MXPA98002013A - Mananasa purificada a partir de bacillus amyloliquefaciens y metodo de preparacion - Google Patents

Abstract

De acuerdo a la presente invención se proporciona una enzima mananasa purificada obtenida a partir Bacillus amyloliquefaciens. Preferentemente, la mananasa de la invención tiene un peso molecular cercano a 35,000 cuando es analizado con el método SDS-PAGE y 20,000 cuando es medido por filtración de gel, un punto isoeléctrico (pl) de cerca de 5.2-5.6, un pHóptimo de cerca de 1.8-5.2 y una vida media a 80øC de cerca de 45 segundos. En otra modalidad de la invención, un método se proporciona para la preparación de una mananasa purificada derivada de Bacillus amyloliquefaciens.

Description

MAÑANASA PURIFICADA A PARTIR DE BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS Y MÉTODO DE PREPARACIÓN ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a la nueva enzima mananasa. Más específicamente, la presente invención se refiere a una nueva mananasa obtenida a partir de Bacillus amyloliquefaciens, su producción y uso de esa mananasa, particularmente en el blanqueo de pulpa de madera .

Los usos industriales de hemicelulosas han llegado a ser importantes comercialmente en años recientes. Además para aplicaciones en alimento de animales y textiles, en pulpa y papel utilizando hemicelulosas continúan en expansión. Mientras la industria de papel ha encontrado uso de enzimas en el control de resina, eliminación de agua y eliminación de tinta, estos usos están generalmente todavía en experimentación. Sin embargo, la utilización en pre-blanqueo de pulpa utilizando xilanasa es una tecnología establecida. Se cree que la xilanasa hidroliza xilanas precipitadas las cuales están asociadas con lignina cromofórica sobre las superficies de pulpa de madera fuerte (pulpa raft) , dando como resultado una REF: 26944 extractabilidad de lignina mejorada y una eficiencia de blanqueado. Con el uso de xilanasa, el consumo de químicos clorados se reduce, lo cual reduce significativamente los niveles de desechos peligrosos liberados en la corriente de desecho del molino, los compuestos orgánicos halogenados son el principal subproducto del proceso de blanqueo utilizando cloro y compuestos que contienen cloro. En lo que se refiere a regulaciones ambientales las efluentes de los molinos de pulpa de madera, las alternativas libres de cloro para blanqueo de pulpa llegan a ser críticas para la industria de la manufactura de papel. Las secuencias del blanqueo libre de cloro, las enzimas han sido exitosamente utilizadas para mejorar la brillantez o mejorar la calidad de la pulpa, en parte debido a la necesidad disminuida por el peróxido de hidrógeno.

Las mañanas y glucomananas son hemicelulosas asociadas con la xilana y lignina sobre las superficies de la pulpa de madera y las capas interiores. Como resultado, los pretratamientos de la pulpa con una combinación de mananasa y xilanasa ha sido demostrado en resultar en más alta brillantez que aquella obtenida con xilanasa sola (ver por ejemplo, Ross et al., Enzyme-microb, Technol . , vol. 14, no. 2, pp. 90-95 (1992)).

Las mananasas han sido identificadas en algunos organismos de Bacillus . Por ejemplo. Talbot et al., Appl . Environ. Microbiol . , vol 56, no. 11, pp . 3505-3510 (1990) describe una ß-mananasa derivada de Bacillus stearothermiphillus en forma de dimero teniendo un peso molecular de 162,000 daltones y un pH óptimo de 5.5-7.5.

Mendoza et al., World J. Microbio. Biotech., vol. 10 no. , pp. 551-555 (¡994) describe una ß-mananasa derivada de Bacill us subtilis teniendo un peso molecular de 38,000 daltones, una actividad óptima a pH 5.0 y a 55° C y un pl de 4.8. La JP 0304706, Acceso Derwent No. 91-07734, describe una ß- mananasa derivada de Bacillus sp. Teniendo un peso molecular de 37, 000+/-3 , 000 daltones cuando se miden por filtración en gel, un óptimo pH de 8-10 y un pl de 5.3-5.4.

El arte previo, sin embargo, falla en identificar una mananasa derivada del Bacillus amyloliquefaciens , como se describe a continuación.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN De acuerdo a la presente invención, se proporciona una enzima mananasa purificada obtenida a partir Bacillus amyloliquefaciens . Preferentemente, la mananasa de la invención tiene un peso molecular cercano a 35,000 cuando es analizado con el método SDS-PAGE y 20,000 cuando es medido por filtración de gel, un punto isoeléctrico (pl) de cerca de 5.2-5.6, un pH óptimo de cerca de 4.8-5.2 y una vida media a 80° C de cerca de 45 segundos. En otra modalidad de la invención, un método se proporciona para la preparación de una mananasa purificada derivada de Bacillus amyloliquefaciens .

