MXPA96004539A - Aminoacidos modificados para la distribucion de farmaco - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un sistema de distribución oral, y en particular a los aminoácidos modificados o péptidos para el uso como un sistema de distribución de agentes sensibles, tales como péptidos bioactivos. Los aminoácidos modificados o péptidos pueden formar mezclas no covalentes o microesferas con agentes biológicos activos. Estas mezclas o microesferas son adecuadas para la administración oral de agentes biológicamente activos a animales. Se escriben también los métodos para la preparación de tales aminoácidos y péptidos.

Description

AMINOÁCIDOS MODIFICADOS PARA LA DISTRIBUCIÓN DE FÁRMACO La presente invención se refiere a las com-posiciones apropiadas para la distribución de fármacos, y en particular a las composiciones en las cuales se usan péptidos o aminoácidos modificados como portadores para agentes biológicamente activos incluyendo, pero no limitados a, péptidos bioactivos y similares. Los péptidos o aminoácidos modificados pueden formar mezclas no covalentes o microesferas con agentes biológicamente activos, y son apropiados para la administración oral a animales. Los métodos para la preparación y para la administración de tales composiciones son también descritos .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los medios convencionales para la distribución de agentes biológicamente activos, incluyendo, pero no limitados a agentes terapéuticos y farmacológicos a animales, de manera frecuente están severamente limitados por barreras químicas y físicas impuestas por el cuerpo. La distribución oral de muchos agentes biológicamente activos podría ser la ruta de elección, si no es por la presencia REF: 23054 de barreras químicas y físico-químicas tales como el pH extremo y variante en el tracto gastrointestinal (GI), la exposición a enzimas digestivas poderosas, y la impermeabilidad de membranas gastrointestinales al ingrediente activo. Entre los numerosos agentes farmacológicos que no son apropiados para la administración oral están los péptidos biológicamente activos tales como calcitonina e insulina. Los ejemplos de otros compuestos que son afectados por las barreras fisico-químicas son polisacáridos y mucopolisacáridos , incluyendo, pero no limitados a, heparina, hepar inoides , antibióticos y otros substratos orgánicos. Estos agentes son rápidamente destruidos en el tracto gastrointestinal por la hidrólisis acida, enzimas o similares. Los métodos previos para la administración oral de agentes farmacológicos vulnerables, han confiado en la co-administración de adyuvantes (por ejemplo, resorcinoles y surfactantes no iónicos tales como éter oleico de polioxietileno y éter polietielénico de n-hexadecilo) para incrementar artificialmente la permeabilidad de las paredes intestinales; y en la coadministración de inhibidores enzimáticos (por ejemplo, inhibidor de la tripsina pancreática, diisopropilfluoro-fosfato (DFF) y trasilol) para evitar la degradación enzimática. Los liposomas han sido también descritos como sistemas de distribución de fármaco para la insulina y la heparina. Ver, por ejemplo, Patente Norteamericana No. 4,239,754; Patel y colaboradores, (1976) FEBS Letters Vol. 62, página 60; y Hashimoto y colaboradores (1979) Endocrinol. Japan, Vol. 26, página 337. El uso más amplio de los métodos anteriormente mencionados, sin embargo, como sistemas de distribución de fármaco están excluidos por razones que incluyen: (1) el uso de cantidades tóxicas de adyuvantes o inhibidores; (2) la falta de cargas de peso molecular bajo, apropiadas; (3) la pobre estabilidad y la vida inadecuada en anaquel de los sistemas; (4) la dificultad en la fabricación; y (5) la falla de los sistemas para proteger el ingrediente activo; y (6) la falla de los sistemas para promover la absorción del agente activo. Más recientemente, han sido descritas microesferas o polímeros artificiales, o proteinoides , de aminoácidos mixtos para la distribución de productos farmacéuticos. Por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 4,925,673 describe tales microesferas, así como los métodos para su preparación y uso. Las microesferas proteinoides de la paetnte '673 son útiles para encap-sular un número de agentes activos. Existe una necesidad en la técnica para un sistema de distribución simple y barato, el cual sea fácilmente preparado y el cual pueda distribuir una amplia gama de agentes biológicamente activos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se proporcionan las composiciones para la distribución de agentes biológicamente activos, que incorporan aminoácidos modificados como portadores. Las composiciones comprenden: (A) al menos un agente biológicamente activo, y (B) (a) al menos un aminoácido acilado; (b) al menos un péptido que comprende al menos un aminoácido acilado; o (c) una combinación de (a) y (b); en donde el aminoácido acilado se acila mediante (i) un agente de acilación de cicloalquilo de 3 a 10 átomos de carbono, estando dicho agente substituido con alquilo de 1 a 7 átomos de carbono, alquenilo de 2 a 7 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 7 átomos de carbono, hidroxilo, fenilo, fenoxi, o -CO^R, en donde R es hidrógeno, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono o alquenilo de 2 a 4 átomos de carbono; o (ii) un agente de acilación de alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, substituido con cicloalquilo de 3 a 10 átomos de carbono. En una modalidad alternativa, estas composiciones se usan en formas unitarias de dosis oral. Las composiciones o formas unitarias de dosis oral pueden ser oralmente administradas a animales.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una ilustración gráfica de los resultados de la prueba de cebadura oral en ratas, usando calcitonina con los portadores ciclohexanoil-(L)-leucina, cicloheptanoil-(L) -leucina y 2-metilciclo-hexanoil-(L)-leucina.

La Figura 2 es una ilustración gráfica de los resultados de la prueba de cebadura oral en ratas, usando calcitonina con los portadores ciclohexanoil-(L)-arginina, ciclopentanoil-(L)-ar ginina , y ciclohexanoil-(L)-fenilglicina .

La Figura 3 es una ilustración gráfica de los resultados de la prueba de cebadura oral en ratas, usando calcitonina con los portadores ciclohexanoil-(L)-arginina, ciclohexanoil-(L)-leucina , y ciclohexanoil-( L)-t irosina .

La Figura 4 es una ilustración gráfica de los resultados de la prueba de cebadura oral en ratas, usando calcitonina con los portadores ciclohexanoil-(L)-leucina, ciclohexanoil-(L)-glicina , y ciclopropanoil- ( L) -leucina .

La Figura 5 es una ilustración gráfica de los resultados de la prueba de cebadura oral en ratas, usando calcitonina con el portador ciclohexanoil-(L)-leucina .

Las Figuras 6 y 7 son ilustraciones gráficas de los resultados de las pruebas de cebadura oral en ratas, usando heparina con el portador ciclohexanoil-(L)-leucina .

La Figura 8 es una ilustración gráfica de i°s resultados de la prueba de dosis oral en ratas, usando heparina con el portador ciclohexanoil-(L)-ar ginina .

Las Figuras 9 y 10 son ilustraciones gráficas de los resultados de la prueba de inyección intraduodenal en ratas, usando heparina con el portador ciclo-hexanoil-(L)-leucina.

Las Figuras 11 y 12 son ilustraciones gráficas de los resultados de las pruebas de cebadura oral en ratas, usando heparina de bajo peso molecular con el portador ciclohexanoil-(L)-leucina .

La Figura 13 es una ilustración gráfica de los resultados de la prueba de cebadura oral en ratas, usando cromoglicato disódico con el portador ciclo-hexanoil-(L)-leucina.

