MXPA97009464A - Cultivo de lawsonia intracellularis, vacunas contra lawsonia intracellulares y agentes de diagnostico - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un método para cultivo a gran escala y atenuación de las bacterias L. intracellularis mediante inoculación de células con las bacterias L. intracellularis para infectar las células, incubar las células infectadas en una concentración de oxígeno reducida y mantener las células infectadas en suspensión.Se preparan vacunas contra L. intracellularis a partir de los cultivos que han crecido en suspensión. También se describen agentes de diagnóstico.

Description

CULTIVO DE Lawsonia ±ntracellularia . VACUNAS CONTRA Lawßoaia intracellularia Y AGENTES DE DIAGNÓSTICO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención está dirigida a vacunas contra Lawsonia intracellularis y métodos para conferir protección contra y para diagnosticar infección por Lawsonia intracellularis. Los productos y procesos de la invención se pueden obtener, en parte, como resultado de método mejorado el cual ha sido descubierto para el cultivo de suministros a gran escala de L. intracellularis .

DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA RELACIONADA El agente causal de la enteropatía proliferativa porcina ("PPE"), L. intracellularis, afecta virtualmente todos los animales, incluyendo humanos, conejos, urones, hámsteres, zorros, caballos y otros animales tan diversos como avestruces y emus. En porquerizas, una gran causa de pérdidas es particularmente L. intracellularis . Los estimados de prevalencia e incidencia de PPE en los E.U. han sido tan elevados como 20 por ciento de las porquerizas con pérdidas estimadas de $20 millones anualmente. REP: 26269 Una característica consistente de PPE es su presentación de bacillus intracitoplasmáticos curvos no unidos a membrana dentro de los eritrocitos en porciones afectadas del intestino. Las bacterias asociadas con PPE se han mencionado como "organismos similares a Campylobacter" . S. McOrist et al., Vet. Pathol., Vol. 26, 260-64 (1989). Posteriormente, se ha identificado a la bacteria causal como un género de especie taxonómico novedoso, mencionado de manera vernácula como Ileal symbiont (IS) intracelulares. C. Gebhart et al., Int'l. J. of Sytemic Bacteriology, Vol. 43, No. 3, 533-38 (1993). Más recientemente, estas bacterias novedosas se les ha dado el nombre taxonómico de Lawsonia (L. ) intracellularis. S . McOrist et al., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, Vol. 45, No. 4, 820-25 (1995) . Estos tres nombres se han utilizado de manera intercambiable para referirse al mismo organismo como se identifica adicionalmente y se describe en la presente. Hemos elegido el uso del nombre taxonómico, L. intracellularis, en la discusión de la presente invención. L. intracellularis es una bacteria intracelular obligada la cual no puede ser cultivada por métodos bacteriológicos normales en medios convencionales libres de células y se ha considerado que requieren unión a células epiteliales para su crecimiento. S. McOrist et al., Infection and Immunity, Vol. 61, No. 10, 4286-92 (1993) y G. La son et al., J. of Clinical Microbiology, Vol. 31, No. 5, 1136-42 (1993) describen el cultivo de L. intracellularis utilizando monocapas de células epiteliales intestinales de rata IEC-18 de matraces de cultivo de tejido convencionales. Además, H. Stills, Infection and Immunity, Vol. 59, No. 9, 3227-36 (1991) describe el uso de monocapas de células intestinales embriónicas humanas Intestine 407 y monocapas de células de adenocarcinoma colónico de cobayo GPC-16 en matraces de cultivo de tejido convencional . Estos métodos de cultivo anteriores requieren mucho trabajo y no son adecuados para la producción a gran escala. La comprensión actual de la infección por L. intracellularis y el tratamiento y control efectivo de la enfermedad han sido menoscabados seriamente por los requerimientos de crecimiento exigentes de L. intracellularis en cultivos in vitro. Actualmente existe una necesidad por un método mejorado para cultivo de L. intracellularis. También existe la necesidad de vacunas contra L. intracellularis y herramientas efectivas para el diagnóstico en la determinación de infección por L. intracellularis .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Un objetivo de la invención es proporcionar vacunas contra L. intracellularis . Otro objetivo de la invención es proporcionar métodos para detectar la presencia de anticuerpos para L. intracellularis en muestras biológicas. Un objetivo adicional es proporcionar un método de cultivo mejorado que permita el cultivo a gran escala de L. intracellularis para producción de vacunas y agentes de diagnóstico. Para obtener estos y otros objetivos, y de acuerdo con el propósito de la invención como se incluye y se describe de manera general en este documento, la presente invención proporciona un método para cultivar L. intracellularis y suministros a gran escala de bacterias producidas por el mismo. De acuerdo con el método, se incuban bacterias L. intracellularis en una concentración de oxígeno desde aproximadamente 0 por ciento hasta aproximadamente 18 por ciento, mientras se agitan las bacterias para cultivar L. intracellularis, y al mismo tiempo se mantiene a las bacterias en suspensión. De acuerdo con otra modalidad, se proporciona un método para cultivar bacterias L. intracellularis al inocular una monocapa de células HEp-2, McCoys, o IEC-18 la cual se encuentra a aproximadamente 30 por ciento de confluencia, con un inoculo que comprende bacterias de L. intracellularis de manera que infectan a las células con las bacterias. Las células infectadas después se incuban a una temperatura de aproximadamente 36 a aproximadamente 38°C con una concentración de oxígeno de aproximadamente 0 por ciento hasta aproximadamente 8.0 por ciento hasta que las células alcanzan confluencia. Las células infectadas y el medio de crecimiento después se colocan en un fermentador, biorreactor, matraz con agitación u otro recipiente adecuado para mantener las células en suspensión. Las células infectadas se incuban mientras se agitan las células de manera que se cultivan las bacterias de L. intracellularis y al mismo tiempo a que se mantenga a las células infectadas en suspensión. Después una porción de L. intracellularis cultivadas se hacen pasar a células de cultivo frescas para incrementar la producción de bacterias L. intracellularis. La invención proporciona vacunas contra L. intracellularis y métodos para producir vacunas contra L. intracellularis . Se produce una bacteria avirulenta de L. intracellularis al hacer pasar las bacterias cultivadas de L. intracellularis un número de veces suficiente y seleccionar una cepa atenuada, o al someter las bacterias cultivadas a medios químicos o a atenuación. También se preparan vacunas inactivadas de L. intracellularis utilizando métodos de cultivo de la invención. De acuerdo con una modalidad particularmente preferida, las bacterias se cultivan de manera continua durante por lo menos aproximadamente 6 a 8 meses mientras al mismo tiempo se someten a pasajes por lo menos aproximadamente 7 a 12 veces para producir una cepa atenuada para uso como una vacuna. La bacteria atenuada después se mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable y se administra a un animal en una cantidad efectiva para producir una respuesta inmune. Se ha depositado la cepa atenuada, actualmente preferida (N343NP40wk) en American Type Culture Collection. La invención también proporciona un método para determinar la presencia de anticuerpos que reaccionen específicamente con las bacterias L. intracellularis en una muestra biológica al recolectar por lo menos una porción de las bacterias L. intracellularis cultivadas, poner en contacto una muestra biológica de un animal con las bacterias L. intracellularis recolectadas o con un componente de las mismas bajo condiciones por las cuales el anticuerpo presente en la muestra biológica reaccione con L. intracellularis o con uno de sus componentes, y determinar si se ha producido una reacción anticuerpo-antígeno.

Las características y ventajas adicionales de la invención se establecerán en la descripción la cual sigue y la cual será evidente a partir de la descripción o la cual se puede aprender mediante la práctica de la invención.

DESCRIPCIÓN DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS Como se utiliza en la presente, el término "L. intracellularis" significa bacterias gramnegativas, curvas, intracelulares descritas con detalle por C. Gebhart et al., Int'l. J. of Systemic Bacteriology, Vol. 43, No. 3, 533-38 (1993) y S. McOrist et al. Int'l. J. of Systemic Bacteriology, Vol. 45, No. 4, 820-25 (1995) (cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad) e incluye, pero no se limita a la bacteria depositada como ATCC 55672 en American Type Culture Collection, Rockville, MD; la bacteria depositada como NCTC 12656 y 12657 en National Collection of Type Cultures, Colindale, Londres; la bacteria causal la cual puede ser obtenida a partir de cerdos infectados con PPE u otros animales a través del mundo dado el conocimiento en la técnica de las enseñanzas en la presente; y las variantes o mutantes de cualquiera de las bacterias anteriores, obtenidos ya sea de manera espontánea o artificial.

Como se utiliza en la presente, el término "cepa atenuada" significa cualquier cepa de L. intracellularis que se prepare de acuerdo con las técnicas de cultivo y pasaje descritas en la presente para obtener avirulencia, y al mismo tiempo con el mantenimiento de propiedades inmunogénicas cuando se administre a un animal huésped. Como se muestra abajo, se han cultivados diversas cepas diferentes de L. intracellularis y se han atenuado de acuerdo con las enseñanzas actuales para obtener cepas inmunogénicas atenuadas que tengan eficacia como vacunas en cerdos u otros animales susceptibles de infección por L. intracellularis . Las cepas atenuadas de la invención se espera que tengan utilidad como inmunógenos en vacunas antimicrobianas para animales, que incluyen aves, peces, ganado, cerdos, caballos, mamíferos y primates en general, así como humanos . Tales vacunas se pueden preparar por técnicas conocidas por aquéllos familiarizados con el arte, dadas las enseñanzas contenidas en la presente. Tal vacuna estaría constituida de una cantidad inmunológicamente activa de la cepa atenuada en un portador farmacéuticamente aceptable. La vacuna se puede administrar en una o más dosis . Una cantidad inmunológicamente efectiva es determinable por medios conocidos en la técnica sin experimentación indebida, dadas las enseñanzas contenidas en la presente. La cantidad de bacterias avirulentas será suficiente para estimular una respuesta inmunológica en animales susceptibles a enfermedad, mientras aún está avirulenta. Esto dependerá del animal, las bacterias y la enfermedad particulares involucrados. La dosis recomendada para administrarse al animal susceptible de manera preferible es 103 a 10' bacterias/kg de peso corporal, y de manera más preferible aproximadamente 10s a 107 bacterias/kg de peso corporal . Los portadores son aquéllos conocidos por los familiarizados en la técnica e incluyen estabilizantes y diluyentes . Tal vacuna también puede contener un adyuvante apropiado. Las vacunas de la invención se puede utilizar en combinación con otras vacunas, por ejemplo, como un diluyente de otra vacuna liofilizada, o combinadas antes de liofilización con otra vacuna. Las preparaciones de vacuna también se pueden desecar, por ejemplo, por liofilización para propósitos de almacenamiento o para formulación posterior en vacunas líquidas. En consecuencia, la invención también comprende un método para inducir una respuesta inmunitaria ante la presencia de la bacteria L. intracellularis de tipo silvestre, virulenta, en un huésped animal con el propósito de proteger al huésped contra tal bacteria. El método comprende administrar una cantidad inmunológicamente efectiva de la bacteria atenuada o de la bacteria inactivada de la invención al huésped y, de manera preferible, administrar la vacuna de la invención al huésped. Como se utiliza en la presente, el término "cultivo a gran escala" significa un nivel de cultivo de L. intracellularis mayor de aproximadamente 2.0 a 3.0 litros y que incluye la producción a una escala de 100 litros o más. Como se utiliza en la presente, "cultivo" significa el proceso de promover el crecimiento, reproducción y/o proliferación de L. intracellularis . En la práctica del método de cultivo de la invención, las células ? de cultivo primero se pueden inocular con un inoculo que comprende bacterias L. intracellularis de manera que infecten a las células con las bacterias. Se pueden utilizar diversas líneas celulares en la práctica de la invención, que incluyen, pero que no se limitan a: células epiteliales intestinales de rata IEC-18 (ATCC 1589) , células de carcinoma epidermoide humano HEp-2 (ATCC 23), células de ratón (no especificadas) McCoys (ATCC 1696) , células de riñon de perro Madin-Darby MDCK (ATCC 34) , células de riñon de mono verde búfalo (BGMK (Biowhittaker #71-176) y células del epitelio intestinal de cerdos. Las células de cultivo preferidas son células HEp-2, McCoys o IEC-18. De manera alternativa, las bacterias se pueden cultivar en un sistema libre de células - Íl eon la condición de que las bacterias se mantengan a la concentración de 02 disuelta apropiada como se describe en la presente. Si se utilizan células en cultivo, de manera preferible pero no necesaria, las células que van a ser inoculadas deben estar en forma de una monocapa. Para formar la monocapa, las células se pueden sembrar en matraces convencionales . Cada matraz generalmente se siembra con una cantidad entre aproximadamente 1 x 105 células hasta aproximadamente 10 x 10s células por matraz de 25 cm2 mezclado con medio de crecimiento. El medio de crecimiento puede ser cualquier medio para el cultivo de células el cual incluya una fuente de nitrógeno, los factores de crecimiento necesarios para las células de cultivo elegidas y una fuente de carbono, tal como glucosa o lactosa. El medio preferido es DMEM con 2-5% de suero bovino fetal, aunque se pueden utilizar con buenos resultados otros diversos medios disponibles comercialmente . Se ha encontrado que se mejora el cultivo exitoso de L. intracellularis al mantener las células de cultivo en un estado de crecimiento constante. Por lo tanto, la monocapa de células de cultivo debe ser por lo menos aproximadamente 20 por ciento hasta aproximadamente 50 por ciento de confluencia en el momento de inoculación. De manera preferible, las células deben estar a aproximadamente 30 por ciento hasta aproximadamente 40 por ciento de confluencia en el momento de inoculación, prefiriéndose aproximadamente 30 por ciento de confluencia. El inoculo puede ser un cultivo puro de L. intracellularis obtenido, por ejemplo, a partir de ATCC depósito 55672, NCTC depósitos 12656 a 12657, o a partir de cerdos u otros animales infectados utilizando las enseñanzas de aislamiento y purificación descritas en la presente. De acuerdo con una modalidad, el inoculo para llevar a la práctica la invención es un homogeneizado intestinal preparado por raspado de la mucosa del íleon de un cerdo u otro animal infectado con PPE. Cuando se prepara un homogeneizado intestinal, las secciones de íleon seleccionadas para cultivo deben mostrar lesiones graves con engrosamiento grande del intestino. Debido a la naturaleza frágil de las bacterias, las muestras deben congelarse de manera preferible a -70°C tan pronto como sea posible después de la necropsia. De manera preferible, se agrega un antibiótico al cual sea resistente L. intracellularis, tal como vancomicina, anfotericina B o miembros del grupo de aminoglicósidos de antibióticos, que incluyen gentamicina y neomicina, para suprimir las bacterias contaminantes y al mismo tiempo permitir el crecimiento de L. intracellularis .