En otra modalidad de la invención, la mananasa de la invención es utilizada en el blanqueo de pulpa de madera y papel. Preferentemente, la mananasa es utilizada en combinación con una xilanasa.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN De acuerdo con la modalidad preferida de la invención, un caldo de fermentación de Bacillus amyloliquefaciens se prepara. Después de la separación de las células enteras, las células fragmentadas y la materia particular, el sobrenadante es tratado de esta manera para concentrar y aislar las mananasas en el sobrenadante. En una modalidad preferida de la invención, las mananasas purificadas comprenden un peso molecular de cerca de 33-37 kD cuando se determina por el método de SDS-PAGE y cerca de 18-22kD cuando se determina con el método de filtración con gel, un pl de cerca de 5.2-5.6, un pH óptimo de cerca de 4.8-5.2 y una vida media de cerca de 45 segundos a 80° C. La más preferida, la mananasa purificada comprende un peso molecular de cerca de 35 kD cuando se determina por el método de SDS-PAGE y cerca de 18-22kD cuando se determina con el método de filtración con gel, un pl de cerca de 5.4, un pH óptimo de cerca de 5.0.

La fermentación de Bacillus amyloliquefaciens para producir mananasa de acuerdo con la invención puede ser acompañada de acuerdo con cualquier método del arte reconocido de cultivo de estos microorganismos. Preferentemente, tales condiciones son manipuladas para maximizar la producción de mananasa, cuyas condiciones son bien conocidas en el arte.

La purificación de mananasa a partir del caldo de fermentación puede ser por cualquier medio del arte reconocido para purificación de tales composiciones. Por ejemplo, filtración con gel o ultrafiltración son medios adecuados para purificar la mananasa.

En otra modalidad de la invención, la mananasa de la invención es utilizada en el blanqueo de pulpa de madera para la producción de papel. Mientras el uso de la mananasa sola en el blanqueo de pulpa de madera proporciona un beneficio incremental, es particularmente preferida utilizar mananasa de la invención en combinación con xilanasa para proporcionar excelentes resultados de blanqueo. El tratamiento de enzima (mananasa o mananasa/xilanasa) puede ser utilizado en cualquier fase del proceso de blanqueo, sin embargo, es particularmente preferido que la mananasa sea utilizada antes del blanqueo con químicos conteniendo cloro. Adicionalmente se prefirió que el blanqueo enzimático sea utilizado en combinación con blanqueo de oxígeno para limitar o aún eliminar el uso de químicos conteniendo cloro a partir del proceso de blanqueo.

Una dosis adecuada para mananasa durante el blanqueo de pulpa de madera es cerca de 10-500 nkat/g de pulpa de madera cuando la actividad es medida por una prueba de DNS . Las condiciones para tratamiento de pulpa con mananasa son hábilmente acertadas por aquellos con habilidad en el arte, sin embargo, una temperatura adecuada de cerca de 40° C a cerca de 60° C y un pH adecuado es desde cerca de 4.0 a cerca de 7.0. Una dosis adecuada para xilanasa cuando es utilizada en combinación con mananasa es cerca de 0.10 a 200 unidades/g de pulpa seca, y más preferentemente 0.50 a 50 unidades/g. La actividad de xilanasa de las preparaciones de enzimas es determinada como sigue: a 1.8 mi de solución de xilana (0.6% Sigma No. X-0627, preparada en 0.05 m de solución amortiguadora de acetato de sodio y ajustada a un pH de 5.3 con ácido acético), 0.200 mi de una enzima diluida adecuadamente en la misma solución amortiguadora es adicionada. La solución es incubada a 40° C por exactamente 30 minutos. La reacción es entonces parada adicionando 3 mi de reactivo DNS (3 , 5-dinitrosalicilato 10g/l; tartrato de Na,K 300g/l) , y el color es desarrollado por ebullición de la muestra por 5 minutos. La absorbencia es entonces medida a una longitud de onda de 540 nm. Una unidad de enzima libera un micromol de azúcares reducidos calculada a xilosa por minuto bajo las condiciones de prueba. La actividad es calculada a partir de la dilución de enzimas liberando 4 micromoles de azúcares reducidos bajo las condiciones de prueba.

