MXPA98006381A - Accion anti-parasitaria de n,n-dietil-m-toluamida(deet) y formulaciones que prolongan su actividaden la °piel. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan formulaciones novedosas de DEET que comprenden liposomas y otros portadores. Se proporcionan asimismo métodos y materiales para impedir Esquistomiasis y otras enfermedades parasitarias y microbianas. Se proporcionan también materiales y métodos mejorados para repeler los insectos mordedor

Description

"ACCION ANTI-PARASITARIA DE N, N-DIETIL-m-TOLUAMIDA (DEET) Y FORMULACIONES QUE PROLONGAN SU ACTIVIDAD EN LA PIEL" REFERENCIA A LA SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud reclama prioridad de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos Número 60/040,251, presentada el 10 de Febrero de 1997.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Los parásitos y organismos microbianos que obtienen entrada en huéspedes humanos y animales mediante (a) penetrando a través de la piel, o (b) siendo "suministrados" a través de otros vectores (v.g. mosquitos, garrapatas, moscas, etc.) a través de la piel, son responsables de una gran proporción ce enfermedades. Un ejemplo de un organismo que penetra en la piel es la esquistosomíasis que es una infección que amenaza la vida de seres humanos y animales en muchas partes tropicales y subtropicales del mundo. De acuerdo con el cálculo de World Health Organization (WHO) hay en actualidad más de 200 millones de personas infectadas con este parásito, y otros 600 millones en riesgo [WHO Experte Committee on the Control of Schistosomiasis : Public Health Impact of Schistosomiasis Disease and Mortality Bulletin of the World Health Organization, 71:657-662, 1993]. Los viajeros que visitan estas áreas endémicas están a mayor riesgo de adquirir la enfermedad y diseminarla adicionalmente . La piel es la única vía de entrada conocida para este parásito en seres humanos y animales con la etapa infecciosa (cercaría) del parásito teniendo la capacidad de penetrar en la piel intacta dentro de minutos después de contacto con el agua. Por lo tanto, cualquier agente que interfiera con la entrada de cercaría en la piel, impedirá esencialmente la esquistosomiasis . Otra condición de la enfermedad llamada "dermatitis esquistosómica" o "dermatitis cercarial" se ocasiona mediante la entrada inadvertida de cercarías de los esquistosomas animales (es decir, Trichobilharzia ocellata) hacia la piel humana resultante en dermatitis seria. Esta condición está prevaleciente extensamente en los muchos lagos de agua dulce de los Estados Unidos, Asia y Nueva Zelandia así como los arrozales de Asia. De manera semejante, los parásitos de la lombriz intestinal, particularmente Necator americanus, infectan directamente al hombre y animales pentrando en la piel intacta. La lombriz madura vive en el estómago, consumiendo diariamente una comida de sangre y contribuyendo a la nutrición deficiente del huésped. Además, la infección con este parásito f ecuentemente está acompañada con otros estados de enfermedad. Se calcula de manera conservadora que aproximadamente un billón de personas pueden estar infectadas con la lombriz intestinal. Los artrópodos y las especies relacionadas "suministran" los parásitos y otros organismos productores de enfermedad microbiana a través de la piel después de morder al huésped. El mejor conocido y más problemático es el paludismo, que afecta a millones de personas en regiones del mundo tropicales y subtropicales. De acuerdo con los cálculos de WHO, el paludismo se considera entre las cinco causas principales superiores que ocasionan la muerte en todo el mundo. A través de los últimos 20 años, el problema del paludismo se ha empeorado mediante la aparación de cepas resistentes a la droga. Los mosquitos también se conocen como siendo portadores de enfermedades no parasitarias tales como Dengue, Fiebre Amarilla, y otras condiciones. Varias especies de garrapatas son responsabels de la Enfermedad de Lyme, Fiebre Manchada de la Montaña Rocosa, Erliquiosis, Fiebre de Garrapata de Colorado, Tularemia, Fiebre de Recaída, Encefalitis de Po asan y parálisis de garrapata. De acuerdo con los Centers for Disease Control and Prevention (CDC) , se dieron a conocer más casos de enfermedad llevadas por garrapatas durante el periodo de 1994 a 1997, que el total de casos combinados dados a conocer para sarampión, paperas, tosferina, rubéola, difteria, cólera, leptospirosis, lepra, plaga, tétanos, triquinosis, fiebre tifoidea, lambdiasis y enfermedad del legionario en los estados Unidos. Las garrapatas infectan a los seres humanos y animales tomando una comida de sangre e introduciendo de esta manera su propia saliva infectada en el huésped. Las moscas de arena también morderán a los huéspes humanos, introduciendo de esta manera el organismo responsable por la Leishmaniasis humana. Hay muchos ejemplos adicionales de artrópodos (moscas negras, niguas, dípteros pequeños, moscas de venado, pulgas, moscas tsetse, chinches reduvideos, etc.) que pueden ocasionar la enfermedad a través de mordeduras en la piel. Independientemente de la enfermedad ocasionada por estos artrópodos y especies relacionadas, sus mordeduras son la causa de molestias significativas en comodidad tanto en climas tropicales como en climas de verano más templado. El impacto económico de todas estas enfermedades e incomodidades es importante.

COMPENDIO DE LA INVENCION La invención está dirigida a materiales y métodos para impedir las enfermedades parasitarias que se ocasionan mediante parásitos que penetran la piel o mediante parásitos que se introducen en un animal huésped a través de un vector antrópodo . La invención está también dirigida al material y métodos para repeler insectos. Las enfermedades parasitarias ejemplares incluyen Schistosomiasis o "dermatitis esquistosómica" y enfermedades ocasionadas por la especie Ancylostoma, la especie Necator, la especie Strongyloid.es y otras. Los insectos mordedores ejemplares incluyen garrapatas, moscas de arena, moscas negras, chinches triatomid, chinches reduvideos, pulgas, mosquitos y otras especies de vectores antrópodos que transmiten las enfermedades infecciosas en seres humanos y animales. Los materiales útiles en la práctica de la presente invención incluyen N, -dietil-m-toluamida (DEET) y formulaciones de DEET que prolongan la eficacia de DEET y que requieren dosis de menor concentración que aquéllas usadas comúnmente. Estas formulaciones incluyen DEET envuelta en liposomas o en combinación con polímeros y poliolprepolímeros . Las formulaciones de lipososmas/DEET de acuerdo con la presente invención no requieren la presencia de residuos químicos de anclaje de piel adicional para su eficacia. Las formulaciones anteriormente descritas también son útiles para repeler los insectos mordedores.

Los liposomas pueden ser aniónicos, catiónicos o neutrales. Los liposomas preferidos son los liposomas catiónicos que comprenden L-alfa-fosfatidilcolina, esterarilamina y colesterol. Las concentraciones preferidas de DEET incluyen de aproximadamente 1 por ciento a 50 por ciento en peso/volumen, son especialmente preferidas las concentraciones de aproximadamente 7 por ciento a aproximadamente 10 por ciento. Especialmente preferida es la concentración de aproximadamente 7.5 por ciento de DEET. Los poliolprepolimeros preferidos de la invención incluyen poliolprepolimero 2 y poliolprepolimero 15.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La Figura 1 ilustra los efectos in vitro de DEET en cercarías de S. mansoni. Los efectos in vitro de DEET en cercarías de Schistosoma mansoni. Los cercarías se colocaron en placas de valoración de 96 pozos revestidas anteriormente con diluciones de duplicación en serie de DEET que varían de 30 por ciento a 0.24 por ciento. Durante periodos de tiempo diferentes después de la exposición a DEET se avaluó el porcentaje de viablidad de cercarías mediante método de exclusión roja o neutral. El experimento se repitió 17 veces con un "n" de 189 a 440 cercarías para cada tratamiento.

