MXPA97009221A - Regiones intergeneticas del virus de la parte superior del racimo de platanos - Google Patents

Abstract

Una molécula de ADN que es un fragmento parcial de una región intergénica de un componente de BBTV o en forma alterna cuya molécula ADN se deriva de tal región intergénica con lo cual la molécula de ADN es capaz de promover, mejorar, regular o modificar la transcripción de un gen BBTV.

Description

REGIONES INTERGENICAS DEL VIRUS BANANA BUNCHY TOP CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona a secuencias de ADN del virus banana bunchy top (BBTV) y en particular a las regiones intergénicas de los componentes l a ß. TÉCNICA PREVIA La enfermedad banana bunchy top (BBTD) es la enfermedad viral más importante de los plátanos (Date, 1987, Advances in Virus Research 33 301-325) . La enfermedad está propagada en Asia y el Pacífico del Sur y tiene distribución limitada en Australia y África. No se ha reportado de las Américas. La enfermedad se consideró que originalmente que era causada por un luteovirus ya que era persistentemente transmitida por áfidos pero no transmitida mecánicamente, induce síntomas tipo amarilleo y plantas infectadas que tienen floema dañado. Sin embargo, recientemente partículas tipo virus isométricas de 18-20 nm (VLPs) se han purificado de plantas infectadas y han demostrado estar asociadas con la enfermedad (Harding y colaboradores, 1991, Journal of General Virology 72 225-230; Thomas & Dietzgen, 1991, Journal of General Virology 72 217-224; Wu y Su, 1990, Journal of Phytopathology 128 153-160) . Harding y colaboradores (Harding y colaboradores, 1991, Journal of General Virology 72 225-230; Harding y colaboradores, 1993, Journal of General Virology 74 323-328) han aislado ADN de hebra sencilla circular, de aproximadamente 1 kb de estos VLPs y clonado y secuenciado un componente ssADN. Este componente, conocido como el componente ADN BBTV 1, tiene un gran molde de lectura abierto (ORF = Open Reading Frame) en el sentido virión y codificado una replicasa putativa. Este componente se transmite con la enfermedad por áfidos . En Burns y colaboradores, 1994, Arch Virol 137 371-380, reportaron la clonación y secuenciado de un segundo componente de BBTV. Encontraron Othat una secuencia de 93 nucleótidos se conservaba fuertemente entre dos componentes genómicos ssADN de BBTV. Dos cebadores o imprimadores proyectantes hacia afuera se designaron de esta secuencia y emplearon en una reacción de cadena polimerasa (PCR = Polymerase Chain Reaction) con ADN que se extrae a partir de viriones BBTV purificado. Productos amplificados con PCR consisten de al menos siete bandas distintas todas con aproximadamente 1 kb y que representan posiblemente dsADN BBTV de longitud íntegra se resolvieron. Los productos amplificados por PCR se clonaron y los clones se clasificaron por análisis de enzima de restricción. Cuatro grupos de análisis de restricción distinto se identificaron. Esta referencia concluye que el genoma de BBTV contiene al menos cinco componentes y que BBTV pertenece a un grupo previamente no descrito de virus de plantas que también contienen el virus de atrofia de trébol subterráneo (subterranean clover stunt) . En Karan y colaboradores, 1994, Journal of General Virology 75 3541-3546, se hace mención de componente BBTV 1 a partir de aislados de 10 diferentes países que se clonan y secuencían y las secuencias se alinean y comparan subsecuentemente. Este análisis indica dos grupos: el grupo del Pacífico del Sur (aislados de Australia, Burundi, Egipto, Fiji, India, Tonga y Samoa Occidental) y el grupo Asiático (aislados de las Filipinas, Taiwán y Vietnam) . La diferencia de secuencia promedio dentro de cada grupo fue 1.9 a 3.0% y entre aislados de los dos grupos fue aproximadamente 10%, pero algunas partes de las secuencias difieren más que otras. Sin embargo, la proteína codificada por el molde de lectura abierto principal difirió en aproximadamente 5%. La región desde el principio de la secuencia de asa-tallo a la caja TATA potencial fue idéntica en todos los aislados excepto por un cambio de dos nucleótidos en el aislado de Samona Occidental y un solo cambio en el aislado NSW. Estos resultados, junto con otra evidencia sugieren que BBTV se ha difundido a plátanos después del movimiento inicial de plátanos de las regiones del Asia Pacífico al África y las Américas.

En Xie y colaboradores, 1995, Phytopathology 85 339-347; el aislado Hawaiiano de BBTV se purificó de cultivador de plátanos infectados Williams (banana cultivar Williams) . Tres componentes de ADN de una sola hebra (ssADN) se clonaron y secuenciaron; se nombraron componentes 1, 3 y 4, respectivamente. El componentes 1 es de 1,110 nucleótidos de longitud y comparte 98% de identidad de la secuencia de nucleótido con el componente ADN BBTV 1 del aislado australiano como se describe por Harding y colaboradores (1993), anteriormente. Este componente contiene dos moldes de lectura abiertos (ORF = Open Reading Frames) capaces de codificar una proteína de 33.5 kDa, que puede funcionar como una replicasa, y una proteína de aproximadamente 15.2 kDa con funciones desconocidas. El componente 3 es de 1,057 nucleótidos de longitud y no contiene ningunos ORFs más grandes que 10 kDa. El componente 4 es de 1,017 nucleótidos de longitud y codifica potencialmente una proteína de 18.9 kDa. Todos los tres componentes ssADN tienen la misma secuencia de asa-tallo y tienen una región no codificadora conservada. La secuencia de cada uno de estos tres componentes es diferente de aquélla de los componentes ADN BBTV de dos aislados taiwaneses . Clones específicos BBTV se emplearon en ensayo de hibridización de manchado de puntos para detección de BBTV en plantas, utilizando sondas radioactivas y no radioativas. Un ensayo de reacción en cadena polimerasa (PCR - Polymerase Chain Reaction) se desarrolló para detección de BBTV en muestras de plátano y ensayos de hibridización de manchado de puntos con áfidos sencillos, fueron tan sensibles como el ensayo inmunosorbente enlazado por enzima (ELISA) , mientras que PCR fue 1,000 más sensible que los ensayos de manchado de puntos y ELISA para detección de BBTV en plátanos. Aunque las así denominadas regiones intergénicas de componentes genómicos 1, 3 y 4 se han detectado por Harding y colaboradores, 1993 arriba; y Xie y Hu, 1995, arriba. La única característica de estas regiones intergénicas ha sido una estructura de asa-tallo en el componente 1 como se describe por Harding y colaboradores, 1993, arriba. En una solicitud previa, (es decir la Solicitud Internacional PCT/AU95/00311) se hace referencia a los componentes BBTV 3, 4 y 6, que se reclaman per se. Las regiones fuera de las regiones ORF (es decir las así denominadas "regiones intergénicas") también se han descrito en esta previa solicitud. Los componentes genómicos 1, 3 y 4 descritos por Xie y Hu, 1995, arriba, corresponden a los componentes 1, 2 y 5 referidos en la solicitud previa PCT/AU95/00311.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Sorprendentemente, ahora se ha descubierto que las regiones intergénicas de componentes genómicos BBTV 1 a 6, o sus partes, tienen secuencias derivadas, capaces de promover, mejorar, regular o modificar transcripción de genes no BBTV. La invención por lo tanto induce dentro de su alcance, las regiones intergénicas anteriormente mencionadas, cuando se emplea para promover, mejorar, regular o modificar transcripción de un gen no-BBTV, así como sus partes, secuencias derivadas de ahí y sus mutantes per se. En la invención también se incluye dentro de su alcance una molécula de ADN que es un fragmento parcial de una región intergénica de un componente BBTV o alternativamente esta molécula de ADN se deriva de la región intergénica con lo que la molécula de ADN es capaz de promover, mejorar, regular o modificar la transcripción de un gen no-BBTV. El fragmento parcial se define en esta especificación por ser una secuencia inferior que la secuencia íntegra de la región intergénica de un componente BBTV pero igual a o mayor que una secuencia de aproximadamente 172 pares base desde un componente BBTV. La secuencia de la molécula ADN puede ser idéntica a la secuencia complementaria del fragmento parcial de una región intergénica de un componente BBTV. La región intergénica se emplea en esta especificación para definir la región no codificadora de un componente BBTV o la región fuera del ORF en un componente BBTV. La secuencia de la molécula ADN puede ser substancialmente idéntica o substancialmente complementaria al fragmento parcial de la región intergénica de los componentes BBTV 1-6. Substancialmente se emplea en esta especificación para referirse a secuencias que tienen variaciones hasta de 20%. La cantidad de variación de secuencia puede determinarse por procedimientos de hibridización standard o comparación de secuencias. El porcentaje de 20% es la variación ilustrada con la región fuera del ORF del componente 1, entre diferentes aislados geográficos (Karan y colaboradores, 1994, Journal of General Virology, 75, 3541-3546; y la Solicitud de Patente de los E.U.A. No. 08/202186) . Ambos de estos documentos aquí se incorporan por referencia para soportar la reivindicación de 20% de variación de todos los componentes de BBTV. La variación determinada para el componente 1 de diferentes aislados geográficos es representativa de la variación entre cada componente de diferentes aislados geográficos. Esta variación hasta del 20% también se aplica a las secuencias de los componentes 2 a 6 discutidos a continuación. El término derivado define cualquier secuencia que se ha cambiado, alterado o modificado por cualquier procedimiento incluyendo mutagénesis a partir de un fragmento de la región intergénica de un componente BBTV. En particular, la secuencia de la molécula ADN puede ser los insertos derivados de la región intergénica BBTV de pBT6.1 (fragmento de aproximadamente 623 pares base), pBT6.2 (fragmento de aproximadamente 351 pares base) , pBT6.3 (fragmento de aproximadamente 239 pares base) y pBT6.4 (fragmento de aproximadamente 172 pares base) del componente 6; pBTl.l (fragmento de aproximadamente 214 pares base) , pBTl INT (fragmento de aproximadamente 980 pares base) del componente 1; pBT2.1 (fragmento de aproximadamente 855 pares base) del componente 2; pBT3.1 (fragmento de aproximadamente 526 pares base) del componente 3; pBT4.1 (fragmento de aproximadamente 659 pares base) del fragmento 4; pBT5.1 (fragmento de aproximadamente 454 pares base) del componente 5. La molécula ADN puede ser la región de 275 pares base que incluye CR-M que está presente en el inserto de pBT6.1, pero no en el inserto de pBT6.2. La región de 275 pares base puede ser una región regulatoria. La molécula de ADN puede comprender la región entre o incluir la región CRSL y ATG del molde de lectura abierto de cualquiera de los componentes BBTV 1 a 6. Los insertos de pBTl .1, pBT2.1, pBT3.1, pBT4.1, pBTS.l y pBT6.1 se ilustran en la Figura 11. La Figura 12 muestra la secuencia del inserto pBTl.INT. La Figura 13 muestra la secuencia ADN de los insertos (a)pBT6.1; (b) pBT6.2; (c) pBT6.3; y (d) pBT6.4. El gen no-BBTV puede ser cualquier gen conveniente tal como GUS, NPTII, gen de resistencia a insecticida, gen de resistencia a herbicida o un gen promotor de crecimiento. La molécula ADN puede transcribir el gen el cualquier huésped eucariota o procariota conveniente. De preferencia, la molécula ADN puede transcribir el gen en una célula de planta monocotiledónea, tal como células de planta de células de trigo, Muse spp (plátano) . La molécula ADN puede transcribir el gen en una planta monocotiledónea tales como plátano y trigo. De preferencia, la molécula ADN puede transcribir el gen en una célula de planta dicotiledónea tal como células de tabaco y calabacita o zapallito italiano. La molécula ADN puede transcribir el gen en una planta dicotiledónea tal como tabaco y calabacitas. La molécula de ADN de preferencia transcribe el gen en células de tejido no diferenciado en una planta dicotiledónea.

