concentración después de purificar del contaminante a 1% o menos de la concentración del contaminante antes de purificar y más preferentemente será de aproximadamente 0.5% o menos de la concentración antes de purificar del contaminante. Una "solución alimentadora" se refiere a cualquier solución que contiene a un compuesto que debe ser purificado. Por ejemplo, puede utilizarse una mezcla de reacción empleada _-ÉMU-M-i-a--i-i-i? para sintetizar un oligosacárido como solución alimentadora a partir de la cual se purifica el producto de reacción deseado con empleo de los métodos de acuerdo con la invención. Formas de Realización del Invento La presente invención proporciona métodos para purificar rápida y eficientemente ciertas estructuras específicas de carbohidratos y oligosacáridos con un alto grado de pureza con el empleo de membranas semipermeables como membranas de osmosis inversa y/o nanofiltración. Los métodos son particularmente útiles para separar compuestos de oligosacáridos de reactivos y otros contaminantes que permanecen en una mezcla de reacción después de la síntesis o el desmembramiento de los oligosacáridos. Así, por ejemplo, proporciona la invención métodos para separar oligosacáridos de enzimas y/u otros componentes de mezclas de reacción que se utilizan para síntesis enzimáticas o la degradación enzimática de oligosacáridos, azúcares de nucleótidos, glicolípidos, liposacáridos, nucleótidos, nucleósidos y otros compuestos que contienen sacáridos. Igualmente se proporcionan métodos para retirar sales, azúcares y otros componentes de soluciones alimentadoras con el empleo de una ultrafiltración, nanofiltración o una osmosis inversa. Con el uso de estas técnicas, los sacáridos, (por ejemplo, la lactosa de sialilo, SLex y muchos otros) pueden ser producidos hasta una pureza ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^gg/^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ del 100% fundamentalmente. Además puede decirse que los métodos de purificación de acuerdo con la presente invención son más eficientes, más rápidos y conducen mejor a purificaciones a gran escala que aquellos métodos de purificación de carbohidratos, conocidos anteriormente. A menudo puede llevarse a cabo una purificación deseada en una sola etapa; en términos generales no se requieren de pasos adicionales de purificación como podría ser una cristalización y operaciones similares. Por lo tanto, proporciona la invención métodos que constan de un solo paso, para purificar compuestos que contienen sacáridos. Para purificar los sacáridos de acuerdo con la invención se selecciona una membrana que es propia para separa el carbohidrato deseado de los componentes no deseados de la solución a partir de la cual debe purificarse el carbohidrato. La meta en la selección de una membrana es optimizar para alguna aplicación en particular, el recorte del peso molecular (abreviatura en inglés MWCO) , la composición de la membrana, la permeabilidad y las características de rechazo, es decir la capacidad total de la membrana para retener ciertas moléculas específicas en tanto que permite que sales y otras moléculas más pequeñas o de carga opuesta, pasan a través de la misma. El porcentaje de retención de un componente y (R es dado por la fórmula Rx= (1-C?p/C?r) x 100%, en donde C?p es la concentración -—~ - -• - — ir k?******* r.-.. ..,A.^..^ ^,.^,^^-del componente i en el permeato y C?r es la concentración del componente i en el material retenido, ambas expresadas en un porcentaje en peso. El porcentaje de retención de un componente también es llamado la característica de retención o el coeficiente de rechazo de la membrana. Para lograr una separación efectiva se elige una membrana que tenga una proporción elevada de rechazo ante el sacárido de interés, por lo que se refiere a la proporción de rechazo para compuestos de donde se desea la separación. Cuando una membrana tiene un alto grado de rechazo para un primer compuesto en relación a un segundo compuesto, la concentración del primer compuesto presente en la solución de permeato que pasa a través de la membrana disminuye en relación a aquella del segundo compuesto. Viceversa, la concentración del primer compuesto aumenta en relación a la concentración del segundo compuesto en el material retenido. Si una membrana no rechaza a un compuesto, la concentración del compuesto tanto en la parte de permeato como de rechazo permanecerá fundamentalmente igual como en la solución alimentadora. Es igualmente posible que una membrana tenga una proporción de rechazo negativa para un compuesto cuando la concentración del compuesto presente en el permeato se torne mayor que la concentración del compuesto en la solución alimentadora. Una explicación general de la tecnología de las -^ ^^^,^¿ m? ^^^^^^^^^gg¡^l^^^^^^^m^^^^^^^^^^ membranas la encontramos en "Membrane Separation Processes", en la en Enciclopedia de Ullmann: Encyclopedia of Industrial Chemistry (VCH, 1990) ; véase también, Noble and Stern, Membrane Sparations Technology: Principies and Applications (Elsevier, 1995) . Elegirá generalmente una membrana que tenga un recorte en el peso molecular (abreviatura en inglés MWCO) , que a menudo estará relacionado con el tamaño de los poros de la membrana) que, según se espera, retendrá los compuestos deseados en tanto que permite que algún compuesto no deseado presente en la corriente alímentadora pasará a través de la membrana. El recorte de peso molecular deseado MWCO será generalmente menor al peso molecular del compuesto que se está purificando y típicamente será mayor que el peso molecular del contaminante no deseado que debe ser retirado de la solución que contiene al compuesto que se está purificando. Por ejemplo, para purificar un compuesto que tiene un peso molecular de 200 Da, uno escogería una membrana que tenga un recorte molecular MWCO de menos de aproximadamente 200 Da. Una membrana con un recorte molecular MWCO de 100 Da, por ejemplo, también sería un candidato adecuado. Las membranas que se utilizan en la presente invención se clasifican en parte sobre la base de su recorte molecular MWCO como membranas de ultrafiltración (UF) membranas de nanofiltración (NF) , o bien •fr-**"»»* — *- -^ "'"' """ m?—»—»•» ^^ .-^..^. membranas de osmosis inversa (RO) , en dependencia de la separación deseada. Para fines de esta invención, se clasifican las membranas UF, NF, y RO tal y como se definen en el manual Puré Water Handbook, Osmonics, Inc. (Minnetonka MN) . Las membranas RO, o sea de osmosis inversa tienen típicamente un recorte molecular MWCO nominal de menos de aproximadamente 200 Da y rechazan a la mayor parte de los iones, las membranas NF generalmente tienen un valor de recorte MWCO nominal entre 150 Da y 5 kDa aproximadamente y las membranas UF tienen un recorte molecular MWCO nominal entre aproximadamente 1 kDa y alrededor de 300 kDa (estos rangos de MWCO presuponen la presencia de una molécula parecida a un sacárido) . Un segundo parámetro que es considerado para seleccionar una membrana adecuada para alguna separación específica es el tipo de polímero de la membrana. Las membranas utilizadas en cada zona se hacen de un material de membrana convencional, que puede ser inorgánico, orgánico o bien una mezcla de material inorgánico y orgánico. Típicos materiales inorgánicos incluyen vidrios, cerámica, cermets, metales y similares. Las membranas de cerámica, que son los materiales preferidos para la zona UF, pueden fabricarse, por ejemplo, como se describe en las Patentes Norteamericanas números 4,692,354 otorgada a Asaeda et al . , 4,562,021 concedida a Alary et al . , y otros. Los materiales orgánicos ¡g^^5|j^^JggBgj«|ggg^^g^^^^^^^^^^j^^^^^^^^^^^^^?¿WKtóSj^ que son preferidos para las zonas NF y RO son típicamente polímeros, ya sea isotrópicos, o anisotrópicos con una capa delgada o "piel" ya sea en el lado del orificio o bien en el lado de casco o envoltura de las fibras. Los materiales 5 preferidos para las fibras son poliamidas, polibenzamidas, polisulfonas (incluyendo polisulfonas sulfonada y poliéter- sulfona sulfonada entre otros) , los poliestirenos, incluyendo los copolímeros que contienen estireno como los copolímeros de acrilonitrilo-estireno, butadieno-estireno y estireno- 10 vinilbencilhaluro, policarbonatos, polímeros celulósicos incluyendo acetato de celulosa, polipropileno, poli (vinil cloruro), poli (etilen tereftalato), alcohol polivinílico, fluorocarbonos, y similares, como aquellos dados a conocer en las Patentes Norteamericanas 4,230,463, 4806,244, y 4,259,183.

Las membranas NF y RO muchas veces constan de un substrato de soporte poroso además de una capa de discriminación polimérica. De importancia particular al seleccionar una composición adecuada para una membrana en la carga de superficie de la membrana. Dentro del rango requerido del recorte molecular MWCO, se selecciona una membrana que tenga una carga de superficie que sea adecuada para la carga iónica del carbohidrato y para aquella de los contaminantes. En tanto que el recorte molecular MWCO para una membrana específica es * generalmente invariable, el cambio del pH de la solución alimentadora puede afectar las propiedades de separación de una membrana alterando la carga de seuperficie de la membrana. Así por ejemplo, una membrana que tiene una clara carga de superficie negativa con un valor neutral del pH puede ser ajustada para que tenga una carga neutral neta simplemente disminuyendo el pH de la solución. Un efecto adicional de ajustar el pH de la solución es modular la carga iónica en los contaminantes y en el carbohidrato de interés . Por consiguiente, mediante la elección de un cierto tipo de polímero adecuado para la membrana y un pH correcto, uno puede obtener un sistema en que tanto el contaminante como la membrana son neutrales para facilitar así el paso del contaminante. Por ejemplo cuando un contaminante está cargado negativamente en un valor de pH neutral a menudo es deseable reducir el pH de la solución de alimentación para protonizar el contaminante, por ejemplo, la remoción del fosfato se facilita reduciendo el pH de la solución hasta aproximadamente 3 lo cual protoniza el anión fosfato permitiendo el paso a través de una membrana. Como se muestra en el Ejemplo 5 una reducción en el pH de 7.5 a 3.0 disminuye el porcentaje de GlcNAc que pasa a través de una membrana de poliamida tal como una Osmonics MX07 en treinta minutos del 70% al 28% al mismo tiempo aumentando el porcentaje de paso del fosfato de 10% a ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^g¡^^^^^^^JJg^g||^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ 46% (ver, Ejemplo 6, Tabla 5 para ejemplos adicionales del efecto de un cambio en el pH sobre la tasa del paso de otros componentes a través de varias membranas de nanofiltración) . Para la purificación de un carbohidrato aniónico, el pH estará generalmente entre 1 y 7 aproximadamente. Viceversa, cuando el contaminante tiene una carga de superficie positiva, el pH de la solución alimentadora puede ser ajustado a un pH de 7 y de 14 aproximadamente. Por ejemplo, el incremento del pH de una solución que contiene un contaminante que tiene un grupo amino (-NH3+) neutralizará al grupo amino facilitando así su paso a través de la membrana. Así como un aspecto de la invención implica la modulación de una separación mediante el ajuste del pH de una solución en contacto con la membrana; esto puede cambiar la carga iónica de un contaminante y también puede afectar la carga de superficie de la membrana, facilitando así la purificación del carbohidrato deseado. Desde luego es menester seguir las instrucciones del fabricante por lo que se refiere a un rango aceptable del pH para una membrana específica, para evitar el causar daños a la membrana. Para algunas aplicaciones, primero se somete una mezcla a una nanofiltración u osmosis inversa en un determinado nivel de pH después de lo cual el material retenido que contiene al sacárido de interés, es ajustado a un pH diferente y sometido a una vuelta adicional de purificación por membrana. Por ejemplo la filtración de una mezcla de reacción utilizada para sintetizar la lactosa de sialilo a través de una membrana Osmonics MX07 (una membrana de nanofiltración con un nivel MWCO de aproximadamente 500 Da) en un pH de 3.0 retendrá la lactosa de sialilo y retirará la mayor parte del fosfato, piruvato, salimanganeso de la solución en tanto que también retirará un poco del GlcNAc, lactosa y ácido siálico. Una mayor recirculación a través de la membrana MX07 después de ajustar el pH del material retenido a 7.4, retirará la mayor parte del material restante de fosfato, todo el piruvato, la totalidad de la lactosa, una parte del ácido siálico y cantidades substanciales del manganeso restante . Cuando debe purificarse un sacárido a partir de una mezcla que contiene proteínas, como enzimas utilizas para sintetizar un oligosacárido o azúcar de nucleótido deseado, muchas veces conviene retirar las proteínas como primer paso del procedimiento de purificación. Para un sacárido que es más pequeño que las proteínas, se lleva a cabo esta separación escogiendo una membrana que tiene un nivel de MWCO que es menor que la masa molecular de la proteína u otra macromolécula que debe ser retirada de la solución y que es mayor que la masa molecular del oligosacárido bajo purificación (es decir, el porcentaje de rechazo en este caso es mayor para la proteína que para el sacárido deseado) . Las proteínas y otras macromoléculas que tienen una masa molecular mayor que el recorte de MWCO serán rechazadas por consiguiente por la membrana en tanto que el sacárido pasará a través de la 5 membrana. Viceversa, si debe purificarse un oligosacárido o un azúcar de nucleótido a partir de proteínas que son más pequeñas que el oligosacárido o el azúcar de nucleótido, se utiliza una membrana que tiene un recorte de peso molecular MWCO que es mayor que la masa molecular de la proteína pero más pequeño que el del oligosacárido o del azúcar de nucleótido. En términos generales, la separación de proteínas de carbohidratos hará uso de membranas a que hace referencia comúnmente con el término de membranas de ultrafiltración (UF) . Las membranas de ultrafiltración que son adecuadas para emplearse en los métodos de acuerdo con la presente invención se encuentran disponibles a partir de diferentes fabricantes comerciales, incluyendo Millipore Corp. (Bedford, MA) , Osmonics, Inc. (Minnetonka, MN) , Filmtec (Minneapolis, MN) , UOP, Desalination Systems, Advanced Membrane Technologies, y Nitto. La invención proporciona igualmente métodos para retirar sales y otros componentes de bajo peso molecular y una mezcla que contiene un sacárido de interés mediante el uso de una membrana de nanofiltración (NF) o de osmosis inversa (RO) .

