MXPA98009501A - Composiciones para tincion in vivo, proceso de fabricacion y metodos de uso para identificar tejidos displasicos - Google Patents

Abstract

Los derivados de N-demetilación y N, N-demetilación de los isómeros conformacionales de azul de toluidina O ("TBO") se han sintetizado, aislado e identificado. Una composición de tinción biológica in vivo incluye los isómeros conformacionales de TBO y esos derivados de N- y N,N-demetilación. La proporción de esos isómeros a los derivados de demetilación es por lo menos 6:1. Un método mejorado para detectar tejido displásico oral, oral incluye la aplicación en este tejido de tales productos de TBO, en un vehículo líquido. Un proceso para preparar productos de TBO incluye (1) oxidar N,N-dimetil-p-fenilendiamina para formar un intermediarioácido 2-amino-5-dimetilaminofenil tiosulfónico, (2) oxidar este intermediario y condensar el producto de oxidación con o-toluidina, formarácido indamina tiosulfónico y (3) oxidación posterir del intermediario indamina para formar un producto de reacción que contiene TBO, el cual se precipita de la mezcla de reacción como un complejo, del cual se separa el producto de TBO final. El agente acomplejante se añade a la mezcla de reacción al menos antes de la etapa final de oxidación, de preferencia antes de la segunda etapa de oxidación. Un método HPLG para caracterizar los productos de TBO que contiene los isómeros conformacionales de TBo y sus derivados de N,N-demetilación. La móvil contiene una solución acuosa de un compuesto orgánicoácido.

Description

COMPOSICIONES PARA TINCIÓN IN VIVO, PROCESO DE FABRICACIÓN Y MÉTODOS DE USO PARA IDENTIFICAR TEJIDOS DISPLÁSICOS SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud sostiene múltiples prioridades convencionales, basadas en mi Solicitud Internacional PCT US/97/20981, presentada el 13 de noviembre de 1997 y basada en mi Solicitud EUA, Serie N° 09/110, 788, presentada el 6 de julio de 1998.

CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a nuevas composiciones de tinción biológica adaptadas para aplicación tópica in vivo. En particular la invención contempla nuevos productos colorantes de Azul Toluidina O ("TBO") , los cuales contienen TBO y derivados específicos de TBO, en proporciones específicas. Según otro aspecto, la invención se refiere a nuevos métodos de fabricación de composiciones de TBO, entre los que se incluyen esos nuevos productos de TBO, como se describió en mi Solicitud Internacional anterior. Además, la invención se refiere a procesos de fabricación mejorados, los cuales tienen mayor rendimiento del producto TBO, conducen a mayores ' economías de P1659/98MX fabricación y a mayor capacidad productiva del equipo de fabricación, como se describió en mi solicitud USA anterior. Todavía en otro aspecto, la invención está relacionada con métodos para el uso in vivo de tales nuevas composiciones de TBO para identificar displasias sospechosas, p.ej., tejidos anormales. Todavía en otro aspecto adicional, la invención se refiere a las composiciones, los métodos de uso de las mismas para diagnóstico in vivo y los métodos de fabricación de las mismas, los cuales están adaptados especialmente para detectar tejido oral displásico, especialmente tejido canceroso y precanceroso. Aún en otra consideración, la invención está relacionada con los productos nuevos y los de N-de etilación de TBO que se han sintetizado, aislado, identificado y recuperado. En otro aspecto, la invención se refiere a los métodos HPLC para análisis de productos TBO que contienen isómeros confor acionales y otros compuestos relacionados estructuralmente .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las diversas modalidades de la invención y la práctica de las mismas serán más evidentes para los P1-659/98MX expertos en la materia a partir de la descripción detallada de las mismas, cuando se tomen considerando las reivindicaciones y los dibujos, en los cuales: Fig. 1 es una gráfica de HPLC a 254 nm, que representa los picos típicamente característicos para composiciones del producto TBO, conocidas previamente y disponibles comercialmente. Fig. 2 es una gráfica de HPLC, que representa los picos característicos de las composiciones del producto TBO típicas de la presente invención; y Fig. 3 es un diagrama de flujo de proceso, que representa los procesos que he descubierto para fabricación de productos de TBO, entre los que se incluyen las nuevas composiciones del producto TBO de la presente invención.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La mayoría de las lesiones orales resultan de trauma. Sin embargo, otras lesiones orales son tumores displásicos, algunos de ellos pueden ser benignos, pero algunos pueden ser cancerosos o precancerosos . Además, muchas lesiones displásicas son pequeñas y se omiten fácilmente por los dentistas en una revisión visual de rutina. Se conoce una prueba de diagnóstico in vivo que identifica y describe tejido oral displásico sospechoso.

P1659/98MX Esta prueba de cribado está descrita de manera general en la Patente de los Estados Unidos 4,321,251 asignada a Mashberg y en la Patente de Estados Unidos 5,372,801 asignada a Tucci et al. Más recientemente se han desarrollado estuches de prueba que hacen posible a los dentistas administrar la prueba fácil y rápidamente, como parte de otros procedimientos dentales de rutina y así identificar y/o describir sitios sospechosos en la etapa en la que el paciente es asintomático o cuando las lesiones displásicas son tan pequeñas que pueden ser ignoradas durante un examen visual normal. Una vez que la lesión displásica se identifica por el protocolo Mashberg, se puede tomar una muestra para biopsia regular y someterse a examen histológico, para determinar si la lesión es maligna o precancerosa. Los estuches para realizar esta prueba, que contienen la premezcla colorante y soluciones de enjuague en las cantidades y concentraciones adecuadas, están autorizados por Zila, Inc. y están disponibles comercialmente en Canadá por Germiphene, Inc., bajo la marca comercial ORASCAN TM y en el Reino Unido y Australia por Stafford-Miller Ltd., bajo la marca comercial "ORASCREENR".

LA TÉCNICA ANTERIOR DE LOS PRODUCTOS TBO Ahora se ha descubierto que el contenido de P1S59/98MX colorante orgánico de los productos TBO de la técnica anterior que típicamente estaban disponibles comercialmente, era relativamente bajo, dependiendo del proveedor. Típicamente, las áreas combinadas de los picos a 254 nm en HPLC (ver el procedimiento de HPLC del Ejemplo 3) , las cuales representan los isómeros conformacionales de TBO en esos productos de la técnica anterior, fue únicamente cerca de = 2%-75% de las áreas combinadas de los picos a 254 nm en HPLC que representan el TBO y todos los componentes de TBO relacionados, p.ej., los dos isómeros conformacionales de TBO además de hasta seis componentes relacionados con TBO. Con referencia a la Fig.l, los picos 7 y 8 en HPLC representan los dos isómeros conformacionales de TBO (mostrados aquí en forma de sal, como cloruro) : P1659/98MX Los picos 5 y 6 en HPLC se han identificado como los derivados N-demetilados de los dos isómeros conformacionales de TBO: Los picos 2 y 3 en HPLC se han identificado como los derivados N, N-demetilados de los dos isómeros conformacionales de TBO: P16S9/98MX Las estructuras exactas de los compuestos representados por los picos 1 y 4 en HPLC no se han determinado completamente. En todo caso, en las composiciones de TBO de la técnica anterior, una composición típica se representa en la Fig.l, estuvieron presentes los compuestos representados por los picos 1-4 en cantidades relativamente mayores que los de la presente invención (Ver Fig. 2) y los compuestos representados por los picos 5-8 estuvieron presentes en cantidades relativamente menores que en los productos de TBO de la presente invención. Los dos derivados N-demetilados de los isómeros conformacionales de TBO, representados por los picos 5 y 6, de la técnica anterior (Fig. 1) estuvieron presentes en cantidades relativamente mayores, típicamente arriba de 20% del contenido del colorante orgánico, que los que se presentan en los productos de TBO de mi invención.

