MXPA98006892A - Compuestos relacionados a la familia de los amidinios, composiciones farmaceuticas que los contienen y sus aplicaciones - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere:Ver formula (III)La presente invención se refiere además a la composiciones farmacéuticas correspondientes,útiles principalmente en terapia génica para la transferencia de genes terapéuticos en las células.

Description

COMPUESTOS RELACIONADOS A LA FAMILIA DE LOS AMIDINIOS, COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS QUE LOS CONTIENEN Y SUS APLICACIONES DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a los nuevos compuestos emparentados a la familia de los amidinios en particular los guanidinios, a las composiciones farmacéuticas que los contienen y a sus aplicaciones. De manera más precisa, la presente invención se refiere a los compuestos de la fórmula general I y a sus sales en la cual: -Rl representa un derivado del colesterol o un grupo alquila ino-NR ' R' ' con R' y Rt ' que representan independientemente uno del otro un radical alifático, saturado o no, lineal o ramificado de 12 a 22 átomos de carbono, REF. 27885 R2 y R3 representan independientemente uno del otro un átomo de hidrógeno o un grupo de la fórmula general II con al menos uno de entre ellos diferente de un átomo de hidrógeno, -[(CH2)n—N m-R5 II R4 en la cual: - n y representan independientemente uno del otro y de manera distinta entre los grupos R2 y R3 un número entero comprendido entre 0 y 4, - R4 y R5 representan independientemente uno del otro un átomo de hidrógeno o un grupo de la fórmula III en la cual p y q representan, independientemente uno del otro un número entero comprendido entre 0 y 4, y r es igual a 0 ó 1, con r igual a 1 X representa un grupo NH y x es pues igual a l ó X representa un átomo de azufre y x es pues igual a 2 y Con p, q y r que pueden variar independientemente entre los grupos R4 y R5. A manera de subfamilia preferida, se citaran más particularmente en el marco de la presente invención los compuestos de la fórmula general I en la cual R2 o R3 representan, independientemente uno del otro, un átomo de hidrógeno o un grupo de la fórmula IV en la cual n, y p son como se definen anteriormente y R4 representa un átomo de hidrógeno o un grupo de la fórmula V con q y r definidos como se describe anteriormente, y con m, n, p, q y r que pueden variar de manera independiente entre los diferentes grupos R2 y R3. Estos nuevos productos de la fórmula general (I) pueden presentarse bajo la forma de sales no tóxicas y farmacéuticamente aceptables. Estas sales no tóxicas comprenden las sales con los ácidos inorgánicos - (ácidos clorhídrico, sulfúrico, bromhídrico, fosfórico, nítrico) o con los ácidos orgánicos (ácidos acético, propiónico, succínico, maléico, hidroximaléico , benzoico, fumárico, metansulfónico u oxálico) o con las bases inorgánicas (sosa, potasa, litina, cal) u orgánicas (aminas terciarias como la trietilamina, piperidina o bencilamina) . A manera representativa de los compuestos de acuerdo a la invención se pueden citar más particularmente los compuestos de las subfórmulas generales siguientes: (H2N) 2+C-NH- (CH2) 2-NH-C00-R1 Vi [ (H2N)2+C-NH-(CH2)3] [ (H2N)2C+-NH- (CH2) 4]-N-COO-Rl VII [ (H2N) 2+C-NH- (CH2) 2] 2-N- (CH2 ) 2-NH-COO-Rl VIII [ (H2N) 2+C- (CH2) 2J2N-C00-R1 IX [ [ (H2N) 2 +C- (CH2) 2] 2-N- (CH2) 2] 2N-COO-RI X en las cuales Rl posee la definición precedente . A manera representativa de los guanidinios y amidinios reivindicados, se pueden citar más particularmente los compuestos de las subfórmulas precedentes VII, VIII y IX con Rl que representa un grupo colesterilo. Los tres compuestos serán respectivamente identificados más adelante bajo la designación BGSC (bis-guanidino-espermidino-colesterol) y BGTC (bis-guanidino-tren-colesterol) y BADC (bis-clorhidrato de bis-amidinio-dietilentriamino-colesterol ) . Los compuestos reivindicados son más particularmente interesantes sobre el plano terapéutico por sus características no tóxicas y sus propiedades anfifílicas. Tomando en cuenta estas cualidades, éstos pueden ser utilizados principalmente para la formación de complejos de ácidos nucleicos en la perspectiva de una transfección celular de éstos. Estos compuestos pueden entonces ser ventajosamente empleados en terapia génica. Los compuestos VII (BGSC) y VIII (BGTC) son más particularmente ventajosos para la transferencia de genes in vivo. Estos dos compuestos se forman en complejo con el ADN y lo protegen contra la degradación debida a las variaciones de pH al momento del transporte hacia la célula a tratar. La invención se refiere pues a una composición farmacéutica que comprende al menos un compuesto de acuerdo a la invención. En una modalidad de realización preferida de la invención, el compuesto es el bis-guanidino-espermidino-colesterol (BGSC) y en otra modalidad preferida el compuesto es el bis-guanidino-tren-colesterol (BGTC) . La terapia génica tiene por objetivo principal el corregir las enfermedades genéticas asociadas a una falla de la expresión y/o de una expresión anormal, es decir deficiente o excesiva, de uno o varios ácidos nucleicos. Se intenta suplir este tipo de anomalías genéticas por medio de la expresión celular in vivo o in vitro de genes clonados . Hasta hoy, han sido propuestos varios métodos para la distribución intracelular de este tipo de información genética. Una de las tecnologías actualmente puestas en operación radica precisamente en el empleo de vectores químicos o bioquímicos. Estos vectores sintéticos tienen dos funciones principales, compactar el ADN a transfectar y promover su fijación celular así como su paso a través de la membrana plasmática y, según el caso, a través de las dos membranas nucleares. Los lípidos catiónicos cargados positivamente como el cloruro de N- ( 1- ( 2 , 3-dioleiloxi ) propil ( -N, N, N-trimetilamonio (DOTMA) han sido también propuestos. Ventajosamente, estos interactúan, bajo la forma de liposomas o de pequeñas vesículas, espontáneamente con el ADN, que es luego cargado negativamente, para formar los complejos lípidos-ADN, capaces de fusionarse con las membranas celulares, y permiten asi la distribución celular del ADN. No obstante, en el caso particular del DOTMA, su buena eficacia al nivel de la transfección permanece desgraciadamente asociada a una falta de biodegradación y a un carácter tóxico con respecto a las células . Desde el DOTMA, han sido desarrollados otros lípidos catiónicos sobre este modelo de estructura: el grupo lipofílico asociado a un grupo amino vía un brazo denominado "espaciador". Entre éstos, se pueden citar más particularmente aquellos que comprenden a manera de grupo lipofilico dos ácidos grasos o un derivado de colesterol y que incluyen, además, según el caso, a manera de grupo amino, un grupo amonio cuaternario. Los DOTAP, DOBT o el ChOTB pueden ser citados principalmente a manera representativa de esta categoría. de lípidos catiónicos . Por parte de su estructura química y su carácter biodegradable, los compuestos reivindicados responden precisamente a las exigencias requeridas para un vector de transfección de ácidos nucleicos. La presente invención considera pues igualmente cualquier aplicación de estos nuevos compuestos en la transfección in vitro, ex vivo y/o in vivo de células, y principalmente para la vectorización de ácidos nucleicos. Esta se refiere en particular a cualquier composición farmacéutica que comprenda, además de al menos un compuesto de acuerdo a la invención, un ácido nucleico. En las composiciones de la presente invención, el ácido nucleico asociado al menos a un compuesto reivindicado puede ser también un ácido desoxirribonucleico así como un ácido ribonucleico. Se puede tratar de secuencias oligonucleotídicas o polinucleotídicas de origen natural o artificial, y principalmente de ADN genómico, de ADNc, de ARNm, de ARNt, de ARNr, de secuencias híbridas o de secuencias sintéticas o semi-sintéticas . Estos ácidos nucleicos pueden ser de origen humano, animal, vegetal, bacteriano, viral, etc. Estos comprenden de preferencia un gen terapéutico. Otro objetivo de la invención radica pues en una composición farmacéutica que contiene además un ácido nucleico. Preferentemente, este ácido nucleico es ya sea un ácido desoxirribonucleico o bien un ácido ribonucleico. En una modalidad preferida de realización de la invención, el ácido nucleico incluye un gen terapéutico. En el sentido de la invención, por gen terapéutico se entiende principalmente cualquier gen que codifica para un producto proteico que tiene un efecto terapéutico. El producto proteico codificado de este modo puede ser una proteína, un péptido, etc. Este producto proteico puede ser homólogo frente a la célula objetivo (es decir un producto que es normalmente expresado en la célula objetivo mientras ésta no presenta ninguna patología) . En este caso, la expresión de una proteína permite por ejemplo paliar una expresión insuficiente en la célula o la expresión de una proteína inactiva o débilmente activa, en virtud de una modificación, o incluso de sobreexpresar dicha proteína. El gen terapéutico puede también codificar para un mutante de una proteína celular, que tiene una estabilidad acrecentada, una actividad modificada, etc. El producto proteico puede igualmente ser heterólogo frente a la célula