Cuando el inoculo es un cultivo puro o un homogeneizado intestinal, la inoculación de las células de cultivo se puede llevar a cabo por diversas técnicas conocidas en el arte con las enseñanzas que se proporcionan en la presente. Las bacterias y/o células de cultivo inoculadas después se incuban bajo una concentración reducida de 02 disuelto. A concentraciones de oxígeno disuelto mayores de 18% el crecimiento de L. intracellularis es menor del óptimo con suspensión de crecimiento la cual ocurre finalmente a concentraciones de oxígeno fuera de este intervalo. De manera preferible, las células de cultivo inoculadas se incuban en una concentración de oxígeno disuelto en el intervalo desde aproximadamente 0% hasta aproximadamente 10%. De manera más preferible, las células se incuban en una concentración de oxígeno en el intervalo desde aproximadamente 0% hasta aproximadamente 8%, con una concentración de oxígeno de aproximadamente 0% a 3.0% como la más preferible. La concentración adecuada de dióxido de carbono también es importante para el crecimiento adecuado de L. intracellularis . A concentraciones de dióxido de carbono mayores de 10% y menores de 4%, se observa un crecimiento que no es óptimo con suspensión del crecimiento la cual ocurre finalmente a concentraciones de dióxido de carbono fuera de este intervalo. De manera preferible, la concentración de dióxido de carbono está en el intervalo desde aproximadamente 6% hasta aproximadamente 9%, preferiéndose una concentración de dióxido de carbono de aproximadamente 8.8%. Además, las células se incuban de manera preferible a una concentración de hidrógeno en el intervalo desde aproximadamente 73% hasta aproximadamente 94%. Se puede utilizar nitrógeno en lugar de parte o la totalidad del hidrógeno presente. De acuerdo con una modalidad particularmente preferida, las células se incuban en aproximadamente 0-8.0% de 02, aproximadamente 8.8% de C02 y aproximadamente 83.2% de H2. Las células inoculadas pueden ser incubadas en un incubador de gas doble u otra cámara de gas la cual contenga las concentraciones apropiadas de oxígeno y de dióxido de carbono y la cual permita que las células se suspendan durante la incubación. La cámara debe comprender un medio para mantener las células inoculadas en suspensión, y un monitor de gas y una fuente de suministro para proporcionar y mantener las concentraciones adecuadas de gas. La temperatura de incubación debe estar en el intervalo de 30°C hasta 45°C y de manera más preferible en el intervalo desde aproximadamente 36 °C hasta aproximadamente 38°C. De manera más preferible, la temperatura debe estar en aproximadamente 37°C. El equipo necesario para los métodos de cultivo y atenuación de la invención está disponible fácilmente para aquéllos habitualmente familiarizados con la técnica proporcionada por las enseñanzas en la presente. Un ejemplo de equipo adecuado para llevar a cabo la presente invención es un incubador de gas doble, por ejemplo, el modelo 480 disponible de Lab-Line, Melrose Park, Illinois, junto con matraces de agitación para mantener las células en suspensión. El equipo actualmente preferido comprende un fermentador, un biorreactor o un agitador giratorio que contenga menos de aproximadamente 2 litros de medio y que sea capaz de mantener las células de cultivo en suspensión por medio de purgado de gas de la concentración apropiada u otros medios de agitación mecánica, y monitorear continuamente las concentraciones disueltas de 02 en el medio. New Brunswick, Braun y otras compañías tienen fermentadores adecuados y biorreactores para este propósito. Al mantener las células inoculadas en un estado suspendido durante la incubación se obtiene un crecimiento máximo de las células, y por lo tanto de L. intracellularis , al incrementar la exposición individual de cada célula al medio de crecimiento y la mezcla adecuada de oxígeno y de dióxido de carbono. Las células en cultivo se pueden agitar y mantener en suspensión por diversos métodos conocidos en la técnica que incluyen, por ejemplo, matraces de cultivo, frascos giratorios, cultivos de membrana y matraces de agitación. Las células se pueden mantener en suspensión durante la incubación al incubar las células en un matraz de suspensión dentro de un incubador de gas doble o un aparato similar. Como se utiliza en la presente, el término, "matraz de agitación" significa un matraz u otro recipiente el cual utilice una paleta, propulsor u otro medio para agitar el cultivo y mantener las células contenidas en el mismo en suspensión. En una modalidad particularmente preferida de la invención, las células inoculadas se incuban hasta que las células alcanzan confluencia y después las células se colocan en un matraz de agitación que contenga medio de cultivo y se incuban en un incubador de gas doble y al mismo tiempo se hacen girar los matraces. De manera preferible, las células inoculadas son raspadas dentro del matraz de agitación. Esto se puede llevar a cabo por diversos métodos conocidos en la técnica tales como la utilización de un raspador de células para desprender las células. Una vez que las células se introducen en el matraz de agitación, la paleta del matraz de agitación típicamente se hace girar en un intervalo desde aproximadamente 30 hasta aproximadamente 60 rpm con el fin de mantener las células infectadas en suspensión.

Una porción de L. intracellularis cultivada se hace pasar después a células de cultivo fresco para incrementar la producción de bacterias L. intracellularis . El término "pasaje" o variaciones del mismo en la presente significa el proceso de transferir una porción de L. intracellularis cultivadas a células de cultivo frescas con el fin de infectar las células frescas con la bacteria. El término "fresco", como se utiliza en la presente, significa células las cuales aún no han sido infectadas por L. intracellularis . De manera preferible, tales células son, en promedio, no más de aproximadamente 1 día de edad. El pasaje de L. intracellularis en cultivos de suspensión se puede llevar a cabo al remover una porción del cultivo original y agregarlo a un matraz fresco que contenga células de cultivo frescas. Si el cultivo original tiene un número elevado de bacteria/ml, por ejemplo, más de aproximadamente 10" bacterias/ml, es preferible agregar entre aproximadamente 1 a 10% (volumen a volumen) del cultivo desde el matraz infectado a un matraz nuevo que contenga células frescas. Esto se lleva a cabo de manera preferible cuando se infectan 50-100% de las células. Si se infectan menos de 50% de las células, el pasaje de manera preferible se lleva a cabo al dividir el cultivo 1:2 en un matraz fresco y aumentar a escala el volumen al agregar medio fresco. En cualquier caso, no se requiere la lisis celular u otras etapas, en contraste directo con el pasaje de cultivos de monocapas, como en la técnica anterior. Después del crecimiento suficiente de las células de cultivo y la infección subsecuente por L. intracellularis a una infectividad celular mayor de aproximadamente 70%, determinada por IFA, TCIDS0 u otro método comparable, después se recolectan por lo menos una porción de las bacterias L. intracellularis cultivadas. Se puede llevar a cabo la etapa de recolección al separar las bacterias de la suspensión por diversas técnicas conocidas por aquéllos habitualmente familiarizados con la técnica y dadas las enseñanzas en la presente. De manera preferible, se recolectan las bacterias L. intracellularis por centrifugación del contenido de la totalidad o una porción de la suspensión para sedimentar las células de cultivo, resuspender los sedimentos celulares resultantes y lisar las células infectadas. Típicamente, se centrifuga por lo menos una porción del contenido a aproximadamente 3000 x g durante aproximadamente 20 minutos con el fin de sedimentar las células y las bacterias. Después se puede resuspender el sedimento en, por ejemplo, una solución de sacarosa-fosfato-glutamato (SPG) y se hace pasar aproximadamente cuatro veces a través de una aguja calibre 25 con el fin de lisar las células. Si se desea purificación adicional, se puede centrifugar las muestras a aproximadamente 145 x g durante aproximadamente 5 minutos para remover los núcleos y los residuos celulares. Después se centrifuga el sobrenadante a aproximadamente 3000 x g durante aproximadamente 20 minutos y se resuspende el sedimento resultante en un diluyente apropiado tal como SPG con suero bovino fetal (para preparar bacterias recolectadas adecuadas para liofilización o para uso como un inoculante) o medio de crecimiento (para preparar bacterias recolectadas de manera más adecuada para pasaje a células frescas) . Como se menciona previamente, se mejora el crecimiento efectivo de L. intracellularis para producción a gran escala al mantener las células de tejido en crecimiento activo. Con monocapas, cuando los cultivos se vuelven confluentes a velocidades de división celular que disminuyen sustancialmente. Los intentos por hacer crecer L. intracellularis en cultivo de tejido de monocapa han tenido éxito limitado y no ha sido posible su elaboración a gran escala. Sin embargo, utilizando cultivos en suspensión se facilita en gran medida el mantenimiento de células en crecimiento activo y permite la expansión continua de cultivo y la producción a gran escala. Utilizando un fermentador y entre aproximadamente 0-3% de 02 disuelto como se explicó en lo anterior, ha sido posible hacer crecer hasta 10* bacterias/ml. Ahora se tiene la posibilidad de mantener las bacterias cultivadas en crecimiento activo durante muchos meses y se espera poder realizar esto de manera indefinida. Antes de la presente invención, generalmente se creía que las células debían estar unidas a una superficie con el fin de ser infectadas por L. intracellularis . Las suspensiones celulares de la presente invención son únicas y contradicen esta teoría. Cuando se utilizan células McCoys o IEC-18, de manera preferible se agrega gelatina, agarosa, colágeno, acrilamida o esferas de sílice, tales como microportadores porosos Cultisphere-G fabricados por HyClone Laboratories, Logan, UT, junto con el medio de crecimiento, sin embargo, las células HEp-2 y otras no requieren de microportadores de acuerdo con el método de cultivo de la invención. Esto proporciona una vía especialmente ventajosa y económica para el cultivo a gran escala. Para propósitos de mantenimiento de cultivo, con cultivos HEp-2 de manera preferible 25-50% del cultivo se retira y sustituye con medio fresco a intervalos semanales. Para cultivos celulares con microportadores o esferas, de manera preferible 25-50% del cultivo se remueve y sustituye con microportadores o esferas frescas y con medio fresco 1-2 veces a la semana. Para propósitos de producción a gran escala, se puede agregar al cultivo 25-50% adicional de medio, o medio con microportadores. Con base a la velocidad a la cual las células de cultivo se infectan, el pasaje a células frescas generalmente se produce entre aproximadamente de 2 a aproximadamente 5 semanas. Suponiendo que las células de cultivo se encuentran infectadas por lo menos en un 70% en las siguientes 2-3 semanas, el pasaje de manera preferible se lleva a cabo entre aproximadamente cada 3 a 4 semanas. La presente invención también proporciona vacunas y métodos para producir vacunas contra L. intracellularis . De acuerdo con una modalidad particularmente preferida, después de mantener las células infectadas en suspensión durante un tiempo prolongado (por ejemplo 6-8 meses) , por lo menos una porción de las bacterias L. intracellularis cultivadas se recolectan y monitorean para determinar su atenuación potencial. De manera preferible, tal monitoreo se lleva a cabo por un animal huésped o por exposiciones en modelos animales para seleccionar una cepa atenuada. Tales cepas atenuadas se utilizan en vacunas de acuerdo con los métodos descritos en la presente. Las vacunas atenuadas de L. intracellularis de acuerdo con la presente invención han demostrado eficacia contra infección por L. intracellularis en diversos animales y se espera que sean efectivas también en humanos.