P1659/98MX EL PROCESO DE FABRICACIÓN DE TBO EN LA TÉCNICA ANTERIOR. La síntesis clásica de TBO se ejemplifica en la Patente de los Estados Unidos 418,055, otorgada el 30 de noviembre de 1989, a Dandliker et al. Esta síntesis es una serie de tres pasos de oxidación: (1) oxidación de N,N-diemtil-p-fenilendiamina, p.ej., con dicromato de potasio, para formar ácido 2-amino-5-dimetilaminofenil tiosulfónico; (2) condensación de ácido tiosulfónico con o-toluidina, para formar el correspondiente ácido indamina-tiosulfónico; y (3) ciclización del anillo del ácido indamina-tiosulfónico, p.ej., en presencia de cloruro de cinc a la temperatura de ebullición por 30 minutos aproximadamente, para formar TBO. La mezcla de reacción se enfría entonces y el producto TBO resultante de la reacción de ciclización del anillo se acompleja y se forma una sal, p.ej, por tratamiento con cloruro de sodio y cloruro de cinc, para precipitar el complejo TBO, p.ej., como complejo TBO/ZnCl2. La purificación se puede llevar a cabo por repetidas redisoluciones y re-precipitaciones, p.ej., por re-disolución en solución acuosa caliente de cloruro de cinc y reprecipitación con cloruro de sodio/cloruro de cinc. Hasta donde se sabe, los investigadores anteriores que fomentaron el uso de TBO para identificación de displasias in vivo, utilizaron los productos anteriormente descritos de la técnica anterior, p.ej., P1659/98MX composiciones en las cuales los isómeros conformacionales de TBO más los derivados de N-demetilación y N,N-demetilación fueron menos de 80% de la composición colorante y en las cuales los dos derivados de N-demetilación de los isómeros conformacionales constituyeron aproximadamente más de 20% de la composición colorante. Según mi información, los investigadores anteriores ignoraban la composición exacta de sus productos de "TBO" y los fabricantes de los productos de la técnica anterior fueron incapaces de prepararlas reproduciblemente. De hecho, las descripciones que prevalecen en la literatura acerca de la calidad del TBO es simplemente "azul toluidina de buen valor de color". La Comisión de Tinción Biológica especifica un procedimiento analítico de titulación para determinar únicamente el "contenido de colorante orgánico" del material. El uso en la técnica anterior del vagamente definido "TBO" dio por resultado observaciones clínicas anómalas y problemas serios para obtener los certificados regulatorios necesarios para fabricación y comercialización de tales productos para su uso en procedimientos de diagnóstico en humanos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Brevemente, las nuevas composiciones de materia que incorpora la invención son un producto de TBO, en el P1659/98MX que están comprendidos los isómeros conformacionales de TBO y los derivados de N-demetilación de esos isómeros conformacionales y están presentes en una proporción de isómeros de TBO con respecto a sus derivados de N-demetilación en tal forma que la proporción de las áreas combinadas de los picos HPLC a 254 nm que representan los isómeros de TBO (determinados según el procedimiento de HPLC del Ejemplo 3) con respecto a las áreas combinadas de los picos que representan sus derivados de N-demetilación es por lo menos 6:1 aproximadamente. Así, como se representa en la Fig.2, el área combinada de los picos a 254 nm en HPLC, que representa a los isómeros conformacionales de TBO (picos 7 y 8), es por lo menos aproximadamente seis veces el área combinada de los picos a 254 nm en HPLC que representa a sus respectivos derivados de N-demetilación (picos 5 y 6) . En la modalidad preferida de la invención, los componentes representados por los picos 5, 6, 7 y 8 equivalen a por los menos 95% aproximadamente del contenido de colorante orgánico del producto. En la modalidad particularmente de mayor preferencia, el área del pico 8 (254 nm) representa por lo menos 58% del contenido de colorante orgánico del producto. La invención también considera un método para detección in vivo de tejido displásico en humanos, el cual incluye los pasos de aplicar al tejido humano los nuevos P1659/98 X productos de TBO descritos arriba. Todavía otra modalidad de la invención es un nuevo proceso general para la fabricación de manera reproducible de composiciones de TBO, entre las que se incluyen los nuevos productos de TBO descritos arriba, en el cual el agente acomple ante se añade a la mezcla de reacción antes de la etapa (tercera) de ciclización de la síntesis de Dandliker, de preferencia antes de la primera etapa de oxidación (11, de la Fig.3) del proceso. El proceso Dandliker de la técnica anterior incluía los pasos de: oxidar iones de N,N-dimetil-p-fenilendiamina en una primera mezcla de reacción para formar un primer intermediario, ácido 2-amino-5-dimetilaminofenil tiosulfónico, oxidar el primer intermediario y condensar con o-toluidina el primer producto de la oxidación, en una segunda mezcla de reacción, para formar el segundo intermediario, ácido indamina tiosulfónico, oxidar el segundo intermediario en una tercera mezcla de -reacción para cerrar el ciclo de indamina, formando un producto de reacción TBO, disuelto en la tercera mezcla de reacción, introducir un reactivo acomplejante en dicha tercera mezcla de reacción, para formar un producto P1659/98MX Co plejo-TBO, y separar dicho Complejo-TBO a partir de dicha mezcla de reacción. Mi mejora a este proceso Dandliker comprende el paso de adición del reactivo acomplejante en una etapa anterior a la formación de la tercera mezcla de reacción, de preferencia antes de la formación de la segunda mezcla de reacción. Según una modalidad aún de mayor preferencia, adaptada especialmente a la fabricación de las nuevas composiciones de productos de TBO de la invención, la temperatura de las mezclas de reacción durante las etapas de oxidación se mantiene a no más de 10° centígrados aproximadamente . Todavía en otra modalidad adicional de mayor preferencia, especialmente adaptada para mejorar la calidad de los productos de TBO, el pH de la mezcla de reacción durante los pasos de oxidación se mantiene en el rango de 2.8-3.8 aproximadamente (de preferencia 3.3) en la primera mezcla de reacción, 3.1-4.1 aproximadamente (de preferencia 3.6) en la segunda mezcla de reacción y aproximadamente 3.0 en la tercera mezcla de reacción. Todavía en otra modalidad preferida, mi nuevo proceso general, descrito brevemente arriba, se mejoró para proporcionar mayores incrementos en el rendimiento de los P1S59/98MX productos de TBO.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Como se representa en la Fig. 1, los productos TBO típicos comercialmente disponibles previamente, presentaban dos picos a 254 nm en HPLC (picos 7 y 8), los cuales representan los isómeros conformacionales de TBO y dos picos a 254 nm en HPLC (picos 5 y 6) , los cuales he descubierto que son los derivados de demetilación de los isómeros conformacionales. Las cantidades relativas de los isómeros conformacionales de TBO a sus derivados N-demetilados en estos productos típicos de la técnica anterior, eran tales que la proporción del área del pico de los isómeros conformacionales con respecto a la de los derivados N-demetilados es menor de 4:1. En productos de TBO aislados anteriormente se dio accidentalmente una proporción más alta, aproximándose o excediendo 6:1, pero las cantidades relativas de tales productos no se conocieron o no se consideraron importantes. En todo caso, los productos de TBO con tales proporciones altas no se pudieron preparar reproduciblemente mediante los procedimientos de fabricación de la técnica anterior. Según los requerimientos regulatorios basados en pruebas clínicas recientes, el TBO que se utiliza en procedimientos de diagnóstico en humanos (en general de P1659/98MX acuerdo con el protocolo de Mashberg) para detectar tejido displásico, debe tener una proporción de área de pico a 254 nm en HPLC de los isómeros conformacionales de TBO con respecto a la de los derivados de N-demetilación de por lo menos 6:1, p.ej., el área combinada de los picos 7 y 8 a 254 nm en HPLC, debe ser por lo menos seis veces mayor que el área combinada de los picos 5 y 6 a 254 nm en HPLC. Sería sumamente deseable proporcionar composiciones de productos de TBO que cumplieran los requerimientos de los procedimientos para pruebas de diagnóstico en humanos, en los cuales la proporción de áreas de los picos a 254 nm en HPLC de los isómeros conformacionales con respecto a las áreas de sus derivados de N-demetilación es por lo menos 6:1. Además, sería sumamente deseable proporcionar un proceso de manufactura para preparar confiable y reproduciblemente tales productos de TBO, que tienen esta proporción específica de los isómeros de TBO con respecto a los derivados de demetilación de TBO y para producir confiable y reproduciblemente otros productos de TBO con incremento en el rendimiento y pureza total. Como será evidente a partir de la Fig. 2, la cual representa el análisis por HPLC a 254 nm de las composiciones típicas de la presente invención, la proporción del área de los picos de los isómeros P16S9/98MX conformacionales de TBO con respecto a los derivados de N-demetilación es mayor de 6:1 aproximadamente, a saber, 6.68:1, como se demostró por el hecho de que las áreas combinadas de los picos 7 y 8 a 254 nm en HPLC es 6.68 veces mayor que las áreas combinadas de los picos 5 y 6. La pureza total, determinada por HPLC y pruebas de calcinación, se define como [cien menos el porcentaje de residuo a la calcinación] multiplicado por la pureza en HPLC (p.ej., la suma de las áreas de los picos 5, 6, 7 & 8 dividida entre el total de áreas de los picos) de los productos de TBO de la invención, es por lo menos mayor de 75%, comparada con 2-10% para la mayoría de las composiciones de la técnica anterior. En incidentes aislados, una pureza comparable pudo haberse obtenido en los productos de la técnica anterior, pero no de manera reproducible . Según un aspecto de mi invención, la proporción de las áreas de los picos (picos 3, 6 & 8) con el grupo metilo del anillo en la posición -2 (p.ej., ver Fórmula I) con respecto a las áreas de los picos (picos 2, 5 & 7) con el grupo metilo del anillo en la posición -4 (p.ej., ver Formula II) es aproximadamente 2.5:1. En contraste, según mi conocimiento, esta proporción en los productos de la técnica anterior fue no mayor de 1.5:1. Esta combinación de alta proporción de las áreas P1659/98MX de los picos 7+8: picos 5+6 y la alta proporción de las áreas de los picos 3+6+8: picos 2+5+7 según mi conocimiento, no han sido presentadas por ningún producto de la técnica anterior. Ya que el pico 8 es el pico principal de TBO, la estructura de éste es la aceptada más ampliamente como TBO, después los picos 3, 6 y 8 se prefieren a los picos 2, 5 y 7. Los picos 7 y 8 son, por supuesto, preferidos sobre los picos 5 y 6, los cuales son a su vez preferidos sobre los picos 2 y 3. Así en la modalidad de mayor preferencia de mi invención, los productos satisfacen la combinación de estos dos criterios de proporción. Fig. 3 es un diagrama de flujo de proceso el cual representa un proceso para preparar productos de TBO, que cumple los requerimientos regulatorios para uso clínico de conformidad general con el protocolo de Mashberg. El material de partida 10 para la síntesis de la Fig. 3 es N,N-dimetil-p-fenilendiamina de alta pureza, disponible comercialmente: P1659/98MX Formación de la Primera Mezcla de Reacción Una solución acuosa del material de partida 10 se oxida 11, de preferencia a menos de 10°C, especialmente a menos de 5°C aproximadamente, por reacción con un agente oxidante adecuado 12, p.ej., dicromato de potasio 12, en presencia de ácido, sulfato de aluminio y un reactivo, 13 (el cual se cree que forma complejo con el intermediario (s) y se usa en una etapa posterior del proceso para formar el complejo de los componentes de la composición de TBO) , p.ej., cloruro de cinc. Después se añade una fuente de iones tiosulfato 14, p.ej., tiosulfato de sodio, para formar la primera mezcla de reacción 15 que contiene el primer intermediario, ácido 2 -amino-5-dimetil aminofenil tiosulfónico : Formación de la Segunda Mezcla de Reacción La primera mezcla de reacción 15 posteriormente se hace reaccionar, de preferencia a temperatura no mayor de 10°C, con agente oxidante adicional 16, p.ej., dicromato P1659/98MX de potasio y clorhidrato de o-toluidina 17, en un paso de condensación 18 para formar el segundo intermediario, un producto de condensación, ácido indamina tiosulfónico en la segunda mezcla de reacción 19.