La presente invención puede ser aplicada para mejorar cualesquiera de la amplia variedad de pulpas de madera crudas o procesadas. Las pulpas procesadas, i. e., pulpas las cuales han sido ya previamente tratadas para reducir el contenido de lignina, son preferentemente tratadas en el proceso de acuerdo a la invención a una mejora adicional de remoción de lignina y abrillantamiento de las pulpas. La invención es particularmente aplicable a las pulpas químicas de madera, esto es, a aquellas en las cuales el componente lignina ha sido químicamente modificado por varios tratamientos químicos tales como en los procesos de sulfato (papel kraft) o sulfito y/o delignificación por oxígeno, y es preferentemente aplicada a pulpas de madera kraft. En el método preferido, las enzimas de la presente invención son aplicadas a la pulpa de madera kraft después de la digestión o de la delignificación por oxígeno pero previa al tratamiento de blanqueo químico. En el caso donde ambas digestiones kraft y deligníficación por oxígeno sean llevadas a cabo sobre la misma pulpa, la enzima es preferentemente aplicada después de la delignificación por oxígeno. La presente invención es también aplicable a las pulpas blanqueadas por ozono o a las pulpas las cuales son blanquedas en secuencias conteniendo ozono.

Los extractantes son utilizados a menudo en el blanqueo de pulpas de madera para remover el componente de lignina modificada subsecuente al blanqueo. En una modalidad preferida de la invención, la pulpa de madera tratada con las enzimas de la presente invención es subsecuentemente tratada con químicos degradatorios de lignina tales como el cloro, dióxido de cloro y peróxido, y entonces con un extractante adecuado, seguido por la degradación de lignina con blanqueo químico o enzimas y un tratamiento final con un extractante apropiado. Los extractantes los cuales solubilizan el componente de lignina afectado incluyen bases tales como hidróxidos de metales alcalinos (E) , DMF, dioxano, acetona, y alcohol. Las extracciones de hidróxido pueden ser combinadas con peróxido de hidrógeno (Ep) u oxígeno (E0) . La pulpa resultante puede entonces posteriormente blanquearse por una secuencia de blanqueo químico tal como el dióxido de cloro (DED) o peróxido (P-P) para la brillantez deseada. Ahorros substanciales de químicos son observados cuando el método de la presente invención es practicado en comparación con el blanqueo de la pulpa preparada blanqueda a la misma brillantez por la misma secuencia excepto sin utilizar el tratamiento enzimático por reducción del uso de la cantidad de químicos conteniendo cloro o peróxido. Similarmente, la ejecución de la presente invención con las enzimas anteriormente presentadas, uno puede aplicar la misma cantidad de químicos para blanqueo a la pulpa y aún alcanzar una mayor brillantez en la pulpa tratada.

La invención será posteriormente descrita por referencia a los siguientes ejemplos, los cuales son ilustrativos en propósito y no intentan ser limitativos.

EJEMPLOS Ejemplo 1 Purificación de Mananasa a partir de un Caldo de Fermentación de Bacillus amyloliquefaciens El Bacillus amyloliquefaciens, ATCC #23842, creció bajo condiciones incluyendo Proflo 1%, goma de algarrobo 1% y 67.5 ml/1 de un medio conteniendo 8.2 g/1 de KH2P04, 91.2 g/1 de Na2P04.7H20, 5 g/1 MgS04.7H20, 10.4 g/1 de KC1. 11.8 g/1 de citrato de sodio.2H20 y 20 g/1 de extracto de levadura. La fermentación fue llevada a cabo por 4-6 días a 37° C bajo agitación constante a cerca de 250 rpm en un matraz agitado suavemente. Utilizando una combinación de ultrafiltración, gel de filtración, cromatografía de intercambio iónico como se describe posteriormente, la mananasa purificada se obtuvo. El sobrenadante del cultivo, 375 mi, enriquecidos por la mananasa fue concentrado utilizando un agitador de células Amicon (350 mi de capacidad, membrana PM-10) a un volumen final de 75 mi. 25 mi de este concentrado fueron aplicados a una columna de filtración por gel (XK 26/100 empacada con Sephacryl S-100 HR, Pharmacia) la cual ha sido equilibrada con 10 mM tris-HCl, pH 9.0. La velocidad de flujo utilizada fue de 0.5 ml/min, las fracciones de 15 mi fueron colectadas, la absorbencia UV fue monitoriada a 280 nm. La actividad de la mananasa en las fracciones resultantes fueron detectadas utilizando una prueba de substrato de RBB-glucomanana (ver abajo) . La actividad eluyó en las cuatro fracciones hacia el comienzo del pico de absorbencia principal. Este procedimiento fue repetido dos o más veces; todas las fracciones con actividad de mananasa fueron combinadas. 100 mi del material combinado fueron entonces aplicados sobre una columna de cromatografía de intercambio iónico (FPCL 10/10 empacada en Q-Sepharosa, Pharmacia) equilibrada con 10 mM tris HCl, pH 9.0. La velocidad de flujo de 2 ml/min, la absorbencia UV fue monitoriada a 280 nm así como su conductividad, fracciones de 1.5 mi fueron colectadas. Después de lavar la columna con 10 mi (2 volúmenes de vacío) , la elución fue llevada con 100 mi en un gradiente incremental linear de NaCl, a partir de 10 mM-tris-HCl, pH 9.0 a 100 mM NaCl en 10 mM-tris-HCl, pH 9.0. La actividad de la mananasa fue determinada como se hizo anteriormente, la mayor parte de la cual fue encontrada por eluir aproximadamente a la mitad del camino a través del gradiente de sal, en las cuatro fracciones. El grado de pureza fue determinado utilizando geles concentrados en el isoeléctrico de coloración plata (IEF) sobre un PhastSystem (Pharmacia) . Los geles IEF revelaron mananasa homogénea en las primeras tres de las cuatro fracciones anteriormente mencionadas.