objetivo. En este caso, una proteína expresada puede por ejemplo completar o aportar una actividad deficiente en - la célula, permitiéndole luchar contra una patología, o estimular una respuesta inmune. Entre los productos terapéuticos en el sentido de la presente invención, se pueden citar más particularmente las enzimas, los derivados sanguíneos, las hormonas, las linfocinas: interleucinas, interferones , TNF, etc. (Patente Francesa FR 9203120), los factores de crecimiento, los neurotransmisores o sus precursores o enzimas de síntesis, los factores tróficos: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/pleiotrofina, etc., la distrofina o una minidistrofina (Patente Francesa FR 9111947), la proteína CFTR asociada a la tnucoviscidosis , los genes supresores de tumores: p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc. (Patente Francesa FR 9304745), los genes que codifican para los factores implicados en la coagulación: Factores VII, VIII, IX, los genes que intervienen en la reparación del ADN, los genes suicidas ( timidina-cinasa, citosina-desaminasa) , los genes de la hemoglobina o de otros transportadores proteicos, los genes que corresponden a las proteínas implicadas en el metabolismo de los lípidos, de tipo apolipoproteína, elegidos entre las apolipoproteínas A- 1 , A-II, A-IV, B, C-I, C-II, C-III, D, E, F, G, H, J y apo(a), las enzimas del metabolismo como por ejemplo la lipoproteína-lipasa, la lipasa hepática, la lecitina-colesterol-aciltransferasa, la 7-alfa-colesterol-hidroxilasa, la ácido-fosfatídico-fosfatasa, o incluso las proteínas de transferencia de lípidos como la proteína de transferencia de esteres de colesterol y la proteína de transferencia de fosfolípidos, una proteína de unión de los HDL o incluso un receptor elegido por ejemplo entre los receptores LDL, receptores de los quilomicrones remanentes y los receptores depuradores, etc. El ácido nucleico terapéutico puede ser igualmente un gen o una secuencia antisentido, donde la expresión en la célula objetivo permite controlar la expresión de los genes o la transcripción de los ARNm celulares. Tales secuencias pueden, por ejemplo, ser transcritas en la célula objetivo en RN complementarios de los ARNms celulares, y bloquear así su traducción en proteína, según la técnica descrita en la Patente Europea EP 140 308. Los genes terapéuticos comprenden igualmente las secuencias que codifican para las ribozimas, que son capaces de destruir selectivamente los ARN objetivo (Patente Europea EP 321,201) . Como se indica anteriormente, el ácido nucleico puede igualmente poseer uno o varios genes que codifican para un péptido antigénico, capaz de generar en el hombre o en el animal una respuesta inmunitaria. En esta modalidad particular de puesta en operación, la invención permite pues la realización ya sea de vacunas o bien de tratamientos inmunoterapéuticos aplicados al hombre o al animal, principalmente contra los microorganismos, virus o cánceres. Se puede tratar principalmente de péptidos antigénicos específicos de virus de Epstein Barr, del virus HIV, del virus de la hepatitis B (Patente Europea EP 185 573), del virus de la pseudo-rabia, del "virus formador de sincitios", otros virus o incluso específicos de tumores (Patente Europea EP 259 212) . Preferentemente, el ácido nucleico comprende igualmente secuencias que permiten la expresión del gen terapéutico y/o del gen que codifica para el péptido antigénico en la célula o el órgano deseado. Se puede tratar de secuencias que son naturalmente responsables de la expresión del gen considerado, .mientras que estas secuencias son susceptibles de funcionar en la célula infectada. Se puede tratar igualmente de secuencias de origen diferente (responsables de la expresión de otras proteínas, o incluso sintéticas) . Principalmente, se puede tratar de secuencias promotoras de los genes eucariotes o virales. Por ejemplo, se puede tratar de secuencias promotoras provenientes del genoma de la célula que se desea infectar. De igual modo, se puede tratar de secuencias promotoras provenientes del genoma de un virus. A este respecto, se pueden citar por ejemplo los promotores de los genes E1A, MLP, CMV, RSV, etc. Además, estas secuencias de expresión pueden ser modificadas mediante la adición de secuencias de activación, de regulación, etc. Se puede tratar también de secuencias promotoras, inducibles o reprimibles . Por otro lado, el ácido nucleico puede igualmente poseer, en particular con dirección 5' o hacia arriba del gen terapéutico, una secuencia de señal que dirige el producto terapéutico sintetizado hacia las vías de secreción de la célula objetivo. Esta secuencia de señal puede ser la secuencia de señal natural del producto terapéutico, pero puede igualmente tratarse de cualquier otra secuencia de señal, funcional, o de una secuencia de señal artificial. El ácido nucleico puede igualmente poseer una secuencia de señal que dirige el producto terapéutico sintetizado hacia un compartimento particular de la célula. Los lípidos catiónicos descritos en la presente invención y, en particular el BGTC y el 3GSC, son capaces de formarse en complejo con el ADN, y representan una alternativa ventajosa para los vectores virales, para la transferencia de ácidos nucleicos de interés terapéutico, in vitro, ex vivo o in vivo. Debido al hecho de las propiedades químicas de los grupos guanidinio, y en particular de su pKa elevado, estos lípidos catiónicos son capaces de proteger las moléculas de ADN contra las degradaciones debidas a las variaciones del pH . Los resultados presentados en los ejemplos muestran que estos compuestos permiten la transfección de numerosos tipos celulares, con una gran eficacia. La eficacia de la transfección depende en particular de la relación lipido catiónico/ADN en los complejos formados. Una relación entre los dos compuestos particularmente favorable para la transfección, consiste en tener 6 a 8 grupos guanidinio por un grupo fosfato sobre el ADN. La eficacia de la transfección de los complejos lípido catiónico/ADN puede además ser mejorada mediante la adición de un lípido neutro y la formación de liposomas catiónicos. Estos liposomas son formados por un complejo entre el lipido catiónico y el lípido neutro. Este puede ser elegido entre: la dioleilfosfatidiletanolamina (DOPE), la oleil-palmitoilfosfatidiletanolamina (POPE) , - la di-es tearoil , -palmitoil, miristoil-fosfatidiletanolamina sus derivados N-metilados 1 a 3 veces; los fos fatidilgliceroles , - los diacilgliceroles , - los glucosildiacilgliceroles , - los cerebrósidos (principalmente tales como los galactocerebrósidos ) , los esfingolípidos (principalmente tales como las esfingomielinas ) y los asialogangliósidos (principalmente tales como los asialoGMl y GM2 ) . Se utiliza preferentemente la DOPE. Preferentemente, el compuesto de la invención y el lípido neutro están presentes en una relación comprendida entre 1 y 5, más preferentemente 2 y 4. Además, la relación de Lípido total (compuesto de la invención más~ el lípido neutro) sobre el ADN, es ventajosamente elegida de tal suerte que la relación neta de cargas positivas esté comprendida entre 2 y 5. Particularmente ventajosa es la proporción de 3, aproximadamente . La invención se refiere igualmente a cualquier composición farmacéutica que comprenda un compuesto de acuerdo a la invención, un lípido neutro y un ácido nucleico. Preferentemente, el compuesto de acuerdo a la invención es elegido entre el BGTC y el BGSC. Todavía más preferentemente el lípido neutro es el DOPE. El ácido nucleico es ya sea un ácido desoxirribonucleico o bien un ácido ribonucleico. Preferentemente, el ácido nucleico incluye un gen terapéutico. Además de esta aplicación de los derivados de amidinio reivindicados, es igualmente posible considerar su valorización en las aplicaciones siguientes: interferencia al nivel de las interacciones entre los ácidos nucleicos y las proteínas que dan como resultado una inhibición de estimulación de ciertos procesos, por ejemplo de regulación o de expresión genética o de actividad enzimática (polimerasa, transcriptasa, etc...), formación de complejo selectiva de especies aniónicas para su extracción, su eliminación o su detección con ayuda de sondas/electrodos para membrana por ejemplo, utilización como reactivo de laboratorio para efectuar operaciones de transfección in vitro, etc. En consecuencia, la presente invención tiene igualmente por objetivo cualquier aplicación terapéutica de los derivados de a idinio tales como se describen anteriormente, ya sea directamente, o bien en el seno de composiciones farmacéuticas. De preferencia, las composiciones farmacéuticas de la invención contienen igualmente un vehículo farmacéuticamente aceptable para una formulación inyectable, principalmente para una inyección directa a nivel del órgano deseado, o para una administración por vía tópica (sobre la piel y/o la mucosa) . Se puede tratar en particular de soluciones estériles, isotónicas, o de composiciones anhidras, principalmente liofilizadas , que, por adición según el caso de agua esterilizada o de suero fisiológico, permiten la constitución de solutos inyectables. La presente invención será más completamente descrita con ayuda de los ejemplos y figuras siguientes, gue deben ser considerados como ilustrativos y no como limitantes.