Formación de la Tercera Mezcla de Reacción La segunda mezcla de reacción 19 se oxida posteriormente 21, de preferencia por la adición de un agente oxidante adecuado 22, p.ej., dicromato de potasio, a temperatura no mayor de aproximadamente 10 °C. Esto es seguido de la adición de sulfato de cobre, agente acomplejante de cloruro de cinc, ácido y calentamiento a 100 °C para llevar a cabo la ciclización del anillo de indamina, formando el TBO en una tercera mezcla de reacción 24. En este punto el TBO se separa de la tercera mezcla de reacción y se purifica.

Separación/Purificación de TBO Por ejemplo, ahora en la modalidad de preferencia P1659/98MX del proceso de la presente invención, el TBO se precipita de la tercera mezcla de reacción por formación de complejo 24 con un agente acomplej ante 25 , p . ej . , cloruro de cinc , para formar el sal doble complej a de TBO-cloruro de cinc . El precipitado se filtra 26 de la fase líquida y se lava con solución de cloruro de sodio 27 . La torta de filtración lavada se redisuelve 28 en un volumen crítico1 de agua 29 para formar una solución de TBO 30 , la cual entonces se filtra 31 para eliminar sólidos no disueltos 32a, los cuales se desechan. Se añade entonces cloruro de cinc seguido por la adición de un volumen/concentración críticos2 de cloruro de sodio 33 al filtrado 32 para precipitar otra vez la sal doble complej a de TBO-cloruro de cinc , ilustrativamente (se muestra únicamente uno de los isómeros conformacionales) , 1 Si se usa demasiada agua esto impide el aislamiento del TBO . Si se usa muy poca agua (1) no se logran disolver todos los productos de TBO, se reduce el rendimiento y (2 ) esto disminuye la pureza del producto . 2 Si se usa muy poco cloruro de sodio, no se formará la sal de todos los productos, reduciendo el rendimiento . Si se usa demasiado cloruro de sodio se provocará que las impurezas e precipiten junto con el TBO, disminuyendo la pureza del producto . P1S59/98 X El complejo TBO-cloruro de cinc sal doble se separa de la mezcla por filtración, para dar una torta de filtración 34 de TBO-cloruro de cinc/clorhidrato de TBO. Como se indica por la línea punteada 35, la torta de filtración 34 se puede redisolver, filtrar, reprecipitar y reaislarse múltiples veces para alcanzar el grado de pureza y rendimiento de TBO deseados. La torta de filtración purificada final del producto complejo 34 se seca entonces 35, p.ej., en una estufa de convección convencional y/o en una estufa al vacío y la torta de filtración seca 36 se muele y se mezcla 37 para dar el producto TBO final 38. El producto TBO final contiene tanto la sal doble de cloruro de cinc del TBO (Fórmula X) como la sal de cloruro de TBO (Fórmulas I & II) . Introduciendo el reactivo acomplejante antes de la formación de la tercera mezcla de reacción, p.ej., antes de la oxidación del ácido indamina tiosulfónico y acomplejando el producto de reacción TBO resultante para formar el Complejo-TBO, se obtiene un producto Complejo-TBO P1659/98MX que tiene una proporción mejorada de los isómeros conformacionales con respecto a los productos de N-demetilación de los mismos. Si el reactivo acomplejante se introduce antes de la formación de la tercera mezcla de reacción, se puede obtener una proporción de al menos 6:1. Por supuesto, como se reconocerá por los expertos en la materia, obtener estas proporciones mejoradas de isómeros a los derivados de demetilación también dependerá un poco de observar otras precauciones en los parámetros de procesamiento, como se discutirá más abajo con relación a la descripción de las modalidades de preferencia del proceso de la invención, en las cuales es deseable mejorar el rendimiento y la pureza del producto Complejo-TBO. Sin embargo, aún si se observan otros rendimientos y pureza aumentando las precauciones, no se obtendrán las proporciones mejoradas deseadas de isómeros con respecto a los productos de N-demetilación y no se obtendrán las proporciones mejoradas deseadas de los picos con el grupo metilo en la posición -2 vs. -4, a menos que el reactivo acomplejante se adicione por lo menos antes de la formación de la tercera mezcla de reacción, p.ej., antes de oxidar el ácido indamina sulfónico y acomplejar el producto TBO resultante. Actualmente, yo creo que la adición temprana del reactivo acomplejante, p.ej., antes de la formación de la P1659/98MX tercera mezcla de reacción, mejora la proporción isómero: derivado de N-demetilación del producto final, a causa de la formación temprana de un complejo del material de partida y/o el ácido tiosulfónico y/o el ácido indamina-tiosulfónico, el cual aparentemente presenta impedimento esférico para la demetilación. En otras palabras, debido a su tamaño y a su estructura, el complejo presenta volumen esférico (y posiblemente efectos electrónicos) el cual protege a los grupos N-metil de la demetilación oxidante. A causa de que las tres etapas de reacción involucran oxidación y posible demetilación, tiene ventajas la formación de este complejo lo más temprano posible, por lo que yo recomiendo que el agente acomplejante esté presente tan temprano como sea posible. Según modalidades adicionales y de mayor preferencia de la invención, como se describió en mi anterior solicitud EUA, identificada arriba, el rendimiento de mi proceso general, descrito arriba, se incrementa significativamente al introducir la fuente de iones tiosulfato en la primera mezcla de reacción, para formar el primer intermediario, mientras se mantiene la mezcla de reacción a una temperatura reducida de aproximadamente 10°C y se continúa la reacción a esta temperatura reducida antes de aumentar a una temperatura elevada. Así, en la fabricación del intermediario ácido indamina tiosulfónico, P1659/98 X la cual comprende los pasos de oxidar la N,N'-dimetil-p-fenilendiamina en una mezcla de reacción que contiene esta y un agente oxidante e introducir una fuente de iones tiosulfato y en seguida pasar a una temperatura elevada durante 30 minutos aproximadamente, para formar una solución de ácido indamina tiosulfónico disuelto en la mezcla de reacción, aumenta mucho el rendimiento total del producto de TBO a partir del proceso total por el hecho de mantener la temperatura de la mezcla oxidación-tiosulfonación en o por debajo de aproximadamente 10°C durante 30 minutos aproximadamente, antes de elevar la temperatura para formar la solución de la mezcla de reacción del ácido indamina tiosulfónico.