En un segundo aspecto, la invención es un vector o cartucho quimérico de ADN, que tiene una molécula ADN como se describió anteriormente corriente arriba de un gen de interés para permitir la promoción, mejora, regulación o modificación de transcripción del gen. El vector quimérico puede derivarse de pB/101.3. El vector puede ser cualquier construcción conveniente mencionada a continuación. El cartucho puede ser cualquier construcción conveniente mencionada a continuación. El gen de interés puede ser cualquier gen conveniente como se mencionó anteriormente . El vector o cartucho quimérico puede introducirse en cualquier huésped conveniente incluyendo células de plantas monocotiledóneas y células de plantas dicotiledóneas para expresión en el huésped. La invención en un tercer aspecto, es una célula de planta que tiene una molécula de ADN como se describió anteriormente . La invención en un cuarto aspecto es una planta con las células de planta como se describió anteriormente. La invención en un quinto aspecto proporciona un método para expresar un gen no BBTV en una célula de planta utilizando la molécula de ADN como se describió anteriormente . La invención ahora se describirá con referencia a modalidades preferidas. Sin embargo, estas modalidades preferidas se dan a manera de ejemplo. El ejemplo 1 describe el descubrimiento e identificación de los tres componentes adicionales de BBTV y se incorpora en la especificación por conveniencia para permitir una persona con destreza en la especialidad el aislar sus componentes BBTV. Esta información esencialmente se ha publicado en Burns y colaboradores, 1995, Journal of General Virology, 76, 1471-1482) . EXPERIMENTAL EJEMPLO 1; COMPONENTES BBTV MÉTODOS Síntesis y clonación de cADN. Plátanos con síntomas característicos de la enfermedad "banana bunchy top" se recolectaron de la región Nambour de S-E Queensland. Partículas de BBTV se purificaron como se describe por Wu & Su, 1990, Journal of Phytopathology 128 153-160 y Thomas & Dietzgen, 1991, Journal of General Virology 72 217-224. Se extrajo ácido nucleico de viriones como se describe por Francki y Randles, 1973, Virology 54 359-368. ADN de doble hebra se sintetizó como se describe por Gublor & Hoffman, 1983, Gene 25 263-269 utilizando hexámeros aleatorios (Bresatec) para cebar o imprimar la síntesis de primera hebra. El dsADN se trata con nucleasa de grano o de frijol mung (Promega) y liga en vector plásmido digerido Smal pUC18 (Uporoft y Healey, 1987, Gene 5169-75) . El plásmido luego se emplea para transformar la cepa Escherichia coli JM109 (Hanahan, 1983, Journal of Molecular Biology 166 557-580) y clones recombinantes potenciales se identificaron al clasificar el substrato X-gal (Vieira & Messing, 1982, Gene 19 259-268) . Se aislaron plásmidos bajo el método de lisis alcalina (Sambrook y colaboradores, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York; Cold Spring Harbor Laboratory) . Se cortaron insertos por digestión con EcoRI/hindIII, sometieron a electroforésis en geles de agarosa y tiñeron capilarmente en Hybond N+ (Amersham) utilizando 0.4 M NaOH (Sambrook y colaboradores, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York; Cold Spring Harbor Laboratory) . Insertos para utilizar como sondas ADN se purificaron a partir de geles de agarosa utilizando un equipo Gene-Clean (Bresatec) . Sondas ADN se etiquetaron utilizando un equipo de etiquetado Ready-To-Go (Pharmacia) como se recomienda por el fabricante. Se realizaron prehibridizaciones e hibridizaciones como se describe por Burns y colaboradores, 1994, Archives of Virology 137 371-380. Secuenciado y análisis de secuencia. Mini-preparaciones de clones BBTV respectivos se prepararon por lisis alcalina seguido por precipitación de polietilen glicol (Haftori & Sakaki, 1986, Analytical Biochemistry 152 232-238) . El secuenciado se realizó utilizando 35SdATP y un equipo Sequenase (US Biochemcals) como se recomienda por el fabricante. Se sometieron a electroforésis los productos de reacción en 8% (p/v) en gel de poliacrilamida que contiene urea 7 M. Geles se fijaron, secaron y expusieron a película de rayos-X. Los imprimadores empleados para secuenciar ya fueron imprimadores de secuenciado universal o imprimadores 17-30 nt complementarios a regiones apropiadas del ADN viral clonado, que se sintetiza utilizando un PCR Mate de Applied Biosytems (ABI) y procesaron como se recomienda por el fabricante . Productos PCR para secuenciar se purificaron de geles de agarosa utilizando un equipo Gene-Clean (Bresatec) . ADN se secuenció utilizando un equipo Sequenase (USB) esencialmente como se describe por el fabricante. La desnaturalización del ADN plantilla (500 ng) se realizó por ebullición siguiendo a la adición de DMSO y 3 pmoles de imprimador de secuenciado. Se analizaron secuencias de nucleótido utilizando el paquete de análisis GCG versión 8 disponible a través de la instalación de cómputo ANGIS en la Universidad de Sydney, Australia. Las secuencias de nucleótido y aminoácido se alinearon utilizando el paquete de soporte lógico (software) Clustal V (Higgins y colaboradores, 1991, CABIOS 8 189-191) . Cuatro bases de datos de ADN (GenBank, GenBank actualizaciones semanales, EMBL y EMBL actualizaciones semanales) y cinco bases de datos de proteínas (SwissProt, SwissProt actualizaciones semanales, PIR, GenPeptide Proteins y GenPeptides actualizaciones semanales) se buscaron para homologías de secuencia con secuencias de amino ácidos deducidas y nucleótidos BBTV utilizando dos programas para análisis de búsqueda de base de datos. FASTA (Pearson & Lipman, 1988, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 852444-2448) y BLAST (Altschul y colaboradores, 1990, Journal of Molecular Biology 215 403-410) . PCR: Análisis y clonación. Utilizando las secuencias de nucleótidos respectivas de los clones (i) pBTRP-11, 20, 80 y 88 y (ii) pBTRP-Pl y P2 y las secuencias de nucleótido de los componentes BBTV 1 (Harding y colaboradores, 1993, Journal of General Virology 74 323-328) y 2, tres conjuntos de imprimadores que se extienden hacia afuera inmediatamente adyacentes (i) imprimador A: 5 GCATCCAACGGCCCATA 3%; imprimador B: 5' CTCCATCGGACGATGGA 3l; (ii) imprimador C: 5l TATTAGTAACAGCAACA 3 *; imprimador D: 5 CTAACTTCCATGTCTCT 3 ; (iii) imprimador E: 5* CGGGa/tATa/cTGATTGt/gGT 3 \- e imprimador F: 5 TACa/tTTTGTCATAGc/tGT 3 se sintetizaron y utilizaron en un PCR con ADN BBTV como plantilla como se describe por Burns y colaboradores, 1994, Archives of Virology 137 371-380) . Los productos amplificados se clonaron utilizando el equipo de clonación TA (Invitrogen) en los vectores plásmido pCRII o pCR200 como se recomienda por el fabricante o en pUC 19 con coleo T y Bluescript (Marchuk y colaboradores, 1990, Nucleic Acids Research 19 1154) . Clones recombinantes se seleccionaron utilizando el substrato X-gal en agar Luria Bertani (LB) que contiene el antibiótico apropiado y plásmidos aislados utilizando el método de lisis alcalina (Sambrook y colaboradores, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio) New York; Cold Spring Harbor Laboratory) . Clones con insertos de longitud íntegra (aproximadamente 1 kb) se seleccionaron para secuenciado) . Polaridad de ssADN virión. ssADN de BBTV se extrae, somete a electroforésis en agarosa y teñido capilarmente en membranas de nylon duplicadas (Harding y colaboradores, 1993, Journal of General Virology 74 323-328) . Para el componente 2, un equipo de etiquetado para extremo 3 ? ADN (Boehringer Mannheim) se emplea para preparar sondas de hibridización específicas de oligonucleótido de hebra etiquetadas 32P (imprimador BT2F5.30 (G) 5X GGTCCCCTTTAAGATTCCTTCTTCGTCGC 3 -imprimador BT2R5.30 (H) : 5 CGGAAAATGAATAAGTATGAGGTGAAAGAG 3 x ) . Membranas se prehibridizaron e hibridizaron por 12 y 20 horas respectivamente en Rapid-hyb (Amersham) a 60°C. Se lavaron filtros una vez con 1% SDS, 2xSSC (0.3 M NaCl, 0.03 M citrato de sodio, pH 7.0) a temperatura ambiente seguido por lavados con 2xSSC a 65°C. Las membranas secas se expusieron a película de rayos-X a -80°C utilizando filtros de intensidad. Para los componentes 3, 4, 5 y 6, se emplearon sondas ARN específicas de hebras. Transcripciones ARN de longitud íntegra de clones BBTV de longitud íntegra de cada uno de los cuatro componentes, se sintetizaron utilizando una ribosonda en el equipo de transcripción in vitro (Promega) como se recomienda por el fabricante. RESULTADOS Clonación y secuenciado de cinco componentes genómicos Cinco componentes genómicos de BBTV se clonaron y secuenciaron de dos bibliotecas (i) una biblioteca imprimada en forma aleatoria y (ii) una biblioteca PCR. (i) Biblioteca Imprimada Aleatoria Una biblioteca imprimada aleatoria se generó a partir de ssADN BBTV que se extrae de viriones purificados. El dsADN resultante se trata con nucleasa de frijol mung, ligada por extremo despuntado o romo en pUC 18 cortado con Smal y clonaron en E. coli JM109. Esta biblioteca se clasifica con ADN etiquetado 32P de viriones BBTV, plátanos sanos y el inserto de pBT338 que fue un clon parcial del componente ADN BBTV 1 (Harding y colaboradores, 1991, Journal of General Virology 72 225-230; Harding y colaboradores, 1993, Journal of General Virology 74 323-328) . Componente ADN BBTV 2: Cuatro clones, pBTRP-11, 20, 80 y 88, hibridizados con ADN virión BBTV y entre sí pero no con ADN de plátano sano o pBT338. Los insertos de estos clones se secuenciaron; pBTRP-20 y 88, cada uno con insertos de 220 bp, tuvieron secuencias idénticas; pBTRP-80 tuvo un inserto de 188 bp y tuvo una secuencia de 148 bp idéntica a pBTRP-20 y 88 y además una secuencia de 40 bp en un extremo que fue única; la secuencia del inserto de 115 bp de pBTRP-11 fue idéntica a la región equivalente de pBTRP-20 y 88. Dos imprimadores que se proyectan hacia afuera inmediatamente adyacentes, los imprimadores A y B, se diseñaron de la secuencia de translape de los cuatro clones tales que estos imprimadores imprimaran la amplificación de las copias dsADN de longitud íntegra de una molécula ssADN circular (Harding y colaboradores, 1993, Journal of General Virology 74323-328) . ssADN virión BBTV se amplifica por PCR utilizando estos imprimadores y polimerasa ADN Pfu y el producto clonó en pCR2000. Cuatro de los clones resultantes se secuenciaron en ambas direcciones utilizando imprimadores de avance y retroceso universales e imprimadores específicos de secuencia. Tres de estos clones contienen insertos 1060 bp y un clon contiene un inserto de 1059 bp. Los cuatro clones tuvieron secuencias idénticas excepto por nueve cambios de nucleótido sencillo incluyendo una eliminación. Además, las secuencias de los cuatro clones cADN originales se encontraron dentro de los cuatro clones PCR. La secuencia de consenso de este componente, denominado componente ADN BBTV 2, se compila (Figura la) y compara con la secuencia del componente ADN de BBTV l (Harding y colaboradores, 1993, Journal of General Virology 74 323-328); las dos secuencias fueron esencialmente diferentes de las dos regiones significantes de homología. Componente BBTV ADN 6: Dos clones adicionales de la misma biblioteca imprimada aleatoria, pBTRP-Pl y P2 también se hibridizaron con ADN virión BBTV etiquetado pero no con ADN de los plátanos sanos o pBT338. Sin embargo, los insertos de estos clones ambos fueron de aproximadamente 1 kb, se digirieron con EcoRV mientras que ninguno de los componentes 1 o 2 tuvieron sitios EcoRV. Los dos clones se suecuenciaron parcialmente utilizando imprimadores de avance y retroceso universales. Las secuencias de ambos clones fueron idénticas pero claramente diferentes de aquélla de los componentes 1 y 2. De nuevo, dos imprimadores que se extienden hacia afuera, inmediatamente adyacentes, imprimadores C y D, se diseñaron a partir de la secuencia y se sintetizaron. ssADN de virion BBTV, se emplearon como una plantilla con estos dos imprimadores en una reacción PCR y el producto resultante clonó en un vector Bluescript cola-T. Un clon de longitud íntegra aparente pBT-P2Al, se elige y secuencia en ambas direcciones a partir de sub-clones generados por la digestión de exonucleasa III e imprimadores de avance y retroceso universales y específicos de secuencia. La secuencia de componente final 6 de 1089 bp luego se compiló (Figura le) . (ü) Biblioteca PCR Cuando las secuencias de componentes 1 y 2 se compararon, se identificaron dos regiones de homología. La primer región, posteriormente definida como la región común de asa-tallo (CR-SL) incluye la secuencia de asa/tallo potencial brevemente identificada en el componente l (Harding y colaboradores, 1993, Journal of General Virology 74 323-328) ; la segunda región, que está contenida dentro de la región posteriormente definida como la región común principal (CR-M) , fue una secuencia aproximada de 66 nucleótidos 5 a la secuencia de asa-tallo. Se hipotetizó que todos los componentes genómicos BBTV habrán de contener una CR-M y por lo tanto dos imprimadores degenerados que se extienden hacia afuera, inmediatamente adyacentes, los imprimadores E y F, se diseñaron de esta región, sintetizaron y proyectaron por PCR utilizando ssADN virión BBTV como una plantilla (Burns y colaboradores, 1994, Archives of Virology 137 371-380) . Siete productos, cada uno de aproximadamente 1 kb, se resolvieron por electroforésis en gel de poliacrilamida. Los productos se clonaron en pCRII. Los clones resultantes se dividieron en tres grupos, grupos B, C y D, en base a que hibridizaron con el ADN virión BBTV pero no ADN a partir de plátanos sanos y que cada grupo tuvo patrones de restricción diferentes a los otros dos grupos y a los componentes 1, 2 y 6 (Burns y colaboradores, 1994, Archives of Virology 137 371-380). Un grupo, el grupo A tuvo un patrón de restricción indistinguible de aquél del componente 2 y posteriormente se confirmó por secuenciado que los clones del grupo A representan clones del componente 2. Se considera que cada grupo de clones representa un nuevo y único componente ADN BBTV. Para cada grupo de clones, tres clones (componente 3) o cuatro clones (componentes 4 y 5) se secuenciaron parcialmente utilizando imprimadores de avance y retroceso universal . En cada instancia, todos los clones dentro de un grupo tuvieron secuencias idénticas en donde estas secuencias se translapan excepto por 1 o 2 cambios de nucleótidos sencillo. Además, las secuencias de cada grupo fueron diferentes entre sí y a las secuencias de los componentes 1, 2 y 6. Un clon de cada grupo o componente se elige y secuencia completamente en ambas direcciones . De manera importante, cada uno de estos grupos de clones se generó utiizando imprimadores degenerados que cubren una secuencia de 34 nucleótidos derivados de la CR-M conservada de los componentes 1 y 2. La CR-M de los componentes 1 y 2 no se conservó completamente y de esta manera se esperaba que la secuencia CR-M hipotetizada variaría entre otros componentes. Por lo tanto, los imprimadores convergentes únicos a cada componente se diseñaron y emplearon para amplificar una secuencia que incluye CR-M por cada componente de ssADN de virión BBTV. El producto PCR resultante se secuencia directamente utilizando los imprimadores convergentes específicos de dos componentes . Componente ADN BBTV 3: El componente 3 (clon Grupo C pBTP-64) se secuenció en ambas direcciones a partir del clon original y de sub-clones generados por fragmentos de digestión o restricción de exonucleasa III utilizando imprimadores de avance y retroceso universales y tres imprimadores específicos de secuencia. Dos imprimadores convergentes adicionales se diseñaron de esta secuencia para amplificar un producto de 380 bp incluyendo la CR-M. La secuencia de este producto fue idéntica a la de pBTP-64 excepto por cinco cambios de nucleótidos sencillos, cuatro de los cuales estuvieron cubiertos en secuencia por los imprimadores degenerados originales y uno fuera de esta secuencia en el nucleótido 947. La secuencia de componente final 3 de 1075 bp luego se compiló (Figura Ib) . Componente ADN BBTV 4: El componente 4 (clon Grupo D pBTP-62) se secuencia en ambas direcciones a partir del clon original y de los sub-clones generados por la digestión de exonucleasa III utilizando imprimadores de avance y retroceso universales y tres imprimadores específicos de secuencia. Dos imprimadores convergentes adicionales se diseñaron de esta secuencia para amplificar un producto de 350 bp incluyendo la CR-M. La secuencia de este producto fue idéntica a la de pBTP-62 excepto por dos cambios de nucleótido sencillo en la secuencia cubierta por los imprimadores degenerados originales. La secuencia de 4 componentes final de 1043 bp luego se compiló (Figura lc) . Componente ADN BBTV: El componente 5 (clon Grupo B pBTP-129) se secuencia en ambas direcciones a partir del clon original y de los sub-clones generados por la digestión de exonucleasa III, utilizando imprimadores de avance y retroceso universales y tres imprimadores específicos de secuencia. Dos imprimadores convergentes adicionales se diseñaron a partir de esta secuencia para amplificar un producto de 290 bp incluyendo la CR-M. La secuencia de este producto fue idéntica a la de pBTP-129 excepto por cuatro cambios de nucleótido sencillo en la secuencia cubierta por los imprimadores degenerados originales. La secuencia de 5 componentes final de 1018 bp luego se compiló (Figura Id) . Orientación de componentes genómicos y asociación con la enfermedad banana bunchy top. Previamente hemos mostrado que el genoma BBTV está encapsidado como ADN de hebra sencilla (Harding y colaboradores, 1991, Journal of General Virology 72 225-230; Harding y colaboradores, 1993, Journal of General Virology 74 323-328) . Para determinar la orientación de cada componente en viriones, se sintetizaron sondas ADN o ARN específicas de hebra para cada componente e hibridizaron con ADN virión BBTV. Las sondas específicas de componente 2 fueron dos oligonucleótidos 30-mero etiquetados con extremo 3 v mientras que sondas específicas para componentes 3, 4, 5 y 6 fueron transcripciones ARN etiquetadas 32P-promovidas por SP6, T3 o T7. Por cada componente, las sondas cuya secuencia fue complementaria a la secuencia de componentes, presentadas en la Figura 1, se hibridizaron fuertemente a ADN de virión BBTV mientras que las sondas cuya secuencias fueron las mismas que en las secuencias de la Figura 1, no se hibridizaron (Figura 2) .