La Figura 14 es una ilustración gráfica de los resultados de la prueba de cebadura oral en ratas, usando interferón alfa2b (rhIFN) con los portadores ciclo-hexanoil-(L)-fenilglicina y ciclohexanoil-(L)-arginina .

La Figura 15 es una ilustración gráfica de l°s resultados de la prueba de administración oral en monos, usando interferón alfa2b con los portadores ciclo-hexanoil-fenileno y ciclohexanoil-arginina .

La Figura 16 es una ilustración gráfica de los resultados de las pruebas de cebadura oral y de inyección intraduodenal en ratas, usando interferón alfa2b y el portador ciclohexanoil-(L)-fenilglicina .

La Figura 17 es una ilustración gráfica de los resultados de la prueba de cebadura oral en ratas, usando interferón alfa2b y el portador ciclohexanoil-(L)-fenilglicina.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los aminoácidos modificados y péptidos que incluyen al menos un aminoácido modificado, se pueden usar como portadores para distribuir agentes biológicamente activos tales como péptidos, mucopolisacáridos, carbohidratos, lípidos y plaguicidas. Estos portadores son particularmente útiles para facilitar la distribución de los agentes biológicamente activos, oralmente sensibles. Por ejemplo, las hormonas tales como calcitonina, insulina y polisacáridos tales como heparina, no son considerados oralmente administrables por diversas razones. La insulina, por ejemplo, es sensible a las condiciones de desnaturalización del tracto gastrointestinal (GI). También, la heparina, en virtud de su carga y naturaleza hidrofílica, no es fácilmente absorbida desde el tracto intestinal. En contraste a los aminoácidos modificados y péptidos de la presente invención, los aminoácidos libres no modificados proporcionan protección inadecuada contra la degradación en el tracto gastrointestinal para agentes bioactivos lábiles. Las composiciones de la presente invención son útiles para la administración de agentes biológicamente activos a cualesquiera animales tales como pájaros; mamíferos, tales como primates y particularmente humanos; e insectos. La presente invención, en varias modalidades, usa materiales iniciales fácilmente disponibles y baratos, y proporciona un método de costo efectivo para preparar y aislar aminoácidos modificados y péptidos. El método es simple de realizar y es adecuado a escala industrial, para la producción comercial. Los agentes biológicamente activos apropiados para el uso con los portadores descritos en la presente incluyen, pero no están limitados a, péptidos, y par-ticularmente hormonas peptídicas pequeñas, las cuales por sí mismas pasan lentamente o no del todo a través de la mucosa gastrointestinal y/o son susceptibles de sufrir escisión química por ácidos y enzimas en el tracto gastrointestinal; polisacáridos y particularmente mezclas de mucopolisacáridos, carbohidratos; lípidos; o cualquier combinación de los mismos. Los ejemplos incluyen, pero no están limitados a, hormona del crecimiento humano; hormona del crecimiento bovino; hormona de liberación de hormona del crecimiento; interferones; interleucina 1; insulina; heparina, y particularmente heparina de bajo peso molecular; calcitonina; eritropoyetina ; factor natrurético atrial; antígenos; anticuerpos monoclonales; somatostatina ; adrenocorticotropina ; hormona de liberación de gonadotropina ; oxitocina; vasopresina; vancomicina ; cromilín sódico; desferrioxamina (DFO); o cualquier combinación de los mismos. Además, los portadores de la presente invención pueden ser usados para distribuir otros agentes activos tales como plaguicidas y similares. Un aminoácido es cualquier ácido carboxílico que tiene al menos un grupo amino libre e incluye aminoácidos sintéticos y de origen natural. Los aminoácidos preferidos para el uso en la presente invención son alfa-aminoácidos, y más preferentemente son alfa-aminoácidos de origen natural. Los poli-aminoácidos son ya sea péptidos o dos o más aminoácidos ligados por un enlace formado por otros grupos los cuales pueden estar ligados, por ejemplo, un éster, un anhídrido o un enlace anhídrido. Se hace mención especial de los poli-aminoácidos de origen no natural, y particularmente de los hetero-poliaminoácidos de origen no natural, por ejemplo, de aminoácidos mixtos. Los péptidos son dos o más aminoácidos unidos por un enlace peptídico. Los péptidos pueden variar en longitud desde dipéptidos con dos aminoácidos hasta polipéptidos con varios cientos de aminoácidos. Ver, Wal er, Chambers Biological Dictionary, Cambridge, Inglaterra: Chambers Cambridge, 1989, página 215. Se hace mención especial de los péptidos de origen no natural y particularmente de los péptidos de origen no natural de aminoácidos mixtos. Los péptidos más útiles en la práctica de la presente invención incluyen dipéptidos, tri-péptidos , tetra-péptidos y pentapéptidos . Los péptidos preferidos son di-péptidos y tripéptidos. Los péptidos pueden ser homo- o hetero-péptidos , y pueden incluir aminoácidos naturales, aminoácidos sintéticos, o cualquier combinación de los mismos. Los aminoácidos apropiados para el uso en la presente invención son en general de la fórmula N (R*) - (R - O - OH II 0 en donde R es hidrógeno, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono o alquenilo de 2 a 4 átomos de carbono; 2 R es alquilo de 1 a 24 átomos de carbono, alquenilo de 2 a 24 átomos de carbono, cicloalquilo de 3 a 10 átomos de carbono, cicloalquenilo de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, naftilo, (alquil de 1 a 10 átomos de carbono)-fenilo , (alquenil de 2 a 10 átomos de carbono)-fenilo , (alquil de 1 a 10 átomos de carbono)-naftilo, (alquenil de 2 a 10 átomos de carbono)naftilo , fenil-(alquilo de 1 a 10 átomos de carbono), fenil-(alquenilo de 2 a 10 átomos de carbono), naftil-(alquilo de 1 a 10 átomos de carbono), o naftil-(alquenilo de 2 a 10 átomos de carbono); 2 R está opcionalmente substituido con alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alquenilo de 2 a 4 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono, -OH, 3 -SH, -COpR , cicloalquilo de 3 a 10 átomos de carbono, cicloalquenilo de 3 a 10 átomos de carbono, heteroci.clo que tiene 3 a 10 átomos en el anillo, en donde el heteroátomo es uno o más de nitrógeno, oxígeno, azufre o cualquier combinación de los mismos, arilo, (ale- de 1 a 10 átomos de carbono)arilo , ar(alquilo de 1 a 10 átomos de carbono) o cualquier combinación de los mismos ; 2 R está opcionalmente interrumpido por oxíge-no, nitrógeno, azufre o cualquier combinación de los mismos ; y 3 R es hidrógeno, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, o alquenilo de 2 a 4 átomos de carbono. Los aminoácidos de origen natural preferidos para el uso en la presente invención como aminoácidos o componentes de un péptido, son alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, citrulina, cisteína, cistina, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, ornitina, fenilalanina , prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina, valina, hidroxiprolina , gamma-carboxiglutamato , fenilglicina , o 0-fosfoserina . Los aminoácidos preferidos son arginina, leucina, lisina, fenilalanina , tirosina, triptofano, valina, y fenilglicina . Los aminoácidos de origen no natural, preferidos, para el uso en la presente invención son beta-alanina, ácido alfa-aminobutírico , ácido gamma-amino-butírico, ácido gamma-(aminofenil )-butírico , ácido alfa-amino-isobutírico , ácido épsilon-amino-caproico , ácido 7-amino-heptanoico , ácido beta-aspártico , ácido aminobenzoico , ácido aminofenil-acético , ácido amino-fenil-butírico , ácido gamma-glutámico , cisteína (ACM), épsilon-lisina , épsilon-lisina (A-Fmoc), metionin-sulfona, norleucina, norvalina, ornitina, d-ornitina, p-nitro-fenilalanina , hidroxiprolina, ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico y tioprolina. Los aminoácidos o péptidos son modificados mediante la acilación le al menos un grupo amino libre, con un agente de acilación el cual reacciona con al menos uno de los grupos amino libres presentes. Los ejemplos apropiados, pero no limitantes de agentes de acilación útiles para la modificación de aminoácidos o derivados peptídicos, útiles en la práctica de la presente invención, incluyen agentes de acilación, y particularmente agentes de acilación de cloruro de ácido, que tienen la fórmula 0 R — C — X en donde R es (i) cicloalquilo de 3 a 10 átomos de carbono, opcionalmente substituido con alquilo de 1 a 7 átomos de carbono, alquenilo de 2 a 7 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 7 átomos de carbono, hidroxilo, fenilo, fenoxi, o -C02R 9 » en donde R9 es hidrógeno, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono o alquenilo de 2 a 4 átomos de carbono ; o (ii) alquilo de 1 a 6 átomos de carbono substituido con cicloalquilo de 3 a 10 átomos de carbono; y g X es un grupo saliente. Preferentemente, R es ciclopropilo, ciclopentilo, ciclohexilo o cicloheptilo . En una reacción en la cual la molécula substrato se llega a escindir, parte de ésta (la parte que no contiene el carbono) es usualmente denominada el "grupo saliente". Ver Advanced Organic Chemistry, 2a edición, Jerry March, New York; McGraw-Hill Book (1977). Los grupos salientes típicos incluyen, pero no están limitados a, halógenos tales como cloro, bromo y yodo. Los agentes de acilación preferidos incluyen, pero no están limitados a, haluros de acilo tales como cloruro de ciclohexanoilo , cloruro de ciclopentanoilo , cloruro de cicloheptanoilo y similares; y anhídridos, tales como anhídrido ciclohexanoico , anhídrido ciclo-pentanoico, anhídrido cicloheptanoico , anhídrido ciclo-heptanoico y similares. Los agentes de acilación más preferidos son cloruro de ciclohexanoilo , cloruro de ciclopentanoilo y cloruro de cicloheptanoilo . Los aminoácidos acilados preferidos de la presente invención tienen la fórmula 0 0 R^ — C N — (R? — C)— OH en donde: R es (i) cicloalquilo de 3 a 10 átomos de carbono, opcionalmente substituido con alquilo de 1 a 7 átomos de carbono, alquenilo de 2 a 7 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 7 átomos de carbono, hidroxilo, fenilo, fenoxi o -C0„R , en donde R es hidrógeno, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, o alquenilo de 2 a 4 átomos de carbono; o (ii) alquilo de 1 a 6 átomos de carbono substituido con cicloalquilo de 3 a 10 átomos de carbono; R es hidrógeno, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, o alquenilo de 2 a 4 átomos de carbono; R es alquilo de 1 a 24 átomos de carbono, alquenilo de 2 a 24 átomos de carbono, cicloalquilo de 3 a 10 átomos de carbono, cicloalquenilo de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, naftilo, (alquil de 1 a 10 átomos de carbono )-fenilo , (alquenil de 2 a 10 átomos de carbono) -fenilo , (alquil de 1 a 10 átomos de carbono)-naftilo, (alquenil de 2 a 10 átomos de carbono )-naftilo , fenil-(alquilo de 1 a 10 átomos de carbono), fenil- (alquenilo de 2 a 10 átomos de carbono), naftil-(alquilo de 1 a 10 átomos de carbono) o naftil-(alquenilo de 2 a 10 átomos de carbono); R está opcionalmente substituido con alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alquenilo de 2 a 4 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono, -OH, -SH, -CO R , cicloalquiio de 3 a 10 átomos de carbono, cicloalquenilo de 3 a 10 átomos de carbono, heterociclo que tiene de 3 a 10 átomos en el anillo, en donde el heteroátomo es uno o más de nitrógeno, oxígeno, azufre 0 cualquier combinación de los mismos, arilo, (ale de 1 a 10 átomos de carbono)arilo , ar(alquilo de 1 a 10 átomos de carbono), o cualquier combinación de los mismos; R está opcionalmente interrumpido por oxígeno, nitrógeno, azufre, o cualquier combinación de los mismos; y R es hidrógeno, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, o alquenilo de 2 a 4 átomos de carbono. Los aminoácidos modificados de la presente invención pueden ser preparados mediante la re.ac?ión de los aminoácidos simples, mezclas de dos o más aminoácidos, esteres de aminoácido o amidas de amino-ácido, con un agente de modificación tipo amina que reacciona con las porciones amino libres presentes en los aminoácidos para formar amidas. Los aminoácidos y esteres de aminoácido son fácilmente disponibles de un número de fuentes comerciales tales como Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, I , USA); Sigma Chemical Co.