TRABAJO EJEMPLOS Los ejemplos siguientes se presentaron para ilustrar la práctica de la invención en términos tales que permitan a los expertos en la materia hacer y utilizar las nuevas composiciones de TBO, practicar los nuevos métodos de diagnóstico que utilizan tales composiciones- de TBO y practicar los nuevos procesos para preparar composiciones de TBO, los cuales juntos forman las diversas modalidades de la invención y para indicar a los expertos en la materia las formas mejores conocidas hasta ahora para practicar las P1659/98MX diversas modalidades de la invención. Esos ejemplos se presentan únicamente para ilustrar y no para indicar límites en el alcance de esta invención, la cual está definida únicamente por las reivindicaiones adjuntas.

EJEMPLO 1 Proceso de Fabricación Este ejemplo se ilustra con los detalles necesarios para satisfacer las condiciones regulatorias requeridas por las Buenas Prácticas de Manufactura en los procedimientos exactos para llevar a cabo la fabricación a escala comercial general de un lote de producto colorante TBO. Preparación de Soluciones de Materia Prima Equipo/suministros A. Balanza Ohaus IP15KS B. Balanza AnD HV150KAI C. Balanza Fairbanks H90-5150 D. Balanza Ohaus WB25/1-20W E _ Agitadores Colé Par er (51201-0) y Thermoline (S25535) F. Aditamentos de muestreo, tales como cucharas de acero, muestreadores para tambor, etc. G. Matraces Erlenmeyer, vasos de precipitado, bombonas y otro material de vidrio apropiado.

P1659/98MX H. Etiquetas para Soluciones de Producción. Seguridad: Se debe usar equipo protector, tal como guantes, lentes de seguridad, batas de laboratorio y mascarillas cuando se manejen sustancias químicas de acuerdo con los lineamientos de MSDS (Hojas de Datos de Seguridad de Materiales) . Procedimiento de Preparación de las Soluciones de Materia Prima : Añadir 1364.2 g (+ 5.5 g) de agua Purificada USP a 1362.4 g (+ 5.5 g) de ácido clorhídrico. Agitar hasta que la solución esté clara. Añadir 2548.9 g (+ 10.0 g) de agua Purificada USP a 1779.1 g (+ 7.0 g) de Sulfato de Aluminio Hexadecahidratado. Agitar hasta que la solución esté clara. Añadir 2786.7 g (+ 11.0 g) de agua Purificada USP a 7384.6 g (+ 30.0 g) de Cloruro de Cinc. Agitar hasta que la solución esté clara. Añadir 25203.8 g (+ 100.0 g) de agua Purificada USP a 2101.9 g (+ 8.0 g) de Dicromato de Potasio. Agitar hasta que la solución esté clara. Añadir 2043.6 g (+ 8.0 g) de agua Purificada USP a 1526.6 g (+ 6.0 g) de Tiosulfato de Sodio Pentahidratado. Agitar hasta que la solución esté clara. Añadir 1613.1 g (+ 6.0 g) de agua Purificada USP P1659/98MX a 509.7 g (+ 2.0 g) de Sulfato de Cobre Pentahidratado. Agitar hasta que la solución esté clara. Añadir 600.0 g (+ 2.0 g) de agua Purificada USP a 600.0 g (+ 2.0 g) de Ácido Sulfúrico. Agitar hasta que la solución esté clara. Añadir 234.4 kg (+ 850.0 g) de agua Purificada USP a 70.4 kg (+ 250.0 g) de Cloruro de Sodio. Agitar hasta que la solución esté clara.

SÍNTESIS Equipo y Suministros de Síntesis: Panel de Control LFE (3000) Tanques Con Chaqueta Revestidos de Vidrio para Purificación con tapa (E71224) Dos Tanques con Chaqueta Revestidos de Vidrio para Purificación con tapas, de 100 galones (Pl, PT-001) (P2, L- 13621) Enfriador de Recirculación FTS (RC96C032) y Tanque de Almacenamiento en frío de 500 galones (500CST) Tres Mezcladores Caframo (BDC-1850) (Rl, 18500961) (Pl, 18501148) (P2, 18501173) con eje e impulsor Mezclador Lightning (L1U08) (201550) Tres Intercambiadores de Calor (Gardner Machinery) (Rl, 01960763) (Pl, 01960764) (P2, 08950727) Tres Recirculadores de Fluido con Chaqueta 12KW (Watlow, P1659/98MX BLC726C3S20) Tres Bombas de Recirculación (Sta-Rite, JBHD-62S, C48J2EC15) Bomba Peristáltica Digital Masterflex (A94002806) Bomba Peristáltica Masterflex (B96002074) Unidad de Filtración Neutsche (70-2038, 43421-1) Dos Unidades de Filtración Buchner (Zll, 624-6, Z10, 441-8) Bomba de Vacío Siemens (F2BV2) Tanque de Recolección Revestido de Vidrio de 60 galones con tapa (86854, E164-1186) Compresor de Aire (DF412-2) (9502312538) Controlador de Flujo (3-5500) (69705069190) Seis Controladores de Lote (3-5600) (#1,69705069191, #2,69705069199, #3,69705069194, #4,69705058829, #5,69705058805, #6,69705069195) Seis Sensores de Flujo (#1, 69704295165, #2, 6970424995, #3, 69704024994, #4, 69704025027, #5, 69612178606, #6, 69703120990) Cuatro Bombas de Diafragma (Ml) Cuatro Supresores de Ondas (A301H) (#2, 15557, #3, 15561, #4, 15558, #5, 15559) Cuatro Reguladores de Aire (CFR10) Cuatro Válvulas Solenoides (utilizadas con los reguladores de aire) Cuatro Sensores de Flujo Lento (FS 500) P1659/98MX Filtros de Aire / Reguladores (T1R) PTFE / F06R113AC Material Filtrante, Polipropileno (7211-1) Material Filtrante, Grado Whatman 52 Tubería PharMed (-18, -82, -90) Medidor de pH; Hanna 9321 (1303675) & Orion 620 (001911) Espectrofotómetro 20 (3MU7202070) Estufa de Vacío Fisher Scientific (9502-033) Estufa de aire a presión VWR 1370 FM (1370FM) Mascarilla para Polvo/Neblina Molino para Laboratorio Tho as Wiley (3375-E10) Mezclador Peterson-Kelley (Blendmaster, C416578) Balanza Ohaus TS4KD Balanza Ohaus IP15KS Balanza Mettler AG 104 Balanza AnD HV150KA1 Balanza Fairbanks H90-5150 Impresora Multifuncion AD-8121 Impresora de Matriz de Puntos Citizen iDP 3540 HPLC Hewlett Packard (1050) Limpiador Ultrasónico (8892-DTH, QCC9601 005C) Registrador de Temperatura tipo Termopar K (KTx, 6292753, 6355146) Matraces Erlenmeyer (8L, 6L, 4L, 1L) Vasos de Precipitado (8L, 6L, 500mL, 250 mL) Bombonas (4L, 10L, 50L) P1659/98MX Tambores HDPE (55 galones, 100 galones) Matraces Volumétricos (100 mL) Embudo de plástico Pipetas Pasteur & Pipetas de Bulbo y Volumétricas (lOmL, 5mL) & Bulbo Fuelles (25 mL, 50 mL) Papel para pesar Espátulas Material de Empaque (recipientes, tapas, etiquetas) Soluciones de Materia Prima SÍNTESIS: Etapa 1 Síntesis de ácido 2-amino-5-dimetilaminofenil tiosulfónico: • Comprobar la integridad del sistema de agua USP. Añadir al reactor (28,000 g + 100.0 g) de Agua Purificada Grado USP y agitar a 190 + 10 RPM. Registrar la conductividad del agua USP en el momento que esta se suministró. • Adicionar (5.128 mol, 720.0 g + 3.0 g) de N,N-dimetil- 1, 4-fenilendiamina. El material debe adicionarse como polvo (no en trozos) . Agitar 10 minutos (+ 5 minutos) .