Esto indica que cada componente fue encapsulado como ssADN y solo en una orientación, la presentada en la Figura 1. Además, las sondas específicas de hebra y componente que se hibridizaron con ssADN de virión BBTV se emplearon como sondas para demostrar que cada componente fue asociado con la enfermedad banana bunchy top. Extractos de ADN de planta de tres (para el componente 2) o cuatro (para los componentes 3 a 6) diferentes aislados BBTV y ADN de cuatro plátanos sanos, se sometieron a teñido Southern e hibridizaron con cada sonda. Cada sonda específica de componente hibridizada con un ADN de bajo peso molecular de tamaño esperado en todos los extractos a partir de plátanos infectados con BBTV, pero no se hibridiza con los extractos de plátanos sanos (resultados no mostrados) . Esto indica que cada componente se asoció claramente con la enfermedad y el virus . Análisis de los componentes genómicos BBTV Las secuencias de los cincos componentes genómicos BBTV aquí presentadas y la secuencia del componente 1, (Harding y colaboradores, 1993, 2) se alinearon y compararon. Cada una de las seis secuencias fue diferente excepto por dos regiones significantes que tuvieron grados variantes de homología entre todos los seis componentes .

Reaión común de asa-tallo: Hemos identificado previamente una estructura de asa-tallo potencial en el componente BBTV 1 (Harding y colaboradores, 1993, Journal of General Virology 74 323-328) que tuvo una secuencia de asa casi idéntica a la secuencia de asa invariante de geminivirus (Lazarowitz, 1992, Critical Reviews in Plant Sciences 11 327-349) . Una estructura de asa/tallo equivalente también se encontró en los componentes 2 a 6 (Figura 3) . Cada componente tuvo una secuencia de asa de 11 nucleótidos de los cuales 9 nucleótidos consecutivos se conservaron entre todos los componentes . Cada componente también tuvo una secuencia de tallo de 10 bp, de los cuales 14 nucleótidos se conservaron completamente. Sin embargo, cuando todos los seis componentes se compararon, la región de homología se extendió hasta 25 nucleótidos 5' de la estructura de asa-tallo y hasta 13 nucleótidos 3? de la estructura de asa-tallo. Los 25 nucleótidos 5X se conservaron completamente entre los componentes 1, 3, 4 y 5. Aparentemente hubo dos eliminaciones en ambos componentes 2 y 6. En el componente 2, ocho nucleótidos se conservaron completamente con los componentes 1, 3, 4 y 5, mientras que en el componente G, se conservaron 16 nucleótidos con estos otros componentes. Los 13 nucleótidos 3* del asa-tallo se conservaron completamente entre todos los seis componentes excepto por una eliminación de nucleótido sencillo aparente en el componente 2. La secuencia de hasta 69 nucleótidos incluyendo la secuencia de asa-tallo se denominó la región conservada de asa-tallo o CR-SL. Región común principal : La segunda región común se localizó a diversas distancias 5 de CR-SL y se denominó la Región Común Principal o CR-M. Esta región varía en tamaño de 65 nucleótidos en el componente 1 a 92 nucleótidos en el componente 5 (Figura 4) . El componente 1 aparentemente tuvo los primeros 25 nucleótidos de la CR-M eliminados así como una eliminación de nucleótido sencillo adicional. Los componentes 2, 3, y 4 tuvieron dos eliminaciones de nucleótido sencillo y el componente 6 tuvo una sola eliminación de nucleótido sencillo. Cuarenta y cinco nucleótidos se conservaron entre todos los componentes y 23 de los primeros 26 nucleótidos eliminados en el componente 1, se conservaron entre los componentes 2a 6. También en los componentes 2 a 6, hubo una repetición directa de 16 nucleótidos casi completa (ATACAAc/gACa/gCTATGA) de los nucleótidos 4 a 20 y 21 a 36. Además, una secuencia rica en GC de 15 nucleótidos (promedio de 86% de GC) se localiza desde los nucleótidos 78 a 92 y fue casi 93% conservada entre todos los componentes .