La presente invención proporciona una expansión rápida de cultivo, un incremento en los rendimientos de 100-1000 veces y un costo reducido. Como resultado, el suministro abundante de bacterias L. intracellularis producido de acuerdo con el método del cultivo de la invención se atenúa rápidamente para propósitos de producción de vacunas. La atenuación es difícil en cultivos de monocapa debido a los bajos rendimientos de bacterias producidos utilizando técnicas de crecimiento convencionales de monocapa. En contraste, el método de crecimiento de L. intracellularis de la presente invención incrementa en gran medida la facilidad, velocidad y cantidad de bacterias disponibles para este propósito. Cuantas más células haya y más divisiones celulares se presenten, mayor será el nivel de mutaciones que se presenten las cuales son ventajosas en el desarrollo de una vacuna. El crecimiento en suspensiones de acuerdo con la invención incrementa la expresión de inmunógenos importantes controlados por genes regulados ambientalmente y sus productos de expresión. Las cepas atenuadas resultantes se pueden cultivar en monocapas de cultivo de tejido como se describe en el Ejemplo 1 abajo, pero de manera preferible se cultivan en cultivos en suspensión de acuerdo con el método de la invención. Otros medios de atenuación pueden incluir atenuación química mediante el uso de, por ejemplo, N-metil nitrosoguanidina y otras sustancias conocidas en la técnica. Ya sea por pasaje múltiple o por medios químicos, se produce L. intracellularis atenuada y se selecciona para preparación de vacunas . De acuerdo con una modalidad de la invención para vacunas, el antígeno se recolecta por centrifugación o microfiltración como se describe en lo anterior. Después el antígeno se estandariza a un nivel definido en base a la respuesta inmune óptica del animal huésped, determinada por una titulación de dosis en las especies del animal huésped. La bacteria puede ser inactivada por exposición prolongada, por ejemplo, una semana, a concentraciones ambientales de 02 o mediante el uso de formalina al 0.3% u otro agente inactivante para preparar una vacuna inactivada. El antígeno después se incorpora en un adyuvante adecuado tal como hidróxido de aluminio o aceite mineral para mejorar la respuesta inmune. Después se utiliza el antígeno para vacunar al huésped por medio de inyección intravascular subcutánea. En el caso de cerdos de aproximadamente 3-4 semanas de edad, con una dosis de refuerzo en caso de que sea necesaria. De manera alternativa, de acuerdo con una modalidad de vacuna particularmente preferida, las bacterias se hacen pasar en serie para inducir y seleccionar un cultivo vivo a virulento y atenuado. El cultivo se prueba en el animal huésped (preferiblemente después de por lo menos 6 a 8 meses o más de crecimiento en el cultivo en suspensión) para observar signos de atenuación. El cultivo se recolecta como se describe anteriormente y se diluye. Se vacunan cerdos, por ejemplo, oralmente con 1 x 105 hasta 1 x 106 bacterias. Aproximadamente 28 días después de la vacunación los cerdos son inoculados por vía oral con aproximadamente 1 x 107 organismos de un cultivo menos virulento que ha sido sometido a pasaje (de aproximadamente 30 a 45 días de edad) de L. intracellularis . Los animales infectados se someten a necropsia 21 días después de la exposición y se observa el intestino delgado en búsqueda de lesiones gruesas así como lesiones microscópicas. También se pueden realizar pruebas por PCR y anticuerpos fluorescentes. Aproximadamente 80 por ciento de los animales control mostrarán lesiones grandes o microscópicas y un resultado positivo ante la prueba para detectar la presencia de L. intracellularis en las células de mucosa de intestino utilizando los métodos de prueba PCR o FA. Los animales vacunados tendrán superficies de mucosa normales determinada por observaciones histológicas y serán negativos en la prueba para PCR.

Generalmente, la cepa inmunogénica atenuada de L. intracellularis se produce después de cultivo continuo entre por lo menos aproximadamente 150 y 250 días, tiempo durante el cual el cultivo es sometido a pasajes por lo menos aproximadamente 7 a aproximadamente 12 veces. Otros cultivos atenuados pueden producirse al variar estas cantidades siempre y cuando se utilicen los métodos de monitoreo y selección descritos en la presente. Posteriormente se prepara una vacuna que comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de L. intracellularis atenuado en un portador farmacéuticamente aceptable. El inmunógeno y el portador combinado pueden ser una solución acuosa, emulsión o suspensión. Una cantidad inmunológicamente efectiva es determinada por medios conocidos en la técnica sin experimentación indebida dadas las enseñanzas contenidas en la presente. En general, la cantidad de inmunógeno estará entre 50 y 500 microgramos, y de manera preferible entre 107 y 109 TCID50, cuando se utilizan bacterias purificadas. Las vacunas de acuerdo con la invención generalmente se administran a animales susceptibles, de manera preferible cerdos, en una o más dosis. La vacuna atenuada o inactivada se puede administrar una o dos veces a intervalos de dos semanas. Para las vacunas vivas, atenuadas, se prefiere una dosis. Las vías preferidas de administración de cepas atenuadas vivas son oral o intranasal, pero también se puede utilizar la inyección intramuscular o subcutánea. Las vías de inyección intramuscular y subcutánea son más preferidas para la vacuna inactivada. El diagnóstico efectivo de PPE también ha sido impedido por el tiempo requerido para cultivar la bacteria causal. Como un resultado de la presente invención, ahora es posible el desarrollo de herramientas de diagnóstico que promuevan ensayos rápidos y precisos para detectar la presencia de L. intracellularis en muestras biológicas tomadas de cerdos y otros animales susceptibles a PPE. Las bacterias L. intracellularis que. crecen de acuerdo con el método de la presente invención, o los componentes derivados de tales bacterias, se puede utilizar como un antígeno en ELISA u otro inmunoensayo, tal como la prueba de anticuerpos inmunofluorescentes ("IFA"), para detectar anticuerpos para L. intracellularis en el suero y en otros fluidos corporales de animales sospechosos de estar infectados con la bacteria. El inmunoensayo actualmente preferido es una IFA como se describe en el ejemplo siguiente. De manera alternativa, se pueden utilizar bacterias que crecen de acuerdo con la invención en un ensayo de transferencia Western.

El protocolo de ELISA preferido de acuerdo con esta modalidad de la invención es como sigue: l. Agregue 0.1 ml/pozo de antígeno diluido en amortiguador de revestimiento. Incube durante 18 h a 4°C. 2. Lave 3 veces con PBS . 3. Agregue 0.25 ml de amortiguador de bloqueo a cada pozo de la placa. Incube 1 a 2 h a 37°C. 4. Lave 3 veces con amortiguador de lavado. 5. Diluya suero en amortiguador de bloqueo y agregue 0.1 ml a los primeros pozos de la placa. Haga diluciones seriadas 1:2 a través de la placa. Incube durante 1 h a 37°C. 6. Lave 3-5 veces con amortiguador de lavado. 7. Diluya el conjugado en amortiguador de bloqueo y agregue 0.1 ml a los pozos de la placa e incube durante 1 h a 37°C. 8. Lave 3-5 veces con amortiguador de lavado. 9. Agregue sustrato. 12. Mida la absorbancia de luz con un espectrofotómetro. 13. Los pozos en los cuales no se agregó antígeno se utilizan como blancos. 14. También deben utilizarse con cada prueba suero de cerdo control positivo y negativo.

El protocolo preferido para transferencia Western es como sigue: 1. Pruebe antígenos en SDS-PAGE al 12% y transfiéralos a membrana de nitrocelulosa. 2. Coloque la membrana en amortiguador de bloqueo durante 2 h. 3. Retire el amortiguador de bloqueo y humedezca con PBS durante 1 minuto. 4. Diluya el suero en amortiguador de bloqueo y agregúelo a la membrana. Incube durante 2 h a temperatura ambiente . 5. Lave tres veces con amortiguador de lavado (5 minutos para cada lavado) . 6. Diluya el conjugado en amortiguador de bloqueo y agregúelo a la membrana. Incube durante 1 h a temperatura ambiente. 7. Lave 3 veces con amortiguador de lavado. 8. Agregue sustrato durante 10 minutos o hasta que se presente la formación de una banda fuerte. 9. Humedezca con PBS. 10. Seque al aire y almacene en la oscuridad. La presente invención se describe adicionalmente en los siguientes ejemplos los cuales se proporcionan únicamente con propósitos ilustrativos y no se consideran limitantes.

EJEMPLO l Aislamiento de L. intracellularis de los intestinos de cerdos americanos que presentan enteropatia proliferativa porcina Materiales y métodos: Selección de las muestras de inoculo: Se obtiene la muestra N24912 a partir de un rebaño en una granja en Iowa en la cual quince de 300 cerdos terminales de cinco meses de edad se observaron los cuales presentaban heces sanguinolentas persistentes pese al tratamiento con penicilina. Al realizar la necropsia en los cerdos, el intestino (íleon) muestra una mucosa engrosada. Los exámenes histopatológicos con tinción de plata demuestra la presencia de bacterias intracelulares curvas e hiperplasia enterocítica críptica que confirma el diagnóstico de PPE. Se obtiene la muestra N72994 de la segunda carnada de 1.5 años de edad de una cerda SPF en una granja de Minnesota. El tamaño del rebaño está entre 70-80 cerdas y se desconoce el tratamiento de antibióticos. Al momento de la necropsia, la mucosa del íleon estaba engrosada con cierta hemorragia. La tinción de Giminez de la mucosa demostró muchas de bacterias curvas. Se obtiene la muestra N101494 de cerdos de 12 semanas de edad de una granja de Indiana con 600 surcos para cerdas terminadas. Los cerdos se trataron con Tylan inyectable al momento de la diarrea sanguinolenta, pero los animales murieron poco después de iniciado el tratamiento.