FIGURAS Figura 1: Representación esquemática de los protocolos de operación de la preparación del BGSC y BGTC.

Figura 2: Representación esquemática de los protocolos de operación de la preparación del BADC .

Figura 3: Medición de la eficacia de la transfección en función de la relación del compuesto lipídico/ADN.

Figura 4: Medición de la eficacia de la transfección en función de la relación lípidos totales/ADN.

Figura 5: Medición del efecto del suero sobre la eficacia de la transfección de las células HepG2 (5A), HeLa (5B), NIH 3T3 (5C) y 293 (5D) . Barras grises: Presencia de suero; Barras vacías: transfecciones en ausencia de suero durante 2 horas.

Figura 6: Fotografías de criosecciones de tráqueas murina que muestran la expresión del gen reportero en el epitelio del aparato respiratorio, después de la transfección in vivo con los liposomas 3GTC/D0PE. (6A) y ( 6B ) : Detección de la expresión de la beta-galactosidasa en las células transfectadas, localizadas en la superficie del epitelio ( 6A) y en las glándulas submucosales (6B); (6C) : Detección de las células que expresan la beta-galactosidasa en las glándulas submucosales mediante marcación con inmunoperoxidasa, utilizando un anticuerpo monoclonal anti-beta-galactosidasa; (6D) : detección de las células que expresan la luciferasa en las glándulas submucosales mediante marcación con inmunoperoxidasa, utilizando un anticuerpo policlonal anti-luciferasa; (6E); coloración con inmunoperoxidasa: control negativo efectuado en ausencia de anticuerpos.

Figura 7: Medición de la eficacia de transferencia de genes in vivo mediante inyección intravenosa de un complejo ADN/BGTC-liposoma .

Figura 8: Medición de la eficacia de la transferencia de genes in vivo mediante inyección intraperitoneal de un complejo ADN/BGTC-liposoma.

A. PREPARACIÓN DE DERIVADOS DE ACUERDO A LA INVENCIÓN MATERIAL Y MÉTODOS 1. Medidas físicas Los espectros de resonancia magnética nuclear de protones (RMN 1H) han sido registrados sobre un espectrómetro Bruker AC200. Los desplazamientos químicos están expresados en ppm con relación al TMS. 2. Cromatografías sobre sílice Las cromatografías sobre capa delgada (CCM) han sido efectuadas sobre placa de gel de silice Merck de 0.2 mm de espesor. Las cromatografías sobre columna han sido efectuadas sobre gel de sílice 60 Merck de granulometría 0.040-0.063 mm .

EJEMPLO 1: PREPARACIÓN DE GUANIDUSTQ-ESPERMIDINQ- COLESTEROL BGSC 1; Preparación del carbonato de Di-Boc(l) Se agrega una solución de cloroformiato de colesterilo (0.9 g, 2 mmol) y de Et3N (0.214 g. 2 mmol) en cloruro de metileno (40 mi) a una solución de 1N, 8N-Boc2-espermidina (0.690 g, 2 mmol) en cloruro de metíleno (20 mi) . Después de reflujo durante 5 horas, la mezcla se lava con agua (2x50 mi ) , se seca sobre sulfato de sodio y el solvente se evapora. El producto bruto es purificado mediante cromatografía sobre un gel de sílice utilizando cloruro de metileno/metanol 95/5 como eluyente, para dar el carbonato puro (1.3 g, 86%) .

RMN ÍH, d(CDCl3. 200 MHz); 0.5-2.5 (m, estructura del colesterilo, señal Boc y grupos centrales CH2 de la espermidina) , 3.1-3.3 (m, 8H. N-CH2) , 4.50 (m, ÍH, H3a) 5.37 (d, ÍH, H6) . 2. Preparación del aminocarbonato (2) Se disuelve el compuesto (1) (1.3 g) en 20 mi de cloruro de metileno, y se agrega a esta solución enfriada (lecho de hielo) 2 mi de CF3C02H recién destilado, para liberar - los grupos protectores BOC. Después de la agitación a temperatura ambiente durante 3 horas, se agregan 50 mi de hidróxido de sodio 1N y la mezcla se extrae con cloruro de metileno. Las capas orgánicas se lavan con agua, se secan sobre sulfato de sodio y se evaporan para obtener el aminocar amato (2) bruto (0.945 g. 98%) .

RMN 1H, d(CDCl3, 200 Mhz); 0.5-2.5 (m, estructura de colesterilo y grupos centrales provenientes de la espermidina) , 2.7 (m, 4H, CH2-N-CO-), 3.25 (m amplio, 4H, N-CH2), 4.49 (m, ÍH, H3a) , 5.35 (d, ÍH, H6) - 3. Síntesis del BGSC Se disuelve el carbamato (2) bruto (0.94 g) en 30 mi de tetrahidrofurano/ etanol 85/15. Después se agrega la lH-pirazolcarboxamidina (0.495 g, 3.4 mmol) y diisopropiletilamina (0.436 g, 3.4 mmol) en 30 mi de tetrahidrofurano/metanol 85/15. Después de agitación a temperatura ambiente durante 18 horas se agregan lentamente 250 mi de éter dietílico y se separa el precipitado obtenido mediante decantación. El compuesto bruto se pone en suspensión tres veces en éter dietílico y se separa mediante decantación para dar el GSC puro (0.570 g, 47%) .