La secuencia entre el último nucleótido de la CR-M y el primer nucleótido de la CR-SL varía en longitud de 22 nucleótidos en el componente 1, a 233 nucleótidos en el componente 2 (Figuras 1 y 5) . De manera interesante, esta secuencia de 175 nucleótidos en los componentes 3 y 4 fue 97% conservada entre estos dos componentes) . Cajas TATA potenciales: Una caja TATA potencial se identificó en el componente BBTV 1 y se localizó 20 nucleótidos 3 del último nucleótido del asa-tallo y 43 nucleótidos 5 del codón de partida del gen replicasa putativa (Harding y colaboradores, 1993, Journal of General Virology 74 323-328). Cajas TATA potenciales similares también se identificaron en los componentes 2 a 6. En cada uno de estos componentes, la caja TATA potencial fue una secuencia de nueve nucleótidos. CTATa/ta/tAt/aA, y se localizó corriente abajo de la secuencia de asa-tallo (Figura 1) . Sin embargo, la secuencia entre el último nucleótido 3* de la secuencia de asa-tallo y la caja TATA potencial fue considerablemente más larga en los componentes 2 a 6 que en el componente 1 y varió de 157 nucleótidos en el componente 5 a 227 nucleótidos en el componente 4 (Figuras 1 y 5) . Análisis de las señales de poliadenilación potencial Seis señales de poliadenilación potencial se identificaron asociadas con el extremo 3* de los ORFs mayores de los componentes 3 a 5. Una región rica en GT de 10 a 17 nucleótidos se localizó entre 0 y 23 nucleótidos 3V de cada una de estas señales de poliadenilación y cada región rica en GT contiene la secuencia trinucleótido TTG (Figura 4) . Solo una señal de poliadenilación potencial identificada en el componente 2 tuvo una región rica en GT correspondiente con la secuencia de trinucleótido TTG y esta se localizó a 233 nucleótidos 3? de la caja TATA potencial no anucleótido en el sentido virión. CONCLUSIONES Todos los seis componentes comparten dos regiones comunes, la CR-SL y la CR-M, en la región no traducida o intergénica putativa y cinco de los seis componentes tienen un gran ORF en el sentido virión con cajas TATA potenciales asociadas y señales de poliadenilación (Figura 5) . La CRSL incorpora la estructura asa-tallo conservada. La secuencia de asa de 11 nucleótidos se conserva en todos los componentes BBTV excepto por dos nucleótidos y fue similar a la presente en nueve geminivirus (Lazarowitz, 1992, Geminiviruses : genome structure and gene fuction 2), CFDV (Rohde y colaboradores, 1990, Virology 176 648-651) y un componente adicional BBTV (Yen y colaboradores, 1994, Virology 198 645 652) . Un modelo para implicar la secuencia de asa en la replicación de círculo rodante se ha descrito para geminivirus (Saunders y colaboradores, 1993, DNA forms of the geminivirus - African cassava mosaic virus consistent with the rolling circle mechanism of replication. (Formas de ADN de geminivirus - Virus mosaico casava africano - consistente con el mecanismo de replicación de círculo rodante.) IXo. Congreso Internacional de Virología, Glasgow. Agosto, 1993. Extracto P60-18) . Es posible que la secuencia de asa en BBTV tenga una función similar. La secuencia de asa-tallo también se conservan altamente en todos los componentes BBTV, y contienen la secuencia pentanucleótido TACCC que se ha mostrado es el sitio para iniciación de la síntesis de ADN de hebra viral en geminivirus de trigo enano (Heyraud y colaboradores, 1993, EMBO Journal 12 4445-4452) . La región común principal (CR-M) se identifica en todos los componentes y se localiza 3? de la ORF mayor (excepto por el componente 2, en donde no se identifica ORF mayor) y 5X de CR-SL (Figura 5). Las repeticiones de hexanucleótido se identificaron dentro de la CR-M en todos los componentes excepto por el componente 1. Sin embargo, no pudo atribuirse directamente función a estas repeticiones pero pueden asociarse con o ser parte de secuencias promotoras. La CR-M también contiene una secuencia rica en GC de 15 nt localizada en el extremo 3? y tuvo el potencial para formar una pequeña estructura de asa-tallo. Esta secuencia rica en GC, también contiene dos repeticiones GC directas que semejan los sitios de unión Spl que se encuentran en promotores de genes en células de animales y virus (Fenoll y colaboradores, 1990, Plant Molecular Biology 15 866-877). Un promotor similar en el geminivirus de lista de maíz infectado de monocota, ha mostrado que se requiere para máxima transcripción directa y también parece ligar factores nucleares de maíz en una forma no cooperativa (Fenoll y colaboradores, 1990, Plant Molecular Biology 15 865-877) . Karan y colaboradores, 1994, Journal of General Virology 75 3541-3546, reporta que el componente 1 secuencia CR-M está altamente conservado dentro del grupo "South Pacific" (Pacífico del Sur) de aislados BBTV (96.5% homología) y con grupos "Asiáticos" de aislados (98.0% de homología) pero fue altamente variable entre los dos grupos de aislados (68.0% de homología). Hubo 76% entre las secuencias CR-M de los seis diferentes componentes de un aislado Australiano aquí reportado. Por lo tanto, será importante determinar el nivel de homología entre las secuencias CR-M de componentes individuales a partir de los diferentes grupos de aislados, para ver si estas secuencias se conservan altamente dentro de los grupos de aislados pero variables entre grupos y diferentes componentes y además si esto tiene algún significado biológico.