Preparación de inóculos bacterianos derivados de cerdos: Las muestras intestinales se mantienen a -70°C.

Se abren los intestinos y se lavan con solución salina amortiguada con fosfato (PBS) . Se raspan muestras de un gramo de mucosa en glutamato de sodio y potasio (SPG) y se homogeiniza durante 30 segundos con 4.0 ml de tripsina al 1% (JRH Biosciences, Lenexa, KS) en SPG. Las suspensiones se incuban durante 35 minutos a 37°C. Se agregan 10 ml de SPG/suero bovino fetal al 10% (FCS) (JRH Biosciences, lenexa, KS) y las muestras se trituran en un homogeneizador de tejido durante 1 minuto. Se agregan 10 ml de SPG/10% (FCS) y se filtran una vez a través de papel filtro (Whatman 113V; Whatman Labsales, Hillsboro, OR) y de manera secuencial a través de filtros de membrana de 5.0, 1.0 y 0.65 micrómetros. Se toman alícuotas de los filtrados y se concentran a -70°C en alícuotas de 1.0 ml. Se realizan frotis de la mucosa sobre placas para tinción de Giminez.

Los frotis separados de los filtrados se tiñen con IFA utilizando anticuerpo monoclonal específico para L. intracellularis . S. McOrist et al., Vet. Rec. 121:421-422 (1987) (incorporado en la presente como referencia en su totalidad) .

Cultivo celular: Se hacen crecer células IEC-18 (Células epiteliales intestinales de rata, ATCC CRL 1589) en DMEM (JRH Biosciences, Lenexa, KS) con L-glutamina y FCS al 10% y se someten a pasaje sistemático por tripsina, semanalmente. Las monocapas de células se hacen crecer a 37 °C en aire con C02 al 5%.

Infección del cultivo celular: Se siembran células IEC-18 a 1.25 x 105 células en matraces de 25 cm2 y a velocidades comparables en placas de cámara (Nunc, Inc., Naperville, IL) , se incuban durante 24 h, y después se elimina el medio. Se calientan rápidamente aislados carentes de bacterias, de cerdo, congelados, y se diluyen en DMEM/7% FCS con Vancomicina (100 µg/ml) y Anfotericina B (2.0 µg/ml) en proporciones de 1.0 ml de homogeneizado a 15 ml de medio y se agregan a las monocapas. Las monocapas y las suspensiones bacterianas se centrifugan durante 30 minutos a 2000 g y se transfieren a recipientes anaeróbicos. Los recipientes se evacúan y el gas es sustituido con hidrógeno y dióxido de carbono para proporcionar una mezcla de 8.0% de 02, 10% de C02 y 82% de H2. Los cultivos se incuban durante 3 ha 37 °C y después se vuelven a alimentar con DMEM/7% de FCS con L-glutamina, vancomicina (100 µg/ml) , neomicina (50 µg/D , y anfotericina B (2.0 µg/ml). Los cultivos se vuelven a colocar en los recipientes anaeróbicos y se incuban durante 6 días con cambios de medio cada dos días .

Pasa e de L. intracellularis: Se someten a pasaje bacterias L. intracellularis por lisis celular utilizando cloruro de potasio como se describe previamente en G. Lawson et al., J. Clinl. Microbiol., 31:1136-1142 (1993) (incorporada como referencia en la presente en su totalidad) y después se agregan a monocapas frescas de IEC-18. El medio se elimina por vertido de las monocapas y se agrega KCl al 0.1% y las células se incuban durante 10 minutos a 37°C. Se elimina KCl y se agrega SPG/10% y las monocapas se separan mecánicamente con un raspador celular. Las células se lisan al hacer pasar 3 veces a través de una jeringa con una aguja calibre 21. Se retiran los núcleos de las células por centrifugación a 100 x g durante 5 minutos y la suspensión bacteriana en el fluido sobrenadante se agrega a monocapas frescas de 1 d de células IEC-18.

Monitoreo de infección de cultivos celulares: Se monitorea la infección al fijar las células sobre placas de cámara con acetona/metanol frío durante 5 minutos . La tinción se lleva a cabo por inmunofluorescencia y método de inmunoperoxidasa. Ambos métodos utilizan un anticuerpo monoclonal de ratón (como se describe en S. McOrist et al., Vet. Rec. 121:421-422 (1987) ) como el anticuerpo principal y después con conjugado de inmunoglobulina G contra ratón-fluorocromo (isotiocianato de fluoresceína; Organon Teknika Corporation, Durham, NC) o con conjugado de peroxidasa (inmunoglobulina G de chivo, contra ratón; Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) . La cuantificación de las bacterias se lleva a cabo mediante el conteo del número de bacterias teñidas de manera específica dentro de las células, en cada frotis.

Reacción en cadena de polimerasa: Se incorporan inóculos de muestra y bacterias sometidas a pasaje como ADN de plantilla en PCR utilizando el método de preparación de muestra, los iniciadores y parámetros de ciclo como se describe por Jones et al., J. Clin. Microbiol., 31:2611-2615 (1993) y McOrist et al., Vet. Microbiol. 1-8 (1994) (cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad) . Los parámetros de ciclo son a 93°C durante 5 minutos, 55°C durante 45 segundos y 72 °C durante 45 segundos para el primer ciclo. Se realizan 33 ciclos a las temperaturas mencionadas previamente 45 segundos por temperatura, así como un ciclo a 93 °C durante 45 segundos, 55 °C durante 45 segundos y 72 °C durante 2 minutos. Los inóculos positivos únicamente se utilizaron para inocular las células IEC-18. También se llevó a cabo PCR para el monitoreo del material de pasaje para confirmar las infecciones. El ADN producido por PCR se envió a Iowa State University Nucleic Acid Facility para determinación de la secuencia. Los resultados del secuenciado se comparan con las secuencias producidas por Gary F. Jones reportado en su tesis para Ph.D., University of Minnesota, Minneapolis, MN (junio de 1993) .

Resultados: Selección de las muestras de inoculo: Los cerdos números N24912 y N72994 presentaban PPE severo con contenido intestinal sanguinolento y mucosa engrosada. N101494 muestra PPE es severo y hemorragia grave que resulta en un coágulo sanguíneo grande en el lumen intestinal . La tinción de Giminez de los frotis de mucosa demuestra cantidades grandes de bacterias curvas o en forma de S . La tinción IFA muestra grandes cantidades de bacterias que presentan fluorescencia brillante en inóculos bacterianos derivados de cerdos .

Monitoreo de la infección de cultivos celulares : Se monitorean monocapas inoculadas mediante microscopía óptica a través de lo cual se observó el ciclo de crecimiento y cambio morfológico leve de las células. Las monocapas no infectadas que crecen bajo tensión de oxígeno reducida (8% 02) presentan morfología similar. La inmunofluorescencia y los cultivos infectados teñidos con inmunoperoxidasa demuestran grandes cantidades de bacterias teñidas específicamente curvas o en forma de S aparentemente dentro de las células. Las monocapas no tienen infección confluente. Las células infectadas con frecuencia están asociadas estrechamente con focos infectados de 1-10 células. Las células con infección severa (es decir, células con 30 o más bacterias) también se observan en asociación con células con menos de 30 bacterias. Los números bacterianos alcanzaron un máximo aproximadamente a los 6 días . La infección es dependiente de las condiciones específicas de crecimiento. Las bacterias se someten a pasaje exitoso mediante el procedimiento de lisis de células descrito en la presente. La centrifugación de células recién inoculadas no es necesaria pero incrementa las cantidades de células infectadas. La centrifugación también disminuye la contaminación al permitir que las células se expongan a infección con medio libre de antibióticos para ser realimentadas a las 3 h con medio que contiene antibióticos. Es necesario una reducción de FCS de 10% a 7% en el medio para disminuir el crecimiento de células IEC-18 para permitir de esta manera que las bacterias proliferen en cantidades mayores antes de que las monocapas se vuelvan confluentes .

Reacción en cadena de polimerasa: La PCR del ADN cromosómico generó un fragmento de 319 pb (que incluye a los iniciadores o sebadores) para todos los aislados. Un fragmento de tamaño apropiado se comparó visualmente con una muestra positiva conocida generada por McOrist et al. (1994) utilizando PCR. El análisis de secuencia de los productos por PCR de N24912, N72994 y N101494 confirma una homología estrecha (97-99%) con la secuencia p78 determinada por Jones (1993) .

EJEMPLO 2 Crecimiento de L. intracellularis en cultivos en suspensión de células HEp-2 Preparación de homoaeneizados intestinales para inoculo: Se prepara un homogeneizado intestinal por raspado de la mucosa de 6.0 a 8.0 cm de íleon de muestras intestinales de Ejemplo 1. Se agrega tripsina (1%) a la mucosa raspada y las muestras se homogeneizan brevemente, después se inoculan durante 35 minutos a 37CC. Después se agregan 10 ml de SPG/10% de FBS y las muestras se trituran en un homogeneizador de tejido. Se agregan otros 10 ml de SPG/10% FBS. Los homogeneizados se hacen pasar a través de un filtro Whatman V113 y después se someten secuencialmente a filtros de 5.0, 1.0* y 0.65 µm. Las muestras se suministran en alícuotas de 1 ml y se congelan a -70°C.

Infección del cultivo celular: Método A: Se siembran células de tejido a 1 x 107 células en 50 ml de DMEM/10% de FBS en un matraz de agitación de 100 ml. Los cultivos se incuban durante 24 h, y después se agrega vancomicina y fungizona. Un frasco de homogeneizado intestinal congelado se calienta rápidamente y se diluye en 3.0 ml de DMEM/5% de FBS con vancomicina (100 µg/ml) y anfotericina B (2.0 µg/ml). La muestra se hace pasar a través de un filtro de 0.65 µm y se agrega al matraz. El cultivo se coloca en una cámara de gas, se evacúa y se regasifica con hidrógeno y dióxido de carbono para proporcionar una mezcla de 8.0% de 02, 8.8% de C02 y 83.2% de H2. Los cultivos se inoculan durante 3 h a 37°C y después se agrega neomicina y gentamicina. El cultivo se vuelve a alimentar a las 24 h con DMEM/5% de FBS con L-glutamina, vancomicina (100 µg/ml), neomicina (50 µg/1) , gentamicina (50 µg/1) y anfotericina B (2.0 µg/ml).

Método B: Dos matraces convencionales de 25 cm2 se siembran con 1.25 x 10s células HEp-2 en DMEM/10% de FBS y se permite que crezcan durante 18-24 h. Las células se encontraban a 30% de confluencia en el momento de la inoculación. El inoculo se diluye en DMEM/5% de FBS. Cuando el inoculo es de homogeneizado intestinal, el medio también contiene vancomicina (100 µg/ml) y anfotericina B (2.0 µg/ml). Los cultivos se colocan en una cámara de gas, se evacúan y se regasifican con hidrógeno y dióxido de carbono para proporcionar una mezcla de 8.0% de 02, 8.8% de C02 y 83.2% de H2. Los cultivos se incuban durante 3 h a 37°C y después se agrega neomicina y gentamicina. El cultivo se vuelve a alimentar a las 24 h con DMEM/5% de FBS con L-glutamina, vancomicina (100 µg/ml) , neomicina (50 µg/1) , gentamicina (50 µg/1) y anfotericina B (2.0 µg/ml). No se requieren antibióticos cuando el inoculo es un cultivo puro. Los cultivos se incuban durante 6 días o hasta confluencia. Las células se raspan del matraz y se agregan a un matraz de agitación de 100 ml que contiene 50 ml de DMEM/5% de FBS. El cultivo se diluye 1:2 a intervalos semanales ya sea por recolección de la mitad del cultivo y agregando medio fresco o bien al pasarlo a un matraz de agitación más grande y agregando más medio.

