MXPA98001641A - Cuantificacion de p97 para diagnosticar y monitorear la enfermedad de alzheimer - Google Patents

Abstract

Un método para diagnosticar la Enfermedad de Alzheimer cuantificando p97 en una muestra de fluido corporal de un individuo humano comprendiendo los pasos de:a) obtener una muestra de fluido corporal de un individuo que se sospecha que tiene la Enfermedad de Alzheimer, obteniendo asíuna muestra de prueba;b) determinar la cantidad de p97 en la muestra de prueba;y c) comparar la cantidad de p97 en la muestra de prueba con una cantidad de p97 en muestras de control, en donde la presencia de una cantidad elevada de p97 en la muestra comparado con la cantidad de p97 en las muestras de control indica el potencial para la Enfermedad de Alzheimer.

Description

CUANTIFICACION DE p97 PARA DIAGNOSTICAR Y MONITOREAR LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a métodos para cuantificar p97 que se utiliza para diagnosticar y monitorear la enfermedad de Alzheimer. ANTECEDENTE DE LA INVENCIÓN La enfermedad de Alzheimer (EA) es una enfermedad neurodegenerativa que afecta el conocimiento, comportamiento y función. En un estudio reciente se ha mostrado que la EA afecta casi el 7% de individuos a la edad de 75 años, incrementándose de 1 en 4 a la edad de 85 años [Canadian Study of Health and Aging Working Group, J. Can. Med. Assoc. 150, 899-913 (1994)]. Otros estudios han reclamado incidencias aún superiores de EA que afecta a las personas de edad [Evans, D.A. J. Am. Med. Assoc. 262, 2551-2559 (1989)]. En la actualidad solamente hay muy pocas opciones terapéuticas limitadas para la EA y el único método definitivo para el diagnóstico es la autopsia del cerebro. La EA se caracteriza por varios marcadores patológicos en el cerebro incluyendo placas seniles compuestas principalmente de proteína ß-amiloide (Aß), nudos neurofibrilares con proteína asociada con microtubulina y hiperfosforilada [Goedert, M., Spillantini, y otros, Neuron 8, 156-160 (1992), y Selkoe, D.J. Neuron 6, 487-498 (1991)], muerte de células neuronales y pérdida de conexiones sinápticas [Terry, R. D., y otros Ann. Neurology 30, 572-580 (1991)]. Se ha propuesto que el depósito anormal de la proteína Aß da como resultado la muerte de células neuronales en las regiones del cerebro implicadas en el conocimiento y memoria [Blass, J.P. Neurology 43, S25-38 (1993); y Price, D. L. Ann. Rev. Neurosci. 9,489-512 (1986)]. Clínicamente el diagnóstico de EA se hace a través de valoraciones neurológicas y neuropatológicas que desafortunadamente no se pueden detectar la enfermedad en su primera etapa. La aplicación de criterios de diagnósticos clínicos uniformes, tales como NINCDS-ADRDA, han mejorado la exactitud de diagnóstico patológico clínico a más del 80% [McKahann, G., y otros. Neurology 34, 939-944 (1984)]. Los intentos para correlacionar niveles de proteínas del fluido espinal cerebral (FEC) con EA se han cumplido con éxito limitado. Por ejemplo, una prueba desarrollada para detectar Aß en FEC mostró que los niveles totales de Aß en pacientes con EA no difiere significativamente de los controles [Shoji, M. y otros. Science 258, 126-129 (1992)], aunque los pacientes con EA inicial tuvieron niveles de Aß ligeramente superiores que los controles con más tiempo [Nakamura, T., y otros, Ann. Neurol. 36, 903-911 (1994)]. Sin embargo se ha observado que la Aß que se extiende a 42, Aß?-42 predominó tanto en placas amiloides difusas y seniles en el tejido cerebral de EA [Roher, A., y otros J. Biol. Chem. 268, 3072-3083 (1993)] y que Aß1- 2 se ha encontrado que significativamente menor en el FEC de pacientes con EA en relación con los controles [Motter, R., y otros. Ann. Neurol. 38, 643-648 (1995)]. En estudios en la forma secretada de la proteína precursora de amiloide (PPA), de la cual se deriva Aß, se ha encontrado que la PPA soluble se redujo considerablemente en el FEC de pacientes con EA comparado con controles [Van Nostrand. W.E. y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89, 2551-2555(1992)]. Sin embargo, otros estudios solamente han observado disminuciones ligeras [Palmert, M.R., y otros, Neurol. 40, 1028-1034 (1990)] o aún aumentos en PPA [Kitaguchi, N., y otros, Biochem. Biophys. Res Comm. 166, 1453-1459 (1990)]. Las pruebas desarrolladas para monitorear la proteína Tau en FEC reveló que, aunque en niveles promedio de Tau fueron elevados en pacientes con EA sobre ios controles, también fue considerable el traslape con controles normales [Motter, R., y otros, Ann. Neurol. 38, 643-648 (1995), Vigo-Pelfrey, C. y otros. Neurology 45, 788-793 (1995)] y con controles que sufren de otras enfermedades neurológicas [Vandermeeren, M. y otros. J. Neurochem. 61, 1828-1834(1993)]. Se han considerado otros marcadores de diagnóstico de FEC y se han encontrado inadecuados, tales como Alfal-antiquimiotripsina asociada con placas seniles [Abraham, C.R., Seikoe, D.J. & Potter, H. Cell. 52, 487-501 (1988)] y ubiquitina [Wang, G.P., y otros. Acta Neuropathol. (Berl.) 82, 6-12 (1991)], debido a los resultados contradictorios y traslape entre EA y controles. Estos no son los únicos resultados que han desilusionado, si no que FEC demuestra la rutina para diagnóstico de pacientes no tiende a ser bien recibida. Sin embargo, una prueba de diagnóstico comercialmente disponible se ha desarrollado por Athena Neuroscience Inc. que combina medir los niveles de Tau y Aß?- 2 de FEC con la frecuencia de alelos E4 de la apolipoproteína E (ApoE) localizada en el cromosoma 19 en seres humanos. Se ha establecido que la ApoE esta asociada con placas seniles y que las personas que son homocigotos para E4 de ApoE tienen una probabilidad creciente de desarrollar EA [Sanders, A.M., y otros. Neurol. 43, 1467-1472 (1993)]. Se reclama, que estos análisis combinados pueden ayudar a los médicos a determinar la probabilidad de que un paciente tenga EA [Motter, R., y otros. Ann. Neurol. 38, 643-648 (1995)]. Sin embargo, la prueba es tardada y solamente provee una respuesta probable. Un reporte reciente que estudia la respuesta pupilar ha sugerido que los pacientes con EA exhiben hipersensibilidad a una solución diluida de fármaco bloqueador de acetilcolina, tropicamida [Scinto, L.F. y otros, Science 266, 1051-1054 (1994)]. Esta hipersensibilidad primero se observó en sujetos con síndrome de Down quienes invariablemente desarrollan una neuropatología que es muy similar a EA [Olson, M.l. & Shaw, C.M. Brain 92, 147-156 (1969)] a edad mediana. Aunque este estudio parecía prometedor, los resultados no han sido replicados fácilmente y sufren de traslape y dificultades en interpretación, tales como el efecto que pueden tener los trastornos de los ojos o colores sobre la prueba [Loupe, D.N., y otros, Opthalmology 103, 495-503 (1996)]. Más recientemente se describió una estrategia [Parshad, R., y otros. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93, 5246-5150 (1996)] en donde las células de EA se identificaron detectando defectos en su capacidad para reparar el daño a ADN. Se concluyó que la prueba podría probar utilidad para soportar o hacer poco probable en diagnóstico de EA. Sin embargo, la prueba aún esta lejos de la práctica clínica dado que es laboriosa y requiere pasos múltiples con células cultivadas. Finalmente se ha observado que es posible detectar variaciones en el metabolismo de glucosa dentro del cerebro de pacientes con EA utilizando tomografía de emisión de positrones [Reiman, E.M. N. Engl. J. Med. 334, 752-758 (1996)]. La prueba no es práctica para usarse sobre una base rutinaria. Se ha dirigido un interés considerable en causas genéticas de EA y se ha mostrado que las mutaciones en varios genes confieren susceptibilidad a un número pequeño de casos de EA familiares. Las mutaciones en el gen de PPA [Murrell, J., y otros, Science 254, 97-99 (1992) and Karlinsky, H. Neurology 42, 1445-1449 (1992)] en el cromosoma 21 se ha correlacionado con EA de inicio temprano (<65 años) dominantes autosomal y mutaciones en las presenilinas S182 ligadas al cromosoma 14 [Schellenberg, G.D y otros. Science 258, 668-671 (1992); Van Broeckhoven, C. y otros. Nature Genet 2, 335-339 (1992); y Sherrington, R. y otros Nature 375, 754-760 (1994)] y STM2 ligadas al cromosoma 1 [Levy-Lahd, E., y otros. Science 269, 973-977 (1995); y Rogaev, E.I., y otros. Nature 376, 775-778 (1995)], se han relacionado con un número pequeño de casos de EA familiar. Además los alelos E4 del gen ApoE encontrados en el cromosoma 19 codifica el riesgo de desarrollar el inicio tardío de EA [Sanders, A.M., y otros, Neurol. 43, 1467-1472 (1993); y Rogaev, E.I., y otros. Nature 376, 775-778 (1995)]. Mientras que el descubrimiento de estos genes tendrá valor considerable para determinar la predisposición de un número pequeño de individuos para desarrollar EA, la valoración genética no será útil para detectar o monitorear EA. El antígeno p97, también conocido como melanotransferina, se ha asociado con EA (PCT/CA93/00272 publicada como WO94/01463 el 20 de Enero de 1994). p97 pertenece al grupo importante de proteínas que se unen al hierro que incluyen transferina (Tf), lactoferina y ovotransferina de suero de claras de huevo de aves [Baker, E.N., Rumball, y otros, Trends Biochem. Sci. 12, 350-353 (1987)]. p97 es capaz de unirse al hierro y esta implicado en la absorción de hierro celular [Kennard, M.L., y otros, EMBO J. 14, 4178-4185 (1995)]. Estas son dos formas de p97; una de las cuales se une a la superficie celular por un fijador de glicosil/fosfatidilinositol y uno que se secreta activamente [Food, M.R. y otros. J. Biol. Chem. 269, 3034-3040 (1994)]. En un estudio reciente, se ha encontrado que p97 y el receptor de transferina (RT) están localizados altamente en el endotelio capilar del cerebro humano. Mientras que la propia transferina (Tf) se ha encontrado principalmente localiza en las células gliales [Rothenberger, S. y otros, Brain Res. 712, 117-121 (1996)]. p97 también ha mostrado ser expresada específicamente sobre las células de la microglia reactivas asociadas con placas amiloides en el tejido cerebral post mortem de pacientes con EA [Jefferies, W.A. y otros. Brain Res. 712, 122-126 (1996)]. Las demás mícroglias no asociadas con las placas seniles de EA y aquellas encontradas en el tejido cerebral de otras neuropatologías (enfermedad de Parkinson, parálisis supranuclear progresiva, enfermedad de Huntington y esclerosis lateral amiotrópica) no expresaron niveles detectables de p97. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Los inventores de la presente han mostrado específicamente que la forma soluble de la proteína que se une al hierro, p97 es significativamente elevada en el suero y fluido espinal cerebral (FEC) de pacientes con Alzheimer comparado con individuos saludables. Se determinó consistentemente que la cantidad de p97 en muestras de pacientes con Alzheimer fue superior comparado con la cantidad de p97 en muestras de individuos saludables. Los inventores de la presente también han mostrado significativamente que los niveles de p97 en suero se incrementan con la duración creciente de la enfermedad. Además los niveles de p97 parecieron empezar a incrementar en un estimado de dos años antes de observar los síntomas de EA. La cuantificación especifica de p97 puede identificar sujetos que padecen la enfermedad y se pueden utilizar para monitorear el inicio y progresión longitudinal de la enfermedad. Como resultado de estos hallazgos los inventores de la presente han diseñado una prueba sencilla y confiable para la detección de EA en fluidos corporales que es una herramienta valiosa tanto en la valoración como en el manejo de la enfermedad. Los diagnósticos tempranos de EA utilizando la presente invención dan a las familias más tiempo para planear el cuidado apropiado de los pacientes con Alzheimer y eliminar la posibilidad de condiciones que imitan los síntomas de Alzheimer, tales como depresión o apoplejía. El método de la presente invención se puede utilizar para monitorear la efectividad de nuevas estrategias de tratamiento para EA. Aunque se están desarrollando muchos fármacos para el tratamiento de EA, no hay un método económico y rápido para estudiar la efectividad de estos fármacos. Los análisis clínicos actuales intentan medir la eficacia con valoraciones del comportamiento neurológico complejo y de mucho trabajo. Hablando ampliamente, la presente invención se refiere a un método para diagnosticar la enfermedad de Alzheimer cuantificando p97 en una muestra de fluido corporal de un paciente que comprende los pasos de: a) obtener una muestra de fluido corporal de un paciente que se sospecha que tiene la Enfermedad de Alzheimer, obteniendo así una muestra de prueba; b) determinar la cantidad de p97 en la muestra de prueba; y c) comparar la cantidad de p97 en la muestra de prueba con una cantidad de p97 en muestras de control. en donde la presencia de una cantidad elevada de p97 en la muestra de prueba comparado con la cantidad de p97 en las muestras de control indica el potencial para la Enfermedad de Alzheimer. La invención también se refiere a un método para monitorear la progresión de la Enfermedad de Alzheimer cuantificando p97 en una muestra de fluido corporal de un paciente que tiene la Enfermedad de Alzheimer, comprendiendo los pasos de: a) obtener una muestra de fluido corporal de un paciente que tiene ia Enfermedad de Alzheimer, obteniendo así una muestra de prueba; b) determinar la cantidad de p97 en la muestra de prueba; y c) comparar la cantidad de p97 en la muestra de prueba con una cantidad de p97 en una primera muestra de prueba obtenida previamente del paciente, en donde la presencia de una cantidad elevada de p97 en la muestra de prueba comparado con la cantidad de p97 en la primera muestra de prueba indica la progresión de la Enfermedad de Alzheimer en el paciente. Además la invención se refiera a un método para monitorear un tratamiento de la Enfermedad de Alzheimer cuantificando p97 en una muestra de fluido corporal de un paciente que tiene la Enfermedad de Alzheimer comprendiendo los pasos de a) obtener una muestra de fluido corporal de un paciente que ha recibido un tratamiento para la Enfermedad de Alzheimer obteniendo así una muestra de prueba; b) determinar la cantidad de p97 en la muestra de prueba; y c) comparar la cantidad de p97 en la muestra de prueba con una cantidad de p97 en una muestra de pretratamiento obtenida del paciente antes del tratamiento, en donde las diferencias en la cantidad de p97 en la muestra de prueba comparado con la cantidad de p97 en la muestra de pretratamiento indican la eficacia del tratamiento. La invención además contempla equipos útiles para llevar a cabo los métodos de la invención comprendiendo un agente que detecte la presencia de p97 en una muestra de prueba y todos los reactivos requeridos para detectar la presencia de p97 y soportes adecuados útiles para realizar los métodos de la invención. Este y otros aspectos de la presente invención serán evidentes por referencia a la siguientes descripción detallada y dibujos anexos.