" (St. Louis, MO, USA); y Fluka Chemical Corp. (Ronkon- koma), NY, USA). Los aminoácidos modificados pueden ser fácilmente preparados mediante métodos conocidos por aquellos 5 expertos en la técnica. Por ejemplo, los aminoácidos se disuelven en una solución alcalina acuosa de un hidróxido metálico, por ejemplo, hidróxido de sodio o potasio y el agente de acilación agregado. El tiempo de reacción puede estar en el intervalo de aproxímao damente 1 hora y aproximadamente 4 horas, preferentemente de aproximadamente 2 - 2.5 horas. La temperatura de la mezcla es mantenida a una temperatura en general en el intervalo de aproximadamente 5°C y aproximadamente 70°C, preferentemente entre aproximadamente 10°C y 5 aproximadamente 50°C. La cantidad de álcali empleada por equivalente de grupos NH~ en los aminoácidos, está en general en el intervalo de entre aproximadamente 1.25 moles y aproximadamente 3 moles, y está preferentemente entre aproximadamente 1.5 moles y aproximadamente o 2.25 moles por equivalente de NH2. El pH de la solución de reacción está en general en el intervalo de aproximadamente pH 8 y aproximadamente pH 13, y está preferentemente entre aproximadamente pH 10 y aproximadamente pH 12. La cantidad de agente de modificación de amino, 5 empleado en relación a la cantidad de aminoácidos, está basada en las moles del NH,-. libre total en los aminoácidos. En general, el agente de modificación de amino se emplea en una cantidad en el intervalo de entre aproximadamente 0.5 y aproximadamente 2.5 equivalentes mol, preferentemente entre aproximadamente 0.75 y aproximadamente 1.25 equivalentes, por equivalente molar de los grupos NH„ totales en los aminoácidos. La reacción de formación de aminoácidos modificados es apagada mediante el ajuste del pH de la mezcla con un ácido apropiado, por ejemplo, ácido clorhídrico concentrado, hasta que el pH alcanza entre aproximadamente 2 y aproximadamente 3. La mezcla se separa con el reposo a la temperatura ambiente, para formar una capa superior transparente y un precipitado blanco o blanquecino. La capa superior se desecha y los aminoácidos modificados se recolectan mediante filtración o decantación. Los aminoácidos modificados crudos son luego mezclados con agua. Los materiales insolubles se eliminan mediante filtración y el filtrado se seca a vacío. El rendimiento de los aminoácidos modificados está en general en el intervalo de aproximadamente 30 y aproximadamente 60%, y usualmente de aproximadamente 45%. La presente invención también contempla los aminoácidos que han sido modificados mediante acilación múltiple, por ejemplo diacilación o triacilación.