Las membranas de nanofiltración constituyen una clase de membranas para las cuales la separación está basada en el peso molecular y la carga iónica. Estas membranas entran típicamente entre membranas de osmosis inversa y de ultrafiltración en términos del tamaño de las especies que pasarán a través de la membrana. Las membranas de nanofiltración tienen típicamente microporos o aberturas entre las cadenas en una red polimérica hinchada. Los recortes de peso molecular para las moléculas no ionizadas se sitúan típicamente en el rango de 100 a 20,000 Dalton. Para los iones del mismo peso molecular, los rechazos (retenciones) de membrana incrementarán progresivamente para las cargas iónicas de 0, 1, 2, 3 etcétera para una membrana en particular debido a la mayor densidad de carga ( véase, por ejemplo, Eriksson, P. , " Nanofiltration Extends the Range of Membrane Filtration" , Environmental Progress, 7: 58-59 (1998)). La nanofiltración también se describe en Chemical Engineering Progress, pp. 68-74 (marzo de 1994), Rautenbach et al . , Desalination 11 : 73 (1990), y USPN 4,806,244). En una aplicación típica se retendrán los sacáridos de interés por la membrana de nanofiltración y pasarán las sales contaminantes así como otros componentes no deseados. Una membrana de nanofiltración efectiva en los métodos de acuerdo con la presente invención tendrán típicamente una característica de ^^¡^^^^Jgßg^?Sggg^^^^^^^^^^gg^^^^^^^^t^^^^^ retención para el sacárido de interés de 40% a 100% aproximadamente, y de preferencia desde 70% a 100%. Las membranas de nanofiltración utilizadas en este invento pueden ser cualesquiera de las membranas de nanofiltros convencionales, siendo particularmente adecuadas las membranas de poliamida. Varios fabricantes comerciales, incluyendo Millipore Corp. (Bedford, MA) , Osmonics, Inc., (Minnetonka, MN) , Filmtec, UOP, Advanced Membrane Technologies, Desalination Systems, y Nitto, entre otros, distribuyen membranas de nanofiltración que son adecuados para utilizarse en los métodos de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, las membranas adecuadas incluyen los modelos Osmonics MX07, YK, GH (G-10) , GE (G-5) , así como las membranas HL entre otras . Las membranas de osmosis inversa (RO) también permiten que toda una variedad de material soluto acuoso pase a través de las mismas mientras que ciertas moléculas seleccionadas serán retenidas. Generalmente la osmosis se refiere a un procedimiento por el cual un líquido puro (por lo general agua) pase a través de una membrana semipermeable hasta dentro de una solución (generalmente azúcar o sal y agua) para diluir la solución y lograr un equilibrio osmótico entre los dos líquidos. En cambio, la osmosis inversa es un proceso con membrana, bajo impulso de presión, en que la t^^ ^ mm? aplicación de una presión externa sobre el sistema de la membrana resulta en un flujo al revés en que las moléculas de agua pasan desde un compartimiento que contiene agua salada o una solución de azúcar para llegar al compartimiento de agua pura del sistema de membrana. Una membrana RO que es semipermeable y no porosa, requiere de una carga acuosa que debe ser bombeada hacia la misma a una presión por encima de la presión osmótica de las substancias disueltas en el agua. Una membrana RO puede retirar efectivamente las moléculas de bajo peso molecular (a nivel inferior a 200 Dalton) y también los iones desde el agua. De preferencia tendrá la membrana de osmosis inversa una característica de retención para el sacárido de interés desde aproximadamente 40% a 100% y de preferencia desde 70% a 100%. Las membranas RO adecuadas incluyen, sin carácter limitativo, los modelos Filmtec BW-30, Filmtec SW-30, Filmtec SW-30HR, las membranas RO de tipo UOP, Desal, Osmonics, de Advanced Membrane Technologies y de Nitto, entre otras. Un ejemplo de una membrana RO adecuada es el modelo Millipore Cat. N° CDRN500 60 (Millipore Corp., Bedford, MA) . Las membranas utilizadas en la invención pueden ser empleadas en cualquiera de las construcciones de membrana conocidas. Así por ejemplo pueden ser las membranas de tipo plano, a base de una lámina y un marco, en forma tubular, en ¿¡^^^^^^^^^^^^g^^^^^^^^^^^g^^^^^^^^^^^ espiral, con fibra hueca y similares. En una forma de realización preferida, la membrana se encuentra enrollada en espiral , las membranas pueden ser empleadas en cualquier configuración adecuada, incluyendo en un sistema de flujo 5 cruzado o en una configuración a profundidad. En la filtración de tipo " flujo cruzado" , que es el sistema preferido para las purificaciones mediante ultrafiltración, nanofiltración u osmosis inversa, de acuerdo con la presente invención, el material " alimentado" o sea la solución a partir de la cual debe ser purificado el carbohidrato de interés pasa fluyendo, a través de los canales de la membrana, ya sea en sentido paralelo o tangencial a la superficie de la membrana y luego se separa en un material retenido (también llamado material recirculado o concentración) como una primera corriente y otra corriente compuesta por el permeato. Para mantener una membrana eficiente, la corriente de alimentación debe fluir, con una velocidad lo suficientemente alta, en sentido paralelo a la superficie de la membrana para crear fuerzas de sizallamiento y/o una turbulencia para purgar las partículas que se van acumulando y que son rechazadas por la membrana. Por consiguiente conlleva una filtración en flujo cruzado o transversal el flujo de tres corrientes, la alimentación, el permeato y el material retenido. En cambio, un filtro de " extremo muerto" o bien " a profundidad" solamente tiene dos corrientes, es decir la alimentación y el material filtrado (o sea el permeato) . La corriente de reciclaje o de material retenido, que conserva todas las partículas y las moléculas grandes rechazadas por la membrana, puede ser reciclada por completo hacia el módulo de la membrana donde es generada la corriente de reciclaje, o también se puede retirar parcialmente del sistema. Cuando se utilizan los métodos de acuerdo con la presente invención para purificar sacáridos de los componentes de peso molecular menor, por ejemplo, los sacáridos deseados quedan contenidos en la corriente retenida (o en la corriente de alimentación para un filtro a profundidad) , en tanto que la corriente del permeato contiene los contaminantes retirados. Los métodos de purificación de acuerdo con la presente invención pueden ser optimizados en mayor grado ajustando la presión, la tasa de flujo y la temperatura a las cuales se lleva a cabo la filtración. Los sistemas UF, NF y RO (ultrafiltración, nanofiltración y osmosis inversa) en términos generales requieren de un aumento de las presiones por encima del nivel ambiental a fin de superar la presión osmótica de la solución que se hace pasar a través de la membrana. Las instrucciones de los fabricantes de las membranas por lo que se refiere a las presiones de operación máximas y las recomendadas, pueden ser observadas por un lado, ".afcAMUg* *áy*yz. ^*^^|¡^^^jU!¡gf^|^^^^^^^^^g¡^^^^^^^^^<^^^^ y por otra parte es posible lograr una mayor optimización efectuando ajustes por incrementos. Por ejemplo la presión recomendada para UF generalmente estará entre 1.75 y 7 kg/cm2, para NF estará entre 3.5 y aproximadamente 105 kg/cm2 y para 5 el sistema RO, o sea osmosis inversa, entre aproximadamente 7 y 105 kgs/cm2. También pueden ajustarse las tasas de flujo tanto de la concentración (solución alimentadora) como del permeato para poner la purificación deseada en un punto óptimo. Nuevamente sí servirán las recomendaciones de los fabricantes para alguna membrana en particular como un punto de partida desde donde se puede comenzar este procedimiento de optimización a través de la realización de ajustes increméntales. Las típicas tasas de flujo para la concentración (Pc) estarán entre 3.80 y alrededor de 57 litros por minuto (LPM) y más preferentemente entre aproximadamente 11.4 y 26.6 LPM. Para el permeato son típicas las tasas de flujo (Pf) entre aproximadamente 0.19 y alrededor de 38 LPM, o sea litros por minuto, prefiriéndose las tasas de flujo que están entre 0.76 y 3.8 LPM. La temperatura a la cual se lleva a cabo la purificación también puede influir sobre la eficiencia y la velocidad de la purificación. Son típicas las temperaturas entre 0 y 100°C aproximadamente y para la mayor parte de las aplicaciones se da la preferencia a niveles de 20 a 40°C. Mayores temperaturas pueden resultar para ciertas -"•'- .»..»^- MMmm átíte>„ ..„»*=* membranas en un incremento en el tamaño de los poros de la membrana, proporcionando así un parámetro adicional que uno puede ajustar para optimizar una purificación. En una forma de realización preferida, se lleva a cabo la filtración en una máquina purificadora de membrana que proporciona un auxiliar para el control automático de la tasa de flujo, la presión, la temperatura y otros parámetros que pueden afecta la purificación. Así por ejemplo es adecuada la máquina purificadora de membrana Osmonics 213T para utilizarse en los métodos de la invención, al igual que las máquinas fabricadas por otras compañías enlistadas arriba. Las membranas pueden limpiarse sin dificultades ya sea después de utilizar o bien después de que haya disminuido la permeabilidad de la membrana. La limpieza puede llevarse a cabo a una temperatura levemente elevada, si así se desea, haciendo un enjuague con agua o una solución cáustica. Si las corrientes contienen pequeñas cantidades de enzimas, podría ser útil el enjuague en la presencia de pequeñas cantidades de un agente tensioactivo, por ejemplo ULTRASIL18. También es posible utilizar los llamados prefiltros (100 a 200 µm) para proteger las membranas de nanofiltración más costosas. En caso deseado se pueden utilizar otros agentes limpiadores. La elección del método de limpieza dependerá de la membrana que se esté limpiando y deben consultarse las instrucciones del &*&_ ^§ &i^¡^¡j^ fabricante de la membrana. La limpieza puede llevarse a cabo con un sistema de purga hacia adelante o bien hacia atrás. Los métodos de purificación de acuerdo con la presente invención se pueden utilizar solos o en combinación 5 con otros métodos para purificar carbohidratos. Por ejemplo puede utilizarse una resina intercambiadora de iones para retirar ciertos iones particulares de una mezcla que contiene un sacárido de interés, ya sea antes o después de la nanofiltración u osmosis inversa, o también tanto antes como después de filtrar. Un intercambio iónico es particularmente conveniente si se trata de retirar iones como fosfato y nucleótidos que permanecen atrás después de una primera ronda de nanofiltración u osmosis inversa. En el caso de una síntesis de lactosa de sialilo, como se ha tratado arriba, esta operación puede llevarse a cabo por ejemplo agregando una resina intercambiadora de aniones como AG1X-8 (forma de acetato, BioRad; véase por ejemplo el catálogo de BioRad para otras resinas intercambiadoras de iones) a un material retenido que tiene un pH de 3.0 aproximadamente o menos, hasta que se encuentre reducida la concentración del fosfato de acuerdo con las preferencias. En este procedimiento se libera el ácido acético, de manera que podría ser conveniente dejar salir el intercambio iónico por una purificación adicional mediante una nanofiltración o un sistema de osmosis inversa. ... -^-^»^». - ¿tOtems****.

Así por ejemplo es posible hacer circular la solución con un pH de 3.0 ó menos, a través de una membrana MX07 ó una membrana similar hasta que la conductividad del permeato sea baja y quede estabilizada. Luego puede elevarse el pH de la solución a 7.4 con NaOH y la solución puede ser recirculada a través de la misma membrana para retirar el acetato de sodio y la sal que han quedado atrás. Se pueden retirar los cationes de una manera similar, por ejemplo para retirar Mn2+, se puede utilizar una resina intercambiadora de iones acida, como por ejemplo AG50WX8 (H+) (BioRad) . Los métodos de purificación de acuerdo con la presente invención son particularmente útiles para purificar los oligosacáridos que han sido preparados con el empleo de una síntesis enzimática. Una síntesis enzimática con el empleo de glicosiltransferasas proporciona un método poderoso para preparar los oligosacáridos; para algunas aplicaciones es conveniente purificar el oligosacárido a partir de las enzimas y otros reactivos presentes en la mezcla de reacción de la síntesis enzimática. Los métodos preferidos para producir muchos oligosacáridos implican ciclos de transferasa de glicosilo, sistema que produce por lo menos un mol de pirofosfato inorgánico por cada mol de producto formado y estos métodos se realizan típicamente en la presencia de un ion de un metal bivalente. Ejemplos de ciclos de glicosiltransferasa son los ciclos de sialiltransferasa, que utilizan una o varias enzimas al igual que otros reactivos.