Además se hace referencia en la presente a varios documentos de patentes y publicaciones que se incorporan aquí por referencia en su totalidad. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1, es una curva de calibración paranormales de p97; La Figura 2, es una gráfica que muestra una comparación entre niveles de p97 en suero para pacientes con Enfermedad de Alzheimer y sujetos de control basada en la edad; La Figura 3, es una gráfica que muestra una comparación entre niveles de p97 en suero para pacientes con Enfermedad de Alzheimer y sujetos de control basada en la duración de la enfermedad; La Figura 4, es una gráfica que muestra una comparación entre niveles de transferina en suero para pacientes con Enfermedad de Alzheimer y sujetos de control basada en la edad; La Figura 5, es una gráfica que muestra una comparación de concentraciones de p97 en suero de sujetos con EA y controles con la edad del sujeto; La Figura 6, es una gráfica que muestra una comparación de concentraciones de p97 en suero de pacientes con EA con el tiempo dado que el paciente fue observado con síntomas de EA; La Figura 7, es una gráfica que muestra una comparación de concentraciones de transferina en suero de sujetos con EA y controles con la edad del sujeto; y La Figura 8, es una gráfica que muestra la relación de concentraciones de p97 en suero de EA y parejas de esposos de control. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención provee métodos para monitorear y diagnosticar la Enfermedad de Alzheimer en una paciente cuantificando p97 en una muestra de fluido corporal de un paciente seguido al método implica obtener una muestra de prueba de fluido corporal de un paciente. El termino "paciente" se refiere a un animal de sangre caliente tal como un mamífero, preferiblemente un individuo humano, el cual padece de la enfermedad de Alzheimer o se sospecha que padece de la enfermedad de Alzheimer. El paciente puede o no exhibir baño cognoscitivo y el paciente puede recibir un tratamiento para EA. Generalmente, el método de diagnóstico de la invención se utiliza para determinar si un individuo, quien no exhibe ningún síntoma de EA, tiene una predisposición o potencial para desarrollar EA. La muestra de prueba puede obtenerse de una variedad de fluidos corporales, incluyendo por ejemplo, suero, linfa, bilis, esputo, o fluido cerebroespinal. Las muestra de células también se pueden utilizar como muestras de prueba, tales como células sanguíneas, preferiblemente monocitos. En particular, los macrofagos activados que expresan p97 pueden ser analizados. Preferiblemente, la muestra de prueba se obtiene de suero o FEC, más preferiblemente de suero. Las muestras de prueba se obtienen utilizando técnicas conocidas. En una modalidad particularmente preferida, se obtienen muestras de suero de un paciente. Las muestras se pueden almacenar y congelar (v.gr., a -80°C) antes de usarse y se pueden utilizar puras y/o diluidas, por ejemplo en suero de becerro fetal (BEF) al 50% v/v en solución reguladora Pandex (DNEM) conteniendo 0.1% de NaH3 y 1.0% p/v de ASB). p97 se cuantificó en una muestra de prueba utilizando un agente que permite que se cuantifique p97 en la muestra de prueba.

Preferiblemente el agente reconoce y une p97 en una muestra de prueba. En una modalidad de la invención el agente es un anticuerpo. El termino "anticuerpo" utilizado en la presente incluye anticuerpos policlonales y monoclonales; mezclas de más de un anticuerpo reactivo con p97 (v.gr., un cóctel de diferentes tipos de anticuerpos monoclonales reactivos con p97); anticuerpos enteros; fragmentos biológicamente funcionales de los mismos que son suficientes para unir el fragmento de anticuerpos a p97; y anticuerpos quiméricos comprendiendo porciones de más de una especie; anticuerpos bifuncionaies; y, anticuerpos tetraméricos. Los métodos convencionales se pueden utilizar para preparar los anticuerpos. Por ejemplo, utilizando un péptido de antisuero policlonal o anticuerpos monoclonales de p97 pueden formarse utilizando métodos normales. Un mamífero (v.gr., un ratón, hámster o conejo) se puede inmunizar con una forma inmunogénica del péptido que produce una respuesta de anticuerpos en un mamífero. Las técnicas para conferir inmunogenicidad en un péptido incluyen la conjugación a vehículos u otras técnicas bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, el péptido se puede administrar en la presencia de un auxiliar. Progreso de inmunización para monitorearse mediante la detención de titulaciones de anticuerpos en plasma o suero. Se pueden utiliza ELISA normal u otros procedimientos inmunoanálisis con el inmunógeno como antígeno para valorar los niveles de anticuerpos. Después de la inmunización, se puede tener antisuero y¡ si se desea anticuerpos policlonales aislados del suero. Para producir anticuerpos monoclonales, se pueden recopilar células productoras de anticuerpos (linfocitos) de un animal inmunizado y fusionarse con células de mieloma por procedimientos de fusión de células somáticas normales inmortalizando así estas células y produciendo células de hibridoma. Dichas técnicas son bien conocidas en la materia (v.gr., la técnica de hibridomas desarrollada originalmente por Kohler y Milstein (Nature 256, 495-497 (1975)) así como otras técnicas tales como la técnica del hibridoma de células-B humanas (Kozbor y otros, Today 4, 72 (1983)), la técnica de hibridoma de EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Colé y otros. Monoclonal Antibodies in Cáncer Therapy (1985) Alien R. Bliss, Inc., páginas 77-96), y tamización de bancos de anticuerpos combinatorios [Huse y otros, Science 246, 1275 (1989)]. Las células hibridomas pueden tamizarse inmunoquímicamente para la producción de anticuerpos específicamente reactivos con p97 y los anticuerpos monoclonales pueden ser aislados. Alternativamente un ratón SCID-hu, por ejemplo el modelo desarrollado por Genpharm, se puede utilizar para producir anticuerpos, o fragmentos de los mismos reactivos con p97. Los anticuerpos también se pueden obtener de varias fuentes incluyendo por ejemplo, laboratorios o depósitos tales como American Type Culture Collection. Por ejemplo, se pueden obtener Ac, Hyb C (33B6E4) monoclonares de ratones anti-p97 del Doctor Shuen-Kuei Liao, McMaster University, Hamilton, ON); 9B6 de anticuerpos monoclonales anti-p97 se pueden obtener de Biotechnology Laboratory, UBC, BC, Canadá, o el anticuerpo no monoclonal de ratones anti-p97, L235 se puede obtener del American Type Culture Collection (ATCC-HB 8446 L235 (H-19). Otros diferentes agentes que reconocen y se unen a p97 en una muestra de prueba y permiten que su presencia sea cuantificada en la muestra se pueden utilizar en el método de la invención. Por ejemplo, el receptor de transferina se une a p97 y se puede utilizar para cuantificar p97 en una muestra de prueba. Además, p97 se une al hierro y otros metales que se pueden utilizar para cuantificar p97 en una muestra de prueba utilizando métodos normales (ver PCT/CA93/0272 publicado como WO94/01463 el 20 de enero de 1994 que describe análisis de unión al hierro). Los agentes utilizados en los métodos de la invención se pueden marcar detectablemente con una substancia detectable, o pueden ser marcados subsecuentemente de manera deteactable. Ejemplos de substancias detectables incluyen varias enzimas, materiales fluorescentes, materiales luminescentes y materiales radioactivos. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano, biotina, fosfatasa alcalinas, ß-galactosidasa, o acetilcolinesterasa; ejemplos de materiales fluorescentes incluyen umbeliferona, fluoresceina, isotiocianato de fluoresceina, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceina, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminescente incluye, luminor; y ejemplos de material radioactivo incluye yodo radioactiva I125, I131 o tritio. Los agentes utilizados en los métodos de la invención pueden ser marcados subsecuentemente de manera detectable utilizando por ejemplo una substancia que se conoce y se une al agente. A manera de ejemplo, si el agente es un anticuerpo (v.gr., anticuerpo de IgG de ratones), un secundo anticuerpo reactivo con el agente (v.gr., una gama-globulina antiratón de conejo) que esta marcada con una substancia detectable como se describe en la presente, se puede utilizar para detectar el agente permitiendo así la cuantificación de p97. Un agente que es un anticuerpo se puede utilizar para detectar y cuantificar p97 en inmunoanálisis conocido que se apoyan en la interacción de unión entre un determinante antigénica de p97 y el anticuerpo. Ejemplos de dichos análisis son readioinmunoanálisis, inmunoanálisis de enzimas (v.gr., ELISA), inmunofluorescencia, inmunoprecipitación, aglutinación de látex, hemaglutinación, inmuno-electroforesís contracorriente (IEFC), radioinmunoprecipitacíones. análisis de manchas de puntos, y análisis de inhibición o competencia y análisis de emparedado. En una modalidad preferida un análisis basado en una técnica ¡nmunofluorescente rápida [v.gr., "Particle concentration fluorescence ¡mmunoassay" (PCFIA) descrito en Jolley y otros. 1984, J. Immunol. Meth., 67, 21-35] se utiliza para cuantificar o determinar los niveles de p97 en una muestra. Este método emplea anticuerpos (Ac) de captura unidos a perlas de poliestireno en submicras. Esta fase sólida "activada" actúa como un absorbente especifico para la proteína de interés. Un segundo Ac marcado fluorescente, también especifico para la proteína, se incuba después con la fase de captura de sólidos para formar un complejo cuya señal fluorescente es proporcional a la concentración de proteína original. Las reacciones se pueden llevar a cabo en placas de 96 pozos especialmente diseñadas (Catalogo 22-400-1; Idexx Laboratories Inc., Wesbrook, ME). Cada pozo contiene una membrana de acetato de celulosa de 0.22µm que permite que los pozos sean drenados bajo vacío para concentrar el complejo fluorescente en la base de cada pozo. Las placas pueden lavarse y cada pozo se le para fluorescencia a diferentes longitudes de onda utilizando un analizador de concentrado de fluorescencia Pandex (ACF; Idexx). Las perlas activadas para usarse en el análisis se pueden preparar utilizando anticuerpos p97 para cubrir partículas de carboxi poliestireno (0.77µm, 0.25% de v/v; Idexx). Los anticuerpos anti-p97 adecuados incluyen el Ac monoclonal de ratón anti-p97, Hyb C(33B6-4; Dr. Shuen-Kuei Liao, McMaster University, Hamilton, ON), 9B6 (Dr. Wilf Jefferies, Biotechnology Laboratory, UBC, BC), o antisuero de conejo anti-p97 (Dr. Wilf Jefferies, Biotechnology Laboratory, UBC, BC). El segundo anticuerpo fluorescentemente marcado puede prepararse utilizando el anticuerpo monoclonal de ratón anti-p97, L235 (ATCC-HB8446 L235 (H-19)) o antisuero de conejo anti-p97 (Dr.

Wilf Jefferies, Biotechnology Laboratory, UBC, BC), fluoresceinado con isotiocianato de fluoresceina (ITCF). Un p97 normal se puede preparar de p97, por ejemplo, p97 purificado del sobrenadante de células de ovario de Hámster chino (OHC) tratadas con fosfatidilinositol fosfolipasa (CFL-FL) transfectadas con p97 de humanos, por cromatografía de inmunoafinidad. En una modalidad particularmente preferida, se puede llevar un análisis de p97 de suero de sangre en placas de 96 pozos especiales (22-401-1; Idexx) y la lectura de fluorescencia en ACF (Idexx). 60µL de la muestra de suero sanguíneo a la dilución apropiada en la solución de ACF al 50% se puede agregar aún pozo en la placa de 96 pozos. Las normales de p97 pueden utilizarse para la preparación de la curva de calibración. Una preparación de la curva de calibración de muestra se exhibe en la Tabla 1 y una curva de calibración se exhibe en la figura 1. Los inventores de la presente han encontrado que los niveles de p97 empiezan a incrementarse en dos años calculados antes de los síntomas observados en la Enfermedad de Alzheimer. Por lo tanto, el método de la presente invención se puede utilizar para diagnosticar la enfermedad de Alzheimer, o potencial para desarrollar la enfermedad de Alzheimer, en un paciente que no tiene síntomas clínicamente evidentes de la Enfermedad de Alzheimer, proveyendo así un diagnóstico temprano para la enfermedad. Para diagnosticar la enfermedad de Alzheimer, la concentración de p97 en la muestra del paciente puede compararse con una escala de concentraciones de p97 en muestras de control de sujetos saludables que puede establecerse mediante estudios estadísticos prospectivos y/o retrospectivos. Los sujetos saludables se pueden seleccionar basado en el criterio de NINCDS-ADRDA y/o los resultados de pruebas de MMS. Preferiblemente, los sujetos saludables no tienen daño cognoscitivo clínicamente evidentes u otros problemas clínicos patológicos. El diagnóstico se puede realizar hallando niveles incrementados de p97 comparado con los niveles previos cuantificados para el mismo paciente. Los niveles elevados de p97 en una muestra de prueba comparado con los controles indican que el paciente tiene enfermedad de Alzheimer, o potencial para desarrollar enfermedad de Alzheimer. A manera de ejemplo, se determinan los niveles de p97 en el suero de un número representativo de sujetos de control, se determinan los niveles promedio de p97 o se grafican los niveles de p97 contra la edad de los sujetos como se muestra en la figura 5 y se estable una línea de regresión o línea de base (en la figura 5) para los sujetos de control. Una muestra de prueba que contiene niveles de p97 por arriba del promedio o línea de la base indica Enfermedad de Alzheimer o el potencial para la Enfermedad de Alzheimer. Generalmente, los niveles de p97 en una muestra de un paciente con Enfermedad de Alzheimer que son elevados por una y media veces o más, en particular dos veces o más, preferiblemente de dos a nueve veces, sobre los niveles en el suero de los sujetos control indica el potencial de Enfermedad de Alzheimer. Los niveles de p97 en suero se han encontrado que incrementan con la progresión de la enfermedad (ver figuras 3 y 6). Por lo tanto, para monitorear la progresión de la Enfermedad de Alzheimer en un paciente, la concentración de p97 en una muestra del paciente se puede comparar con los niveles de p97 de muestras previas del mismo paciente como se describió en la presente. La progresión y valoración de la etapa de la enfermedad también se puede determinar comparando los niveles en una muestra de prueba con los niveles obtenidos de los sujetos de control como se describió en la presente, o los niveles obtenidos de otros pacientes con la Enfermedad de Alzheimer. Esta ultima comparación está basada en la relación lineal entre los niveles de p97 en las muestras de fluidos corporales y la progresión de la enfermedad. A manera de ejemplo, la etapa de la enfermedad de un paciente puede determinarse cuantificando los niveles de p97 en una muestra del paciente y extrapolando desde una curva normal (por ejemplo, la gráfica como se muestra en la figura 6). Los métodos de la invención también se pueden utilizar para monitorear o valorar en un paciente la eficacia de un tratamiento terapéutico para la Enfermedad de Alzheimer. Las muestras se pueden tomar antes, durante y después del tratamiento y la eficacia del tratamiento se determina por efecto del tratamiento sobre la concentración de p97 en la muestras. Se esperará que un tratamiento efectivo sea un tratamiento que da como resultado niveles inferiores de p97 en las muestras comparado con un control. Se contempla que el método se puede utilizar para monitorear la eficacia de cualquier tipo de tratamiento para la enfermedad de Alzheimer, en particular el uso de composiciones farmacéuticas que se piensa que tienen eficacia en el tratamiento de la Enfermedad de Alzheimer. Ejemplos de composiciones farmacéuticas que pueden tener alguna eficacia en el tratamiento de la Enfermedad de Alzheimer y cuyas substancias que restauran o reemplazan la función colinérgica, tal como tacrina, colina, lecitina, huperzina A y B. galantamina, fluoruro de metanesulfonilo, fisostigmina y deprenilo. Los reactivos adecuados para aplicar los métodos de la invención para cuantificar p97 pueden empacarse en equipos convenientes proveyendo los materiales necesarios empacados en recipientes adecuados. Por ejemplo, dichos equipos pueden incluir anticuerpos que reaccionan con p97 y los reactivos necesarios para cuantificar anticuerpos unidos p97 presentes en una muestra por medio de los métodos descritos en la presente. Los equipos también pueden incluir soportes adecuados útiles para realizar los métodos de la invención. Los siguientes ejemplos describen la cuantificación de los presentes inventores de p97 en muestras de pacientes con la Enfermedad de Alzheimer y controles, y las implicaciones de dicha cuantificación. Los ejemplos son ofrecidos a manera de ilustración y no a manera de limitación.