MXPA97009455A

MXPA97009455A - Polinucleotidos de adenosina-cinasa

Info

Publication number: MXPA97009455A
Application number: MXPA/A/1997/009455A
Authority: MX
Inventors: D Cowart Marion; Kerwin Jamesf; N Halbert Donald; Mcnally Teresa
Original assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1997-12-03
Publication date: 1998-02-01

Abstract

La presente invención provee un polinucleótido aislado y purificado que codifica adenosina-cinasa de mamífero, y a un polinucleótido de adenosina-cinasa aislada y purificada. También se proveen adenosina-cinasa recombinante humana y métodos para utilizar polipéptidos de adenosina-cinasa. También se proveen métodos para hacer adenosina-cinasa recombinante utilizando aquellos polinucleótidos y células huésped transformadas con aquellos polinucleótidos.

Description

POLINUCLEOTIDOS DE ADENOSINA-CINASA REFERENCIA CRUZADA A LAS SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud está relacionada con las siguientes solicitudes, las cuales se incorporan aquí por referencia: Solicitud de Patente de E. U .A. Serie No. (no asignado), intitulada "Adenosine Kinase Polypeptides" (Polipéptídos de Adenosina-cinasa) por Cowart, Halbert, Kerwin y McNally, No. de Apoderado 5749. US. D1 y Solicitud de Patente de E. U.A. Serie No. (no asignado), intitulada "Heterocyclic Substituted Cyclopentane Compounds" (Compuestos de Ciclopentano Substituidos Heterocíclícos) por Cowart y Bhagwat, No. de Apoderado 5748. US.01 .

CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN El campo de esta invención es adenosina-cinasa. Más particularmente, el campo de la presente invención es adenosina-cinasa de mam ífero recombinante, polinucléotidos que codifican la adenosina-cinasa, y métodos para hacer adenosina-cinasa recombinante.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La adenosina-cinasa (5'-fosfotransferasa de ATP: adenosina, EC 2.7.1.20) es una enzima ubiquitosa, la cual cataliza la fosforilación de adenosina a AMP, utilizando ATP, preferencialmente, como la fuente de fosfato. El magnesio también es requerido para la reacción , y el co-substrato verdadero es probablemente el complejo MgATP2 (Palella y otros, J. Biol. Chem. 1980, 255: 5264-5269). La adenosina-cinasa tiene una amplia distribución de tejido y especies, y ha sido aislado de levadura (Leibach y otros, Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. , 1971 , 532 : 328-344) , una variedad de fuentes de mamífero (por ejemplo, Miller y otros, J. Biol. Chem. 1979 , 254: 2339-2345; Palella y otros, J. Biol. Chem. 1980, 255: 5264-5269; Yamada y otros, Comp. Biochem. Physiol. , 1982 , 71 B: 367-372; Rottlan y Miras-Portugal, Eur. J. Biochem. , 1985, 151 : 365-371 ) y ciertos microorganismos (por ejemplo, Lobelle-Rich y Reeves , Am. J. Trp. Med. Hyg. , 1983, 32 : 976-979; Datta y otros, J. Biol. Chem. 1987, 262:5515-5521 ) . Se ha encontrado que está presente virtualmente en cada tejido humano analizado incluyendo riñon , hígado, cerebro, placenta y páncreas (Andrés y Fox, J. Biol. Chem. , 1979, 254: 1 1388- 1 1393) . La adenosina-cinasa es una enzima clave en el control de concentraciones celulares de adenosina (Arch y Newsholme, Essays Biochem. , 1978, 14: 82-123) . La adenosina es un nucleósido de purina que es un intermediario en las trayectorias de degradación y salvamento del nucleótido de purina . Además, la adenosina tiene muchos efectos fisiológicos importantes, muchos de los cuales son mediados a través de la activación de receptores ectocelulares específicos, denominados receptores Pi (Burnstock, en Cell Membrane Receptors for Drugs and Hormones, 1978, (Boils and Straub, ed .) Raven, Nueva York, pág. 107-1 18; Fredholm y otros, Pharmacol. Rev. 1994, 46: 143-156). En el sistema nervioso central, la adenosina inhibe la liberación de ciertos neurotransmisores (Crradetti y otros, Eur. J. Pharmacol. 1984, 104: 19-26), estabiliza las funciones potenciales de la membrana (Rudolphi y otros , Cerebrovasc. Brain Metab. Rev. 1992 , 4: 346-360), como un anticonvulsivo endógeno (Dragunow, Trends Pharmacol. Sci 1986, 7: 128-130) y puede tener el papel de un agente neuroprotector endógeno (Rudolphi y otros, Trends Pharmacol. Sci. 1992, 13: 349-445) . La adenosina también ha sido implicada en la modulación de la transmisión en las trayectorias de dolor en la médula espinal (Sawynok y otros, Br. J. Pharmacol. 1986, 88: 923-930), y en la mediación de efectos analgésicos de morfina (Sweeney y otros, J. Pharmacol. Exp. Ther. 1987, 243: 657-665) . En el sistema inmune , la adenosina inhibe ciertas funciones neutrófilas y exhibe efectos antiinflamatorios (Cronstein, J. Appl. Physiol. 1994, 76: 5- 13) . La adenosina también ejerce una variedad de efectos en el sistema cardiovascular, incluyendo vasodilatación , daño de conducción atrioventricular y cardioprotección endógena en isquemia al miocardio y reperfusión (Mullane y Williams, en Adenosine and Adenosine Receptors 1990 (Williams, ed .) H umana Press, New Jersey, pág . 289-334) . Las amplias acciones de la adenosina también incluyen efectos en los sistemas renal, respiratorio , gastrointestinal y reproductor, así como en los glóbulos rojos u adipocitos. La liberación de adenosina endógena parece tener el papel de un mecanismo de defensa natural en varias condiciones patofisiológicas, incluyendo isquemia cerebral y al miocardio, ataques, inflamación y sepsis. Ya que la adenosina está normalmente presente a bajos niveles en el espacio extracelular, su liberación está localmente mejorada en el sitio(s) de actividad celular excesiva, trauma o tensión metabólica. Una vez en el espacio extracelular, la adenosina activa a los receptores extracelulares específicos para producir una variedad de respuestas, las cuales tienden a restaurar la función celular hacia lo normal (Bruns, Nucleosides, Nucleotides, 1991 , 10: 931 -943; Miller y Hsu , J. Nuerotruma, 1992 , 9: S563-S577). La adenosina tiene una vida media medida en segundos en fluidos extracelulares (Moser y otros, Am. J. Physiol. 1989 , 25: C799-C809) , y sus acciones endógenas son , por lo tanto, altamente localizadas. La inhibición de adenosina-cinasa puede dar como resultado el aumento de las concentraciones de adenosina local en el sitio del daño del tejido, incrementando además la citoprotección . Este efecto es probablemente en más pronunciado en los sitios de tejidos en donde el trauma da como resultado una producción incrementada de adenosina, reduciendo así al mínimo las toxicidades sistémicas . Los compuestos farmacológicos dirigidos hacia la inhibición de adenosina-cinasa proveen nuevas terapias efectivas y potencial para trastornos beneficiados por la potenciación de adenosina específica en el sitio y en el caso. La adenosina-cinasa también es responsable de la activación de muchos nucleósidos farmacológicamente activos (Miller y otros, J. Biol. Chem. 1979, 254: 2339-2345), incluyendo tubercidin , formacin, ribavirin , pirazofurin, y 6-(metilmercapto)purina ribosida. Estos análogos de nucleósido de purina representan un importante grupo de antimetabolitos, los cuales poseen propiedades citotóxicas, contra cáncer y antivirales. Sirven como substratos para adenosina-cinasa y son fosforilados por la enzima para generar la forma activa. La pérdida de la actividad de adenosina-cinasa ha sido implicada como un mecanismo de resistencia celular a los efectos farmacológicos de estos análogos de nucleósido (por ejemplo, Benner y otros, Mol. Pharmacol. , 1966, 2: 432-443 ; Caldwell y otros, Can. J. Biochem. , 1967, 45: 735-744; Suttie y otros, Eurp. J. Cáncer, 1981 , 17: 43-51 ) . Los niveles celulares reducidos de adenosina-cinasa también han sido asociados con la resistencia a los efectos tóxicos de 2'-desoxiadenosina (Hershfield y Kredich , Proc. Nati. Acad. Sci, EUA , 1980, 77: 4292-4296) . La acumulación de trifosfao de desoxiadenosina (dATP), derivado de la fosforilación de 2'-desoxiadenosina, ha sido sugerida como un mecanismo tóxico en el defecto inmune asociado con la deficiencia de adenosina-desaminasa heredable (Kredich y Hershfield en The Metabolic Basis of Inherited Diseases, 1989 (Scriver y otros , eds. ) , McGraw-H ill , Nueva York, pág . 1045- 1075) .

En ciertos trastornos, también se han observado alteraciones en la actividad de adenosina-cinasa celular. Se encontró que la actividad de adenosina-cinasa se reduce, relativa a un hígado normal, en una variedad de hepatomas de rata, con actividad de enzima dando una correlación negativa con un régimen de crecimiento de tumor (Jackson y otros, Br, J. Cáncer, 1978, 37: 701 -713). La actividad de la adenosina-cinasa también se disminuyó en la regeneración del hígado después de la hepatectomía parcial en animales experimentales (Jackson y otros, Br. J. Cáncer, 1978, 701 -713) . Se encontró que la actividad de adenosina-cinasa de eritrocito se disminuye en pacientes con gota (Nishizawa y otros, Clin. Chem. Acta 1976, 67: 15-20). La actividad de adenosina-cinasa de linfocito se redujo en pacientes infectados con el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) exhibiendo síntomas de SI DA, y aumentó en sujetos con alto riesgo de ser VI H-seropositivos asintomáticos y VI H-seropositivos , comparado con controles normales (Renouf y otros , Clin. Chem. 1989, 35: 1478- 1481 ) . Se ha sugerido que la medición de la actividad de adenosina-cinasa puede probar se útil para verificar el progreso clínico de pacientes con infección por VI H (Renouf y otros , Clin. Chem. 1989 , 35: 1478- 1481 ) .

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN En un aspecto, la presente invención provee un polinucleótido aislado y purificado que comprende la secuencia de nucleótido que consiste esencialmente de una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de, (a) la secuencia de SEC I D NO: 1 de aproximadamente la posición 16 de nucleótido a aproximadamente la posición 1098 de nucleótido, la secuencia SEC I D NO:4 de aproximadamente la posición 94 de nucleótido a aproximadamente la posición 1128 de nucleótido, o la secuencia de SEC ID NO:7 de aproximadamente la posición 51 de nucleótido a aproximadamente la posición 1 136 de nucleótido; (b) secuencias que son complementarias a las secuencias de (a) , y (c) secuencias que, cuando se expresan, codifican un polipéptido codificado a través de una secuencia de (a). Un polinucleótido preferido es una molécula de ADN . En otra modalidad, el polinucleótido es una molécula de ARN . Un polínucleótido preferido es SEC I D NO: 1 , 4 o 7. En otra modalidad, una molécula de ADN de la presente invención , está contenida en un vector de expresión . El vector de expresión preferiblemente además comprende un mejorador-promotor operativamente enlazado al polinucleótido . En una modalidad especialmente preferida , la molécula de ADN tiene la secuencia de nucleótido de SEC I D NO: 1 de aproximadamente la posición 16 de nucleótido a aproximadamente la posición 1098 de nucleótido, la secuencia de SEC ID NO: 4 de aproximadamente la posición 94 de nucleótido a aproximadamente la posición 1 128 de nucleótido, o la secuencia de SEC I D NO: 7 de aproximadamente la posición 51 de nucleótido a aproximadamente la posición 1 136 de nulcéotido. En otro aspecto, la presente invención provee un oligonucleótido de aproximadamente 15 a aproximadamente 50 nucleótidos conteniendo una secuencia de nucleótido de por lo menos 15 nucleótidos que es idéntica o complementaria a una secuencia análoga de un polinucleótido de esta invención. Un oligonucleótido preferido es un oligonucleótido antisentido que es complementario a una porción del polinucleótido de SEC ID NO: 1 , 4 o 7. La presente invención también provee una composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido antisentido de esta invención y un diluyente fisiológicamente aceptable. En otro aspecto , la presente invención provee una adenosina-cinasa de origen mamífero. En una modalidad , que la adenosina-cinasa es un polipéptido aislado y purificado de aproximadamente 365 o menos residuos de aminoácido y que comprende la secuencia de residuo de aminoácido de por lo menos una de: a) de la posición de residuo 7 a la posición de residuo 18 de SEC ID NO:8; b) de la posición de residuo 26 a la posición de residuo 86 de SEC I D NO: 8; c) de la posición de residuo 100 a la posición de residuo 1 17 de SEC I D NO: 8; d) de la posición de residuo 122 a la posición de residuo 146 de SEC I D NO: 8 ; e) de la posición de residuo 153 a la posición de residuo 170 de SEC I D NO: 8; f) de la posición de residuo 172 a la posición de residuo 181 de SEC ID NO:8; g) de la posición de residuo 183 a la posición de residuo 200 de SEC I D NO:8; h) de la posición de residuo 210 a la posición de residuo 222 de SEC ID NO:8; i) de la posición de residuo 230 a la posición de residuo 262 de SEC I D NO:8; j) de la posición de residuo 279 a la posición de residuo 289 de SEC ID NO:8; k) de la posición de residuo 31 1 a la posición de residuo 329 de SEC ID NO:8; I) de la posición de residuo 331 a la posición de residuo 345 de SEC I D NO:8; y m) de la posición de residuo 347 a la posición de residuo 359 de SEC I D NO: 8. Preferiblemente, una adenosina-cinasa de la presente invención tiene la secuencia de residuo de aminoácido de SEC I D NO:2, 5 o 8. Muy preferiblemente, una adenosina-cinasa de la presente invención es una adenosina-cinasa h umana recombinante. Una adenosina-cinasa humana preferida tiene aproximadamente 365 o menos residuos de aminoácido y comprende la secuencia de residuo de aminoácido 5 al residuo 345 de SEC ID NO: 5. En otro aspecto, la presente invención provee dos formas de adenosina-cinasa humana designada como forma corta humana (S EC I D NO: 5) y forma larga humana (SEC I D NO:8). En otro aspecto, la presente invención provee un procedimiento para hacer adenosina-cinasa que comprende transformar una célula huésped con un vector de expresión que comprende un polinucleótido de la presente invención , mantener la célula transformada durante un período suficiente para la expresión de la adenosina-cinasa y recuperar la adenosina-cinasa. Preferiblemente, la célula huésped es una célula huésped eucariótica tal como una célula de mamífero, o una célula bacteriana. Una célula huésped especial mente preferida es una E. coli. La presente invención también provee una adenosina-cinasa hecha a través del procedimiento de esta invención . Una adenosina-cinasa preferida es una adenosina-cinasa humana recombinante. La presente invención además provee una célula huésped transformada con un polinucleótido o vector de expresión de esta invención . Preferiblemente, la célula huésped es una célula bacteriana tal como E. coli.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS En los dibujos, los cuales forman una porción de la especificación: La Figura 1 muestra un dibujo esquemático de los clones utilizados para aislar y secuenciar adenosina-cinasa de cerebro de rata.