RMN ÍH, d(DMSO dß ) 200 MHz; 0.5-2.5 (m, estructura de colesterilo y CH2 central), 3.1 (m, 8H, N-CH2). 4.3 (m, ÍH, H3a) , 5.3 (d, ÍH, H6); 7.2 (s amplio, 8H, NH2+), 7.8 (s, 2H, NH) , Análisis Calculado para C37H67N70 »2HC1; C, 62.15; H, 9.67; N, L3.71 Resultado del análisis elemental: C, 62.28; H, 9.81; N, 13.15 EJEMPLO 2: PREPARACIÓN DE GUANIDINO-TREN-COLESTEROL , NGTC 1. Preparación del aminocarbamato ( 5 [ Se agrega lentamente una solución de cloroformiato de colesterilo (1.8 q, 4 mmol) en 100 :ml de cloruro de metileno a una saturación de tris (2-aminoetil) amina (TREN) (11.68 g, 80 mmol) en 400 mi de cloruro de metileno. Después de la agitación a temperatura ambiente durante dos horas, se libera la amina inerte mediante lavado con agua (3x100 mi) y después del secado sobre sulfato de sodio se evapora el solvente. Se aisla el compuesto (5) bajo la forma de triclorhidrato de la siguiente manera: se disuelve el producto bruto en 10 mi de metanol y se agrega gota a gota una solución saturada de ácido clorhídrico metanólico (5 mi); el precipitado obtenido se separa mediante decantación y, para obtener un compuesto puro, se pone en suspensión tres veces en metanol y se separa mediante decantación. Después del secado a vacío se obtiene el triclorhidrato (6) puro (1.71 g, 64%) .

RMN ÍH, d(CDCl3 + eCD30D, 200 MHz) . 0.5-2.4 (m, estructura de colesterilo), 2.5 (m, 2H, CH2NHCO), 2.8 (s amplio, 4H, +HN-CH2), 3.06 (s amplio, 4H, CH2NH3+) , 3.20 ( , 2H, +HN-CH2), 4.4 (m, ÍH, H3a) 5.3 (d, ÍH, H6) , Análisis Calculado para C34H62N402»3HC1 ; C, 61.10; H, 9.80; N, 8.38. Resultado: C, 61.25; H, 9.96; N, 8.22. 2. Preparación del NGTC Se agrega lentamente una solución de cloroformiato de colesterilo (2.4 g, 5 mmol) en 100 mi de cloruro de metileno a una saturación grande de tris (2-aminoetil ) amina (TREN) (29.2 g, 200 mmol) en 250 mi de cloruro de metileno. Después de la agitación a temperatura ambiente durante 2 horas, se libera la amina inerte mediante lavado con agua (3x100 mi) y después del secado sobre sulfato de sodio, el solvente se evapora. El producto bruto (3.2 g) se disuelve en tetrahidrofurano/metanol 50/50 (20 mi); después a la mezcla se agrega 1H-pirazol-1-carboxamidina (1.465 g, 10 mmol) y diisopropilamina (1.3 g, 100 mmol) . Después de la agitación a temperatura ambiente durante 18 horas, se agrega éter dietílico y el precipitado obtenido se separa mediante decantación. Con el fin de obtener una muestra pura, el compuesto bruto es puesto en suspensión tres veces en éter dietílico y se separa mediante decantación (2.15 g) , 60% después del secado a vacío.

RMN 1H (DMSOds, 200 MHz); 0.5-2 (m, estructura de colesterilo), 2.2 (m, 2H, N-CH2), 2.6 (s amplio, 4H, N-CH2). 3.0 (d, 2H. N-CH2). 3.2 s amplio, 4H), 4.3 (m, ÍH, H3a) , 5.3 (d, ÍH, H6), 7.3 (s amplio. 8H, NH2+), 7.8 (s amplio, 2H, NH) . Análisis Calculado para C36H66N802*2HC1 ; C, 60.39; H, 9.57; N, 15.65. Resultado: C, 60.38; H, 9.67; N, 15.56.

EJEMPLO 3: PREPARACIÓN DEL BIS-CLORHIDRATQ DE BIS-AMIDINIQ BACD 1. Preparación del dinitrilo Se agrega una solución de cloroformiato de colesterilo (8.97 g, 20 mmol) en cloruro de metileno I'IOO mi) gota a gota a una solución de i minopropionitrilo (2.46 q, 20 mmol) y Et3N (2.02 g, 20 mmol en cloruro de metileno (100 mi)) . Después de la agitación a temperatura ambiente, durante 6 horas, se lava con agua (2x100 mi) y se seca sobre sulfato de sodio. El solvente se evapora y el producto bruto (10.5 g) se recristaliza en metanol (8.59 g, 80%) .

RMN 1H, d(CDCl3, 200 MHz) . 0.5-2.5 (m estructura de colesterilo), 2.7 ( , 4H; -CH2CN) , 3.62 (m, 4H, -CH2-N-) , 4.50 (m, 1H, H3a) , 5.39 ( d, 1H, H6) • 2. Preparación de la ditioamida En una solución de dinitrilo, preparada como se describe anteriormente (0.324 g, 6 mmol) y de dietilamina (0.884 g, 12 mmol) en dimetilformamida (30 mi), mantenida a 50°C, se hace burbujear durante 2 horas una ligera corriente de H2S. Se vierte la solución azul sobre hielo y se separa el precipitado obtenido así mediante filtración. Se disuelve este producto bruto en cloruro de metileno y se lava con agua (2x50 mi) . Después del secado sobre sulfato de sodio el solvente se evapora y el producto obtenido se recristaliza dos veces en metanol (1.86 g, 51.5%) .

RMN 1H (DMSOd6, 200 MHz); 0.5-2.5 (m, estructura de colesterilo), 2.67 (t, 4H, N-CH2), 3.50 (t, 4H, S=C-CH2), 4.3 (m, ÍH, H3ß) . 5.33 (d, ÍH, H6) . 3. Preparación del bis-yoduro de ditioamidato A una solución de ditioamida (0.603 g. 1 mmol) en acetona (20 mi) , se agrega yoduro de metilo (2 mi) y se deja reposar a la temperatura ambiente durante 48 horas. Se filtra el precipitado obtenido (0.741 g, 83.5%) . Este producto se utiliza directamente sin purificación anexa. 4. Preparación del bis-clorhidrato d.e bis-amidinio BADC En una suspensión a reflujo de bis-yoduro ¡0.741 g, 0.83 mmol), tal como se obtiene anteriormente, en isopropanol (10 mi) se hace burbujear una corriente de amoniaco durante 2 horas y después se continúa el calentamiento a reflujo 4 horas suplementarias. Se evapora el isopropanol y los residuos se recogen en metanol (10 mi) . Después del paso de esta solución sobre una resina de intercambio iónico básica, se hace pasar una corriente de ácido clorhídrico en eluyente y se evapora hasta sequedad. El bis-clorhidrato obtenido de este modo, se disuelve en el mínimo de etanol (aproximadamente 5 mi) . Se filtra un material ligeramente insoluble y se agrega al filtrado una gran cantidad de éter dietílico. Se obtiene un polvo que se filtra y se seca (320 mg, 60%) . Una recristalización en isopropanol permite aislar el producto en cuestión, bajo una forma analíticamente pura .