• Añadir (6 N, 1136.9 g + 5.0 g) de ácido clorhídrico. Agitar 1 minutos (+ 5 minutos) . • Asegurar que el medidor de pH está calibrado según SOP # LM-007. Tomar una muestra de aproximadamente 10 mL de la mezcla de reacción, utilizando un aditamento P1659/98MX muestreador de plástico. Marcar la muestra lote#.IPSla. Medir el pH y registrar. El pH debe ser 2.8 - 3.8 @ 25°C + 5°C. • Añadir (4328.0 g + 21.0 g) de solución de sulfato de aluminio hexadecahidratado. Agitar 10 minutos (+ 5 minutos) a 275 + 10 RPM. • Añadir (3641.5 g + 18.0 g) de solución de cloruro de cinc. Enfriar a 4°C + 1°C. • Una vez que la temperatura (PVl)es de 4°C + 1°C adicionar (6532.4 g + 32.0 g) de solución de dicromato de potasio durante un período de (+ 5 minutos) . Cuando se termina la adición agitar 20 minutos (+ 5 minutos) y entonces cambiar el Punto de ajuste (SPl) a 25°C del Menú Principal. • Cuando la temperatura ha alcanzado 20.0°C + 3°C adicionar (3570.2 g + 18.0 g) de solución de tiosulfato de sodio pentahidratado. Agitar la solución a 25°C durante 30 minutos (+ 5 minutos) . • Cambiar el Punto de ajuste a 60°C. Cuando la temperatura (PV1) alcanza 60°C + 3°C dejar la mezcla de reacción 5 minutos (+ 3 minutos) en agitación y cambiar el Punto de ajuste en el Controlador LFE a 10.0. • Una vez gue la temperatura ha alcanzado 13.0°C + 20°C tomar una muestra de aproximadamente 10 mL de la mezcla de reacción, utilizando un aditamento muestreador de P1659/98MX plástico. Marcar la muestra lote #.IPSlb. Medir el pH y registrar. El pH debe ser 3.1-4.1 @ 25°C + 5°C.

SÍNTESIS: Etapa 2 Síntesis de ácido Indamina Tiosulfónico • Pesar (604.4 g + 2.5 g) de o-toluidina y enfriar a 18°C + en un baño de hielo. Añadir lentamente (6N, 1230.7 g + 5.0 g) de ácido clorhídrico a la o-toluidina. Quitar el clorhidrato de o-toluidina del baño de hielo y dejar enfriar la solución a 38°C + 3°C. Añadir la solución a la mezcla de reacción y agitar 5 minutos (+ 3 minutos) . • Adicionar (6532.4 g + 32.0 g) de solución de dicromato de potasio durante un periodo de 30 minutos (+ 5 minutos) . Cuando se termina la adición agitar 10 minutos (+ 5 minutos) . • Cambiar el Punto de ajuste (SP1) del controlador a 60.0. Una vez que la temperatura de la mezcla de reacción alcanza 60.0°C + 3°C dejar la mezcla en agitación por 25 minutos (+ 5 minutos) . Se formará un precipitado que contiene verde indamina. • Utilizando una pipeta tomar una muestra de aproximadamente 10 mL de la mezcla de reacción. Marcar la muestra lote #.IPS2. Registrar el color de la solución.

P1659/98MX SÍNTESIS: Etapa 3 Síntesis de Azul de Toluidina 0 y Azul de Toluidina 0 Sal doble de Cloruro de Cinc • Poner el Punto de ajuste del controlador LFE a 7.0. Una vez que la mezcla de reacción alcanza la temperatura de .0°C + 3°C adicionar (6532.4 + 32.0 g) de solución de dicromato de potasio durante un periodo de 20 minutos (+ 5 minutos) . Cuando se completa la adición agitar 20 minutos . • Añadir (5225.9 g + 26.0 g) durante un período de 20 minutos (+_ 5 minutos) . Cuando la adición se termina agitar 20 minutos (+ 5 minutos) . • Tomar una muestra de aproximadamente 10 mL de la mezcla de reacción, utilizando una pipeta. Marcar la muestra lote #.IPS3. • Añadir (3641.5 g + 18.0 g) de solución de cloruro de cinc. Agitar 20 minutos (+ 5 minutos) a 350 + 10 RPM. • Añadir (2122.8 g + 10. o g) de sulfato de cobre pentahidratado. Agitar 15 minutos (+ 5 minutos). • Tomar una muestra de aproximadamente 10 mL de la mezcla de reacción, utilizando una pipeta. Marcar la muestra lote #.IPS4. • Cambiar el Punto de ajuste (SP1) del controlador a 100.0. Una vez que la temperatura de mezcla de reacción alcanza 67.0°C + 3°C empezar a añadir solución de ácido sulfúrico P1659/98MX hasta un pH de 2.9 + 0.3 mediante la adición de alícuotas (500 mL, 250, 125 mL, etc.). Agitar de 5 a 10 minutos después de cada adición y medir el pH. • Una vez que la temperatura de la mezcla de reacción alcanza 100.0°C + 3°C dejar la mezcla en agitación por 35 + 5 minutos. • Cambiar el Punto de ajuste (SP1) del controlador a 35.0. Una vez que la temperatura de la mezcla de reacción alcanza 70.0°C + 3°C tomar una muestra de aproximadamente 10 mL de la mezcla de reacción, utilizando una pipeta. Marcar la muestra lote #.IPS5. • Cambiar el Punto de ajuste (SPl) del controlador a 2.5. Enfriar a 2.5°C en 4 horas y mantener a 2.5°C + 2.0°C durante 4 a 18 horas. • Tomar una muestra de aproximadamente 10 mL de la mezcla de reacción, utilizando una pipeta. Marcar la muestra lote #.IPS6. Registrar el color de la solución. Medir el pH y registrar. Filtrar la muestra a en papel filtro de 0.45 mieras. Tomar aproximadamente 100 miligramos del precipitado y disolverlo en aproximadamente 100 mL de agua HPLC. Filtrar la solución en papel filtro de 0.45 mieras. Etiquetar la solución Lote#.IPS7 y analizar la muestra por el Método de Análisis RP-HPLC para Azul Toluidina O. Ver Ejemplo 3. Registrar los resultados.