Las Figuras 2a y 2b muestran un clon de longitud completa de la adenosina-cinasa de cerebro de rata con una secuencia de residuo de aminoácido deducida. Las Figuras 3a y 3b muestran un clon de adenosina-cinasa de forma corta de placenta humana con una secuencia de residuo de aminoácido deducida. Las Figuras 4a y 4b muestran un clon de adenosina-cinasa de forma larga de placenta humana con una secuencia de residuo de aminoácido deducida. La Figura 5 muestra una comparación de las secuencias de residuos de aminoácido de la adenosina-cinasa de placenta humana de forma corta, adenosina-cinasa de placenta humana de forma larga y adenosina-cinasa de cerebro de rata. La Figura 6 muestra varios fragmentos de péptido y secuencias de oligonucleótido utilizados en el aislamiento y purificación de ADN de adenosina-cinasa y polipéptido. La Figura 7 muestra la actividad específica de adenosina-cinasa de dos clones independientes de E. coli transformado. La Figura 8 muestra la secuencia de residuo de aminoácido de un clon parcial de adenosina-cinasa de cerebro de rata.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN I. LA INVENCIÓN La presente invención provee polinucleótidos aislados y purificados que codifican adenosina-cinasa de origen mamífero, vectores de expresión que contienen aquellos polinucleótidos, células huésped transformadas con aquellos vectores de expresión, un procedimiento para hacer adenosina-cinasa utilizando aquellos polinucleótidos y vectores, y adenosina-cinasa aislada y purificada.

II. POLINUCLEOTIDOS DE ADENOSINA-CINASA En un aspecto, la presente invención provee un polinucleótido aislado y purificado que codifica un polipéptido de adenosina-cinasa de origen de mamífero. Un polinucleótido de la presente invención que codifica adenosina-cinasa es un polinucleótido aislado y purificado que comprende una secuencia de nucleótido que consiste esencialmente de una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de, (a) la secuencia de SEC I D NO: 1 de aproximadamente la posición 16 de nucleótido a aproximadamente la posición 1098 de nucleótido, la secuencia SEC I D NO:4 de aproximadamente la posición 94 de nucleótido a aproximadamente la posición 1 128 de nucleótido, o la secuencia de SEC I D NO:7 de aproximadamente la posición 51 de nucleótido a aproximadamente la posición 1 136 de nucleótido; (b) secuencias que son complementarias a las secuencias de (a) , y (c) secuencias que, cuando se expresan , codifican un polipéptido codificado a través de una secuencia de (a) . U n polinucleótido preferido es una molécula de ADN . En otra modalidad , el polinucleótido es una molécula de ARN .

Las secuencias de nucleótido y secuencias de residuo de aminoácido deducidas de adenosina-cinasa de rata y humana se establecen en las Figuras 2a, 2b, 3a, 3b, 4a, y 4b. La secuencia de nucleótido de SEC I D NO: 1 en las Figuras 2a y 2b es un clon de ADN de longitud completa de adenosina-cinasa de cerebro de rata. SEC ID NO:2 en las Figuras 2a y 2b es la secuencia de residuo de aminoácido deducida de aquel clon. SEC I D NO: 3 es una cadena de ADN complementaria a SEC ID NO: 1 . La secuencia de nucleótido de SEC ID NO:4 en las Figuras 3a y 3b es un clon de ADN de adenosina-cinasa de forma corta humana . SEC I D NO: 5 en las Figuras 3a y 3b es la secuencia de residuo de aminoácido deducida de aquella de ADN . SEC I D NO:6 en las Figuras 3a y 3b es la cadena complementaria a SEC ID NO:4. La secuencia de nucleótido de SEC ID NO: 7 en las Figuras 4a y 4b es un clon de ADN de adenosina-cinasa de forma larga humana. SEC ID NO:8 en las Figuras 4a y 4b es la secuencia de residuo de aminoácido deducida de aquella de ADN . SEC I D NO:9 en las Figuras 4a y 4b es la cadena complementaria a SEC ID NO:7. La presente invención también contempla secuencias de ADN , las cuales se hibridizan bajo condiciones de hibridación severas a las secuencias de ADN establecidas anteriormente. Las condiciones de hibridación severas son bien conocidas en la técnica y definen un grado de identidad de secuencia mayor que aproximadamente 70%-80% . La presente invención también contempla variaciones alélicas de existencia natural y mutaciones e las secuencias de ADN establecidas anteriormente, siempre que aquellas variaciones y mutaciones codifiquen, bajo expresión, para una adenosina-cinasa de esta invención como se estableció anteriormente. Como ya se estableció, SEC ID NOs: 1, 4 y 7 son clones de ADNc de longitud completa de adenosina-cinasa de roedores y humanos. Como es bien conocido en la técnica, debido a la degeneración del código genético, existen numerosas otras moléculas de ADN y de ARN que pueden codificar para los mismos polipéptidos como aquellos codificados por SEC ID NOs: 1, 4 y 7. La presente invención, por lo tanto, contempla aquellas otras moléculas de ADN y ARN las cuales, después de expresión, codifican para el polipéptido codificado por SEC ID NO: 1, 4 o 7. Habiendo identificado la secuencia de residuo de aminoácido de adenosina-cinasa, y con conocimiento de todos los codones de triplete para cada residuo de aminoácido particular, es posible describir todas estas secuencias de ADN y ARN de codificación. Las moléculas de ADN y ARN distintas a aquellas específicamente descritas en la presente y, las cuales se caracterizan simplemente por un cambio en un codon para un aminoácido particular están dentro del alcance de esta invención. A continuación, en el Cuadro 1, se presenta un cuadro de codones que representan los aminoácidos particulares.

CUADRO 1 Primera Tercera Posici ion Según da Posición posición (Extremo 5') (Extremo 3') T/U C A G Phe Ser Tyr Cys T/U Phe Ser Tyr Cys C T/U Leu Ser Detener Detener A Leu Ser Detener Trp G Leu Pro H is Arg T/U Leu Pro His Arg C C Leu Pro Gln Arg A Leu Pro Gln Arg G Me Th r Asn Ser T/U l ie Thr Asn Ser C A Me Th r Lys Arg A Met Thr Lys Arg G Val Ala Asp G ly T/U Val Ala Asp Gly C G Val Ala Glu Gly A Val Ala Gl u Gly G Un cambio simple en un codon para el mismo residuo de aminoácido dentro el polinucleótido no cambiará la estructura del polipéptido codificado. A manera de ejemplo, se puede ver a partir de SEC I D NO:4 (ver Figuras 3a y 3b) que un codon de TCA para serina existe en las posiciones de nucleótido 100- 102 y otra vez en 298-300. También se puede ver a partir de la misma secuencia, sin embargo, que serina puede ser codificada por un codon de TCT (ver, por ejemplo, posiciones de nucleótido 1015- 1017) La substitución del último codon de TCT para serina con el codon de TCA para serina, o vice versa, no altera substancialmente la secuencia de ADN de SEC I D NO:4 y da como resultado la expresión del mismo polipéptido. En una forma similar, se pueden hacer substituciones de codones para otros residuos de aminoácidos en una forma similar sin apartarse del verdadero alcance de la presente invención. Un polinucleótido de la presente invención también puede ser una molécula de ARN . Una molécula de ARN contemplada por la presente invención es complementaria a o se hibridiza bajo condiciones severas a cualquiera de las secuencias de ADN establecidas anteriormente. Como es bien conocido en la técnica , dicha molécula de ARN se caracteriza por la base de uracilo en lugar de timidina. Las moléculas de ARN ilustrativas y preferidas con las moléculas de ARN m que codifican una adenosina-cinasa de esta invención . La presente invención también contempla oligonucleótidos con una longitud de aproximadamente 15 a aproximadamente 50 nucleótidos, tales nucleótidos sirven como iniciadores y sondas de hibridación para la clasificación de colecciones de ADN y la identificación de moléculas de ADN o ARN que codifican la adenosina-cinasa . Dichos iniciadores y sondas se caracterizan porque ellos hibridizarán a secuencias de polinucleótido que codifican adenosina-cinasa . Una sonda o iniciador de oligonucleótido contiene una secuencia de nucleótido de por lo menos 15 nucleótidos que es idéntica a o complementaria a una secuencia contigua de un polinucleótido de adenosina-ci nasa de la presente invención . De esta manera, cuando una sonda de oligonucleótido tiene una longitud de 25 nucleótidos, por lo menos 15 de aquellos nucleótidos son idénticos o complementarios a una secuencia de nucleótidos contigua de un polinucleótido de adenosina-cinasa de la presente invención. Los polinucleótidos de adenosina-cinasa ilustrativos de la presente invención son como se establecieron anteriormente. Un oligonucleótido preferido es un oligonucleótido antisentido. La presente invención provee un oligonucleótido antisentido sintético de menos de aproximadamente 50 nucleótidos, de preferencia de menos de aproximadamente 35 nucleótidos, muy preferiblemente de menos de alrededor de 25 nucleótidos, y de preferencia de menos de aproximadamente 20 nucleótidos. Un oligonucleótido antisentido de la presente invención está dirigido contra una molécula de ADN o ARN que codifica adenosina-cinasa. Preferiblemente, el oligonucleótido antisentido está dirigido contra el sitio de iniciación de translación de proteína o el sitio de partida transcripcional . De acuerdo con esta modalidad preferida, una molécula antisentido es dirigida contra una región de SEC I D NO: 1 de aproximadamente la posición 1 de nucleótido a aproximadamente la posición 40 de nucleótido; una porción de SEC I D NO:4 de aproximadamente la posición 80 de nucleótido a aproximadamente la posición 120 de nucleótido y una porción de SEC I D NO: 7 de aproximadamente la posición 35 de nucleótido a aproximadamente la posición 75 de nucleótido. Es entendido por algún experto en la técnica que el oligonucleótido antisentido puede ser dirigido ya sea contra una secuencia de ADN o una de ARN que codifica a un objetivo específico. De esta manera, un oligonucleótido antisentido de la presente invención también puede ser dirigido contra polinucleótidos que son complementarios a aquellos mostrados en SEC ID NOs: 1 , 4 y 7 (es decir, SEC ID NOs: 3, 6 y 9) así como las moléculas de ARN equivalentes. Preferiblemente, los nucleótidos de un oligonucleótido antisentido son enlazados a través de enlaces de pseudofosfato que son resistentes a la escisión a través de enzimas de exonucleasa o endonucleasa. Preferiblemente, los enlaces de pseudofosfato son enlaces de fósforotiotato. Reemplazando un enlace de fosfodiéster con uno que sea resistente a la acción de exo- y/o endonucleasa, se incrementa la estabilidad ácido nucleico en presencia de aquellas enzimas. Como se utiliza en la presente, los enlaces de pseudofosfato incluyen, pero no se limitan a, enlaces de metilfosfonato, fosfomorfolidato, fósforotioato, fósforoditioato y fósforoselenoato. U n iniciador o sonda de oligonucleótido, así como un oligonucleótido antisentido de la presente invención puede ser preparado utilizando procedimientos normales bien conocidos en la técnica . Un método preferido de síntesis de polinucleótido es a través de química de fosforoamidita de cianoetilo. Una descripción detallada de la preparación , aislamiento y purificación de polinucleótidos que codifican adenosina-cinasa de mam ífero se establece a continuación.

A. Adenosina-Cinasa de Rata a. Purificación de adenosina-cinasa Se purificó una adenosina-cinasa del tejido de cerebro de rata . Las ratas fueron anestesiadas con dióxido de carbono, se decapitaron, y se removió el cerebro y se almacenó a -80°C antes de uso. Se descongelaron 350 g del tejido del cerebro calentando a 4°C y se homogeneizaron en 10 mM de clorhidrato de Tris (hidroximetil) amino metano (Tris-HCl) pH 7.5, 1 mM de ditiotreitol (DTT) , 0.1 mM de ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA) , 10 µM de Pepstatin (Sigma, St. Louis, MO) , 10 µM de Leupeptin (Sigma, St. Louis, MO) y 10 µM de Chymostatin (Sigma , ST. Louis, MO) . Los sólidos se removieron mediante centrifugación a 10,000 g durante 1 hora, seguido por ultra filtración a 100,000 g durante 30 minutos. La adenosina-cinasa se purificó adicionalmente haciendo pasar el sobrenadante limpio sobre 20 ml de AMP-sepharose (Sigma, St. Louis, MO) continuamente durante la noche a 4°C en un regulador de pH de TKM (2 mM de Tris-HCl , pH 7.0, 150 mM de KCl , 20 mM MgCI2, 1 M de DTT, 1 mM de E DTA) . La columna después se lavó sucesivamente con dos volúmenes de columna , cada uno de TKM con 500 mM NaCI, TKM con 10 mM de trifosfato de adenosina (ATP), TKM con 5 mM de adenosina y TKM con 1.3 mM de fosfato de dinucleótido de adenina de nicotinamida , reducida (NADPH) . La actividad de adenosina-cinasa se eluyó con el lavado de adenosina. Basado en la actividad inicial , se recuperó un 86% del material en este paso, lo cual dio una purificación de 1270 veces y una actividad específica de 0.77 U/mg (una U se define como la cantidad de enzima requerida para 1 µmoles de fosforilato de adenosina por minuto 37°C, a un pH de 7.5). La muestras conteniendo la actividad de adenosina-cinasa significativa se vaciaron y se concentraron en un Centricon 100™ (Amicon Inc. Beverly, MA). El concentrado se aplicó después a una columna de 1 ml de Q-Sepharose™ FPLC (Pharmacia, Piscataway, NJ). La columna se equilibró y la proteína se cargó en 10 mM de Tris, pH 7.5, 0.4 mM de DTT. La adenosina-cinasa se eluyó con un gradiente de KCl a partir de 0 a 100 mM en el mismo regulador de pH, con la actividad de adenosina-cinasa eluyéndose como un pico mayor a aproximadamente 50 mM de KCl. La proteína fue una banda homogénea individual a través de SDS PAGE utilizando un precolado de 12.5% de gel de acrilamida (Daíichi Puré Chemicals Company, Tokio, Japón) y se tiñó con el equipo de tinción de plata de Biorad (Biorad, Richmond, CAÁ). La purificación total de la adenosina-cinasa a partir de citosol fue de 21,700 veces, con una actividad específica de 13 U/mg. b. Digestión de adenosina-cinasa con ARG C de endoproteinasa Se concentraron 20 µg de adenosina-cinasa en 200 µl de 10 mM de Tris pH 7.5, 100 mM de KCl, 0.1 mM de DTT a 100 µl bajo vacío. La solución de proteína se ajustó a 20 mM de etanolamina y 4M de urea. Se añadieron 20 µl de 50 mM de DTT y 5 mM de EDTA y se realizó la reducción durante 30 minutos a temperatura ambiente bajo N2 l y después se añadieron 80 µl de 100 mM de Tris-HCl , pH 7.6, 10 mM de CaCI2. Después se añadieron 1 .2 µg de Endo Arg C (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) y se llevó a cabo la digestión durante 20 horas a 37°C bajo N2. La actividad se extinguió con la adición de 20 µl de 10% e ácido trifluoroacético (TFA)/5% de acetonitrilo (CH3CN) . c. Cromatografía en líquido de alta presión de fase inversa (RP-HPLC) de la digestión de Endo Arg C de adenosina-cinasa La digestión de Endo Arg C de adenosina-cinasa se separó mediante RP-H PLC utilizando una columna de 1 x 100 mm de ABI-OD300 (Applied Biosystems, Foster, CA) y el sistema de cromatografía de Pharmacia SMART™ (Pharmacia, Pitscataway, NJ) . El regulador de pH de partida fue 0.1 % de TFA/5% de CH3CN . El regulador de pH de elución fue de 0.082% de TFA/80% de CH3C N . Se utilizó una velocidad de 200 µl/min . Después de cargar el producto de digestión en la columna, se logró la cromatografía corriendo un gradiente de 55 minutos de 0 a 100% del regulador de pH de elución . Las fracciones se recogieron utilizando las capacidades de detección de pico del sistema SMART™ y se almacenaron a -80°C antes de analizar. d. Secuenciación de Péptido Los fragmentos de péptido se secuenciaron a través de la degradación de Edman secuencial en un secuenciador Applied Biosystems 476™ o 477™ (Applied Biosystems, Foster, CA) siguiendo los protocolos recomendados por el fabricante. Los datos se recogieron y se analizaron en un Perkin Elmer Nelson A/D941 (Perkin Elmer, Norwalk, CT.) . Se determinaron las secuencias de 5 fragmentos diferentes. Las secuencias de aquellos fragmentos se muestran en la Figura 6 y se designaron como SEC I D NOs: 10- 14, en donde X en la posición 5 en SEC I D NO: 1 1 indica un residuo indefinido. X en las posiciones 21 y 25 en SEC I D NO : 1 1 y en las posiciones 7 y 12 en SEC I D NO: 13 indican los residuos indeterminados. La secuenciación de la proteína purificada sin escisión proteolítica se intentó sin éxito, sugiriendo que el término amino de la proteína puede ser bloqueado. e. Diseño de oligonucleótidos Se diseñaron oligonucleótidos de degeneración utilizando las secuencias de péptido SEC ID NOs: 10-14. Se substituyó la Inosina (I) de base de discriminación menor en regiones de ambigüedad y alta degeneración . Observar que los paréntesis en la secuencia de nucleótido indican una mezcla igual de dos nucleótidos para representar ambigüedad en el uso de codon. Una variedad de iniciadores de degeneración fueron sintetizados y probados. El par de iniciadores, los cuales resultaron en la formación de un producto de PCR auténtico se muestra en a Figura 6 y las SEC ID NOs: 16 y 18 designadas. Las porciones de la SEC ID NOs:11 y 13 del péptido se utilizaron para designar las sondas como se muestra en la Figura 6 como las secuencias SEC ID NOs:15 y 17. Las secuencias mostradas como SEC ID NOs:15 y 17 representan porciones de SEC ID NOs:11 y 13, respectivamente.

