MXPA97005082A - Composiciones para el suministro de antigenos - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con el suministro de antígenos. Los sistemas de suministro que incluyen el antígeno y aminoácidos o poliaminoácidos acilados o sulfonados. También se proporcionan métodos para la preparación y administración de estas composiciones.

Description

OCMPOSICTQNES PARA EL SaM-OJ-CSTRO DB AMTÍG.BMOS CAMPO DE LA IMV?HCIQ La presente invención se relaciona con composiciones útiles para el suministro, y de manera preferible el suministro oral, de antígenos. También se describen métodos para la preparación y para administración de estas composiciones .

Los medios convencionales para suministro de antígenos a sus objetivos propuestos con frecuencia están limitados gravemente por la presencia de barreras biológicas, químicas y físicas. Habitualmente, estas barreras son impuestas por el ambiente a través del cual debe tener lugar el suministro, el ambiente del objetivo para suministro o el objetivo mismo. El suministro oral al sistema circulatorio para muchos antígenos sería la ruta de elección para administración a animales a no ser por las barreras físicas tales como la capa de moco y las células epiteliales del tracto gastrointestinal (Gl) . Estas barreras son relativamente impermeables a estos antígenos, pero deben ser REF: 24837 atravesadas antes de gue un antígeno suministrado por la ruta de vía oral pueda alcanzar el sistema circulatorio. El suministro oral también es impedido por barreras químicas tales como pH variable en el tracto Gl y la presencia en la cavidad oral y en el tracto Gl de poderosas enzimas digestivas. Además, los antígenos solubles administrados oralmente pueden inducir un estado de falta de respuesta o de tolerancia. Se han desarrollado previamente métodos para administrar antígeno por vía oral los cuales se basan en el uso de microorganismos atenuados o microesferas de polilactida/poliglicólida (PLA/PGA) para incrementar la presentación de antígeno y la captación por las células presentadoras de antígeno apropiadas. Sin embargo, los organismos atenuados, a menos que se» suministren apropiadamente, pueden volver a adquirir virulencia. De manera adicional, el uso de amplio espectro de las microesferas de PLA/PGA no es posible debido a que estos portadores requieren solventes orgánicos o pueden alterar o desnaturalizar a los antígenos. Además, los sistemas PLA/PGA son difíciles de fabricar. Recientemente, se han descrito microesferas constituidas de polímeros artificiales de aminoácidos mezclados (proteinodes) para suministro de agentes biológicamente activos que incluyen a antígenos. Santiago, et al. Pharmaceutical Res. Vol. 10, No. 8, (1993). Sin embargo, aiún existe la necesidad en la técnica de sistemas sencillos, baratos y que se preparan fácilmente los cuales suministren efectivamente una amplia gama de antígenos, particularmente por la vía oral.

BREVE DESCRIPCIÓN DB LA IMVBfCIÓW Se proporcionan composiciones útiles en el suministro de antígenos. Estas composiciones de suministro comprenden: (a) un antígeno; y (b) un portador que comprende un número seleccionado del grupo que consiste de (i) un aminoácido acilado; (ii) un poliaminoácido que comprende por lo menos un aminoácido acilado; (iii) un aminoácido sulfonado; (iv) un poliaminoácido que comprende por lo menos un aminoácido sulfonado; o (v) una combinación de los mismos .

BREVE DESC-RIPC-táN DE LOS DIBUJOS "V. ... La figura 1 es una ilustración gráfica de la proliferación de células T específicas para antígeno de ovalbúmina, OVA después de su exposición al antígeno OVA, de células esplénicas de ratón, de ratones dosificados por administración por sonda oral con antígen OVA y portador aminoácido modificado. La figura 2 es una ilustración gráfica de la proliferación de células T específicas para el antígeno OVA después de la exposición al antígeno OVA de células esplénicas de ratón, de ratones dosificados mediante alimentación por sonda oral con antígeno OVA y portador aminoácido modificado. La figura 3 es una ilustración gráfica de proliferación de células T específicas para antígeno OVA después de la exposición al antígeno OVA, de células esplénicas de ratón, de ratones dosificados mediante alimentación por sonda oral con antígeno OVA, y portador aminoácido modificado. La figura 4 es una ilustración gráfica de la proliferación de células T específicas para antígeno OVA después de su exposición a concentraciones variables de antígeno OVA, de células esplénicas de ratón, de ratones dosificados por alimentación con sonda oral con antígeno OVA y aminoácido portador modificado. La figura 5 es una ilustración gráfica de la proliferación de células T específicas para antígeno OVA después de la exposición a antígeno OVA de células esplénicas de ratón, de un grupo de ratones control.

La figura 6 es una ilustración gráfica de la proliferación de células T específicas para OVA después de la exposición a concentraciones variables de antígeno OVA, de células esplénicas de ratón a partir de un grupo de ratones control . La figura 7 es una ilustración gráfica de títulos de IgG contra OVA inducidos en ratones dosificados por medio de alimentación por sonda oral con antígeno OVA y una mezcla de N-ciclohexanoil- (1) -tirosina y N-ciclohexanoleucina. La figura 8 es una ilustración gráfica de títulos de IgG contra OVA inducidos en ratones dosificados con exposición subcutánea de antígeno OVA seguido por una dosis de refuerzo oral de antígeno OVA y aminoácidos sulfonados mezclados .

DBSCRII LA -MVEHCION La presente invención se relaciona con el suministro de antígenos a través de diversas barreras biológicas, químicas y físicas. Las composiciones de la presente invención son particularmente adecuadas para el suministro de antígenos los cuales están sujetos a degradación ambiental o fisiológica. Otras ventajas proporcionadas por la presente invención incluyen el uso de materiales iniciales baratos disponibles fácilmente y fáciles de preparar. Los métodos de formulación de la presente invención son efectivos en cuanto a costos para preparar y aislar estas composiciones, son sencillos de llevar a cabo y son susceptibles de producción a escala industrial para producción comercial. Las composiciones de la invención son útiles para administrar antígenos a animales que incluyen, pero que no se limitan a aves y mamíferos tales como, por ejemplo, primates y humanos. Las composiciones de suministro de la presente invención inducen una respuesta inmune.

Los antígenos adecuados para uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a proteínas y péptidos sintéticos o derivados de manera natural; carbohidratos que incluyen pero que no se limitan a polisacáridos; lípidos; y antígenos aislados de fuentes biológicas tales como, por ejemplo, microbios, virus o parásitos, en subunidades o extractos de los mismos; o cualquier combinación de los mismos. Se hace mención especial de los antígenos de Streptococcus pneumoniae, carbohidrato VI de S. typhi, Hemophilus influenzae (tipo B) , B. pertussis acelular, Neisseria meningiditis (A,C), H. influenzae (tipo B, Hib) , Clostridium tetani (tétanos) y Corynebacterium diphtheriae (dif eria) .

Los aminoácidos son los materiales básicos utilizados para preparar los portadores útiles en la presente invención. Un aminoácido es cualquier ácido carboxílico que tiene por lo menos un grupo amina libre e incluye aminoácidos que se presentan de manera natural y sintéticos. Los aminoácidos preferidos para uso en la presente invención son o-aminoácidos, y de manera más preferible son o-aminoácidos que se presentan de manera natural . Muchos aminoácidos y esteres de aminoácido están disponibles fácilmente de diversas fuentes comerciales tales como Aldrich Chemical Co. (Mil au ee, Wl, USA) ; Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA); y Fluka Chemical Corp. (Ronkonkoma, NY, USA) . Los aminoácidos representativos, pero no limitantes, adecuados para uso en la presente invención generalmente son de la fórmula H—N(R x) -((RRa—C,))-——OH en la que: R1 es hidrógeno, alquilo de C1-C4 o alquenilo de C2-C4; R2 es alquilo de C^C^, alquenilo de C2-C24, cicloalquilo de C3-C10, cicloalquenilo de C3-C10, fenilo, naftilo, alquilfenilo de ^C^ alquenilfenilo de C2-C10, alquilnaftilo de C^-C^, alquenilnaftilo de C2-C10, fenilalquilo de C^-C^, fenilalquenilo de C2-C10, naftilalquilo de C^C^ o naftilalquenilo de C2-C10; R2 está opcionalmente sustituido con alquilo de C1-C4, alquenilo de C2-C4, alcoxi de C^^, -OH, -SH, -C02R3, cicloalquilo de C3-C10, cicloalquenilo de C3-C10, heterocíclico que tiene 3-10 átomos en el anillo, en el que el heteroátomo es une o más de N, O, S o cualquier combinación de los mismos, arilo, alcarilo de ^-C^ , aralquilo de o cualquier combinación de los mismos; .—¿ . ' R2 está opcionalmente interrumpido por oxígeno, nitrógeno, azufre o cualquier combinación de los mismos; y R3 es hidrógeno, alquilo de CÍ-CJ o álquenilo de C2-C4.