RMN ÍH (DMSOd6, 200 MHz); 0.5-2.6 (m, estructura de colesterilo y -CH2-amidinio) , 3.57 (s amplio, 4H, N-CH2) . 4.3 (m, ÍH, H3«) . 5.3 (d, H, H6). 8.64 (s amplio, 2H; NH2) , 9.07 (s amplio, ÍH; NH) . 9.18 (s amplio, 2H) . Análisis Calculado para C34H56N ?2»2HCl : C, 65.25; H, 9.32; N, 8.94, Resultado C, 65.40; H, 9.87; N, 9.55.

B. UTILIZACIÓN DE LOS DERIVADOS DE ACUERDO A LA INVENCIÓN PARA LA TRANSFERENCIA DE GENES IN VITRO E IN VIVO MATERIALES Y MÉTODOS 1. Los ensayos de transfección siguientes son efectuados con el BGSC y el BGTC preparados de acuerdo a los protocolos descritos en los ejemplos 1 y 2. 2. Preparación de liposomas Una mezcla de lípido catiónico y de DOPE (en una relación molar de 3/2) en cloroformo (CHC13) se evapora a vacío y se pone en suspensión en una solución amortiguadora de HEPES 20 mM a pH 7.4, bajo una atmósfera de nitrógeno. La concentración final en lípido es de 1.2 mg/ml. La mezcla se agita en torbellino (vortex) durante 5 minutos, después se "sónica" durante 5 minutos con un sonicador (Branson Ultrasonic 2210), finalmente se almacena a +4°C durante 24 horas para la hidratación.

La dispersión resultante es "sonicada" nuevamente (Sonifier Branson 450) durante 5 a 10 minutos para formar los liposomas. Después de la centrifugación, la solución se filtra sobre un filtro de diámetro de poro 0.22µ ( (Millex GS, Millepore) y se almacena a +4°C. El tamaño de los liposomas que contienen BGSC o BGTC ha sido estudiado con ayuda de un aparato de difracción láser (Autosizer 4700, Malver Instruments) . Este estudio muestra un tipo único correspondiente a un diámetro medio de 50 nm en aná-lisis multimodal por números.

Cultivos celulares El origen (especie y tejido) de la mayor parte de las líneas celulares utilizadas para los experimentos de transfección, se da en la tabla I. Las células de la linea celular HeLa (P Briand, ICGM Paris) son derivadas de un carcinoma humano de origen epitelial cervical. Las células NIH 3T3 (C Lagrou, Institut Pasteur, Lille) son de fibroblastos de ratón. La linea celular NB2A (C. Gouget, Paris) es derivada de un neuroblastoma de ratón.

Todas las células con excepción de las células ArT-20 y PC12, han sido cultivadas en medio de Dulbecco modificado (DMEM, GIBCO) complementado con 10% de suero fetal de ternera (FCS; GIBCO) , con penicilina de 100 unidades/ml (GIBCO) y estreptomicina (GIBCO) a 100 µg/ml. Las células ArT-20 han sido cultivadas en DMEM/F12 (GIBCO) complementadas con 10% de suero fetal de ternera. Las células PC12 han sido cultivadas en medio DMEM complementado con 10% de FCS y 5% de suero de caballo. Todas las células han sido mantenidas en cultivo en capas de plástico (Falcon) bajo atmósfera húmeda a 5% de CO2. 4. Plásmidos Los plásmidos pRSV-Luc (O. BENSAUDE, ENS, Paris), y pRSV-nlsLacZ han sido amplificados en E. coli y preparados mediante purificación sobre gradiente de cloruro de cesio mediante técnicas estándares. En el plásmido pRSV-nlsLacZ, y el plásmido pRSV-Luc, el gen LacZ de E. Coli y su secuencia de señal de localización nuclear y el gen de la luciferasa, están respectivamente bajo el control transcripcional de LTR/RSV (Virus del Sarcoma de Rous) . El plásmido pXL2774 posee el gen que codifica para la luciferasa, bajo el control del promotor del citomegalovirus (CMV) .

. Protocolo de transfección in vitro El día precedente a la transfección se depositaron 2 X 105 células por pozo (placas de 6 pozos Falcon) . Cada uno de los pozos contiene una línea celular diferente. De este modo al día de la transfección las células están semiconfluentes . El ADN plasmídico (5 µg) y la cantidad deseada de líquido bis-guanidinio han sido diluidas cada una en 250 (1 de DMEM en FCS y agitadas en torbellino. Después de aproximadamente 5 minutos las dos soluciones se dejan incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos. La mezcla de transfección se agrega luego a las células (0.5 mi por pozo) que han sido lavadas con un medio sin suero. Después de 4 a 6 horas de incubación a 37°C, se agrega 1 mi de medio con suero en cada uno de los pozos, sin que se extraiga la mezcla de transfección. 24 horas después de la transfección, el medio es reemplazado con 1 mi de medio de cultivo fresco. Las células se recogen 2 días después de la transfección para medir la expresión de la luciferasa . Las transfecciones testigo han sido efectuadas utilizando agentes de transfección comercializados : - la lipopoliamina Transfectam ® (JP Behr, Estrasburgo, Francia) ha sido utilizada en solución alcohólica a una relación óptima de cargas iónicas Transfectam®/ADN 6-8. - la Lipofectin® (Life Technologies Inc., Cergy Pontoise, Francia) que es una formulación de liposomas que tienen por lípido neutro la DOPE y por lípido catiónico la DOTMA. (cloruro de N- [1(2,3-dioleiloxi) propil] -N, N, N-trimetilamonio ) . Los complejos ADN-liposomas han sido obtenidos en las condiciones estándares recomendadas por el fabricante. las células han sido transfectadas con precipitación con fosfato de calcio (Keown, W.A., Campbell, C.R.; Kucherlapati , R.X. (1990) Methods in Enzymology; Academic Press: New York, 185, 527-537) . 6. Medición de la luciferasa para las transfecciones realizadas in vitro La actividad de luciferasa se mide 48 horas después de la transfección utilizando una variante del procedimiento de De Wet y colaboradores (De Wet, J.R., Wood, K.V., DeLuca, M., Helinski, D.R. & Subra ani, S. (1987) Mol. Cell. Biol 7, 725-737) . se retira el medio de cultivo - las células se lavan con una solución salina amortiguada con fosfato, fría después éstas se lisan mediante incubación en 250 µl de amortiguador de lisis (trifosfato 25 mM pH 7.8, cloruro de magnesio 8 mM, ditiotreitol 1 mM, 15% de glicerol y 1% de tritón X- 100) . se obtiene un lisado claro después de la eliminación de los materiales insolubles mediante centrifugación (15 mm a +4°C) en una microcentrífuga. una alícuota de (20 µl) de extracto celular se diluye en 100 µl de amortiguador de lisis al cual se agregan 9 µl de ATP 25 mM (sigma) y 20 µl de luciferina 25 mM (sigma) . las muestras son colocadas en un luminómetro (Lur et LB9501 Berthold, Nashua, NH) y se mide la emisión luminosa durante 10 segundos. El trazado de la curva RLU/Luciferasa ha sido realizado utilizando diferentes diluciones de luciferasa de luciol purificado (sigma) y muestra que la parte lineal de la curva va de 104 a 107 RLU (unidades de luz relativas) . La concentración en proteína ha sido medida mediante la prueba BCA (ácido bicinconínico ) utilizando la albúmina sérica bovina como testigo. Los datos para la utilidad de luciferasa son expresados en RLU/mg de proteína. 7. Protocolo de inyección in vivo a nivel de las vias respiratorias de ratón Los ratones utilizados son ratones macho OF1 ¡peso 30 g) provenientes de Iffa-Credo (Lyon, Francia) . Los liposomas catiónicos BGTC/DOPE ¡relación molar 3:2) son utilizados. La mezcla de transfección se obtiene a partir de 10 µg de ADN plasmídico (en 10 µl de agua), 20 µl de liposomas catiónicos en un medio Hepes 20 mM (pH 7.4) , a una concentración lipídica total de 5 mg/ml. Los agregados de ADN/lípidos formados de este modo poseen una relación de carga del orden de 6. Después de la anestesia de los ratones con pentobarbital, la mezcla de transfección (30 µl) se inyecta en las vías respiratorias mediante instilación intratraqueal vía una cánula insertada en el lumen traqueal. 48 horas después de la instilación los animales son sacrificados por sobredosis de pentobarbital y los pulmones y tráqueas se retiran para el análisis. 8. Coloración con X-gal Para dosificar la expresión de la beta- alactosidasa de E. Coli en los cultivos primarios, ee impregnan las células durante 15 minutos a 4°C con una solución de paraformaldehído al 4% y se les incuba en seguida con X-gal de sustrato de beta-galactosidasa cromogénico (Sigma). La coloración azul de los núcleos de las células transfectadas es dosificada mediante microscopio de luminancia. 9. Dosificación de las células X-gal a nivel de las vías respiratorias transfectadas in vivo Para la detección de las células X-gal a nivel de las vías respiratorias, los pulmones y tráquea son tratados 1 hora en paraformaldehído al 4%, sumergidas en seguida toda una noche en PBS que contiene 30% de sucrosa, después incorporadas en un medio de congelación y congeladas en nitrógeno líquido. Las secciones de criostatos de 5 µ son en seguida coloreadas para la actividad de ß-galactosidasa mediante incubación toda una noche con el reactivo X-gal (Sigma) .