Clonación de adenosina-cinasa de cerebro de rata Se compró ARN (ARNm) mensajero de cerebro de rata (Clontech, Palo Alto, CA.). Uno µg se transcribió en forma inversa a ADNc utilizando la transcpptasa inversa del virus de leucemia de murino Moloney (Stratagene, La Jolla, CA) siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. Al final de la reacción, el ADNc se precipitó con etanol y se almacenó en 20 µl de agua estéril destilada. Se utilizó 1 µl para cada Reacción de Cadena de Polimerasa (PCR) (Saiki, R.K. Gelfand, D.H. Stoffel, S., Scharf, S.J., Higuchi, R., Horn, G.T., Mullís, K.B., Ehriich, H.A., (1988) Science 239, 487-91). La PCR se realizó en un Perkin Elmer 9600™ Thermal Cycler. la mezcla de reacción contuvo 1 µl de ADNc, 10 pmoles de cada una de SEC ID NOs: 16 y 18 en la Figura 6, 0.2 mM de trifosfatos de desoxinucleótido (dNTPs), 10 µl de 10 x regulador de pH de PCR (200 mM de Tris-HCl, pH 8.4, 500 mM de KCl), 10 µl de 50 mM de MgCI2 y H20 a 100 µl. Directamente después de la incubación durante 2 minutos a 94°C para desnaturalizar el ADN de plantilla, se añadieron 5 unidades de polimerasa de Taq (BRL, Gaithersburg, MD) a cada reacción. La reacción se llevó a través de 25 ciclos, cada ciclo comprendiendo 94°C-30 segundos, 50°C-60 segundos y 72°C-60 segundos. Después del último ciclo, las reacciones fueron incubadas durante 5 minutos adicionales a 72°C, después se almacenaron a 4°C antes del análisis con gel. Para el análisis con gel , la reacciones se precipitaron con 0.1 vol. de 5 M de NaCI y 2 vols. de 100% de etanol enfriado con hielo. Las muestras se incubaron a -20°C durante por lo menos 1 hora y se centrifugaron a 4°C durante 1 hora en una microfuga. Una mitad de la reacción se visualizó a través de luz UV siguiendo electroforesis en un gel de 1 % de agarosa conteniendo 0.1 mg/ml de bromuro de etidío, revelando una banda predominante en la región de 500 bp de tamaño. El resto de la reacción se clonó en el vector pGEM-T™ (Promega, Madison, Wl), siguiendo los protocolos recomendados por el fabricante. Se mezclaron 7 µl de ADN de inserto con 1 µl de regulador de pH de ligasa (250 mM de Tris-HCl pH 7.6, 50 mM de KCl , 25 mM de MgCI2, 5 mM de ATP, 5 mM de DTT, 25% p/v de glicol polietilénico 8000), 1 µl del vector y 1 unidad de lígasa de ADN T4 (Promega, Madison , Wl) . Las reacciones se incubaron a 4°C durante la noche. Se transformaron E. coli Máximum Efficiency™ DH5µ (BRL, Gaithersburg, MD) con 5 µl de la reacción de ligación y después se extendieron sobre agar de caldo Lennox (LB) conteniendo 150 µg/ml de Amplicilina (Microdiagnostics, Lombard, IL) . Se extendieron, sobre la placa antes de uso, 50 µl de 2% de X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indol-beta-D-galactosida) (Sigma, St. Louis, MO) disuelto en dimetilformamida. Los transformantes con el inserto crecieron como colonias blancas en este indicador. Se recogieron colonias individuales en el caldo L (Gibco-BRL, Gaithersburg , MD) conteniendo 100 µg/mm de ampicilina (sal de sodio) (Sigma , St. Louis, MO) y desarrollaron durante la noche a 37°C con aireación vigorosa en el medio LB (Gibco BRL, Gaíthersburg , MD) . El ADN de plantilla se preparó a partir de colonias blancas utilizando miniprepraciones de Promega Magic™ (Promega , Madison, Wl) . El ADN de inserto se secuenció utilizando iniciadores específicos de vector en un secuenciador de ADN Applied Biosystems 373 (A BI , Foster, CA) siguiendo los protocolos recomendados por el fabricante) . Se realizó el análisis de secuencia utilizando software Sequencer™ (GeneCodes, Ann Aror, Ml) . g. Comparación de secuencia de péptido y de ADN Se trasladaron secuencias de ADN en todos los marcos y se compararon con péptidos de adenosina-cinasa utilizando el paquete de análisis de secuencia de University of Wisconsin Genetics Computer Group (Genetics Computer Group, Madison , Wl) . Un clon , designado 2317r, se identificó como un clon parcial de adenosina-cinasa basado en si identidad con secuencias de aminoácido de los péptidos obtenidos por la digestión ArgC. La translación de este clon en el marco 3 se muestra en la Figura 8 como SEC ID NO: 19 con la identificación de los fragmentos de péptido establecidos anteriormente. h. Clasificación de colección de ADNc de cerebro de rata Se clasificó una colección de ADNc de cerebro de rata con el clon de adenosina-cinasa parcial , 2317r, en un intento para aislar un clon de longitud completa. El clon 2317r fue digerido con enzimas de restricción Apa 1 y Sep1 (BRL, Gaithersburg , MD) para liberar el inserto . El A DN digerido se sometió a electroforesis en 1 % de agarosa con un punto de fusión bajo (LMPA) conteniendo 0.1 µgl/ml de bromuro de etidio. La banda de inserto fue visualizada a través de luz UV, después se cortó con una hoja de afeitar estéril . La rebanada de agarosa se pesó y se añadió agua a 1 .5 ml por gramo de agarosa. La rebanada de gel se calentó a 100°C durante 10 minutos, después se equilibró a 37°C durante 30 minutos . La agarosa fundida se dividió en alícuotas de 100 µl y se almacenó a -20°C. El ADN de inserto se marcó con 32P a través de iniciación aleatoria utilizando el equipo de marcación de ADN BRL (Gibco-BRL, Gaithersburg , MD) utilizando el método de Finberg y Vogelstein para la iniciación aleatoria de fragmentos directamente de las rebanadas de gel de agarosa de bajo punto de fusión (Finberg , A . P . y Vogelstein , B. (1984) Annal. Bioche. 132 (1 ) 6- 13) .

Se removió 32P no incorporada a través de cromatografía de columna de giro utilizando columnas de Quick Spin ™ G25-sepharose, (Boehringer Mannheim, Indianapolis, I N). Se obtuvo una colección de ADNc de cerebro de rata en lambda ZAPI I de Stratagene (La Jolla, CA). Esta colección se utilizó para infectar E. coli XLI Blue MRF' (Stratagene, La Jolla, CA.) siguiendo los protocolos recomendados por el fabricante. La colección se tituló para producir aproximadamente 5, 000 placas por 10 cm de una caja de Petri en agar NZCYM (Becton Dickinson, Cockeysile, MD) . Se prepararon 40 cajas de esta manera (aproximadamente 200,000 lacas). Se tomaron elevaciones de placa por duplicado en la membrana Duralon-UV™ (Stratagene, La Jolla, CA) y se fijaron por exposición a luz UV durante 2 minutos. Se prehibridizaron filtros en 50% de formamida , 1 M de NaCI , 10% de sulfato de dextrano, 1 % de SDS y 100 µg/ml compartiendo ADN de esperma de salmón (Sigma, St. Louis , MO) a 42°C en un volumen de 20 ml por 20 filtros. La hibridación se llevó a cabo a 42°C en el mismo regulador de pH con la adición de 5-9x106 cpm de sonda radiomarcada. Después de la h ibridación , los filtros se lavaron 3 veces en 0.1 x SSC (20 x SSC = 3 M de NaCI , 0.3 M de citrato de Na), 0.1 % de SDS a 42°C. Los filtros se secaron con aire y se expusieron a una película Kodak X-AR ™ (Eastman Kodak, New Haven , CT) a -70°C y la película se reveló de acuerdo a las recomendaciones del fabricante . Los clones identificados a través de señal de hibridación se purificaron en placas a través de ciclos de crecimiento y amplificación. La purificación en placa consistió de remover una región de la placa de agarosa alrededor de la placa positiva (alrededor de 5 mm2) e incubarla en 0.5 ml de medio de SM (100 mM de Tris-HCl, 0.01 mM de MgSO4-7H2O, 100 mM de NaCI, 0.01 % de gelatina) para permitir que las partículas del fago se difundan del agar. Después, 5 µl de este producto difundido se utilizaron para infectar células E. coli XLI Blue como se describió. Se tomaron elevaciones de placa como se describió anteriormente y los filtros se hibridizaron con una sonda radioactiva fresca. El enriquecimiento se repitió de esta manera 3 veces hasta que todas las placas en la lámina reaccionaron positivamente con la sonda. i. Subclonación del clon lambda de adenosina-cinasa de cerebro de rata El inserto de adenosina-cinasa de cerebro de rata se copió del clon lambda ZAPI I a través de PCR utilizando iniciadores específicos de vector (iniciadores de promotor T7 y T3, Stratagene , La Jolla , CA) en una mezcla de reacción de PCR comprendiendo 10 pmoles de iniciadores T7 y T3, 10 µl de 10 x regulador de pH de PCR (Gibco-BRL) , 10 µl de 50 m M de NgCI2, 0.2 mM de dNTP, 5 µl de suspensión de fago puro de placa en regulador de pH SM , se ajustó a 100 µl con agua destilada estéril. Las condiciones de PC R fueron 30 ciclos como sigue; 94°C durante 5 minutos para desnaturalizar el ADN seguido por 30 ciclos de 94°C durante 1 minuto, 60°C durante 1 minuto y 72°C durante 2 minutos. Se visualizaron 0.1 µl de la mezcla de reacción amplificada a través de luz UV después de electroforesis en 1 % de gel de agarosa conteniendo 0.1 µg/ml de bromuro de etidio. La banda de inserto tuvo una longitud de aproximadamente 800 bp. El inserto se secuenció como se escribió anteriormente. El análisis de secuencia indicó que el clon careció del extremo 5' del ARNm pero traslapó el clon original y contuvo la región no traducida 3', hasta incluir el extremo poli A (Figura 1 ). j. Aislamiento del extremo amino terminal del ARNm de adenosina-cinasa de rata Se utilizó 5'RACE (Random Amplification of cDNA Ends , Frohman , M.A. , Dush , M. K. Martin, G . R. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. E UA, 85 , 8998-9002, Beyavski , A. , Vinogradova, T. , Rajewski , K. (1989), Nucleic Acids Res. 17, 2919-2932) para aislar el extremo 5' del gen de adenosina-cinasa de cerebro de rata. El ADNc de 5' Race Ready™ de cerebro de rata se obtuvo de Clontech (palo Alto, CA) . Este ADNc se optimizó por el fabricante para incluir el extremo 5' de todos los genes expresados en el tejido particular, e incluye un oligonucleótido de "ancla" ligado al extremo 5' de cada ADNc. La PCR anidada se realizó siguiendo los protocolos del fabricante con iniciadores de promotor específicos de ancla e internos específicos de gen. este procedimiento produjo un extremo 5' intacto para el gen adenosina-cinasa. La secuencia deducida del gen adenosina-cinasa de cerebro de rata completa se generó después traslapando análisis contiguo. La Figura 1 ilustra los clones de traslape que fueron secuenciados para generar la secuencia de codificación de longitud completa. k. Aislamiento de AK de cerebro de rata de longitud completa Después se designaron iniciadores de PCR anidados para obtener la secuencia de longitud completa. Estos iniciadores se unieron a la región 5' y 3' no traducida del gen. Aquellos iniciadores se muestran en la Figura 6 y se designaron como SEC ID NOs:20-23. Estos iniciadores se utilizaron en la PCR para generar un gen de cerebro de rata de ADN de cerebro de rata Quickclone ™ (Clontech, Palo Alto, CA). Después de 1 grupo de 30 ciclos de PCR siguiendo las condiciones detalladas anteriormente con los iniciadores externos (SEC I D NOs:20 y 22 en la figura 6), la mezcla de PCR se diluyó 1 en 10 y la PCR se repitió con el grupo interno de iniciadores anidados (SEC I D NOs: 21 y 23 en la figura 6) . Una alícuota de la reacción de PCR se visualizó a través de luz UV después de electroforesis sobre un gel de 1 % de agarosa conteniendo 0.1 mg/ml de bromuro de etidio. Un fragmento de ADN homogéneo de aproximadamente 1 kb se obtuvo, consistente con el gen de cerebro de rata de longitud completa. El fragmento de PCR se clonó después en el vector pGEM-T como se describió anteriormente. Los insertos de los clones múltiples se suspendieron como se describió anteriormente, y se generó una secuencia de consenso de adenosina-cinasa de cerebro de rata. U na porción de aquella secuencia de consenso así como las secuencias de polinucleótido de codificación se muestran en las Figuras 2a y 2b. Las Figuras 2a y 2b muestran la secuencia de consenso de longitud completa de ADN de cerebro de rata y la secuencia de residuo de aminoácido deducida para adenosina-cinasa. SEC I D NO: 1 en las Figuras 2a y 2b representa la cadena de codificación. SEC I D NO:2 muestra la secuencia de residuo de aminoácido deducida de aquella de la cadena de codificación . SEC ID NO:3 representa la cadena de ADN complementaria.