Los aminoácidos preferidos que se presentan de manera natural para uso en la presente invención como aminoácidos o componentes de un péptido son alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, citrulina, cisteína, cistina, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, ornitina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina, hidroxiprolina, ?-carboglutamato, fenilglicina, u 0-fosfoserina. Los aminoácidos que se presentan de manera natural más preferidos son arginina, leucina, lisina, fenilalanina, tirosina, triptófano, valina y fenilglicina. Los aminoácidos preferidos que no se presentan de manera natural para uso en la presente invención son ß-alanina, ácido o-aminobutírico, ácido ?-aminobutírico, ácido ?- (aminofenil) butírico, ácido a-aminoisobutírico, citrulina, ácido e-aminocaproico, ácido 7-aminoheptanoico, ácido ß-aspártico, ácido aminobenzoico, ácido aminofenilacético, ácido aminofenilbutírico, ácido ?-glutámico, cisteína, e-lisina, e -lisina,' metionina sulfona, nor eucina, norvalina, ornitina, d-ornitina, p-nitrofenilalanina, hidroxiprolina, ácido 1, 2, 3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico y tioprolina. Los poliaminoácidos son péptidos de dos o más aminoácidos unidos por un enlace formado por otros grupos - lu los cuales pueden ser enlazados, por ejemplo, un éster, un anhídrido o un enlace anhídrido. Los péptidos son dos o más aminoácidos unidos por un enlace peptídico. Los péptidos pueden variar en longitud desde dipéptidos con dos aminoácidos hasta polipéptidos con varios cientos de aminoácidos. Véase, Walker, Chambers Biological Dictionary. Cambridge, England: Chambers Cambridge, 1989, página 215. Se hace mención especial de dipéptidos, tripéptidos, tetrapéptidos y pentapéptidos, y particularmente los péptidos preferidos son dipéptidos y tripéptidos. Los péptidos pueden ser homopéptidos o heteropéptidos que pueden incluir aminoácidos naturales, aminoácidos sintéticos o cualquier combinación de los mismos . Los aminoácidos modificados, poliaminoácidos o péptidos están acilados o sulfonados e incluyen amidas de aminoácido y sulfonamidas. awiH t?--u» ? Am aciladofl Se hace mención especial de aminoácidos acilados que tienen la fórmula Ar—Y—(R4) n- -OH II en la que Ar es fenilo o naftilo sustituido o no sustituido; O Y es |J R4 tiene la fórmula , II — C— . _N (R6 )— C-en la que : R5 es alquilo de Cx a C24, alquenilo de Cj. a C24, fenilo, naftilo, alquilfenilo de C1 a C10, alquenilfenilo de C1 a C10, alquilnaftilo de a C10, alquenilnaftilo de Cx a C10, fenilalquilo de Ct a C10, fenilalquenilo de Cx a C10, naftilalquilo de Cx a C:o y naftilalquenilo de Cx a C10; R5 está sustituido opcionalmente con alquilo de Cx a C4, alquenilo de Cx a C4, alcoxi de Cx a C4, -OH, -SH y - C02R7, cicloalquilo, cicloalquenilo, alquilo heterocíclico, alcarilo, heteroarilo, heteroalcarilo o cualquier combinación de los mismos; . R7 es hidrógeno, alquilo de Ct a C, o alquenilo de R5 está opcionalmente interrumpido por oxígeno, nitrógeno, azufre o cualquier combinación de los mismos; y R6 es hidrógeno, alquilo de Cx a C4 o alquenilo de C, a C4. También se hace mención especial de aquéllos que tienen la fórmula en la que: R8 es (i) cicloalquilo de C3-C10, opcionalmente sustituido con alquilo de C^C,, alquenilo de C2-C7, alcoxi de C'.-G,, hidroxi, fenilo, fenoxi o -COjR11, en la que R11 es hidrógeno, alquilo de Cj_-C4 o alquenilo de C2-C4; O (ii) alquilo de sustituido con cicloalquilo de C3-C10; R9 es hidrógeno, alquilo de C^C, o alquenilo de L.2-C4 ; R10 es alquilo de C^ ,,,, alquenilo de C2-C24, cicloalquilo de C3-C10, cicloalquenilo de C3-C10, fenilo, naftilo, alquilfenilo de alquenilfenilo de C2-C10, alquinaftilo de C1-C10, alquenilnaftilo de C2-C10, fenilalquilo de Cx-C10, fenilalquenilo de C2-C10, naftilalquilo de C^C^ o naftilalquenilo de C2-C10; R10 está opcionalmente sustituido con alquilo de Ci-C,, alquenilo de C2-C4, alcoxi de -OH, -SH, -C02R12, cicloalquilo de C3-C10, cicloalquenilo de C3-C10, heterocíclico que tiene 3-10 átomos en el anillo, en el que el heteroátomo es uno o más de N, O, S o cualquier combinación de los mismos, arilo, alcarilo de C^C^, aralquilo de C^C^ o cualquier combinación de los mismos; R10 está opcionalmente interrumpido por oxígeno, nitrógeno, azufre o cualquier combinación de los mismos; y R12 es hidrógeno, alquilo de C^^ o alquenilo de C2-C4. Algunos aminoácidos asimilados preferidos incluyen saliciloilfenilalanina y los compuestos que tienen las fórmulas : .. IX XVIII XXIII XXVII XXVIII ' XXXII XXXIII XXXIV XXXVI XXXVII XXXVIII XXXIX I XLVIII Se hace mención especial del compuesto que tiene la fórmula: en la que A es Tyr, Leu, Arg, Trp, o Cit; y opcionalmente en la que, si A es Tyr, Arg, Trp o Cit; A está acilado en 2 o más grupos funcionales. Los compuestos preferidos son aquéllos en los que A es Tyr, A es Tyr y está acilado en 2 grupos funcionales; A es Leu; A es Arg; A es Arg y está acilado en dos grupos funcionales; A es Trp y está acilado en dos grupos funcionales; A es Cit y A es Cit y está acilado en 2 grupos funcionales . También se hace mención especial de compuestos que tienen la fórmula: en la que A es Arg o Leu; y en la que, si A es Arg, A está opcionalmente acilado 2 o más grupos funcionales; en la que A es Leu o fenilglicina; en la que A es fenilglicina; y rí en la que A es fenilglicina.