Ejemplo 2 Caracterización y Propiedades de la Mananasa a partir de de Bacillus am?loliquefaciens TÉCNICAS. La actividad relativa de la mananasa fue determinada utilizando un substrato de glucomanana de madera de abedul con color azul brillante remazol (RBB-manana) (Megazime, Sidney, Australia) . Las muestras, 200 µl, fueron mezcladas con 250 µl de solución substrato (2% (p/v) RBB-manana en 300 M de acetato de sodio pH 4.5) incubadas a 40° C por 10 minutos. La mañana no digerida fue precipitada por la adición de 1 mi de etanol 95% y removida por centrifugación. El colorante remanente en solución fue cuantificado por espectrofotometría (OD590) y fue proporcional a la actividad de mananasa.

La actividad de mananasa fue cuantificada utilizando un método DNS para la cuantificación de los azúcares reducidos resultantes. La muestra, 200 µl, fue mezclada con 1.8 mi de substrato de galactoglucomanana (0.5% (p/v) de goma de algarrobo en 50 mM citrato de sodio, pH 5.3) e incubada por 10 minutos a 50° C. La solución de DNS (1% (p/v) de tartrato de sodio-potasio y 1.6% (p/v) NaOH), 3 mi, fue adicionada a una solución en ebullición por 5 minutos. La OD a 540 nm fue medida y fue una función de la actividad del azúcar liberado/mananasa cuando se comparó a una curva estándar, las unidades son reportadas en nkat/ml.

El concentrado isoeléctrico (IEF) y la electroforesis en gel de poliacrilamida sulfato dodecil de sodio (SDA PAGE) fueron llevadas a cabo utilizando un PhastSystem (Pharmacia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los marcadores utilizados para determinación de pl fueron un amplio juego pH 3.5-9.3 (Pharmacia Biotech) . Los marcadores de peso molecular utilizados fueron de Sigma Chemical Co . (St Louis, MO) . La visualización de las proteínas fue desarrollado con un sistema color plata PhastSystem como se da en las instrucciones .

La concentración de proteínas fue determinada utilizando un método BCA (Pierce Co . ) .

Las determinaciones del peso molecular fueron llevadas a cabo por SDS-PAGE y por filtración por gel como sigue: Utilizando un sistema Pharmacia FPLC, 1 mi de mananasa fue aplicado a dos columnas de filtración por gel uno tras otro (Pharmacia Superdex G-200 10/30 seguido de Pharmacia Superdex G-75 10/30) las cuales han sido equilibradas con 100 mM de solución amortiguadora de NaCl-50 mM citrato/fosfato, pH 6.0. La velocidad de flujo fue de 0.5 ml/min. La Absorción UV fue monitoriada a 280 mn, las fracciones de 1 mi fueron colectadas. Las fracciones fueron probadas por actividad de mananasa utilizando un substrato de prueba RBB-manana. La actividad de mananasa fue encontrada al eluir después de 52.5 min utilizando este sistema. Los estándares de filtración por gel con bajo peso molecular de Pharmacia (1.25 mg/ml) fueron aplicados al sistema utilizando las condiciones anteriores y los resultados de elución fueron utilizados para crear una curva estándar de peso molecular. La elución de mananasa de Bacillus corresponde al peso molecular de 18-22 kilodaltones cuando se compararon en la curva estándar.

La termoestabilidad y la estabilidad alcalina fueron determinadas ajustando la temperatura y el pH descrito y probando como anteriormente utilizando una prueba de RBB- manana .