La Figura 2 ilustra los efectos in vivo del lipodeet en cercarías de S. mansoni . 100 microlitros si una solución al 10 por ciento de una preparación de lipodeet positiva se aplicó a la piel abdominal afectada de ratones y se dejó secar durante 15 minutos. Durante distintos periodos de tiempo (4 horas, 24 horas y 48 horas) después de que había secado en la piel el lipodeet, la piel se lavó durante un minuto en un flujo continuo de agua destilada y se desinfectó con 300 cercarías de S. mansoni irradiadas con 3¾. Siete días después de la infección, el número de parásitos en la piel y los pulmones se determinó mediante autorradiografía de órgano comprimida.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Durante los últimos 30-40 años, se seleccionaron varios compuestos químicos mediante laboratorios diferentes debido a su capacidad para conferir protección contra la penetración cercarial. Entre éstos, unos cuantos compuestos tales como Niclosamida, Cederol, artemeter, hexaclorofeno, ftalato de dibutilo, benzoato de bencilo y muchas preparaciones crudas de plantas indígenas se encontró que tenían efectos cercaricidas significativos en el cultivo del tejido. Sin embargo, excepto en lo que se refiere a la Niclosamida (J.M. Naples y otros, J. of Tropical Med. and Hygiene 95:390-396; M.M. Grenan y otros, Rev. Inst. Med. Trop. Sao Paolo 27:190-196 (1985); A.M. Ghandour y otros, J. of Helminthology, 49:245-250 (1975); P.J. Fripp y otros, South African Medical Journal 47:526-527 (1974); R.R. Abu-Elyazeed y otros., Am. J. of Trop. Med. And Hygiene 49:403-409 (1993)) ninguna de las otras' subtancias químicas se probaron para su aplicación clínica en seres humanos. La N,N-dietil-m-toluamida (DEET) es un ingrediente activo en muchos repelentes de insectos. Su seguridad relativa y espectro amplio de repelencia (es decir, de la mayor parte de cepas de mosquitos, garrapatas, moscas de arena, etc.) hacen al mismo un producto casi ideal. Además, la investigación química ha producido un número de análogos de DEET y otros compuestos relacionados determinados por el Gobierno de los Estados Unidos como teniendo distintos grados de repelencia a los insectos de especies diferentes, durante periodos de tiempo variables, con seguridad variable y otras inconveniencias. Ninguno ha disfrutado consistentemente un uso tan amplio como el DEET aún cuando un número de compuestos (piperidina de N-benzoilo, piperidina de N-toluilo, benzamida de 2-etoxi, acetanilida de N-butilo, acetanilida de N-etilo, N, N-dietil-3-metilbenzamida, dietilfenil-acetamida, dimetilftalato, N,N-dietil-2, 5-dimetilbenzamida o los isómeros de DEET, tales como N, N-dietil-p-toluamida y 2- etil-1 , 3-hexanodiol ) tienen actividades comparables como repelentes de insectos contra muchos de los insectos mordedores de los seres humanos y animales. Casi todos los estudios sobre DEET hasta la fecha confirman repetidamente que el DEET es una substancia química que salva vidas cuando se usa cuidadosamente. Una vez que se aplica a la piel, el DEET tiene una actividad repelente a los insectos que varían de 30 minutos a 2 horas. Sin embargo, para obtener una dureción de actividad más prolongada de más de 60 minutos, hay una necesidad de aplicar, frecuentemente de manera repetida, concentraciones más elevadas de DEET (tan elevadas así como del 70 por ciento) . Desgraciadamente, esto puede coasionar síntomas neurotóxicos ocasionales en individuos susceptibles y niños debido a la absorción masiva de DEET a través de la piel (M.B. Abou-Donia y otros, J. of Toxicol and Clinical Toxicol 32:1-16 (1996); J.C. Veltri y otros J. of Toxicol and Clinical Toxicol, 32:1-16 (1994); R.D. Verschoyle y otros, Fundamentáis of Applied Toxicol 18:79-88 (1992); D.C. Dormán, Veterinary Clinics of North America Small Animal Practice 20:387-391 (1990)). Por lo tanto, cualquier agente que retarde la absorción de DEET a través de la piel reducirá la toxicidad asociada con las concetraciones elevadas de DEET y prolongaré su actividad repelente en las capas superficiales de la piel. Además, también hay ventajas adicionales de que si DEET es retenido en la piel a tracvés de una duración de tiempo más prolongada, aún las concentraciones más bajas de DEET podrían usarse de manera más efectiva, reduciendo por lo tanto cualquier posibilidad de toxicidad asociada con la absorción. Como se describe a continuación, la presente invención proporciona una nueva aplicación para DEET, aquélla de conferir protección con;ra parásitos que penetran en la piel. Como se demostrará a continuación, con una aplicación a la piel, el DEET fue altamente efectivo para impedir la entrada de estos parásitos a través de la piel y por lo tanto, proteger al huésped de enfermedades mortales y/o de debilitamiento. Los resultados demuestran también que la actividad repelente de las formulaciones de DEET es resistente al agua. Aún después de horas de aplicación, la mayoría de estos parásitos suspendidos en el agua fueron incapaces de penetrar en la piel. Aquellos que penetraron en el área a la cual se había aplicado DEET murieron dentro de minutos en la piel, ayudando potencialmente al huésped a crear una respuesta inmune contra el parásito. Los lípidos de la epidermis intracelulares son un grupo de lípidos polares heterogéneos que confieren una función de barrera a la piel y por lo tanto, juegan un papel importante para regular la permeabilidad de la piel (P.M. Elias, archives of Der. Res. 270:95-102 (1981)). Debido a estas barreras de lipido, muchas drogas convencionales aplicadas a la superficie de la piel pueden fallar y llegar al sitio de acción. Debido a esta razón, muchos mejoradores de penetración fueron introducidos para terapia tópica de enfermedades de la piel (Santus y otros, J. Control. Reí. Subst., 25:1-27 (1993)). Sin embargo, la mayoría de estos mejoradores de penetración alteran las bicapas de lipido intercelular y por lo tanto frecuentemente exhiben efectos secundarios irritantes o tóxicos. A este respecto, varios polímeros y liposomas demostraron ser vehículos excelentes para transferencia de drogas a las capas superficiales de la piel. De acuerdo con la presente invención, dos de estos polímeros Pp2 (el poliolpolínero 2) Ppl5 (el poliolpolímero 15) y una preparación de liposoma para suministro y retardo de absorción de DEET de las capas superficiales de la piel fueron desarrollados. De esta manera, a fin de prolongar la actividad del DEET en la piel, se preparon tres formulaciones ejemplares nuevas de 10 por ciento de DEET (Pp2deet, Ppl5deet y Lipodeet) . Cuando se aplicaron a la piel, estas preparaciones confirieron protección contra parásitos que penetran en la piel hasta durante 48 horas después de una sola aplicación. Los estudios farmacológicos e histológicos usando DEET irradiado con 14C, sugieren que estas formulaciones permiten que las capas superficiales de la piel retengan > 90 por ciento del DEET aplicado durante las primeras 24 horas después de la aplicación. Las formulaciones de la presente invención también fueron efectivas contra algunos insectos mordedores tales como garrapatas y mosquitos. Dada su actividad potente contra parásitos que penetran en la piel e insectos mordedores durante un periodo de tiempo prolongado (es decir, durante más de 48 horas), las formulaciones de DEET que actúan de manera prolongada de la presente invención tienen gran potencial para control de campo de enfermedades infecciosas adquiridas a través de la piel . A mediados de 1960, Alee Bagham observó que los fosfolipidos formaron vesiculos cerredos en presencia de agua y las características psicoquímicas de estas vesículas eran semejantes a una membrana de la célula. La mayoría de los fosfolipidos son anfipáticos. Una molécula de lípido antipática se asemeja a una paleta con una cabeza hidrofílica redonda formada de fosfolípido y una cola hidrofóbica no polar larga. Varias moléculas de estos lípidos anfipáticos alineados en paralelo y unidos juntos, mediante la región de la cola con las cabezas señalando hacia afuera, forman una bicapa de lípido. En un medio de agua, la bicapa se dobla por si para formar una esfera cerrada que atrapa dentro las moléculas acuosas. Estas vesículas ahora son llamada liposomas. Los liposomas son termodinámicamentes estables y cuando se aplican a la piel se fundirán con los lípidos en el estrato córneo y por lo tanto no penetran muy profundamente en las capas de la piel. Esto por lo tanto reducirá al nínimo la absorción sistemática de las drogas suministradas de liposoma. Las ventajas de liposoma son que son potencialmente no tóxicas, degradables y no inmunogénicas . Además, los liposomas pueden almacenar tanto substancias solubles en agua como lipofílicas debido a su estructura anfipática. Es importante observar como C.T. Wang (Vice presidente de Investigación y Tecnolgía en el Centro de Recusos de Tecnología de Formulación, Johnson and Johnson Consumer Products Worldwide, de Skillman, NJ) recalcó que no hay sistema de liposoma universal para servir a todas las aplicaciones (Véase, "Delivery Systems for Cosmetic Ingrediente; Technology Trends and Market Opportunities" , P. Bassett, de Southborough, MA, 1997) . Un tipo especial y diseño de estructura de un sistema de liposoma se requiere normalmente para una molécula seleccionada a fin de lograr los beneficios máximos del suministro de liposoma. Por lo general, los liposomas se preparan con glicerofofolípidos que ocurren de manera natural, tales como fosfatidilcolina, colesterol, estearilamina, fosfatidilserina y fosfatidilglicerol . Cuando se mezclan con agua (o cualquier estabilizador soluble en agua) bajo condiciones de esfuerzo bajo, cada molécula de los fosfolipidos se colocará por si lado a lado en orientación semejante (las cabezas hacia arriba y las colas hacia abajo) para formar una hoja. Si se añade DEET a la mezcla de fosfolipidos, siendo el DEET soluble en un lipido, se interdispersarán uniformemente con los fosfolipidos y formará parte de la hoja. Dos de estas hojas luego unirán cola con cola para formar una membrana de bicapa que atrapa una capa pequeña de agua dentro de un vesiculo. Debido a la naturaleza hidrofóbica, típicamente varios de estos vesículos formarán uno dentro del otro en tamaños que disminuyen, creando una estructura multilamelar de esferas de fosfolipidos concéntricos separados mediante capas de agua, estos vesículos esféricos se denominan micelas de liposoma multilamelares . Puesto el DEET se puede incoporar en las micelas, hemos adoptado el término lipodeete para estos liposomas que contienen DEET. Para el fin de esta invención, el lipodeet se referirá a cualquier preparación de liposomas que incopore DEET o sus derivados en cualquier concentración o forma. Puesto que el lipodeet usa un estabilizador a base de agua para formar las micelas, la invención presente abre una formación de usos posibles que incorporan las drogas antiparasitarias en la micela de lipodeet, que impedirá de manera efectiva muchas infecciones parasitarias que se adquieren a través de la piel. Puesto que se usan fosfolipidos naturales en nuestra preparación de lipodeet, los efectos tóxicos en el huésped debidos a liposomas son mínimos. La carga electostática de las moléculas de fosfolípido en la micela decidirán finalmente al carga final de la preparación de lipodeet. De esta manera, la fosfatidilcolina y el colesterol que tienen cargas neutrales producirán un lipodeet neutral. Mientras que la adición de estearilamina a la preparación, hará que el lipodeet quede cargado positivamente. De manera semejante, la adición de fosfatidilserina y fosfatidilglicerol impartirá una carga negativa total a la preparación de lipodeet. En esta invención, hemos usado todas las tres cargas diferentes de lipodeet (positiva, negativa y neutral) y todas estas preparaciones proporcionaron resultados comparativamente semejantes. Por lo tanto, las formulaciones de la presente invención también tienen la ventaja adicional de que cualquier número de la combinación de drogas solubles en agua, incluyendo los antelminticos , antiprotozoanos, vacunas, etc. se incorporarán en la micela de lipodeet. Además, esta invención también expande la aplicación de usar DEET en combinación con varios vehículos, incluyendo pero no quedando limitados a aqentes tales como azacileptan-2-ona de 1-dodecilo ( laurocparam, Azone) , Catzomas, derivados de lauramida de hexametileno, derivados de azacicloalcanona, pirrolidonas , ácidos grasos y terpenos, que retendrán el DEET en las capas superficiales de la piel. Las microemulsiones que comprenden DEET también quedarán comprendidas mediante la presente invención. Estas microemulsiones comprenden DEET en un aceite, agua y un sistema de anfifilo que es macroscópicamente mono-fásico, ópticamente isotrópico, termodinámicamente estable y se caracteriza por valor de tensión interfacial ultrabaja. Cuando se retiene el DEET en las capas superficiales de la piel, tendrá acción repelente potencial en los insectos mordedores y efectos letales en los parásitos que penetran en la piel, como se señalará a continuación.