Los aminoácidos acilados se pueden preparar al hacer reaccionar aminoácidos sencillos, mezclas de dos o más aminoácidos o esteres de aminoácido con un agente modificador de amina el cual reacciona con porciones amino libres presentes en los aminoácidos para formar aminas. Los ejemplos adecuados, pero no limitantes de agentes acilantes útiles para preparar aminoácidos acilados incluyen agentes acilantes de cloruro de ácido que tiene la 0 fórmula 13 II en la que: R—C—X R13 es un grupo apropiado para el aminoácido modificado que se prepara tal como, pero sin limitarse a, alquilo, alquenilo, cicloalquilo o aromático y particularmente metilo, etilo, ciclohexilo, ciclofenilo, fenilo o bencilo y X es un grupo saliente. Los grupos salientes típicos incluyen, pero no se limitan a halógenos, tales como cloro, bromo y yodo. Los ejemplos de los agentes acilantes incluyen, pero no se limitan a haluros de acilo que incluyen pero que no se limitan a cloruro de acetilo, cloruro de propLj cloruro de ciclohexanoilo, cloruro de ciclopentanoilo y cloruro de cicloheptancilo, cloruro de benzoilo, cloruro de hipurilo y similares; y anhídridos tales como anhídrido acético, anhídrido propílico, anhídrido ciclohexanoico, anhídrido benzoico, anhídrido hipúrico y similares. Los agentes acilantes preferidos incluyen cloruro de benzoilo, cloruro de hipurilo, cloruro de acetilo, cloruro de ciclohexanoilo, cloruro de ciclopentanoilo y cloruro de cicloheptanoilo. Los grupos amina también pueden ser modificados por la reacción de un ácido carboxílico con agentes acoplantes tales como los derivados carbodiimida de aminoácidos, particularmente aminoácidos hidrofílicos tales como fenilalanina, triptófano y tirosina. Los ejemplos adicionales incluyen ciclohexilcarbodiimida y similares. Si el aminoácido es multifuncional, es decir, tiene más de un grupo -OH, -NH2 o -SH, entonces de manera opcional puede estar acLiado en uno o más grupos funcionales para formar, por ejemplo, un éster, amida o enlace tioéster. Por ejemplo, en la preparación de muchos aminoácidos acilados, los aminoácidos se disuelven en una solución alcalina acuosa de un hidróxido de metal, por ejemplo hidróxido de sodio o de potasio y se agrega el agente acilante. El tiempo de reacción puede variar desde aproximadamente 1 hora hasta aproximadamente 4 horas, de manera preferible desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 2.5 horas . La temperatura de la mezcla se mantiene a una temperatura generalmente que varía entre aproximadamente 5°C y aproximadamente 70°C, de manera preferible entre aproximadamente 10 °C y aproximadamente 50 °C. La cantidad de álcali utilizada por equivalente de grupos NH2 en los aminoácidos generalmente varía entre aproximadamente 1.25 moles y aproximadamente 3 moles, y de manera preferible entre aproximadamente 1.5 moles y aproximadamente 2.25 moles por equivalente de NH2. El pH de la solución de reacción generalmente varía entre aproximadamente pH 8 y aproximadamente pH 13, y de manera preferible está entre aproximadamente pH 10 y aproximadamente pH 12. La cantidad de agente modificador de amino utilizada en relación a la cantidad de aminoácidos se basa en las moles de NH2 libre total en los aminoácidos. En general, el agente modificador de amino se utiliza en una cantidad que varía entre aproximadamente 0.5 y aproximadamente 2.5 equivalentes molares, de manera preferible entre aproximadamente 0.75 y aproximadamente 1.25 equivalente, por equivalente molar de grupos NH2 tales en los aminoácidos. La reacción de formación de aminoácido modificado Wl habitualmente se detiene al ajustar el pH de la mezcla con un ácido adecuado, por ejemplo, ácido clorhídrico concentrado hasta que el pH alcance un valor entre aproximadamente 2 y aproximadamente 3. La mezcla se separa al dejarla reposar a temperatura ambiente para formar una capa superior transparente y un precipitado blanco o blancuzco. La capa superior se desecha y los aminoácidos modificados se recolectan por filtración o por decantación. Los aminoácidos modificados sin tratar después se mezclan con agua. Los materiales insolubles se eliminan por filtración y el filtrado se seca in vacuo. El rendimiento de los aminoácidos modificados generalmente varía entre aproximadamente 30 y aproximadamente 60%, y habitualmente es de aproximadamente 45%. La presente invención también contempla aminoácidos los cuales han sido modificados por acilación múltiple, por ejemplo, diacilación, triacilación, etc . Si los esteres o amidas de aminoácidos son los materiales iniciales, se disuelven en un solvente orgánico adecuado tal como dimetilformamida o piridina, y se hacen reaccionar con el agente modificador amino a una temperatura que varía entre aproximadamente 5°C y aproximadamente 70°C, de manera preferible a aproximadamente 25 °C durante un período que varía entre aproximadamente 7 y aproximadamente 24 horas. La cantidad de agentes modificadores amino utilizados en relación a los esteres de aminoácido son las mismas que las descritais antes para aminoácidos. Posteriormente, el solvente de reacción se elimina bajo presión negativa y opcionalmente, se puede eliminar la funcionalidad éster o amida al hidrolizar el éster de aminoácido modificado con una solución alcalina adecuada, por ejemplo, hidróxido de sodio 1 N, a una temperatura que varía entre aproximadamente 50°C y aproximadamente 80°C, de manera preferible a aproximadamente 70 °C durante un período de tiempo suficiente para separar por hidrolización el grupo éster y formar el aminoácido modificado que tiene un grupo carboxilo libre. La mezcla de hidrólisis posteriormente se enfría hasta la temperatura ambiente y se acidifica, por ejemplo, con una solución de ácido clorhídrico acuoso al 25%, hasta un pH que varía entre aproximadamente 2 y aproximadamente 2.5. El aminoácido modificado se separa por precipitación de la solución y se recupera por medios convencionales tales como filtración o decantación. Los aminoácidos modificados pueden ser purificados por precipitación acida, recristalización o fraccionamiento en soportes de columna sólidos. El fraccionamiento se puede llevar a cabo en soportes de columna sólidos adecuados tales como gel de sílica o alúmina utilizando mezclas de solventes tales como ácido acético/butanol/agua como la fase móvil; los soportes de columna de fase inversa utilizan mezclas de ácido trifluoroacético/acetonitrilo como la fase móvil; y la cromatografía de intercambio iónico lleva agua como la fase móvil. Los aminoácidos modificados también pueden ser purificados por extracción con un alcohol inferior tal como metanol, butanol o isopropanol para eliminar impurezas tales como sales inorgánicas.

Los aminoácidos modificados generalmente son solubles en solución acuosa alcalina (pH > 9.0); parcialmente soluble en etanol, n-butanol y una solución 1:1 (v/v) de tolueno/etanol; son insolubles en agua neutra. Las sales de metal alcalino, por ejemplo, las sales de sodio de los aminoácidos modificados, generalmente son solubles en agua a aproximadamente un pH de 6 -8. En los poliaminoácidos o péptidos, uno o más de los aminoácidos pueden estar modificados (acilados) . Los poliaminoácidos modificados y péptidos pueden incluir uno o más aminoácidos acilados. Aunque los poliaminoácidos y péptidos modificados lineales generalmente incluyen únicamente un aminoácido acilado, otros poliaminoácidos y configuraciones de péptidos pueden incluir más de un aminoácido acilado. Los poliaminoácidos y péptidos pueden ser polimerizados con los aminoácidos acilados o pueden ser acilados después de la polimerización. Se hace mención especial del compuesto: en la que A y B independientemente son Arg o Leu.

Los aminoácidos, poliaminoácidos y péptidos modificados sulfonados se modifican al sulfonar por lo menos un grupo amino libre con un agente sulfonante el cual reacciona con por lo menos uno de tres grupos amina presentes . Se hace mención especial de compuestos de la fórmula LV Ar—Y—(R14) n—OH en la que Ar es fenilo o naftilo sustituido o no sustituido; Y es —S02—, R14 tiene la fórmula 0 -N(R16)- en la que : R15 es alquilo de C1 a C24, alquenilo de Cx a C24, fenilo, naftilo, alquilfenilo de Cx a C10, alquenilfenilo de Ct a C10, alquilnaftilo de Cj. a C10, alquenilnaftilo de C a C10, fenilalquilo de Cx a C10, fenilalquenilo de Cx a C10, naftilalquilo de CL a C10 y naftilalquenilo de Cx a C10; R15 está opcionalmente sustituido con alquilo de C1 a C4, alquenilo de C1 a C4, alcoxi de Cx a C4, -OH, -SH y -C02R17 o cualquier combinación de los mismos; R17 es hidrógeno, alquilo de Cj. a C4 o alquenilo de x a C4 ; R15 está opcionalmente interrumpido por oxígeno, nitrógeno, azufre o cualquier combinación de los mismos; y R16 es hidrógeno, alquilo de Cx a C4 o alquenilo de 1 4 * Los ejemplos adecuados, aunque no limitantes, de agentes sulfonantes útiles para preparar los aminoácidos sulfonados incluyen agentes sulfonantes que tienen la fórmula R18-S02-X en la cjue Rlß es un grupo apropiado para el aminoácido modificado que se prepara tal como, pero sin limitarse a, alquilo, alquenilo, cicloalquilo o aromáticos y X es un grupo saliente como se describe en lo anterior. Un ejemplo de un agente sulfonante es cloruro de bencensulfonilo . Los poliaminoácidos y péptidos modificados pueden incluir uno o más aminoácidos sulfonados. Aunque los poliaminoácidos y péptidos modificados lineales utilizados generalmente incluyen sólo un aminoácido sulfonado, otras configuraciones de poliaminoácidos y péptidos pueden incluir más de un aminoácido sulfonado. Los poliaminoácidos y péptidos pueden ser polimerizados con los aminoácidos sulfonados o pueden ser sulfonados después de la polimerización.