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 ESTUDIO RELACIONADO CON NIVELES DE p97 EN EL SUERO DE PACIENTES CON ALZHEIMER Un análisis para medir los niveles de p97 en suero sanguíneo humano se desarrollo basado en una técnica inmunofluorescente rápida, "Particle concentration fluorescence immunoassay" (PCFIA) introducida en 1984 (Jolley y otros. 1984, J. Immunol. Meth., 67, 21-35). Este método emplea anticuerpos (Ac) de captura unidos a perlas de poliestireno en submicras. Esta fase sólida "activada" actúa como un absorbente específico para la proteína de interés. Un segundo Ac marcado fluorescentemente también especifico para la proteína, se encubo entonces con una fase de captura de sólidos para formar un complejo cuya señal fluorescente fue proporcionar a la concentración de proteínas original. Las reacciones se llevaron a cabo en placas de 96 pozos diseñadas especialmente (Catalogo 22-400-1; Idexx Laboratories Inc., Wesbrook, ME). Cada pozo contuvo 0.22 µm de membrana de acetato de celulosa que permitió que los pozos se drenaran bajo vacío para concentrar el complejo fluorescente en la base de cada pozo. Estas placas entonces se lavaron y cada pozo se leyó para fluorescencia a longitudes de onda variables utilizando un analizador de concentración de fluorescencia Pandex (ACF; Idexx). Las pelas activadas para utilizarse en los análisis se prepararon utilizando los siguientes anticuerpos para cubrir partículas de carboxi poliestireno (0.77µm, 0.25% v/v; Idexx): el Ac monoclonal de ratón anti-p97, Hyb C (33B6E4; Dr. Shuen-Kuei Liao, McMaster University, Hamilton, ON), o 9B6 (Dr. Wilf Jefferies, Biotechnology Laboratory, UBC, BC), o antisuero de conejo anti-p97 (Dr. Wilf Jefferies, Biotechnology Laboratory, UBC, BC). 1 ml de las partículas revueltas y tratadas con sonido durante un minuto (se centrifugaron y resuspendieron en 8 ml de solución reguladora de pH de [ácido 2-(4-morfolino) etansulfónico] MES 0.1m a pH 4.5. A esta se le agregaron 4.0 mg de [carbodi-imida de 1-etil-3(3-dimetilaminopropilo)] EDC seguido por 1 ml de anticuerpo (1 mg/ml). La mezcla se revolvió periódicamente, sin colorante la noche a temperatura ambiente y se centrifugo a 6000 rpm durante 10 minutos (Sorval HB4) y las perlas se resuspendieron en 20 ml de solución salina con pH regulado de fosfato (SRF) conteniendo 0.2% de azida de sodio (NaN3) y 2% p/v de albumen de suero de bovino (ASB). Las pelas después se centrifugaron a 6000 rpm por 10 minutos y las perlas revestidas se almacenaron en 32 ml. de PBS conteniendo 0.2% de NaN3 y 2% de ASB a 4°C (-concentración de anticuerpo, 25µg/ml.). el segundo anticuerpo fluorescentemente marcado se preparo utilizando el anticuerpo monoclonal de ratones anti-97, I235 (ATCC-HB8446 I235 (H-19)) o antisuero de conejo anti-p97 (Dr. Wilf Jefferies, Biotechnology Laboratory, UBC, BC), fluoresceinado con ¡sotiocianato de fluorescencia (ITCF) de la siguiente manera. El ITCF se agrego a una 1mg/ml. de solución reguladora de pH de fosfato a 9.5 (Na2HP040.15m). En la ausencia de azida 0.5 mi. del anticuerpo a 4mg/ml. se le agrego la solución de ITCF (0.15ml. de solución de ITCF a 1mg/ml.) y se incubo durante la noche a temperatura ambiente en la obscuridad. El Ac fluoresceinado estaba listo para utilizarse y almacenarse a 4°C). Se preparo una p97 normal de p97 purificado de sobrenadante de células de ovario de hámster chino (OHC) tratado con fosfatidilinositol fosfolipasa C (FI-FLC), transfectado con p97 de humano mediante cromatografía de inmunoafinidad.

Aproximadamente 109 células de OHC transfectadas se trataron con 1 ml de FI-FLC (300mU/ml.) en PBS durante una hora a 37°C. El sobrenadante se recupero de las células por centrifugación y se filtro a través de una membrana de 0.2µm. El sobrenadante después se aplico a una columna (1 x 10) de Ac (HybC) inmovilizado en Affi-Gel 10 (Bio-Rad, Mississauga, ONT). La columna previamente se había lavado y regenerado en PBS A pH 7. El p97 unido se diluyó con ácido cítrico a 0.1M, pH 3.0, seguido por la neutralización con Tris-HCL 1M, pH 9.0. El p97 purificado se concentro utilizando una membrana de uitrafiltración de 30,000 PM. Se dializó contra PBS y se filtro estéril. La concentración de p97 normal se determino utilizando el coeficiente de extinción de p97 a 280nm 1% = 12.0cm-1 (Baker y otros 1992). Las muestras de suero sanguíneo se prepararon de la siguiente manera. Para cada paciente se tomaron las siguientes muestras: (a) muestra de suero almacenado a -20°C y (b) sangre fresca almacenada a 4°C. Antes de probar las muestras, la muestra de sangres se centrifugo y se recupero el suero. Ambos tipos de muestras se probaron puras y/o en 50% v/v de suero de becerro fetal (SBF) en solución reguladora de pH Pandex (DMNE conteniendo 0.1% NaH3 y 1.0%p/v BSA9. El análisis de p97 en suero sanguíneo se llevó a cabo en placas de 96 pozos especiales (22-401-1; Idexx) y la lectura de fluorescencia en ACF (Idexx) de la siguiente manera. 60µL de la muestra de suero sanguíneo a la dilusión apropiada en la solución de ACF al 50% se agregó a un pozo en una placa de 96 pozos. Cada muestra se probó por duplicado o triplicado. A cada placa también se agregaron normales de p97 por duplicado (330, 150, 120, 90, 60, 30, 15, 9, 6 ng/ml.). Estas normales se diluyeron en la solución de ACF al 50% y se usaron para la preparación de la curva de calibración. Una preparación de la curva de calibración de muestras se exhibe en la tabla I y una curva de calibración se exhibe en la figura I. 20µL de las perlas revestidas anti-p97 (-25µg Ac/ml). Se agregaron a cada muestra y se incubaron a temperatura ambiente durante 40 minutos. El contenido de los pozos se mezclo suavemente usando los lados de la placa de 96 pozos. Después de la incubación se agregaron 20µl del segundo Ac anti-p97 fluoresceinado (diluido 1/75 en solución reguladora Pandex (-25-40 µg/ml)) a las muestras y perlas y se incubo durante 5-10 minutos a temperatura ambiente. Las placas se colocaron después en el ACF se drenaron y lavaron 3-5 veces en PBS conteniendo 0.1% de NaH3 y 1% p/v de ASB. Las placas drenadas después se leyeron con el par de filtros de 485/535nm a una ganancia de 25x. Las muestras de suero sanguíneo se obtuvieron del pacientes con Alzheimer (EA), de controles de esposos y de controles no relacionados. La tabla 2 enseña resultados de muestras de concentraciones de suero sanguíneo de p97 a pacientes con EA. La duración de la enfermedad implica en número de años dado el diagnóstico de la condición. Sin embargo, es muy posible que un paciente individual haya sufrido de la enfermedad durante algún tiempo antes del diagnóstico. La tabla 3 muestra las concentraciones de suero sanguíneo de p97 en pacientes con EA y muestras de control. Los niveles de p97 en el suero de controles no relacionados variaron entre 2.4 a 12ng/ml y se encontró que los niveles no se incrementaron con la edad del sujeto (figura 2). Como se muestra en la figura 2, los niveles de p97 en el suero de pacientes con EA fue significativamente elevado comparado con los controles y los niveles parecieron incrementarse con la edad del paciente. Los pacientes de EA tuvieron niveles de p97 en el suero de por lo menos 20ng/ml. El nivel máximo encontrado fue de 300ng/ml. De manera más importante, los niveles de p97 en suero se encontraron correlacionados con la duración de la enfermedad en pacientes de EA como se muestra en la figura 3. Los niveles crecientemente superiores de p97 se encontraron en suero de pacientes con duración más larga de la enfermedad.