Pasa-ie del cultivo: El cultivo se hace pasar a células HEp-2 frescas al sembrar las células HEp-2 nuevas a 1 x 107 en DMEM/5% de FBS . Se permite que el nuevo cultivo se incube durante la noche a 8.0% de 02, 8.8% de C02 y 83.2% de H2. El nuevo cultivo después se inocula con cultivo infectado y se incuba a concentraciones reducidas de 02 como se establece previamente. Las cantidades de inoculo son dependientes del grado de infección del cultivo original .

Recolección v almacenamiento de cultivos: Los cultivos se cosechan al recolectar la cantidad deseada de cultivo cuando se centrifugan a 3000 x g durante 20 minutos. El sedimento se resuspende en solución de sacarosa-fosfato-glutamato (SPG) y se somete a pasaje 4 veces a través de una aguja calibre 25. Los cultivos se someten a alícuotas y se congelan a -70 °C. Para purificación adicional, la muestra se centrifuga a 145 x g durante 5 minutos para eliminar los núcleos y residuos celulares. Posteriormente se centrifuga el sobrenadante a 3000 x g durante 20 minutos. Después se resuspende el sedimento en diluyente.

Estimación de L. intracellularis viables en cultivo de tejido; Se lleva a cabo la cuantificación de L. intracellularis viables por determinación del 50 por ciento de dosis infecciosa del cultivo de tejido (TCIDS0) . Esto se lleva a cabo al retirar 2.0 ml de cultivo que se va a probar y lisar las células al hacerlas pasar a través de una aguja calibre 25 cuatro veces. La muestra se diluye de manera seriada 1:10 en DMEM/5% de FBS que contiene vancomicina (100 µg/ml) y anfotericina B (2.0 µg/ml). Las diluciones se agregan a placas de microtitulación de 96 pozos con 0.1 ml/pozo. Las placas de microtitulación se siembran con células HEp-2 a 1250 células/pozo y se hacen crecer durante 18-24 h antes de la infección. Se utilizan entre 3 pozos/dilución y 6 pozos/dilución. La placa se incuba durante 3 días a concentraciones de gas de 8.0% 02, 8.8% C02, y 83.2% H2. Las células se fijan con acetona fría al 50% y metanol al 50% durante 2 minutos. A los pozos se les agregan 0.03 ml/pozo de anticuerpo monoclonal contra-IS intracellularis (McOrist, 1994) diluida 1:2000 en PBS. La placa se incuba durante 30 minutos a 37°C y después se lava 3 veces con PBS. Se agrega FITC contra ratón diluido 1:30 en la cantidad de 0.03 ml/pozo y se incuba 30 minutos a 37°C. Después de la placa se lava 3 veces con ddH20 y se permite que seque. Se observan las muestras en un microscopio fluorescente y se determina TCID50/ml.

Resultados : Los resultados de CIDS0 indican que los cultivos contienen hasta 1 x 10ß bacterias/ml . Esto se lleva a cabo en 45 días. El volumen de cultivo se aumenta a 3.0 litros en la misma cantidad de tiempo.

EJEMPLO 3 Crecimiento de L. intracellularis en cultivos en suspensión de células McCovs Preparación de homo eneizados intestinales para inoculo: Se preparan homogeneizados intestinales como se describe en el Ejemplo 2. Se deposita una muestra de L. intracellularis cultivo de acuerdo con el método del siguiente ejemplo bajo el Tratado de Budapest el 19 de mayo de 1995 en la American Type Culture Collection (ATCC) , 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland E.U.A. 20852 y se le asigna el número de acceso 55672.

Infección de cultivo celular: Se siembran dos matraces convencionales de 25 cm2 con 1.25 x 10s células McCoys en DMEM/10% de FBS y se permite que crezcan durante 18-24 h. Al momento de la inoculación las células están a 30% de confluencia. Se diluye el inoculo en DMEM/5% de FBS. Cuando el inoculo es de un homogeneizado intestinal, el medio también contiene vancomicina (100 µg/ml) y anfotericina B (2.0 µg/ml). Se colocan los cultivos en una cámara de gas, se evacúa y se reciasifica con hidrógeno y dióxido de carbono para proporcionar una mezcla de 8.0% 02, 10% C02; y 82% H2. Los cultivos se incuban durante 3 h a 37°C, y después se agrega neomicina y gentamicina. El cultivo se vuelve a alimentar a las 24 h con DMEM/5% de FBS con L-glutamina, vancomicina (100 µg/ml) , neomicina (50 µg/1) , gentamicina (50 µg/1) y anfotericina B (2.0 µg/ml). Cuando el inoculo es de un cultivo puro, no se requieren antibióticos. Se incuban los cultivos durante 6 días hasta confluencia. Se raspan las células de los matraces y se agregan a un matraz de agitación de 100 ml que contiene 50 ml de DMEM/2% de FBS y 0.05 g de microportadores Cultisphere-G. Se agitan los matraces a 40-50 rpm. Se diluye el cultivo 1:2 cada 2-3 días ya sea por recolección de la mitad del cultivo y agregado de medio fresco y esferas Cultisphere-G o bien al hacer pasar el cultivo a un matraz de agitación más grande y agregar más medio de cultivo y esferas Cultisphere-G. La concentración final de esferas en el cultivo es de aproximadamente 0.001 g de esferas/ml.

Pasaje del cultivo: El cultivo se pasa a células McCoys frescas al sembrar 1 x 107 células nuevas McCoys en DMEM/2% de FBS y 0.05 g de esferas Cultisphere-G. Se permite que el nuevo cultivo se incube durante la noche a 8.0% de 02, 8.8% C02 y 83.2% H2. El cultivo nuevo después se inocula con 25 ml de cultivo infectado y se incuba a concentraciones reducidas de 02, como se establece • previamente .

Recolección v almacenamiento de los cultivos: Se cosechan los cultivos al recolectar la cantidad deseada de cultivo y centrifugada a 3000 x g durante 20 minutos. Se resuspende el sedimento en SPG y se hace pasar cuatro veces a través de una aguja calibre 22.

Se toman alícuotas de los cultivos y se congelan a -70°C.

Para purificación adicional, se centrifuga la muestra a 145 x g durante 5 minutos para eliminar las esferas, los núcleos y los residuos celulares. Después se centrifuga el sobrenadante a 3000 x g durante 20 minutos. Después se resuspende el sedimento en diluyente.

Estimación de L. intracellularis viable en cul ivo de tejido: Se determina la cuantificación de L. intracellularis viable como se describe en el Ejemplo 2 utilizando una aguja calibre 22 para lisar las células utilizando células McCoy a 1250 células/pozo para sembrarlas en las placas de microtitulación.

Resultados: Los resultados de TCID50 indican que los cultivos contienen hasta 1 x 10ß bacterias/ml . Esto se lleva a cabo en menos de 1 mes. El volumen de cultivo se realiza a gran escala hasta 3.0 litros en la misma cantidad de tiempo.

EJEMPLO 4 Determinación de la dosis infecciosa de cultivos puros de L. intracellularis en animales huésped.

Resumen: Se completó un estudio en 31 cerdos al infectar cerdos convencionales de 6 semanas de edad con cultivos puros de L. intracellularis de la muestra N72994. Se dividieron aleatoriamente los cerdos en cuatro grupos y los grupos se encerraron en corrales por separado. El grupo 1 estaba constituido de 7 cerdos y consistía del grupo control negativo dosificado con cultivo de tejido no infectado o sin dosificación. El grupo 2 estaba constituido de 8 cerdos dosificados con 107 bacterias/cerdo. El grupo 3 estaba constituido de 8 cerdos y estaba dosificado con 10* bacterias/cerdo. El grupo 4 estaba constituido de 8 cerdos que reciben 10s bacterias/cerdo. Se recolectaron frotis fecales en los días 0, 7, 14 y 21 y 24 para realizar prueba de PCR. En el día 24, los cerdos fueron sometidos a necropsia y se recolectaron el íleon, yeyuno y el colon para pruebas por PCR, histopatología y tinciones de FA, todas descritas en lo anterior. La prueba de PCR de la mucosa del íleon mostró la presencia de L. intracellularis en 100% en la dosis elevada, 75% en la dosis media y 50% en la dosis baja. Los resultados de histopatología indican un incremento de células mononucleares en la lámina propia y en la submucosa de 88% de animales con dosis elevada, 75% de los animales con dosis media y 88% de animales con dosis baja. Se observó hiperplasia tríptica en 50% de los animales con dosis elevada, 63% de los animales con dosis media y 50% de los animales con dosis baja. La tinción por FA mostró L. intracellularis en secciones de tejido del íleon, yeyuno y colon en 88% en los animales con dosis elevada, 63% de los animales con dosis media y 63% de los animales con dosis baja. Los animales control fueron negativos respecto a la presencia de L. intracellularis ya sea por PCR, FA o por tinción de plata. En conclusión, un cultivo puro se utilizó con éxito para infectar y provocar lesiones de PPE. Se satisfacen los postulados de Koch mediante la identificación y aislamiento de L. intracellularis a partir de los animales infectados. En 100% de los animales infectados de los animales con la dosis más elevada presentaron recuperación confirmada e identificación por medio de tinción de plata, FA, y PCR.

Materiales y métodos: Crecimiento del inoculo: Se siembra un matraz convencional de 75 cm2 con 3.75 x 10s células HEp-2 en DMEM/10% de FBS y se permite que crezca 18-24 h a 37°C y 5% de C02. Al momento de la inoculación las células están al 30% de confluencia. Se diluye con un frasco de N72994 en 15 ml de DMEM/5% de FBS. El cultivo se coloca en una cámara de gas, se evacúa y se regasifica con hidrógeno y dióxido de carbono para proporcionar una mezcla de 8.0% 02, 8.8% C02 y 83.2% H2. El cultivo se vuelve a alimentar a las 24 h con DMEM/5% de FBS. Se incuban los cultivos durante 6 días, después se raspan las células de los matraces y se agregan a un matraz de agitación de 100 ml que contiene 50 ml de DMEM/5% de FBS. Se aumenta la escala del volumen del matraz al duplicar el volumen de medio a intervalos semanales. Se hace crecer el cultivo durante 3 semanas en el matraz de suspensión.

Recolección de los cultivos: El cultivo se recolecta por centrifugación a 3000 x g durante 20 minutos. El sedimento se resuspende en solución de sacarosa-fosfato-glutamato (SPG) con 10% de FBS y se hace pasar cuatro veces a través de una aguja calibre 25. El inoculo se diluye hasta un volumen final en SPG/10% FBS y se realizan diluciones 1:10. El inoculo para los controles consiste de células HEp-2 no infectadas diluidas hasta la misma concentración de células viables que el cultivo infectado. Las células se recolectan al igual que el cultivo infectado. Los cerdos control recibieron una dosis similar de células del grupo con la dosis elevada.