En una modalidad de la presente invención, los aminoácidos, poliaminoácidos o péptidos modificados pueden ser utilizados directamente como un portador al simplemente mezclar uno o más aminoácidos, poliaminoácidos o péptidos modificados con el antígeno antes de su administración. En otra modalidad, los aminoácidos modificados pueden ser utilizados para formar microesferas que contienen al antígeno. El suministro de un antígeno y un portador como se describe en la presente resulta en respuestas inmunes mejoradas. Esta última ventaja se encuentra particularmente en forma de microesferas. Las microesferas que contienen el antígeno generalmente pueden ser de forma de matriz o de forma de microcápsula. La forma de matriz incluye tanto una esfera de matriz hueca en la cual el portador forma una cubierta de matriz alrededor de un centro hueco y el agente activo se distribuye a través de la matriz, o bien, esfera de matriz sólida en la cual el portador forma un continuo de matriz esférica en la cual se distribuye el agente activo. La forma de microcápsula es una en la cual el agente activo encapsulado está en solución o como un sólido, con un portador que forma una cubierta alrededor del material encapsulado. La forma de microcápsula es la forma considerada con mayor frecuencia por el autoensamblado de los portadores de la presente invención. Si la composición de suministro va a estar en forma de microesfera, las microesferas portadoras se pueden preparar al disolver el portador en un soluto apropiado y después estimular el autoensamblado al poner en contacto la solución portadora con un precipitador. La solubilidad del portador puede ser regulada por la selección de los aminoácidos apropiados.

De manera adicional, los portadores de microesfera y por lo tanto las composiciones de la presente invención pueden estar adaptados al pH para ser solubles selectivamente en intervalos de pH específicos ácido, básico o neutro. Las composiciones las cuales tienen como objetivo un ambiente ácido se pueden producir para que sean selectivamente solubles a pH ácido, por ejemplo el pH del estómago. Estas composiciones se preparan con un portador soluble en ácido. El portador soluble en ácido existe principalmente en forma catiónica en por lo menos una porción del intervalo de pH desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 6.8. Sin embargo, por encima de aproximadamente 6.8 o a intervalos seleccionados por encima de pH 6.8, el portador está principalmente sin protonar y es insoluble en agua. Por lo tanto, el portador en sí mismo podría autoensamblarse en microesferas a pH básico o neutro, y el agente activo en la composición de suministro no sería liberado hasta que el portador se solubilice al encontrar un pB ácido. Las composiciones las cuales tienen como objetivo un ambiente alcalino pueden ser elaboradas para que sean selectivamente solubles a pH alcalino, por ejemplo el pH de la porción distal del intestino. Estas composiciones se preparan con un portador soluble en base. El portador soluble en base existe principalmente en forma aniónica en por lo menos una porción del intervalo de pH desde aproximadamente 7.2 hasta aproximadamente 11. Sin embargo, debajo de pH 7.2, el portador está principalmente protonado y es insoluble en agua. Por lo tanto, el portador se puede autoensamblar en microesferas a pH ácido o neutro, y el antígeno en la composición de suministro podría no ser liberado hasta que el portador se solubiliza al encontrar un pH básico. Las composiciones que tienen como objetivo un ambiente neutro se pueden fabricar para que sean solubles selectivamente a pH neutro. Estas composiciones se preparan con un portador soluble neutro. El portador soluble neutro existe principalmente en forma neutra a pH neutro, es decir, desde aproximadamente 6.8 hasta aproximadamente 7.2. Sin embargo, por encima o por debajo de este intervalo, el portador es insoluble en agua. Por lo tanto, el portador puede autoensamblarse en microesferas a pH básico o ácido, el antígeno en la composición de suministro puede no ser liberado hasta qué el portador se solubiliza cuando encuentre un pH neutro. En una formulación de microesferas típica, la solución final puede contener desde aproximadamente 10 mg hasta aproximadamente 2000 mg de portador por mi de solución, de manera preferible entre aproximadamente 75 y aproximadamente 500 mg de portador por mi de solución, y de manera más preferible desde aproximadamente 75 hasta aproximadamente 200 mg por mi. De manera opcional, la mezcla se calienta hasta una temperatura entre aproximadamente 20 °C y aproximadamente 60 °C, de manera preferible a aproximadamente 40 °C, hasta que el portador se disuelve. Los particulados que permanecen en la solución pueden ser separados por filtración por medios convencionales tales como filtración por gravedad sobre papel filtro. La solución portadora habitualmente se mantiene a una temperatura elevada y se mezcla con el antígeno y un precipitador, por ejemplo, una solución cida tal como, por ejemplo, ácido acético o cítrico acuoso a una concentración que varía desde aproximadamente 1 N hasta aproximadamente 3 N para portadores insolubles en ácido, una solución básica para portadores insolubles en base y una solución neutralizante para portadores insolubles en condiciones neutras. El antígeno se puede mezclar con la solución precipitante o puede ser utilizado por separado. La mezcla resultante se mantiene durante un período de tiempo suficiente- para la formación de microesferas según se observa por microscopía óptica. Aunque se prefiere que la solución portadora se agregue a la solución precipitante, de igual manera la solución precipitante se puede agregar a la solución portadora.

Las soluciones anteriores de manera opcional pueden contener aditivos tales como aditivos estabilizantes. La presencia de tales aditivos promueve la estabilidad y la dispersabilidad del agente activo en solución. Los aditivos estabilizantes pueden ser utilizados a una concentración que varía entre aproximadamente 0.1 y 5% (p/v), de manera preferible a aproximadamente 0.5% (p/v) . De manera adecuada, pero no limitante, los ejemplos de aditivos estabilizantes incluyen sales amortiguadoras, goma acacia, gelatina, metilcelulosa, polietilenglicol, polilisina y ciclodextrinas. Los agentes estabilizantes preferidos son goma acacia, gelatina y metilcelulosa. La cantidad de antígeno la cual puede ser encapsulada por la microesfera depende de varios factores los cuales incluyen las concentraciones de antígeno en la solución encapsulante así como sus afinidades por el portador. Las concentraciones de antígeno en la solución final también varían en base a la dosificación requerida de administración. Cuando sea necesario, se pueden determinar las concentraciones exactas mediante, por ejemplo, análisis por CLAP en fase inversa.