Aplicación de DEET contra etapas cercariales de esquistosomas humanos y animales Como se discute en lo que antecede la piel es la única vía conocida de entrada para parásitos de esquistosoma en seres humanos y animales. Las etapas no efectivas del parásito (cercarías) penetran en la piel intacta dentro de minutos después de ponerse en contacto con el agua. Por lo tanto, cualquier agente que interfiera con la entrada de cercaría en la piel, impedirá esencialmente la esquistosomiasis . Los siguientes ejemplos demuestran que el DEET es altamente letal para cercarías de Schistosoma mansoni y cuando se aplica a la piel impedirán la entrada y establecimiento de la infección. Después de una sola aplicación, la formulación de DEET de accionamiento prolongado específicamente lipodeet protegerá al huésped hasta durante 48 horas contra penetraciones de circarias y por lo tanto lo protegerá contra esquistosomiasis . Otra condición de enfermedad, que de conformidad con la invención puede impedirse usando la formulación descrita en la presente en un ser humano llamado "dermatitis esquisotomica" o "cercarial dermatitis" ocasionado por esquistosomas animales, se puede impedir o tratar con DEET. Más de una docena de especies de esquistosomas que ocasionan la dermatitis incluyendo Trichobilharzia ocellata , T. physellaef T. stagnicola , T. anatína, T. bezghei , T. schoutedemi , T. maegraithi , Giganthobilharzia hutoni , G. gyrauli , G. huronensis, G. sturniae, Austrobilharzia variglandis, A. enneri , Ornithobilharzia canaliculata , O. pricei, Schistsosomarium dothitti se han descrito en la región de los Grandes Lagos de los Estados Unidos. Los caracoles que transmiten estas enfermedades prevalencen extensamente en muchos lagos de Norteamérica. La enfermedad está caracterizada por una dermatitis intensa, edemas y áreas inflamadas rojizas en la piel que se exponen al agua. Las infecciones serias conducirán a insominio y fiebre. La reacción se hace intensa durante contacto repetido. Puesto que nuestra invención muestra que el lipodeet es altamente efectivo contra las etapas cercarial de esquistosoma, la cercarial dermatitis podría impedirse mediante la aplicación del DEET de accionamiento prolongado a la piel .

Aplicación contra otros parásito que penetran la piel Hay varios parásitos de nemátodo humanos y animales tales como Necator americanus, Ancylostoma sp. y, Strongyloides stercolaris que usan la piel como un puerto de entrada en el cuerpo. Aún cuando estos parásitos permanecen en la piel solamente durante un período de tiempo muy corto (unos cuantos minutos), el DEET puede tener un efecto letal en estos parásitos que penetran en la piel y por lo tanto impedir su migración a través de la piel. Por lo tanto, la presente invención está también dirigida a la protección de un animal huésped contra muchos parásitos de nemátodo que penetran la piel que ocasionan la enfermedad de debilitación.

Aplicación contra mosquitos para control de enfermedad llevada por un mosquito Dada que la actividad de las formulaciones de DEET de la presente invención permanecen en la piel durante más de 48 horas, se pueden usar para repeler la actividad contra mosquitos de la especie Anophilus y Culicine durante periodos de tiempo prolongados a concentración más baja en comparación con otras formulaciones de DEET.