Si se desea, pueden ser. usados esteres o amidas de aminoácidos para preparar los aminoácidos modificados de la invención. Los esteres o amidas de aminoácidos, disueltos en un solvente orgánico apropiado tal como dimetilformamida o piridina, se hacen reaccionar con el agente de modificación de amino a una temperatura en el intervalo de entre aproximadamente 5°C y aproximadamente 70°C, preferentemente de aproximadamente 25°C, por un periodo en el intervalo de entre aproximadamente 7 y aproximadamente 24 horas. La cantidad de agentes de modificación de amino, usados con relación a los esteres de aminoácido, son las mismas que las descritas anteriormente para los aminoácidos. Después de esto, el solvente de reacción se elimina bajo presión negativa y opcionalmente el éster o el grupo funcional amida se puede eliminar mediante la hidrólisis del éster de aminoácido modificado, con una solución alcalina apropiada, por ejemplo, hidróxido de sodio 1 N, a una temperatura en el intervalo de entre aproximadamente 50°C y aproximadamente 80°C, preferentemente de aproximadamente 70°C, por un periodo de tiempo suficiente para hidrolizar el grupo éster y formar el aminoácido modificado que tiene un grupo carboxilo libre. La mezcla de hidrólisis se enfría luego hasta la temperatura ambiente y se acidifica, por ejemplo, con una solución acuosa de ácido clorhídrico al 25%, a un pH en el intervalo de entre aproximadamente 2 y aproximadamente 2.5. El aminoácido modificado precipita de la solución y es recuperado por medios convencionales tales como filtración o decantación. Los aminoácidos modificados se pueden purificar mediante precipitación con ácido, recristalización o mediante fraccionamiento sobre soportes de columnas sólidas. El fraccionamiento puede ser realizado en un soporte de columna sólida apropiada, tal como gel de sílice, alúmina, usando mezclas de solventes tales como ácido acético/butanol/agua como la fase móvil; soportes de columna de fase inversa usando mezclas de ácido trif luoroacético/acetonitrilo como la fase móvil; y cromatografía de intercambio iónico usando agua como la fase móvil. Los aminoácidos modificados pueden también ser purificados mediante extracción con un alcohol inferior tal como metanol, butanol o isopropanol, para eliminar las impurezas tales como sales inorgánicas. Los aminoácidos modificados de la presente invención son solubles en general en solución acuosa alcalina (pH mayor o igual a 9.0); parcialmente solubles en etanol, n-butanol y en solución 1:1 (v/v) de tolueno/etanol , e insolubles en agua neutra. Las sales de metal alcalino, por ejemplo, la sal de sodio de los aminoácidos derivados son solubles en general en agua a aproximadamente un pH de 6 - 8. Los péptidos modificados pueden incluir uno o más aminoácidos acilados. Aunque los péptidos modificados lineales incluirán en general únicamente un aminoácido acilado, otras configuraciones peptídicas tales como, pero no limitadas a, péptidos ramificados, pueden incluir más de un aminoácido acilado. Los péptidos se pueden polimerizar con el o los aminoácidos acilados o pueden ser acilados después de la polimerización. Se hace mención especial de los compuestos que tienen la fórmula: en donde A es Try, Leu, Arg, Trp, o Cit; y en donde opcionalmente si A es Try, Arg, Trp o Cit; A está acilado en 2 o más grupos funcionales. Los compuestos preferidos son aquellos en donde A es Try; A es Tyr y está acilado en 2 grupos funcionales; A es Leu; A es Arg; A es Arg y está acilado en 2 grupos funcionales; A es Trp; A es Trp y está acilado en 2 grupos funcionales; A es Cit; y A es Cit y está acilado en 2 grupos funcionales. Se hace también mención especial de los compuestos que tienen la fórmula: en donde A es Arg o Leu y B es Arg o Leu en donde A es Arg o Leu; y en donde si A es Arg, A está opcionalmente acilado en 2 o más grupos funcionales; en donde A es Leu o fenilglicina; en donde A es fenilglicina ; y en donde A es fenilglicina . Si el aminoácido es multifuncional , por ejemplo, tiene más de un grupo -OH, -NH^ o -SH, entonces éste puede estar opcionalmente acilado en uno o más grupos funcionales para formar, por ejemplo, un enlace éster, amida o tioéster. En una modalidad, los aminoácidos o péptidos modificados se pueden usar directamente como un portador de distribución de fármaco simplemente mediante el mezclado de uno o más aminoácidos o péptidos con el ingrediente activo antes de la administración. En una modalidad alternativa, los aminoácidos modificados se pueden usar para -formar microesferas que contienen el agente activo. Los péptidos o aminoácidos modificados de la invención son particularmente útiles para la administración oral de ciertos agentes biológicamente activos, por ejemplo, pequeñas hormonas peptídicas, las cuales, por sí mismas, no pasan o sólo pasan lentamente a través de la mucosa gastrointestinal y/o son susceptibles a escisión química por los ácidos y enzimas en el tracto gastrointestinal. Si los aminoácidos modificados o péptidos van a ser convertidos en microesferas tales como micro-esferas proteinoides, la mezcla se calienta opcionalmente a una temperatura en el intervalo de entre aproximadamente 20 y aproximadamente 50°C, preferentemente de aproximadamente 40°C, hasta que el o los aminoácidos modificados se disuelven. La solución final contiene entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 2,000 mg de aminoácidos modificados o péptidos por mililitro de solución, preferentemente entre aproximadamente 1 y aproximadamente 500 mg por mililitro. La concentración del agente activo en la solución final varía y es dependiente de la dosis requerida para el tratamiento. Cuando es necesario, la concentración exacta puede ser determinada mediante, por ejemplo, análisis de cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa. Cuando los aminoácidos modificados o péptidos se usan para preparar microesferas, otro procedimiento útil es como sigue: los aminoácidos modificados o péptidos se disuelven en agua desionizada a una concentración en el intervalo de entre aproximadamente 75 y aproximadamente 200 mg/ml, preferentemente aproximadamente 100 mg/ml a una temperatura entre aproxima-damente 25°C y aproximadamente 60°C, preferentemente aproximadamente 40°C. El material particulado remanente en la solución puede ser eliminado mediante medios convencionales tales c ^ o filtración. Después de esto, la solución del péptido o aminoácido modificado, mantenido a una temperatura de aproximadamente 40°C, se mezcla 1:1 (v/v) con una solución acida acuosa (también a aproximadamente 40°C) que tiene una concentración de ácido en el intervalo de entre aproximadamente 0.05 N y aproximadamente 2 N, preferentemente aproximadamente 1.7 N. La mezcla resultante se incuba además a 40°C por un periodo de tiempo efectivo para la formación de microesferas, como se observa mediante microscopía de luz. En la práctica de esta invención, el orden preferido de adición es agregar la solución de pépido o aminoácido modificado a la solución acida acuosa.