Cuando las presentes composiciones están en forma de microesferas, el tamaño de partícula de la microesfera también puede ayudar a proporcionar suministro eficiente del antígeno al objetivo. Típicamente, las microesferas de la presente invención tendrán un diámetro de menos de 10 µm, de manera preferible en el intervalo desde aproximadamente 0.1 µm hasta aproximadamente 10 µm y de manera más preferible en el intervalo desde 0.2 µm hasta aproximadamente 10 µm. Se puede controlar el tamaño de las microesferas que contienen un antígeno al manipular una variedad de parámetros físicos o químicos tales como pH, osmolaridad, fuerza iónica de la solución encapsulante o el tamaño de los iones de la solución y/o por la elección de precipitador particular utilizado en los procesos de formación y cargado de microesferas. Por ejemplo, en el tracto Gl, con frecuencia es deseable utilizar esferas las cuales son lo suficientemente pequeñas para suministrar efectivamente el antígeno al área objetivo dentro del tracto gastrointestinal. También se pueden administrar microesferas pequeñas por vía parenteral al suspender las esferas en un fluido apropiado (por ejemplo solución isotónica) e inyectar la solución directamente en el sistema circulatorio por vía intramuscular o subcutánea. El modo de administración de las composiciones de suministro variará, por supuesto, en base a los requerimientos del antígeno administrado. Se ha observado que, las microesferas grandes de aminoácidos (mayores de 50 µm) tienden a ser menos efectivas como sistemas para suministro oral. Las composiciones de la presente invención también pueden incluir uno o más inhibidores enzimáticos. Tales inhibidores enzimáticos incluyen, pero no se limitan a compuestos tales como actionina o epiactinonina y derivados de los mismos. Estos compuestos tienen las fórmulas siguientes: Actinonina LVI Epiactonina LVII Los derivados de estos compuestos se describen en la patente norteamericana No. 5,206,384. Los derivados de actinonina que tienen la fórmula: LVIII en la que R19 es sulfoximetilo o carboxilo o un grupo carboxi sustituido que se selecciona de los grupos carboxamida, hidroxiaminocarbonilo y alcoxicarbonilo; y R20 es un grupo hidroxilo, alcoxi, hidroxiamino, o sulfoxiamino. Otros inhibidores enzimáticos incluyen, pero no se limitan a aprotinina (Trasylol) e inhibidor de Bowman-Birk. Las composiciones de la presente invención se pueden formular en unidades de dosificación mediante la adición de uno o más excipientes, díluyentes, desintegrantes, lubricantes, plastificantes, colorantes o vehículos dosificadores . Las formas de dosificación unitaria preferidas son las formas de dosificación unitarias orales. Las formas de dosificación unitaria incluyen, pero no se limitan a tabletas, cápsulas o líquidos. Las formas de dosificación unitaria pueden incluir cantidades biológicas o inmunogénicamente efectivas del antígeno, pero pueden incluir menos de la misma cantidad si se van a utilizar formas de dosificación unitaria múltiples para administrar una dosificación total del antígeno. Las formas de dosificación unitarias se preparan por métodos convencionales en la técnica. Estas cantidades también pueden variar en base a la consideración de que la dosificación va a ser utilizada como una dosis inicial o un refuerzo .- Los portadores de la presente invención no alteran las cantidades fisiológicas y biológicas del antígeno. Además, el proceso de encapsulación no necesita alterar la estructura del antígeno. Se puede incorporar cualquier antígeno dentro de las microesferas de aminoácido. Las composiciones son particularmente ventajosas para vacunación oral o inmunización con antígenos los cuales de otra manera podrían ser destruidos o se volverían menos efectivos por condiciones que se encuentran dentro del cuerpo del animal al cual se administran, antes de que la microesfera alcance su zona objetivo. Por ejemplo, se pueden suministrar péptidos o antígenos de proteína, los cuales, en sí mismos, no pasan o no son captados en la mucosa gastrointestinal y/o son susceptibles de ruptura química por ácidos y enzimas en el tracto gastrointestinal. Tales antígenos incluyen de manera adicional, por ejemplo, a los utilizados para proporcionar inmunización contra enfermedades que incluyen, pero que no se limitan a influenza, difteria, tétanos, sarampión, polio, hepatitis y similares. Las composiciones de la invención son más efectivas para inducir respuestas de anticuerpos tanto en mucosa como en suero en comparación con antígenos los cuales son administrados si los portadores especificados en este documento. Los antígenos son administrados a un mamífero por su efecto biológico tal como, por ejemplo, como estimuladores del sistema inmune.

La administración de las presentes composiciones o formas de dosificación unitaria de manera preferible es oral o por inyección subcutánea o intraduodenal .

Los siguientes ejemplos ilustran la invención sin limitación.

EJEMPLO 1 PREPARACIÓN DE N-CICLOHEXANOIL- (L) -TIROSINA Se disuelve (L) -tirosina (61.6 g, 0.34 moles) en 190 mi de hidróxido de sodio 2 N. Se agrega a gotas a la mezcla cloruro de ciclohexanoilo (49.32 mi, 0.34 moles) . Se agrega hidróxido de sodio acuoso 2 N adicional y se agita la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla después se acidifica hasta pH 9.5 con ácido clorhídrico acuoso (4:1). Se forma un precipitado el cual se separa por filtración al vacío. Los sólidos se disuelven en hidróxido de sodio 2 N y se secan por liofilización para proporcionar 33.5 g de N,0-diciclohexanoil- (L) -tirosina. El producto se purifica por cromatografía en columna en gel de sílice utilizando butanol/ácido acético/agua como el sistema eluyente. El producto puro es un sólido blanco. 1. Espectro de masas: M + 23 m/e 314. 2. LH RMN (300 MHz, DMSO-d6) : = 6.8 (d, 2H) ; 6.4 (d, 2H) ; 4.4 (m, 1H) ; 2.5 (ddd, 2H) ; 2.0 (m, 2H) ; 1.6 (m, 10H) ; 1.2 (m, 10H) . 3. IR (KBr) cm-1: 3350, 2900, 2850, 1600, 1520, 1450, 1400, 1300.

EJEMPLO 2 PREPARACIÓN DE N-CICLQHEXANQIL- (L) -ARGININA Se disuelve (L) -arginina (103.2 g, 0.6 moles) en 600 mi de hidróxido de sodio 2 N. Se agrega a gotas a la mezcla cloruro de ciclohexanoilo (87 mi, 0.6 moles). La mezcla de reacción se mantiene a 50°C durante 2 horas.

Posteriormente la mezcla se enfría hasta la temperatura ambiente y se acidifica hasta pH 2.3 con ácido clorhídrico acuoso (4:1) . El precipitado que se forma se separa por decantación. Los sólidos se disuelven en hidróxido de sodio 2 N y se secan por liofilización para proporcionar 64.1 g de N-ciclohexanoil- (L) -arginina sin tratar. El producto se purifica por cromatografía en columna en gel de sílice utilizando butanol/ácido acético/agua como el sistema eluyente. Los productos aislados son N-ciclohexanoil- (L) -arginina y N (o) -N(?) -diciclohexanoil- (L) -arginina.

N-ci lohexanoil- (L) -arginina: 1. Espectro de masas: M + 1 m/e 395. 2. XH RMN (300 MHz, DMSO-d6) : ppm d = 8.75 (amplio, 1H) ; 7.6 (amplio, 5H) ; 4.0 (m, 1H) ; 3.05 (m, 2H) , 2.15 (m, 1H) ; 1.1-1.5 (m amplio, 14H) .

N(a) . (N?) -diciclohexanoil- (L) -arginina: 1. Espectro de masas: M + 1 m/e 285. 2. XH RMN (300 MHz, DMSO-d6) : ppm d = 2.0 (m, 3H) , 1.8-1.4 (m amplio, 17H) ; 1.3-1.0 (m amplio, 20H) EJEMPLO 3 PREPARACIÓN DE N-CICLOHEXANOIL- (L) -CITRULTNA Se disuelve L-citrulina (35.2 g., 0.2 moles) en 200 mi de hidróxido de sodio 2 N. Se agrega en gotas a la mezcla cloruro de ciclohexanoilo (29 mi, 0.2 moles) . La mezcla de reacción se mantiene a 25 °C durante 1 hora. Posteriormente la mezcla se acidifica hasta pH 2.6 con ácido clorhídrico acuoso (4:1). El precipitado que se forma se separa por decantación. Los sólidos se disuelven en hidróxido de sodio 2 N hasta pH 6.5 y se secan por liofilización para proporcionar 44.2 g de N-ciclohexanoil-(L) -citrulina. El producto es un sólido blanco. 1. Espectro de masas: M + 23 m/e 308. 2. LH RMN (300 MHz , DMSO-d6) : d = 4.1 (dd, 1H) ; 2.9 (t, 2H) ; 2.1 (m, 2H) ; 1.6-1.2 (m amplio, 14H) . 3. IR (KBr) cm-1: 3400, 3300, 2950, '2850, 1700, 1650, 1600, 1450, 1400 cm-1.