Véanse por ejemplo la Patente Norteamericana N° 5,374,541 WO 9425615 A, PCT/US96/04790 , y PCT/US/96/0482 . Por ejemplo, una reacción utilizada para la síntesis de oligosacáridos sialilados puede contener una sialiltransferasa, una sintetasa de ácido CMP-siálico, un ácido siálico, un aceptante para la sialiltransferasa, CPT, y un catión de metal bivalente soluble. Una a(2,3) sialiltransferasa ejemplificativa, identificada como una a(2,3) sialtransferasa (EC 2.4.99.6) transfiere el ácido siálico a la terminal no reductora Gal de un disacárido Galß^Glc o glicosida. Véase, Van den Eijnden et al., J. Biol. Chem, 256:3159 (1981), Winstein et al., J. Biol. Chem., 257:13845 (1982) y Wen et al., J. Biol. Chem., 267:21011 (1992). Otra a2 , 3-sialiltransferasa ejemplificativa (EC 2.4.99.4) transfiere el ácido siálico a la terminal no reductora Gal del disacárido o del glucósido. Véase, Rearick et al., J. Biol. Chem., 254:4444 (1979) y Gillespie et al., J.

Biol. Chem., 267:21004 (1992). Otras enzimas ejemplificativas incluyen Gal-ß-l, 4-GlcNAc a~2 6 sialiltransferasa (véase, Kurosawa et al. Eur. J. Biochem. 219:375-381 (1994). La mezcla de reacción también contendrá un aceptante para la sialiltransferasa, que de preferencia tendrá una unidad de galactosilo. Aceptantes adecuados incluyen por ejemplo .-j ae^*».^ | 1| mt ) amwgBrlyl| |l|,|Ml t tgMMBH MWfa? i irm i m infáif IH ÜIÍI i ¡ ~ti i» JJQJÚLA-IT: Galßl_3GalNAc,lacto-N-tetraosa, Galßl_3GlcNAc, Galßl_3Ara, Galßl_6GlcNAc, Galßl_4Glc (lactosa), Galßl_4Glcßl-OCH2CH3, Galßl_4Glcßl-OCH2CH2CH3, Galßl_4Glcßl-OCH2C6H3, Galßl_4GlcNAc, Galßl_OCH3, melibiosa, rafinosa, estaquiosa, y lacto-N- 5 neotetraosa (LNnT) . El ácido siálico presente en la mezcla de reacción no solamente puede incluir al propio ácido siálico (ácido 5-N-acetilneuramínico; ácido 5-N-acetilamino-3 , 5- didesoxi-D-glicero-D-galacto-2-nonulosónico; NeuAc, y a veces también abreviados como AcNeu o NANA) , sino también los ácidos siálicos 9-substituidos como el 9-0-acilo de 1 a 6 átomos de carbono-NeuAc, como 9-0-lactil-NeuAc, o bien 9-0-acetil-NeuAc, 9-desoxi-9-fluoro-NeuAc y 9-azido-9-desoxi-NeuAc . La síntesis y el uso de estos compuestos en un procedimiento de sialilación se describe en la solicitud internacional WO 92/16640, que se publicó el 1° de octubre de 1992. En las formas de realización preferidas, el medio de reacción puede comprender además un sistema de reciclaje de ácido siálico CMP que comprende por lo menos 2 moles de donador de fosfato por cada mol de ácido siálico, así como cantidades catalíticas de un nucleótido de adenina, una quinasa capaz de transferir el fosfato del donador de fosfato a los difosfatos del nucleósido, y una quinasa de monofosfato de nucleósido capaz de transferir el fosfato terminal desde un trifosfato de nucleósido a CMP. Por ejemplo, un sistema ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^g¡gj^f^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ regenerador de ácido siálico de CMP adecuado comprende el monofosfato de citidina (CMP) , un trifosfato de nucleósido (por ejemplo el trifosfato de adenosina (ATP) un donador de fosfato (por ejemplo el fosfoenopiruvato o el acetilfosfato) , 5 una quinasa (por ejemplo la quinasa del piruvato o la quinasa de acetato) capaz de transferir el fosfato del donador de fosfato a los difosfatos de los nucleósidos y una quinasa de monofosfato de nucleósido (por ejemplo la mioquinasa) , capaz de transferir el fosfato terminal desde un trifosfato de nucleósido al CMP. La a (2 , 3) sialiltransferasa señalada anteriormente así como la sintetasa del ácido siálico de CMP también pueden considerarse formalmente como una parte del sistema regenerador de ácido siálico de CMP. Para aquellas formas de realización en que no se utiliza un sistema de recirculación del ácido siálico de CMP, el medio de reacción de preferencia comprenderá además una fosfatasa. El piruvato es un subproducto del ciclo de sialiltransferasa y puede ser aprovechado en otra reacción en que se hacen reaccionar la N-acetilmanosamina (ManNAc) y el piruvato en la presencia de NeuAc-aldolasa (Ec 4.1.3.3) para formar el ácido siálico. Como alternativa también puede ser aprovechada la isomerización de GlcNAc a ManNAc, y el GlcNAc menos costoso puede ser utilizado como el material de partida para generar el ácido siálico. Así puede ser reemplazado el ácido siálico por ManNAc (o GlcNAc) y una cantidad catalítica de aldolasa de NeuAc. Aunque la aldolasa de NeuAc también cataliza la reacción inversa (NeuAc a ManNAc y piruvato) , el NeuAc producido se incorpora irreversiblemente en el ciclo de reacción a través del CMP-NeuAc catalizado por la sintetasa del ácido siálico de CMP. Además también puede crearse el material de partida, ManNAc, mediante la conversión química de GlcNAc utilizando los métodos conocidos en la técnica (véase por ejemplo, Simón et al., J. Am. Chem. Soc. 110:7159 (1988). La síntesis enzimática del ácido siálico y sus derivados 9- substituidos y el uso de un ácido siálico resultante en un diferente esquema de reacción sialilante se ha dado a conocer en la solicitud internacional WO 92/16640, que se publicó el 1° de octubre de 1992, y que se incorpora en el presente texto como material de referencia. Cuando se utiliza una galactosiltransferasa para la síntesis enzimática de un oligosacárido, el medio de reacción preferentemente contendrá, además de una galactosiltransferasa, un substrato de donador, un azúcar aceptante y un catión de metal bivalente, un sistema de recirculación del substrato donador que comprende por lo menos 1 mol de 1-fosfato de glucosa por cada mol de azúcar aceptante, un donador de fosfato, una quinasa capaz de transferir el fosfato del donador de fosfato a los difosfatos ^^gg^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^g^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ de nucleósido, y una pirofosforilasa capaz de formar glucosa de UDP desde UTP y 1-fosfato de glucosa y cantidades catalíticas de UDP así como una galactosa-4 -epimerasa de UDP. Las galactosiltransferasas ejemplificativas incluyen una ad'3) galactosiltransferasa (E.C. N° 2.4.1.151) véanse por ejemplo, Dabkowski et al., Transplant Proc. 25:2921 (1993) y Yamamoto et al., Nature 345:229-233 (1990)) y ß(l,4) galactosiltransferasa (E.C. N° 2.4.1.38). Los oligosacáridos sintetizados por otros métodos enzimáticos pueden ser purificados igualmente por los métodos de la presente invención. Por ejemplo son útiles los métodos para purificar los oligosacáridos producidos en reacciones no cíclicos o parcialmente cíclicas como una simple incubación de un sacárido activado y una molécula aceptora adecuada con una glicosiltransferasa bajo condiciones efectivas para transferir y fijar covalentemente el sacárido a la molécula del aceptor. Las glicosiltransferasas, que incluyen aquellas descritas por ejemplo en la Patente Norteamericana N° 5,80,674, y la Publicación de Patente Internacional N° WO 93/13198 y WO 95/02683, al igual que las glicosiltransferasas codificadas por el sitio los de Neisseria (véase USPN 5,545,553), pueden ser fijadas a una superficie de célula o pueden quedar sin fijar. Los oligosacáridos que se pueden obtener con el empleo de estas glicosiltransferasas incluyen por ejemplo: Gala (1_4 ) Galß (1_4) Glc, GlcNAcß (1,3) Galß (1 , 4) Glc, Galß (l_4)GlcNAcß(l_3) Galß (1_4) Glc, y GalNAcß ( 1_3 ) Galß (l_4)GlcNAcß(l_3) Galg (1_4) Glc, entre muchas otras . 5 Entre los compuestos que pueden purificarse con el empleo de los métodos descritos se encuentran el ácido siálico y cualquier azúcar que tenga una porción de ácido siálico. Ellos incluyen las galactosidas de sialilo, incluyendo las lactosidas de sialilo al igual que los compuestos que poseen la fórmula: NeuAca(2_3)Galß(l_4)GlcN(R' )ß-0R o NeuAca (2_3 ) Galß (1_4 ) GlcN (R' ) ß (1_3 ) Galß-OR En estas fórmulas, R' es alquilo o acilo con 1 a 18 átomos de carbono, 5, 6, 7, 8 -tetrahidro-2 , naftamido; benzamido; 2-naftamido; 4-aminobenzamido; o 4-nitrobenzamindo. R es un hidrógeno, un alquilo con 1 a 6 átomos de carbono, un sacárido, un oligosacárido o bien un grupo aglicon que tiene por lo menos un átomo de carbono. El término de " grupo de aglicon que posee al menos un átomo de carbono" se refiere a un grupo-A-Z, en que A representa a un grupo alquileno con 1 a 18 átomos de carbono opcionalmente sustituido con halógeno, tiol, hidroxi, oxígeno, azufre, amino, imino o acoxi; y Z es hidrogeno, -OH, -SH, -NH2, -NHR1, -N(R1)2, -C02H, -CONH2, -CONHR1, -C0N(R1)2, -CONHNH2, o bien -OR1, en que cada R1 es ^m*** ^^.. -^',»*^*** . ... -,^.. . ^—^-^'"pifrnT - —~t«-~ ^^^^^^A^-. independientemente alquilo con 1 a 5 átomos de carbono. Además, R puede ser en que n,m,o es de 1 a 18; (CH2)n-R2 (en que n es de 0 a 18) , en que R2 es un anillo aromático sustituido en varias formas, preferentemente un grupo fenilo, que se encuentra sustituido por uno o varios grupos alcoxi, de preferencia metoxi o bien 0(CH2)mCH3, (en que m es de 0 a 18), o bien una combinación de los mismos. R también puede ser 3- (3,4,5- trimetoxifenil) propilo. La presente invención es igualmente útil para purificar una variedad de compuestos que comprenden porciones de carbohidrato fijadoras de selectina. Estas porciones fijadoras de selectina tiene la fórmula general: R'Galßl , m (Fucal , n) GlcNR6 (R2) en que R° es (alquilo con 1 a 8 átomos de carbono) carbonilo, (alcoxi con 1 a 8 átomos de carbono) carbonilo, o bien (alqueniloxi con 2 a 9 átomos de carbono) carbonilo, R1 es un oligosacárido o bien un grupo que posee la fórmula RJ R-C-O- C02H R3 y R4 pueden ser iguales o diferentes y pueden ser H, alquilo, con 1 a 8 átomos de carbono, hidroxi- (alquilo con 1 a 8 átomos de carbono) , arilo- (alquilo con 1 con a 8 átomos de carbono) , o bien (alcoxi con 1 a 8 átomos de carbono) - (alquilo con 1 a 8 átomos de carbono) , sustituido o insubstituido. R2 puede ser H, alquilo con 1 a 8 átomos de carbono, hidroxi- (alquilo con 1 a 8 átomos de carbono) , arilo- (alquilo con 1 a 8 átomos de carbono) , (alquilo con 1 a 8 átomos de carbono) -arilo, alquiltío, al,2Man, al,6GalNAc, ßl,3Galßl,4Glc, al,2Man-R8, al, 6GalNAc-R8, y ßl,3Gal-R8. R8 puede ser H, alquilo con 1 a 8 átomos de carbono, alcoxi con 1 a 8 átomos de carbono, hidroxi- (alquilo con 1 a 8 átomos de carbono) , aril- (alquilo con 1 a 8 átomos de carbono) , (alquilo con 1 a 8 átomos de carbono) -arilo, o bien alquiltío. En la fórmula, m y n son números enteros y pueden ser 3 ó 4; p puede ser cero o uno. Los grupos substituidos mencionados arriba pueden estar substituidos por hidroxi, hidroxi (alquilo con 1 a 4 '^^^^^^^^^^^^¡^^¡^^^^^^^^^^^^^j^^^^^^g^ggg^^g^^^^^^^^^^^ ^^^^^^^^ átomos de carbono) , polihidroxi (alquilo con 1 a 4 átomos de carbono) , alcanoamido o bien substituyentes de hidrodroxialcanoamido. Los substituyentes preferidos incluyen hidroxi, polihidroxi (alquilo con 3 átomos de carbono), acetamido e hidroxiacetamido. El radical substituido puede tener más de una substitución, la cual puede ser igual o diferente . Para las formas de realización en que R1 es un oligosacárido, éste es de preferencia un trisacárido. Los tpsacáridos preferidos incluyen NeuAca2 , 3Galßl, 4GlcNAcßl, 3 o bien NeuGca2,3Galgl,4GlcNACßl,3. Para las modalidades en que R1 es el grupo que tiene la fórmula RJ R-C-O- C02H R3 y R4 de preferencia forman un solo radical que posee la fórmula -R5- bien -(R6) -0-(R7) - iM¿-S-Í*M-M-i ir r ??rM6Mii-á-Éi-«-ÍM.É-la-É^^ en que R5 es un alquilo divalente con 3 a 7 átomos de carbono, substituido o insubstituido, R6 y R7 son iguales o diferentes y son alquilo divalente con 1 a 6 átomos de carbono, substituido o insubstituido. En la fórmula, q y r son números enteros que pueden ser iguales o diferentes y son cero o uno. La suma de q y r siempre es por lo menos 1. Una estructura más preferida para un sólo radical formado por R3 y R4 es aquella que tiene la fórmula (Rs)-0- en la cual R6 es un alquilo divalente con 3 ó 4 átomos de carbono, substituido o no. Así por ejemplo, R6 puede tener la fórmula -CH2-CH2-CH2-CH2- , preferentemente substituida. El radical puede estar substituido con hidroxi, polihidroxi (alquilo con 3 átomos de carbono) , y grupos alcanoamidos substituidos o insubstituidos, como acetamido o hidroxiacetamido. La estructura substituida formará típicamente un monosacárido, de preferencia un ácido siálico como NeuAc o bien NeuGc vinculado por a2 , 3 al residuo Gal. En la fórmula general anterior, tanto m como n son números enteros y pueden ser 3 ó 4. Así, en un conjunto de estructuras Gal está ligado ßl,4 y Fue está ligado al,3 a «^^^^^g^^^^^^^^^^^^^^MM^^^^^?^ß^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ GlcNAc. Esta fórmula incluye el tetrasacárido Slex. Sle tiene la fórmula NeuAca2,3Galßl,4 (Fucal , 3 ) GlcNAcßl- . Esta estructura es reconocida selectivamente por células portadoras de LECCAM. Los compuestos de Slex que pueden ser purificados con el empleo de los métodos de la invención incluyen NeuAca2, 3Galßl,4 (Fucal , 3) GlcNAcßl-Gal-OEt , NeuAca2,3Galßl,4(Fucal,3)GlcNAcßl,4Galßl-0Et, y otros que están descritos en la solicitud internacional WO 91/19502. Otros compuestos que se pueden purificar con el empleo de los métodos incluyen aquellos descritos en la Patente Norteamericana N° 5,604,207, que poseen la fórmula en que Z es hidrógeno, acilo con 1 a 6 átomos de carbono, o bien Y es seleccionado del grupo compuesto por C(0), SO HNC(O) , OC(O) y SC(O) ; R1 es seleccionado del grupo compuesto por un arilo, un arilo substituido y un grupo de fenilalquileno con 1 a 3 átomos de carbono, que al substituyente arilo seleccionado del 5 grupo compuesto por un halo, trifluorometilo, nitro, alquilo con 1 a 18 átomos de carbono, alcoxi con 1 a 18 átomos de carbono, amino, mono-alquilamino con 1 a 18 átomos de carbono, di-alquilamino con 1 a 18 átomos de carbono, bencilamino, alquilbencilamino con 1 a 18 átomos de carbono, tioalquilo con 10 1 a 18 átomos de carbono y grupos alquil carboxamido con 1 a 18 átomos de carbono, o bien RXY es aliloxicarbonilo o cloroacetilo; R2 es seleccionado del grupo compuesto por monosacárido (incluyendo ßl,3Gal-OR, donde R=H, alquilo, arilo 15 o acilo) , disacárido, hidrógeno, hidrocarbilo de cadena recta, ramificada o de tipo cíclico, con 1 a 18 átomos de carbono, alquilo con 1 a 6 átomos de carbono, 3- (3,4,5- trimetoxifenil) propilo, alquileno con 1 a 5 átomos de carbono- ?-carboxilato, silil-alquileno con 2 a 4 átomos de carbono co- 20 trisubstituido en que el sililo ?-trisubstituido es un grupo sililo que posee tres substituyentes seleccionados independientemente del grupo compuesto por alquilo con 1 a 4 átomos de carbono, o fenilo, o bien OR2 en conjunto forma un carbamanto de hidrocarbilo de cadena recta, ramificada o de tipo cíclico con 1 a 18 átomos de carbono; R3 es hidrógeno o acilo con 1 a 6 átomos de carbono; R4 es hidrógeno, alquilo con 1 a 6 átomos de carbono o bien bencilo; R5 es seleccionado del grupo compuesto por hidrógeno, bencilo, metoxibencilo, dimetoxibencilo y acilo con 1 a 6 átomos de carbono; R7 es metilo o hidroximetilo; y X es seleccionado del grupo compuesto por aciloxi con 1 a 6 átomos de carbono, hidroxilaciloxi con 2 a 6 átomos de carbono, hidroxi, halo y azido. Un conjunto relacionado de estructuras incluidas dentro de la fórmula general son aquellas en que Gal está vinculado por ßl,3 y Fue está ligado por al,4. Por ejemplo, el tetrasacárido, NeuAca2 , 3Galßl, 3 (Fucal, 4) GlcNAcßl- , definido aquí como Sle2, es reconocido por receptores de selectina. Véase, Berg et al., J. Biol. Chem., 266:14869-14872 (1991). En particular Berg et al . , demostraron que las células transformadas con ADNc de selectina-E fijaban selectivamente las neoglicoproteínas que comprendían Slea. Los métodos de la invención son igualmente útiles para purificar los compuestos de oligosacáridos que poseen la fórmula general Galal,3Gal-, incluyendo Galal, 3Galßl, 4Glc (R) ß-0- MAj?ÜSí, - . - .--A** *^ ^ imiíii i lii ' — ^ R1, en que R1 es -(CH2)n-COX, con X=OH, OR2, -NHNH2, R=OH o bien Nac, y R2 es un hidrógeno, un sacárido, un oligosacárido o bien un grupo aglicon que posee por lo menos un átomo de carbono y en que n es un número entero de 2 a 18, más preferentemente de 2 a 10. Por ejemplo, es posible purificar un compuesto que posee la fórmula Galal, 3Galßl, 4GlcNAcß-0- (CH2)5-COOH utilizando procedimientos como aquellos descritos en los ejemplos 7 y 8. Igualmente entre los compuestos que pueden ser purificados de acuerdo con la presente invención se encuentran lacto-N-neotetraosa (LNnT) , GlcNAcßl, 3Galßl, 4Glc (LNT-2) , sialil (a2, 3) -lactosa, y sialil (a2 , 6) -lactosa. En las descripciones presentadas arriba, los términos son utilizados generalmente de acuerdo con sus significados convencionales. El término de " alquilo" como se emplea en este texto significa un radical hidrocarburo de cadena ramificada o no, saturado o no, monovalente o divalente, que posee desde 1 a 20 átomos de carbono, incluyendo los alquilos inferiores con 1 a 8 átomos de carbono, como por ejemplo metilo, etilo, n-propilo, butilo, n-hexilo, y similares, los cicloalquilos (con 3 a 7 átomos de carbono) , los cicloalquilmetilos (con 4 a 8 átomos de carbono), y los arilalquilos . El término de " alcoxi" se refiere a los radicales alquilo unidos al resto de la molécula por un oxígeno, por ejemplo etoxi, metoxi o n-propoxi . El «^s^^aa^-. ^ll uM ¡? lmlgBBi¡a? ¿í m iu t¡*É*má É¡iiéá término de " alquiltío" se refiere a los radicales alquilo unidos al resto de la molécula por un azufre. El término de " acilo" se refiere a un radical derivado de un ácido orgánico mediante el retiro del grupo hidroxilo. Los ejemplos incluyen acetilo, propionilo, oleilo y miristoilo. El término de " arilo" se refiere a un radical derivado de un hidrocarburo aromático mediante el retiro de un solo átomo, por ejemplo fenilo de benceno. El hidrocarburo aromático puede contener más de un solo anillo de carbono insaturado, por ejemplo naftilo. El término de " alcoxi" se refiere a los radicales alquilo unidos al resto de la molécula por un oxígeno, por ejemplo etoxi, metoxi o n-propoxi . El término de " alquiltío" se refiere a los radicales alquilo unidos al resto de la molécula por un azufre . Un radical " alcanoamido" tiene la fórmula general -NH-CO- (alquilo con 1 a 6 átomos de carbono) y puede estar substituido o no. Si está substituido, el substituyente es típicamente hidroxilo. El término incluye específicamente dos estructuras preferidas, acetamido, -NH-CO-CH3, e hidroxiacetamido, -NH-CO-CH2-OH. El término de " compuestos heterocíclicos" se refiere a los compuestos de anillo que poseen tres o más átomos en que por lo menos uno de los átomos es distinto al carbono (por ejemplo, N, 0, S, Se, P, o bien As) . Ejemplos de tales compuestos incluyen los furanos (incluyendo la forma furanosa de pentosas, como fucosa) , los piranos (que incluyen la forma piranosa de las hexosas, como glucosa y galactosa) pirimidinas, purinas, pirazinas y similares. Lo métodos de la invención son útiles no únicamente para purificar los carbohidratos que se encuentran recién sintetizados, sino también aquellos que son los productos de degradación, por ejemplo de una degradación enzimática. Véase por ejemplo, Sinnott, M.L., Chem. Rev. 90: 1171-1202 (1990) para tener ejemplos de enzimas que catalizan la degradación de los oligosacáridos. La invención proporciona igualmente métodos para purificar nucleótidos, azúcares de nucleótidos y compuestos relacionados. Por ejemplo, puede purificarse por los métodos aquí descritos un azúcar de nucleótido como por ejemplo GDP- fucosa, GDP-manosa, CMP-NeaAc, UDP-glucosa, UDP-galactosa, UDP-N-acetilgalactosamina, y similares. Los métodos son igualmente útiles para purificar los nucleótidos y los nucleótidos en distintos estados de fosforilación (por ejemplo, CMP, CDP, CTP, GMP, GDP, GTP, TMP, TDP, TTP, AMP, ADP, ATP, UMP, UDP, UTP) , al igual que las formas desoxi de estos y otros nucleótidos.