I. Comparación de secuencia del gen adenosina-cinasa de cerebro de rata Utilizando el algoritmo de búsqueda de la base de datos, BLAST, (Altschul, S. F. , Gísh , W. , Miller, W. , Myers, E.W. , Lipman , D.J . (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410) , el A DN y la secuencia de proteína deducida de adenosina-cinasa de cerebro de rata se comparó con otros ácidos nucleicos y proteínas en las bases de datos de GEN bank y EMBL. Se encontró similitud de secuencia limitada con una ciase de cinasas de azúcar procarióticas . Utilizando el programa GCG MOTUFS (paquete de software de análisis de secuencia GCG , manual del programa v.8 (1994)) , el cual busca dominios de aminoácido compartidos entre las clases comunes de proteínas listadas en la base de datos de Prosite (Bairoch , A . y Bucker, P. ( 1994) Nucleic Acids Res. 22 , 3583-89) , se observó que la adenosina-cinasa de cerebro de rata tiene un motivo de aminoácido común compartido entre estas cinasas de azúcar procarióticas (Bork, P., Sander, C, Valencia, A. (1993) protein Sci. 2, 31-40). Sin embargo, la adenosina-cinasa de cerebro de rata no tuvo ninguna homología de secuencia significativa con otras cinasas de nucleótido reportada, y, sorprendentemente, no parece contener un motivo de unión de ATP clásico.

B. Adenosina-cinasa Humana a. Clonación de isozimas humanas de AK Se utilizó la secuencia de ADNc de adenosina-cinasa de cerebro de rata como una sonda para clasificar varias colecciones de ADNc humano en un esfuerzo para clonar un gen humano homólogo. El gen de cerebro de rata de longitud completa, excluyendo las regiones no traducidas, se radiomarcó a través de iniciación aleatoria como se describió previamente. Esta sonda se utilizó después para clasificar colecciones de ADNc del hipocampo humano, placenta humana, células linfoides MOLT-4 y células linfoides Raji (todas de Clontech, Palo Alto, CA), músculo esquelético humano (Stratagene, La Jolla, CA). La colecciones se colocaron en placas ya sea sobre células E. coli XL-1Blue o células E. coli Y1090, dependiendo de que cepa de lambda se utilizó (ya sea lambda Zap II o lambda gt11, respectivamente). Las colecciones se colocaron en placas a una densidad de 18,000 placas por lámina sobre cajas de Petri de poliestireno de 150 mm en un medio NZCYM. La hibridación se llevó a cabo como se describió anteriormente. Se identificaron varios clones positivos a la hibridación del ADNc de placenta humana. b. Análisis de secuencia de clones de adenosina-cinasa putativa de placenta humana Se obtuvieron clones de fago de lambda individual después de tres vueltas de purificación de placa, como se describió anteriormente. Los insertos se obtuvieron de una muestra de placa purificada a través de PCR como se describió previamente , utilizando oligonucleótidos específicos de lambda gt1 1. Los productos de PCR de longitud completa se clonaron a pGEM-T y se secuenciaron como se describió previamente. Ese clon de longitud completa se muestra en las Figuras 3a y 3b. En las Figuras 3a y 3b, la cadena de ADN de codificación se muestra como SED I D NO:4 con la secuencia de residuo de aminoácido deducida mostrada como SEC ID:5. La secuencia de ADN complementaria se muestra como SEC ID NO:6. La comparación de la secuencia de aminoácido del clon de ADNc de placenta humana con aquella del cerebro de rata reveló algunas diferencias principales en el término amino como se muestra en la Figura 5. En la Figura 5, la secuencia de adenosina-cinasa del residuo de aminoácido se muestra en como SEC ID NO:2. La secuencia de residuo de aminoácido de la forma humana de adenosina-cinasa, designada en la presente como la forma corta , se muestra como SEC I D NO: 5. Se puede calcular a partir de la Figura 5 que la identidad entre la forma corta humana y la enzima de rata es de 86% al nivel de aminoácido. Sin embargo, existen diferencias significativas en el término amino. Con el fin de verificar estas diferencias, se llevó a cabo 5' RACE, como se describió anteriormente, en ADNc de cerebro humano 5'RACE Ready™ (Clontech , Palo Alto, CA) . Los oligonucleótidos utilizados se muestran en la Figura 6 y se designan como SEC ID NOs:24-25. Una banda mayor se visualizó a través de electroforesis en gel y tinción con bromuro de etidio de la PCR . Los productos de PCR fueron clonados a pG EM-T (Promega, Madison , Wl) y las colonias blancas fueron secuenciadas como se describió anteriormente . Dos formas de adenosina-cinasa, las cuales difieren en sus términos amino, fueron identificadas a través de este procedimiento. La PCR anidada de ADNc utilizando SEC I D NOs:26-31 de oligonucleótidos específicos para adenosina-cinasa humana, se utilizó para obtener clones de longitud completa de ambas formas de adenosina-cinasa. Los productos de PCR de longitud completa se clonaron a pGEMT y se secuenciaron como se describió anteriormente. El análisis de secuencia de estos clones revela que son idénticos excepto en sus términos 5' . El clon de longitud completa de la forma larga de adenosina-cinasa humana se muestra en las figuras 4a y 4b. En las Figuras 4a y 4b, la cadena de ADN de codificación se muestra como SEC I D NO: 7 con la secuencia de residuo de aminoácido deducida mostrada como S EC I D : 8. La secuencia de ADN complementaria se muestra como SEC ID:9.

III. POLIPEPTIDOS DE ADENOSINA-CINASA En otro aspecto, la presente invención provee una adenosina-cinasa de origen mamífero. Una adenosina-cinasa de la presente invención es un polipéptido de aproximadamente 365 o menos residuos de aminoácido. Como se estableció anteriormente, se han identificado formas de adenosina-cínasa con de 345 a 362 residuos de aminoácido. Las varias formas de adenosina-cinasa se caracterizan por un alto grado de identidad de secuencia. A manera de ejemplo, la identidad entre la forma corta y la enzima de rata es de 86% al nivel de aminoácido. Como se estableció anteriormente , cuando la secuencia de residuo de aminoácido de adenosina-cinasa se comparó contra otras secuencias de residuo de adenosina-cinasa conocidas, utilizando una base de datos de búsqueda de algoritmo, sólo se encontró una sim ilitud de secuencia muy limitada con una clase de cinasas de azúcar procarióticas. Aunque se encontró que la adenosina-cinasa de rata tiene un motivo de aminoácido común compartido entre las cinasas de azúcar procarióticas, la adenosina-cinasa de cerebro de rata no tuvo ninguna homología de secuencia significativa con otras cinasas de nucleótido reportadas . El alto grado de identidad entre las varias formas de adenosina-cinasa descritas en la presente , cuando se combinan con la ausencia de identidad con otras cinasas de nucleósido reportadas permiten la defin ición de la secuencia de residuo de aminoácido de adenosina-cinasa a través de regiones de identidad de residuo. De esta manera, en una modalidad, una adenosina-cinasa es un polipéptido aislado y purificado de aproximadamente 365 o menos residuos de aminoácido, teniendo actividad biológica de adenosina-cinasa y comprendiendo por lo menos una de las siguientes secuencias de residuo de aminoácido: a) de la posición de residuo 7 a la posición de residuo 18 de SEC ID NO:8; b) de la posición de residuo 26 a la posición de residuo 86 de SEC ID NO:8; c) de la posición de residuo 100 a la posición de residuo 117 de SEC ID NO:8; d) de la posición de residuo 122 a la posición de residuo 146 de SEC ID NO:8; e) de la posición de residuo 153 a la posición de residuo 170 de SEC ID NO:8; f) de la posición de residuo 172 a la posición de residuo 181 de SEC ID NO:8; g) de la posición de residuo 183 a la posición de residuo 200 de SEC ID NO:8; h) de la posición de residuo 210 a la posición de residuo 222 de SEC ID NO:8; i) de la posición de residuo 230 a la posición de residuo 262 de SEC ID NO:8; j) de la posición de residuo 279 a la posición de residuo 289 de SEC ID NO:8; k) de la posición de residuo 31 1 a la posición de residuo 329 de SEC I D NO: 8; I) de la posición de residuo 331 a la posición de residuo 345 de SEC ID NO:8; y m) de la posición de residuo 347 a ia posición de residuo 359 de SEC I D NO:8. Muy preferiblemente, una adenosina-cinasa de la presente invención comprende dos o más de las secuencias anteriores. Muy preferiblemente, una adenosina-cinasa tiene todas las secuencias anteriores. Preferiblemente, una adenosina-cínasa de la presente invención tiene la secuencia de residuo de aminoácido de cualquiera de SEC I D NO:2 , 5 u 8. Muy preferiblemente, una adenosina-cinasa es una adenosina-cinasa humana recombinante. Las formas humanas de adenosina-cinasa se muestran en SEC I D NOs:5 y 8. SEC ID NO:5 representa una forma corta de adenosina-cinasa humana. SEC I D NO: 8 representa una segunda forma, larga de adenosina-cinasa humana. Se puede ver a partir de un examen de aquellas secuencias que todas las formas humanas comparten un alto grado de identidad de secuencia . De esta manera, la adenosina-cinasa humana puede ser definida como un polipéptido de aproximadamente 365 o menos residuos de aminoácido comprendiendo la secuencia de residuo de aminoácido de la posición de residuo 5 a la posición de residuo 345 de SEC I D NO: 5. Una adenosina-cinasa humana recombinante preferida tiene la secuencia de residuo de aminoácido de SEC I D NO: 5 u 8. La presente invención también contempla secuencias de residuo de aminoácido que son substancialmente duplicativas de la secuencias establecidas en la presente, de manera que aquellas secuencias demuestran una actividad biológica similar a las secuencias descritas. Dichas secuencias contempladas incluyen aquellas secuencias caracterizadas por un cambio mínimo en una secuencia o tipo de residuo de aminoácido (por ejemplo, secuencias substituidas conservativamente) , dicho cambio no substancial no altera la naturaleza básica ni la actividad biológica de adenosina-cinasa . Es bien conocido en la técnica que se pueden hacer cambio y modificaciones en la estructura de un polipéptido sin alterar substancialmente la función biológica de aquel péptido. Por ejemplo , ciertos aminoácidos pueden ser substituidos por otros aminoácidos en un polipéptido dado sin ninguna pérdida apreciable de función. Para hacer tales cambios, se pueden hacer substituciones de residuos de aminoácido similares con base en la similitud relativa de los substituyentes de cadena lateral, por ejemplo, su tamaño , carga , hidrofobicidad , hidrofilicidad , y similares. Como se detalla en la patente de E . U .A .- No . 4, 554 , 101 , incorporada aqu í por referencia, se han asignado los siguientes valores de hidrofilicídad a los residuos de aminoácido : Arg ( + 3.0) ; Lys (+3.0); Asp (+3.0); Glu (+03.); Ser (+0.3); Asn (+0.2); Gln ( + 0.2); Gly (0); pro (-0.5); Thr (-0.4); Ala (-0.5); His (-0.5); Cys (-1.0); Met (-1.3); Val (-1.5); Leu (-1.8); Me (-1.8); Tyr (-2.3); Phe (-2.5); y Trp (-3.4). Se entiende que un residuo de aminoácido puede ser substituido por otro que tenga un valor de hidrofilicidad (por ejemplo, dentro de un valor de más o menos 2.0) y sigue obteniendo un polipéptido biológicamente equivalente. En una forma similar, se pueden hacer substituciones con base en la similitud en el índice hidropático. A cada residuo de aminoácido se la asignado un índice hidropático con base en su hidrofobicidad y características de carga. Aquellos valores de índice hidropático son: Me (+4.5); Val (+4.2); Leu (-3.8); Phe (+2.8); Cys (+2.5); Met (+1.9); Ala (+1.8); Gly (-0.4); Thr (-0.7); Ser (-0.8); Trp (-0.9); Tyr (-1.3); Pro (-1.6); His (-3.2); Glu (-3.5); Gln (-3.5); Asp (-3.5); Asn (-3.5); Lys (-3.9); y Arg (-4.5). Para hacer una substitución con base en el índice hidropático, se prefiere un valor dentro de más o menos 2.0. Un polipéptido de adenosina-cinasa de la presente invención tiene numerosos usos. A manera de ejemplo, dicho polipéptído puede ser utilizado en un ensayo de clasificación para la identificación de fármacos o compuestos que inhiben la acción de adenosina-cinasa (por ejemplo, agonista y antagonista). Como se estableció anteriormente, adenosina-cinasa es una enzima que cataliza la fosforilación de adenosina a AMP. Una ensayo de clasificación para la identificación de inhibidores de adenosina-cinasa, por lo tanto, puede ser establecido por lo que la habilidad de un inhibidor para inhibir la acción de adenosina-cinasa puede ser determinada, exponiendo la adenosina en presencia de cofactores necesarios, a un polipéptido de la presente invención y cantidades variables de compuestos con la sospecha de que inhiben la actividad de adenosina-cinasa. Además, un polipéptido de adenosina-cinasa de la presente invención puede utilizarse para producir anticuerpos que específicamente inmunorreaccionan con adenosina-cinasa. En la técnica son bien conocidos los medios para producir anticuerpos. Un anticuerpo dirigido contra adenosina-cinasa puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal. Los anticuerpos contra adenosina-cinasa pueden ser preparados inmunizando un animal con el polipéptido de adenosina-cinasa de la presente invención. En la técnica son bien conocidos los medios para inmunizar animales para la producción de anticuerpos. A manera de ejemplo, un mamífero puede ser inyectado con un inoculo que incluye un polipéptido como se describió anteriormente. El polipéptido puede ser incluido en un inoculo sólo o conjugado a una proteína portadora tal como hemocianina de limpeto de clave (KLH) . El polipéptido puede ser suspendido, como es conocido en la técnica, en un auxiliar para mejorar la inmunogeneicidad del polipéptido. Después se produjeron sueros conteniendo anticuerpos inmunológicamente activos a partir de la sangre de dichos animales inmunizados utilizando procedimientos normales bien conocidos en la técnica.

La identificación de anticuerpos que inmunorreaccionan específicamente con adenosina-cinasa se hace exponiendo los sueros, con sospecha de contener tales anticuerpos, a un polipéptido de la presente invención para formar un conjugado entre los anticuerpos y el polipéptido. La existencia del conjugado después es determinada utilizando procedimientos normales bien conocidos en la técnica. Un polipéptido de adenosina-cinasa de la presente invención también pueden ser utilizado para preparar anticuerpos monoclonales contra adenosina-cinasa y utilizado como un ensayo de clasificación para identificar dichos anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales son producidos a partir de hibridomas preparados de acuerdo con técnicas normales tales como aquellas descritas por Kohier y otros (Nature. 256:495, 1975) . brevemente, una mamífero adecuado (por ejemplo ratón BALB/c) es inmunizado a través de una inyección con un polipéptido de la presente invención . Después de un período predeterminado, se removieron los esplenocitos del ratón y se suspendieron en un medio de cultivo de célula. Los esplenocitos después se fusionaron con una l ínea de célula inmortal para formar u n hibridoma. Los hibridomas formados se desarrollaron en el cu ltivo de célula y se clasificaron para su habilidad para producir un anticuerpo monoclonal contra adenosina-cinasa. La clasificación del medio de cultivo se hace con un polipéptido de la presente invención .