EJEMPLO 4 PREPARACIÓN DE N-C CLQPENTA Q L- (L) -ARGININA- Se disuelve (L) -arginina (32.8 g, 0.19 mmoles) en 188 mi de hidróxido de sodio 2 N. Se agrega en gotas a la mezcla cloruro de ciclopentanoilo (22.9 mi, 0.19 moles) . La mezcla de reacción se mantiene a aproximadamente 25 °C durante 2 horas. La mezcla posteriormente se acidifica hasta pH 1.5 con ácido clorhídrico acuoso (4:1). El precipitado-que se forma se separa por decantación. Los sólidos se disuelven en hidróxido de sodio 2 N hasta pH 7.5 y se secan por liofilización para proporcionar 67.4 g de N-ciclopentanoil- (L) -arginina. El producto es un sólido blanco. Espectro de masas: M + 1 m/e 271.

EJEMPLO 5 PREPARACIÓN DE N-CICLOHEXANOIL- (t ) -ARGININA Se disuelve (t) -arginina (14.2 g, 0.1 moles) en 100 mi de hidróxido de sodio 2 N. Se agrega en gotas a la mezcla cloruro de ciclohexanoilo (13 mi, 0.098 moles) . La mezcla de reacción se mantiene a 25 °C durante 2 horas. Posteriormente la mezcla se enfría hasta la temperatura ambiente y se acidifica hasta pH 6.6 con ácido clorhídrico acuoso (4:1) . El precipitado blanco que se forma se separa por decantación. Los sólidos se disuelven en una cantidad mínima de hidróxido de sodio 2 N. El producto, un sólido blanco (11.6 g, 49%), se aisla al disminuir el pH del producto purificado por acidificación con ácido clorhídrico acuoso (4:1) hasta un pH de aproximadamente 7-9. 1. Espectro de masas: M + 1 m/e 2423. 2. XH RMN (300 MHz, D20) : ppm d = 4.9 (s, 1H) ; 2.2 (m, 1H) ; 1.7-1.4 ( , 5H) ; 1.3-1.0 (m, 5H) ; 0.8 (s, 9H) . 3. IR (KBr) cm-1: 3350, 2950, 2850, 1550, 1500, 1400 cm"1.

Se han sintetizado los siguientes aminoácidos y péptidos siguiendo el procedimiento de los Ejemplos 1-5: c i c l ohe noi l - Al a , ác ido m - (ciclohexanoila ino) benzoico, p- (ciclohexanoilamino) -benzoico, ácido 4- (ciclohexanoilamino) butírico, 6-( c iclohexanoi 1 amino ) hexanoico , ácido ciclo-hexanoilantranilílico, ciclohexanoil-Arg-Leu, ciclo-hexanoil-Asp, isatoicanhidruro-Asp, ciclohexanoil-Glu, ciclohexanoil-Gly, ciclohexanoil-Gly-Arg, ciclohexanoil-Ile, ciclohexanoil-Leu, ciclopentanoil-Leu, ciclopropanoil-Leu, 3-metilciclohexanoil-Leu, 2-metilciclohexanoil-Leu, 4-meticiclohexanoil-Lelu, ciclohexanoil- (D) -Leu, ciclo-hexanoil- (t) -Leu, ciclohexanoil-Leu-Arg, ciclohexanoil -Leu-Leu, ciclohexanoil- (D) -Leu- (L) -Leu, ciclohexanoil-Leu-Lys-Val, ciclohexanoil-Lys, ciclohexanoil-Orn, ciclohexanoil-Phe, cicloheptanoil-Phg, ciclohexilpropanoil-Phg, ciclohexanoil-Phg, ciclopentanoil-Phg, ciclopropanoil-Phg, 4 -met iciclohexanoil -Phg, ciclohexanoil - (D) -Phg, ciclohexanoil-Tio, ciclohexanoil-Trp, ciclohexanoil-Tyr-Leu, ciclohexanoil-Val, ciclopentanoil -Val, ciclohexanoil-Val-Val, cicloheptanoil-Leu, y ciclohexilpropanoil-Leu.

EJEMPLO 6 PREPARACIÓN DE ÁCIDO 4 - (4 -AMINOFENIL) BUTÍRICO SULFONADO Se disuelve ácido 4- (4-aminofenil) butírico (20 g, 0.11 moles) en 110 mi de una solución acuosa de hidróxido de sodio 2 N. Después de agitar durante aproximadamente 5 minutos a temperatura ambiente, se agrega a gotas cloruro de sulfonilo (14.2 mi, 0.11 moles) en la solución de aminoácido durante 1 período de 15 minutos. Después de agitar durante aproximadamente 3 horas a temperatura ambiente, la mezcla se acidifica hasta pH 2 mediante la adición de ácido clorhídrico. Esto proporciona un precipitado café claro el cual se aisla por filtración. El precipitado se lava con agua caliente y se seca. El rendimiento de ácido 4- (fenilsulfonamido) 4-fenilbutírico es de 24.3 g (69%). El punto de fusión es de 123-25°C. Si es necesario, los aminoácidos modificados pueden ser modificados por recristalización y/o cromatografía .

EJEMPLO 7 PREPARACIÓN DE 4 -AMINOBENZOICO SULFONADO El ácido 4-aminobenzoico se convierte a ácido 4-(fenilsulfonamido) benzoico al seguir el procedimiento del Ejemplo 6.

EJEMPLO 8 PREPARACIÓN DE ÁCIDO 4 -AMINOFENILACÉTICO SULFONADO. ÁCTnO 4-AMINQH PÚRICO Y ÁCIDO 4-AMINOMETILBENZOICO El ácido 4-aminofenilacético, ácido 4-aminohipúrico, y ácido 4-aminometilbenzoico se convierten a ácido 4- (fenilsulfonamido) fenilacético, ácido 4-( f e n i 1 s u 1 f onam i do ) h i pú r i c o y ácido 4-(fenilsulfonamidometil) benzoico respectivamente, al seguir el procedimiento del Ejemplo 6.

EJEMPLO 9 PREPARACIÓN DE UNA MEZCLA DE AMINOÁCIDOS SULFONADOS Se prepara antes de la reacción una mezcla de 16 aminoácidos. Los constituyentes de la mezcla se resumen en la Tabla 1. Se disuelven 65 gramos de la mezcla de aminoácidos (concentración total de grupos [-NH2] = 0.61 moles) en 760 mi de una solución de hidróxido de sodio 1 N (0.7625 equivalentes) a temperatura ambiente. Después de agitar durante 20 minutos, se agrega durante un período de 20 minutos cloruro de bencensulfonilo (78 mi, 1 equivalente) . Posteriormente la mezcla de reacción se agita durante 2.5 horas, sin calentamiento. En la medida en que se presenta cierta precipitación, se agrega una solución adicional de NaOH (2N) a la solución, hasta que alcance un pH de 9.3. La mezcla de reacción se agita durante la noche a temperatura ambiente. Posteriormente, la mezcla se acidifica utilizando ácido clorhídrico diluido (38%, 1:4) y se separa por precipitación un material de color crema. El precipitado resultante se aisla por decantación y se disuelve en hidróxido de sodio (2N) . Esta solución posteriormente se reduce in vacuo para proporcionar un sólido amarillo, el cual seca en el liofilizador .

TAfiíA 1; Qrppofll CÍSS EJEMPLO 10 PREPARACIÓN DE UNA MEZCLA DE AMINOÁCIDOS SULFONADOS Se disuelven 86.1 g (0.85 moles de NH2) de una mezcla de aminoácidos (véase la Tabla 2) en 643 mi (1.5 equivalentes) de una solución acuosa de hidróxido de sodio 2 N. Después de agitar durante 30 minutos a temperatura ambiente, se agrega en porciones cloruro de bencensulfonilo (108 mi, 0.86 moles) en la solución de aminoácidos durante un período de 15 minutos. Después de agitar durante 2.5 horas a temperatura ambiente, se ajusta el pH de la mezcla de reacción (pH 5) hasta pH 9 con una solución adicional de hidróxido de sodio 2 N. La mezcla de reacción se agita durante la noche a temperatura ambiente. Posteriormente, el pH de la mezcla de reacción se ajusta a pH 2.5 por adición de una solución acuosa diluida de ácido clorhídrico (4:1, H20:HC1) y se forma un precipitado de aminoácidos modificados. Se desecha la capa superior y el precipitado amarillo resultante se aisla por decantación, se lava con agua y se disuelve en hidróxido de sodio 2 N (2N) . La solución se reduce in vacuo para proporcionar un sólido amarillo el cual liofiliza durante la noche. El rendimiento del aminoácido modificado crudo es 137.9 g.