Aplicación contra garrapatas y enfermedad llevada por la garrapata Las infecciones llevadas por garrapata son una de las enfermedades infecciosas que crecen más rápidamente en Norteamérica. Las infecciones que son transmitidas mediante las garrapatas incluyen enfermedad de Lyme, Babesiosis, Ehrlichiosis, fiebre manchada de Montaña Rocosa, fiebre de garrapata de Colorado, Tularemia, fibre de Recaída, encefalitis Powassan, y parálisis de garrapata. Estos agentes infecciones son transportados hacia el huésped a través de la salida de la garrapata durante su alimentación. De acuerdo con los Centros para Control de Prevención de Enfermedades (CDC) se dieron a conocer un mayor número de infecciones llevadas por la garrapata durante el período de 1994 a 1997 que los casos totales combinados dados a conocer para sarampión, paperas, rubéola, difteria, cólera, paludismo, leptospirosis , lepra, plaga, tétano, triquinosis, fiebre tifoidea, lambliasia y enfermedad de Legionario. Por lo tanto, cualquier agente que pueda repeler o impedir que las garrapatas muerdan la piel impedirán esencialmente todas las enfermedades transmitidas por la garrapata el DEET se conoce como siendo efectivo contra garrapatas bajo condiciones de laboratorio (V.B. Solberg, y otros, J. of Med. Entomoly 32: 870-875 (1995); S. Kumar, y otros, Med. Veterinary Entomology 6:47-50 (1992); P. Couch, y otros, American Journal of Hosp. and Pharm. 49:1164-1173 (1992)). Sin embargo, la aplicación de DEET para control de las mordidas de garrapata bajo condiciones del campo se limita debido a su despej amiento rápido de la piel y su corto periodo de actividad. Es impráctico aplicar DEET cada 30 minutos en animales que pastan o personas que caminan a través de vegetación infectada por garrapatas. Como se señalará a continuación, 10 por ciento de lipodeet cuando se aplica a la piel impedirá que se adhieran las garrapatas durante más de 72 horas. Las garrapatas que trataron de morder la piel en donde se aplicó lipodeet mueren un unos cuantos minutos. Por lo tanto, las formulaciones de DEET de accionamiento prolongado de la presente invención (Lipodeet, Pp2deet, Ppl5deet) serán de gran beneficio bajo condiciones de campo para controlar las mordidas de garrapatas y por lo tanto impedir las enfermedades transmitidas por la garrapata.

Aplicación contra otros insectos ordedores tales como moscas de arena, chinches de triatomidr pulgas y moscas negras Las formulaciones de DEET de accionamiento prolongado de la presente invención también serán útiles para controlar otros insectos mordedores tales como moscas de arena que transmiten la leishmaniasis, chinches de triatomid que transmiten la tripanosomiasis, y moscas negras que transmiten la oncocercasis . Puesto que el lipodeeet permanece en las capas superficiales de la piel a través de una duración de tiempo más prolongada, los insectos mordedores se han repelido durante un periodo de tierno prolongado con una aplicación. En áreas en donde hay insectos esto también reducirá la toxicidad ocasionada asociada con la aplicación repetida de DEET.

Aplicación contra sanguijuelas y otros organismos mordedores de la piel por ejemplo piojos. Puesto que el DEET se ha demostrado que es efectivo contra sanguijuelas y piojos (Mehr Z.A. y otros, J. of Med Entomology 21:665-669 (1984); M. Bar-Zeev, y otros, J. of Med. Entomology 9:215-218 (1972)), las formulaciones de la presente invención también pueden usarse en métodos para controlar mordidas de sanguijuela y la infección de piojos. Se ofrecen los siguientes ejemplos para fines ilustrativos únicamente y no se destina limitar el alcance de la invención, tal y como se señala en las reivindicaciones anexas. El Ejemplo 1 describe la preparación y recolección de cercarías irradiadas. El Ejemplo 2 describe la infección de animales con cercarías. El Ejemplo 3 describe la auto-radiografia de órgano entera. El Ejemplo 4 describe la selección de compuestos químicos como agentes de anti-penetración. El Ejemplo 5 describe el efecto in vitro de DEET en S. mansoni. El Ejemplo 6 describe el efecto de DEET en la morfología de cercarías. El Ejemplo 7 describe los efectos in vivo. El Ejemplo 8 describe el efecto de varias concentraciones de DEET en penetración de cercarías y establecimiento de lombrices. El Ejemplo 9 describe el efecto de DEET después de exponerse a infecciones con S. mansoni.

El Ejemplo 10 describe la duración de la actividad de DEET después de una sola aplicación en la piel . El Ejemplo 11 describe la preparación de las formulaciones que prolongan el efecto de DEET. El Ejemplo 12 describe estudios dirigidos a la localización en la piel de las formulaciones de DEET. El Ejemplo 13 describe el elfecto de formulaciones de DEET en los insectos mordedores. El' Ejemplo 14 describe el efecto de formulación de DEET de accionamiento prolongado en la fijación de las garrapatas a la piel.

Ejemplo 1 Preparación y Recolección de Cercarías Irradiado La especie Biomphalaria glabrata de caracoles infectados con S. mansoni se obtuvo del Dr. Fred Le is, Universaidad de Massachusetts, de Lowell, MA como parte de un subcontrato del Instituto Nacional de Alergia y Enfermedades Infecciosas (AI # 052590) . Los caracoles infectados se nantuvieron en agua exenta de cloro continuamente aereada en una habitación obscura mantenida a una temperatura constante de 29° a 30°C. El agua en el tanque de caracoles se cambió tres veces a la semana y los caracoles se alimentaron con cantidades pequeñas de lechuga esterilizada en autoclave y un pedazo de greda. Aproximadamente 30 días después de la fecha de infección, los caracoles se comprobaron individualmente para determinar la presencia del parásito observando la emergencia de cercarías desde los mismos como un resultado de exponerse a una fuente luminosa brillante durante una hora. Después de determinar que los caracoles estaban liberando cercarías, se irradiaron con -^^S-metionina como se describe anteriormente en Li y otros, Parasitology International, 46:55-65 (1997). Abreviando, los caracoles suspendidos en agua destilada, 0.5 mililitro por caracol) se expusieron a 20 microCi por mililitro de 35s_me-j;j_on-¡_na irradiada (irradiación Tran35S, ICN Pharmaceuticals, Inc., Irvine, CA; actividad especifica: 1047 Ci/milimoles ; catálogo #51006) a 37°C en la obscuridad. Después de 16 horas de exposición al radioisótopo, los caracoles se enjuagaron y se movieron a agua aereada fresca y se mantuvieron en la obscuridad durante tres días antes de inducir la caída de cercarías. Los cercarías se recogieron suspendiendo los caracoles en agua destilada caliente y exponiendo los mismos a una fuente luminosa brillante durante 1 hora. Cercarías irradiado emergente se recogió y se concentró pasando a través del tamiz de malla de alambre (38 micrómetros; Newark Wire Cloth Co . , Newark, NJ) . Después de la recolección de cercarías irradiada se suspendieron en agua destilada se contaron y se usaron en la infección. El procedimiento rindió consistentemente > 99 por ciento de cercarías irradiados.

Ejemplo 2 Infección de los Animales de Laboratorio con Schistosome cercarías Para experimentos de animales in vivo, se usaron ratones macho de la cepa CDl que pesaban de aproximadamente de 18 a 20 gramos comprados de Charles River Laboratories (de ilmington, MA) . El uso de animales en estos experimentos fue de acuerdo con el Decreto de Beneficiencia de animales y otros estatutos federales y reglamentos que se relacionan con animales como se manifiesta en la publicación del Instituto Nacional de Salubridad: Guia para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Los ratones se infectaron individualmente con cercarías de esquistosoma a través ya sea de la piel de la cola o a través de la piel abdominal afeitada. Para infección a través de la piel de la cola, el ratón se restringió en una jaula y la cola se sumergió durante 60 minutos en un tubo que contiene 250-300 cercarías irradiadas con -^S se suspendieron en 10 mililitros de agua destilada a temperatura ambiente. Para la infección a través de la piel abdominal el ratón se restringió en su lomo. Después de afeitar la piel abdominal, se aplicaron de 150 a 200 cercarías irradiadas con 35S a la piel en una gota de agua destilada, se cubrieron con una cubierta y se expusieron durante 30 minutos .