IV. MÉTODO PARA HACER ADENOSINA-CINASA En otro aspecto, la presente invención provee un procedimiento para hacer adenosina-cinasa. De acuerdo con este procedimiento, una célula huésped adecuada es transformada con un polinucleótido de la presente invención. La célula transformada es mantenida durante un período suficiente para la expresión de la adenosina-cinasa. La adenosina-cinasa formada después es recuperada. En la técnica son bien conocidos medios para transformar células huésped de tal forma que aquellas células producen polipéptidos recombinantes . Brevemente , un polinucleótido que codifica el polipéptido deseado es colocado en un vector de expresión adecuado para una célula huésped dada. El vector puede ser un vector viral , fago o plásmido. En una modalidad preferida, una célula huésped utilizada para producir adenosina-cinasa es una célula huésped eucariótica y un vector de expresión es un vector de expresión eucariótico (es decir, un vector capaz de dirigir la expresión en una célula eucariótica) . Dichos vectores de expresión eucarióticos son bien conocidos en la técnica. En otra modalidad preferida, la célula huésped es una célula bacteriana. U n célula bacteriana especialmente preferida es £. coli. Así, un vector de expresión preferido es un vector capaz de dirigir la expresión en E. coli. Un polinucleótido de vector de expresión de la presente invención está de preferencia operativamente asociado o enlazada con un mejorador-promotor. Un promotor es una región de una molécula de ADN típicamente en alrededor de 100 pares de nucleótido en frente del (corriente arriba del) punto en el cual empieza la transcripción. Esa región típicamente contiene varios tipos de elementos de secuencia de ADN que son ubicados en posiciones relativas similares en diferentes genes. Como se utiliza en la presente, el término "promotor" incluye lo que es denominado en la técnica como una región promotora corriente arriba o un promotor de una unidad de transcripción de polimerasa de ARN generalizada. Otro tipo de elemento de secuencia reguladora de transcripción es un mejorador. Un mejorador provee carácter específico de n ivel de tiempo, ubicación y expresión para una región de codificación particular (por ejemplo, un gen) . Una función principal de un mejorador es incrementar el nivel de transcripción de una secuencia de codificación en una célula que contiene uno o más factores de transcripción que se unen a dicho mejorador. A diferencia de un promotor, un mejorador puede funcionar cuando se localiza a distancias variables desde un sitio de inicio de transcripción siempre que el promotor esté presente. Como se utiliza en la presente, la frase "mejorador-promotor" significa una unidad compuesta que contiene elementos tanto mejorador como promotor. Un mejorador-promotor está operativamente enlazado a una secuencia de codificación que codifica por lo menos un producto de gen . Como se utiliza en la presente, la rase "operativamente enlazado" o su equivalente gramático significa que un elemento de secuencia reguladora (por ejemplo, un mejorador-promotor o región de terminación de transcripción) está conectado a una secuencia de codificación de tal manera que la transcripción de aquella secuencia de codificación es controlada y regulada a través del mejorador-promotor. En la técnica son bien conocidos los medios para enlazar operativamente un mejorador-promotor a una secuencia de codificación . Un mejorador-promotor utilizado en un vector de expresión de la presente invención puede ser cualquier mejorador-promotor que activa la expresión en una célula huésped . Empleando un mejorador-promotor con propiedades bien conocidas, el nivel de expresión puede ser optimizado. Por ejemplo, la selección de un mejorador-promotor que es activo en células específicamente transformadas permite la expresión específica de tejido o célula del producto deseado. Aún más, la selección de un mejorador-promotor que es regulado en respuesta a una señal fisiológica específica puede permitir la expresión inducida . Una secuencia de codificación de un vector de expresión está operativamente enlazada a una región de terminación de transcripción. La polimerasa de ARN transcribe una secuencia de ADN de codificación a través de un sitio en donde ocurre la poliadenilación . Típicamente, las secuencias de ADN ubicadas a pocos cientos de pares de base corriente abajo de la poliadenilación sirven para terminar la transcripción . Aquellas secuencias de ADN son denominadas en la presente como región de terminación de transcripción. Aquellas regiones son requeridas para la poliadenilación eficiente del ARN mensajero transcrito (ARNm). Los mejoradores-promotores y las regiones de terminación de transcripción son bien conocidas en la técnica. La selección de un mejorador-promotor particular o la región de terminación de transcripción dependerá, como es también conocido en la técnica, de la célula que será transformada. Un clon de la forma corta de adenosina-cinasa fue identificada por el análisis de secuencia de ADN para ser idéntico al consenso descrito previamente. Este clon se utilizó en todos los estudios de expresión subsecuentes. La adenosina-cínasa fue expresada en E. coli BL21(DE3)(Novagen, Madison, Wl) bajo el control del promotor T7. Se diseñó por ingeniería un sitio de Nde I sobre el gen de adenosina-cinasa a través de clonación de PCR en la construcción de expresión con el oligonucleótido SEC ID NO:32, mostrado en la Figura 6. Este oligonucleótido, cuando está en pares con un oligonucleótido externo de 3' para PCR, como se describió anteriormente, utilizando SEC ID NO:30, produjo un producto de PCR individual, al cual comprendía el gen adenosina-cinasa con el sito de enzima recientemente diseñado por ingeniería. El producto fue digerido con la enzima de restricción Hha I para la escisión de todo el plásmido padre pero dejando intacto al inserto. Los productos de PCR fueron clonados a pGEM-T (Promega, Madison, Wl) . Se desarrollaron clones positivos en una cantidad y ADN de plásmido purificado mediante una preparación media Qiagen ™ (Qiagen, Chatsworth, CA). El ADN purificado se cortó con Nde I y Sal I y la reacción se electroforeó sobre un gel de 1 % de agarosa conteniendo 0.1 mg/ml de bromuro de etidio. La reacción de gel conteniendo el inserto de adenosina-cinasa fue visualizada a través de luz UV y después se dividió con una navaja de rasurar estéril . El inserto fue purificado fuera de la rebanada de gel mediante la extrusión a través de un filtro de 0.2 mieras. El plásmido padre pET21 a también fue digerido con Nde I y Sal I y se purificó a través de cromatografía de columna Chromospin ™ (Clontech , Palo Alto, CA) . Se realizaron la ligaduras utilizando el equipo de ligadura de ADN Takara (Panvera, Madison, Wl). Las reacciones se llevaron a cabo a 16°C durante la noche con 2 µl de pET 21 A (corte de Nde I y Sal I) , 4 µl de inserto , 24 µl de regulador de pH A, y 6 µl de regulador de pH B. Se transformaron 5 µl de la mezcla de ligadura a DH5µ de Eficiencia Máxima, como se describió anteriormente. Las colonias fueron clasificadas mediante PCR, utilizando un iniciador de terminador T7 y un iniciador interno de adenosina-cinasa (SEC ID NO: 34 de la Figura 6) . 15 de las 20 colonias produjeron fragmentos de PCR que corresponden en tamaño a aquellos esperados para el ADNc de adenosina-cinasa . Dos de estas colonias fueron expandidas, durante la noche se desarrollaron en un medio de LB, su ADN se preparó y se transformó a cepas de E. coli BL21 (DE3) y HMS 174(DE3) , las cepas se utilizaron para expresión de vector pET.

Se recogieron los transformantes individuales, se desarrollaron a un OD de 0.6 en 100 ml de Superbroth ™ y después se incubaron con 0.4 mM de isopropil-ß-tiogalactopiranosida (IPTG). Los cultivos se desarrollaron durante 2 horas más para permitir la expresión óptima del ADN de inserto. Las células fueron cosechadas a través de centrifugación y se Usaron mediante célula de presión francesa. Los lisatos se hicieron girar en una microfuga para separar el material citosólico soluble de los componentes insolubles. El análisis en gel de poliacrilamida SDS de estas fracciones separadas reveló una banda de proteína importante a 40 KDa asociada con el componente insoluble, sugiriendo que la proteína recombinante formó cuerpos de inclusión . U na proteína de peso molecular de 40 KDa estuvo presente en las muestras conteniendo insertos de adenosina-cinasa, consistente con el tamaño esperado de adenosina-cinasa. De la misma manera, la forma larga de adenosina-cinasa humana fue expresada utilizando el oligonucleótido en SEC I D NO: 33 a PCR del gen . Todas la otras condiciones fueron ¡guales a las establecidas anteriormente. El vector de expresión que contiene la secuencia de ADN de codificación para la adenosina-cinasa humana de forma corta es designada como pET21 AK5 (corta) y el vector de expresión conteniendo la secuencia de ADN de codificación para adenosina-cinasa humana de forma larga es designada como pET21 AK18 (larga). Ambos vectores fueron depositados, bajo los términos del Tratado de Budapest, el , en American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, y se les asignó los números de acceso ATCC Nos: (pET21AK5) y (pET21AK18).

La actividad de adenosina-cinasa de los sobrenadantes se analizó radiométricamente. Los ensayos se realizaron a temperatura ambiente en un volumen final de 100 µl. la mezcla de reacción contuvo 64 mM de Tri-HCI (pH 7.5), 0.2 mM de MgCI2, 1 mM de ATP, 0.2 µM de U [14C]-adenosina (642 mCi/mmoles), Amersham) y volúmenes apropiados de la muestra de sobrenadante. La reacción se terminó después de 15 minutos colocando 40 µl de la mezcla de reacción sobre los discos de papel de intercambio de aniones Whatman DE-81. Los discos DE-81 después se secaron con aire, se lavaron durante 10 minutos en 2 mM de formiato de amonio, se enjuagaron sucesivamente con agua destilada, metanol y acetona, y se secaron. Los discos DE-81 se remojaron después durante 5 minutos en 0.1 N de HCI/0.4 M de KCl antes de la adición del cóctel de escintilación y contando a través del conteo de escintilación. Las actividades específicas (pmoles) de adenosina fosforilada/min./mg de proteína) para dos clones independientes se muestra en la Figura 7. La presente invención también contempla una célula huésped transformada con un polinucleótido o vector de expresión de esta invención. Los medios para transformar las células y polinucleótido y vectores de expresión utilizados para transformar células huésped son como se establecieron anteriormente. De preferencia, la célula huésped es una célula huésped eucariótica tal como una célula de mam ífero o una célula procariótica tal como E. coli. V. COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS La presente invención también provee una composición farmacéutica que comprende un polipéptido o un polinucleótido de esta invención y un diluyente fisiológicamente aceptable. En una modalidad preferida, la presente invención incluye uno o más oligonucleótidos antisentido, como se estableció anteriormente, formulados a composiciones junto con uno o más diluyentes, portadores, auxiliares o vehículos fisiológicamente tolerables no tóxicos, que colectivamente denominados en la presente como diluyentes, para inyección parenteral , para administración en forma sólida o líquida , para administración rectal o tópica, similares. Las composiciones pueden ser administradas a seres humanos y animales ya sea oral, parenteral , intracisternal, intravaginal , intraperitoneal, localmente, o como una aspersión bucal o nasal. Las composiciones adecuadas para administración parenteral pueden comprender soluciones , dispersiones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas estériles fisiológicamente aceptables , y polvos estériles para reconstitución a tales soluciones o dispersiones estériles. Ejemplos de diluyentes adecuados incluyen agua , etanol , polioles, mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales y esteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo . La fluidez apropiada puede ser mantenida, por ejemplo, a través del uso de un revestimiento tal como lecitina, a través del mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y mediante el uso de agentes tensoactivos. Las composiciones también pueden contener auxiliares tales como agentes conservadores, humectantes, emulsificantes, y dispersantes. La prevención de la acción de microorganismos puede ser asegurada a través de varios agentes antibacterianos y contra hongos, por ejemplo, parabenes, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos , por ejemplo, azúcares, cloruro de sodio y similares. La absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede ser conducida a través del uso de agentes de retraso de absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Además délos diluyentes inerte, la composición también puede incluir agentes edulcorantes , saborizantes y de perfuma. Las suspensiones, además de los compuestos activos, pueden contener agentes de suspensión, como por ejemplo, alcoholes isoestearílicos etoxilados, polioxietilen sorbitol y esteres de sorbitán , cel ulosa microcristalina, metahidróxido de aluminio, bentonita, agar-agar y tragacanto, o mezcla de estas substancias y similares.