Los ácidos adecuados para la formación de microesferas incluyen cualquier ácido el cual (a) no afecte de manera adversa los aminoácidos modificados o los péptidos, por ejemplo, inicie o propague descomposición química ; (b) no interfiera con la formación de micro- esferas; (c) no interfiera con la incorporación de microesreras de la carga; y (d) no interactúe adversamente con la carga. Los ácidos preferidos para el uso en esta invención incluyen ácido acético, ácido cítrico, ácido clorhídrico, ácido fosfórico, ácido málico, y ácido maleico . En la práctica de la invención, puede ser incorporado un aditivo para estabilizar microesferas, en la solución de ácido acuoso o en la solución de ácido modificado o de proteína, antes del proceso de formación de microesferas. Con algunos fármacos la presencia de tales aditivos promueve la estabilidad y/o la disper-sabilidad de las microesferas en solución. Los aditivos de estabilización pueden ser empleados a una concentración en el intervalo de entre aproximadamente 0.1 y 5% (p/v), preferentemente aproximadamente 0.5% (p/v). Los ejemplos apropiados, pero n° limitantes de aditivos de estabilización de micro-esferas, incluyen goma de acacia, gelatina, metilcelulosa, polietilenglicol y polilisina. Los aditivos de estabilización preferidos son goma de acacia, gelatina y metilcelulosa. Bajo las condiciones anteriores, las moléculas de polipéptido o aminoácido modificado forman micro-esferas del tipo matriz hueca o sólida, en donde la carga está distribuida en una matriz portadora o en micro-esferas tipo cápsula que encapsulan la carga líquida o sólida. Si las microesferas de aminoácido modificado o de péptido se forman en presencia de un material soluble, por ejemplo, un agente farmacéutico en la solución acida acuosa anteriormente mencionada, este material será encapsulado dentro de las microesferas. De esta manera, se pueden encapsular materiales farmacológicamente activos tales como péptidos, proteínas y polisacáridos , así como moléculas orgánicas cargadas," por ejemplo, agentes antimicrobianos, los cuales normalmente tienen pobre biodisponibilidad mediante la ruta oral. La cantidad del agente farmacéutico que puede ser incorporada por la microesfera es dependiente de un número de factores que incluyen la concentración del agente en la solución, así como la afinidad de la carga por el portador. Las microesferas de péptido o de aminoácido modificado de la invención no alteran las propiedades fisiológicas y biológicas del agente activo. Además, el proceso de encapsulación no altera las propiedades farmacológicas del agente activo. Puede ser incorporado cualquier agente farmacológico dentro de las microesferas de aminoácido. El sistema es par-ticularmente ventajoso para la distribución de agentes químicos o biológicos que podrían ser de otro modo destruidos o hechos punos efectivos por las condiciones encontradas dentro del cuerpo del animal, al cual éste se administra, antes de que la microesfera alcance su zona objetivo (por ejemplo, el área en la cual el contenido de la microesfera va a ser liberado) y los agentes farmacológicos que son pobremente absorbidos en el tracto gastrointestinal. Las zonas objetivo pueden variar dependiendo del fármaco empleado. El tamaño de partícula de la microesfera juega un papel importante en la determinación de la liberación del agente activo en la área objetivo del tracto gastrointestinal. Las microesferas preferidas tienen diámetros entre aproximadamente menores o iguales a 0.1 mieras y aproximadamente 10 mieras, preferentemente entre aproximadamente 0.5 mieras y aproximadamente 5 mieras. Las microesferas son suficientemente pequeñas para liberar de manera efectiva el agente activo en el área objetivo dentro del tracto gastrointestinal tal como, por ejemplo, entre el estómago y el yeyuno. Pueden también ser administradas pequeñas microesferas parenteralmente al suspenderse en un fluido portador apropiado (por ejemplo, solución salina isotónica) e inyectarlas directamente hacia el sistema circulatorio, intramuscular o subcutáneamente.' El modo de administración seleccionado variará, por supuesto, dependiendo del requerimiento del agente activo que se administre. Las microesferas de aminoácido grandes (mayores de 50 mieras) tienden a ser menos efectivas como sistemas de distribución oral. El tamaño de las microesferas formadas mediante el contacto de los aminoácidos o péptidos modificados con agua o una solución acuosa que contiene agentes activos, puede ser controlada mediante la manipulación de una variedad de parámetros físicos o químicos, tales como el pH, osmolaridad o fuerza iónica de la solución de encapsulamiento , el tamaño de los iones en la solución y mediante la elección del ácido usado en el proceso de encapsulamiento. Típicamente, las composiciones farmacológicas de la presente invención se preparan mediante el mezclado de una solución acuosa del portador con una solución acuosa del ingrediente activo, justo antes de la admi-nistración. Alternativamente, el portador y el ingrediente biológicamente activo pueden ser mezclados durante el proceso de fabricación. Las soluciones pueden contener opcionalmente aditivos tales como sales de amortiguador de fosfato, ácido cítrico, ácido acético, gelatina y goma de acacia.

En la práctica de la invención, se pueden incorporar aditivos de estabilización dentro de la solución portadora. Con algunos fármacos, la presencia de tales aditivos promueve la estabilidad y la disper-sabilidad del agente en la solución. Pueden ser empleados aditivos de estabilización a una concentración en el intervalo de entre aproximadamente 0.1 y 5% (p/v), preferentemente de aproximadamente 0.5% (p/v). Los ejemplos adecuados pero no limitantes de aditivos de estabilización incluyen goma de acacia, gelatina, metilcelulosa, polietilenglicol y polilisina. Los aditivos de estabilización preferidos son goma de acacia, gelatina y metilcelulosa. La cantidad de agente activo en la composición típicamente es una cantidad farmacológica o biológicamente efectiva. Sin embargo, la cantidad puede ser menor que una cantidad farmacológica o biológicamente efectiva, cuando la composición se usa en una forma de dosis unitaria, tal como una cápsula, una tableta o un líquido, debido a que la forma de dosis unitaria puede contener una pluralidad de composiciones de portador/agente biológicamente activo, o pueden contener una cantidad farmacológica o biológicamente efectiva, dividida. Las cantidades efectivas totales serán admi-nistradas mediante unidades acumulativas que contienen, en total, cantidades farmacológica o biológicamente activas del agente biológicamente activo. La cantidad total del agente biológicamente activo a ser usada puede ser determinada por aquellos expertos en la técnica. Sin embargo, se ha encontrado sorprendentemente que con ciertos agentes biológicamente activos, tales como calcitonina, el uso de los portadores actualmente descritos proporciona distribución extremadamente eficiente. Por lo tanto, pueden ser adminis-tradas al sujeto cantidades menores del agente biológicamente activo que aquellas usadas en las formas de dosis unitaria o sistemas de distribución anteriores, mientras que aun se logren los mismos niveles sanguíneos y efectos terapéuticos. La cantidad de portador en la presente composición es una cantidad efectiva de distribución y puede ser determinada para cualquier portador particular o portador biológicamente activo, mediante métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica. Las formas de dosis unitaria pueden también incluir cualquiera de los excipientes; diluyentes; desintegradores; lubricantes; plastificantes; colorantes; y vehículos de dosificación, incluyendo, pero no limitados a agua, 1 , 2-propanodiol , etanol, aceite de oliva o cualquier combinación de los mismos.