Ejemplo 3 Autorradiografia de órgano entera Para determinar la penetración en la piel y el establecimiento de la lombriz, toda la piel de la cola o el área de la piel abdominal gue se expuso a cercarías como se describe en lo que antecede y los pulmones se removieron de cada ratón al día séptimo después de la infección y se procesaron para técnicas de autorradiografía de órgano comprimidas como se describe anteriormente (JW Li y otros, Parasitology International 46: 55-65 (1997)) . Brevemente, la piel y los pulmones se montaron en una hoja de cartón cubierta con una envoltura de plástico y se mantuvieron bajo una prensa de tejido durante 48 horas a temperatura ambiente. El tejido prensado y secado luego se expuso a una película de rayos X (Fuji RX, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) a -70°C durante de 7 a 9 días. Después del revelado autorradiográfico, las manchas obscuras (que representan focos de plata reducidos en la película) se contaron y se calculó el porcentaje del establecimiento de lombrices (número de manchas/número total de cercarías usado para la infección X 100) . Los resultados de estos estudios demuestran que más de aproximadamente el 28 por ciento de la dosis efectiva de cercarías penetraron en la piel intacta. Del número total de cercarías que habían entrado en la piel, más del 50 por ciento habían migrado hacia los pulmones para el séptimo día.

Ejemplo 4 DEET como un Agente de Anti-Penetración Potente Contra Cercarías de Esquistosoma Durante las pasadas tres décadas, se seleccionaron varios compuestos químicos debido a su capacidad para conferir protección contra penetración cercarial, especialmente después de una aplicación a la piel. Entre estos cuantos compuestos como N,N-dietillauramida, Niclosamida, Cederol, hexaclorofeno, ftalato de dibutilo y benzoato de bencilo se encontró que tenían efecto cercaricidal significativo in vitro, (J.M. Naples y otros, supra, M.M. Grenan, y otros, supra; P.J. Fripp, y otros, supra; RR Abu-Elyazeed, y otros, Supra) .

Sin embargo, excepto en lo que se refiere a la Niclosamida, ninguna de las otras substancias químicas se probaron para su aplicación clínica bajo condiciones de campo. Durante los estudios para seleccionar un vehículo apropiado para aplicación a la piel de Cederol, una substancia química aislada del aceite de madera de cedro y que se muestra que tiene actividad cercaricidal in vitro (JM Naples y otros, Supra) contra cercarías, se descubrió que los vehículos que contienen N-dietil-m-toluamida (DEET) por si mismos eran altamente efectivos para impedir la penetración a la piel cercarial. El análisis extenso de cada uno de los componentes en el vehículo sugirió que la actividad de anti-penetración de la preparación se debía al DEET.

Ejemplo 5 Efectos. In Vitro del DEET en Cercarías de S. mansoni Basándose en las observaciones anteriormente citadas, el DEET se probó para sus efectos en cercarías de S. mansoni. El DEET puede obtenerse comercialmente y se compró de Fluka Chemical Corp. (de Ronkonkoma, NY) . Para estudios in vitro, las diluciones duplicadas en serie de DEET que varían de 30 por ciento a 0.24 por ciento se prepararon en isopropanol (Sigma, St. Louis, MO) y se transfirió 50 microlitros de cada dilución a pozos individuales de una placa de microvaloración inferior plana de 96 pozos (Costar, Cambridge, MA) . Los pozos de control recibieron 50 microlitros de isopropanol cada uno. Las placas luego se mantuvieron cubiertas con una capota y el fluido se dejó evaporar durante la noche. Al siguiente día se colocaron 50 cercarías de S. mansoni suspendida en 50 microlitros de un medio de RPMI-1640 (pH de 7.4; Gibco BRL) o solución salina estabilizada con fosfato (PBS, pH de 7.0) en cada pozo y la viabilidad de las cercarías se supervisó a los 30 minutos, 60 minutos y 4 horas. Se llevaron a cabo un total de 17 duplicados para cada dilución y para cada punto de tiempo en cualquier experimento determinado. Para determinar la viabilidad de las cercarías 10 microlitros de un Rojo Neutral al 0.05 por ciento (Sigma Chemical Co.) se añadió a cada pozo al final del experimento y el porcentaje de cercarías vivas y muertas se determinó como se describe en el artículos de He y otros, Acta Zoológica Sínica, 31:240:245 (1985) . Estos estudios in vitro demostraron que DEET a concentraciones de 15 por ciento y mayores era altamente letal para cercarías de S. mansoni (Figura 1) . Cuando se expusieron a estas concentraciones de DEET, las cercarías inmediatamente se inmovilizaron. El teñido rojo neutral 30 minutos después confirmó que el 100 por ciento de las cercarías estaban muertas. Un estudio de transcurso de tiempo mostró que el DEET a concentraciones de 7.5 por ciento inmovilizó inicialmente todas las cercarías dentro de 5 minutos y mediante las 4 horas el 100 por ciento de las cercarías estaban muertas. Sin embargo, las concentraciones menores de 7.5 por ciento de DEET fueron menos efectivas para inmovilizar o exterminar las cercarías de S. mansoni .

Ejemplo 6 Efecto de DEET en la Morfología de Cercarías Se evaluó el efecto de DEET en la morfología cercarial mediante estudios microscópicos electrónicos de transmisión. En estos experimentos, de aproximadamente de 300 a 500 cercarías de S. mansoni suspendidas en 100 microlitros de PBS se colocaron en cada pozo de una placa de 96 pozos revestida con distintas concentraciones de DEET (que variaban de 7.5 por ciento a 40 por ciento) o isopropanol (control) como se describe en lo que antecede. Las muestras se recogieron a los 5, 10, 20, 30 y 240 minutos después de exponerse a DEET y procesarse para microscopía electrónica de transmisión como se describe en el artículo de Salafsky y otros, Exper. Parasitol, 67:116-127 (1988). Abreviando, las cercarías recogidas de cada tubo se transfirieron a tubos nuevos que contienen PBS más 10 por ciento de suero bovino fetal (Sigma Chemical Co . ) y se concentraron en un gránulo mediante centrifugación a 500 revoluciones por minuto (300 gramos) durante 5 minutos. El gránulo luego se fijó durante la noche a 4°C en un fijativo que contiene 3 por ciento de gluteraldehido, y 1 por ciento de formaldehido en un estabilizador de fosfato de 0.1 M (pH de 7.2) . Durante una hora de pos-fijación en tetróxido de osmio al 1 por ciento, el gránulo se deshidrató a través de una serie de acetona graduada y se incrustó en la resina epon. Las secciones se examinaron en un microscopio electrónico de transmisión Hitachi H-500 después de teñirse con acetato de uranilo y citrato de plomo. Las imágenes microscópicas del electrón de transmisión de cercarías normales demostraron un tegumento corrugado intacto con glicocalyx externo, una sola membrana y una ausencia de gránulos de citón. La capa muscular y la parenquima más profunda estaban intactas, sin edema ni cambios degenerativos. Sin embargo, al exponerse a 7.5 por ciento de DEET, los cambios ultraestructurales de dos tipos se observaron: cambios de transformación que imitan los cambios normales en el tegumento de las cercarías durante su transformación en esquistosomulo, y cambios degenerativos indicativos de cambio celular serio. Ambos cambios eran evidentes tan pronto asi como cinco minutos después de la exposición pero se hicieron más severos con una duración aumentada de exposición. Los cambios típicos después de cinco minutos de exposición a DEET incluyen migración del gránulo de citón hacia el tegumento (indicativo de cambios de transformación) , cantidad disminuida de glicocalix, y cambios degenerativos tempranos tales como hinchamiento celular intra y extra, cambios edematoso difusos en el parenquima y lisis focal. Estos cambios se observaron en todos los parásitos examinados, aún cuando hasta un grado variable. Los cambios avanzaron en grado a los 10 y 30 minutos de duración de exposición. Los cambios de transformación con pérdida de migración de gránulo de citón y gicocalix, debido a que eran más prominentes se sobresombrearon generalmente mediante cambios degenerativos. La acumulación masiva de fluido extracelular eran común, ocasionando un aplastamiento del tegumento, y fractura de enfoque de la integridad del tegumento se observó desde luego. Los cambios degenerativos intracelulares de vacuolización, condensación y rotura de los miofilamentos en la capa del músculo, hinchamiento nuclear y condensación de cromatina, y lisis celular eran progresivos a través del transcurso del tiempo. La lisis franca de las cercarías se observó 240 minutos después de la exposición a DEET.