LISTA DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLITANTE: Cowart, Marión Daniel, Halbert, Donald N., Kerwín, Jr., James F., MaNally, Teresa. (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: Polinucleótidos de Adenosina- Cinasa (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 34 (iv) DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA: (A) DIRECCIÓN: Abbott Laboratories (B) CALLE: D-377 AP6D, 100 Abbott Park Road (C) CIUDAD: Abbott Park (D) ESTADO: Illinois (E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL: 60064-3500 (v) FORMA LEGIBLE EN COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Diskette, 3.0 pulg. (B) COMPUTADORA: Macintosh (C) SISTEMA OPERATIVO: Macintosh System 7.1 (D) SOFTWARE: Microsoft Word 6.0 (vi) DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD: (A) NUMERO DE SOLICITUD: (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 7 de Junio de 1995 (C) CLASIFICACIÓN: (vii) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR: (A) NUMERO DE SOLICITUD: (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: (viii) INFORMACIÓN DE APODERADO/AGENTE: (A) NOMBRE: Thomas D. Brainard (B) NUMERO DE REGISTRO: 32,459 (C) NO. REFERENCIA/APODERADO: 5749. US.01 (ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN: (A) TELEFONO: (708) 937-4884 (B) TELEFAX: (708) 938-2623 (2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1190 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUCTURA DE CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) ASPECTO: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACION: 16...1101 (C) MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: experimental (D) OTRA INFORMACIÓN: /evidencia = EXPERIMENTAL (ix) ASPECTO: (A) NOMBRE/CLAVE: mat_péptido (B) LOCALIZACION : 16 ... 1098 (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 1 : GGG ATT AGA GTC AAG ATG GCA GCT GCG GAC GAG CCG AAG CCC AAG AAG 48 Met Ala Ala Ala Asp Glu Pro Lys Pro Lys Lys 1 5 10 CTC AAG GTG GAA GCG CCA GAA GCG CTG AGT GAA AAT GTG CTG TTT GGA 96 Leu Lys Val Glu ?la Pro Glu Ala Leu Ser Glu Asn Val Leu Phß Gly 15 20 25 ATG GGG AAT CCT CTT CTT GAC ATC TCT GCT GTG GTA GAC AAA GAT TTC 144 Met Gly Asn Pro Leu Leu Asp lie Ser Ala Val Val Asp Lys Asp Phe 30 35 40 CTT GAT AAG TAT TCT CTG AAA CCA AAC GAC CAG ATC TTG GCC GAA GAC 192 Leu Asp Lys Tyr Ser Leu Lys Pro Asn Asp Gln lie Leu Ala Glu Asp 45 50 55 AAG CAC AAG GAA TTG TTT GAT GAA CTT GTA AAA AAA TTC AAA GTT GAA 240 Lys His Lys Glu Leu Phe Asp Glu Leu Val Lys Lys Phe Lys Val Glu 60 65 70 75 TAT CAT GCC GGT GGG TCC ACG CAG AAT TCA ATG AAA .GTG GCT CAG TGG 288 Tyr His Ala Gly Gly Ser Thr Gln Asn Ser Met Lys Val Ala Gln Trp 80 85 90 ATG ATT CAG GAG CCA CAC AGA GCA GCA ACG TTC TTC GGA TGC ATT GGG 336 Met He Gln Glu Pro His Arg Ala Ala Thr Phe Phe Gly Cys He Gly 95 100 105 ATA GAT AAG TTC GGG GAG ATC CTG AAG AGC AAA GCC GCA GAT GCA CAC 384 He Asp Lys Phe Gly Glu He Leu Lys Ser Lys Ala Ala Asp Ala His 110 115 120 GTG GAC GCC CAT TAC TAT GAG CAG AAC GAG CAG CCC ACA GGA ACG TGC 432 Val Asp Ala His Tyr Tyr Glu Gln Asn Glu Gln Pro Thr Gly Thr Cys 125 130 135 GCT GCA TGC ATC ACC GGT GGC AAC CGG TCT CTT GTT GCT AAC CTT OCT 480 Ala Ala Cys He Thr Gly Gly Asn Arg Ser Leu Val Ala Asn Leu Ala 140 145 150 155 GCC GCC AAT TGT TAT AAG AAA GAA AAG CAC CTT GAT CTG GAG AAC AAC 528 Ala Ala Asn Cys Tyr Lys Lys Glu Lys His Leu Asp Leu Glu Asn Asn 160 165 170 TGG ATG TTG GTA GAG AAA GCC AGA GTT TAC TAC ATA GCT GGC TTC TTT 576 Trp Met Leu Val Glu Lys Ala Arg Val Tyr Tyr He Ala Gly Phe Phe 175 180 185 CTC ACC GTC TCC CCA GAG TCA GTG TTG AAA GTG GCT CGC TAT GCT GCC 624 Leu Thr Val Ser Pro Glu Ser Val Leu Lys Val Ala Arg Tyr Ala Ala 190 195 200 GAG AAC AAC AGG ACC TTC ACT CTT AAC CTG TCC GCA CCG TTC ATT AGC 672 Glu Asn Asn Arg Thr Phe Thr Leu Asn Leu Ser Ala Pro Phe He Ser 205 210 215 CAG TTC TTC AAG GAA GCC TTG ATG GAA GTC ATG CCT TAT GTT GAC ATC 720 Gln Phe Phe Lys Glu Ala Leu Met Glu Val Met Pro Tyr Val Asp He 220 225 230 235 CTC TTT GGA AAT GAG ACG GAG GCT GCC ACT TTT GCT AGA GAG CAÁ GGC 768 Leu Phe Gly Asn Glu Thr Glu Ala Ala Thr Phe Ala Arg Glu Gln Gly 240 245 250 TTT GAG ACT AAA GAC ATT AAA GAA ATA GCC AGA AAG ACG CAG GCT CTT 816 Phe Glu Thr Lys Asp He Lys Glu He Ala Arg Lys Thr Gln Ala Leu 255 260 265 CCA AAG GTG AAC TCG AAG AGG CAG AGG ACC GTG ATC TTC ACC CAÁ GGG 864 Pro Lys Val Asn Ser Lys Arg Gln Arg Thr Val He Phe Thr Gln Gly 270 275 280 AGA GAT GAC ACT ATA GTA GCT ACA GGA AAT GAT GTC ACT GCT TTC CCT 912 Arg Asp Asp Thr He Val Ala Thr Gly Asn Asp Val Thr Ala Phe Pro 285 290 295 GTC TTG GAT CAÁ AAC CAG GAA GAG ATC GTT GAC ACC AAT GGA GCT GGA 960 Val Leu Asp Gln Asn Gln Glu Glu He Val Asp Thr Asn Gly Ala Gly 300 305 310 315 GAT GCA TTT GTA GGA GGG TTT CTG TCT CAG CTG GTC TCC AAC AAG CCT 1008 Asp Ala Phe Val Gly Gly Phe Leu Ser Gln Leu Val Ser Asn Lys Pro 320 325 330 CTG ACT GAA TGC ATC CGG GCC GGG CAC TAT GCA GCG AGC GTC ATC ATT 1056 Leu Thr Glu Cys He Arg Ala Gly His Tyr Ala Ala Ser Val He He 335 340 345 AGG CGA ACT GGC TGT ACT TTT CCT GAG AAG CCA AAC TTC CAC TGACGGAAGA 1108 Arg Arg Thr Gly Cys Thr Phe Pro Clu Lys Pro Asn Phß His 350 355 360 AAAGCAACTC AGGCAATCAC TAGTGCGGCC GCCTGCAGGT CGACCATATG GGAGAGCTCC 1168 CAACGCGTTG GATGCATAGC TT 1190 (3) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 361 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) ESTRUCTURA DE CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (¡x) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 2: Met Ala Ala Ala Asp Glu Pro Lys Pro Lys Lys 1 5 10 Leu Lys Val Glu Ala Pro Glu Ala Leu Ser Glu Asn Val Leu Phe Gly 15 20 25 Met Gly Asn Pro Leu Leu Asp He Ser Ala Val Val Asp Lys Asp Phe 30 35 40 Leu Asp Lys Tyr Ser Leu Lys Pro Asn Asp Gln He Leu Ala Glu Asp 45 50 55 Lys His Lys Glu Leu Phe Asp Glu Leu Val Lys Lys Phe Lys Val Glu 60 65 70 75 Tyr His Ala Gly Gly Ser Thr Gln Asn Ser Met Lys Val Ala Gln Trp 80 85 90 Met He Gln Glu Pro His Arg Ala Ala Thr Phe Phe Gly Cys He Gly 95 100 105 He Asp Lys Phe Gly Glu He Leu Lys Ser Lys Ala Ala Asp Ala His 110 115 120 Val Asp Ala His Tyr Tyr Glu Gln Asn Glu Gln Pro Thr Gly Thr Cys 125 130 135 Ala Ala Cys He Thr Gly Gly Asn Arg Ser Leu Val Ala Asn Leu Ala 140 145 150 155 Ala Ala Asn Cys Tyr Lys Lys Glu Lys His Leu Asp Leu Glu Asn Asn 160 165 170 Trp Met Leu Val Glu Lys Ala Arg Val Tyr Tyr He Ala Gly Phe Phe 175 180 185 Leu Thr Val Ser Pro Glu Ser Val Leu Lys Val Ala Arg Tyr Ala Ala 190 195 200 Glu Asn Asn Arg Thr Phe Thr Leu Asn Leu Ser Ala Pro Phe He Ser 205 210 215 Gln Phe Phe Lys Glu Ala Leu Met Glu Val Met Pro Tyr Val Asp He 220 225 230 235 Leu Phe Gly Asn Glu Thr Glu ?la Ala Thr Phe Ala Arg Glu Gln Gly 240 245 250 Phe Glu Thr Lys Asp He Lys Glu He Ala Arg Lys Thr Gln Ala Leu 255 260 265 Pro Lys Val Asn Ser Lys Arg Gln Arg Thr Val He Phe Thr Gln Gly 270 275 280 Arg Asp Asp Thr He Val Ala Thr Gly ?sn ?sp Val Thr ?la Phe Pro 285 290 295 Val Leu ?sp Gln ?sn Gln Glu Glu He Val ?sp Thr ?sn Gly ?la Gly 300 305 310 315 ?sp ?la Phe Val Gly Gly Phe Leu Ser Gln Leu Val Ser ?sn Lys Pro 320 3,25 330 Leu Thr Glu Cys He ?rg ?la Gly His Tyr ?la ?la Ser Val He He 33S 340 345 ?rg ?rg Thr Gly Cys Thr Phe Pro Glu Lys Pro ?sn Phe His 350 355 360 (4) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1190 bases de pares (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUCTURA DE CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 3: ?AGCT?TGC? TCCAACGCGT TGGG?GCTCT CCCATATGGT CGACCTGCAG GCGGCCGCAC 60 T?GTG?TTGC CTGAGTTGCT TTTCTTCCGT CAGTGGAAGT TTGGCTTCTC AGG????GT? 120 C?GCC?GTTC GCCT??TG?T G?CGCTCGCT GCATAGTGCC CGGCCCGGAT GC?TTC?GTC 180 ?G?GGCTTGT TGGAGACCAG CTG?G?C?G? ??CCCTCCT? C?AATGCATC TCC?GCTCC? 240 TTGGTGTCAA CGATCTCTTC CTGGTTTTGA TCCAAGACAG GGAAAGCAGT GAC?TC?TTT 300 CCTGT?GCT? CT?TAGTGTC ATCTCTCCCT TGGGTGAAG? TCACGGTCCT CTGCCTCTTC 360 G?GTTC?CCT TTGGAAGAGC CTGCGTCTTT CTGGCTATTT CTTTAATGTC TTTAGTCTC? 420 ??GCCTTGCT CTCTAGC??A AGTGGCAGCC TCCGTCTC?T TTCC?AAGAG G?TGTC??C? 480 T??GGC?TG? CTTCCATCAA GGCTTCCTTG A?G?ACTGGC TAAGTA?CGG TGCGG?C?GG 540 TT??G?GTGA ?GGTCCTGTT GTTCTCGGC? GC?TAGCGAG CC?CTTTC?? C?CTG?CTCT 600 GGGG?G?CGG TGAGAAAGAA GCCAGCT?TG T?GT??ACTC TGGCTTTCTC T?CC??C?TC 660 C?GTTGTTCT CCAGATCAAG GTGCTCTTCT TTCTTAT??C ??TTGGCGGC ?GC??GGTT? 720 GC??C??G?G ?CCGGTTGCC ?CCGGTG?TG C?TGC?GCGC ?CGTTCCTGT GGGCTGCTCG 80 TTCTGCTC?T ?GT??TGGGC GTCC?CGTGT GC?TCTGCGG CTTTGCTCTT C?GG?TCTCC 840 CCG??CTC?T CT?TCCC??T GC?TCCG??G ??CGTTGCTG CTCTGTGTGG CTCCTG??TC 900 ATCCACTG?G CC?CTTTC?T TG??TTCTGC GTGG?CCCAC CGGC?TG?T? TTC?ACTTTG 960 ??TTTTTTT? C??GTTC?TC ???C??TTCC TTGTGCTTGT CTTCGGCC?? G?TCTGGTCG 1020 TTTGGTTTC? G?G??T?CTT ?TC??GGG?? TCTTTGTCT? CC?C?GC?G? G?TGTC??GA 1080 AG?GG?TTCC CC?TTCC??? C?GC?C?TTT TC?CTC?GCG CTTCTGGCGC TTCC?CCTTG 1140 ?GCTTCTTGG GCTTCGGCTC GTCCGC?GCT GCC?TCTTG? CTCT??TCCC 1190 (5) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1172 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUCTURA DE CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) ASPECTO: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACION: 94 ... 1 131 (ix) ASPECTO: (A) NOMBRE/CLAVE: mat_péptido (B) LOCALIZACION : 94 ... 1 128 (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 4: GCCGGG??GC AGTTGCTGTG GTACCTGCTG CTGCCCGAGC GGACGTAGAG C?TCGG?CGC 60 GGGCGCCGTG GCGTTGGGCA GGAGGGCGA? GCC ?TG ?CG TC? GTC ?G? G?? ??T 114 Met Thr Ser Val ?rg Glu ?sn 1 5 ?TT CTC TTT GG? ?TG GG? ?AT CCT CTG CTT G?C ?TC TCT GCT GT? GTG 162 He Leu Phe Gly Mßt Gly ?sn Pro Leu Leu ?sp He Ser ?la Val Val 10 15 20 G?C ??? G?T TTC CTT G?T ??G T?T TCT CTG ?AA CC? ?AT GAC C?? ?TC 210 ?sp Lys ?sp Phe Leu ?sp Lys Tyr Ser Leu Lys Pro ?sn ?sp Gln He 25 30 35 TTG GCT G?? G?C ??? C?C ??G G?? CTG TTT G?T G?? CTT GTG ?AA A?A 258 Leu ?la Glu ?sp Lys His Lys Glu Leu Phe ?sp Glu Leu Val Lys Lys 40 45 50 55 TTC AA? GTC G?? T?T C?T GCT GGT GGC TCT kCC CAG AAT TCA ATT AA? 306 Phe Lys Val Glu Tyr His ?la Gly Gly Ser Thr Gln ?sn Ser He Lys 60 65 70 GTG GCT C?G TGG ?TG ?TT C?? C?G CCA C?C ??? GC? GC? ?C? TTT TTT 354 Val ?la Gln Trp Mßt He Gln Gln Pro Hiß Lys ?la ?la Thr Phß Phß 75 80 85 GG? TGC ?TT GGG ?T? G?T ??? TTT GGG G?G ?TC CTG ?AG AG? ??? GCT 402 Gly Cys He Gly He ?sp Lys Phe Gly Glu He Leu Lys ?rg Lys ?la 90 95 100 GCT G?? GCC C?T GTG G?T GCT C?T T?C T?C G?G C?C ??T G?G C?G CC? 450 ?la Glu ?la His Val ?sp ?la His Tyr Tyr Glu Gln ?sn Glu Gln Pro 105 110 115 ?C? GG? ?CT TGT GCT GC? TGC ?TC ?CT GGT G?C ??C ?GG TCC CTC ?T? 498 Thr Gly Thr Cys ?la ?la Cys He Thr Gly ?ßp Asn ?rg Ser Leu He 120 125 130 135 GCT A?T CTT GCT GCT GCC ??T TGT T?T ?AA ?AG GA? ??? CAT CTT G?T 546 ?la ?sn Leu ?la ?la ?la ?sn Cys Tyr Lys Lys Glu Lys His Leu ?sp 140 145 150 CTG G?G AA? ??C TGG ?TG TTG GT? GAA AAA GCA AGA GTT TGT TAT AT? 594 Leu Glu Lys ?sn Trp Met Leu Val Glu Lys ?la ?rg Val Cys Tyr He 155 160 165 GC? GGC TTT TTT CTT ?C? GTT TCC CC? G?G TCA GTA TTA A?G GTG GCT 642 ?la Gly Phe Phß Leu Thr Val Ser Pro Glu Ser Val Leu Lys Val ?la 170 175 180 C?C C?T GCT TCT G?? A?C ??C ?GG ?TT TTC ?CT TTG ??T CT? TCT GC? 690 His His ?la Ser Glu ?sn ?sn ?rg He Phe Thr Leu ?sn Leu Ser ?la 185 190 195 CCG TTT ?TT ?GC C?G TTC T?C ??G G?? TC? TTG ?TG A?A GTT ?TG CCT 738 Pro Phe He Ser Gln Phe Tyr Lys Glu Ser Leu Met Lys Val Met Pro 200 205 210 215 T?T GTT G?T ?T? CTT TTT GG? ??T GAG AC? GAA GCT GCC ACT TTT GCT 786 Tyr Val Asp He Leu Phe Gly Asn Gli .hr Glu Ala ?la Thr Phe ?la 220 225 230 ?G? G?G C?? GGC TTT GAO ?CT ??? GAC ?TT ??? G?G ATA GCC AAA A?G 834 ?rg Glu Gln Gly Phe Glu Thr Lys ?sp He Lys Glu He Ala Lys Lys 235 240 245 ACA C?? GCC CTG CC? ??G ?TG ??C TC? ??G ?GG C?G CG? ?TC GTG ?TC 882 Thr Gln ?la Leu Pro Lys Mßt ?sn Ser Lys ?rg Gln ?rg He Val He 250 255 260 TTC ?CC C?? GGG ?G? G?T G?C ?CT ?T? ?TG GCT ?C? G?? ?GT G?? GTC 930 Phe Thr Gln Gly ?rg ?sp ?sp Thr He Met ?la Thr Glu Ser Glu Val 265 270 275 ACT GCT TTT GCT GTC TTG G?T C?? GAC CAG A?? G?? ?TT ?TT GAT ACC 978 Thr Ala Phe Ala Val Leu ?sp Gln ?sp Gln Lys Glu He He ?sp Thr 280 285 290 295 ??T GG? GCT GG? G?T GC? TTT GTT GG? GGT TTT CTG TCT C?? CTG GTC 1026 ?sn Gly ?la Gly ?sp ?la Phe Val Gly Gly Phe Leu Ser Gln Leu Val 300 305 310 TCT G?C ?AG CCT CTG ?CT G?? TGT ?TC CGT GCT GGC C?C T?T GC? GCA 107 Ser ?sp Lys Pro Leu Thr Glu Cys He ?rg ?la Gly His Tyr ?la ?la 315 320 325 ?GC ?TC ?T? ?TT ?G? CGG ?CT GGC TGC ?CC TTT CCT G?G ??G CC? G?C 1122 Ser He He He ?rg ?rg Thr Gly Cys Thr Phe Pro Glu Lys Pro ?sp TTC C?C TG? TGG??GAGCT G??AAC?C?? GCCCAGGAGT GC?G?C?CCCC 1172 Phe His * 345 (6) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 345 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 5: Met Thr Ser Val ?rg Glu ?sn He Leu Phe Gly Met Gly ?sn Pro Leu 1 5 10 15 Leu ?sp He Ser ?la Val Val ?sp Lys ?sp Phe Leu ?sp Lys Tyr Ser 20 25 30 Leu Lys Pro ?sn ?sp Gln He Leu ?la Glu ?sp Lys His Lys Glu Leu 35 40 45 Phe ?sp Glu Leu Val Lys Lys Phe Lys Val Glu Tyr His ?la Gly Gly 50 55 60 Ser Thr Gln ?sn Ser He Lys Val ?la Gln Trp Met He Gln Gln Pro 65 70 75 80 His Lys ?la ?la Thr Phe Phe Gly Cys He Gly He ?sp Lys Phe Gly 85 90 95 Glu He Leu Lys ?rg Lys ?la ?la Glu ?la His Val ?sp ?la His Tyr 100 105 110 Tyr Glu Gln ?sn Glu Gln Pro Thr Gly Thr Cys ?la ?la Cys He Thr 115 120 125 Gly ?sp ?sn ?rg Ser Leu He ?la ?sn Leu ?la ?la ?la ?sn Cys Tyr 130 135 140 Lys Lys Glu Lys His Leu ?sp Leu Glu Lys ?sn Trp Met Leu Val Glu 145 150 155 160 Lys ?la ?rg Val Cys Tyr He ?la Gly Phe Phe Leu Thr Val Ser Pro 165 170 175 Glu Ser Val Leu Lys Val ?la His His ?la Ser Glu ?sn ?sn ?rg He 180 185 190 Phe Thr Leu Asn Leu Ser Ala Pro Phe He Ser Gln Phe Tyr Lys Glu 195 200 205 Ser Leu Met Lys Val Met Pro Tyr Val Asp He Leu Phe Gly Asn Glu 210 215 220 Thr Glu Ala Ala Thr Phe Ala Arg Glu Gln Gly Phe Glu Thr Lys Asp 225 230 235 240 He Lys Glu He Ala Lys Lys Thr Gln Ala Leu Pro Lys Met ?sn Ser 245 250 255 Lys ?rg Gln Arg He Val He Phe Thr Gln Gly Arg Asp Asp Thr He 260 265 270 Met Ala Thr Glu Ser Glu Val Thr Ala Phe Ala Val Leu Asp Gln Asp 275 280 285 Gln Lys Glu He He Asp Thr Asn Gly Ala Gly Asp Ala Phe Val Gly 290 295 300 Gly Phe Leu Ser Gln Leu Val Ser ?sp Lys Pro Leu Thr Glu Cys He 305 310 315 320 ?rg ?la Gly His Tyr ?la ?la Ser He He He ?rg ?rg Thr Gly Cys 325 330 335 Thr Phe Pro Glu Lys Pro ?sp Phe His 340 (7) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1172 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUCTURA DE CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 6: GGGGTGTCTG C?CTCCTGGG CTTGTGTTTT C?GCTCTTCC ?TCAGTGG?A GTCTGGCTTC 60 TC?GG??AGG TGCAGCCAGT CCGTCTA?TT ?TG?TGCTTG CTGCATAGTG GCC?GC?CGG 120 ?T?C?TTC?G TCAGAGGCTT GTCAG?G?CC ?GTTG?G?C? G?AACCTCC A?C???TGC? 180 TCTCC?GCTC CATTGGTATC A?T??TTTCT TTCTGGTCTT G?TCC??G?C ?GC??AAGC? 240 GTG?CTTC?C TTTCTGT?GC C?TT?T?GTG TC?TCTCTCC CTTGGGTG?? G?TC?CG?TT 300 CGCTGCCTCT TTGAGTTCAT CTTTGGCAGG GCTTGTGTCT TTTTGGCT?T CTCTTTAATG 360 TCTTTAGTCT CAAAGCCTTG CTCTCTAGCA ?AAGTGGC?G CTTCTGTCTC ?TTTCCAAAA 420 ?GT?TATCA? CATAAGGCAT AACTTTCATC A?TGATTCCT TGTAGAACTG GCTA?T??C 480 GGTGCAG?TA GATTCAAAGT GAAAATCCTG TTGTTTTCAG ?AGCATGGTG AGCC?CCTTT 540 ??T?CTG?CT CTGGGGAAAC TGTAAGAAAA ?AGCCTGCT? T?TAACAAAC TCTTGCTTTT 600 TCT?CCAACA TCCAsTTTTT CTCC?G?TC? ?G?TGTTTTT CCTTTTT?T? ?C??TTGGC? 660 GC?GC?AG?T TAGCTATGAG GGACCTGTTG TCACCAGTGA TGC?TGC?GC ?C??GTTCCT 720 GTTGGCTGCT C?TTCTGCTC GT?GT?ATGA GC?TCCAC?T GGGCTTCAGC ?GCTTTTCTC 780 TTC?GG?TCT CCCC?AATTT ATCTATCCC? ?TGC?TCC?? AA??TGTTGC TGCTTTGTGT 840 GGCTGTTG?? TC?TCCACTG AGCC?CTTT? ?TTGAATTCT GGGTAG?GCC ?CCAGCATG? 900 T?TTCG?CTT TG??TTTTTT C?C??GTTC? TC." * " C?GTT CCTTGTGTTT GTCTTC?GCC 960 ??G?TTTGGT C?TTTGGTTT C?G?G?ATAC TTA -?GGA ??TCTTTGTC C?CT?C?GC? 1020 G?G?TGTC?? GC?G?GG?TT TCCC?TTCC? ??G?G??T?T TTTCTCTG?C TG?CGTC?TG 1080 GCTTCGCCCT CCTGCCC?GC GCC?CGGCGG CCGCGTCCG? TGCTCT?CGT CCGCTCGGGC 1140 ?GC?GC?GGT ?CCACAGCA? CTGCTTCCCG GC 1172 (8) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1181 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUCTURA DE CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) ASPECTO: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACION: 51 ... 1139 (ix) ASPECTO: (A) NOMBRE/CLAVE: mat_péptido (B) LOCALIZACION : 51 ... 