P1659/98MX Purificación: Etapa 1 • Filtrar la mezcla de reacción en un material filtrante adecuado (Whatman Grado 52) . • Cuando el reactor está vacío pesar 24.0 kg + 150.0 g de solución NaCl 30% y añadir 24.0 kg + 150-0 g de agua USP (registrar la conductividad del agua suministrada) . Cerrar la válvula inferior del reactor y adicionar a este la solución de NaCl al 15%. Agitar la solución levemente. Cuando se termina la filtración adicionar la solución de NaCl a la unidad de filtración para enjuagar la torta de filtrado. Recoger el filtrado en el mismo recipiente y etiquetar lote # . HW1 (desecho peligroso 1). • Procesar el filtrado (lote#.HWl) según los procedimientos de disposición de desechos. • Revisar las condiciones del tanque de purificación con chaqueta, revestido de vidrio, de 100 galones #1 y asegurarse que se ha etiquetado adecuadamente como LIMPIO, con fecha y firma. Equipar el tanque con tapa de HPDE, agitador Caframo, eje agitador, propulsor y termopar inserto en un receptor de plástico para termopar. Verificar que la válvula inferior esté cerrada y que la salida esté tapada. • Etiquetar el tanque con Lote#.PlA (Purificación ÍA) • Pesar 190.0 kg + 1.0 kg de agua USP en un recipiente de HDPE (registrar la conductividad del agua suministrada) y P1659/98MX transferirla al Tanque de Purificación 1. Agitar la mezcla a 350 RPM. Una vez que se termina el lavado de la torta de filtración con NaCl adicionar ésta al Tanque de Purificación 1 mientras se agita. • Agitar la mezcla de 2 a 4 horas. Tomar una muestra (a través de la válvula inferior) de aproximadamente 50 mL. Marcar la muestra lote#.IPS8. Registrar el color de la solución. • Fijar el controlador LFE del Tanque de Purificación 1 a 75.0 (SP1) . • Cuando la temperatura de la mezcla (PVl) alcanza 75.0°C + 3°C cambiar el Punto de ajuste en el controlador a 40.0.

• Dejar agitar la mezcla a 40°C y 350 RPM de 12 a 36 horas.

• Tomar una muestra ( a través de la válvula inferior) de aproximadamente 50 mL. Marcar la muestra lote #.IPS9.

Registrar el color de la solución. Medir el pH y registrar. Medir 1.0 mL de la muestra con una pipeta de 1 mL y diluir a 100 L en un matraz volumétrico de 100 mL. Etiquetar la muestra lote #.IPS9A. Tomar entonces 10.0 mL de esta solución con una pipeta de 10 mL y diluir a 100 mL en un matraz volumétrico de 100 mL. Etiquetar la muestra lote#.IPS9B. Medir la absorbancia de esas muestras utilizando el espectronic 20+. Registrar los resultados. La absorbancia de la muestra 9B deberá ser > 0.220.

P1659/98MX Purificación: Etapa 2 • Filtrar la mezcla a través de un medio filtrante en la unidad de filtración. Recoger el filtrado en un recipiente de HDPE Tarado con tapa. • Revisar las condiciones del tanque de purificación con chaqueta, revestido de vidrio, de 100 galones #2 y asegurarse que se ha etiquetado adecuadamente como LIMPIO, con fecha y firma. Equipar el tanque con tapa de HPDE, agitador Caframo, eje agitador, propulsor y termopar inserto en un receptor de plástico. Verificar que la válvula inferior esté etiquetada como LIMPIO, cerrada (posición horizontal) y que la salida esté tapada . • Etiquetar el tanque con Lote # . P2A (Purificación 2A) , fecha y firma. • Cuando la filtración se termina pesar el recipiente y la solución. Restar el peso de tara. Registrar el peso de la solución. Calcular el volumen de la solución. (peso de soln TBO g) (100.0 L soln TBO / 100.42 g soln TBO)= ml de soln TBO • Etiquetar la torta de filtración lote #.HW2 (desecho peligroso 2) y procesarlo según los procedimientos para disposición de desechos. • En un recipiente limpio de HDPE pesar solución de NaCl P16S9/98MX 30% en cantidad igual al volumen de solución registrado arriba, utilizando la fórmula siguiente: (ml de soln TBO) (116.91 g soln NaCl/ 100.0 ml soln NaCl) = g de soln NaCl • Muestrear aproximadamente 10 mL del filtrado y medir el pH. Etiquetar lote #.IPS10. El pH debe ser 3.0 - 4.0. Transferir el filtrado (por peso) al Tanque de Purificación 2. Agitar la solución a 350 RPM. • Añadir (1636.3 g + 6.5 g) de solución de cloruro de cinc. • Transferir la solución de NaCl (por peso) al Tanque de Purificación 2. • Fijar el controlador LFE del Tanque de Purificación 2 a 75.0 (SP1) . • Cuando la temperatura de la mezcla (PVl) alcanza 75.0°C + 3°C cambiar el Punto de ajuste en el controlador a 5.0.

• Enfriar a 5°C en 6 horas y mantener a 5°C + 4.0°C de 4 a 24 horas. • Tomar una muestra de aproximadamente 50 mL (a través de la válvula inferior). Marcar la muestra lote #.IPS11.PT2.

PROCESAMIENTO i. Filtración • Filtrar la mezcla a través de un medio de filtración tarado (Whatman Grado 52) en la unidad de filtración. • Pesar 12 kg + 50 g de solución de cloruro de sodio al 30% P1659/98MX y diluir con 12 kg + 50 g de agua USP (registrar la conductividad del agua suministrada) . Lavar la torta de filtración con la solución de NaCl al 15% adicionando la solución directamente al buchner. Cuando se termina la filtración remover cuidadosamente el papel filtro que contiene el producto azul toluidina O. • Procesar el Lote # . HW3 (Desecho Peligroso 3) según los procedimientos de disposición de desechos. ii. Secado • Colocar el producto TBO en la estufa y secar a 50.0°C + 3.0°C durante 5 + 1 horas. Etiquetar la estufa lote #.

PRE-SECADO. iii. Pesado • Remover el producto y pesar el Azul de Toluidina O y filtrar. Restar el peso del filtrado y registrar el peso del TBO. • Utilizar una espátula de acero inoxidable para remover cuidadosamente el producto del papel filtro. Usar mascarilla Polvo/Neblina. Pesar el Azul Toluidina. iv. Molienda • Transferir el producto al ÁREA DE TERMINADO DEL AZUL TOLUIDINA O. Revisar las condiciones del Molino para Laboratorio Thomas Wiley y asegurarse que se ha etiquetado adecuadamente como LIMPIO con fecha y firma. Usar el tamiz de 0.5 mm. Colocar un recipiente limpio en P1659/98MX el canal de distribución. La puerta de la cámara debe estar cerrada y asegurada. • Cerrar la ventanilla corrediza del fondo de la tolva, quitar la tapa de la tolva y adicionar la muestra. Tapar la tolva. Poner en marcha el molino y abrir la ventanilla corrediza ligeramente. Alimentar muestra en la cámara del molino de manera suficientemente lenta para que el molino no disminuya la velocidad ni se atasque. • Una vez que se termina la molienda remover cuidadosamente el recipiente del canal de distribución. v. Mezclado • Revisar las condiciones del Mezclador Patterson-Kelly Lab y asegurarse de que se ha etiquetado adecuadamente como LIMPIO con fecha y firma. • Transferir el producto Azul Toluidina O al recipiente mezclador y cerrar la tapa. Fijar el cronómetro a 15 + 5 min. vi . Prueba • Muestrear el producto para prueba. Analizar la muestra por el Método de Análisis RP-HPLC para Azul Toluidina O.

Registrar los resultados.