Cuantificación de L. intracellularis : Se lleva a cabo la cuantificación de L. intracellularis viables por determinación del 50 por ciento de dosis infecciosa de cultivo de tejido (TCID50) . Esto se lleva a cabo al extraer 2 ml de cultivo que se va a probar y lisar las células al hacerlas pasar a través de una aguja calibre 22 cuatro veces. Se diluye de manera seriada la muestra 1:10 en DMEM/5% de FBS que contiene vancomicina (100 µg/ml) y anfotericina B (2.0 µg/ml). Se agregan las diluciones a una placa de microtitulación de 96 pozos con 0.1 ml/pozo. Las placas de microtitulación se siembran con células HEp-2 a 2500 células/pozo y se hacen crecer durante 18-24 h antes de infección. Se utilizan doce pozos/dilución. Se incuba la placa durante 6 días a concentraciones de gas de 8.0% 02, 8.8% C02, y 83.2% N2. Las células se fijan con acetona fría al 50% y metanol al 50% durante 2 minutos. Se agrega a los pozos 0.03 ml/pozo de anticuerpo monoclonal contra L. intracellularis (McOrist, 1987) diluido 1:2000 en PBS. Se incuba la placa durante minutos a 37°C y después se lava tres veces con PBS. Se agrega FITC contra ratón diluido 1:30 a 0.03 ml/pozo y se incuba 30 minutos a 37°C. Se lavan tres veces las placas con ddH20 y se permite que se sequen. Se observan las muestra en un microscopio fluorescente y se determina la TCID50/ml .

Animales : Se proporcionaron por el doctor Kent Schwartz 31 cerdos de sexo indistinto de 6 semanas de edad de las hembras PIC x Lieske y puercos maduros sin castrar blancos grandes . Los cerdos se distribuyeron aleatoriamente en cuatro pocilgas por peso en el día 0.

Instalaciones: Se utilizaron cuatro pocilgas en una instalación de veterinarios pequeña, cada una separada por lo menos por un metro (3 pies) para alojar a los cerdos. Las pocilgas tenían piso de alambre y divisiones de pocilga sólidas. Se proporcionó calor por un horno con calor suplementario por zonas mediante lámparas superiores . La temperatura se mantuvo entre 25 y 29 °C (78-85°F) durante la duración del estudio.

Alimentación y agua: Se proporcionó ad libitum una dieta de maíz-soya molido con 19% de proteína, libre de antibióticos, por medio de alimentadores de acero inoxidable. Se proporcionó agua ad libitum por medio de bebedores con chupones.

Infección de los cerdos: En el día 0, se utilizaron los cerdos y se recolectaron muestras de sangre por medio de un tubo capilar colocado en el seno retroorbital . El suero se recolectó y almacenó congelado a -20 °C. También se recolectaron muestras fecales para PCR. Se dosificó a los cerdos con 10 ml de inoculo proporcionado intragastricalmente por medio de un tubo en el estómago.

Tratamiento No. de cerdos Control - cerdos no infectados 5 Control - sin tratamiento 2 Dosis alta 8 Dosis media 8 Dosis baja 8 Los cerdos fueron pesados y sangrados los días 0, 10, 17 y 24.

Reacción en cadena de polimerasa: Se monitoreó la infección de los cerdos por PCR utilizando iniciadores y parámetros de ciclo como se describe por Jones (1993) . Las muestras fecales se recolectaron en los días 0, 7, 14, 21 y 24 así como la mucosa de los intestinos fue verificada por PCR.

Histopatolosía: Secciones de íleon, yeyuno y colon fueron habitualmente, teñidas con ilmetoxilina y eosina y también se evaluaron impregnaciones en plata. También se tiñeron secciones utilizando anticuerpo monoclonal específico para L. intracellularis.

Resultados : Signos clínicos: Los signos clínicos consisten de heces sueltas que se observaron por primera vez en el grupo de dosis alta a los 3 días. Los signos alcanzaron un máximo a los 14 días y comenzaron a ceder posteriormente.

Ganancia de peso: Se calculó la ganancia de peso diaria promedio, lo que muestra que los grupos con dosis elevada y media tenían ganancias de peso reducidas en comparación con el grupo control. Existe un efecto de titulación de dosis en las ganancias de peso cuando se comparan los grupos .

PCR: No se observó derramamiento fecal hasta los 14 días. A los 21 días, 37.5% de los cerdos con dosis alta fueron positivos por PCR en las heces. Después de la necropsia, se verificaron las mucosas de los íleon por PCR con un resultado 100% positivo con la dosis alta, 75% con la dosis media y 50% con la dosis baja, y 0% en los controles .

Lesiones sruesas: Se encontraron lesiones gruesas en 2 cerdos del grupo con dosis alta (#50 y #202) . Los cerdos presentaron un engrosamiento de aproximadamente 1 metro (3 pies) en el íleon, con necrosis en el cerdo #202.

Histopatolosia: FA: La tinción con FA de secciones de íleon, yeyuno y colon mostró la presencia de L. intracellularis en 87.5% de los animales con dosis alta, 62.5 en los cerdos con dosis media y baja y 0% en los controles.

Lesiones microscópicas : Se observaron lesiones en 100% de los cerdos con dosis alta, 75% con dosis media y 87% con dosis baja, y 14% en los controles. Esto se determinó por observación de células mononucleares aumentadas en la lámina propia y la submucosa, con frecuencia asociada con hiperplasia de las placas de Peyer. También se observó hiperplasia críptica.

Tinción con plata: También se realizó la tinción con plata de secciones para detectar la presencia de bacterias curvas intracelulares. Esto demostró la presencia de bacterias en 87.5% de la dosis elevada, 62.5% en la dosis media, 87.5% en la dosis baja y 0% en los controles.

Discusión; Los cerdos fueron infectados exitosamente con cultivos puros de L. intracellularis . A dosis de 107 bacterias, 100% de los cerdos demostraron infección por PCR y lesiones microscópicas. La gravedad de las lesiones y las cantidades de bacteria en las secciones de tejido fueron relativamente bajas. Este estudio es un modelo de disposición satisfactorio para L. intracellularis debido a la presencia de L. intracellularis y lesiones microscópicas en los cerdos. Las lesiones pueden mejorarse con una segunda dosis 7 días después de la primera dosis.

EJEMPLO 5 Experimento de eficacia de vacuna en hámster Objetivo: Evaluar un modelo de animal de laboratorio para determinar la seguridad y eficacia de una vacuna inactivada avirulenta de L. intracellularis en hámsteres.

Resumen: Se completa un estudio de 40 hámsteres al vacunar hámsteres de 3 semanas de edad con cultivos puros de la cepa de pasaje elevado de L. intracellularis y exponer los 22 días después de la vacunación con cultivos puros de material virulento de pasaje bajo. Los hámsteres se dividieron en 3 grupos. El grupo A se vacunó con una dosis de L. intracellularis cepa N72994 en el día 0. El grupo B se designó como el grupo control y no se dosificó con un cultivo de vacuna. Ambos grupos fueron expuestos con dos dosis de un cultivo puro de L. intracellularis cepa N343 en los días 22 y 25 posteriores a la vacunación. El grupo C se le proporcionó una cepa de exposición, N101494, para comparar la virulencia relativa con la cepa N343. Los grupos A y B contienen 15 hámsteres cada uno y el grupo C contiene 10 hámsteres. Los resultados del 50% de dosis infecciosa de cultivo de tejido (TCIDS0) indicaron que los hámsteres se vacunaron con 10s TCID50/dosis . La exposición con N343 contiene 1055 TCID50/dosis . La dosis de exposición para el grupo C fue de 10275 TCIDS0/dosis. Se recolectaron muestras fecales los días 0, 7, 14, 21, 29, 36 y 43 para la curva de reacción en cadena de polimerasa (PCR) . En el día 21, se sometieron a necropsia 5 animales de los grupos A y B, cada uno para la prueba por PCR de las mucosas así como FA, tinciones de hematoxilina y eosina y tinciones de plata de secciones íleon para determinar la persistencia de colonización de bacterias en los hámsteres vacunados. Los animales restantes fueron sometidos a necropsia 21 días después de la exposición con pruebas similares. Los resultados de PCR indican la presencia de L. intracellularis en las mucosas intestinales de 100% de los hámsteres del grupo A 21 días después de la vacunación. Los hámsteres del grupo B fueron todos negativos a los 21 días posteriores a la vacunación. 50% de los hámsteres a los 21 días posteriores a la exposición fueron PCR positivos en el grupo A y 100% fueron positivos en el grupo B. La histopatología de las secciones indica lesiones moderadas a severas en 50% de los animales en el grupo A y lesiones moderadas en el 50% en el grupo B los 21 días posteriores a la exposición. Ningún animal mostró lesiones 21 días después de la vacunación. El grupo C de animales no presentó lesiones a los 21 días posteriores a la exposición. Las tinciones con FA y plata no pudieron demostrar la presencia de L. intracellularis en cualquiera de las secciones . En conclusión, se observa una reducción de 50% de infección en hámsteres vacunados con una cepa de pasaje elevado de L. intracellularis, demostrado por PCR. Los intestinos estaban colonizados con cantidades pequeñas de organismos intracelulares como se demuestra por la carencia de organismos observados en las secciones teñidas con FA y con plata. Los hámsteres en el grupo C no mostraron infección durante el estudio debido muy probablemente a la baja dosificación de bacterias.

Materiales v métodos: Descripción de hámsteres: Se utilizaron 40 hámsteres hembra de 3 semanas de edad de Harían Sprague Dawley.

Crecimiento del inoculo: Cultivo de vacuna: Se utilizó un cultivo continuo de L. intracellularis que creció en células HEp-2 durante 29 semanas. El cultivo se hace crecer de manera similar como se establece en la sección de cultivo de exposición excepto que el cultivo se hace pasar a células HEp-2 nuevas cada 2-3 semanas.

Cultivos de exposición: Se sembró un matraz de cultivo de tejido convencional de 75 cm2 con 3.75 x 105 células McCoys en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con 10% de suero bovino fetal (FBS) y se permite que crezca a 18-24 h a 37°C con 5% de C02. El medio se separó de las células y se agregó al matraz un frasco de N343 MSC x diluido en 14 ml de DMEM/2% de FBS. El cultivo se colocó en una cámara de gas, se evacuó y se regasificó con hidrógeno y dióxido de carbono para proporcionar una mezcla de 8.0% 02, 8.8% C02 y 83.2% H2. Se hace crecer el cultivo durante 6 días, después se raspan las células en un matraz de agitación de 100 ml con 90 ml de DMEM/2% de FBS y 0.01 g de esferas cultisphere-G. El cultivo se hace crecer a la concentración de gas establecida antes. El volumen de matraz fué aumentado al duplicar el volumen de medio a intervalos semanales. Se hace crecer el cultivo durante 25 días en un matraz de agitación hasta un volumen final de 250 ml. Se hace crecer la cepa N101494 de la misma manera que la cepa N343.

Cultivos de recolección: Cultivo de vacuna: Se recolectaron los cultivos al centrifugar a 3000 x g durante 20 minutos. El sedimento se resuspendió en solución de sacarosa-fosfato-glutamato (SPG) con 10% de FBS y se hizo pasar cuatro veces a través de una aguja calibre 25. El inoculo se diluyó hasta el volumen final (15 ml) en SPG/10% de FBS.

Cultivos de exposición: Se recolectaron cultivos al centrifugar a 3000 x g durante 20 minutos. Se resuspendieron los sedimentos en solución de sacarosa-fosfato-glutamatos (SPG) con 10% de FBS y se hicieron pasar cuatro veces a través de una aguja calibre 25. El inoculo se diluyó hasta el volumen final en SPG/10% de FBS (20 ml para la cepa N343 y 10 ml para la cepa N101494) .

Dosificación de los hámsteres: Vacuna: En el día 0, se vacunaron por vía oral a todos los hámsteres en el grupo A con 1 ml de la vacuna preparada.

Exposición: 22 días después de la vacunación, se dosificaron oralmente a 10 hámsteres en el grupo A y 10 hámsteres en el grupo B con 0.5 ml de cultivo de exposición de la cepa N343. El grupo C se sometió a exposición con 0.5 ml de cultivo de exposición de la cepa N101494.