Se ofrecen los siguientes ejemplos únicamente para fines de ilustración y no llevan la intención ni de limitar ni de definir la invención. EJEMPLOS Los ejemplos 1 a 5 demuestran la síntesis de sialil-lactosa y su purificación con el empleo de nanofiltración e intercambio de iones. En resumen se generó la N-acetil-D-manosamina (ManNAc) a partir de N-acetil-D-glucosamina (GluNAc) bajo condiciones básicas. La ManNAc fue condensada con piruvato de sodio para producir ácido siálico enzimáticamente. Se utilizó el ciclo de la sialiltransferasa para convertir el ácido siálico en sialil-lactosa, la cual luego fue purificada por nanofiltración e intercambio de iones. El ejemplo 6 demuestra la separación de sales orgánicas e inorgánicas mediante nanofiltración. El ejemplo 7 demuestra las características de separación de las membranas de nanofiltración de polibenzamida. El ejemplo 8 demuestra las características de separación de las membranas para nanofiltración de poliamida. EJEMPLO 1 Síntesis y Purificación de Ácido Siálico Este ejemplo demuestra el método para sintetizar ácido siálico con empleo de un substrato relativamente poco costoso, GlcNAc, en vez de la ManNAc más costosa o el ácido siálico. Procedimiento similar a aquel descrito en Simón et al . , J. Am. Chem. Soc. 110:7159 (1998), fue utilizado para convertir la GlcNAc a ManNAc. En términos breves, se disolvió el GlcNAc (1000 g, 4.52 mole) en agua (500 ml) . Se ajustó el pH a 12.0 con NaOH al 50% (-115 ml) . Se agitó la solución bajo argón durante 7.5 horas y luego se enfrió en un baño de hielo y se ajustó el pH a 7.7 con HCl concentrado (-200 ml) . Luego se produjo el ácido siálico mediante una condensación por aldol de ManNAc . Para obtener el ácido siálico, se sometió la ManNAc producida en el paso anterior a una condensación por aldol mediada por una aldolasa de ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac) y ácido pirúvico. A una solución acuosa de 1.5 litros que contenía alrededor de 57 g (0.258 moles) de ManNAc y 193 g de GlcNAc a partir de una epimerización catalizada con una base, se agregaron 123.8 g de piruvato de sodio (1.125 moles), 1.5 g de albúmina de suero bovino, y 0.75 g de azida sódica. Se ajustó el pH en 7.5 y se agregaron 11,930 U de aldolasa de ácido siálico. Se incubó la solución a 37°C durante 7 días. El análisis HPLC (cromatografía en capa de alta presión) en una columna de Aminex HPX87H (BioRad) (H2S04 0.004 M, 0.8 ml/min, monitor A220) reveló que la solución contenía ácido siálico 0.157 M (conversión al 91% de ManNAc, 0.235 moles). EJEMPLO 2 i iit irZXitiiir , ,) n^r<HM,lli¡gl¡a¡ fc1,, |J Síntesis de Sialil-Lactosa utilizando el Ciclo de Sialiltransferasa Al ácido siálico producido en el ejemplo 1 se agregó monohidrato de lactosa (79.2 g, 0.22 moles), 0.7 g de albúmina 5 de suero bovino, sal monopotásica de fosfoenolpiruvato (37 g, 0.22 moles) y se ajusta el pH a 7.5. Se agregaron CMP (2.84 g, 0.0088 moles), ATP (0.54 g, 0.0009 moles) y se reajustó el pH a 7.5. Se agregó azida sódica (0.35 g) al igual que las siguientes enzimas: quinasa de piruvato (19,800 U) , mioquinasa (13,200 U) , sintetasa de ácido siálico CMP (440 U) y sialiltransferasa (165 U) . Se agregaron 66 ml de MnCl2 1M y se ajustó el volumen final a 2.2 litros con agua. La reacción fue llevada a cabo a temperatura ambiente. La reacción era monitoreada diariamente mediante cromatografía en capa delgada (CCD -abreviatura en inglés de TLC-) y se determinó [Mn2+] a través de una cromatografía iónica. Se llevaron a cabo adiciones y ajustes tal y como se muestra en la Tabla 1 : Tabla 1 Día 2 Se agregaron 44 ml de MnCl2 1M Día 4 Se agregaron 43 ml de MnCl2 1M Día 6 Se agregaron 34.3 ml de MnCl2 1M, 37 g de PEP; se reajustó el pH a 7.5; kinasa de piruvato (19,800 U) , mioquinasa (13,200 U) , sintetasa de ácido siálico CMP (440 U) , y sialiltransferasa (165 U) Día 7 31.7 ml de MnCl2 1M Día 8 24.6 ml de MnCl2 1M Día 9 44 ml de MnCl2 1M Día 10 30.8 ml de MnCl2 1M Día 11 31.7 ml de MnCl2 1M Día 12 24.6 ml de MnCl2 1M, se reajustó el pH a 7.5 Día 13 440 U de sintetasa de ácido siálico CMP, 82.5 U de sialiltransferasa Día 14 Se reajustó el pH a 7.5 Día 16 37.7 ml de MnCl2 1M, 19,800 U de quinasa de piruvato, 13,200 U de mioquinasa Día 17 26 g de fosfenilpiruvato, sal trisódica El rendimiento en lactosa sialílico fue de aproximadamente 70 a 80% según se determinó por la cromatografía en capa delgada CCD. EJEMPLO 3 Síntesis de Sialil-Lactosa utilizando el Ciclo de Sialiltransferasa Este ejemplo ilustra la producción de (2,3)ß-galactosil (1, 4) glucosa de ácido a-N-acetilneuramínico con el -*¿~«~~—~ - " —m—*^- ._ . ^^ - —~^*-^—Í- empleo del ciclo de sialiltransferasa con control de la concentración del ion manganeso. En un recipiente de polipropileno se disolvieron sal tpsódica de fosfoenolpiruvato (285.4 g, 1.22 moles) y ácido siálico (197 g, 0.637 moles) en 5 litros de agua y se ajustó el pH a 7.1 con NaOH con 6 M. Se agregaron 5' -monofosfato de citidina (5.14 g, 15.9 milimoles) y cloruro de potasio (7.9 g, 0.106 moles) y se reajustó el pH a 7.45 con NaOH 6 M. Se agregaron quinasa de piruvato (28,000 unidades), mioquinasa (17,000 unidades), trifosfato de adenosina (0.98 g, 1.6 milimoles), sintetasa de CMP-NeuAc (1,325 unidades), a2, 3sialiltransferasa (663 unidades) y MnCl2»4H20 (52.4 g, 0.265 moles) y se mezcló. A una porción de 3.7 litros de la mezcla resultante se agregaron lactosa (119 g, 0.348 moles) y azida de sodio (1.75 g) . La mezcla de reacción se mantuvo a temperatura ambiente y se monitoreó diariamente mediante cromatografía en capa delagada (CCD) y cromatografía iónica. Al cabo de dos días se agregaron las enzimas adicionales de la siguiente manera: quinasa de piruvato (38,100 unidades), mioquinasa (23,700 unidades), sintetasa de CMP NeuAc (935 unidades) y a2 , 3 -sialiltransferasa (463 unidades). El pH se ajustó periódicamente a 7.5 con NaOH 6 M. Adicionalmente se midió la concentración de ion manganeso se suplemento de la manera mostrada en la siguiente Tabla 2 : ^^^^^^^^¡^^^¿^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ j ^KS^?i^^^^^^^^^^^^ ^^^^^^^^ Tabla 2 )ía [Mn++] Pérdida de Mn++ Cantidad de Suplemento (medido, mM) (del día (mL de 1 M, concentración anterior) de adición final) 1 28 22.0 Ninguno 2 23.9 4.1 Ninguno 3 10.7 13.2 111 mL, +30mM 4 1.4 39.3 111 mL, +30mM 5 3.0 28.4 148 mL, +40mM 6 12.9 30.1 74 mL, +20mM 7 10.0 22.9 80 mL, +20mM 8 12.0 18.0 80 mL, +20mM 9 24.3 7.7 Ninguna Al día 9 quedó esencialmente completada la reacción según la cromatografía en capa delgada. Como indican los resultados en la tabla, el agotamiento de Mn++ resultó en cantidades adicionales de MnCl2«4H20 que fueron agregadas casi diariamente para mantener la concentración en los iones metálicos. El ion manganeso es un factor secundario requerido para al menos una enzima en el ciclo de la sialiltransferasa. Sin embargo el ion manganeso y el fosfato inorgánico producidos forman un complejo de una solubilidad muy baja. A raíz de esa solubilidad limitada puede seguir el ciclo de transferasa pero a velocidades menores de reacción. Mediante la adición de iones manganeso que se pierden por precipitación con el pirofosfato se puede mantener la tasa de velocidad de la reacción. Así cuando se mantiene la concentración del ion 5 manganeso en un rango óptimo, se puede impulsar el ciclo de la reacción de sialiltransferasa hacia su terminación completa. EJEMPLO 4 Purificación de Sialil-Lactosa Utilizando Intercambio Iónico y Osmosis Inversa 10 Este ejemplo ilustra la preparación y la purificación del trisacárido producido en el Ejemplo 2, seguida por peracetilación y esterificación. Una solución (2 litros) de 5-acetamido-3 , 5-didesoxi-a-glicero-D-galacto- nonulopiranosilonato- (2-3) -0-ß-D-galactopiranosil- (1-4) -0-ß-D- 15 glucopiranosa de sodio producida a partir de la acción de una sialiltransferasa en la presencia de co-factores adecuados sobre lactosa (55g) se filtró a través de papel. El material filtrado se dejó pasar a través de una membrana con un peso molecular de 3,000 a 10,000, recortada para retirar la proteína del producto deseado. El eluato fue concentrado y desalado dejándolo correr en contra de una membrana de osmosis inversa de poliamida en un aparato adecuado (Cat. N° CDRN500 60, Millipore, Bedford, MA) . El material retenido que contenía el producto fue evaporado para formar un jarabe espeso.