. Dosificación de la iuciferasa a nivel de las vías respiratorias transfectadas in vivo Para dosificar la actividad de luciferasa después de las transfecciones in vivo, los fragmentos de tejido son puestos en presencia de 30 µ.l de amortiguador de lisis (Tris-fosfato 25 mM pH 7.8, ditiotreitol 1 mM (DTT), 15% de glicerol y 1% de Tritón X-100), se lisan en aproximadamente 1 minuto con un homogeneizador (Polylabo, Estrasburgo, Francia) y se conservan sobre hielo. Después de la centrifugación, se utilizan 20 µl de lisado para la dosificación. La actividad de la luciferasa se expresa en RLU por mg de proteína. 11. Protocolo inmunohistoquímico Las criosecciones de las muestras de pulmones y tráqueas son incubadas 1 hora ya sea con Los anticuerpos murinos monoclonales anti-ß-galactosidasa de E. Coli a 5 µg/ml (Genzyme, Cambridge, MA) o anticuerpos de conejo policlonales dilución de 1:400 (Promega) . La proteína ß-galactosídasa de Escherichia coli es dosificada mediante coloración con inmunoperoxidasa utilizando un anticuerpo secundario anti-Ig de ratón marcado con biotina (Boehringer) y un conjugado a estreptavidina-POD (Boehringer) . La proteína luciferasa es dosificada mediante coloración con inmunoperoxidasa utilizando un anticuerpo de cabra anti-conejo (ICN Biomedicals, Inc.) y el sistema peroxidasa-antiperoxidasa de conejo (PAP) (Dako Glostrup, Dinamarca) . Las secciones son examinadas mediante microscopía luminiscente. Los controles negativos son efectuados sin anticuerpos.

EJEMPLO 4: TRANSFECCIONES IN VITRQ A DIFERENTES RELACIONES DE AGENTE DE TRANSFECCION/ADN Con el fin de optimizar la eficacia de la transfección obtenida con los agregados BGTC/ADN, la solicitante ha estudiado la influencia de la relación BGTC/ADN sobre la tasa de transfección en 3 tipos diferentes de células de mamíferos conocidos por su relativa sensibilidad a los métodos de transfeccióp clásica. Los resultados se presentan en la Figura 3. Los experimentos de transfección han sido pues realizados con los fibroblastos murinos 3T3 de las células epiteliales humanas HeLa y los neuroblastomas de ratón NB2A. En el curso de estos experimentos una cierta cantidad fija de plásmido pRSV-Luc ha sido puesta en contacto con cantidades variables de solución BGTCen. Para determinar la gama de relaciones a estudiar, la solicitante parte del principio de que un µg de ADN equivaldría a 3 nm de fosfato cargado negativamente, y que solamente dos grupos guanidinio están cargados positivamente a pH neutro de formación de agregados y de transfección. Se mide la actividad de luciferasa 48 horas después de la transfección. La expresión de la luciferasa es máxima para los agregados que contienen 6 (células HeLa) a 8 (células 3T3, NB2A) grupos guanidinio para un grupo fosfato de ADN, es decir agregados que tienen una carga positiva importante .

EJEMPLO 5: TRANSFECCIONES IN VITRO CON DIFERENTES TIPOS CELULARES La transferencia de genes por mediación de lípidos catiónicos es una técnica de transfección atractiva no solamente por el hecho de que ésta no necesite intermediarios, sino también porque permite '"ransfectar una gran .variedad de células de tejido y de organismos diferentes. Para estudiar la extensión de la eficacia de BGTC como agente de transfección, han sido probadas varias líneas celulares de orígenes diversos. Los resultados son expuestos en la tabla 1 siguiente. La relación de cargas ha sido elegida entre 6 y 8 para una eficacia máxima. Con el fin de establecer una comparación, las células de las mismas líneas han sido igualmente transfectadas utilizando una lipopoliamida por una parte, y por otra parte fosfato de calcio. Los resultados muestran que el BGTC es normalmente eficaz también como el Transfectam y dos veces más eficaz que el fosfato de calcio.

Tabla 1 : Expresión de la luciferasa en diferentes líneas celulares de mamíferos transfectados ya sea por BGTC, fosfato de calcio o Transfectam ®.

Todas las transfecciones han sido hechas al menos dos veces (n(2) .

EJEMPLO 6: TRANSFECCIONES IN VITRO EN PRESENCIA DE UN LIPIDO NEUTRO El compuesto BGSC es menos soluble en medio acuoso que el BGTC y la solicitante ha utilizado el primero bajo la forma de liposomas en presencia de un lípido neutro, es decir la DOPE (dioleilfosfatidiletanolamina) . Las formulaciones son preparadas en una relación molar 3/2. Una segunda preparación gue contiene esta vez BGTC, ha sido igualmente preparada con la DOPE en las mismas condiciones . 6.1 Determinación de la relación lípido total/ADN.

La solicitante ha determinado primeramente la relación lípido/ADN en el curso de un experimento de transfección sobre las células HeLa. La curva obtenida es representada como Figura 4. Las condiciones óptimas de transfección son obtenidas por las relaciones de liposomas BGSC/ADN comprendidas entre 1.5 y 5, con un centro en 2.5-3. Los grupos guanidinio -están protonados a pH neutro, los mejores agregados BGSC-DOPE/ADN tienen una carga positiva de aproximadamente 3 (Figura 4) . Las mejores relaciones BGSC-DOPE/ADN son pues inferiores a aquellas obtenidas con los agregados del tipo BGTC/ADN (entre 6 y 8). La transfección en presencia de liposomas catiónicos es facilitada por la presencia de DOPE y las propiedades fusogénicas de ésta. 6.2 Transfacción de diferentes lineas celulares mediante liposomas catiónicos La solicitante ha procedido a experimentos de transfección en diferentes líneas celulares utilizando formulaciones de liposomas catiónicos BGSC-DOPE y BGTC-DOPE en relaciones molares 3/2. La relación de cargas de guanidinio de los lípidos/ fos fatos del ADN es de aproximadamente 2.5 (aproximadamente 3) para estos dos sistemas de transferencia de genes. Una transfección con Lipofectin® sirve de testigo. Los resultados son expuestos en la tabla 2 siguiente. Estos resultados muestran que los derivados de colesterol poseen grupos guanidinio bajo la forma de liposomas catiónicos y son al menos también eficaces para la transfección de la lipofectina. Estos resultados pueden por supuesto ser optimizados para cada línea celular.