TAftTtft 2 EJEMPLO 11 PREPARACIÓN DE UNA MEZCLA DE AMINOÁCIDOS MODIFICADOS UTILIZANDO CLORURO DE BENZOILO Se disuelven 86 g (0.85 moles de NH2) de una mezcla de aminoácidos (véase la Tabla 2 en el Ejemplo 10) , en 637 mi (1.5 equivalentes) de una solución acuosa de hidróxido de sodio 2N. Después de agitar durante 10 minutos a temperatura ambiente, se agrega en porciones cloruro de benzoilo (99 mi, 0.85 moles) en la solución de aminoácidos durante un período de 10 minutos. Después de agitar durante 2.5 horas a temperatura ambiente, se ajusta el pH de la mezcla de reacción (pH 12) hasta pH 2.5 utilizando ácido clorhídrico diluido (4:1, H20:HC1) y se forma un precipitado de aminoácidos modificados. Después de dejar sedimentar durante 1 hora, el precipitado resultante se aisla por decantación, se lava con agua y se disuelve en hidróxido de sodio (2N) . Esta solución después se reduce in vacuo para proporcionar los aminoácidos modificados sin tratar como un sólido blanco (220.5 g) .

EJEMPLO 12 PREPARACIÓN DE L-VALINA SULFONADA Se disuelve L-valina (50 g, 0.43 moles) en 376 mi (0.75 equivalentes) de hidróxido de sodio acuoso 2N mediante agitación a temperatura ambiente durante 10 minutos. Posteriormente se agrega cloruro de bencensulfonilo (68.7 mi, 0.38 moles, 1.25 equivalentes) a la solución de aminoácidos durante un período de 20 minutos, a temperatura ambiente. Después de agitar durante 2 horas a temperatura ambiente, aparece un precipitado. El precipitado se disuelve al agregar 200 mi de una solución adicional de hidróxido de sodio 2 N. Después de agitar durante 30 minutos adicionales, se agrega una solución acuosa diluida de ácido clorhídrico (4:1, H20:HC1) hasta que el pH de la mezcla de reacción alcanza 2.6. Se forma un precipitado de aminoácidos modificados y se recupera por decantación. Este material se disuelve en hidróxido de sodio 2N y se seca in vacuo para proporcionar un sólido amarillo. Rendimiento de los aminoácidos modificados sin tratar = 84.6 g, 77%.

EJEMPLO 13 PREPARACIÓN DEL ESTER METÍLICO DE FENILALANINA MODIFIC DO. UTTT.TZANDO CLORURO DE HIPURILO Se disuelve clorhidrato del éster metílico de L-fenilalanina (15 g, 0.084 moles) en dimetilformamida (DMF) (100 mi) y a esto se agrega (30 mi) . Se agrega inmediatamente una solución de cloruro de hipurilo (16.6 g, 0.084 moles en 100 mi de DMF) a la solución del éster de aminoácido, en dos porciones. La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción posteriormente se reduce in vacuo y se disuelve en hidróxido de sodio acuoso 1 N. La solución se calienta a 70 °C durante 3 horas con el fin de hidrolizar el éster metílico a un grupo carboxilo libre. Posteriormente, la solución se acidifica hasta pH 2.25 utilizando una solución acuosa diluida de ácido clorhídrico (1:3 HC1/H2Q) . Se forma un precipitado similar a goma y este se recupera y se disuelve en hidróxido de sodio 1 N. La solución se reduce in vacuo para proporcionar 18.6 g del producto de aminoácido modificado sin tratar (rendimiento 18.6 g) . Después de recristalización a partir de acetonitrilo, se recupera la fenilalanina modificada pura (12 g) como un polvo blanco, p.f. 223-225°C.

EJEMPLO 14 PREPARACIÓN DE COMPOSICIONES DE ANTÍGENO/PORTADOR Se prepara una solución portadora al agregar 900 mg de N-ciclohexanoil- (1) -tirosina y 1.35 g de N-ciclohexanoil-leucina a 1.5 mi de agua. Se prepara una solución de antígeno al agregar 3 mg de antígeno de ovalbúmina (OVA) a 1.5 mi de una solución de ácido cítrico 1.7 N/l% de goma acacia/2% de ciclodextrina. La solución portadora y la solución de antígeno de OVA se calientan a 40°C y se mezclan. La muestra tiene una concentración de portador de 75 mg/ml y una concentración de antígeno de OVA de 1 mg/ml.

EJEMPLO 15 RESPUESTA INMUNE EN RATONES Se preparó medio de cultivo celular CRPMI estándar con los siguientes ingredientes: 1. Solución de aminoácidos MEM (50x), (Gibco) (10 mi) 2. Solución de aminoácidos no esencial MEM (10 ML 100 X), (Gibco) (10 mi) 3. Piruvato de sodio MEM (100 nM, 100 ) , (Gibco) (10 mi) 4. Solución de vitamina MEM (100x) , (Gibco) (10 mi) 5. L-glutamina (200 nM, 100x) , (Gibco) (10 mi) 6. Penicilina-estreptomicina, (Gibco) (10 mi) 7. Solución de reactivo de gentamicina (10 mg/ml), (Gibco) (1 mi) 8. Solución de amortiguador Hepes (1 M) , (Gibco) (2 mi) 9. 2-mercaptoetanol (5 x 10 M) , (Sigma) (1 mi) . Bicarbonato de sodio (Gibco) (2 g) 11. MEDIO RPMI 1640, (Gibco), hasta constituir un litro.

Para uso como un medio de lavado, se agregan un volumen al 5% de FBS (Gemini Bioproducts Inc.) . Para uso como medio de cultivo, se agrega 10% en volumen de FBS (Hyclone) . Ratones sometidos a ayuno fueron anestesiados con Ketamine y después se administró, mediante alimentación por sonda oral, dosis iniciales de composiciones de antígeno/portador preparadas de acuerdo con el método del Ejemplo 14 (0.1 mg de antígeno de OVA y 7.5 mg de portador) . Este procedimiento se repite para tres grupos de ratones de acuerdo con el siguiente protocolo: Grupo 1: Dosificados los días 1, 2, 3, 8, 9 y 10. Grupo 2: Dosificados los días 8, 9, y 10. Grupo 3: Dosificados el día 10. Todos los grupos fueron reforzados con tres dosis diarias consecutivas ocho semanas después de la última dosis de inicio el día 10. Después de completar los procedimientos de dosificación, los ratones fueron sacrificados. Se extrajeron su bazos, y las células esplénicas se obtuvieron y prepararon como sigue: 1. Triturar el bazo con fórceps. 2. Lisar los eritrocitos (células sanguíneas rojas) con NH4C1-Tris 0.1 M (pH 7.1) . 3. Lavar las células esplénicas 3 veces con CRPMI % FBS. 4. Resuspender las células esplénicas en CRPMI 10% FBS. 5. Contar la densidad de células esplénicas o por medio de un hemocitómetro. 6. Ajustar la densidad de células esplénicas a 7 x 106/ml. Se realizaron ensayos en células esplénicas para determinar la proliferación de células T específicas para antígeno OVA. Los materiales utilizados para el ensayo de proliferación son los siguientes: 1. Una placa de fondo plano, de 96 pozos (Corning) ; 2. Timidina, (metil-3H) - (Dupont) ; 3. OVA (4 mg/ml en CRPMI) ; 4. mAb contra CD4 (GKL.5) IgGib de rata (hybridoma para ATCC); contra CD8 (2.43) IgG2b de rata (hibridoma de ATCC) . El procedimiento de ensayo es el siguiente: 1. Agregar 50 µl o 100 µl de suspensión de células esplénicas a cada pozo (7 x 103 células/pozo) 2. Agregar una solución de antígeno de OVA o medio de cultivo. 3. Agregar la cantidad correspondiente de solución de MAB (40 µg/ml) o medio de cultivo al volumen total de 200 µl/pozo. 4. Incubar durante 5 días en un incubador de C02. 5. Un día antes de la recolección, agregar 1 µCi/pozo de 3H-timidina. 6. Recolectar las células y determinar la timidina en un contador Beta. Los anticuerpos contra CD4 o anticuerpos contra CD8 se agregaron a algunos de los pozos para demostrar que la proliferación se debe a células T CD4+. Los resultados de los ensayos de células con una concentración de antígeno de OVA en el ensayo de 200 µg/ml para los grupos de ratones 1, 2 y 3 se ilustra en las figuras 1, 2 y 3, respectivamente. Los resultados de ensayos de células a partir del grupo 3 de ratones con concentraciones variables de antígeno OVA de ensayo se ilustran en la figura 4.