Cuantificación de IS intracellularis: Se llevó a cabo la cuantificación de IS intracellularis viable por determinación del 50 por ciento de dosis infecciosas de cultivo de tejido (TCID50) . Esto se llevó a cabo al extraer 2 ml de cultivo que se va a probar y lisar las células al hacerlas pasar a través de una aguja calibre 22 cuatro veces. La muestra se diluyó de manera seriada 1:10 en DMEM/5% de FBS que contiene vancomicina (100 µg/ml) y anfotericina B (2.0 µg/ml) . Las diluciones se suministraron a 0.1 ml/pozo y se incubó 18-24 horas a 37 °C y 5% de C02 antes de la infección. Se utilizaron doce pozos/dilución. Se incubó la placa durante 6 días a concentraciones de gas de 8.0% 02, 8.8% C02 y 83.2% N2. En el día 6, se fijaron las células con acetona al 50% y metanol al 50% fríos, durante 2 minutos. Se agregó a los pozos 0.03 ml/pozo de anticuerpo monoclonal contra IS intracellularis diluido 1:2000 en PBS. Se incubó la placa durante 30 minutos a 37°C y después se lavó tres veces con PBS. Se agregó FITC contra ratón diluido 1:30 a 0.03 ml/pozo y se incubó durante 30 minutos a 37 °C. La placa se lavó tres veces con ddH20 y se permitió que secara. Se observaron las muestras en un microscopio fluorescente y se determinó TCIDS0/ml .

Monitoreo de infección de hámsteres: Se monitoreó la infección de los hámsteres por PCR utilizando iniciadores y parámetros de ciclo como se describe por Gary Jones. Se recolectaron muestras fecales los días 0, 7, 14, 21, 29, 36 y 43 posteriores a la vacunación. Después del sacrificio de los hámsteres, también se verificó la mucosa de los intestinos por PCR.

Histopatolo ía: Las secciones de íleon y colon fueron fijadas en formalina, procesadas de manera habitual, teñidas con hematoxilina y eosina e impregnación de plata, y fueron evaluadas. Las secciones también se tiñieron con anticuerpo monoclonal específico para L. intracellularis .

Ganancia promedio en peso diario: Se determinó el peso de los hámsteres a los 21, 28, 35 y 42 días posteriores a la vacunación para determinar la ganancia de peso diaria promedio.

Resultados : Refiérase a la tabla abajo. t?iP50_ Los resultados de TCIDS0 indican que el grupo de vacuna (Grupo A) recibió 10*ßsTCID50/hámster. Los hámsteres en el grupo A y B fueron expuestos con la cepa N343 y recibieron 1055 de TCID50. Los hámsteres del grupo C expuestos con la cepa N101494 recibieron 102,7S TCID50/hámster.

PCR: La prueba de PCR demostró la presencia de L. intracellularis en 100% de los hámsteres vacunados cuando fueron sometidos a necropsia 21 días posteriores a la vacunación. Las pruebas 23 días posteriores a la vacunación demostraron que 100% de los hámsteres control y 50% de los hámsteres vacunados estaban infectados con L. intracellularis . Ninguno de los hámsteres expuestos con N101494 fue positivo. No se detectó derramamiento fecal durante al estudio en ninguno de los hámsteres.

Histopatolosía: Las cepas H & E no mostraron lesiones histológicas en todas las secciones de hámsteres sometidos a necropsia 21 días posteriores a la vacunación. En secciones recolectadas 43 días posteriores a la vacunación, 50% del grupo de vacuna presentaba enteritis linfocítica moderada a grave y 50% del grupo control presentaba enteritis linfocítica moderada. No se observaron lesiones en el grupo expuesto a N101494.

Las tinciones por FA no demostraron L. intracellularis en ninguno de los hámsteres 43 días posteriores a la vacunación.

Discusión: Se observó una reducción de 50% de infección en hámsteres vacunados con una cepa de pasaje alto de L. intracellularis, como se demuestra por PCR.

Fecal Fecal Fecal Fecal Fecal Fecal Fecal Mucosa Mucosa PCR PCR PCR PCR PCR PCR PCR PCR PCR Lesiones microscópicas ID DO d7 dl4 d21 d29 d36 d43 Día 21 Día 43 Tinción HE Plata FA A-l - - - - - - - NA + Enteritis ligera A-2 - - - - - - - NA A-3 - - - - - - - NA + Enteritis ligera A-4 - - - - - - - NA A-5 - - - - - - - NA A-6 - - - - - - - NA A-7 - - - - _ - - N NAA + Enteritis grave A-8 ~ ß — NA + Enteritis moderada A--9 - - - NA - - A--10 ~ — ~ NA — Enteritis ligera A--11 NA NA NA + NA - A-•12 NA NA NA + NA - A--13 NA NA NA + NA - A- 14 NA NA NA + NA - A- 15 NA NA NA + NA _ I I I I I I 1 I l i l i l í I I I W J ? 4-1 1 I W 4-) ? 4 W 4J I I I I I I I I I I I _ _ ¡Z¡ 53 _ _ á S £2_i £Z_ _2£i Z § g rt *t *t *t *t i i i 5 Z Z Z Z " i i I I I í $ * * t $ Z $ Z Z $ Z Z i i i I I I I I I l i l i l í t gt * gt * gt * gt g *t t gt g *t I I I I I I I I I I I 1 I l i l i l í Ejem lo 6 Experimento de eficacia de vacuna en cerdos Propósito: El objetivo de este estudio es evaluar la seguridad, colonización persistente y eficacia de un aislado atenuado avirulento aislado inactivado de L. intracellularis en cerdos de 2-3 semanas de edad. Se llevó a cabo un estudio en animales huésped en los cuales se vacunaron cerdos de 3 semanas de edad y después se expusieron a una exposición virulenta con L. intracellularis cepa N343 para comparar las diferencias en cuanto a protección entre las vacunas. étodos : El 11 de diciembre de 1995, se adquirieron un total de 45 cerdos, de 3 semanas de edad de H & K Farms. Se transportaron a Veterinary Resources, Inc., una instalación de investigación localizada cerca de Cambridge, Iowa, en donde fueron etiquetados para identificar individualmente a cada cerdo. Los cerdos se mantuvieron en esta instalación durante dos días antes del inicio del estudio para permitir la aclimatación a las instalaciones y se alimentaron con alimento libre de antibióticos durante el estudio. El 13 de diciembre, todos los cerdos fueron pesados, sangrados para recolectar suero, clasificados clínicamente y se recolectaron muestras rectales. Después se dividió de manera aleatoria a los cerdos en grupos de cinco y se colocaron en tinas. Se colocaron veinte cerdos en un cuarto separado y se designaron como grupos control y control estricto. Se colocaron 15 cerdos en un segundo cuarto para la vacuna ISi-1. Un tercer cuarto tiene 10 cerdos para ISi-2. Se preparó la vacuna viva en la instalación NOBL Laboratories Research and Development y se identificó con los números de serie ISi-1. Se aisló ISi-1 (cepa N343) de un cerdo, y se hizo crecer continuamente en cultivo puro durante 29 semanas. La vacuna se hizo crecer en células McCoys en matraces de agitación bajo oxígeno reducido hasta que se observó aproximadamente 100% de infección. Una muestra de la cepa N343 de pasaje alto utilizada para ISi-1 se hace pasar 11 semanas adicionales ("N343NP40wk") y se depositó bajo el Tratado de Budapest el 22 de mayo de 1996 en ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland E.U.A. 20852 y se le asignó el número de acceso 55783. Los cultivos fueron recolectados por centrifugación a 3000 x g durante 20 minutos. Los sedimentos se resuspendieron en solución de sacarosa-fosfato-glutamato (SPG) con 10% de FBS y se pasaron cuatro veces a través de una aguja, calibre 25. Los lisados fueron centrifugados a 500 x g durante 5 minutos para sedimentar los residuos y las esferas microcarrier. El sobrenadante se guardó y se almacenó a -70°C hasta aproximadamente 1 hora antes de la vacunación en la que se almacenaba hielo hasta su administración. La vacuna inactivada (ISi-2) se hizo crecer, se pasó durante 12.5 semanas y se recolectó de una manera similar a lo anterior y se purificó en un gradiente percol . Las bacterias purificadas después se almacenaron a -70°C hasta aproximadamente 1 semana antes de la vacunación en la cual se almacenaron a 4°C a niveles de oxígeno atmosférico normales lo que vuelve tóxico a L. intracellularis . Se agregó A10H a las bacterias hasta una mezcla final de 10% de AlOH. Se determinó la concentración de proteína utilizando el método Biurett.

Cuantificación de IS intracellularis : Se llevó a cabo la cuantificación de L. intracellularis viables por determinación del 50 por ciento de dosis infecciosa de cultivo de tejido (TCID50) . Se sembraron placas de microtitulación de 96 pozos con células McCoys a 1250 células/pozos y se hicieron crecer durante 18-24 h antes de la infección. Las muestras se diluyeron de manera seriada 1:10 en DMEM/5% de FBS que contiene vancomicina (100 µg/ml) y anfotericina B (2.0 µg/ml). Las diluciones se agregaron a placas de microtitulación de 96 pozos con 0.1 ml/pozo. Se utilizaron 12 pozos/dilución. Se incubó la placa durante 6 días a 37°C y concentraciones de gas de 8.0% 02, 8.8% C02 y 83.2% N2. Se fijaron las células con 50% de acetona y 50% de metanol fríos durante 2 minutos. A los pozos se les agregó 0.03 ml/pozo de anticuerpo monoclonal contra L . intracellularis (desarrollado por el doctor Steven McOrist) diluido 1:2000 en PBS. Se incubó la placa durante 30 minutos a 37°C y después se lavó tres veces con PBS. Se agregó conjugado contra inmunoglobulina G de ratón-fluorocromo (FITC) diluido 1:30 a 0.03 ml/pozo y se incubó durante 30 minutos durante a 37°C. La placa se lavó tres veces con ddH20 y se permitió que checara. Se observaron las muestras en un microscopio fluorescente y se determinó TCID50/ml utilizando el método de cálculo de Reed-Meunsch. Los resultados de TCIDS0 indican que ISi-1 tienen 1.8 x 10s bacterias/ml . Un cuarto inoculo fue placebo y se derivó de células de cultivo de tejido procesadas de la misma manera que las vacunas.

La vacuna inactivada se probó para un contenido de proteína total utilizando el método de Biurett y contenía 0.311 mg/ml. Los cerdos fueron vacunados el 12/13/95. Se proporcionó a todos la vacuna viva a una dosis de 2 ml IN con 1 ml/ventana de la nariz. La vacuna ISi-2 (inactivada) se proporciona IM con 1.5 ml/cerdo y nuevamente a los 14 días después. A todos los animales control se les administraron células no infectadas de la misma manera que las vacunas vivas .

Observación v muestras: Se recolectaron muestras fecales y suero a intervalos de 7 día durante el estudio. Las muestras fecales se procesaron para probar por PCR utilizando el conjunto de iniciadores, 5' -TATGGCTGTCAAACACTCCG-3' y ' -TGAAGGTATTGGTATTCTCC-3' para las amplificaciones de ADN.

Los parámetros de ciclo fueron 93°C durante 5 minutos, 55CC durante 45 segundos y 72 °C durante 45 segundos para el primer ciclo. Se llevaron a cabo 33 ciclos a las temperaturas mencionadas previamente durante 45 segundos por temperatura. El ciclo final fue de 93 °C durante 45 segundos, 55 °C durante 45 segundos y 72 °C durante 2 minutos, los iniciadores se definieron por Jones et al.