1 136 (ix) DESCRI PCIÓN DE SECU ENCIA: SEC I D NO: 7: GTGG?TGGC? G?GGTGGGCT GT?G?GCC?? ?GTGGGGTGG GAGCGCG??G ?TG GCT 5 Met ?la 1 GCT GCT G?G G?G G?G CCG ??G CCC AAA AAG CTG AAG GTG GAG GCG CCG 104 Ala Ala Glu Glu Glu Pro Lys Pro Lys Lys Leu Lys Val Glu Ala Pro 5 10 15 C?? GCG CTG ?G? G?? ?AT ATT CTC TTT GG? ?TG GG? ??T CCT CTG CTT 152 Gln ?la Leu ?rg Glu ?sn He Leu Phe Gly Met Gly ?sn Pro Leu Leu 20 25 30 G?C ?TC TCT GCT GT? GTG G?C AA? G?T TTC CTT G?T ??G T?T TCT CTG 200 ?sp He Ser ?la Val Val ?sp Lys ?sp Phe Leu ?sp Lys Tyr Ser Leu 35 40 45 50 ??? CC? ??T G?C C?? ?TC TTG GCT G?? G?C ??? C?C ??G G?? CTG TTT 248 Lys Pro ?sn ?sp Gln He Leu ?la Glu ?sp Lys His Lys Glu Leu Phe 55 60 65 G?T G?? CTT GTG ??? ??? TTC ??? GTC G?? T?T C?T GCT GGT GGC TCT 296 ?sp Glu Leu Val Lys Lys Phe Lys Val Glu Tyr His ?la Gly Gly Ser 70 75 80 ?CC C?G ??T TC? ?TT ??? GTG GCT C?G TGG ?TG ?TT C?? C?G CCA C?C 344 Thr Gln ?sn Ser He Lys Val ?la Gln Trp Met He Gln Gln Pro His 85 90 95 ??? GC? GC? ?C? TTT TTT GG? TGC ?TT GGG ?T? G?T ??? TTT GGG G?G 392 Lys ?la ?la Thr Phe Phe Gly Cys He Gly He ?sp Lys Phe Gly Glu 100 105 110 ?TC CTG ??G ?G? ??? GCT GCT G?? GCC C?T GTG G?T GCT C?T T?C T?C 440 He Leu Lys ?rg Lys ?la ?la Glu ?la His Val ?sp ?la His Tyr Tyr 115 120 125 130 G?G C?G ??T G?G C?G CC? ?C? GG? ?CT TGT GCT GC? TGC ?TC ?CT GGT 88 Glu Gln ?sn Glu Gln Pro Thr Gly Thr Cys ?la ?la Cys He Thr Gly 135 140 145 G?C ??C ?GG TCC CTC ?T? GCT ??T CTT GCT GCT GCC ??T TGT T?T ?AA 536 Asp Asn Arg Ser Leu He Ala ?sn Leu ?la ?la ?la ?sn Cys Tyr Lys 150 155 160 ??G G?? ??? C?T CTT G?T CTG G?G ??? ??C TGG ATG TTG GT? G?? ??? 584 Lys Glu Lys His Leu ?sp Leu Glu Lys ?sn Trp Met Leu Val Glu Lys 165 170 175 GC? ?G? GTT TGT T?T ?T? GC? GGC TTT TTT CTT ?C? GTT TCC CC? G?G 632 ?la ?rg Val Cys Tyr He ?la Gly Phe Phe Leu Thr Val Ser Pro Glu 180 185 190 TC? GT? TTA AAG GTG GCT CAC CAT GCT TCT GAA AAC AAC AGG ATT TTC 680 Ser Val Leu Lys Val Ala His His Ala Ser Glu Asn Asn Arg He Phe 195 200 205 210 ACT TTG ??T CT? TCT GC? CCG TTT ?TT AGC CAG TTC TAC A?G G?? TC? 728 Thr Leu ?sn Leu Ser Ala Pro Phe He Ser Gln Phe Tyr Lys Glu Ser 215 220 225 TTG ATG AA? GTT ATG CCT TAT GTT GAT ATA CTT TTT GGA AAT GAG ACA 776 Leu Met Lys Val Mßt Pro Tyr Val Asp He Leu Phe Gly Asn Glu Thr 230 235 240 G?? GCT GCC ?CT TTT GCT AGA GAG CA? GGC TTT G?G ?CT ?? G?C ?TT 824 Glu ?la ?la Thr Phe Ala Arg Glu Gln Gly Phe Glu Thr Lys Asp He 245 250 255 A?? GAG ATA GCC AAA AAG AC? C?? GCC CTG CC? ?AG ATG A?C TCA AAG 872 Lys Glu He Ala Lys Lys Thr Gln Ala Leu Pro Lys Met Asn Ser Lys 260 265 270 ?GG C?G CG? ?TC GTG ATC TTC ACC C?? GGG ?G? G?T G?C ?CT ?T? ?TG 920 ?rg Gln ?rg He Val He Phe Thr Gln Gly ?rg ?sp ?sp Thr He Met 275 280 285 290 GCT ?C? G?? ?GT G?A GTC ACT GCT TTT GCT GTC TTG G?T C?? G?C CAG 968 ?la Thr Glu Ser Gl'. /?i Thr ?la Phe ?la Val Leu ?sp Gln ?sp Gln 295 300 305 ??? G?? ?TT ?TT G?T ACC ??T GG? GCT GG? G?T GC? TTT GTT GG? GGT 1016 Lys Glu He He ?sp Thr ?sn Gly ?la Gly ?sp ?la Phe Val Gly Gly 310 315 320 TTT CTG TCT C?? CTG GTC TCT G?C ??G CCT CTG ?CT G?? TGT ?TC CGT 1064 Phe Leu Ser Gln Leu Val Ser ?sp Lys Pro Leu Thr Glu Cys He ?rg 325 330 335 GCT GGC C?C T?T GC? GC? ?GC ?TC ?T? ?TT ?G? CGG ?CT GGC TGC ?CC 1112 ?la Gly His Tyr ?la ?la Ser He He He ?rg ?rg Thr Gly Cys Thr 340 345 350 TTT CCT G?G ??G CC? G?C TTC C?C TG?TGG?AG? GCTG??AAC? C??GCCC?GG 1166 Phe Pro Glu Lys Pro ?sp Phe His 355 360 ?GTC?G?C?C ?CCCC 1181 (9) I N FORMACIÓN PA RA SEC I D NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS D E SECU ENCIA: (A) LONGITUD: 362 aminoácidos (B) TI PO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (ix) DESCRIPCIÓN DE SECU ENCIA: SEC I D NO: 8: Met Ala Ala Ala Glu Glu Glu Pro Lys Pro Lys Lys Leu Lys Val Glu 1 5 10 15 Ala Pro Gln Ala Leu Arg Glu Asn He Leu Phe Gly Met Gly ?sn Pro 20 25 30 Leu Leu ?sp He Ser Ala Val Val Asp Lys Asp Phe Leu ?sp Lys Tyr 35 40 45 Ser Leu Lys Pro ?sn Asp Gln He Leu Ala Glu ?sp Lys His Lys Glu 50 55 60 Leu Phe ?sp Glu Leu Val Lys Lys Phe Lys Val Glu Tyr His ?la Gly 65 70 75 80 Gly Ser Thr Gln ?sn Ser He Lys Val ?la Gln Trp Met He Gln Gln 85 90 95 Pro His Lys ?la ?la Thr Phe Phe Gly Cys He Gly He ?sp Lys Phe 100 105 110 Gly Glu He Leu Lys ?rg Lys ?la Ala Glu Ala His Val Asp Ala His 115 120 125 Tyr Tyr Glu Gln Asn Glu Gln Pro Thr Gly Thr Cys Ala Ala Cys He 130 135 140 Thr Gly Asp Asn Arg Ser Leu He ?la ?sn Leu ?la ?la ?la ?sn Cys 145 150 155 160 Tyr Lys Lys Glu Lys His Leu ?sp Leu Glu Lys ?sn Trp Met Leu Val 165 170 175 Glu Lys ?la ?rg Val Cys Tyr He ?la Gly Phe Phe Leu Thr Val Ser 180 185 190 Pro Glu Ser Val Leu Lys Val ?la His His ?la Ser Glu ?sn ?sn ?rg 195 200 205 He Phe Thr Leu ?sn Leu Ser ?la Pro Phe He Ser Gln Phe Tyr Lys 210 215 220 Glu Ser Leu Met Lys Val Met Pro Tyr Val ?sp He Leu Phe Gly ?sn 225 230 235 240 Glu Thr Glu ?la ?la Thr Phe ?la ?rg Glu Gln Gly Phe Glu Thr Lys 245 250 255 ?sp He Lys Glu He ?la Lys Lys Thr Gln ?la Leu Pro Lys Met ?sn 260 265 270 Ser Lys ?rg Gln ?rg He Val He Phe Thr Gln Gly ?rg ?sp ?sp Thr 275 280 285 He Met ?la Thr Glu Ser Glu Val Thr ?la Phe Ala Val Leu Asp Gln 290 295 300 ?sp Gln Lys Glu He He ?sp Thr Asn Gly Ala Gly Asp Ala Phe Val 305 310 315 320 Gly Gly Phe Leu Ser Gln Leu Val Ser ?sp Lys Pro Leu Thr Glu Cys 325 330 335 He ?rg ?la Gly His Tyr Ala Ala Ser He He He ?rg ?rg Thr Gly 340 345 350 Cys Thr Phe Pro Glu Lys Pro ?sp Phe His 355 360 (10) INFORM?TION FOR SEQ ID NO: 9 : 0) I N FOR MACIÓN PA RA SEC I D NO : 9: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECU ENCIA : (A) LONGITU D: 1 181 pares de base (B) TI PO: ácido nucleico (C) ESTR UCTU RA DE CA D ENA : desconocida (D) TO PO LOG ÍA : desconocida (ii) TI PO DE MOLÉCU LA : A DN (genómico) (ix) DESCRI PCIÓN DE S ECU ENCIA : SEC I D NO: 9: GGGGTGTGTC TG?CTCCTGG GCTTGTGTTT TC?GCTCTTC C?TC?GTGG? ?GTCTGGCTT 60 CTC?GG???G GTGC?GCC?G TCCGTCT??T T?TG?TGCTT GCTGC?T?GT GGCC?GC?CG 120 G?T?C?TTC? GTC?G?GGCT TGTC?GAGAC C?GTTG?G?C ?G????CCTC C??C???TGC 180 ?TCTCC?GCT CC?TTGGT?T C??T??TTTC TTTCTGGTCT TGATCC??G? C?GC????GC 240 ?GTG?CTTC? CTTTCTGT?G CC?TT?T?GT GTC?TCTCTC CCTTGGGTG? ?G?TC?CG?T 300 TCGCTGCCTC TTTG?GTTC? TCTTTGGC?G GGCTTGTGTC TTTTTGGCT? TCTCTTT??T 360 GTCTTT?GTC TC???GCCTT GCTCTCT?GC ????GTGGCA GCTTCTGTCT C?TTTCC??? 420 ??GT?T?TC? ?C?T??GGC? T??CTTTC?T C??TG?TTCC TTGT?G??CT GGCT??T??? 480 CGGTGC?G?T ?G?TTC???G TG????TCCT GTTGTTTTC? G??GC?TGGT G?GCC?CCTT 540 T??T?CTG?C TCTGGGG??? CTGT??G??? ?AAGCCTGCT ATATAACAA? CTCTTGCTTT 600 TTCT?CC??C ?TCC?GTTTT TCTCC?G?TC ??G?TGTTTT TCCTTTTT?T ??C??TTGGC 660 AGC?GCAAG? TTAGCTATG? GGG?CCTGTT GTC?CCAGTG ATGCATGCAG CAC??GTTCC 720 TGTTGGCTGC TC?TTCTGCT CGTAGT?ATG AGCATCC?CA TGGGCTTCAG CAGCTTTTCT 780 CTTC?GGATC TCCCCA?ATT TATCTATCCC AATGCATCCA AAAAATGTTG CTGCTTTGTG 840 TGGCTGTTGA ?TC?TCC?CT G?GCC?CTTT ?ATTGAATTC TGGGTAGAGC CACCAGCATG 900 ?T?TTCG?CT TTGAATTTTT TCACAAGTTC ATCAAACAGT TCCTTGTGTT TGTCTTCAGC 960 CAAGATTTGG TCATTTGGTT TCAGAGAATA CTTATCAAGG AAATCTTTGT CCACT?CAGC 1020 AGAG?TGTCA AGCAG?GG?T TTCCCATTCC AAAGAGAATA TTTTCTCTCA GCGCTTGCGG 1080 CGCCTCC?CC TTCAGCTTTT TGGGCTTCGG CTCCTCCTCA GCAGC?GCC? TCTTCGCGCT 1140 CCCACCCCAC TTTGGCTCTA C?GCCCACCT CTGCCATCCA C 1181 (11) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 12 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) ESTRUCTURA DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 10: Lys Thr Gln Ala Leu Pro Lys Val Asn Ser Lys Arg 1 5 10 (12) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 26 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) ESTRUCTURA DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) ASPECTO: (A) NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado (B) LOCALIZACION: 5, 21, 25 (D) OTRA INFORMACIÓN: /marca= Xaa /nota= "Xaa = Desconocido" (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 11: Lys Phe Lys Val Xaa Tyt His Ala Gly Gly Ser Thr Gln Asn Ser Met 1 5 10 15 Lys Val Ala Gln Xaa Met He Gln Xaa Pro 20 25 (13) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 28 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) ESTRUCTURA DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 12: Ala Ala Thr Phe Phe Gly His He Gly He Asp Lys Phe Gly Glu He 1 5 10 15 Leu Lys Ser Lys Ala ?la ?sp ?la His Val ?sp ?la 20 25 (14) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) ESTRUCTURA DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) ASPECTO: (A) NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado (B) LOCALIZACION: 7,11 (D) OTRA INFORMACIÓN: /marca= Xaa /nota= "Xaa = Desconocido" (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 13: Thr Phe Thr Leu ?sn Leu Xaa ?la Pro Phe He Xaa Gln Phe Phe Lys 1 5 10 15 Glu ?la Leu (15) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) ESTRUCTURA DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 14: ?la Gly His Tyr ?la ?la Ser Val He He ?rg 1 5 10 (16) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 15: (¡) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 8 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) ESTRUCTURA DE CADENA: desconocida (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) ASPECTO: (A) NOMBRE/CLAVE: Sitio modificado (B) LOCALIZACION: 5 (D) OTRA INFORMACIÓN: /marca= Xaa /nota= "Xaa = Desconocido" (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 15: Lys Phe Lys Val Xaa Tyr His ?la 1 5 (17) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 23 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUCTURA DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (¡x) ASPECTO: (A) NOMBRE/CLAVE: Base_modificada (B) LOCALIZACION: 12 (C) MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: experimental (D) OTRA INFORMACIÓN: /evidencia = EXPERIMENTAL /mod_base = i /nota = "N = inosina" (ix) ASPECTO: (A) NOMBRE/CLAVE: Base_modificada (B) LOCALIZACION: 13 (C) MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: experimental (D) OTRA INFORMACIÓN: /evidencia = EXPERIMENTAL /mod_base = i /nota = "N = inosina" (ix) ASPECTO: (A) NOMBRE/CLAVE: Base_modificada (B) LOCALIZACION: 14 (C) MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: experimental (D) OTRA INFORMACIÓN: /evidencia = EXPERIMENTAL /mod_base = i /nota = "N = inosina" (ix) ASPECTO: (A) NOMBRE/CLAVE: Base_modificada (B) LOCALIZACION: 15 (C) MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: experimental (D) OTRA INFORMACIÓN: /evidencia = EXPERIMENTAL /mod_base = i /nota = "N = inosina" (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 16 AARTTYAARG TNNNNTAYCA YGC 23 (18) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) ESTRUCTURA DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 17: Gln Phe Phe Lys Glu Ala 1 5 (19) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 20: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUCTURA DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (¡i) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 18: GTYAARAARTTYCTYCG 17 (20) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 19: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 154 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) ESTRUCTURA DE CADENA: desconocida (D) TOPOLOGÍA: desconocida (i¡) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 19: Lys Phe Lys Val Gly Tyr His ?la Gly Gly Ser Thr Gln ?sn Ser Met 1 5 10 15 Lys Val ?la Gln Trp Met He Gln Glu Pro His ?rg ?la ?la Thr Phe 20 25 30 Phe Gly Cys He Gly He ?sp Lys Phe Gly Glu He Leu Lys Ser Lys 35 40 45 ?la ?la ?sp ?la His Val ?sp ?la His Tyr Tyr Glu Gln ?sn Glu Gln 50 55 60 Pro Thr Gly Thr Cys ?la ?la Cys He Thr Gly Gly ?sn ?rg Ser Leu 65 70 75 80 Val ?la ?sn Leu ?la ?la ?la ?sn Cys Tyr Xaa Lys Glu Xaa His Leu 85 90 95 ?sp Leu Glu ?sn ?sn Trp Met Leu Val Glu Lys ?la ?rg Val Tyr Tyr 100 105 110 He ?la Gly Phe Phe Leu Thr Val Ser Pro Glu Ser Val Leu Lys Val 115 120 125 ?la ?rg Tyr ?la ?la Glu ?sn ?sn ?rg Thr Phe Thr Leu ?sn Pro Ser 130 135 140 ?la Pro Phe He Ser Gln Phe Phe Lys Glu 145 150 (21) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 20: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 23 bases de pares (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUCTURA DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 20: GAATTCGTGG AGCCAAACCG CGG 23 (22) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 21: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 22 bases de pares (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUCTURA DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 21 AGAGTCAAGA TGGCAGCTGC GG 22 (23) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 22: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 bases de pares (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUCTURA DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 22: GTCTCTGCAG TCTCCACTCC 20 (24) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 23: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 bases de pares (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUCTURA DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 23: GCCTGAGTTG CTTTTCTTCC G 21 (25) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 24: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 bases de pares (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUCTURA DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 24: AATGATGCTG CTTTGTGTGG 20 (26) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 25: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 bases de pares (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUCTURA DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (¡i) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 25: TTGAATCATC CACTGAGCCA 20 (27) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 26: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 bases de pares (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUCTURA DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (¡i) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 26: GTGGATGGCA GAGGTGGGCT G 21 (28) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 27: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 22 bases de pares (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUCTURA DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 27: GCCAAAGTGG GGTGGGAGCG CG 22 (29) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 28: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 bases de pares (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUCTURA DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 28: GCCGGGAAGC AGTTGCTGTG G 21 (30) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 29: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 22 bases de pares (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUCTURA DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 29: GCTGCTGCCC GAGCGGACGT AG 22 (31) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 30: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 bases de pares (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUCTURA DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 30: GGGGTGTCTG CACTCCTGGG 20 (32) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 31: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 bases de pares (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUCTURA DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 31 CTTGTGTTTT CAGCTCTTCC 20 (33) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 32: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 43 bases de pares (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUCTURA DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (¡x) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 32: GTAACCTGCC ATGGCTCATA TGACGTCAGT CAGAGAAATA TTC 43 (34) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 33: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 38 bases de pares (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUCTURA DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 33: GGGGTGGGAG CGCGATATG GCTGCTGCTG AGGAGGAG 38 (35) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 34: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 bases de pares (B) TIPO: ácido nucleico (C) ESTRUCTURA DE CADENA: individual (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID NO: 34: AGTCTACAA CGAATCATTG 20