La administración de las presentes composiciones o formas de dosis unitaria es preferentemente oral o mediante inyección intraduodenal.

EJEMPLOS La invención será ahora ilustrada en los siguientes ejemplos no limitantes, los cuales son ilustrativos de la invención pero no se pretende limitar el alcance de la invención.

EJEMPLO 1 PREPARACIÓN DE N-CICL0HEXAN0IL-(L)-TIR0SINA La (L)-tirosina (61.6 g, 0.34 mol) se disolvió en 190 mi de hidróxido de sodio 2 N. Se agregó gota a gota a la mezcla cloruro de ciclohexanoilo (49.32 mi, 0.34 mol). Se agregó hidróxido de sodio 2 N acuoso, adicional y la mezcla de reacción se dejó agitar a temperatura ambiente por 2 horas. La mezcla se acidificó luego a pH 9.5 con ácido clorhídrico acuoso (4:1). Se formó un precipitado el cual se separó mediante filtración a vacío. Los sólidos se disolvieron en hidróxido de sodio 2 N y se secaron mediante liofilización para proporcionar 33.5 g de , 0-diciclohexanoil-(L)-tirosina . El producto se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice usando butanol/ácido acético/agua como el sistema eluyente. El producto crudo fue un sólido blanco. 1. Espectro de Masa: M + 23 m/e 314. 2. RMN H (300 MHz, DMS0-d6) : d = 6.8 (d, 2H); 6.4 (d, 2H); 4.4 (m, 1H) ; 2.5 (ddd, 2H); 2.0 (m, 2H) ; 1.6 (m, 10H); 1.2 (m, 10H). 3. IR (KBr) cm-1: 3350, 2900, 2850, 1600, 1520, 1450, 1400, 1300.

EJEMPLO 2 PREPARACIÓN DE N-CICL0HEXAN0IL-(L)-ARGININA .

La (L)-arginina (103.2 g, 0.6 mol) se disolvió en 600 mi de hidróxido de sodio 2 N. Se agregó gota gota a la mezcla, cloruro de ciclohexanoilo (87 mi, 0.6 mol). La mezcla de reacción se mantuvo a 50°C por 2 horas. La mezcla se enfrió luego a temperatura ambiente y se acidificó a pH 2.3 con ácido clorhídrico acuoso (4:1). El precipitado que se formó fue separado mediante decantación. Los sólidos se disolvieron en hidróxido de sodio 2 N y se secaron mediante liofilización para proporcionar 64.1 g de la N-ciclohexanoil-(L)-arginina cruda. El producto se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice usando butanol/ácido acético/agua como el sistema eluyente. Los productos aislados fueron N-ciclohexanoil-(L)-arginina y N(alfa)-N( gamma )-diciclohexanoil-(L) -arginina.

N-ciclohexanoil-(L) -arginina: 1. Espectro de Masa: M + 1 m/e 395. 2. RMN XH (300 MHz, DMS0-d6): ppm delta - 8.75 (amplio, 1H); 7.6 (amplio, 5H); 4.?" (m, 1H); 3.05 (m, 2H); 2.15 (m, 1H); 1.1- 1.5 ( m amplio , 14H) . N( alfa ),N( gamma) -diciclohexanoil-(L)-arginina: 1. Espectro de masa: M + 1 m/e 285. 2. RMN 1H: (300 MHz, DMS0-d6): d = 2.0 (m, 3H); 1.8-1.4 (m amplio, 17H); 1.3-1.0 (m amplio , 20H) .

EJEMPLO 3 PREPARACIÓN DE N-CICL0HEXAN0IL-(L)-CITRULINA.

La L-citrulina (35.2 g, 0.2 mol) se disolvió en 200 mi de hidróxido de sodio 2 N. Se agregó gota a gota a la mezcla, cloruro de ciclohexanoilo (29 mi, 0.2 mol). La mezcla de reacción se mantuvo a aproximadamente 25°C por 1 hora. La mezcla se acidificó luego a pH 2.6 con ácido clorhídrico acuoso (4:1). El precipitado que se formó fue separado mediante decantación. Los sólidos se disolvieron en hidróxido de sodio 2 N a pH 6.5, y se secaron mediante liofilización para proporcionar 44.2 g de la N-ciclohexanoil-(L )-citrulina . El producto fue un sólido blanco. 1. Espectro de Masa: M + 23 m/e 308. 2. RMN l R (300 MHz, DMS0-d6): d = 4.1 (dd, 1H); 2.9 (t, 2H); 2.1 (m, 2H); 1.6-1.2 (m amplio , 14H) . 3. IR (KBr) cm-1: 3400, 3300, 2950, 2850, 1700, 1650, 1600, 1450, 1400 cm"1.

EJEMPLO 4 PREPARACIÓN DE N-CICL0PENTAN0IL-(L)-ARGININA .

La (L)-arginina (32.8 g, 0.19 moles) se disolvió en 188 mi de hidróxido de sodio 2 N. Se agregó gota a gota a la mezcla, cloruro de ciclohepentanoilo (22.9 mi, 0.19 mol). La mezcla de reacción se mantuvo a aproxi-madamente 25°C por 2 horas. La mezcla se acidificó luego a pH 1.5 con ácido clorhídrico acuoso (4:1). El precipitado que se formó fue separado mediante decantación. Los sólidos se disolvieron en hidróxido de sodio 2 N a pH 7.5, y se secaron mediante liofilización para proporcionar 67.4 g de la N-ciclopentanoil-(L)-arginina . El producto fue un sólido blanco. Espectro de masa M + 1 m/e 271.

EJEMPLO 5 PREPARACIÓN DE N-CICL0HEXAN0IL-( t )-ARGININA .