Los niveles de transferina en suero se midieron en las muestras de pacientes con EA y controles. No se encontró diferencia aparente en los niveles de transferina en suero entre pacientes de EA y controles y no se encontró correlación entre la edad del sujeto y los niveles de suero de transferina (figura 4). Los niveles de transferina y p97 también se midieron en SCF y muestras de suero obtenidas previamente de un grupo de pacientes con EA japoneses y sujetos de control. Estas muestras se congelaron durante dos años y se sometieron a descongelamiento y congelación por segunda vez, por lo tanto los niveles reales de proteína no pueden reflejar los niveles absolutos presentes originalmente en las muestras. Sin embargo, los resultados mostrados en la tabla 4 confirmaron los hallazgos anteriores de que los niveles de p97 fueron elevados en el suero de pacientes con EA comparados con los niveles de los sujetos de control. Los resultados también indicaron que los niveles de p97 en CESF fueron elevados en pacientes de EA comparado con los controles. Los niveles de transferina en el suero y FEC de los pacientes con EA no fueron elevados de los niveles de control. EJEMPLO 2 Una descripción y discusión más completa de los estudios ilustrados en el ejemplo 1 como se provee en este ejemplo 2. Los siguientes materiales y métodos se utilizaron en los estudios descritos en el ejemplo 2.

Sujetos canadienses. Los sujetos con EA (N = 27) se seleccionaron de aquellos que asisten al Programa de Ensayos Clínicos de la Clínica de UBC para enfermedad de Alzheimer y trastornos relacionados Hospital de Vancouver. A todos los sujetos con EA se les diagnóstico como "clínicamente probable" de acuerdo con el criterio de NINCDS-ADRDA. La duración calculada de sintomatología cognoscitiva se determino para todos los sujetos con EA. Los sujetos no estaban sometidos a medicación experimental en el momento de este estudio. Los controles tanto elegidos aleatoriamente de voluntarios saludables (N = 15) o cuidadores esposos (N-10) no demostraron daño cognoscitivo clínicamente significativo evidente. Se llevaron a cabo dos estudios: (a) se almacenaron muestras de suero a 4°C inmediatamente después de la punción venosa y se analizaron para p97 y Tf dentro de 24 horas. 17 sujetos con EA (10 mujeres, 7 hombres) con edades variando de 51 a 82.5 años (66.4+17.52 años) se compararon con 15 sujetos de control (6 mujeres, 9 hombres) con edades variando de 28 a 76 años (52.33 + 16.5 años), b) se sacaron muestras de suero de parejas de esposos (N = 10 pareja) se almacenaron congelados a -20°C inmediatamente después de la punción venosa. Se sacaron muestras de parejas de esposos, al mismo tiempo se congelaron y después se analizaron al mismo tiempo. Los pacientes con EA (7 mujeres, 3 hombres) con edades variando de 54 a 86 años (70.6 + 10.47 años) se compararon con sus esposos sin EA (3 mujeres, 7 hombres) con edades variando de 54 a 84 años (69.9+10.21 años). Sujetos japoneses. Ocho sujetos con EA (6 mujeres, 2 hombres) se probaron con edades variando de 51 1 80 años (71.6 + 6.52 años) y se compararon con 7 sujetos de control (4 mujeres, 3 hombres) con edades variando de 57 a 72 años (66.57 + 6.4 años). Las muestras de suero FEC de sujetos con EA y controles se obtuvieron del Departamento de Neurología, Escuela de Medicina, Universidad de Chiba. Todos los sujetos con EA se diagnosticaron como "clínicamente probable" de acuerdo con el criterio de NINCDS-ADRDA. Los controles vienen de sujetos de mayor edad que sufren de las siguientes neuropatologías: 1 enfermedad de Parkinson, 2 degeneración de espino cerebral, 1 de esclerosis lateral amiotrópica, 2 espondilosis cervical y 1 neuropatía periférica. Las muestras de suero y FEC se congelaron a -20°C inmediatamente después de la extracción y se descongelaron colectiva e idénticamente antes del análisis. Análisis de p97. Se probaron muestras puras y diluidas al 50% v/v de suero de becerro fetal en solución reguladora pH de DMEM conteniendo 0.1% de azida de sodio y 1.0%. p/v de albúmina de suero de bovino. El anticuerpo de ratón anti-p97, HybC se utilizo para cubrir ias partículas de captura de carboxipoliestireno (0.77µm) y el anticuerpo monoclonal de ratón anti-p97, L235 (ATCC-HB 8445 L235 (H-19)) se fluoresceinó (Kennard, M.L., EMBOJ. 14, 4178-4186 (1995). Las normales de p97 se prepararon de manera en fresco en la solución reguladora de pH de DMEM conteniendo suero de becerro fetal en la escala de 300 a 1 ng/ml. El análisis consistió en mezclar 60µl de muestras y normales con 20µl de partículas de captura (-25 µg anticuerpo/ml) en las placas de 96 pozos especializadas e incubando durante 40 minutos a temperatura ambiente. Después 20µl del anticuerpo secundario fluoresceinado (-25 a 40 µg/ml) se agregaron y la mezcla se incubó durante 5 a 10 minutos adicionales a temperatura ambiente. Las placas después se colocaron en un "analizador de concentración de Fluorescencia" (Jolley, M.J. Immunol. Methods 67, 21-35 (1984)), se drenó y lavo hasta cuatro veces con PBS conteniendo 0.1% de azida de sodio y 1.0% de albúmina de suero de bovino. Las placas drenadas después se leyeron con el par de filtros de 485/435 a una ganancia de 25x. Las concentraciones de p97 se determinaron de una curva de calibración preparada de las normales de p97 de las cuales correlacionaron fluorescencia concentración de p97. Todas las muestras se analizaron por triplicado a varias dílusiones y la concentración se promedio de todos los resultados. Análisis de transferina. Este análisis se baso en el "inmunoanáiisis de Fluorescencia de Concentración de Partículas" descrito previamente. El antisuero de cabra de transferina antihumana se revistió sobre las partículas de captura y el antisuero de ovejas de transferina anti-humano se fluoresceinó. Las normales de transferina se prepararon en fresco en la escala de 3 a 0.5µg/ml.