Claims

REIVINDICACIONES

1 - Un polinucleótido aislado y purificado que comprende una secuencia de nucleótido que consiste esencialmente de una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo que consiste de: a) la secuencia de SEC ID NO: 1 de la posición 16 de nucleótido a la posición 1098 de nucleótido, la secuencia SEC ID NO:4 de la posición 94 de nucleótido a aproximadamente la posición 1 128 de nucleótido, o la secuencia de SEC I D NO: 7 de la posición 51 de nucleótido a aproximadamente la posición 1 136 de nucleótido; b) secuencias que son complementarias a las secuencias de (a), y (c) secuencias que, cuando se expresan, codifican un polipéptido codificado a través de una secuencia de (a) . 2.- El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1 , que es una molécula de ADN . 3.- El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la secuencia de nucleótido es SEC I D NO: 1 , 4 o 7. 4.- Un vector de expresión que comprende la molécula de ADN de la reivindicación 2. 5.- El vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 4 , en donde ei polinucleótido tiene la secuencia de nucleótido de SEC I D NO : 1 de la posición 16 de nucleótido a aproximadamente la posición 1098 de nucleótido, la secuencia SEC ID NO:4 de la posición 94 de nucleótido a aproximadamente la posición 1 128 de nucleótido, o la secuencia de SEC I D NO:7 de la posición 51 de nucleótido a aproximadamente la posición 1 136 de nucleótido. 6.- Un oligonucleótido de aproximadamente 15 a aproximadamente 50 nucleótidos que contienen una secuencia de nucleótido de por lo menos 15 nucleótidos que es idéntica o complementaria a una secuencia contigua del polinucleótido de la reivindicación 1 . 7.- Una célula huésped transformada con el vector de expresión de la reivindicación 4 o la reivindicación 5. 8. - La célula huésped transformada de acuerdo con la reivindicación 7 que es una célula huésped eucariótica o una célula huésped bacteriana. 9. La célula huésped transformada de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la célula huésped es una cepa de E. coli designada BL21 (DE3)/pET21 AK5, BL21 (DE3)/pET21 AK18, HMS 174(DE3)/pET21 AK5 o HMS 174(DE3)/pET21 AK18. 10. Un procedimiento para hacer adenosina-cinasa que comprende transformar una célula huésped con el vector de expresión de la reivindicación 4, manteniendo la célula transformada durante un período suficiente para la expresión de la adenosi na-cinasa y recuperar la adenosina-cinasa. 11 - El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la célula huésped es una célula huésped eucariótica o una célula huésped bacteriana. 12.- El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el polinucleótido tiene la secuencia de nucleótido de SEC I D NO: 1 de la posición 16 de nucleótido a aproximadamente la posición 1098 de nucleótido, la secuencia SEC I D NO:4 de la posición 94 de nucleótido a aproximadamente la posición 1 128 de nucleótido, o la secuencia de SEC I D NO:7 de la posición 51 de nucleótido a aproximadamente la posición 1 136 de nucleótido. 13.- Un polinucleótido aislado y purificado de menos de 365 residuos de aminoácido que comprende por lo menos uno de: a) de la posición de residuo 7 a la posición de residuo 18 de SEC I D NO:8; b) de la posición de residuo 26 a la posición de residuo 86 de SEC I D NO: 8; c) de la posición de residuo 100 a la posición de residuo 1 17 de SEC ID NO: 8¡ d) de la posición de residuo 122 a la posición de residuo 146 de SEC I D NO: 8; e) de la posición de residuo 153 a la posición de residuo 170 de SEC ID NO:8; f) de la posición de residuo 172 a la posición de residuo 181 de SEC I D NO: 8; g) de la posición de residuo 183 a la posición de residuo 200 de SEC I D NO: 8; h) de la posición de residuo 210 a la posición de residuo 222 de SEC I D NO:8; i) de la posición de residuo 230 a la posición de residuo 262 de SEC ID NO:8; j) de la posición de residuo 279 a la posición de residuo 289 de SEC ID NO:8; k) de la posición de residuo 31 1 a la posición de residuo 329 de SEC I D NO:8; I) de la posición de residuo 331 a la posición de residuo 345 de SEC ID NO:8; y m) de la posición de residuo 347 a la posición de residuo 359 de SEC ID NO:8. 14.- El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 13, que tiene la secuencia de residuo de aminoácido de SEC I D NO:2 , 5 u 8. 15. - Una adenosina-cinasa humana recombinante. 16.- La adenosina-cinasa de acuerdo con la reivindicación 15, que tiene menos de aproximadamente 362 residuos de aminoácidos y que comprende la secuencia de residuo de aminoácido del residuo 5 al residuo 345 de SEC ID NO: 5