La (t)-arginina (14.2 g, 0.1 mol) se disol-vio en 100 mi de hidróxido de sodio 2 N. Se agregó gota a gota a la mezcla, cloruro de ciclohexanoilo (13 mi, 0.098 mol). La mezcla de reacción se mantuvo a 25°C por 2 horas. La mezcla se enfrió luego a temperatura ambiente y se acidificó a pH 6.6 con ácido clorhídrico acuoso (4:1). El precipitado blanco que se formó fue separado mediante decantación. Los sólidos se disolvieron en un mínimo de hidróxido de sodio 2 N. El producto, un sólido blanco (11.6 g, 49%) se aisló mediante la disminución del pH del purificado mediante acidificación con ácido clorhídrico acuoso (4:1) a un pH de aproxi-madamente 7-9, 1. Espectro de masa: M + 1 m/e 2423 2. RMN XH (300 MHz, D20): ppm delta = 4.9 (s, 1H); 2.2 (m, 1H) ; 1.7-1.4 (m, 5H) ; 1.3-1.0 (m, 5H); 0.8 (s, 9H). 3. IR (KBr) cm"1: 3350, 2950, 2850, 1550, 1500, 1400 cm"1 Siguiendo el procedimiento del Ejemplo 1, han sido sintetizados los siguientes aminoácidos y péptidos : ciclohexanoil-Ala , ácido m-( ciclohexanoil-amino )benzoico , ácido p-( ciclohexanoilamino) benzoico , ácido 4-(ciclohexanoilamino )butí rico , ácido 6-(ciclo-hexanoilamino)hexanoico , ácido ciclohexanoilantranílico , ciclohexanoil-Arg-Leu , ciclohexanoil-Asp , isatoico-anhídrido-Asp , ciclohexanoil-Glu, ciclohexanoil-Gly , ciclohexanoil-Gly-Arg , ciclohexanoil-Ile , ciclohexanoil-Leu, ciclopentanoil-Leu , ciclopropanoil-Leu , 3-metil-ciclohexanoil-Leu , 2-metilciclohexanoil-Leu , 4-metil-ciclohexanoil-Leu , ciclohexanoil-( D)-Leu , ciclohexanoil-(t)-Leu, ciclohexanoil-Leu-Arg , ciclohexanoil-Leu-Leu , ciclohexanoil-(D)-Leu-(L)-Leu, ciclohexanoil-Leu-Lys-Val, ciclohexanoil-Lys , ciclohexanoil-Orn , ciclohexanoil-Phe , cicloheptanoil-Phg , ciclohexilpropanoil-Phg, ciclo-hexanoil-Phg , ciclopentanoil-Phg , ciclopropanoil-Phg , 4-metilciclohexanoil-Phg , ciclohexanoil-(D)-Phg , ciclo-hexanoil-Tio , ciclohexanoil-Trp , ciclohexanoil-Tyr-Leu , ciclohexanoil-Val , ciclopentanoil-Val , ciclohexanoil-Val-Val, cicloheptanoil-Leu y ciclohexilpropanoil-Leu .

EJEMPLO 6 PREPARACIÓN DE SOLUCIONES DE DOSIFICACIÓN DE CALCITONINA: En un tubo de ensayo de 400 mg de ciclo-hexanoil-(L)-leucina se agregaron 2.9 mi de etanol al 15%. La solución se agitó y se agregó hidróxido de sodio (1.0 N) para elevar el pH a 7.2. Se agregó agua para llevar el volumen total a 4.0 mi. La muestra fue de una concentración de portador de 200 mg/ml. Se agregó calcitonina (10 µg) a la solución. La concentración total de calcitonina fue de 2.5 µg/ml. Siguiendo un procedimiento similar se preparó una segunda solución que tenía 400 mg de cicloheptanoil-(L)-leucina como el portador, y una tercera solución que tenía 2-metilciclohexanoil-(L)-leucina como el portador. Cada solución tuvo una concentración de calcitonina de 2.5 µg/ml).

EJEMPLO 7 EXPERIMENTOS In Vivo CON CALCITONINA EN RATAS Para cada muestra se anestesiaron un grupo de ratas en ayunas. A las ratas se les administró, mediante cebadura oral o mediante inyección intraduodenal, una de las dosificaciones de calcitonina/portador preparadas en el Ejemplo 6. La concentración de calcitonina en cada muestra fue de 2.5 µg/ml. A cada rata se le administró una dosis de cuatro (4) ml/kg cada una. Las muestras sanguíneas se recolectaron en serie de la arteria de la cola. El calcio sérico se determinó mediante la prueba con el Equipo de Calcio Demand MR (disponible de Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri, USA). Los resultados de la prueba se ilustran en la Figura 1.

EJEMPLO 8 Se prepararon tres muestras de 400 mg/kg de ciclohexanoil-( L) -arginina y 10 µg/kg de calcitonina, 400 mg/kg de ciclopentanoil-(L)-ar inina y 10 µg/kg de calcitonina, 400 mg/kg de ciclohexanoil-(L)-fenil-glicina y 10 µg/kg de calcitonina, respectivamente. Las muestras se dieron a ratas en ayunas como se des-cribe en el Ejemplo 7. Los resultados de la prueba se ilustran en la Figura 2.

EJEMPLO 9 Se preparó una muestra que tiene una mezcla de 266 mg/kg de ciclohexanoil-(L)-arginina , 266 mg/kg de ciclohexanoil-( L)-leucina , 266 mg/kg de ciclohexanoil-(L)-tirosina y 10 µg/kg de calcitonina. La muestra se dio a ratas en ayunas como se describe en el Ejemplo 7. Los resultados de la prueba se ilustran en la Figura 3.

EJEMPLO 10 Se preparó una serie de muestras que tenían 400 mg/kg de ciclohexanoil-(L)-leucina y 3 µg/kg de calcitonina, 400 mg/kg de ciclohexanoil-(L)-glicina y 3 µg/kg de calcitonina, 400 mg/kg de ciclopropanoil-(L)-leucina y 3 µg/kg de calcitonina, respectivamente. Las muestras se dieron a las ratas en ayunas como se describe en el Ejemplo 7. Los resultados de la prueba se ilustran en la Figura 4.

EJEMPLO 11 Se prepararon dos muestras, que tenían 400 mg/kg de ciclohexanoil-(L)-leucina y 10 µg/kg de calci-tonina, y ciclohexanoil-(L)-leucina y 3 µg/kg de calcitonina, respectivamente. Las muestras se dieron a las ratas en ayunas como se describe en el Ejemplo 7. Los resultados de la prueba se ilustran en la Figura 5.

EJEMPLO 12 PREPARACIÓN DE SOLUCIONES DE DOSIFICACIÓN DE HEPARINA: Siguiendo el procedimiento general publicado por Santiago, N. en Proc. Int. Symp. Control Reí. Bioact. Mat., Vol. 19, páginas 514-515, (1992), se prepararon las muestras de heparina. En un tubo de ensayo se agregaron 900 mg de ciclohexanoil-(L) -leucina a 4.5 mi de agua. Se disolvió heparina (74.7 mg ) en 4.5 mi de una solución de ácido cítrico 1.7 N y goma arábiga al 0.5%. Las soluciones se calentaron a aproximadamente 40°C y se mezclaron. La muestra tuvo una concentración de portador de 100 mg/ml. La concentración de heparina fue de 8.3 mg/ml. Siguiendo un procedimiento similar, se preparó una segunda muestra que tenía 900 mg de ciclohexanoil-(L)-leucina y heparina (150 mg ) . La concentración de la heparina fue de 16.7 mg/ml.

EJEMPLO 13 EXPERIMENTOS DE HEPARINA In Vivo, EN RATAS Para cada muestra se anestesiaron un grupo de ratas en ayunas. A las ratas se les administró, mediante cebadura oral, una de las dosis de heparina/ portador preparadas en el Ejemplo 11. La concentración de heparina en las muestras fue de 8.3 y 16.7 mg/ml, respectivamente. A cada rata se le administró una dosis de aproximadamente tres (3) ml/kg cada una. Las muestras sanguíneas fueron recolectadas en serie de la vena de la cola. La actividad de la heparina se determinó mediante la utilización del tiempo de tromboplastina parcial, activada (APTT) de acuerdo al método de Henry, J- B., Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods; Philadelphia , PA; WB Saunders (1979). Los resultados de la prueba se ilustran en la Figura 6.

EJEMPLO 14 Se prepararon dos muestras, teniendo cada una 600 mg/kg de ciclohexanoil-(L)-leucina y 50 mg/kg de heparina, y 600 mg/kg de ciclohexanoil-(L)-leucina y 100 mg/kg de heparina, respectivamente. Las muestras se dieron a ratas en ayunas como se describe en el Ejemplo 13. Los resultados de la prueba se ilustran en la Figura 7.