^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^? ^^Ss^^ ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^¿^^^^^ Opcionalmente es posible tratar al material retenido con una resina quelante para retirar los cationes divalentes. Después de filtrar, el material filtrado contenía el producto deseado virtualmente libre de sales y en un elevado estado de pureza, 5 según se muestra mediante la espectroscopia ^mr. Por lo demás se evaporó el jarabe dos veces en esta forma, aplicando piridina (2 x 200 mL) . El frasco de evaporación se cargó con una solución de N,N-dimetilaminopiridina (2.2g) en piridina (1.2 litros). Se agregó anhídrido acético (0.83 litros) durando un periodo de una hora. Se dejó reposar la mezcla resultante por un lapso de 24 a 48 horas bajo rotación lenta a temperatura ambiente. Se verificó la reacción mediante cromatografía en capa delgada (metano: diclorometano 1:9). Una vez completada la reacción se aplicó un vacío y luego se evaporó la solución para producir un residuo. El residuo se disolvió en acetato de etilo (1.5 litros) . Esta solución se lavó con ácido clorhídrico acuoso al 5% (1.5 litros), seguido por bicarbonato de sodio acuoso saturado (1.5 litros) y finalmente agua (1.5 litros). La capa orgánica se secó por encima de sulfato de sodio anhidro y se filtró. El material filtrado se concentró para formar un residuo semisólido. El trisacárido de lactona per-O-acetilado (69 g) fue disuelto en metanol (350 mL) y se agregó una solución de metóxido de sodio (17.5 mL, solución al 25% en ^stí—^^ i^ítíi?i^^^^ É ^m metanol) , después de lo cual se agregó agua (3.5 mL) . Durante la cromatografía en capa delgada que se desarrolló con isopropanol : hidróxido de amonio: agua en una proporción de 7:1:2 se pudo demostrar que ya estaba completada la reacción y después se agregó a la solución ácido acético (2 mL) . Se agregó éter etílico (180 mL) a la solución para precipitar el producto. Este sólido fue filtrado y disuelto en agua (350 mL) . Se agregó carbón vegetal (24 g) a esta solución y se calentó el material a 60°C durante una hora. Se dejó enfriar esta solución a temperatura ambiente y se filtró. La evaporación del material filtrado rindió el producto sólido (34 g) . La espectroscopia con resonancia magnética nuclear 1H demostró que ese sólido era sialil-lactosa pura que contenía 11% de acetato de sodio, peso/peso. EJEMPLO 5 Purificación de Sialil-Lactosa con el Empleo de una Nanofiltración Se sometió una mezcla de reacción similar a aquella descrita en el Ejemplo 2 a filtración, utilizando una membrana de ultrafiltración que tenía un recorte de peso molecular de kDa para retirar las proteínas. La concentración de fosfato [P043 ] , como se determinó por el procedimiento convencional del ensaye de fósforo según se describe abajo, fue mayor de 2.8 mM. ^^^^^|^^^^^^^^g^^^^^g|^^^^^MH^^^Mß^^^^^^^^^^^¿^^^^^^^^^^^^^^^fc Se ajustó la solución con HCl concentrado (-500 ml) hasta llegar a un pH de 3.0. Luego se purificó en una máquina purificadora con membrana de Osmonics 213T (tipo de membrana MX07) con un pH de 3 durante 5 horas hasta que quedó inalterable la conductividad de la solución del permeato. Luego se enjuagó la solución de la máquina y la solución enjuagada y alimentada, en forma combinada, se trató con NaOH hasta un pH de 7.4. Se midió la concentración de Mn2+ mediante cromatografía en capa de alta presión como se describe abajo. Los parámetros de la nanofiltración fueron los siguientes: Presión de operación: Pf= 7 kgs/cm2 Tasa de Flujo de la Qc= 5 galones/minuto, o Concentración: sea 19 litros/minuto Tasa de Flujo del Qf= 7 galones/hora, que Permeato: equivale a 26.6 litros/hora Rango de Temperatura: 20-40°C Volumen: 5 galones, o sea 19 litros . La conductividad del permeato inicial fue 28.1 mS; al cabo de 5 horas de recircular, la conductividad había bajado a 115 µS; en tanto que la concentración del fosfato [P043~] había disminuido a 770 mieras, en tanto que la concentración del manganeso está al [Mn2+] estaba en 3.4 mM.

H |gg j^^ g K^ Luego fue ajustada la solución a un pH de 7.4 y se siguió purificando en la máquina de purificación por membrana (Osmonics, tipo de membrana MX07) durante una hora aproximadamente hasta que ya no se alteraba la conductividad de la solución del permeato. Luego se enjuagó la solución, sacándola de la máquina de membrana. Los parámetros de nanofiltración fueron: Presión de operación: Pf= 7 kgs/cm2 Tasa de Flujo de la Qc= 5 galones/minuto, o sea 19 Concentración : litros/minuto Tasa de Flujo del Qf= 7 galones/minuto, que Permeato : equivale a 1.14 litros/minuto Rango de Temperatura: 20-40°C Volumen : 5 galones, o sea 19 litros.