Tabla 2 : Expresión de la luciferasa en diferentes líneas celulares eucarióticas transformadas por medio de liposomas BGSC/DOPE, de liposomas BGTC/DOPE y de Lipofectina®.

COS-7 ND 1.4 X 107 9.5 X 106 MDCK-1 1 X 106 7 X 10d 1.9 X 10d ROS ND 9 X 106 6 X 106 NB2 ,Aa 1.5 X 107 1.4 X ÍO7 ND NIH 3T3a 7 X 106 1.5 X lO6 ND Todas las transfecciones han sido realizadas al menos tres veces (n>3) . a: medición media en RLU de la actividad de luciferasa para 100 µg/500 µg de lisado total (n=4) .

EJEMPLO 7: ESTUDIO DEL EFECTO DE LA . PRESENCIA DE PROTEÍNAS SÉRICAS SOBRE LA EFICACIA DE TRANSFERENCIA DE GENES IN VITRO La mayor parte de las composiciones de transfección a base de lípidos catiónicos presentan una eficacia disminuida en presencia de suero. Este ejemplo tiene por objetivo el probar la sensibilidad de los compuestos de la invención con efecto suero. 7.1 Formulaciones de lípidos catiónicos Los lípidos descritos en la invención son solubilizados en etanol. i) soluciones de "liposomas" son obtenidas en presencia de DOPE como sigue: la DOPE (AVANTI) en solución en cloroformo es agregada a las soluciones de lípido en etanol, en una relación molar de lípido catiónico/DOPE de 3/2. Después de la evaporación hasta sequedad las mezclas son recogidas en agua y calentadas a 50°C durante 30 minutos; ii) las soluciones de "micelas" son obtenidas siguiendo el protocolo descrito para la obtención de "liposomas" pero la solución de DOPE es reemplazada por el cloroformo.

Las soluciones son todas ajustadas a 10 M en lípido catiónico. 7.2 Acido Nucleico El ácido nucleico utilizado es el plásmido pXL2774. 7.3 Mezclas citofectantes (preparación extemporánea) El ADN es diluido a 20 µg/ml en cloruro de sodio 50 mM y las diferentes formulaciones de lípido catiónico son diluidas en agua a 40, 80, 120 y 160 µM . Las soluciones de ADN y de lípido son mezcladas volumen a volumen, lo gue da proporciones en nmoles/µg de ADN respectivamente, de 2, 4, 6 y 8; la concentración salina es de 75 mM. 7.4 Transfecciones Las células son cultivadas en las condiciones apropiadas en microplacas de 24 pozos (2 cm2/pozo) y son transfectadas mientras que éstas están en fase exponencial de crecimiento y a 50-70% de la confluencia. Las células son lavadas con 2 porciones de 500 µl de medio desprovisto de proteínas séricas, y puestas en crecimiento ya sea en medio sin suero [transfección en ausencia de suero], o bien en medio completo (transfección en presencia de suero) y 50 µl de mezcla citofectante (0.5 µg de ADN/pozo) son agregados a las células (3 pozos/condición lipido-ADN) .

Cuando las células son transfectadas en "ausencia de suero" el medio de crecimiento es suplementado con la cantidad apropiada de suero 2 horas después de la transfección. La eficacia de transfección es evaluada mediante una medición de la expresión de la luciferasa de acuerdo a las recomendaciones dadas para la utilización del equipo Promega (Sistema de Ensayo de Luciferasa ( . La toxicidad de las mezclas citofectantes es estimada mediante una medición de las concentraciones proteicas en los lisados celulares . 7.5 Resultados (Figura 5¡ Los resultados obtenidos con cuatro tipos celulares (NIH3T3 - 293- HepG2 - HeLa) muestran gue, en las condiciones probadas, las formulaciones bajo la forma de "liposomas" son más eficaces que aquellas bajo la forma de "micelas". Por otro lado, de manera contraria a lo que se observa con la mayor parte de las preparaciones citofectantes que contienen los lípidos catiónicos, no ha podido ser puesto en evidencia ningún efecto inhibidor significativo, ligado a la presencia de suero para el BGTC bajo la forma de "liposomas" o de "micelas", en las presentes condiciones de transfección.

EJEMPLO 8: EXPRESIÓN IN VIVO DEL TRANSGEN EN LAS VÍAS RESPIRATORIAS DE RATÓN, CON LOS LIPOSOMAS BGTC/DOPE Para hacer esto, se han utilizado los liposmas catiónicos BGTC/DOPE. La obtención de agregados de ADN/liposomas y el protocolo de administración son efectuados como se describe en la sección de materiales y métodos. Las células X-gal son detectadas en el epitelio de las vías respiratorias de ratones tratados 48 horas después de la transfección a nivel de las células de plásmidos LacZ con la ayuda de liposomas BGTC/DOPE. Los resultados se presentan en la Figura 6. La mayor parte de las células transfectadas están localizadas en la tráquea y solo algunas células X-gal son observadas en las vías respiratorias secundarias. Este tipo de distribución ha sido ya reportado en otras transfecciones celulares.

Hemos efectuado además una prueba inmunohistoquímica para identificar el producto del gen reportero. Principalmente, estas son las células maduras que son transfectadas a nivel de la superficie del epitelio (Figura 6A) . Estos datos muestran que los liposomas catiónicos son capaces de inducir la transfección de los genes en las células no proliferativas y totalmente diferenciadas del epitelio de las vías respiratorias. La expresión del transgen es igualmente detectada en las glándulas submucosales (Figura 6B) . La detección mediante marcación inmunológica de las células transfectadas, utilizando un anticuerpo monoclonal dirigido contra la ß-galactosidasa de E. Coli, confirma esta expresión en las glándulas submucosales y el epitelio de la superficie (Figura 6C) . La expresión transgénica es igualmente puesta en evidencia en las glándulas submucosales mediante coloración con inmunoperoxidasa con un anticuerpo dirigido contra la proteína luciferasa, después de la transfección de pRSV-Luc con BGTC/DOPE (Figura 6D) . Los controles negativos son efectuados sin anticuerpos (Figura 6E) .

Estos resultados son de interés más particular para la terapia génica dirigida contra la mucoviscidosis . En efecto, para tratar esta patología, es necesario seleccionar las glándulas submucosales gue son el sitio principal de la expresión de la CFTR en los bronguios humanos.

EJEMPLO 9: DOSIFICACIÓN CUANTITATIVA DE LA EFICACIA DE TRANSFECCION DE BGTC/DOPE IN VIVO Para hacer esto, los pulmones y la traguea de ratones, tratados con el liposoma BGTC/DOPE y el plásmido pRSV-Luc, en las condiciones descritas en el Ejemplo 8, son obtenidas 48 horas después de la transfección y la actividad de luciferasa dosificada de acuerdo al protocolo descrito en la sección de materiales y métodos. Los resultados se presentan en la tabla 3 siguiente .

Tabla 3 La actividad de luciferasa es detectada de manera sistemática en los homogeneizados de tráquea, pero no en aquellos de los pulmones . Esta observación está de acuerdo con los resultados precedentes obtenidos al momento del examen de la distribución de las células positivas a X-gal. Se nota que la expresión de luciferasa está directamente ligada al plásmido de expresión, puesto que ninguna actividad ha podido ser detectada en el testigo que contiene un plásmido LacZ. A manera de testigo, se ha realizado igualmente una transfección del plásmido sin vector. En este ensayo testigo no se observa ninguna expresión de la luciferasa.

Estos datos demuestran la eficacia de los liposomas BGTC/DOPE para la transfección génica in vivo de las vías respiratorias.