Todas las muestras se analizaron por triplicado en varias difusiones y la concentración se promedio de todos los resultados. Se desarrolló un análisis cuantitativo que pudo monitorear la concentración de p97 en fluidos corporales humanos. El análisis se baso en una técnica inmunofluorescente rápida, "Inmonoanálisis de Fluorescencia de Concentración de Partículas" que emplean anticuerpos de captura unidos a perlas de poliestireno en submicras y anticuerpos secundarios marcados fluorescentes (Kennard, M. L. Y otros, Biotech, Bioeng. 42, 480-486, 1993). El análisis de emparedado modificado se llevó a cabo en placas de 96 pozos diseñadas especialmente que contienen membranas de acetato de celulosa de 0.22µm. Los pozos se pueden drenar bajo vació permitiendo que el complejo fluorescente se concentre en la base de cada pozo. Las placas se pueden lavar y cada pozo leerse para fluorescencia en donde la fluorescencia es proporcional a la concentración de p97. Se encontró que p97 es parcialmente inestable en suero de humanos y pierde antigenicidad con el almacenamiento. La tabla 5 muestra el efecto de la temperatura y tiempo de almacenamiento en la concentración detectable de p97 anulado en suero inicialmente a 100ng/ml. p97 se volvió detectable en muestras que fueron tratadas con calor a 60°C durante 30 minutos (sorprendentemente el Tf de suero pareció no afectado por este tratamiento) y las muestras que se almacenaron a temperatura ambiente perdieron hasta 20% de antigenicidad durante 48 horas. Sin embargo, las muestras fueron relativamente estables durante un periodo de 48 horas cuando se almacenaron a 4°C y -20°C, aunque e! congelamiento y descongelamiento redujo adicionalmente la detección de p97. Por estas razones, en un estudio en donde la concentración de p97 en suero de pacientes con EA comparó con controles cognoscitivamente normales, las muestras de suero se almacenaron a 4°C inmediatamente después de la extracción y se analizaron dentro de 24 horas. La figura 5 muestra que tanto los pacientes con EA tuvieron niveles elevados de p97 en su suero comparado con controles y no hubo traslape. La concentración media de p97 del grupo de EA (N = 17, 43.8+11.6 ng/mL) fue significativamente de la media del grupo de control (N = 14, 7.04 + 3.28ng/m!) basado en la prueba t en par (t0.os= 2.96, p = 6.6 x 10"10). Hasta la fecha solo ha habido otro estudio de p97 en sangre humana (Brown, J.P. y otros, Proc. Nati. Acd. Sci. USA 78, 539-543, 1981) cuando p97 se detecto en la escala de 1.3 a 2.7 ng/ml. Aunque la edad media del grupo de control (52.3+16.5 años) fue menor a la edad media del grupo de EA (66.4+17.52 años), la regresión lineal mostró que no hubo correlación significativa entre la concentración de suero de p97 y edad del sujeto. (Pacientes con EA: N = 17. inclinación de línea de regresión = 0.359, R = 0.30, p = 0.249; Controles: N = 15, inclinación de línea de regresión = 0.07, R = 0.35, p = 0.197). Cuando los datos para pacientes de EA se graficaron contra tiempo que el paciente se observó primero con síntomas de EA (figura 6) la regresión lineal mostró que hubo una correlación significativa entre la concentración de suero de p97 incrementada y la progresión de la enfermedad (N = 17, inclinación de línea de regresión = 3.3, R = 0.82, p = 0.0003). Finalmente, la extrapolación de la regresión lineal a la concentración máxima de p97 de los controles sugirió que la concentración de p97 puede empezar a incrementarse en un estimado de dos años antes de los síntomas observados de EA. Con el fin de eliminar la posibilidad de que p97 no se incremente específicamente en EA, se analizó otra proteína de unión al hierro de la sangre, transferina (Tf) en el suero de pacientes con EA y controles. La figura 7 muestra que hubo poca diferencia entre las concentraciones de Tf de ambas poblaciones. La concentración media de Tf del grupo de EA (N = 17, 1.81+0.71 mg/ml) no fue significativamente diferente de la media del grupo de control (N = 15, 1.93 + 0.78 mg/ml) basado en las pruebas iguales de t (t0.05 = 0.41, p = 0.69). En otro estudio se compararon los niveles de suero p97 de pacientes de EA con sus esposos normales cognoscitivamente para determinar si puede haber un efecto en la dieta, estilo de vida u algún otro factor común sobre la concentración de p97 en suero. En este caso las muestras de suero se congelaron inmediatamente a -20°C después de la extracción. La figura 8 compara las relaciones de niveles de p97 en suero de diez pares de pacientes con edad (70.6+10.47 años) y sus controles esposos (69.9+10.21 años). En todos los casos los niveles de p97 en suero de pacientes con EA fueron elevados comparados con sus controles de esposos con la relación variando de 1.6 a 32.5 (media 10.17 + 9.08). Este hallazgo provee evidencia de que los factores ambientales probablemente no son la causa de los niveles elevados de p97 en suero de pacientes con EA. Niveles de p97 transferina en suero y FEC En un tercer estudio las muestras congeladas tanto de suero como de FEC con pacientes con EA y controles de origen japonés se analizaron para Tf y p97. Los controles no utilizados en este estudio fueron sujetos que sufren de otras neuropatoiogías diferentes y se probaron con el fin de determinar si los niveles de suero de p97 fueron elevados en otras enfermedades neurodegenerativas. Sin embargo estas muestra de suero se congelaron y se descongelaron colectiva e idénticamente antes del análisis, lo cual disminuyó desafortunadamente la detección de p97. Sin embargo, como se puede observar en la tabla 6, fueron insignificantes varias observaciones. La concentración media de p97 se elevó en el FEC de pacientes con EA (N = 5, 22.4 + 9.21 ng/ml; edad media 72.4+5.99 años) comparado con los controles (N = 5, 4.48 + 4.02 ng/ml; edad media 67.2 + 6.82 años). Estas concentraciones fueron significativamente diferentes basado en la prueba de t (t0.05=2.90, p = 0.044). Esto también es cierto para p97 en suero en donde la concentración media de p97 del grupo con EA (N=4, 11.3 + 2.76 ng/ml; edad media 74.3+_6.63 años) fue significativamente diferente de la media del grupo de control (N = 6, 2.01 + 1.75 ng/ml; edad media 65.6 + 6.52 años) basado en la prueba 3 igualada (t0.o5 = 4.52, p = 0.02. Esto concordó con los datos en la figura 5, aunque las concentraciones globales se redujeron considerablemente. Reforzando las otras observaciones, las concentraciones de p97 parecieron correlacionarse con la edad o sexo del