Los resultados de la filtración fueron los siguientes : Conductividad: Conductividad de permeato inicial: 2.01 mS Al cabo de recircular por 5 horas: 93.7 µS Concentración [P043~] = 410 µM del fosfato: Concentración [P043~] = 410 µM del manganeso: .¿sfe- >&*&-&&:- &* ,"a&«a La solución anterior (6 galones, o sea 22.8 litros) fue tratada después con la resina AG50WX8 (H+) (BioRad, 1.18 Kg) y se agitó durante dos horas hasta que el pH estaba en 2.0. Luego se filtró la resina para proporcionar una solución de color amarillo muy claro. Solamente se detectó una cantidad mínima de [Mn2+] mediante la cromatografía en capa bajo alta presión. Luego se neutralizó la solución con NaOH (50% peso/peso) hasta un pH de 7.4. Antes del tratamiento con resina: [Mn2+] = 3 mM; [P043~] = 410 µM Después del tratamiento con resina: pH= 3, [Mn2+] = [P043"] = 190 µM 1.23 mM; pH= 2, [Mn2+]= 6.8 µM; Se trataron algunas pequeñas porciones de la solución anterior con la resina AG1X8 (en su forma de acetato) para retirar más el fosfato. Los resultados se muestran en la siguiente Tabla 3 : ?tm¿¡^ lá¡íma ¿¡^? Tabla 3 Volumen de la Peso de la Tiempo de [P043~] µM stra (ml) resina (g) Agitación (en horas) 50 ml 0.25 g 1 86 50 ml 0.5 g 1 41 50 ml 1.0 g 1 30 50 ml 2.0 g 1 8 Se purificó la solución en mayor grado recirculando la solución utilizando una máquina de purificación con membrana Osmonic (Osmonic MX07) durante 5 horas bajo las siguientes condiciones: Presión de Operación: Pf= 7 kgs Tasa de Flujo de la Qc,= 19 LPM Concentración: Tasa de Flujo del Qf= 0.76 LPM Permeato Rango de Temperatura: 20 a 40°C Volumen: 19 litros Los resultados fueron los siguientes: Conductividad del Conductividad de permeato inicial: Permeato: 0.136 mS Después de una separación de 5 ^**yy. . „ -- -^^-.^S ^?^. horas: 45 µS Luego se concentró la solución a 3-4 litros, después de lo cual se agregó carbón vegetal activado (J. T. Baker, 180 g) . Se calentó la suspensión a 55°C durante 2 horas. Luego se retiró el carbón mediante filtración para producir una solución de color amarillo muy claro, la cual fue liofilizado para formar un sólido blanco. Los datos de análisis para la solución de sialil- lactosa purificada como se describe arriba, se muestran en la Tabla 4. Tabla 4 Ensayo Resultado Método Contenido en P043~ 330 ppm (en peso) Ensayo de fosfato1 Contenido en No detectado (ABS280= UV (0.1 mM, nucleótido/nucleósido 0.0) sialilactosa) RMN-1!. b) No detectado Contenido en Mn2+ 80 ppm (en peso) Determinado por CCAP2 (cromatografía en capa bajo alta presión) Contenido en sialil- 71% RMN-H1 (se utilizó la lactosa furanosa de D-glucosa de 1, 2-osopropilideno como control Contenido en ácido -2% NMR-1!! sialílico Contenido en lactosa No detectable NMR- Contenido de acetato No detectable NMR-1H Contenido de N-acetil- No detectable NMR-1!! glucosamina Contenido de piruvato No detectable NMR-1!! Método de Ensayo de Fosfato1 La muestra desconocida (100 µl) fue diluida con agua D.l. (775 µl) . Luego se trató la solución con 100 µl de molibdato ácido (preparado disolviendo 1.25 de molibdato de amonio en 100 µl de 2.5N de H2S04) , 25 µl de una Solución llamada Fiska Subha Row (adquirida de Sigma como un polvo, y preparada de acuerdo con las instrucciones del fabricante) . Se calentó la mezcla a 100°C durante 7 minutos, y luego se registró la absorción a 810 nm. Se determinó la concentración comparando la absorción con una curva convencional de fosfato. Ensayo de CCAP2 para la determinación de la concentración de Mn+: Columna: columna de Catión Universal de Alltech, 0.46 x 10 cm Detector: detector de conductividad modelo 320 de Alltech Fase Móvil: 3mM de ácido ftálico, 0.5 mM de ácido dipicolínico Tasa de flujo: 1.5 ml/min Temperatura en el horno de columna: 35°C ^j^ EJEMPLO 6 Separación de Compuestos Inorgánicos y Sales Inorgánicas por Nanofiltración Se probaron varias membranas de nanofiltración para establecer su capacidad de separar diferentes compuestos orgánicos y sales inorgánicas de una solución acuosa. Se probaron las membranas a dos diferentes niveles de pH para demostrar que mediante el ajuste de la carga iónica, ciertos compuestos es posible modular el perfil de la separación. Los resultados se muestran en la Tabla 5. Las membranas de nanofiltración probadas fueron los modelos MX07, SX12 y B006 producidos por Osmonics, Inc.

(Minnetonka MN) y el modelo DL2540 producido por Osmonics, DeSalination Systems. Se utilizó la membrana MN07 tal y como se describe en el ejemplo anterior 5. Los parámetros para las demás membranas fueron como se muestra en la Tabla 6.

Tabla 5 : Porcentaje de Compuestos que pasa a través de la Membrana en 30 Minutos Notas Porcentaje que pasa, basado en un tiempo de separación de 30 minutos. Temperatura de prueba de 20°C y 40°C GluNac : N-acetil-D-Glucosamina PEP: es sal trisódica de 2-fosfoenolpiruvato CMP: 5 ' -monofosfato de citidina Membranas MX07, SX12, B006 de Osmonics, Inc., DL2540 de Osmonics, Desalination Systems ^g (Escondido, CA) . Tabla 6 Ejemplo 7 Características de Separación de Membranas de Nanofiltración de Polibenzamida Este ejemplo describe experimentos que demuestran que una membrana de polibenzamida (YK, Osmonics) es efectiva para la purificación de azúcares tanto en forma de hoja plana como de espiral. Se prueba la membrana a diferentes niveles del pH para el paso o bien la retención de azúcares y sales. Materiales y Métodos A. Operaciones en máquina en hoja plana y en espiral y preparación de membrana Una máquina de membrana de sal (Osmonics, Desalination Systems, Escondido, CA) con la membrana YK se lavó en forma completa enjuagando primero la máquina 4 a 5 veces cada cual con aproximadamente un litro de agua destilada. Se vació el agua en el tanque de alimentación y se circuló por aproximadamente 1 minuto (-7 kgs x cm2) y se vació utilizando la válvula de drenaje, torciéndola en sentido 5 antihorario a una posición abierta. Después del vaciado se cerró la válvula y se repitió el proceso de 4 a 5 veces. Después de enjuagar se agregó aproximadamente 1 litro más de agua. Se recirculó el sistema a una presión de 10.5 kgs x cm2 durante 30 minutos y luego se vació. El sistema con inclusión de la membrana, luego fue utilizado en los siguientes experimentos . Una vez concluido cada experimento se lavó la máquina con agua, 3 a 4 veces, según se ha descrito arriba. Luego se recirculó alrededor de 1 litro de agua por un tiempo de 15 a 20 minutos a una presión de 7 a 10.50 kgs x cm2 y se vació desde la máquina. Ello fue seguido ocasionalmente por un breve lavado adicional, en caso de que si se sospechaba que alguna parte del compuesto de la prueba todavía permaneciera en el aparato. Siempre se verificaba la conductibilidad para asegurar que se había retirado la totalidad de la muestra. Si la conductividad permaneciera en nivel alto, se lavó la máquina hasta que los contaminantes fueran virtualmente indetectables . La mayor parte de los compuestos iónicos se retiraron con facilidad, con la excepción de MNCL2 que ^^¿¿^^^^^^^^^^^^^^^¿¿^^^^^^^^^^^T^j^^^^^^^jggft^^^^^^ solamente requirió un lavado breve adicional o en algunos casos 2 lavados . B. Pruebas de Sales Para determinar las características de retención de diferentes sales, se probaron soluciones de 10 mM de las siguientes sales con las membranas de hoja plana: MnCl2, NaH2P04, NaC3H303, NaOAc, Na4P207, benzoato de sodio, MgS04, NaN3 y NaCl. Una solución de un litro de una de las sales se vació en el tanque de alimentación y se recirculó a 7 kgs x cm2 durante aproximadamente 15 minutos. En este momento se recogieron las muestras tanto del permeato como de la concentración y se midió el material utilizando un medidor de conductividad. Se recogieron las muestras cada 5 minutos después, con un total de por lo menos 3 recolecciones para cada pasada de muestra. El porcentaje de sal que pasó a través de la membrana (el porcentaje de material que "pasó") se calculó dividiendo la conductividad del permeato entre la conductividad de la concentración. Una vez completada la primera pasada, se bajo el pH de la solución a un nivel de 3.0, y en caso de ser posible con el empleo de un ácido conjugado de la sal bajo prueba. Se recirculó la solución en tanto que se ajusto el pH para asegurar que se mezclara igualmente la solución dentro del máquina. Se repitió el proceso de prueba, determinándose la conductividad tanto del permeato como de la concentración. Luego se llevo el pH de la solución a 7.0 aproximadamente con una base conjugada, y una vez más se repitió la pasada con el nuevo nivel del pH. De nueva cuenta se determinó la conductividad tanto del permeato como de la concentración. C. Prueba de Azúcares Los azúcares que fueron probados incluyeron la lactosa de sialilo, lactosa, N-acetil-glucosamina, NeuAca2,3Galßl,4 (Fucal, 3) GlcNacßl, 4Galßl-OEt (Compuesto I) , Galal,3Galßl,4GlcNAcß-0- (CH2)5-COOH (Compuesto II), LNT-2,LNnT, CMP, citidina y ácido siálico. Se vació una solución de azúcar (1 litro) en el contenedor de alimentación y se recirculó a 7 kgs por cm2 durante al menos 10 minutos. Se tomaron muestras del permeato y de la concentración al cabo de 10 minutos y se tomó otra muestra del permeato después de 15 minutos. Se compararon las muestras visualmente mediante una Cromatografía en Capa Delgada. Cualquier ajuste en el pH que se llevo a cabo, se realizó con el uso de HCl y/o NaOH. RESULTADO; A. Membrana de hoja plana Las características de retención para diferentes sales y azúcares de una membrana para nanofiltración de polibenzamida en forma de hoja plana (YK 002 sobre un respaldo de papel de YV+ (Osmonics)) se muestran en la Tabla 7. Los experimentos fueron realizados a una temperatura de 25°C a 35°C y con una tasa de flujo del permeato de 2 a 8 mL por minuto. Tabla 7 * % el porcentaje que pasa es la proporción en porciento de la cantidad de material dentro del permeato respecto a la cantidad de material dentro de la concentración. ** "pH 5" varia de 4.8 a 5.6 "pH 7" varia de 7.1 a 7.4 *** Determinado visualmente por Cromatografía en Capa Delgada B. Membrana en espiral Las características de retención para diferentes sales y azúcares de una membrana de nanofiltración de polibenzamida en espiral (YK 1812CZA; Osmonics) se muestran en la Tabla 8. Los experimentos se realizaron a una temperatura de 25 a 35°C y con una tasa de flujo de permeato de 3 mL/segundo. ^. ÉJggJ? s ^.^Y^^ S ^M^^^Ém^M^^ Tabla 8 ¡ * : * porcentaje que pasa la tasa en porciento, la cantidad de material en el permeato respecto a la cantidad de material en la concentración. ** "pH 5" variaba de 4.5 a 5.2 "pH 7" variaba de 6.6 a 7.0 "pH 3" variaba de 2.8 a 3.4 *** Determinado visualmente con Cromatografía en Capa Delgada (# "traza" se define como material apenas detectable con cromatografía TL, según se observa a simple vista) . Estos resultados indican que la membrana en hoja plana YK 002 y la membrana en espiral YK1812CZA retenían la lactosa de sialilo al igual que los compuestos I y II LNT-2 y LNnT, en tanto que permitían que pasaran los compuestos iónicos, haciendo así este tipo de membrana como un buen material de elección para la purificación de tales sacáridos. Ejemplp 8 Características de separación de las membranas de nanofiltración. de polvamida Este ejemplo describe la evaluación de varias membranas de poliamida para utilizarse en la purificación de azúcares, tanto en la forma de hoja plana como de espiral. Las membranas fueron probadas a diferentes niveles del pH para el paso o la retención de azúcares y sales. MATERIALES Y MÉTODOS **&fc¿&?Íto# mfi~- A. Operaciones en la Máquina, del tipo de Hoja Plana y de Espiral y la Preparación de las Membranas Una máquina Desal (Osminics, Desalination Systems) con una membrana de poliamida G-5 (GE; Osmonics) se lavó en forma completa enjuagando primeramente la máquina 4 a 5 veces, cada vez, aproximadamente un litro de agua destilada. El agua se vació al interior del tanque de alimentación, se dejo circular por un minuto aproximadamente (-7 kgs por cm2) y se vació con el empleo de la válvula de drenaje. Se cerró la válvula después de vaciar y se repitió el procedimiento de 4 a 5 veces. Después de enjuagarse se agregó aproximadamente un litro más de agua. Se recirculó el sistema bajo una presión de 10.50 kgs x cm2 durante 30 minutos y luego se vació. El sistema con inclusión de la membrana, luego quedo listo para probar su aplicación. Después de cada experimento se lavo la máquina con agua, 3 a 4 veces, según se describe arriba. Luego se recirculó alrededor de un litro de agua por un lapso de unos 15 a 20 minutos bajo una presión de 7 a 10.50 kgs x cm2 y se vació la máquina. En ocasiones este procedimiento era seguido por un lavado breve adicional , cuando se sospechaba que todavía quedaba un poco de compuesto en el aparato. Siempre se verificaba la conductividad para asegurarse de que se había retirado toda la muestra. Si permaneciera alta la conductividad, se lavaba la máquina hasta que fueran virtualmente indetectables los contaminantes. La mayor parte de los compuestos iónicos eran retirados con facilidad, con la excepción de MnCl2 y solamente requería de 1 ó 2 lavados breves, adicionales. B. La Prueba de las Sales Una cantidad de 10 mM de solución de las siguientes sales se probó con las membranas en forma de hoja plana: MnCl2, NaH2P04, NaC3H303 y NaCl. Una solución de un litro de una de las sales se vació en el tanque de alimentación y se recirculó el material a 7 kgs x cm2 durante unos 15 minutos. En este momento se recolectaron las muestras del permeato y de la concentración y se llevo a cabo la medición utilizando un medidor de conductividad. Se recogieron las muestras cada 5 minutos después, con un total de por lo menos colecciones para cada pasada de muestra. El porcentaje de paso se calculó dividiendo la conductividad de permeato entre la conductividad de la concentración. Completada la pasada, se bajo el pH de la solución a 3.0, dentro de lo posible con el empleo de un ácido conjugado de la sal bajo prueba. La solución fue recirculada mientras que se ajustaba el pH para asegurar que también se hubiera mezclado la solución colocada dentro de la máquina. Se repitió el procedimiento de prueba, con los datos de recolección como se indican anteriormente. Luego se llevo la solución a un pH de 7.0 con una base conjugada y una vez más se repitió la pasada con el nuevo nivel del pH. Después se vació la máquina y se enjuagó de la manera descrita arriba. C. Pruebas de Azúcares Los azúcares que se probaron incluyeron la lactosa de sialilo, lactosa, NeuAca2 , 3Galßl, 4 (Fucal, 3) GlcNAcßl, 4Galßl- OEt (Compuesto I), Galal, 3Galßl, 4GlcNAcß-0- (CH2) 5-COOH (Compuesto II), LNT-2, y LNnT. Una solución de azúcar (de un litro) se vació en el contenedor de alimentación y se recirculó a 7 kgs x cm2 durante por 10 minutos. Se tomaron muestras del permeato y de la concentración al cabo de 10 minutos y otra muestra del permeato después de 15 minutos. Las muestras fueron comparadas visualmente por la Cromatografía en Capa Delgada. Cualquier ajuste a pH que se llevaba a cabo, se realizó mediante el uso de HCl y/o NaOH. Una vez que se había probado el azúcar, se transfirió el material a un frasco de Pyrex para ser reutilizado para otras membranas. RESULTADOS A. Membrana en forma de Hoja Plana Las características de retención para diferentes sales y azúcares de una membrana de nanofiltración de poliamida en forma de hoja plan (G-10 (GH; Osmonics) se muestran en la Tabla 9. El valor A del miembro era de 10.0 y la transmisión en porciento del agua de la llave era de 62.8 (se probó con el uso de 2000 ppm de MgS04 a temperatura ambiente) . Los experimentos fueron realizados a una temperatura de 25 a 35°C y con una tasa de flujo del permeato de 5 a 8 mL por minuto. Tabla 9 * % porcentaje de material que pasó es la proporción en porciento de la cantidad de material en el permeato respecto a la cantidad de material presente en la ^¡g| concentración . ** "pH 5" variaba de 4.8 a 5.6 *** Determinado visualmente a partir de una Cromatografía en Capa Delgada. # "Traza" se define como apenas visible con el sistema Cromatografía en Capa Delgada. En otro experimento se probó una membrana de poliamida G-10 (GH) con un valor A de 8.0 y una transmisión en porciento del agua de la llave de 38.9. El experimento era realizado a 25 a 35°C y la tasa de flujo del permeato fue de 6 a 8 mL por minuto. Los resultados se muestran en la Tabla 10.