P1659/98MX EJEMPLO 2 Protocolo de Prueba Clínica Preparación de las Soluciones para Prueba Clínica Este ejemplo ilustra el uso del producto TBO del Ejemplo 1 en la identificación de displasia oral. El producto TBO del Ejemplo 1, agente saborizante de frambuesa (IFF Frambuesa IC563457), agente de regulación acetato de sodio trihidratado y conservador H202 (30% USP) (Ver Patente de los Estados Unidos 5,372,801) se disuelven en agua purificada (USP) , ácido acético glacial y alcohol etílico SD 18 para producir una solución de prueba para TBO, que tiene la composición indicada en la Tabla A: TABLA A Componente Peso Producto TBO 1 , . 00 Sabor . 20 Agente de Regulación 2 , . 45 Conservador . 41 Ácido acético 4 . . 61 Alcohol etílico 7 . . 48 Agua 83 . . 85 100 . . 00 Se prepararon soluciones de prueba para pre y post enjuague, al 1% en peso de ácido acético en agua P1659/98MX purificada, benzoato de sodio como conservador y saborizante de frambuesa.

Protocolo Clínico El paciente se cubre con una tela para proteger la ropa. Para que el paciente escupa se le proporciona una taza de 10 oz, la cual se puede desechar en el recipiente de residuos infecciosos o su contenido vaciarse directamente en el centro del drenaje del lavabo para evitar mancharlo. Las superficies u objetos del entorno que puedan ser manchados se cubren o se quitan del área de prueba . El examen visual del cáncer oral se lleva a cabo sin utilizar ningún instrumento que pueda causar rasguños o cortadas en los tejidos suaves. Se hacen anotaciones de la apariencia pre-tinción de los tejidos suaves y de los dientes . El paciente se enjuaga la cavidad bucal con aproximadamente 15 ml de la solución de pre-enjuague durante 20 segundos aproximadamente y escupe, para eliminar el exceso de saliva y proporcionar un entorno oral consistente. Este paso se repite después con solución pre-enjuague adicional. Después durante 20 segundos el paciente se enjuaga y hace gárgaras con agua y escupe.

P1659/98MX Después el paciente durante un minuto se enjuaga y hace gárgaras con 30 ml de la solución de prueba TBO y escupe . Entonces el paciente durante 20 segundos se enjuaga con 15 ml de la solución post-enjuague y escupe. Este paso se repite después. Entonces el paciente durante 20 segundos se enjuaga y hace gárgaras con agua y escupe. Este paso se repite después. Entonces se hacen observaciones de la cavidad bucal, usando las técnicas apropiadas para el examen de tejido suave, que incluyen retracción, iluminación balanceada y amplificación, si es necesario. Se hacen y se registran observaciones de la ubicación, tamaño, morfología, color y características superficiales de lesiones sospechosas que tengan retención de coloración azul. Para reducir los falsos positivos, se hace regresar al paciente después de 10-14 días para repetir el protocolo de arriba. Este período deja tiempo para la cicatrización de cualquier lesión ulcerativa o traumática o irritación etiológica durante el primer examen. Una tinción positiva durante el segundo examen de un área sospechosa detectada en el primero, se considera como indicación de tejido canceroso o precanceroso y se hace una biopsia para P1659/98MX confirmar esta conclusión. Lesiones eritroplásicas tempranas se tiñen de azul, frecuentemente en un patrón punteado o desigual. Sin embargo, es normal que la tinción sea retenida por las grietas papilares irregulares en el dorso de la lengua, lo cual no es una indicación positiva. Otras áreas que retienen la tinción azul, pero no se consideran positivas incluyen la placa dental, los márgenes gingivales de cada diente, tinción difusa del paladar suave a causa del colorante transferido desde el dorso de la lengua y lesiones ulcerativas que son distinguidas fácilmente. En todo caso, cuando una lesión es altamente sospechosa, pero no tiñe positivamente con esta prueba, no obstante, es indispensable gue se tome una biopsia.

Ejemplo 3 Procedimiento HPLC Este ejemplo describe un procedimiento para análisis de muestras de TBO, para usarse en pruebas de identificación, ensaye y pureza.

Equipo y Suministros Acetonitrilo, Grado HPLC Ácido acético Glacial, grado reactivo Acetato de Amonio, grado reactivo P1659/98MX Agua Deionizada, adecuada para análisis por HPLC Medidor de pH, con reguladores estándar pH 4.0 y 7.0 Material de vidrio para laboratorio, entre los que se incluyen matraces y pipetas volumétricos Baño Ultrasónico Balanza Analítica Agitador Magnético Helio Comprimido Aparato de filtración con filtros de nylon de 0.45 mieras Jeringa 100 µL Cromatóqrafo HPLC y Accesorios, entre los que se incluyen Bombas Hewlett Packard Series 1050 o equivalentes con capacidad para flujo isocrático de alta presión Detector con Diodo Hewlett Packard Series 1050 o detector de longitud de onda UV equivalente Hewlett Packard Vectra Series 3 con Unidad de Disco (controlador computarizado) con monitor Ultra VGA 1280 e impresora láser o registrador de integración equivalente Columna de HPLC Prodigy, 5µ, QDS (3) 100A°, 2.5 cm X 4.6 mm, o equivalente . Inyector Fixed-loop (10 o 20 µL) P1659/98MX Calentador de Columna Preparación de la Fase Móvil Preparar un litro de solución de acetato de amonio 0.01 M por transferencia de 0.77 g de acetato de amonio a un matraz volumétrico de 1000 mL. Añadir agua, mezclar para disolver y aforar con agua. Transferir la solución de acetato de amonio 0.010 M a un matraz Erlenmeyer y agitar con agitador magnético. Utilizar un medidor de pH previamente calibrado con los reguladores de pH 4.0 y 7.0, ajustar con ácido acético el pH de la solución entre 3.3 y 3.6. Filtrar la solución a través de un filtro de 0.45µ . Filtrar el acetonitrilo en un filtro de nylon de 0.45µ, utilizando un aparato de filtración Millipore y añadir exactamente 250 mL a la solución acuosa de acetato de amonio agitada. Colocar este depósito de la fase móvil en posición de acceso para la bomba de HPLC y purgar con helio durante 5 o 10 minutos.

Preparación de las Muestras de TBO Pesar con exactitud aproximadamente 50 mg de muestra de TBO, transferir a un matraz volumétrico de 100 mL y diluir con agua hasta la marca. Tapar el matraz, aplicar ultrasonido durante 30 minutos y mezclar. Esta es una solución patrón de aproximadamente 0.5 mg/mL.

P1659/98MX Transferir 10.0 mL de la solución patrón a un matraz volumétrico de 100 mL, diluir con agua hasta la marca y mezclar. Esta solución de TBO para trabajar diluida aproximadamente a 0.05 mg/ml se etiqueta adecuadamente.

Condiciones Cromatográficas Volumen de inyección - 10 o 20 µL Velocidad de flujo - cerca de 1.5 mL/minuto Temperatura de la columna - 40 °C Longitud de onda del detector - 254 nm Ajustes de sensibilidad y atenuación - apropiados para el instrumento utilizado Integración - Área de respuesta Análisis de las Muestras por HPLC Establecer y permitir que en el cromatógrafo HPLC se equilibre con el flujo de la fase móvil. Se usan pruebas de adecuación del sistema como las de la Farmacopea de los Estados Unidos USP XXIII para verificar la precisión y exactitud de los datos obtenidos por HPLC. Para cada ensayo, evaluar los parámetros siguientes: Precisión: Se comparan un mínimo de cinco inyecciones de la muestra que se trabaja. La Desviación Estandard Relativa (RSD) debe ser igual o menor de 2%. Se P1659/98MX realizan seis inyecciones si la RSD es mayor de 2%, pero menor de 3.0% para las áreas combinadas de los picos 5-8. Resolución: Calcular la resolución de la línea base de los picos 7 y 8 (los picos mayores) en un cromatograma de la muestra, por la ecuación siguiente: R = 2 (t, - t?) wx + w2 donde tx = tiempo de retención, en mm, del pico 7 t2 = tiempo de retención, en mm, del pico 8 wx = amplitud del pico, en mm, del pico 7 w2 = amplitud del pico, en mm, del pico 8 La resolución entre los picos 7 y 8 debe ser mayor de 1.5 Coleo: Medir la simetría de los picos para asegurar gue la cuantificación del área bajo el pico es exacta. Calcular el factor de coleo (T) para los picos 7 y 8 en un cromatograma de la muestra, por la siguiente ecuación: T = W0, 05 / 2f donde W, 0, 05 amplitud del pico determinada a 5% de la altura del pico a partir de la línea base del pico f = distancia entre pico máximo y pico frontal en W 0, 05 T debe ser menor que un factor de 3. Registrar los cromatogramas y determinar el área P1659/98MX de respuesta de los picos principales (5, 6, 7 y 8), así como todos los picos de impurezas que se detecten (todos los picos diferentes al los picos frontales del disolvente) al aparecer en el cromatograma.