La longitud y secuencia de nucleótido entre CR-M y CR-SL fue diferente en cuatro de los seis componentes. Sin embargo, en los componentes 3 y 4, esta región de 175 nucleótidos fue 97% hom loga y los 334 nucleótidos desde el extremo 5* de la CR-M al extremo 3V de CR-SL fueron 98% homólogos. Una región común grande similar de 300 nucleótidos se ha encontrado en geminivirus y es idéntica entre los componentes A y B de geminivirus bipartitos individuales (Lazarowitz, 1992, Geminivirus: Estructura de genoma y función de gen. 2) En geminivirus, esta región incluye la región de asa-tallo. Una región de homología también se encuentra en cinco de los siete componentes de SCSV que incluyen la región de asa-tallo (Surin y colaboradores, 1993, El virus de atrofia de trébol subterráneo consiste de micro-cromosomas que codifican ORFs simples. (The subterranean clover stunt virus genome consists of micro-chromosomes encoding single ORFs. IXo. Congreso Internacional de Virología, Glasgow, Agosto, 1993. Extracto P62-1) que es similar al geminivirus pero diferente a cuatro de los seis componentes BBTV. Los componentes 3, 4, 5 y 6 todos tuvieron un gran ORF en el sentido virión 31 de CR-SL. Cada uno de estos ORFs tuvo cajones TATA conservados potenciales y señales de poliadenilación asociadas con ellos (Figura 8) . Los cajones TATA potenciales altamente conservados con la secuencia no anucleótida CTATa/ta/tAa/tA que esencialmente era similar a la descrita por Bucher y colaboradores, 1990, Journal of Molecular Biology 212 563-578. La distancia entre el cajón TATA potencial y el codón para inicio de traducción varía en cada componente de 13 nucleótidos en el componente 3 a 102 nucleótidos en el componente 1. Un codón de iniciación de traducción ATGG se identifica en los cinco componentes que codifican grandes ORFs. Sin embargo, dos codones para inicio de traducción posibles se identificaron en el componente 3, el primero en el nucleótido 213 (ATGT) y el segundo en el nucleótido 227 (ATGG) ; el segundo codón de iniciación estaba en molde con el primero. Esto sugeriría que el segundo codón de iniciación es el codón correcto; esto puede verificarse por 5* RACE o secuenciado N-terminal del producto de traducción ORF. Regiones ricas en GT se identificaron 0 a 24 nucleótidos 3 v de cada una de las señales de poliadenilación en los componentes 1, 3, 4, 5 y 6. Cada una de estas regiones ricas en GT contiene la secuencia de nucleótido TTG. Ambas señales de poliadenilación en los componentes 3 y 6 tuvieron estas secuencias . La combinación de una señal de poliadenilación de consenso Aa/tTAAa/t) y una región rica en GT próxima 3? que contiene la secuencia de trinucleótido TTG, solo se asociaron con el ORF de sentido virión mayor sencillo en los componentes 1, 3, 4, 5 y 6 y no se identificaron en otra parte en estas secuencias, sugiriendo cada uno de estos componentes codifica un solo gen. Secuencias similares se han asociado con muchas señales de poliadenilación y pueden requerir terminación eficiente (Gil & Proudfoot, 1984, Nature 312 473-474; Conway & Wickens, 1985, Minutas de la Academia nacional de Ciencias EUA(Proceedings of the National Academy of Sciences USA) 82 3949-3953) . EJEMPLO 2: MODIFICACIÓN DE EXPRESIÓN CON REGIÓN INTERGENICA DE BBTV MATERIALES Y MÉTODO Los plásmidos Transformación mediada por Agrobacterium Todas las secuencias promotoras potenciales derivadas del genoma BBTV se ligaron en el vector binario Agrobacterium, pBI101.3 (Clontech). Este plásmido tuvo un cartucho resistente a antibiótico que consiste de gen promotor nopalina sintasa/NPTII (gen de resistencia a kanamicina) /terminador nopalina sintasa (NOS) y un gen ß-glucuronidasa "sin promotor" (GUS) con un terminador NOS. Las secuencias derivadas de BBTV se ligaron separadamente en el sitio de BamHI 5X del gen GUS sin promotor. El plásmido pBI121 (Clontech) se emplea como el plásmido de control. Este plásmido es idéntico a pBI101.3 excepto porque tiene promotor CaMV 5 de la expresión GUS promotora de gen GUS . Bombardeo de micro-proyectiles Para análisis transitorio de actividad promotora BBTV mediante bombardeo de micro-proyectiles, el cartucho nos/GUS/promotor BBTV se sub-clonó en pGEM3zf* (Promega) . Como un control positivo para la mayoría de los experimentos, el cartucho nos/GUS/promotor CaMV 35S se subclonó similarmente de pBI121 en pGEM3zf* (pGEM35S-GUS) . Grandes cantidades de estos plásmidos en una forma altamente purificada se prepararon para biolística (método que emplea bombardeo de partículas para introducción de ADN en células o protoplastos) utilizando el equipo Qiagen Plasmid Maxi Kit (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes . Transformación Los plásmidos pBI121, pBI101.3 o pBI101.3 con secuencias derivadas de BBTV 5' del gen GUS, se introdujeron en una gama de especies de plantas y tipos de tejido ya sea por bombardeo de micro-proyectiles, electroporación o transformación mediada por Agrobacterium (Horsch y colaboradores, 1989, En: Manual de Biología Molecular de Plantas (Plant Molecular Biology Manual) , Gelvin y colaboradores (eds.) Dordrecht Kluwer Academic Publishers, pp A5/1-A5/9; Hauptmann y colaboradores, 1987, Plant Cell Reports 6 265-270; Last y colaboradores, 1991, Theoretical and Applied Genetics 81 581-588) . Ensayo para expresión GUS es esencialmente el mismo que se describe por Jefferson, 1987, Plant Molecular Repórter 5(4): 387-405. Preparación de Construcciones Promotoras de BBTV Imprimadores : BT6.1 (25 mero) 5'gcctgcagagttgtgctgtaatgt3 BT6.2 (24 mero) gcggatccgcttctgccttccgct BT6.3 (25 mero) gccctgcagcatggacgtcagcaagg BT3.1 ((24 mero) gcctgcagactattgtatggaatg BT3.2 (23 mero) gcggatccctatctagacactgg BT4.1 (23 mero) gctctagaatgggtattgatgta BT4.2 (25 mero) gcggatccttagctgcgtcctattt BT5.2 (23 mero) gcggatccgacgagtgatttcgg BT129V3.17 (17 mero) gttatcatggcatcgac BT1R1.17 (17 mero) gaacaagtaatgacttt BT1.F4.30 (30 mero) ggaagaagcctctcatctgcttcagagagc BT1. INT.R28 ggatcctacatgacaatttaaatgaacc BT1. INT. F25 aagc11ataaaacgaaggcgatgaa Condiciones PCR Etapas secuenciales 1. 94°C x 5 min 2. 94°C x 1 min ) 42°C x 1 min ) x 40 72°C x 1 min ) 3. 72°C x 10 min 1. CLONACIÓN DE REGIONES INTERGENICAS BBTV: Componente BBTV 6 Seis componentes de longitud íntegra (1089 bp) 1. Región intergénica fue amplificada PCR a partir de clon BBTV6 P2A1 utilizando los imprimadores BT6 1 (+746) y BT6.2 (+280) . 2. La región intergénica 623 bp se sub-clonó como fragmento Pstl y BamHi en pUC19 (pUC6.1) . 3. La región intergénica se clonó de pUC6.1 como un fragmento HindIII y BamHI en pBI101.2 (pBT6.1) . 4. El fragmento nos/GUS/promotor BBTV6 de pBT6.1 se subclonó en pGEM3zf* como un fragmento HindIII y EcoRI (pGEM6.1-GUS) . Generación de Eliminaciones 5 de Región Intergénica BBTV6 Construcción de pBT6.2 1. Una eliminación de 5N 272 bp de la región intergénica BBTV6 se genera al digerir pUC6.1 con Accl, un sitio de restricción presente en +1018 en el círculo de seis componentes, y Pstl presente en la región 5 del sitio de clonado múltiple de pUC19. 2. Los extremos se llenaron utilizando fragmento Klenow y re-ligaron para producir pUC6.2. 3. El fragmento 351bp se clonó de pUC6.2 como un fragmento HindIII y BamHI en pBI101.3 (pBT6.2). 4. El cartucho nos/GUS/promotor BBTV6 (351bp) se sub-clona de pBT6.2 como un fragmento HindIII y EcoRI en pGEM3zf* (pGEM6.2-GUS) . Construcción de pBT6.3 1. Una eliminación 5' de 384 bp de la región intergénica BBTV6 se genera por amplificación PCR a partir del clon P2A1 BBTV6 utilizando los imprimadores BT6.3(+41) y BT6.2(+280) . 2. La región intergénica 239 bp se clona como un fragmento Pstl y BamHI en pUC19 (pUC6.3) . 3. La región intergénica se clona de pUC6.3 como un fragmento HindIII y BamHI en pBI101.3 (pBT6.3) . 4. El cartucho nos/GUS/promotor BBTV6 (239 bp) se sub-clona de pBT6.3 y como un fragmento de HindIII y EcoRI en pGEM3zf* (pGEM6.3-GUS) . Construcción de pBT6.4 1. Una eliminación 5V de 451bp de la región intergénica BBT6 se genera al digerir pUC6.3 con BamHI y HaelII (un sitio de restricción presente en la posición +108 en el círculo BBTV6) . 2. Los extremos se llenaron utilizando fragmento Klenow y el extremo despuntado o rasurado de fragmento de 172 bp clonado en el sitio Smal de pBI101.3 (pBT6.4) . 3. El cartucho nos/GUS/promotor BBTV6 (172 bp) se sub-clona de pBT6.4 como un fragmento HindIII y EcoRI en pGEM3zf* (pGEM6.4GUS) . Componente BBTV 1 Un componente de longitud íntegra (1111 bp) 1. Un fragmento de 225 bp que contiene la región intergénica BBTV1 se amplifica PCR a partir del clon BBTV1 de longitud íntegra utilizando los imprimadores BT1R1.17 (+986) y BT1F4.30 (+129). 2. El producto PCR resultante se digiere con Taql (como un sitio de restricción presente en la posición +118 en el círculo BBTV1) . 3. El fragmento 214bp resultante se le hace extremo despuntado o rasurado utilizando fragment Klenow y clona en el sitio Smal de pBI101.3 (pBTl.l) . 4. El cartucho nos/GUS/promotor BBTV1 (214 bp) se sub-clona a partir de pBTl.l como un fragmento HindIII y EcoRI en pGEM3zf* (pGEMl .1-GUS) . Nota: Un pequeño ORF en BBTV-1 se identifica por experimentos 3' RACE. Este ORF se localiza en la posición +430 a +555. Con base en la ubicación de este ORF, se aisló otro promotor intergénico BBTV-1. 1. La gran región intergénica con base en el ORF más pequeño recientemente identificado en BBTV-l, se amplificó PCR de BBTV-1 de longitud íntegra utilizando los imprimadores BT1. INT.R26 (+429) y BTl.INTF25 (+560). 2. La región intergénica de 980 bp resultante se clona corriente arriba del gen reportero GUS en pBI101.3 como un fragmento BamHI y HindIII (pBTl.INT). Componente BBTV 2 Componente dos de longitud íntegra (1059 bp) Forma replicativa de doble hebra con longitud íntegra BBTV2 , clona en pUC19 como un fragmento Xbal en la posición +381 (pUC-BT2) se obtiene de Raktham Wanitchakorn. 1. Un fragmento intergénico de 855 bp se genera a partir de pUC-BT2 por digestión con Xbal y Accl (un sitio de restricción presente en la posición +565 en el círculo de dos componentes) . El extremo Accl fue despuntado en extremo utilizando un fragmento Klenow y el sitio Xbal se mantuvo adherente . 2. Esta región completa intergénica se clonó direccionalmente en el vector pGEM3zf* (pGEM2.1) similarmente preparado. 3. La región intergénica se clonó a partir de pGEM2.1 como un fragmento HindIII y BamHI en pBI101.3 (pBT2.1) . 4. El cartucho nos/GUS/promotor de BBTV2 (866 bp) se subclonó de pBT2.1 como un fragmento HindIII y EcoRI en pGEM3zf* (pGEM2.1-GUS) .

Componente BBTV 3 Componente tres de longitud íntegra (1075 bp) 1. La región completa intergénica de componente 3 se amplificó PCR a partir de extracto nucleico de plátano infectado BBTV (Qld) , utilizando imprimadores BT3.1 (+761) y BT3.2 (+212) . 2. La región intergénica 526bp se subclonó como un fragmento Pstl BamHI en pGEM3zf* (pGEM3.1) . 3. La región intergénica se clonó de pGEM3.1 como un fragmento HindIII y BamHI en pBI101.3 (pBT3.1) . 4. El cartucho nos/GUS/promotor BBTV3 (526 bp) se subclonó de pBT3.1 como un fragmento HindIII y EcoRI en pGEM3zf* (pGEM3.1-GUS) . Componente BBTV 4 Componente cuatro de longitud íntegra (1043 bp) 1. La región intergénica completa del componente 4 se amplificó PCR a partir de extracto nucleico de plátano infectado BBTV (Qld) utilizando imprimadores BT4.1 (+662) y BT4.2 (+278) . 2. La región intergénica de 659 bp se subclonó como un fragmento Xbal y BamHI en pGEM3zf* (pGEM4.1) . 3. La región intergénica se clonó a partir de pGEM4.1 como un fragmento Xbal y BamHI en pBI101.3 (pBT4.1) . 4. El cartucho nos/GUS/promotor de BBTV4 (569 bp) se subclonó a partir de pBT4.1 como un fragmento Xbal y EcoRI en pGEM3zf* (pGEM4.1-GUS) . Componente BBTV 5 Componente cinco de longitud íntegra (1018 bp) 1. La región intergénica de componente 5 se amplificó PCR a partir de extracto de ácido nucleico de plátano atacado con BBTV (Qld) utilizando imprimadores BT129V3.17 (+639) y BT5.2 (+230). 2. El producto de PCR resultante se digiere con BamHI y Accl (un sitio de restricción presente en la posición +794 en el círculo de 5 componentes) . El sitio Accl se despuntó en extremo utilizando fragmento Klenow y el BamHI se mantuvo adherente. 3. La región intergénica 454bp resultante se subclonó direccionalmente en pGEM3zf* (pGEM5.1) similarmente preparado. 4. La región intergénica se clonó de pGEM5.1 como un fragmento HindIII y BamHI en pBI101.3 (pBT5.1) . 5. El cartucho nos/GUS/promotor de BBTV5 (454 bp) se subclonó a partir de pBTS.l como un fragmento HindIII y EcoRI en pGEM3zf* (pGEM5.1-GUS) . 2. AMALJSIS TRANSITORIO DE ACTIVIDAD DE PROMOTOR BBTV MEDIANTE BOMBARDEO DE MICRO- PROYECTILES DE LINEA CELULAR DE Nicotíana fcabacum (NT) Preparación de Suspensión Celular NT 1. 25 mL de suspensión celular NT se subcultivan en 75 mL de medio líquido NT fresco y agita a 28°C bajo luz moderada . 2. Dos días posteriores a subcultivo, 50 mL del cultivo de NT de crecimiento activo se transfirieron a un tubo Falcon de 50 mL y se dejó que sedimentaran por 5-10 minutos . 3. El volumen celular NT empacado resultante se resuspendió en un volumen igual de medio líquido NT. 4. Alícuotas de 200 µL de la mezcla celular NT se tiñieron en medio sólido NT y se dejó que secaran al aire por 3-4 horas, 5. Puntos NT se incubaron a 28°C bajo luz moderada por dos días . 6. Puntos NT se sometieron a bombardeo de micro-proyectiles como se describe a continuación. Cinco puntos NT se lanzaron por construcción de promotor. 7. Después los puntos NT biolísticos se incubaron a 28°C bajo luz moderada por 3 días. 8. Actividad promotora se analizó cualitativamente por teñido GUS uno punto NT por construcción de promotor, utilizando el substrato X-glucurónido. Los cuatro puntos NT restantes se sometieron a análisis fluorométrico GUS cuantitativo utilizando el substrato MUG. Estas técnicas se realizaron esencialmente como se describe por Jefferson, 1987, Plant Molecular Repórter 5(4): 387-405. Preparación de suspensión de oro-ADN para bombardeo de Micro-proyectiles 1. Suspensión de oro se sometió a torbellino brevemente y sónico en agua-hielo por 30 segundos. 2. Suspensión de oro-ADN se preparó en hielo por adición de 2µg de ADN, 25µL de CaC1.2H20 (2.5M) y 5µL de base libre de espermidina (0.1M) a 25µL de suspensión de oro (lOOmg/mL) . 3. Suspensión de oro ADN se sometió a torbellino intermitentemente por 5 minutos, luego dejó que sedimentara en hielo por 10 minutos. 4. Un volumen de 22 µL del sobrenadante se retira y descarta. La suspensión restante se somete a torbellino y una alícuota de 5 µL se empleó para bombardeo de micro-proyectiles. 5. Una preparación de oro se emplea por construcción de promotor. Esta suspensión de oro-ADN proporciona suficiente suspensión para lanzar cinco puntos NT. Condiciones de Lanzamiento para la Pistola con Flujo de Ingreso de Partículas Vacío de 25 mm Hg.