Tabla 10 * % de material que pasa en la proporción en porciento de la cantidad de material en el permeato a la cantidad de material presente en la concentración. ** "pH 5" fluctuaba de 4.8 a 5.6 *** Se determinó visualmente mediante una Cromatografía en capa delgada .

Una membrana de poliamida G-5 (GE) (valor A:3.9, porcentaje de transmisión del agua de la llave: 33.9) también fue sometida a prueba. El experimento era realizado a 25 a °C y bajo una tasa de flujo de permeato de 3 a 5 mL/minuto. Los resultados se muestran en la Tabla 11. Tabla 11 * % de material que pasa en la proporción en porciento de la cantidad de material en el permeato a la cantidad de material presente en la concentración. ** "pH 5" fluctuaba de 4.8 a 5.6 *** Se determinó visualmente mediante una Cromatografía en capa delgada. Las características de retención de azúcar y sal de una membrana de poliamida de HL (Osmonics) se muestran en la Tabla 12. Los experimentos fueron realizados a 25 a 35°C con una tasa de flujo de permeato de 8 a 13 mL/minuto. Tabla 12 * % de material que pasa en la proporción en porciento de la cantidad de material en el permeato a la cantidad de material presente en la concentración. ^£í^ifa¡^*Stog?»siiitój?«||B^^^ .amiaifcg?¿afc>~-~r ÜÉ ** "pH 5" fluctuaba de 4.5 a 5.8 *** Se determinó visualmente mediante una Cromatografía en capa delgada. B. Membrana enrollada en espiral También se determinaron las características de la retención de azúcar y de sal en diversas membranas de poliamida enrolladas en espiral. Se probó una membrana GH1812CZA (Osmonics) a una temperatura de 25 a 35°C con una tasa de flujo de permeato de 1.5 a 2 mL/segundo. Los resultados se muestran en la Tabla 13.

Tabla 13 % de material que pasa en la proporción en porciento de la cantidad de material en el permeato a la cantidad de ^^^s¡& *&&^ material presente en la concentración. ** "pH 5" fluctuaba de 4.5 a 5.6 "pH 7" fluctuaba de 6.1 a 7.4 *** Se determinó visualmente mediante una Cromatografía en capa delgada. # "Traza" se define como una cantidad apenas detectable en la cromatografía en capa delgada a simple vista. Los resultados obtenidos para una membrana de poliamida enrollada en espiral GE1812CZA (Osmonics) probada a 25 a 35°C y con una tasa de flujo disminuida de permeato de 0.9 mL/segundo, se muestran en la Tabla 14.

Tabla 14 porcentaje que pasa la tasa en porciento, la cantidad de material en el permeato respecto a la cantidad de material en la concentración. ** "pH 5" variaba de 4.8 a 5.6 *** Determinado visualmente con Cromatografía en Capa Delgada # "traza" se define como material apenas detectable con cromatografía TL, según se observa a simple vista. Estos resultados demuestran que las membranas en forma de hoja plana G-10 (GH) (valor A=10) y G-10 (GH) (valor A=8) así como la membrana enrollada en espiral GH1812CZA permitían que pasaran los iones pero que no se retenían eficientemente la lactosa de sialilo o los trisacáridos similares. La membrana en forma de hoja plana G-5 (GE) (valor A=3.9) y la membrana enrollada en espiral GE1812CZA retenían la lactosa de sialilo al igual que los compuestos I y II, LNT-2 y LNnT, en tanto que permitían que pasaran los compuestos iónicos . Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes mencionadas en este texto se incorporan aquí como material de referencia en la misma medida como si cada publicación, patente o solicitud de patente individual se hubiera indicado específica e individualmente en este texto como material de referencia. La descripción anterior es ilustrativa y no tiene un carácter restrictivo. Muchas variaciones en la invención se sugerirán a los expertos en la materia al revisar este texto. Simplemente a título de ejemplo señalamos que puede reemplazarse un número de substractos, enzimas y condiciones de reacción en ciclos de transferasa de glicosilo como parte de la presente invención sin extralimitarse del alcance de la misma. Por lo tanto debe determinarse del evento no con referencia a la descripción anterior sino más bien con referencia a las reivindicaciones adjuntas en combinación con el alcance completo de sus equivalencias .