Ejemplo 7 Efectos In Vivo de DEET en la Penetración Cercarial a Través de la Piel y Establecimiento de Infección de Ratones En vista de los resultados anteriormente citados, se llevaron a cabo los experimentos para determinar los efectos de DEET en la penetración cercarial in vivo. Para la aplicación de DEET a la piel de la cola, los ratones se mantuvieron individualmente en jaulas restringidas y su cola se sumergió en una solución de DEET al 7.5 por ciento (preparada en isopropanol) durante 5 minutos. Después de la aplicación la piel se secó al aire durante 30 minutos, y se enjuagó en agua destilada durante 1 minuto antes de exponerse a las cercarías irradiadas de S. mansoni, como se menciona en el Ejemplo 3. Para la aplicación de DEET a la piel abdominal, los ratones se restringieron sobre su lomo y su abdomen se afeitó. Se dejaron caer hacia el abdomen 200 microlitros de una concentración apropiada de DEET en una solución de isopropanol y se dejaron secar durante 15 minutos. Despés de secarse, la piel se lavó durante 1 minuto con agua destilada y se expuso a cercarías irradiadas durante 30 minutos . Los resultados de los estudios in vivo demostraron que los animales de control que se trataron con sólo isopropanol, una proporción significativa (más del 28 por ciento) de la dosis de infección penetró en la piel intacta. Del total que había entrado en la piel, más del 50 por ciento había emigrado a los pulmones mediante el día 7. La aplicación de DEET al 7.5 por ciento a la piel antes de la infección dio por resultado una reducción significativa en la capacidad del parásito para penetrar en la piel intacta. Estos resultados muestran que solamente 0.13 por ciento de la dosis total de infección pudo penetrar en la piel revestidca con DEET al 7.5 por ciento (Cuadro 1) . Sin embargo, su capacidad para migrar a los pulmones se perdió completamente después del tratamient con 7.5 por ciento de DEET (Cuadro 1). Esto sugiere que el 7.5 por ciento de DEET es un agente de anti-penetración potente contra cercarías de esquistosomas .

Cuadro 1 Efecto de DEET en la entrada cercarial hacia la piel del ratón y el establecimiento de la infección Porcentaje de gusanos establecidos Grupos Piel Pulmones Total Control 9. .9 18.6 28.5 + 1.2% + 4.1% + 6.4% 7.5% de DEET 0 , , 13 0 0.13 + 0.01% + 0.00% n = 10 Ejemplo 8 Efecto de las Distintas Concentraciones de DEET en la Penetración Cercarial y Establecimiento de Gusanos El experimento descrito en el Ejemplo 7 se repitió con concentraciones variadas de DEET (5 por ciento, 10 por ciento, 20 por ciento, 40 por ciento) . A 5 por ciento la protección era de solamente 72 por ciento sugiriendo que esta concentración de DEET no es completamente efectiva, mientras que el DEET cuando se aplica a la piel a concentraciones de 10 por ciento, 20 por ciento o 40 por ciento, era 100 por ciento efectiva apra impedir la entrada de cercarías en la piel del ratón. Estos estudios por lo tanto, confirmaron los resultados anteriormente citados y demostraron que DEET podía usarse satisfactoriamente para impedir infecciones con 5. mansoni .

Ejemplo 9 Efecto de DEET Después de Exponerse a Infecciones con 5. mansoni A fin de determinar si el DEET tenía cualquier efecto en la penetración cercarial y migración después de exponerse a las cercarías, aplicamos 40 por ciento de DEET a la piel durante varios períodos de tiempo después de la infección. Es bien establecido que después de la entrada, el parásito permanece en la piel durante de 24 a 72 horas antes de migrar a los pulmones. Por lo tanto, los experimentos se llevaron a cabo para determinar si DEET es todavía capaz de matar los parásitos si se aplica a la piel después de exponerse a la infección. Si es efectivo, la exposición accidental potencial a la infección podría tratasrse con DEET. Los ratones se infectaron con cercarías irradiadas a través de la piel abdominal (como se describe en el Ejemplo 2) y aplicó 40 por ciento de DEET al sitio de infección a los 30 minutos, 4 horas, 24 horas o 48 horas después. El establecimiento de los gusanos se determinó mediante autorradiografia de órgano comprimido (como se describe en el Ejemplo 7) . Estos estudios demostraron que DEET cuando se aplica a la piel dentro de 30 minutos después de la exposición a las cercarías era 100 por ciento efectivo para impedir la infección. Sin embargo, la aplicación de DEET a la piel 4 horas después de la infección, no confirió protección alguna. Estos resultados demostraron que DEET puede usarse de manera efectiva para controlar la esquistosomiasis aún hasta 30 minutos después de la exposición a la infección.

Ejemplo 10 Duración de la Actividad de DEET Después de una Sola Aplicación a la Piel Se llevaron también a cabo experimentos para ver que tan prolongada permanecía la actividad cercaricida de DEET en la piel después de una sola aplicación. En estos experimentos, se aplicó 10 por ciento de DEET a la piel abdominal afeitada de los ratones y se dejó secar. Treinta minutos después de la aplicación de DEET, el área de la piel se lavó continuamente durante un minuto con agua destilada corriente. En puntos de tiempo diferentes (30 minutos, 1 hora, 4 horas, y 24 horas) después de la aplicación de DEET, los ratones se infectaron con sercarias irradiadas (como se describe en el Ejemplo 2) y el establecimiento de los gusanos se determinó mediante autorradiografia de órgano comprimida (como se describe en el Ejemplo 3) . Estos estudios demostraron que la exposición a la infección 30 minutos, una hora y cuatro horas después de la aplicación de DEET conferia 100 por ciento, 98 ± 1 por ciento, y ¦ 85 ± 1 por ciento de protección respectivamente contra esquistosomiasis . Sin embargo, la exposición a la infección 24 horas después no conferia ninguna protección. Estos resultados por lo tanto sugieren que el efecto de DEET en la piel dura solamente un tiempo corto, es decir, de 30 minutos a una hora.