Presión de Helio de aproximadamente 550 Kpa. Altura de plataforma 10 cm. Malla utilizada para proteger el objetivo. Construcciones empleadas Pruebas: pGEM6.1GUS, pGEM6.2GUS, pGEM6.3GUS, pGEM6.4GUS pGEMl.l-GUS, pGEM2.1-GUS, pGEM3.1-GUS, pGEM4.1-GUS, pGEM5.1-GUS. Controles: pGEM35S Resultados : Los resultados del experimento se ilustran en la Figura Comparación de Actividad Promotora BBTV6 1. La región intergénica íntegra de componente seis BBTV tuvo actividad promotora comparable con aquélla del promotor de 800 bp CaMV 35S a partir de pBI121. 2. La eliminación 5' 272bp (pGEM6.2-GUS) provoca un incremento significante en actividad promotora que se mantiene con una eliminación adicional de 5 de 112 bp (pGEM6.3-GUS) . 3. La actividad promotora se reduce significativamente con una eliminación 5 adicional de 75 bp (pGEM6.4-GUS) . Significancia de Resultados: El incremento observado en actividad promotora etre los plásmidos pGEM6.1-GUS y pGEM6.2-GUS implica que la región 272 bp que circunda la CR-M puede contener una secuencia desregulatoria putativa, responsable por esta reducción en actividad de promotor. Los niveles de actividad de promotor observados entre los plásmidos pGEM6.2-GUS, pGEM6.3-GUS y pGEM6.4-GUS indican que la mayoría de la actividad promotora fuerte asociada con la región intergénica BBTV6 se asocia con una región de 112 bp situada a 3? de CR-S/L. De manera importante, esta región contiene un motivo promotor putativo TGA-Ib (posición +44) , que contiene la secuencia núcleo TGACGT análoga a otros motivos promotores y dominios de liga de factor de transcripción. Comparación de Promotores BBTV1-6 1. El promotor BBTV-1 no tiene actividad en transformación transitoria de suspensiones celulares NT. 2. El promotor BBTV-2 tiene la actividad promotora más alta de los seis componentes BBTV, con niveles 2 a 3 veces mayores que el promotor 800bp CaMV 35S derivado de pBI121. 3. Los promotores BBTV-3, -4 y -5 son relativamente débiles con niveles de actividad aproximadamente 50% menores que el promotor CaMV 35S. 4. Región intergénica íntegra BBTV-6 tiene un nivel similar de actividad promotora que aquél del promotor CaMV 35S. Significancia de Resultados: La ausencia de la actividad promotora asociada con la región intergénica BBTV-1 puede indicar que este promotor es un patrón de expresión altamente específico de tejido o requiere factores de transcripción ausentes en núcleos de tabaco. La identificación del motivo promotor putativo (elemento Tipo-1 del gen H3 histona de trigo) asociado con expresión celular específica de fase-S dentro de ese promotor, puede implicar que su actividad se restringe a tipos de tejidos meristemáticos de división activa. Los altos niveles de actividad promotora asociados con la región intergénica BBTV-2 pueden hacer esta secuencia un promotor potencialmente útil para dirigir alto nivel de expresión. A pesar del hecho de que BBTV infecta una monocota, surge de este estudio que los promotores BBTV2-6 son activos en grados variantes en un sistema dicotiledóneo. 3. ANÁLISIS TRANSITORIO DE ACTIVIDAD PROMOTORA BBTV EN OTRAS ESPECIES DE PLANTAS Bombardeo de Micro-proyectiles de Pepino 1. Callos pre-embriogénicos de pepino se sub-cultivaron en medios SQM2EV 2 semanas antes de la transformación biolística. 2. Se transfirieron callos a pequeñas placas SQM2EV 4 días antes de la transformación biolística. 3. El bombardeo de micro-proyectiles se realiza como previamente . 4. La actividad GUS se observó en callos transformados por teñido GUS cualitativo utilizando un substrato X-glucurónido (2 días posteriores a biolística) . Construcciones Empleadas: pBT6.1, pBT6.3, pBTl.l, pBI121 Resultados 1. Tanto pBT6.12 como pBT6.3 producen una cantidad similar de focos azules (eventos de transformación) como pBI121 después de teñido GUS. 2. pBTl.l no mostró evidencia de actividad promotora en callo de pepino (es decir no se observaron focos azules) . Electroporación de Protoplastos de Calabacitas Aislamiento de Protoplastos de Calabacitas 1. Un volumen de 1.5 mL de suspensión de callos de calabacitas embriogénicas, se mezcla con 20 mL de Enzima (E3) e incuba a 25°C en la oscuridad en un agitador lento (30-50 RPM) por 5-6 horas. 2. Se aislaron protoplastos al pasar a través de tamices con tamaños 450 µm, 105 µm y 51 µm y centrifugado a 40-50 g por 5 minutos. 3. Se lavaron protoplastos una vez en solución PWS y finalmente resuspendieron en un volumen conocido de TBS. 4. Se estimó el número de células utilizando un contador de porta-objetos calibrado y el volumen se ajusta para contener 1 x 108 protoplastos/mL. 5. 10 µg de ADN plásmido se agregan a 1 mL de protoplastos e incuban en hielo por 10 minutos. Electroporación de Protoplastos de Calabacitas 1. La mezcla protoplastos:ADN se sometió a electroporación en una cuba de electroporación BioRad (0.4 cm de espacio de electrodo) con 10 µg de ADN plásmido utilizando un aparato Gene Pulsar (BioRad) con 3 pulsos de 300V, ancho de pulso de 10 mseg y retardo pulso de 100 mseg. 2. Los protoplastos se incubaron por 10 minutos más en hielo y nodulizaron por centrifugación a 1000 RPM en una microcentrífuga. 3. Se lavaron protoplastos una vez en Medio de Cultivo 415A y finalmente resuspendieron en 1 mL de 415A. 4. Se transfirieron protoplastos a una placa de micro-titulación de 12 pozos e incubaron por 48 horas en un agitador lento en la oscuridad. 5. Después de incubación, los protoplastos se cosecharon por centrifugación y ensayaron para actividad GUS. Ensayo Fluorométrico GUS 1. Una cantidad de 5 µg de proteína de protoplasto extraída se emplea de manera standard para ensayos fluorométricos (estimado utilizando Reactivo para Ensayo de Proteína BioRad) . 2. El volumen se ajustó a 100 µL con amortiguador de extracción de proteína e incubó con 100 µL de substrato GUS (2 mM) a 37°C por 30 minutos. 3. Se detuvieron las reacciones por adición de 1 mL de Na2C03. 4. La actividad enzimática se estima contra una curva standard 4-MU (0-500 nM) utilizando un espectro-fotómetro fluorométrico (excitación - 365 nm; emisión -455 nm; tiempo de integración - 10) . La actividad GUS se analiza utilizando un ensayo fluorométrico descrito por Jefferson, 1987, Plant Molecular Repórter 5(4); 387-405. Construcciones empleadas: pBT6.3, pBTl.l, pBI121?. Resultados CONSTRUCCIÓN ACTIVIDAD GUS (pmol Mü/min/ma proteína. pBI101.3 0 pBI121 10,000 pBTl.l <1000 pBT6.3 22,000 No se observó actividad GUS con el vector binario GUS sin promotor (pBI101.3) .

Niveles de actividad GUS dirigidos por el fragmento de 239 bp de la región intergénica BBTV6 (pBT6.3) fueron dos veces mayores que el promotor 800bp CaMV 35S (pBI121) . Se observó poca a ninguna actividad GUS del promotor BBTV1 (pBTl.l) . Bombardeo de Micro-proyectiles de Suspensión de Células de Trigo 1. Suspensión de células de trigo se subcultivan en 50 mL de medio WTL1, 4 días antes de bombardeo de micro-proyectiles . 2. Las células de trigo se nodulizaron por centrifugación a baja velocidad y resuspendieron en 10 mL de medio WTL1. 3. Las células se transfirieron a papel filtro estéril inmediamente antes de bombardeo. 4. Bombardeo de micro-proyectiles se realiza como se describió previamente. 5. Dos días posterior a biolística, la suspensión de trigo transformada se somete a teñido GUS utilizando el substrato X-glucurónido. Construcciones empleadas : pBTl . l, pBT2.1, pBT3. l, pBT4.1, pBT5.1, pBT6.1, pBI121, DM8052 (promotor mejorado de actina de arroz que dirige la expresión GUS) . Resultados 1. Promotor mejorado de actina de arroz produce >5000 de focos azules por transformación. 2. pBH21 produce, en promedio aproximadamente 70 focos azules por transformación. 3. De todas las construcciones de promotor BBTV probadas, solo pBT2.1 fue activa, produciendo en promedio 100 focos azules por transformación. Bombardeo de Micro-proyectiles de Células Embriogénicas de Flor Macho de Plátano 1. Un cultivo embriogénico de plátano Cavendish contra "Williams" se genera utilizando flores macho como se describe por Escalant y colaboradores, 1994, In Vitro Cellular and Developmental Biology 30P: 181-186. Este cultivo se mantiene en un sistema de inmersión temporal en medio MP líquido (Escalant y colaboradores, 1994, In Vitro Cellular and Developmental Biology 30P: 181-186) . 2. Cinco días antes de bombardeo de miero-proyectiles, el callo embriogénico se transfiere a medio MP sólido. 3. Se somete tejido a bombardeo de micro-proyectiles como se describió previamente. 4. Actividad GUS transitoria se visualiza por teñido GUS utilizando substrato X-glucurónido, 2 días posterior a biolística.