Claims (18)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para purificar un compuesto de carbohidrato a partir de una solución alimentadora que contiene un contaminante, el método que comprende poner la solución alimentadora en contacto con una membrana de nanofiltración o de osmosis inversa bajo condiciones tales que la membrana retenga al compuesto de carbohidrato en tanto que una mayor parte del contaminante pasa a través de la membrana, en el cual es seleccionado el compuesto de carbohidrato a partir del grupo compuesto por: galactosidas de sialilo; ácido siálico; LriNt; LNT-2; NeuAca (2? 3) Galß (1?4) (Fucal?3) Glc (R^ßl-OR2, en que
2. R1 es OH ó NAc; R2 es un hidrógeno, alcoxi, un sacárido, un oligosacárido o bien un grupo agíicón que posee por lo menos un átomo de carbono; y Gala (1?3) Galß (1?4) Glc (R^ß-O-R3, en que R1 es OH ó NAc; R3 es -(CH2)n-C0X, en que X es OH, OR4, ó bien -NHNH2, en que R4 es hidrógeno, un sacárido, un oligosacárido o bien un grupo agíicón que posee por lo menos un átomo de carbono y n es un número entero de 2 a 18. 2. El método según la reivindicación 1 en que el ^^á^xAißt^a ^ compuesto de carbohidrato es seleccionado del grupo compuesto por galactosida de sialilo, LnNT, LNT-2 y Galal,3Galßl,4GlcNAcßl-0- (CH2)5-COOH.
3. 3. El método según la reivindicación 2 en que el compuesto de carbohidrato es seleccionado del grupo compuesto por una (a2 , 3) -galactosida de sialilo y una (a2 , 6) -galactosida de sialilo.
4. 4. El método según la reivindicación 2 en que la membrana comprende poliamida o polibenzamida.
5. 5. El método según la reivindicación 4, en que la membrana es una membrana seleccionada del grupo compuesto por un modelo YK, un GE (G-5) y un MX07.
6. 6. El método según la reivindicación 1 en que el compuesto de carbohidrato es NeuAca2,3Galßl,4 (Fucal, 3) GlcNAcßl, 4Galßl-OEt .
7. 7. El método según la reivindicación 6 en que la membrana es una membrana seleccionada del grupo compuesto por un modelo YK, un GE (G-5) , un GH (G-10) , un modelo HL y un modelo MX07.
8. 8. El método según la reivindicación 1 en que la solución alimentadora es una mezcla de reacción enzimática utilizada para la síntesis del compuesto de carbohidrato.
9. 9. El método según la reivindicación 1 en que la capacidad de la membrana de retener al compuesto de carbohidrato mientras que pasa el contaminante, es optimizada mediante un ajuste del pH de la solución alimentadora.
10. 10. El método para purificar un compuesto de carbohidrato desde una solución alimentadora que contiene un contaminante, lo cual comprende poner la solución alimentadora en contacto con una membrana de nanofiltración o de osmosis inverso bajo condiciones tales que la membrana retiene al compuesto de carbohidrato mientras que una mayor parte del contaminante pasa a través de la membrana, en que el compuesto de carbohidrato tiene la fórmula en que Z es hidrógeno, acilo de Cl-C6 ó bien Y es seleccionado del grupo compuesto por C (0) , S02HNC(0), 0C(0) y SC(O) ; R1 es seleccionado del grupo compuesto por un grupo arilo, arilo substituido y fenil-alquileno con 1 a 3 átomos de íS-(-M-l^«-M carbono, en que el arilo es substituido comprende un substituyente seleccionado del grupo compuesto por un halo, trifluorometilo, nitro, alquilo con 1 a 18 átomos de carbono, alcoxi con 1 a 18 átomos de carbono, amino, mono-alquiloamino con 1 a 18 átomos de carbono, di-alquilamino con 1 a 18 átomos de carbono, bencilamino, alquilbencilamino con 1 a 18 átomos de carbono, tioalquilo con 1 a 18 átomos de carbono y grupos de alquil -carboxamido con 1 a 18 átomos de carbono; o bien R1 Y es aliloxicarbonilo o cloroacetilo; R2 es seleccionado del grupo compuesto por monosacárido, disacárido, hidrógeno, hidrocarbilo de cadena recta o ramificada o bien cíclico con 1 a 18 átomos de carbono, alquilo con 1 a 6 átomos de carbono, 3- (3,4,5-trimetoxifenil) -propilo, alquilen-a-carboxilato con 1 a 5 átomos de carbono, sililalquileno a - trisubstituido con 2 a 4 átomos de carbono en que el sililo a-trisubstituido es un grupo sililo que posee tres substituyentes seleccionados independientemente del grupo compuesto por alquilo con 1 a 4 átomos de carbono y fenilo, o bien R2 en conjunto forman un carbamato de hidrocarbilo de cadena recta, cadena ramificada o de tipo cíclico con 1 a 18 átomos de carbono; R3 es hidrógeno o acilo con 1 a 6 átomos de carbono; R4 es hidrógeno, alquilo con 1 a 6 átomos de carbono 0 bencilo; R5 es seleccionado del grupo compuesto por hidrógeno, bencilo, metoxibencilo, dimetoxibencilo y acilo con 1 a 6 átomos de carbono; R7 es metilo o hidroximetilo; y X es seleccionado del grupo compuesto por aciloxi con 1 a 6 átomos de carbono, hidroxiaciloxi con 2 a 6 átomos de carbono, hidroxi, halo y azido.
11. 11. El método según la reivindicación 10 en que el compuesto carbohidrato tiene la fórmula NeuAca (2?3) Galß (1?4) GlcNÍR1) ß-OR2 ó bien NeuAca (2->3) Galß (l?4)GlcN(R1)ß(l?3) Galß-OR2, en que R1 es alquilo o acilo con 1 a 18 átomos de carbono, 5, 6, 7, 8-tetrahidro-2-naftamido; benzamido; 2 -naftamido; 4-aminobenzamido; ó 4-nitrobenzamido y R2 es un hidrógeno, sacárido, un oligosacárido o bien un grupo agíicón que posee por lo menos un átomo de carbono.
12. 12. El método según la reivindicación 10 en que el compuesto carbohidrato tiene la fórmula NeuAca (2?3) Galß (1?4) (Fucal?3) GlcN (R1) ß-OR2 ó bien NeuAca (2?3) Galß (1?4) (Fucal?3) GlcN (R1) ß (1?3) Galß-OR2, en que R1 es alquilo o acilo con 1 a 18 átomos de carbono, 5,6,7,8-tetrahidro-2 -naftamido; benzamido; 2-naftamido; 4-aminobenzamido; ó 4-nitrobenzamido y R2 es un hidrógeno, un sacárido, un oligosacárido o bien un grupo agíicón que posee ^-..^.^?.l- ^-a-¿^ por lo menos 1 átomo de carbono.
13. 13. Un método para purificar un compuesto de carbohidrato desde una solución alimentadora que comprende una mezcla de reacción enzimática utilizada para sintetizar el compuesto de carbohidrato, método que comprende los pasos de: retirar cualquier proteína presente en la solución alimentadora poniendo la solución en contacto con una membrana de ultrafiltración de manera que las proteínas son retenidas en la membrana en tanto que el compuesto de carbohidrato pasa a través de la misma como un permeato; y poner el permeato procedente del paso de ultrafiltración en contacto con una membrana de nanofiltración o de osmosis inversa bajo tales condiciones de que la membrana de nanofiltración o de osmosis inversa retenga al compuesto de carbohidrato en tanto que una mayor parte de un contaminante no deseado pasa a través de la misma.
14. 14. Un método para purificar un compuesto de carbohidrato desde una solución alimentadora que contiene a un contaminante, comprendiendo este método poner la solución alimentadora en contacto con una membrana de nanofiltración o de osmosis inversa bajo tales condiciones de que la membrana retenga el compuesto de carbohidrato en tanto que una mayor parte del contaminante pasa a través de la membrana, y en que el compuesto de carbohidrato es un nucleótido o un azúcar de nucleótido.
15. 15. El método según la reivindicación 14 en que el azúcar de nucleótido es seleccionado del grupo compuesto por GDP-fucosa, GDP-manosa, CMP-NeuAc, UDP-glucosa, UDP-galactosa y UDP-N-acetilgalactosamida.
16. 16. El método según la reivindicación 14 en que el compuesto de carbohidrato es un nucleótido o nucleósido.
17. 17. Un método para retirar un contaminante desde una solución alimentadora que comprende a un carbohidrato de interés, comprendiendo el método poner la solución alimentadora en contacto con un primer lado de una membrana de nanofiltración o de osmosis inversa que tiene coeficientes de rechazo para el carbohidrato y el contaminante de tal modo que se retiene el carbohidrato en tanto que se permite que el contaminante pase a través de la membrana, en que la solución alimentadora comprende una mezcla de reacción enzimática utilizada para sintetizar el carbohidrato. 18. El método según la reivindicación 17 en que la reacción enzimática comprende la degradación enzimática de un oligosacárido o polisacárido. 19. El método según la reivindicación 17 en que la membrana separa la solución en una porción retenida y una porción de permeato, comprendiendo la porción de material retenido una concentración menor del contaminante respecto a la concentración de contaminante presente en la solución alimentadora . 20. El método según la reivindicación 17 en que el pH de la solución alimentadora es seleccionado de tal manera que se ajustan los coeficientes de rechazo de la membrana para el compuesto de carbohidrato y el contaminante a fin de obtener un retiro incrementado del contaminante desde la solución alimentadora y/o una retención incrementada del compuesto de carbohidrato. 21. El método según la reivindicación 20 en que el contaminante es un anión y un pH de la solución alimentadora se sitúa entre aproximadamente 1 y 7. 22. El método según la reivindicación 20 en que el contaminante es un catión y el pH de la solución alimentadora se sitúa entre 7 y 14, aproximadamente. 23. El método según la reivindicación 20 en que el pH de la solución alimentadora es seleccionado para hacer positiva la carga de superficie neta de la membrana de nanofiltración. 24. El método según la reivindicación 20 en que el pH de la solución alimentadora es seleccionado para hacer negativa la carga de superficie neta de la membrana de nanofiltración. 25. El método según la reivindicación 20 en que el ^Ss|Íá pH de la solución alimentadora es seleccionado para hacer neutral la carga de superficie neta de la membrana de nanofiltración . 26. El método según la reivindicación 17 en que el carbohidrato es un oligosacárido o polisacárido. 27. El método según la reivindicación 17 en que el carbohidrato es sialilado. 28. El método según la reivindicación 17 en que el contaminante comprende a l ó varios compuestos seleccionados del grupo integrado por azúcares de nucleótidos, azúcares sin reaccionar, iones inorgánicos, purivato, fosfato, fosfoenolpiruvato, nucleótidos, nucleósidos y proteínas. 29. El método según la reivindicación 17 en que se retiran las proteínas de la mezcla antes de la nanofiltración. 30. El método según la reivindicación 17 que además comprende un paso de purificación por intercambio de iones. 31. Un método para purificar un compuesto de carbohidrato desde una solución alimentadora que comprende una mezcla de reacción enzimática utilizada para sintetizar el compuesto de carbohidrato, comprendiendo el método poner la solución alimentadora en contacto con una membrana de nanofiltración o de osmosis inversa bajo condiciones tales que la membrana retenga al compuesto de carbohidrato en tanto que una mayor parte del contaminante pasa a través de la misma. ,,j? a'*'M ;-,.,_ -«—-«Mi*» át-á-' 32. El método según la reivindicación 31 en que la mezcla de reacción enzimática cataliza la degradación enzimática de un oligosacárido o polisacárido. 33. El método según la reivindicación 31 en que la 5 mezcla de reacción enzimática comprende una glicosiltranferasa . 34. El método según la reivindicación 31 en que la mezcla de reacción enzimática comprende una fucosiltransferasa . 10 35. El método según la reivindicación 31 en que la mezcla de reacción enzimática comprende un aceptor para una glicosiltransferasa, en que el aceptor es seleccionado del grupo compuesto por: Galßl—>3GalNAc, lacto-N-tetraosa, Galßl?3GlcNAc, Galßl-3Ara, Galßl?6GlcNAc, Galßl?4Glc 15 (latosa), Galßl?4Glcßl-OCH2CH3,Galßl?4Glcßl?OCH2CH2CH3, Galßl-»4Glcßl?4Glcß-OCH2C6H5, Galßl?4GlcNAc, Galßl-OCH3, melibiosa, rafinosa, estaquiosa y lacto-N-neotetraosa (LNnT) . 36. El método según la reivindicación 31 en que el compuesto de carbohidrato comprende una porción fijadora de 20 selectina. 37. El método según la reivindicación 36 en que el compuesto de carbohidrato comprende la fórmula: R'Galßl , m (Fucal , n) GlcNR0 (R2) p ; gg^^^^^^^^^^^^^^É^^^^gj^^g^^^^^^^^^a^ en que R° es (alquilo de carbonilo (alcoxi de C-L-Cg) carbonilo o (alqueniloxi de C2-C9) carbonilo; R1 es un oligosacárido o un grupo que tiene la fórmula R3 C02H R2 es seleccionado del grupo compuesto por H, alquilo de C1 a C8, hidroxi (alquilo de C1 a C8) aril- (alquilo de C1 a C8) , (alquilo de C1 a C8) -arilo, alquiltio, al, 2Man, al,6GalNAc, ßl , 3Galßl, 4Glc, al, 2Man-R8, al , 6GalNAc-R8 y ßl,3Gal-R8; R3 y R4 se seleccionan independientemente del grupo compuesto por: H, alquilo de C1 a C8, hidroxi- (alquilo de C1 a C8) , aril- (alquilo de Cx a C8) y (alcoxi de Cx a C8) - (alquilo de Cx a C8) , substituido o insubstituido; R8 es. seleccionado del grupo compuesto por: H, alquilo de Cx a C8, alcoxi de Cx a C8, hidroxi- (alquilo de Cx a C8) arilo- (alquilo de Cx a C8) , (alquilo de C1 a C8) -arilo, o bien alquiltio; m y n son 3 ó 4 , y p es cero ó 1 ^^^|gj|^ 38. El método según la reivindicación 31, en que el compuesto de carbohidrato comprende la fórmula: en la cual Z es hidrógeno, acilo de C1 a C6 ó bien Y es seleccionado del grupo compuesto por C(0), S02, HNC(O), 0C(0) y SC(0); R1 es seleccionado del grupo compuesto por un arilo, un arilo substituido y un grupo de alquileno de fenilo de Cx a C3, en que el arilo substituido comprende substituyente seleccionado del grupo compuesto por un halo, trifluorometilo, nitro, alquilo don C1 a C18, alcoxi con C1 a C18, amino, mono-alquilamino con Cx a C18, dialquilamino con C? a C18, bencilamino, alquilo con Cx a C18-bencilamino, tioalquilo con x a C18 y a grupos de alquilo con Cx a C18-carboxamido o bien R1Y es aliloxicarbonilo o cloroacetilo; R2 es seleccionado del grupo compuesto por monosacárido, disacárido, hidrógeno, hidrocarbilo con Cx a C18 de cadena recta, ramificada o cíclica, alquilo con Cx a C6, 3- (3 , 4 , 5-trimetoxifenil) propilo, alquileno con acarboxilato y un alquileno de sililo de C2 a C4 a-trisubstituido en que el sililo a-trisubstituido es un grupo sililo que posee tres substituyentes seleccionados independientemente del grupo compuesto por alquilo con Cx a C4 y fenilo; o bien OR2 en conjunto forman un carbamato de hidrocarbilo de Cx a C18 de cadena recta, ramificada o cíclica; R3 es hidrógeno o acilo con C a C6; R4 es hidrógeno, alquilo con Cx a C6 o bencilo; R5 es seleccionado del grupo compuesto por hidrógeno, bencilo, metoxibencilo, dimetoxibencilo y acilo con R7 es metilo o hidroximetilo; y X es seleccionado del grupo compuesto por aciloxi con Cx a C6, hidroxiaciloxi con C2 a C6; hidroxi, halo y azido. 39. El método según la reivindicación 31 en que R2 es ßl,3Gal-0R en que R es H, alquilo, arilo o acilo. 40. El método según la reivindicación 31 en que el compuesto de carbohidrato comprende la fórmula Galal,3Gal- 41. El método según la reivindicación 40 en que el compuesto de carbohidrato comprende la fórmula Galal^Galßl^GlcWß-O-R1, en que R1 representa -(CH2)n-COX, en que X es OH,OR2 ó bien -NHNH2, R es OH ó NAc y R2 es un hidrógeno, sacárido, un oligosacárido o bien un grupo aglicón que posee por lo menos un átomo de carbono y n es un número entero de 2 a
18. 18. Mtttijgba M^