Ejemplo 11 Formulacionj es para Prolongar los Efectos de DEET en la Piel En un intento para identificar un vehículo apropiado que retenga la actividad de DEET a través de un tiempo de duración más prolongado en las capas superiores de la piel, especialmente la capa córnea de la uña, analizamos la capacidad del Poliolprepolímero 2 (Penederm Incorporated, Foster City, CA; distribuido por Barnet Products Corp., de Englewood Cliffs, de NJ) , el Poliolpolímero 15 (Barnet Products Corp.) y el estuche de liposoma cargado positivamente (colina de L-alfa-fosfatidilo 63 micromoles, estearilamina 18 micromoles, colesterol 9 micromoles, lote 47H8350, número de catálogo Signa L-4395) . El Pp2deet (preparaciones que contienen 10 por ciento de DEET más 10 por ciento de poliolprepolimero 2 en isopropanol) se elaboró añadiendo un mililitro de la solución al 100 por ciento de DEET a 9 mililitros del poliol prepolímero 2 al 10 por ciento en isopropanol, y agitándose vigorosamente durante 10 minutos a temperatura ambiente. El Ppl5deet (10 por ciento de DEET más 10 por ciento del poliol prepolímero 15 en isopropanol) se preparó de manera semejante al Pp2deet. Otras concentraciones de los poliol prepolímeros y DEET son asimismo útiles en la práctica de la invención. Por ejemplo, las concetraciones del poliol prepolímero pueden variar de aproximadamente 1 por ciento en peso/ volumen hasta aproximadamente 70 por ciento en peso/ volumen aún cuando se prefiere 10 por ciento en peso/ volumen . El lipodeet multilamelar cargado positivamente se preparó añadiendo 1.0 mililitro de DEET al 100 por ciento a 63 micromoles de L-alfa-fosfatidilcolina, 18 micromoles de estearilamida y 9 micromoles de colesterol. La mezcla se mezcló bien hasta que se formó una solución uniforme. Una solución al 10 por ciento de la micela de lipodeet multilamelar se prearó luego añadiendo 9.0 mililitros de una solución salina estabilizada con fosfato (PBS) a la mezcla y agitándose vigorosamente durante 10 minutos a temperatura ambiente. La mezcla de lipodeet luego se dejo reposar durante 10 minutos a temperatura ambiente. El tamaño y estructura de la micela se observaron bajo un microscopio (amplificación de 100 veces) para confirmar la uniformidad. Los liposomas de acuerdo con la presente invención no requieren la presencia de una molécula de anclaje tal como piridintiona de sodio, como se requiere mediante los liposomas de la Patente Número 5,173,303, y que se incorpora en la presente por referencia. Para determinar el efecto de las formulaciones en la penetración cercarial y migración, se aplicaron los vehículos Pp2deet, Ppl5deet o Lipodeet a la piel abdominal, como se detalla en el Ejemplo 7. Los diferentes puntos en tiempo después de la aplicación a la piel (4 horas, 24 horas o 48 horas) los ratones se infectaron con cercarías irradiadas y se midió el establecimiento del gusano, mediante autoradiografía de órgano comprimido. Estos estudios demostraron que comparado con DEET solo, todos los tres vehículos probados prolongaron el efecto del DEET en la piel hasta las 48 horas. Los resultados se representan en la Figura 2. De los tres vehículos probados, el lipodeet parecía que era el más eficiente para reponer la actividad de DEET en la piel, que los poliolprepolímeros, aún cuando todos los tres compuestos se usaron de manera efectiva. Estos datos establecen que la formulación de la presente invención, las preparaciones de accionamiento prolongado de DEET permiten la retención de la actividad de DEET en la piel, a través de una duración de tiempo más prolongada, reduciendo al mínimo de esta manera su absorción y catabolismo y toxicidad. Otras preparaciones de liposomas que difieren en las cargas (referencias positiva, negativa y neutral a aquellos liposomas), o que difieren en la composición de la molécula hidrofílica (un antelmintico de espectro amplio soluble en agua, tal como praziquantel o tiabendazol en vez de PBS) se puede usar para proporcionar una combinación de formulación de terapia/profiláctica, con o sin DEET.

Ejemplo 12 Cuantificación y Localización de la Cantidad de Formulaciones de DEET en la Piel La cuantificación y evaluación de la cantidad de DEET retenida en la piel cuando se administra la formulación de lipodeet y la identificación en cual de las capas de la piel se localiza el DEET, se logra usando una preparación de lipodeet irradiada con 14C (DEET 14C más liposomas cargados positivamente como se describe en lo que antecede) . La colocación del DEET en varias capas de la piel (como se determina mediante teñido histológico) se miden mediante cuenta de escintiliación mediante autoradiografia . La formulación se aplica a la piel y pedazos de la piel se quitan durante distintos periodos de tiempo (30 minutos, 4 horas, 8 horas, 24 horas, 48 horas y 72 horas) después de la aplicación y se evalúan. Estos estudios demostraron que a los 30 minutos, 4 horas y 8 horas después de la aplicación, había presente el 100 por ciento del Lipodeet irradiado con 14C en las capas superficiales de la piel. El recuento de escintilación después de 24 horas mostró que 84 ± 2 por ciento del Lipodeet irradiado con l^C estaba todavía presente en la piel. El análisis a las 48 y 72 horas de mostró que hay una disminución gradual en la cantidad del Lipodeet irradiado con 14C en la piel (52 ± 12 por ciento y 36 ± 17 por ciento, respectivamente) . Estos resultados se confirmaron mediante técnicas de depuraciónde de piel, como se describe en el artículo de Artmann y otros, Drug Research, 40:12-28 (1965) . Estos estudios demostraron que más del 91 por ciento del Lipodeet irradiado con -^C es retenido en la capa córnea de la uña durante las primeras 24 horas después de una sola aplicación.

Ejemplo 13 Efecto de DEET en Garrapatas Para determinar el efecto de DEET en la fijación y alimentación de garrapatas se usaron dos especies de garrapatas Amblyoma amercanum y Dermacetor variabilis compradas de la Universidad de Oklahoma. La garrapatas se dejaron alimentar en las orejas de conejos blancos de Nueva Zelanda macho, comprados de .Charles River. Para alimentación, se introdujeron cinco garrapatas en un pozo de célula de 60 micróemtros (Fisher Scientific) que estaba fijado a la oreja del conejo con goma para la uña. Las garrapatas se observaron cada 30 minutos durante las primeras ocho horas evaluar su fijación a la piel y comportamiento de alimentación. La fijación de la garrapata se definió como un tiempo mínimo requerido para que tres de las cinco garrapatas se fijaran a la oreja. Si las garrapatas no se fijaban aún después de 24 horas, se quitaban y se introducían en el mismo pozo cinco nuevas garrapatas y se observaron como anteriormente. La observación se continuó durante 72 horas para ambas especies de garrapatas. Se usaron conejos separados para cada especie y para cada tratamiento. Los resultados demuestran que el tiempo de fijación para Dermacetor y ñmblyoma en la oreja de los conejos normales era de 4.5 horas y 20 horas, respectivamente. Sin embargo, las aplicaciones de 10 por ciento de DEET a la oreja antes de la introducción de las garrapatas dio por resultado que no hubo fijación de garrapatas durante las 7.0 horas iniciales en el el caso de Dermacetor y 22.0 horas iniciales para Amblyoma. Esto sugiere que DEET es efectivo durante unas cuantas horas a través de las lineas de base respectivas. Todas las garrapatas en este estudio eran activas hasta que se fijaron. Estos resultados confirman los estudios anteriores de que DEET es un repelente efectivo contra mordedura de garrapata aún cuando el efecto es de corta duración.

Ejemplo 14 Efecto de Lipodeet en las Garrapatas · Para determinar el efecto del lipodeet de accionamiento prolongado en la fijación de la garrapata y comportamiento de alimentación, se aplicaron 100 microlitros de la preparación de 10 por ciento de lipodeet, como se describe en lo que antecede a la piel dorsal de la oreja del conejo y se introdujeron cinco garrapatas en cada una como se describe en el Ejemplo 13. Las garrapatas se supervisaron cada 30 minutos durante las primeras ocho horas y luego cada 24 horas. Se introdujeron cinco garrapatas nuevas cada 24 horas hasta durante 72 horas. En estos experimentos se usaron las dos mismas especies de garrapatas como se describe en el Ejemplo 13. Los resultados demuestran que las garrapatas dejaron de fijarse a la piel aún hasta las 72 horas después de la aplicación de lipodeet. Todas las garrapatas introducidas durante las primeras 48 horas estaban muertas dentro de las cinco horas después de la introducción, sugiriendo que 10 por ciento de lipodeet era letal para las garrapatas. Las garrapatas introducidas después de las 48 horas, tres de las cinco estaban muertas dentro de cinco horas y el resto no se había fijado hasta las 72 horas. Estos resultados que el lipodeet es 100 por ciento efectivo contra mordeduras de garrapata hasta las 72 horas después de una sola aplicación.