EJEMPLO COMPARATIVO 15A Se sacrificaron ratones no inmunizados. Se obtuvieron las células esplénicas y se realizaron los ensayos de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 15. Los resultados de los ensayos con un ensayo con una concentración de antígeno con OVA de 200 µg/ml se ilustra en la figura 5. Los resultados de los ensayos con concentraciones variables del antígeno de OVA en el ensayo se ilustran en la figura 6.

EJEMPLO 16 EXPERIMENTO DE ANTÍGENQ IN VIVO, EN RATONES Se administró a ratones una composición de antígeno/portador preparada de acuerdo con el método del Ejemplo 14. Se extrajeron muestras de sangre de los ratones de los grupos 1, 2 y 3 del Ejemplo 15 en el día 52 después de una dosis de carga inicial. Se realizaron ensayos en suero utilizando un método ELISA de acuerdo con el procedimiento siguiente para medir la inducción de IgG en suero contra OVA.

DETERMINACIÓN DEL TÍTULO DE IsG EN SUFRO (USE ÚNICAMENTE POZOS INTERIORES EN PLACAS UNITARIAS ÚNICAS) 1. Agregar 100 µl de solución de OVA (4 µg/ml en amortiguador de carbonato, pH 9.6) a cada pozo. 2. Incubar a 4°C durante la noche, o 2 horas a temperatura ambiente, con agitación. 3. Vaciar y lavar las placas cuatro veces con amortiguador de imidazol que tiene Tween 20 a 0.05%, con un enjuagado durante 5 minutos. 4. Agregar 300 µl de una solución BSA e incubar 30 minutos a temperatura ambiente. 5. Lavar como en lo anterior. 6. Agregar 100 mi de una solución de BSA diluida 1/15 cada pozo, excepto en la primera hilera de muestras, primer pozo de curva estándar y los pozos para controles positivo y negativo. 7. Agregar las muestras y controles.

Muestras : Coloque 150 µl de una solución 1/200 de cada muestra en el primer pozo de las hileras de muestra. Realice diluciones seriadas de 50 µl para diluciones triples.

Controles positivos: Coloque 200 µl de suero hiperinmune en una solución 1/200 en el primer pozo. Realice diluciones seriadas dobles de 100 µl hasta 1/64000 (6 pozos) . Control negativo: Utilice suero recolectado de ratones no expuestos (dilución 1/200) : 100 µl. "Fondo" : todos los reactivos excepto el suero en por lo menos dos pozos . 8. Incube durante 2 horas a temperatura ambiente, con agitación. 9. Lave 8 veces con amortiguador imidazol que tiene Tween 20 al 0.05% con un enjuagado durante 5 minutos. 10. Agregue 10 µl de IgG de carnero, contra ratón, conjugado con fosfatasa alcalina (diluido 1/1000 en una solución 1/15 de PBSA/BSA que contiene PEG 6000 al 4%) 11. Incube durante la noche a 4°C después de agitar durante algunos minutos. 12. Lave 8 veces con amortiguador imidazol que tiene Tween 20 al 0.05%. 13. Agregue 100 µl de solución pNPP recién preparada a cada pozo y. revele a temperatura ambiente en la oscuridad. 14. Lea a DO405. 15. Registre el tiempo para DO40S de 1/2000 estándar = 1.2- (aproximadamente 0.5-1 hora). 16. Calcule los títulos de anticuerpo en las muestras por interpolación de DO de las diluciones, (inducción máxima a la cual la DO405 = 3X del fondo) . Los resultados se ilustran en la figura 7.

EJEMPLO 17 EXPERIMENTOS DE ANTÍGENO IN VIVO. EN RATONES Se administró a ratones una dosis primaria subcutánea con antígeno OVA (10 µg) y diez días después, se administró un refi arzo oral (100 µg de antígeno OVA y 10 mg de una mezcla de aminoácidos sulfonados preparados de acuerdo con el método del Ejemplo 10) . El suero de sangre extraída a las 2, 2.5, 5, 6, , 12, 14 y 16 semanas posterior a la dosis inicial, fueron examinados por ELISA de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 16 para medir los títulos de IgG sérica contra OVA. Los resultados se ilustran en la figura 8. Tddas las patentes, solicitudes, publicaciones y métodos de prueba mencionados en la presente se incorporan en este documento como referencia. Muchas variaciones de la presente invención se volverán evidentes a aquéllos expertos en la técnica a la luz de la descripción detallada anterior. La totalidad de tales modificaciones se encuentran dentro del alcance propuesto total de las reivindicaciones anexas. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes :

Claims (13)

1. Una composición, caracterizada porque comprende : (a) un antígeno; y (b) por lo menos un portador que comprende un miembro que se selecciona del grupo que consiste de: (i) un aminoácido acilado; (ii) un poliaminoácido que comprende por lo menos un aminoácido acilado; (iii) un aminoácido sulfonado; (iv) un poliaminoácido que comprende por lo menos un aminoácido sulfonado; o (v) cualquier combinación de los mismos.

2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende una mezcla.

3. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende una microesfera.

4. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el antígeno comprende un péptido.

5. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el portador comprende un aminoácido acilado.

6. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el portador comprende un poliaminoácido que comprende por lo menos un aminoácido acilado.

7. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el portador comprende un aminoácido sulfonado.

8. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el portador comprende un poliaminoácido que comprende por lo menos un aminoácido sulfonado.

9. Una composición, caracterizada porque comprende : (a) ovalbúmina; y (b) por lo menos un portador que comprende un miembro que se selecciona del grupo que consiste de: (i) un aminoácido acilado; (íi) un poliaminoácido que comprende por lo menos un aminoácido acilado; (íii) un aminoácido sulfonado; (iv) un poliaminoácido que comprende por lo menos un aminoácido sulfonado; o (v) cualquier combinación de los mismos.

10. Una forma de dosificación unitaria, caracterizada porque comprende: (A) una composición de conformidad con la reivindicación 1; y . (B) (a) un excipiente, (b) un diluyente, (c) un desintegrante, (d) un lubricante, (e) un plastificante, (f) un colorante, (g) un vehículo de dosificación, o (h) cualquier combinación de los mismos.

11. La forma de dosificación unitaria de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque comprende una tableta, una cápsula o un líquido.

12. Un método para administrar un antígeno a un animal, el método está caracterizado porque comprende administrar oralmente al mamífero una composición de conformidad con la reivindicación 1.

13. Un método para preparar una composición de conformidad con la reivindicación 1, el método está caracterizado porque comprende mezclar un antígeno y un portador que comprende un miembro que se selecciona del grupo que consiste de: (i) un aminoácido acilado; (ii) un poliaminoácido que comprende por lo menos un aminoácido acilado; (iii) un aminoácido sulfonado; (iv) un poliaminoácido que comprende por lo menos un aminoácido sulfonado; o (v) cualquier combinación de los mismos. La presente invención se relaciona con el suministro de antígenos. Los sistemas de suministro que incluyen el antígeno y aminoácidos o poliaminoácidos acilados o sulfonados. También se proporcionan métodos para la preparación y administración de estas composiciones.