Exposición: A todos los animales, excepto a los controles estrictos, se les administró un cultivo de exposición 26 y 27 días posterior a la vacunación que consiste de cultivo de pasaje bajo de L. intracellularis cepas N343 y N72994 que crecieron entre 8 y 12 semanas de manera continua. Los cultivos se recolectaron por centrifugación a 3000 x g durante 20 minutos. Se resuspendieron los sedimentos en solución de sacarosa-fosfato-glutamato (SPG) con 10% de suero bovino fetal y se pasaron cuatro veces a través de una aguja calibre 25. Algunos cultivos recolectados se almacenaron a -70°C hasta el momento de la exposición mientras que otros se hicieron crecer hasta el día de la exposición y se recolectaron. Los inóculos de exposición se combinaron y se determinó la TCID50 de los cultivos. Las muestras se almacenaron en hielo hasta su administración. El cultivo de exposición proporcionado el 1/8/96 consiste de 4 x 104 bacterias/ml y el cultivo de exposición proporcionado el 1/9/96 tenía 3 x 10* bacterias/ml. Se proporcionó a los cerdos 15 ml de material de exposición ambos días por medio de lavado gástrico. Por lo tanto, los animales recibieron 6 x 10s bacterias/cerdo y 4.7 x 10S bacterias/cerdo los días 1/8/96 y 1/9/96 respectivamente.

Resultados: Seguridad: Resultados de PCR fecal: La detección de L. intracellularis utilizando PCR demostró que los cerdos no diseminaban las bacterias al principio del estudio. A los siete días posteriores a la vacunación todos los cerdos daban resultado negativo. A los 14 días posteriores a la vacunación 3 cerdos en el grupo ISi-1 fueron positivos. Dos animales fueron positivos en el grupo ISi-1 21 días posteriores a la vacunación y todos los demás cerdos dieron un resultado negativo. Al día 26 posterior a la vacunación los animales no diseminaban en la bacteria según la detección por PCR. A los 26 días posteriores a la vacunación, 5 cerdos de los grupos ISi-1 y los controles y 4 cerdos del grupo ISi-2 fueron sometidos a necropsia. Se recolectaron muestras de íleon, colon, nodulos linfáticos mesentéricos y amígdalas, así como muestras de cultivo para cerdos con lesiones sospechosas de neumonía. Se llevó a cabo la prueba de PCR en muestras individuales de íleon y pulmón. Se acumularon las muestras de amígdalas, colon y nodulos linfáticos por grupos de tratamiento y se realizaron PCR. Los resultados de la prueba de PCR se muestran a continuación.

PCR de íleon Nodulo 2S días Doste- linfático ripjres a a Colon esentérico Pulmón QrµVQ vacunación acumulado acumuladas acumulado Acumulado ISi-1 1 de 5 + - - 1 de 1 ISi-2 0 de 4 - - - 0 de 1 Controles 0 de 5 - - sin prueba Controles sin sin sin sin sin prueba estrictos prueba prueba prueba prueba Se tiñeron secciones histológicas del íleon utilizando anticuerpo monoclonal específico para L. intracellularis como el anticuerpo primario y el conjugado de anti-inmunoglobulina G de ratón-fluorocromo como el anticuerpo secundario. Se observó L. intracellularis en 3 de los 5 cerdos con ISi-l. Todos los demás cerdos fueron negativos por tinción de anticuerpos fluorescentes . Los cerdos restantes fueron sometidos a necropsia 21 días después de la exposición y las mismas muestras se recolectaron para evaluación. Los resultados de PCR se listan abajo.

PCR de íleon Nfflylg 26 días poste- linfgfrigP riores a la Colon Amígdalas l?egentérico Pµlt?fn Grupo exposición acumulado acumuladas acumulado Acumµlado ISi-l 0 de 10 + ISi-2 0 de 6 Controles 4 de 10 - Controles 0 de 5 estrictos Se llevaron a cabo tinciones FA de los cortes de íleon como se establecen en lo anterior con 7 de los 10 animales con resultados positivo en el grupo control . Todos los demás animales fueron negativos para la presencia de L. intracellularis . Se realizaron pruebas en suero para determinar la producción de anticuerpo IgG por los cerdos después de la exposición a L. intracellularis. La prueba se lleva a cabo al sembrar cultivo de tejido tratado en placas Terasaki con células McCoys a una concentración de 125 células/pozo y se hacen crecer 18-24 h antes de la infección. Se diluye un cultivo puro de L. intracellularie a 1000-3000 bacterias/ml en DMEM con 5% de suero bovino fetal y después se agrega a los pozos con 0.01 ml/pozo. La placa se incuba durante 6 días a concentraciones de gas de 8.0% 02, 8.8% C02 y 83.2% N2. Las células se fijan con 50% de acetona y 50% de metanol fríos durante 2 minutos. Los sueros de los cerdos se diluyen 1:75 en PBS estéril. Se agrega suero diluido a los pozos, a 0.01 ml/pozo.

Posteriormente se incuban las placas durante 30-60 minutos a 37°C. Se lavan las placas cinco veces con PBS estéril. Se agrega a los pozos 0.01 ml/pozo de conjugado contra inmunoglobulina IgG, G de cerdo-fluorocromo. La placa se incuba durante 30 minutos a 37°C. Las placas se lavan cinco veces con ddH20 y se permite que seque. Se lavan las muestras cinco veces con ddH20 y se permite que sequen. Se observan las muestras en un microscopio fluorescente y los pozos sobre los cuales se observan las bacterias se marcan positivos, en los pozos en los cuales no se observan bacterias se marcan como negativos.

Resultados 47 días posterior a la vacunación Grupo Oía 0 2? día$ pgteripr 21 dias posteriores a la vacunación a la exposición ISi-l 0 de 15 6 de 15 8 de 10 ISi-2 0 de 10 3 de 10 5 de 6 Controles 1 de 15 0 de 15 9 de 10 Controles 0 de 5 0 de 5 0 de 5 estrictos Los animales que fueron positivos en el día 0 fueron probados nuevamente a intervalos semanales. Los resultados demuestran que todos se vuelven serológicamente negativos a los 14 días posteriores a la vacunación. Esto no es inesperado puesto que la edad de los cerdos en el día 0 es de tres semanas y los resultados positivos a esa edad pueden ser debidos a anticuerpos maternos. Los sueros se probaron junto con un suero control positivo obtenido por hiperinmunización de un cerdo con L. intracellularis que creció en cultivo puro. El suero de control negativo utilizado se recolectó de un cerdo gnotobiótico en South Dakota State University. La descripción anterior y los ejemplos únicamente son ilustrativos de las modalidades preferidas las cuales alcanzan los objetivos, características y ventajas de la presente invención, y no se considera que la presente invención esté limitada por los mismos. . Cualquier modificación de la presente invención la cual se encuentre dentro del espíritu y alcance de las siguientes reivindicaciones se considera como parte de la presente invención. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:

Claims (22)

RBIVI DICACIO ES

1. Un método para cultivar bacterias L. intracellularis, caracterizado porque comprende las etapas de incubar las bacterias a una concentración de oxígeno menor de aproximadamente 18%, y mantener las bacterias en suspensión para cultivar las bacterias.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las bacterias están en células de cultivo las cuales se mantienen en suspensión.

3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque comprende la etapa adicional de hacer pasar una porción de las células a células frescas para incrementar la producción de bacterias L. intracellularis.

4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque comprende la etapa adicional de recolectar por lo menos una porción de las células .

5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se obtienen bacterias L. intracellularis de un animal infectado con L. intracellularis.

6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el animal es un cerdo .

7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la incubación se lleva a cabo a una concentración de oxígeno en el intervalo desde aproximadamente 0% hasta aproximadamente 8% .

8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la incubación se lleva a cabo a una concentración de oxígeno en el intervalo desde aproximadamente 0% hasta aproximadamente 3%.

9. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque las células de cultivo se seleccionan del grupo que consiste de células HEp-2, McCoys e IEC-18.

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque las células McCoys e IEC-18 se incuban en microportadores.

ll. Las bacterias L . intracell ularis caracterizadas porque crecen de acuerdo con el método de conformidad con la reivindicación 1.

12. Un método para cultivar bacterias L. intracellularis, caracterizado porque comprende las etapas de: (i) inocular células de cultivo con un inoculo que comprende bacterias L. intracellularis de manera que infecten a las células con las bacterias; y (ii) incubar las células infectadas a una temperatura desde aproximadamente 36 °C hasta aproximadamente 38°C en una concentración de oxígeno desde aproximadamente 0% hasta aproximadamente 8% mientras se agitan las células infectadas de manera que se cultive L. intracellularis mientras se mantienen las células infectadas en suspensión.

13. Un método para producir una cepa atenuada de L. intracellularis, caracterizado porque comprende obtener células de cultivo infectadas con bacterias L. intracellularis, incubar las células infectadas a una concentración de oxígeno desde aproximadamente 0% hasta aproximadamente 18%, agitar las células infectadas de manera que se cultiven las bacterias mientras se mantienen las células infectadas en suspensión, someter a pasaje por lo menos una porción de las bacterias cultivadas, recolectar por lo menos una porción de las bacterias cultivadas y seleccionar una cepa atenuada para proporcionar bacterias L. intracellularis atenuadas.

14. Una prueba de diagnóstico para detectar la presencia de anticuerpos que reaccionen específicamente con L. intracellularis en una muestra biológica utilizando las bacterias L. intracellularis producidas de acuerdo con el método de conformidad con la reivindicación 1 o un componente de la bacteria.

15. Un método para determinar la presencia de anticuerpos que reaccionan específicamente con bacterias L. intracellularis en una muestra biológica, caracterizado porque comprende las etapas de obtener células de cultivo infectadas con bacterias L. intracellularis, incubar las células infectadas a una concentración de oxígeno desde aproximadamente 0% hasta aproximadamente 18%, agitar las células infectadas de manera que se cultive L. intracellularis y al mismo tiempo se mantienen las células infectadas en suspensión, recolectar por lo menos una porción de las bacterias L. intracellularis cultivadas, obtener una muestra biológica de un animal, poner en contacto la muestra con bacterias L. intracellularis recolectadas o un componente derivado del mismo bajo condiciones por las cuales el anticuerpo presente en la muestra biológica reacciona con L. intracellularis o con el componente, y determinar si se ha llevado a cabo una reacción de anticuerpo-antígeno, para de esta manera determinar la presencia de anticuerpo contra L. intracellularis en la muestra.

16. Una vacuna para inducir en un animal una respuesta inmune contra bacterias L. intracellularis, caracterizada porque comprende una cepa atenuada de L. intracellularis en un portador farmacéuticamente aceptable, en el que la cepa atenuada está en una cantidad efectiva para producir una respuesta inmune.

17. La vacuna de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque la cepa atenuada se produce de conformidad con la reivindicación 13.

18. Una vacuna para inducir una respuesta inmune en un animal contra bacterias L. intracellularis, caracterizada porque comprende bacterias L. intracellularis inactivadas o destruidas en un portador farmacéuticamente aceptable, en el que la bacteria se produce de acuerdo con el método de conformidad con la reivindicación 1 y es una cantidad efectiva para producir una respuesta inmune.

19. La vacuna de conformidad con la reivindicación 16 a 18, caracterizada porque L. intracellularis que infecta a las células de cultivo se prepara a partir de un homogeneizado intestinal de un animal infectado con L. intracellularis .

20. La vacuna de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque la cepa atenuada es la cepa N343NP40wk.

21. Un método para inducir una respuesta inmune en un animal contra bacterias L. intracellularis, caracterizado porque comprende administrar una cantidad inmunológicamente efectiva de vacuna de conformidad con las reivindicaciones 16 ó 18 al animal .

22. Una cepa atenuada caracterizada porque se produce de acuerdo con el método de conformidad con la reivindicación 13.