Ejemplo 15 Efecto de Lipodeet en Otros Insectos Mordedores Las formulaciones de la presente invención son ¦ también útiles como repelentes contra otros vectores del antrópodo mordedor, tales como las moscas de arena, mosquitos y chinches que transmiten infecciones mortales tanto en seres humanos como animales. Los huéspedes experimentales tales como ratones (para chinches) , perros (para moscas de arena) y seres humanos (mosquitos) son bien conocidos en la técnica. Estos animales huésped se tratan con formulaciones de la presente invención y la capacidad de los vectores del artrópodo para alimentarse en el huésped se evalúan. Las dosificaciones apropiadas de las formulaciones se determinam fácilmente mediante métodos tales como aquellos descritos en lo que antecede, bien conocidos en la técnica. Los ejenplos anteriormente citados se presentan a modo de ilustración y no debe interpretarse de manera alguna como limitando el alcance de la presenta invención, tal y como señala en las reivindicaciones anexas.

LITERATURA CITADA Las referencias citadas a continuación se incorporan en la presente por referencia. Artman, C, Roding J, Ghyczy M, Liposomas de fosfolipidos de soya como portadores de dorga percutánea. Las investigacionj es cualitativas in vivo mediante macromoléculas y liposomas cargadas con sal con irradiación radioactiva. Drug Researc 40: 12-28, 1965.

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Claims (35)

1. REIVINDICACIONES 1. El uso de una cantidad antiparasíticamente efectiva de una composición que comprende N, -dietil -m-toluamida (DEET) , para la elaboración de un medicamento para prevenir la enfermedad parasitaria ocasionada por parásitos que penetran la piel .
2. 2. El uso de la reivindicación 1, en donde la composición comprende de aproximadamente 1 por ciento en peso/volumen a aproximadamente 5 por ciento en peso/volumen de DEET.
3. 3. El uso de la reivindicación 1, en donde la composición comprende de aproximadamente 7.0 por ciento a aproximadamente 10 por ciento de DEET.
4. 4. El uso de la reivindicación 1, en donde la composición comprende aproximadamente 7.5 por ciento de DEET.
5. 5. El uso de las reivindicaciones 1, 2 3 ó 4, en donde la composición además comprende una droga antihelmíntica que se selecciona del grupo que consiste de drogas antihelmínticas solubles es agua y drogas antihelmínticas insolubles en agua.
6. 6. El uso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1, 2 3 ó 4, en donde el parásito que penetra la piel es un Esquistosoma.
7. 7. El uso de la reivindicación 5, en donde el parásito que penetra la piel es un Esquistosoma.
8. 8. El uso de conformidad con la reivindicación 7, en donde el Esquistosoma se selecciona del grupo que consiste de Schistoso a mansoní , Schistosoma hematobium, y Schistosoma japonicum, Trichobilharzia ocellata, T. stagnicola, T. anatina, T. berghei, T. shoutedeni, T. maegraithi, Giganthobilharzia huttoni , G. gyrauli, G. huronensis, G. sturniae, Autrobilharzia variglandis, A. enneri, Ornithobilharzia canaliculata, O. pricei, Schistsosomatium douthi tti .
9. 9. El uso de conformidad con la reivindicación 8, en donde el Esquistosoma se selecciona del grupo que consiste de Schistosoma mansoní, Schistosoma hematobium, y Schistosoma japonicum, Trichobilharzia ocellata, T. stagnicola, T. anatina, T. berghei, T. schoutedeni, T. maegraithi, Giganthobilharzia huttoni, G. gyrauli, G. huronensis, G. sturniae, Austrobilharzia variglandis, A. enneri, Ornithobilharzia canaliculata, O. pricei, Schistsosomatium douthitti .
10. 10. El uso de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 7, 8 y 9, en donde la composición además comprende un portador que se selecciona del grupo que consiste de poliolprepolímeros y liposomas .
11. 11. El uso de la reivindicación 5, en donde la composición además comprende un portador que se selecciona del grupo que consiste de poliolprepolímeros y liposomas.
12. 12. El uso de la reivindicación 6, en donde la composición además comprende un portador que se selecciona del grupo que consiste de poliolprepolímeros y liposomas.
13. 13. El uso de la reivindicación 5, en donde el portador es un liposoma que se selecciona del grupo que consiste de liposomas neutrales, catiónicos y aniónicos.
14. 14. El uso de la reivindicación 6, en donde el portador es un liposoma que se selecciona del grupo que consiste de liposomas neutrales, catiónicos y aniónicos.
15. 15. Una composición antiparasitaria que comprende un liposoma y N, -dietil -m-toluamida (DEET) .
16. 16. La composición de la reivindicación 15, en donde el liposoma se selecciona del grupo que consiste de liposomas catiónicos, aniónicos y neutrales.
17. 17. La composición de la reivindicación 15, que además comprende una droga antihelmíntica.
18. 18. La composición de la reivindicación 15, en donde el liposoma comprende L-alfa-fosfatidilcolina, estearilamina y colesterol .
19. 19. La composición de cualesquiera de las reivindicaciones 15 a 18, en donde el DEET es de aproximadamente 1 por ciento a aproximadamente 50 por ciento de DEET.
20. 20. La composición de conformidad con cualesquiera de las reivindicación 15 a 18, en donde el DEET es de aproximadamente 7 por ciento a aproximadamente 10 por ciento de DEET.
21. 21. La composición de cualesquiera de las reivindicaciones 15 a 18, en donde el DEET es de aproximadamente 7.5 por ciento de DEET.
22. 22. El uso de una dosis efectiva contra insectos de una composición que comprende N, -dietil -m-toluamida (DEET) en un portador, en donde el portador se selecciona del grupo que consiste de liposomas y poliolprepolímeros , para la elaboración de un medicamento para repeler insectos.
23. 23. El uso de la reivindicación 22, en donde la composición comprende -de aproximadamente 1 por ciento en peso por volumen a aproximadamente 50 por ciento en peso por volumen de DEET.
24. 24. El uso de la reivindicación 22, en donde la composición comprende de aproximadamente 7.0 por ciento a aproximadamente 10 por ciento de DEET.
25. 25. El uso de la reivindicación 22, en donde la composición comprende aproximadamente 7.5 por ciento de DEET.
26. 26. El uso de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 22, 23, 24 ó 25, en donde el insecto es un artrópodo .
27. 27. El uso de la reivindicación 20, en donde el insecto es un artrópodo que se selecciona del grupo que consiste de mosquitos, garrapatas, moscas negras, niguas, dípteros pequeños, chinches, reduvideos, mosca tsetse y moscas de venado.
28. 28. Una composición repelente de insectos que comprende un liposoma y N, -dietil -m-toluamida (DEET) .
29. 29. La composición de la reivindicación 28, en donde el liposoma se selecciona del grupo que consiste de liposomas catiónicos, aniónicos y neutrales.
30. 30. La composición de la reivindicación 28, en donde el liposoma consiste esencialmente de fosfatidilcolina, estearilamina y colesterol .
31. 31. La composición de cualesquiera de las reivindicaciones 28, 29 ó 30, en donde el DEET es de aproximadamente 1 por ciento a aproximadamente 50 por ciento de DEET.
32. 32. La composición de cualesquiera de las reivindicaciones 28, 29 ó 30, en donde el DEET es de aproximadamente 7 por ciento a aproximadamente 10 por ciento de DEET.
33. 33. La composición de cualesquiera de las reivindicaciones 28, 29 ó 30, en donde el DEET es de aproximadamente 7.5 por ciento de DEET.
34. 34. Un método para la fabricación de un medicamento para evitar la enfermedad parasitaria, el método comprende los pasos de: a) preparar una solución de N, -die i 1-n- oluamida (DEET) ; b) mezclar el DEET del paso a) con un glicerofosfolípido; c) añadir la mezcla obtenida en el paso b) a una solución salina estabilizada con fosfato; y d) mezclar vigorosamente la mezcla obtenida en el paso c) a fin de permitir la formación de liposomas.
35. 35. El método de la reivindicación 34, en donde el glicerofosfolípido del paso b) comprende uno o más glicerofosfolípidos que se seleccionan del grupo que consiste de fosfotidilcolina, colesterol, estearilamina, fosfotidilserina y fosfatidilglicerol .