Cálculos y otras Determinaciones por HPLC Identidad (Substancia del medicamento TBO y medicamento) : El perfil cromatográfico de la muestra de la preparación puede mostrar el mismo perfil general (presencia e intensidades de los picos) que el del cromatograma representado en la Fig. 2. Substancias Relacionadas (Substancia del medicamento) : La cantidad de cada pico de impureza (las impurezas conocidas designadas como picos 1, 2, 3 y 4 más cualquier otro pico de impureza) se calcula como un área porcentual contra el área total de todos los picos en el cromatograma . Ensayo de la substancia del medicamento TBO: El porcentaje de cada uno de los cuatro picos principales de TBO (picos 5-8) se determina como para las impurezas, p.ej., Pureza por HPLC = suma de áreas de los picos 5-8 X 100 suma de todas las áreas de los picos P1S59/98MX Habiendo descrito mi invención en términos tales que permitan a aquéllos expertos en la materia entenderla y llevarla a la práctica, habiendo identificado en el momento presente las modalidades de mayor preferencia de la misma, expongo las reivindicaciones: P1659/98MX

Claims (12)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES : 1. Una nueva composición de materia gue comprende: (A) los isómeros conformacionales del azul de toluidina O; y (B) los derivados de N-demetilación de dichos isómeros, la proporción de las áreas combinadas de los picos a 254 nm en HPLC que representan dichos isómeros con respecto a las áreas combinadas de los picos que representan dichos derivados de N-demetilación es por lo menos 6:1. 2. Una nueva composición de una materia, que comprende : (A) un primer grupo de componentes, que comprende al isómero conformacional de azul de toluidina O que tiene el grupo metilo del anillo en la posición -2, el derivado de N-demetilación del mismo y el derivado de N, N-demetilación del mismo; y (B) un segundo grupo de componentes, que comprende el isómero conformacional del azul de toluidina O que tiene el grupo metilo del anillo en la posición -4 el derivado de N-demetilación del mismo y el
2. P1659/98MX derivado de N, N-demetilación del mismo; la proporción de las áreas combinadas de los picos a 254 nm en HPLC que representa dicho primer grupo con respecto a las áreas combinadas de los picos en HPLC que representan dicho segundo grupo es por lo menos aproximadamente 2.5:1. 3. Una nueva composición de una materia, que comprende los isómeros conformacionales del azul de toluidina 0, en la cual el isómero que tiene el . grupo metilo del anillo en la posición 2- (pico 8) comprende por lo menos 58% del contenido total de colorante orgánico de dicha composición. 4. En un método para identificación de tejido displásico, el paso de aplicar a tejido humano oral la composición de la reivindicación 1 en un vehículo líquido. 5. En un proceso para fabricar azul toluidina 0
3. ("TBO"), proceso que incluye los pasos de: (A) oxidar N,N-dimetil-p-fenilendiamina en una primera mezcla de reacción, para formar un primer intermediario, ácido 2-amino-5-dimetilaminofenil tiosulfónico, (B) oxidar dicho primer intermediario y condensar el producto de oxidación en una segunda mezcla de reacción con o-toluidina, formar un segundo intermediario, ácido indamina-tiosulfónico, (C) oxidar dicho segundo intermediario para cerrar el
4. P1659/98MX anillo de indamina del mismo, formar un producto de reacción que contiene TBO disuelto en una tercera mezcla de reacción, (D) introducir un reactivo acomplejante en dicha tercera mezcla de reacción, para formar un producto
5. Complejo-TBO disuelto en dicha tercera mezcla de reacción, (E) precipitar dicho producto Complejo-TBO de dicha tercera mezcla de reacción, y (F) separar dicho producto Complejo-TBO, que contiene los isómeros conformacionales de TBO y los derivados de N-demetilación y N, -demetilación de los mismos, de dicha tercera mezcla de reacción, el proceso mejorado que comprende introducir dicho reactivo acomplejante a la mezcla de reacción antes de la formación de dicha tercera mezcla de reacción.
6. 6. El proceso de la reivindicación 5 en el cual la temperatura de la mezcla de reacción se mantiene no más de aproximadamente 10 °C.
7. 7. El proceso de la reivindicación 5 en el cual el pH de las mezclas de reacción se mantiene en el intervalo de aproximadamente 2.8 - 3.8 en la primera mezcla de reacción, aproximadamente 3.1 - 4.1 en la segunda mezcla de reacción y aproximadamente 3.0 en la tercera mezcla de reacción. P1659/98MX
8. 8. El derivado N-demetilado de uno de los isómeros conformacionales del Azul de toluidina 0.
9. 9. El derivado N, N-demetilado de uno de los isómeros conformacionales del Azul de toluidina 0.
10. 10. En un método HPLC para el análisis de un producto azul toluidina O, dicho método incluye hacer una fase móvil hacer una solución de una muestra de TBO equilibrar una columna de HPLC con el flujo de la fase móvil, y inyectar la solución de la muestra en la columna HPLC, la mejora para la identificación de los componentes colorantes de la muestran y para el ensaye y determinación de la pureza de dicha muestra, dicha mejora comprende hacer dicha fase móvil como una composición que contiene una sal soluble en agua de un ácido orgánico.
11. 11. El proceso de la reivindicación 5 el cual incluye las etapas de introducir una fuente de iones tiosulfato en dicha primera mezcla de reacción, mientras mantiene la temperatura de dicha primera mezcla de reacción en una temperatura no mayor de aproximadamente 10°C.
12. 12. El proceso para sintetizar ácido 2-amino-5-dimetilaminofenil tiosulfónico, que comprende las etapas de oxidar N,N ' -dimetil-p-fenilendiamina en presencia de una P1659/98MX fuente de iones tiosulfato, mientras se mantiene la temperatura de la mezcla de reacción a no más de aproximadamente 10°C. P1659/98MX RESUMEN DE LA INVENCIÓN Los derivados de N-demetilación y N,N-demetilación de los dos isómeros conformacionales de azul de toluidina 0 ("TBO") se han sintetizado, aislado e identificado. Una composición de tinción biológica in vivo incluye los isómeros conformacionales de TBO y esos derivados de N- y N, N-demetilación. La proporción de esos isómeros a los derivados de demetilación es por lo menos 6:1. Un método mejorado para detectar tejido displásico oral, incluye la aplicación en este tejido de tales productos de TBO, en un vehículo líquido. Un proceso para preparar productos de TBO incluye (1) oxidar N,N-dimetil-p-fenilendiamina para formar un intermediario ácido 2-amino-5-dimetilaminofenil tiosulfónico, (2) oxidar este intermediario y condensar el producto de oxidación con o-toluidina, formar el ácido indamina tiosulfónico y (3) oxidación posterior del intermediario indamina para formar un producto de reacción que contiene TBO, el cual se precipita de la mezcla de reacción como un complejo, del cual se separa el producto de TBO final. El agente acomplejante se añade a la mezcla de reacción al menos antes de la etapa final de oxidación, de preferencia antes de la segunda etapa de oxidación. P1659/98MX Un método HPLC para caracterizar los productos de TBO que contienen los isómeros conformacionales de TBO y sus derivados de N, N-demetilación. La fase móvil contiene una solución acuosa de un compuesto orgánico ácido. P1659/98MX