EJEMPLO 10: TRANSFERENCIA DEL GEN IN VIVO MEDIANTE INYECCIÓN INTRAVENOSA O INTRAPERITONEAL Las formulaciones de los lípidos catiónicos y del ADN se describen en el Ejemplo 7. .1 Efecto de la dosis de los lípidos catiónicos (Figuras 7-8) Los ratones BalbC de 5 semanas de edad son inyectados mediante vía intravenosa (vena de la cola) o intraperitoneal con 200 µl de mezcla transfectante en solución en cloruro de sodio 37.5 tiM, glucosa al 5% y la expresión de la luciferasa es investigada 24 horas después de la transfección en el pulmón, después de la inyección intravenosa, y en el hígado y el bazo después de la inyección intraperitoneal. Los órganos son recogidos en frío en un amortiguador de lisis (Promega E153A) adicionado de inhibidores de proteasa (Boehringer 1697498) y homogeneizados con un triturador Heidolph DIAX600. La actividad de luciferasa es investigada en el sobrenadante de 14000 g de los extractos tisulares.

Inyección intravenosa Cada ratón recibe 50 µg de ADN formado en complejo por las diferentes concentraciones de BGTC bajo la forma de "liposomas". La relación óptima en nanomoles de lípido catiónico/µg de ADN observada es de 9 (Figura 7) ; no ha podido ser puesta en evidencia ninguna toxicidad para las dosis que van hasta 900 nanomoles de BGTC inyectados.

Inyección intraperitoneal La BGTC bajo la forma de "liposomas" ha sido inyectada con 100 µg de ADN por ratón. Tanto en el hígado (Figura 8B) como en el bazo (Figura 8A) , el máximo de expresión es obtenido para 1.5 nanomoles de BGTC/ ( de ADN. .2 Cinética de expresión después de la inyección intravenosa Se ha investigado la biodis tribución de la expresión de la luciferasa en 7 órganos, en función del tiempo siguiente a la inyección de 200 µl de mezcla de "liposomas" de BGTC/ADN en cloruro de sodio 37.5 mM, glucosa al 5% (50 µg de ADN y 9 nanomoles de BGTC/µg de ADN) en la vena de la cola de ratones BalbC de 5 semanas de edad. Los resultados se expresan en picogramos de luciferasa extraída por órgano, después de una curva de calibración con la luciferasa comercializada bajo la forma cristalizada. El límite de detección se sitúa entre 0.5 y 1 picogramo de luciferasa. Se ha puesto en evidencia gue, en las condiciones probadas, el máximo de expresión es obtenido a las 23 horas después de la transfección para 6 de los 7 órganos estudiados, a saber el diafragma, el gastrocnemio, el corazón, el pulmón, el riñon y el bazo. La expresión a nivel del hígado parece más precoz. El máximo de expresión es obtenido a nivel pulmonar con una tasa de 0.5 nanogramo a las 23 horas después de la transfección.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:

Claims (23)

RE IVINDICACIONES

1. Un compuesto de la fórmula general I y sus sales caracterizado porgue: -Rl representa un derivado del colesterol o un grupo alquilamino-NR'R' ' con R' y R' ' que representan independientemente uno del otro un radical alifático, saturado o no, lineal o ramificado de 12 a 22 átomos de carbono, R2 y R3 representan independientemente uno del otro un átomo de hidrógeno o un grupo de la fórmula general II con al menos uno de entre ellos diferente de un átomo de hidrógeno, en la cual : - n y m representan independientemente uno del otro y de manera distinta entre los grupos R2 y R3 un número entero comprendido entre 0 y 4, - R4 y R5 representan independientemente uno del otro un átomo de hidrógeno o un grupo de la fórmula III en la cual : p y q representan, independientemente uno del otro un número entero comprendido entre 0 y 4, y r es igual a 0 ó 1, con r igual a 1 X representa un grupo NH y x es pues igual a l ó X representa un átomo de azufre y x es pues igual a 2 y con p, g y r que pueden variar independientemente entre los grupos R4 y R5.

2. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque R2 y R3 representan independientemente uno del otro un átomo de hidrógeno o un grupo de la fórmula general IV en la cual n, m y p son como se definen anteriormente y R4 representa un átomo de hidrógeno o un grupo de la fórmula V con q y r definidos como se describe anteriormente, y con m, n, p, q y r que pueden variar de manera independiente entre los diferentes grupos R2 y R3 •

3. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 6 2, caracterizado porque se trata preferentemente de un compuesto representado por una de las siguientes fórmulas generales: (H2N) 2+C-NH- (CH2) 2-NH-C00-R1 VI [ (H2N) 2+C-NH- (CH2) 3] [ (H2N)2C+-NH- (CH2) 4] -N-COO-Rl VII [ (H2N) 2+C-NH- (CH2) 2] 2-N- (CH2) 2-NH-COO-Rl VIII [ (H2N) 2+C- (CH2) 2] 2N-COO-RI - IX [ [ (H2N)2+C- (CH2) ]2-N- (CH2)2]2N-C00-R1 x en las cuales Rl es como se define de conformidad con la reivindicación 1.

4. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque éste es elegido entre: [ [ (H2N) 2+C- (CH2) 2] 2-N- (CH2) 2] 2N-COO-RI [ (H2N) 2+C-NH- (CH2) 3] [ (H2N) 2C+-NH- (CH2) 4] -N-COO-Rl y [ (H2N) 2+C- (CH2) 2]2N-C00-R1 en las cuales Rl representa un grupo colesterilo.

5. El compuesto 'de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se trata de bis-guanidino-espermidino-colesterol (BGSC) .

6. El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se trata de bis-guanidino-tren-colesterol (BGTC) .

7. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende al menos un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes .

8. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el compuesto es el bis-guanidino-espermidino-colesterol (BGSC) .

9. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el compuesto es el bis-guanidino-tren-colesterol (BGTC) .

10. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a la 9, caracterizada porque contiene además un ácido nucleico.

11. La composición de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque el ácido nucleico es un ácido desoxirribonucleico .

12. La composición de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque el ácido nucleico es un ácido ribonucleico.

13. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a la 12, caracterizada porque el ácido nucleico incluye un gen terapéutico.

14. La composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un compuesto de conformidad con la reivindicación 1, un lípido neutro y un ácido nucleico.

15. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el compuesto se elige entre el BGTC y el BGSC.

16. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porgue el lípido neutro es la DOPE.

17. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porgue el ácido nucleico es un ácido desoxirribonucleico .

18. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porgue el ácido nucleico es un ácido ribonucleico.

19. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 ó 18, caracterizada porque el ácido nucleico incluye un gen terapéutico.

20. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a la 19, caracterizada porque comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable para una formulación inyectable .

21. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a la 19, caracterizada porque comprende un vehículo armacéuticamente aceptable para una aplicación sobre la piel y/o las mucosas.

22. La utilización de un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 6, para la transfección in vitro, ex vivo y/o in vivo de las células.

23. Un método de transferencia de ácido nucleico en las células, caracterizado el método porque comprende el poner en contacto dicho ácido nucleico con un compuesto de conformidad con la reivindicación 1, y la incubación de la mezcla resultante con dichas células. RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención se - refiere a los nuevos derivados del amidinio de la fórmula en la cual: Rl representa un derivado de colesterol o un grupo alquil-amino-NR' R ' ' , R2 y R3 representan independientemente uno del otro. un átomo de hidrógeno o un grupo de la fórmula II -[(CH2)n—N m-R5 ?? R4 en la cual R4 y R5 representan independientemente uno del otro un átomo de hidrógeno o un grupo de la fórmula III La presente invención se refiere además a las composiciones farmacéuticas correspondientes, útiles principalmente en terapia génica para la transferencia de genes terapéuticos en las células.