Construcciones empleadas: pGEM2.1-GUS, pGEM3.1-GUS, pGEM4.1-GUS, pGEM5.1-GUS, pGEM-Ubi (promotor de Maíz ubiquitina que dirige expresión GUS) . Resultados 1. El promotor de maíz ubiquitina dirige expresión de alto nivel de GUS en este tipo de tejido con focos de teñido azul intenso o eventos de transformación (el número exacto de focos es difícil de determinar debido a la intensidad y número) . 2. De las construcciones de promotor BBTV probadas, todos los promotores han mostrados bajos niveles de actividad (<10 focos azules por transformación) . El orden aproximado de fuerza con base en el número de focos azules es: pGEM2.1-GUS (más alto), pGEM4.1-GUS, pGEM3.1-GUS y pGEM5.1-GUS (más bajo). Significancia de Resultados Resultados de análisis transitorio de actividad promotora BBTV en especies de plantas alternas indica que el promotor BBTV6 (particularmente el fragmento de 239 bp, pBT6.3) parece ser activo en tipos de tejido de cucurbitáceas no diferenciadas (dicot) . Resultados de bombardeo con micro-proyectiles de suspensión de células de trigo solo implica que el promotor BBTV2 está activo en un grado significante. Este resultado indica que al menos uno de los promotores BBTV es activo en cierto grado en monocotiledóneas Gramináceas. Ensayos transitorios utilizando cultivos embriogénicos de plátano indican que los promotores BBTV probados a la fecha, tienen algún nivel de actividad en sus especies de plantas huésped. De nuevo, el más fuerte de los promotores BBTV probado fue aquel del componente 2 BBTV que puede reflejar su importancia como un promotor potencialmente útil en el futuro. 4. TRANSFORMACIÓN ESTABLE DE SUSPENSIÓN CELULAR NT POR INFECCIÓN CON AGROBACTERIUM 1. Dos a tres días antes de transformación, un cultivo LB de 5mL que contiene 100 µg/mL de canamicina, se inocula con una cepa de interés de Agrobacterium transformada a partir de 40% de material de glicerol. 2. Células NT se emplearon 5-7 días posteriores al cultivo (4 mL de este cultivo se emplean por transformación, con 4 mL adicionales para el control que no recibe bacterias) . Nota: Transformación duplicada se realizó por cada construcción. 3. 1 µL de acetosiringona (20 mM en etanol) se agrega por mL de células NT. 4. Utilizando una pipeta de 5 mL, las células NT se pipetearon dentro y fuera aproximadamente 20 veces para ayudar a inducir lesiones y mejorar el evento de transformación. 5. 100 µL de cultivo de Agrobacterium (crecimiento denso) se agregaron a una placa de microtitulación que contiene 4 mL de las células NT tratadas y mezclaron completamente. 6. Se incubaron placas por 3 días a 28°C bajo luz moderada. 7. Posterior a incubación, 10 mL de medio líquido NT que contiene 500 µg/mL de carbenicilina (NTC) se agregaron a cada pozo. 8. Las células se centrifugaron a 1K por 4 minutos en tubos Falcon de 50 mL, con reposición al volumen con NTC. 9. Se repitieron los lavados 2 veces . 10. Finalmente se resuspendieron células en 5 mL de NTC y 2 mL en placas sobre medio sólido 2 NTKC (canamicina 100 µg/mL, carbenicilina 500 µg/mL) . Se incubaron placas a 28°C bajo luz moderada. 11. Transformantes post-infección de 3-4 semanas se sub-cultivarón individualmente y mantuvieron bajo selección con sub-cultivo cada quince días. 12. Actividad de promotor se observa por teñido GUS, utilizando el substrato X-glucurónido.

Construcciones empleadas: pBT6.1 (líneas 3 NT), pBT6.2 (líneas 3NT) , pBT6.3 (líneas 2 NT), pBT2.1 (25 líneas 25 NT) . Resultados l. Fuerte actividad GUS en callos NT transformados estables con todas las construcciones de promotor BBTV. 2. Alguna variación en expresión entre diferentes líneas de NT transformado BT2.1, más probablemente debido al efecto de posición (posición de integración de ADN en genoma huésped) y número de copias integradas . Significancia de Resultados Estos experimentos indican que los promotores BBTV5 y BBTV2 , son altamente activos en tipos de células no diferenciadas de tabaco, establemente transformadas. Estos hallazgos soportan resultados a partir de bombardeo de micro-proyectiles, en donde estos promotores mostraron fuerte actividad transitoria. Además, estos resultados confirman que la actividad de estos promotores no se afecta en un grado significante por integración estable en el genoma huésped. 5. TRANSFORMACIÓN ESTABLE DE TABACO POR INFECCIÓN MEDIADA POR AGROBACTERIUM DE DISCOS DE HOJAS 1. Se introdujeron construcciones binarias de promotor en la cepa de Agrobacterium LBA4404 por electroporación. 2. Los Agrobacterium transformados se desarrollaron bajo selección de canamicina (100 µg/mL) y confirmó que contienen la construcción promotora por un procedimiento de lisis alcalina modificado. 3. Dos a tres días antes de transformación, un cultivo LB de 5 mL de los Agrobacterium transformados para utilizarse, se inicia ya sea de una sola colonia de material de glicerol al 40% y agita a 28°C. 4. El cultivo se diluye 1 en 20 con LB y transfiere a una ampolleta estéril de 10 mL. 5. Hojas de tabaco de 3-6 semanas de edad (Nicotiana xanthil) se eliminan por corte y cortan en trozos de 1 cm x 1 cm. 6. Estos trozos se transfieren al cultivo de Agrobacterium diluido y deja que impregnen por 10-15 minutos . 7. Los trozos de tabaco se secaron con papel filtro estéril, colocaron con el lado adaxial (superior) hacia abajo en medio MS104 e incubaron a 28°C hasta que fue visible un ligero crecimiento de bacterias (2-3 días) . 8. Trozos de hojas se transfirieron a medio de selección MS104 (100 mL de kanamicina y 200 µg/mL timentina) e incubaron bajo luz moderada a 28°C. 9. Después de aproximadamente 2 semanas los callos de agalla de corona fueron visible en el sitio de infección. Después de 2 a 5 semanas más, fueron aparentes brotes . 10. Cuando tallos bien definidos fueron visibles, los brotes se cortaron y colocaron en medio de formación de raíz MS (100 µg/mL de canamicina y 200 µg/mL de timen ina) . 11. Plántulas de crecimiento activo (con sistemas de raíz) se mantuvieron en cultivo bajo selección y transformantes putativos sometidos a teñido GUS cualitativo utilizando substrato X-glucurónido. 12. En general se obtuvieron 6-12 transformantes putativos por construcción de promotor. Construcciones empleadas Prueba: pBT6.1, pBT6.2, pBT6.3, pBT6.4. pBT2.1, pBT2.2, pBT2.3 , pBT2.4. pBTl.l, pBT3.1, pBT4.1, pBT5.1. Controles: pBI121 Resultados 1. Fuerte expresión GUS constitutiva en hojas, tallos y raíces transformadas con pBI121. 2. Débil expresión GUS limitada por floema en secciones de hojas y raíz de aproximadamente 10% de plántulas de tabaco transformadas con las construcciones de promotor BBTV. El 90% restante de transformantes no exhibe actividad GUS dentro de hojas y raíces. Significancia de Resultados Los resultados obtenidos a partir de teñido GUS cualitativo de tejido de la mayoría (90%) de tabaco transformado de manera estable con las construcciones de promotor BBTV, implica que estos promotores tienen poca a ninguna actividad de promotor en plantas enteras o tejidos diferenciados . El hecho de que algunas regiones intergénicas BBTV (componentes 2 y 6) muestran altos niveles de expresión en sistemas transitorios (bombardeo de micro-proyectiles de línea celular de Nicotiana tabacum) indica la actividad de estos promotores, puede estar limitada a tipos de células no diferenciados, o que estos promotores se silencian en la transición a partir de callos no diferenciados a tipos de células diferenciadas. Esta teoría se soporta adicionalmente por experimentos en donde callos regenerados de hojas de tabaco establemente transformado (no mostrando actividad GUS) , exhiben niveles variantes de expresión GUS al teñir. El beneficio de este patrón de expresión único puede estar en dirigir la resistencia selectiva, como la mayoría de los sistemas de transformación de plantas se basan en fuerte selección de tejido transformado durante una fase de célula no diferenciada. Por lo tanto, un cartucho de transformación que contiene un promotor BBTV (componente 2 o 6) que dirige la expresión NTPII, proporcionará fuerte resistencia a canamicina en tejido transformado durante las primeras etapas de transformación de planta (fase de callo) pero una vez que las células se diferenciaron (es decir formación de brotes, hojas, etc.) el promotor estaría desactivado. Ya que la expresión de genes de selección herbicida y antibiótica en plantas transgénicas, es de importancia principal en ciertos países, el uso de este promotor sería benéfico. 6. ANÁLISIS DE PROMOTOR BBTV QUE DIRIGE LA GENERACIÓN DE EXPRESIÓN NPTII DE CONSTRUCCIÓN BBTV6-NPTII 1. El fragmento 239 bp de la región intergénica componente BBTV 6 a partir de pUC6.3 se clona corriente arriba del gen 800bp NPTII con terminador CaMV 35S como un fragmento BamHI y Pstl . 2. El cartucho terminador (239bp) /NPTII/CaMV 35S de promotor BBTV6 resultante se subclona como un fragmento Sacl y Xbal entre los bordes izquierdo y derecho del T-ADN Agrobacterium en el vector binario pTAB5. 3. El cartucho (200 bp) terminador (530 bp) /GUS/CaMV 35S de promotor CaMV35S de pGUS2 se clona corriente abajo como un fragmento EcoRI (ver Figura 14) . 4. El vector resultante pBT6.3-NPT detallado a continuación, subsecuentemente se emplea para transformación mediada por Agrobacterium de tabaco (como se describió previamente) . Análisis de Transformantes 1. Ocho transformantes putativos se obtienen siguiendo transformación mediada por Agrobacterium de tabaco (Nicotiana xanthil) con la construcción pBT6.3-NPT. Estas ocho plantas se eligen en medio que contiene canamicina a una concentración de 100 µg/mL. 2. Niveles de expresión de NPTII de estas plantas se estimaron utilizando un equipo cuantitativo NPTII ELISA (5 Prima -» 3 Prima) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se efectuaron comparaciones entre tipos de tejido (hojas y raíces) y entre promotores (promotor CaMV 35S y promotor de nopalina sintasa) . Resultados Los resultados de experimentos se ilustran en la Figura 1. Altos niveles de expresión NPTII se obtuvieron en ambos niveles y raíces de plantas que contienen la expresión NTPII que dirige el promotor CaMV 35S. 2. En general, niveles NPTII en las ocho plantas que expresan NPT bajo control del promotor BBTV6 fueron significativamente menores que el promotor CaMV 35S. Los niveles de expresión NPTII en las hojas no exceden 6 ng de NPTIl/mg de proteína. Niveles dentro de las raíces fueron ligeramente superiores pero no exceden 12 ng de NPTIl/mg de proteína. Estos niveles de expresión son comparables con el promotor nos . Significancia de Resultados Estos experimentos han mostrado que el fragmento 239 bp de la región intergénica BBTV6 es capaz de dirigir resistencia selectiva en tabaco transformado de manera estable. Como se pronosticó, los niveles de expresión NPTII en las plantas establemente transformadas (hojas y raíces) fueron muy lentos, pero comparables con aquél del promotor de nopalina sintasa. 7. ELEMENTOS REGULATORIOS PRESENTES EN LA REGIÓN INTERGENICA BBTV (I) Caja TATA presente en todos los componentes BBTV y colocada corriente arriba del codón de partida de transcripción. - secuencia nonanucleótida conservada CTATa/ta/tA responsable por la iniciación correcta de transcripción, (ii) motivo TGAl-a secuencia de consenso TGACGTAA - como motivo de enlace-1 involucrado en regulación de transcripción TGACGT (iii) Motivo TGAl-b motivo de enlace de hexámero con secuencia de consenso TGACGT (iv) Elemento de tipo promotor-1 de gen H3 de histona de trigo (motivo hexámero) secuencia de consenso ACGTAA presenta inmediatamente 3X de CR-S/L en todos los componentes BBTV - motivo hexámero de enlace de proteínas TAF-l y HBP-1 relacionadas enlazado a expresión específicamente en la fase-S del ciclo celular (Nakayama y colaboradores, 1992, FEBS Letters, 300; 167-170) sugiriendo que la actividad de promotor se limita a células divididas activamente no diferenciadas . (v) Adhl US1 secuencia de consenso CCACG factor de unión desconocido presente en todas las regiones intergénicas BBTV (ya sea en sentido virión o complementario) (vi) Adhl-US3 secuencia de consenso CGTGG factor de enlace presente en todas las regiones intergénicas BBTV (ya sea en sentido virión o complementario) 8. SOLUCIONES DE CULTIVO DE TEJIDO DE PLANTAS Y MEDIO Medio MSO Medio Sólido NT Sales MS medio líquido NT myo-inositol 100 µg/mL TC Agar 0.7% tiamina-HCl 10 µg/mL ácido nicotínico 1 µg/mL piridoxina-HCl 1 µg/mL sacarosa 3% agar TC 0.7% pH 5.7 Medio MS104 Medio líquido NTC MSO medio líquido NT benziladenina 1 µg/mL carbenicilina 500 µg/mL ácido naftalenacético 0.1 µg/mL Medio de Selección MS Medio NTKC MS104 medio sólido NT canamicina 100 µg/mL canamicina 100 µg/mL timentina 200 µg/mL carbenicilina 500 µg/mL Medio de Raíz MS Medio SWM2EV MSO con agar TC al 0.6% Sales MS canamicina 100 µg/mL Myo-inositol lmg/mL timentina 200 µg/mL sacarosa 3% Agar TC 0.7% 2, 4-D 10 µM BAP 1.5 µM Medio líquido NT Medio WTL1 Sales MS Sales MS Sacarosa 3% CAB A orgánicos MES 0.5 µg/mL L-asparagina 5 µg/mL Bl-inositol 1 µg/mL L-glicina 10 µg/mL KH2P04 180 µg/mL Agua de coco Gibco 2% 2, 4-D 0.222 µg/mL amina NZ 50 µg/mL pH5.7 glucosa 10 mg/mL sacarosa 10 mg/mL manitol 20 mg/mL 2, 4-D 2 µg/mL quinetina omega 2 µg/mL PH 5,8 SOLUCIÓN PWS - (1 litro) cloruro de calcio 735 mg MES 639.6 mg manitol 109.3 g pH 5.6 MEZCLA DE ENZIMAS (E3) celulosa al 2.0% (R-10) macerozima al 0.5% (R-10) hemicelulosa al 0.5% pectoliasa al 1.0% (Y23) BSA al 0.5% Constituido a volumen con PWS (pH 5.6) SOLUCIÓN PBS - (200 mL) Base trizma 0.73 g cloruro de sodio 1.75 g cloruro de calcio 0.18 g manitol 9.2 g pH 9.0 9. SIGNIFICANCIA DE LA CR-M Los alineamientos de secuencia de ADN de los componentes BBTV 1-6 CR-M se suministran. Esta región se considera que actúa como un sitio de enlace de imprimador putativo y sugiere que juega un papel en replicación BBTV.