Un método de cubierta con gel para detectar la presencia de mananasas múltiples y para determinar su punto isoeléctrico (pl) fue también desarrollado utilizando un substrato de RBB-manana. Los geles de IEF, pH 3.9, fueron cubiertos con una suspensión de un substrato de agarosa fundida (4% (p/v) agarosa, 7 mg/ml de RBB-manana, 0.5% (v/v) de glicerol en 50mM de acetato de sodio, pH 4.5) e incubado a 37° C. Después de 1 hora la actividad de xilanasa fue evidente como zonas limpias. Los geles fueron dejados para secarse completamente y almacenados. El pl de la mananasa fue determinado por comparación con corridas idénticas con geles IEF conteniendo estándares pl color plata. Tabla 1 Características de la Mananasa Purificada Ejemplo 3 Blanqueo de una Pulpa de Madera con una Composición Basada en Mananasa La secuencia de blanqueo contiene las siguientes etapas: tratamiento con enzima, quelación y dos etapas alcalinas de peróxido. La etapa de tratamiento con enzima fue llevada a cabo bajo las mismas condiciones como se describieron anteriormente, excepto a 10% de consistencia y los sobrenedantes del cultivo enriquecido por mananasa (purificada para estar libre de celulosa y la mayoría de la xilanasa) fueron utilizados. El filtrado de la etapa de la enzima fue hidrolizado con ácido y los azúcares totales fueron detectados por HPLC. En la etapa de quelación, 0.2% de EDTA fue utilizado a un pH de 5.5 y 85° C por 30 minutos a 3% de consistencia para remover los metales. Las etapas de peróxido fueron llevadas a cabo a 10% de consistencia a 85° C por 4 horas. En la primera etapa de peróxido la concentración de H202 fue de 3.5% y la concentración de NaOH de 2.2%, en la segunda la concentración fue de 1.5 y 85% respectivamente. Después de las etapas de blanqueo la pulpa fue acidificada y una película manual fue preparada para medir la brillantez. La brillantez fue medida de acuerdo al método 2469. El número Kappa, el cual representa la concentración de la lignina en la pulpa fue medida por el método de SCAN-C 1:77. La tabla 2 ilustra los resultados de la pulpa blanqueada utilizando la secuencia XQPP. "xil-man 200" indica el tratamiento con Irgazima 40 (0.3 1/t) más mananasa dosificada a 200 nkat/g pulpa. Los azúcares monoméricos han sido detectados por HPLC después de una hidrólisis acida del filtrado de enzima ("Etapa X"). Tabla 2 Por supuesto, debe entenderse que un amplio rango de cambios y modiificaciones pueden ser hechas a las modalidades preferidas descritas anteriormente. Esto es, por lo tanto, intentó entenderse que las siguientes reivindicaciones, incluyendo todas las equivalentes, las cuales definen el alcance de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Una mananasa purificada obtenida a partir de Bacillus amyloliquefaciens.

2. Una mananasa purificada de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque dicha mananasa tiene un peso molecular de cerca de 33-37 kD cuando se determinó por SDS-PAGE.

3. Una mananasa purificada de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque dicha mananasa tiene un pl de cerca de 5.2-5.6.

4. Una mananasa purificada de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque dicha mananasa tiene un pH óptimo de cerca de 4.8-5.2.

5. Una mananasa purificada de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque dicha mananasa tiene una vida media de 45 segundos a una temperatura de 80° C.

6. Un método para producir una mananasa purificada derivada de Bacillus amyloliquefaciens, caracterizado porque comprende : (a) preparar un caldo de fermentación de Bacillus amyloliquefaciens . (b) separar las células, los fragmentos de las células y la materia particular de dicho caldo de fermentación para purificar dicha mananasa. (c) concentrar opcionalmente dicha mananasa para producir una solución de mananasa concentrada.

7. El proceso de acuerdo a la reivindicación 6, caracterizado porque dicha mananasa tiene un peso molecular de cerca de 33-37 kD cuando se determinó por SDS-PAGE.

8. El proceso de acuerdo a la reivindicación 6, caracterizado porque dicha mananasa tiene un pl de cerca de 5.2-5.6.

9. El proceso de acuerdo a la reivindicación 6, caracterizado porque dicha mananasa tiene un pH óptimo de cerca de 4.8-5.2.

10. El proceso de acuerdo a la reivindicación 6, caracterizado porque dicha mananasa tiene una vida media de 45 segundos a una temperatura de 80° C. Un proceso para el blanqueo de la pulpa de madera caracterizado porque comprende el contacto de dicha pulpa con una composición que comprende mananasa derivada de Bacillus amyloliquefaciens . El proceso de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizada porque dicha composición además comprende xilanasa.