sujeto. Estos datos también sugieren que el monitoreo de CEF, el cual tiene de 2 a 4 veces más que los niveles de p97 en suero para proveer información valiosa con respecto al inicio de progresión de EA. La concentración media de Tf, que es considerablemente más estable en suero que p97, fue virtualmente la misma para los sujetos con EA y control en FEC y suero. Para FEC la concentración media de Tf del grupo de EA (N-(, 20.35+4.78µg/ml, edad media 71.5+6.52 años) no fue significativamente diferente de la media del grupo de control (N = 7, 16.0 + 4.5µg/ml; edad media 67.7+6.32 años) basado en la prueba t igualada (t0.os=2.05, p = 0.18). Para suero, la concentración media de Tf del grupo de Ea (N = 4, 2.24 + 2.6 mg/ml; edad media 74.3 + 5.63 años) no fue significativamente diferente de la media del grupo de control (N = 5, 2.26 + 7.0 mg/ml; edad media 63.4+4.5 años) basado en la prueba t igualada (t0.os = 0.38, p = 0.72). También es interesante observar que los niveles de Tf en suero fueron considerablemente superiores que esta en contraste con p97 cuyos niveles son inferiores en suero que en FEC. Estos datos pueden implicar que p97 tiene una función única dentro del cerebro dado que parece Tf se excluye activamente del cerebro mientras que p97 no. En este estudio, se ha identificado una molécula marcadora bioquímica que es consistentemente elevada en suero de pacientes con EA contra controles relacionados y no relacionados. La inventores de la presente han encontrado que no hay traslape entre pacientes con EA y controles. A partir de lo anterior, será apreciado que, aunque las modalidades especificas se han descrito en la presente con fines de ilustración se pueden hacer varias modificaciones sin desviarse del espíritu y alcance de la invención. Consecuentemente, la invención no se limita excepto por lo anexo. TABLA 1 TABLA 2 Pruebas de suero sanguíneo para concentración de p97 en pacientes con Ac y controles normales Sujetos con EA: Sujeto M/F Fecha Edad Duración Conc.p97 (ng/mL (años) (años) 1 F 4/11/94 51 2 42.7 1 F 7/1194 51 2 40.66 1 F 10/11/94 51 2 38.5 2 F 10/11/94 68 2 41.25 3 F 30/11/94 75 5 38.7 2 F 30/11/94 68 2 34.7 4 F 30/11/94 82 11 60.4 5 F 30/11/94 82.5 4.5 38.2 6 M 30/11/94 64 1.5 31 7 F 30/11/94 73.5 5.5 37.7 8 F 30/11/94 81 7.0 52 5 F 15/4/94 82 4 87.1 6 M 20/4/94 63.5 1 47.2 9 M 27/4/94 74 3 41 10 M 18/3/94 59 9 50.8 11 M 8/6/94 77 7 69.6 8 F 15/7/94 80.5 6.5 56.4 12 F 29/7/94 55 4 45.6 13 M 4/5/94 59 5 40.6 13 M 21/9/94 59.5 5.5 42 TABLA 3 Muestras probadas 21 y 24 Z7/95 - pacientes y controles de esposos Sujeto M/F Fecha Edad Duración Conc. P97 (años) (años) (ng/mL) 1 M 21/7 75 24 1-esposo F 21/7 75 2 2 M 21/7 86 145 2-esposo F 21/7 76 4 3 M 21/7 72 22 3-esposo F 21/7 73 1 4 M 21/7 80 50 4-esposo F 21/7 68 3 1 M 24/7 75 20 1-esposo F 24/7 75 9 M 24/7 86 374 -esposo F 24/7 76 12 M 24/7 72 27 -esposo F 24/7 73 3 M 24/7 80 76 -esposo F 24/7 68 12 Sujetos Control No relacionados Sujeto Duración Conc. P97 (ng/mL (años) 1 31 9.2 2 28 10 3 36 10.5 4 38 11.8 5 40 7.3 6 41 5.3 7 42 1.2 8 51 12 9 53 2.4 10 63 8.9 11 70 7.8 TABLA 4 Muestras de Fluido Espinal Cerebral (FEC) y de Suero Sanguíneo de sujetos Japoneses probados para Transferina (Tf) y p97 FEC Sujeto con Alzheimer Conc. Tf (ug/mL) Conc. p97 (ng/mL 1 13.63 2 23.34 3 28.21. 14.2 27 15.8 30 25.6 40.4 38 21.3 20.5 67 16.9 18.6 79 18 18.5 Control 4 18.0 11 5 12.4 11 6 9.9 7 12.2 10 8 23.4 0.5 9 13.9 9.9 SUERO Suieto con Alzheimer Conc. Tf (ug/mL) Conc. p97 (ng/ml) 1 2.19 8.8 3 2.62 8.2 27 1.68 30 2.48 14.0 Control 4 2.19 0.1 5 2.06 0.8 6 1.25 2.0 7 2.12 2.1 10 1.95 5.6 TABLA 5 Tabla 5 Prueba de Estabilidad* de p97 en suero humano (inicalmente 100ng p/97mL suero) Temperatura (°C) Tiempo de almacenamieno (hr) 0.5 24 48 60 temperatura amb. 0 nd nd 4 95.9 88.2 81.2 -20 99.5 99.0 97.5 94.0 92.4 91.2 *Estabilidad mostrada como un cambio porcentual en p97 detectable con el tiempo nd - no determinado Tabla 6 Concentraciones de p97 y transferina en fluido espinal cerebral y suero de sujetos que sufren de EA y otras neuropatologías *Sujetos con EA FEC Suero Sujeto Edad Sexo p97 (ng/mL) Tf (µg/mL) p97 (ng/mL) Tf (µg/mL) 1 80 F nd 13.6 8.8 2190 2 65 F nd 23.3 nd nd 3 77 M 14.2 28.2 8.2 2520 27 65 F nd 15.8 7.8 1680 75 F 40.4 15.6 14.0 2480 38 72 F 20.5 21.3 nd nd 67 61 M 18.6 16.9 nd nd 79 77 F 18.5 18.0 nd nd 22 .4+9.21 20, .35 +4.78 11 .3+2.76 2240+360 é Control de sujetos que sufren de otras neuropatologías FEC Suero I Suieto Edad Sexo p97 (nig/mL) Tf (µg/mL) p97 (ng/mL) Tf (µg/mL) 4-Con Parkinson 65 F 11.7 18.0 0.1 3400 5-Degeneración Espino-Cerebral 57 M 11.2 12.4 0.8 2060 6-Degeneración Espino-Cerebral 70 F ND 9.9 2.0 1250 7-Esclerosis amiotrofica lateral 65 F 10.0 12.2 2.1 2120 8-Espondilosis Cervical 77 M 0.5 23.4 1.5 nd 9-Espondilosis Cervical 72 F 9.9 13.9 nd nd 10-Neuropatia Periférica 60 M nd nd 5.6 1950 8. 48 +4.02 20. ,35 +4.78 11 .3+2.76 2240+360 EA Clínicamente probable basado en NINCDS-ADRAD nd - no determinado

Claims (7)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para diagnosticar la Enfermedad de Alzheimer cuantificando p97 en una muestra de fluido corporal de un paciente que comprende los pasos de: a) obtener una muestra de fluido corporal de un paciente que se sospecha que tiene la Enfermedad de Alzheimer, obteniendo as[i una muestra de prueba; b) determinar la cantidad de p97 en la muestra de prueba; y c) comparar la cantidad de p97 en la muestra de prueba con una cantidad de p97 en muestras de control, en donde la presencia en una cantidad de p97 en la muestra de prueba que se eleva una y media veces o m[as comparado con la cantidad de Alzheimer.
2. 2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la cantidad de p97 en la muestra de prueba se eleva de dos a nueve veces comparado con la cantidad de p97 en las muestras de control indica el potencial para Enfermedad de Alzheimer.
3. 3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde en el paso (c) la cantidad de p97 en la muestra de prueba se compara con una cantidad promedio o de la línea de la base de p97 determinado en muestras de control.
4. 4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la muestra de control en (c) es una muestra normal del mismo paciente u otro individuo.
5. 5. Un método de prueba de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el fluido corporal es suero o FEC.
6. 6. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la cantidad de p97 en el paso (b) se determina usando anticuerpos para p9
7. 7.