Aunque CR-M o BBTV contiene dos repeticiones GC directas que semejan los sitios de unión Spl encontrados en los promotores de genes en animales y virus (virus de maíz rayado) parece que esta región no tiene papel de mejora de promotor. Esta hipótesis se soporta por análisis de eliminación 5X de la región intergénica BBTV6 que ha demostrado que la remoción de una región 272 bp incluyendo la CR-M produce un incremento significante en actividad de promotor. Además, estudios preliminares con la región intergénica BBTV2 no han mostrado decremento en actividad promotor con remoción de CR-M. 10. CONCLUSIONES Hemos demostrado que las regiones intergénicas o secuencias de ADN de componentes BBTV 1 a 6 tienen actividad promotora y que esta actividad varía de una región intergénica a otra. Utilizando sistemas de expresión transitoria y estable, hemos mostrado que los promotores BBTV parecen poseer un patrón de expresión específico de tejido que puede ser análogo al sitio de replicación BBTV y acumulación en su huésped natural. Además, hemos identificado elementos regulatorios potenciales, presentes cuando menos en uno de los promotores BBTV (componente 6) que parecen influenciar la expresión de gen reportero. BBTV es un virus que infecta monocotas del género Musa . Puede esperarse por lo tanto que los promotores derivados de BBTV tendrán la actividad más fuerte en plátano y potencialmente otras monocotas . Estudios transitorios con suspensiones de células de trigo y callos embriogénicos de plátano, han mostrado que algo de los promotores BBTV son activos en cierta proporción en dicho sistema. De manera importante, también hemos encontrado que dos de los promotores BBTV (BBTV2 y 6) dirigen expresión transitoria de alto nivel en tipos de tejido no diferenciado dicotiledóneos (tabaco, pepino y calabacitas) . LEYENDAS FIGURA 1 Las secuencias de nucleótidos de los componentes ADN BBTV2, 3, 4, 5 y 6 y las secuencias de amino ácidos deducidas de los ORF principales de estos componentes, se dan en las FIGURAS l(a), (b) , (c) , (d) y (e) , respectivamente. Las cajas TATA potenciales están en negrillas y con doble subrayado; las señales de poliadenilación potenciales están en negrillas y subrayadas; la estructura de asa-tallo está en itálicas y subrayada, con la secuencia de tallo con flecha; la CR-SL está subrayada; la CR-M está en negrillas e itálicas; y el ORF está en negrillas. FIGURA 2 Determinación de la orientación de sentido virión de los componentes ADN BBTV 2 a 6. Cada teñido se sondeó separadamente, ya sea con oligonucleótidos etiquetados 32P (componente 2) o transcripciones de ARN de longitud íntegra (componentes 3 a 6) específicos para las hebras de sentido virión y complementarios de cada componente respectivo.

Teñidos de Panel (a) se hibridizaron con sondas complementarias a las secuencias de componentes presentadas en la Figura 1, y teñidos de Panel (b) se hibridizaron con sondas de las mismas secuencias presentadas en la Figura 1. Pista 1: clon de longitud íntegra de cada componente respectivo; Pista 2: ácido nucleico de plátano sano; Pista 3 : ADN extraído de viriones BBTV purificados . FIGURA 3 Las regiones comunes de asa-tallo alineadas (CRSL) de componentes ADN BBTV 1 a 6. La estructura de asa-tallo en cada componente está subrayada y la secuencia de asa está en itálicas. Los asteriscos indican nucléotidos que se conservan entre todos los componentes . Puntos han sido incluidos en algunas secuencias para llevar al máximo el alineamiento de secuencia. FIGURA 4 Las regiones comunes principales alineadas (CR-M) de los componentes ADN BBTV 1 a 6. La secuencia rica en GC de quince nucleótidos está subrayada. Asteriscos indican nucleótidos que se conservan entre todos los componentes y diamantes indican nucleótidos que se conservan entre los componentes 2 a 6 en los primeros 26 nucleótidos que cubren la eliminación en el componente 1. Se han incluido puntos en algunas secuencias para llevar a un máximo alineamiento de secuencia y las secuencias de repetición imperfectas se ilustran en itálicas.

FIGURA 5 Representación diagramática de la organización de genoma propuesta de BBTV. (i) La organización general de todos los componentes y (ii) una representación lineal de cada componente. FIGURA 6 Diversas construcciones de la región intergénica del componente 1. FIGURA 7 Diversas construcciones de la región intergénica del componente 2. FIGURA 8 Diversas construcciones de la región intergénica de los componentes 3 y 4. FIGURA 9 Diversas construcciones de la región intergénica del componente 5. FIGURA 10 Diversas construcciones de la región intergénica del componente 6. FIGURA 11 Secuencias de nucleótidos alineadas de las regiones intergénicas de los componentes 1 a 6 de BBTV. bbtvprol es el inserto de pBTl.l; bbtvpro2 es el inserto de pBT2.1; bbtvpro3 es el inserto de pBT3.1; bbtvpro4 es el inserto de pBT4.1; bbtvprod es el inserto de pBT5.1; y bbtvpro6 es el inserto de pBT6.1. Hay que notar que en bbtvprol que Adhl US1 está presente en la posición 1004. Con respecto a bbtvpro2, hay que notar que TGA-Ib está presente en las posiciones 952 y 1053, Adhl US3 está presente en la posición 137, G-BOX está presente en la posición 225. Con respecto a bbtvpro3, hay que notar que Adhl USl está presente en la posición 1069. Respecto a bbtvpro4 hay que notar que TGA-Ib está presente en la posición 182; Adhl USl está presente en la posición 1037; y G-BOX está presente en las posiciones 45, 63, 128 y 148. Con respecto a bbtvprod, hay que notar TGA-Ib está presente en la posición 96; Adhl USl está presente en la posición 1012; y G-BOX está presente en las posiciones 45 y 64. Con respecto a bbtvprod hay que notar que TGA-la está presente en la posición 1083; TGA-lb está presente en la posición 44. Adhl USl está presente en la posición 173; y G-BOX está presente en la posición 46. También hay que notar que G-BOX es un motivo promotor de planta que se asocia con la secuencia de núcleo de transcripción: CACGTG. FIGURA 12 La secuencia de ADN del inserto pBTl.INT (982 pares base) . Hay que notar que la secuencia de la región intergénica del componente BBTV 1 se basa en el molde de lectura abierto pequeño.

FIGURA 13 La secuencia de ADN del inserto (a)pBT6.1 (622 par base); (b) pBT6.2 (351 pares base); (c) pBT6.3 (238 pares base); y (d) pBT6.4 (pares base 182). Hay que notar que la región resaltada en pBT6.3 es la secuencia asociada con la mayoría de la actividad promotora de la región intergénica de componente 6. Esta región se retira en pBT6.4. FIGURA 14 Construcción BBTV6-NPTII.

Claims (17)

1. REIVINDICACIONES 1. Una molécula de ADN que es un fragmento parcial de una región intergénica de un componente BBTV o alternativamente ésta molécula ADN se deriva de la región intergénica, con lo que la molécula de ADN es capaz de promover, mejorar, regular o modificar transcripción de un gen no-BBTV.
2. 2. Una molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula de ADN tiene una secuencia que es substancialmente idéntica o substancialmente complementaria a una secuencia de la región intergénica de un componente BBTV.
3. 3. Una molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula de ADN tiene una secuencia que tiene hasta 20% de variación a partir de una secuencia substancialmente idéntica o substancialmentente complementaria de la región intergénica de un componente BBTV.
4. 4. Una molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la molécula de ADN tiene una secuencia que es substancialmente idéntica a cualquiera de las secuencias ilustradas en las Figuras 1, 3, 4, 11, 12 o 13.
5. 5. Un cartucho o vector quimérico de ADN que tiene una molécula ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, y que está corriente arriba de un gen de interés para permitir la promoción, mejora, regulación o modificación de transcripción del gen de interés .
6. 6. Un cartucho o vector quimérico de ADN de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el vector o cartucho quimérico de ADN incluye una construcción de gen BBTV6-NPTII ilustrada en la Figura 14.
7. 7. Un método para expresar un gen no BBTV en una célula de planta que utiliza la molécula de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
8. 8. Un método para expresar un gen no BBTV de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la célula de planta es en parte una planta monocotiledónea o dicotiledónea.
9. 9. Una célula de planta que tiene una molécula de ADN de conformidad con las reivindicaciones 1 .
10. 10. Una célula de planta de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque la célula de planta es parte de una planta monocotiledónea o dicotiledónea.
11. 11. Una planta que tiene una célula de planta de conformidad con la reivindicación 9 o 10.
12. 12. Una planta de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque es una planta monocotiledónea.
13. 13. Una planta de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque es una planta dicotiledónea .
14. 14. Una molécula de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque la molécula de ADN puede expresar un gen no BBTV en una célula de planta monocotiledónea.
15. 15. Una molécula de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque la molécula de ADN puede expresar un gen no BBTV en una planta monocotiledónea.
16. 16. Una molécula de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque la molécula de ADN puede expresar un gen no BBTV en una célula de planta dicotiledónea.
17. 17. Una molécula de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque la molécula de ADN puede expresar un gen no BBTV en una célula de planta, a partir de tejido no diferenciado de una planta dicotiledónea.