EJEMPLO 15 Se prepararon dos muestras, teniendo cada una 100 mg/kg de ciclohexanoil-(L)-arginina y 100 mg/kg de heparina, y 600 mg/kg de ciclohexanoil-(L)-arginina y 100 mg/kg de heparina, respectivamente. Las muestras se dieron a ratas en ayunas como se describe en el Ejemplo 12. Los resultados de la prueba se ilustran en la Figura 8.

EJEMPLO 16 Se preparó una muestra que tenía 300 mg/kg de ciclohexanoil-(L)-leucina y 25 mg/kg de heparina. La muestra se dio a ratas mediante inyección intraduo-denal . Como una comparación, se administró heparina a una dosis de 25 mg/kg, mediante inyección intraduodenal. Los resultados de la prueba se ilustra gráficamente en la Figura 9.

EJEMPLO 17 Se preparó una muestra que tenía 300 mg/kg de ciclohexanoil-(L)-leucina y 50 mg/kg de heparina. La muestra se dio a ratas mediante inyección intraduodenal. Como una comparación, se administró ciclo-hexanoil-(L )-leucina sin heparina, mediante inyección intraduodenal. Después de 30 minutos esto fue seguido por una dosis de heparina, 50 mg/kg se administraron mediante inyección intraduodenal. Una segunda comparación, una dosis de heparina sola, 50 mg/kg, se administró también mediante inyección intraduodenal. Los resultados de la prueba se ilustran gráficamente en la Figura 10.

EJEMPLO 18 P REPARACIÓN DE MUESTRAS DE HEPARINA DE BAJO PESO MOLECULAR Muestras que contenían heparina de bajo peso molecular, se prepararon como se describe en el Ejemplo 12.

EJEMPLO 19 EXPERIMENTOS In Vivo DE HEPARINA DE BAJO PESO MOLECULAR, EN RATAS Se prepararon muestras que contenían heparina-de bajo peso molecular (LMWH) y ciclohexanoil-(L)-leucina, como se describe en el Ejemplo 19, y se administraron mediante cebadura oral a un grupo de ratas en ayunas. Las muestras sanguíneas se recolectaron en serie de la arteria de la cola. La heparina de bajo peso molecular (LMWH) se determinó en muestras de plasma. El nivel de plasma se midió con un equipo de ensayo antiFactor Xa disponible de Chromogenix A.B., Suecia. Los resultados de la prueba se ilustran en la Figura 11.

EJEMPLO 20 Se preparó una muestra que tenía 300 mg/kg de ciclohexanoil-(L)-leucina y 8,000 Ul/kg de heparina de bajo peso molecular. La muestra se dio a ratas en ayunas como se describe en el Ejemplo 20. Los resultados de la prueba se ilustran en la Figura 12.

EJEMPLO 21 EVALUACIÓN In Vivo de PREPARACIONES DE CR0M0GLIC0LAT0 EN RATAS Siguiendo los procedimientos descritos en la presente, se prepararon muestras que contenían los portadores de la presente invención y el cromoglicolato disódico. La muestra, en ácido cítrico 0.85 N y 0.5% de acacia, contenían 400 mg/kg de ciclohexanoil-(L)-leucina y 50 mg/kg de cromoglicato disódico (DSCG). El pH de esta muestra fue de 7.1. Se preparó una segunda muestra a un pH de 4.6. A los animales se les administraron las muestras mediante cebadura oral.

Como una comparación el DSCG se distribuyó en agua, pH 7.2, y en ácido cítrico, pH 3.7. La distribución se evaluó mediante el uso del procedimiento descrito por A. Yoshimi en Pharmcobio-Dyn . , 15, páginas 681-686, (1992). Los resultados de las pruebas se ilustran en la Figura 13.

EJEMPLO 22 EVALUACIÓN In Vivo DE PREPARACIONES DE INTERFERON EN RATAS Siguiendo los procedimientos descritos en la presente, se prepararon muestras que contenían los portadores de la presente invención, en una solución amortiguadora de clorhidrato de Trizma MR (Tris-HCl) a un pH de aproximadamente 7-8, e interferón alfa-2b.

A los animales se les administró el fármaco mediante cebadura oral. La distribución se evaluó mediante el uso de un ensayo de ELISA para interferón alfa humano. Se prepararon dos muestras que tenían 800 mg/kg de ciclohexanoil-(L)-fenilglicina en una solución amortiguada, y 1,000 µg/kg de interferón alfa-2b, y 800 mg/kg de ciclohexanoil-(L) -arginina en una solución amortiguada y 1,000 µg/kg de interferón alfa-2b. Las muestras se dieron a ratas en ayunas, mediante cebadura oral. Los resultados de la prueba se ilustran en la Figura 14.

EJEMPLO 23 Se prepararon dos muestras que tenían 800 mg/kg de ciclohexanoil-(L)-fenilglicina en una solución amortiguada y 1,000 µg/kg de interferón alfa-2b, y ciclohexanoil-(L)-arginina en una solución amortiguada y 1,000 µg/kg de interferón alfa-2b. Las muestras se administraron oralmente a monos. Los resultados de la prueba se ilustran en la Figura 15.

EJEMPLO 24 Se preparó una muestra que tenía 400 ^µg/kg de ciclohexanoil-(L)-fenilglicina en una solución amortiguada y 500 µg/kg de interferón alfa-2b. La muestra se dio a ratas en ayunas, mediante cebadura oral. La muestra se dio también a un segundo grupo de ratas mediante inyección intraduodenal. Los resultados de la prueba se ilustran en la Figura 16.

EJEMPLO 25 Se prepararon tres muestras que tenían 400 mg/kg de ciclohexanoil-(L)-fenilglicina en una solución amortiguada con 1,000 µg/kg de interferón alfa-2b, 500 µg/kg de interferón alfa-2b y 250 Jig /kg de interferón alfa-2b. Las muestras se dieron a ratas en ayunas mediante cebadura oral. Los resultados de la prueba se ilustran en la Figura 17. Todas las patentes, solicitudes de patente, publicaciones de literatura y métodos de prueba citados en la presente, se incorporan en la misma por referencia . Serán sugeridas por sí mismas muchas variaciones de la presente invención a aquellos expertos en la técnica, a la luz de la descripción detallada anterior. Todas las modificaciones tales están dentro del alcance completo pretendido de las reivindicaciones anexas .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:

Claims (52)

REIVINDICACIONES

1. Una composición, caracterizada porque comprende : (A) al menos un agente biológicamente activo, y (B) (a) al menos un aminoácido acilado; (b) al menos un péptido que comprende al menos un aminoácido acilado; o (c) una combinación de (a) y (b); en donde el aminoácido acilado se acila mediante (i) un agente de acilación de ciclo-alquilo de 3 a 10 átomos de carbono, estando dicho agente substituido con alquilo de 1 a 7 átomos de carbono, alquenilo de 2 a 7 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 7 átomos de carbono, hidroxilo, fenilo, fenoxi, o -C0~R, en donde R es hidrógeno, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono o alquenilo de 2 a 4 átomos de carbono; o (ü) un agente de acilación de alquilo de 1 a 6 átomos de carbono substituido con cicloalquilo de 3 a 10 átomos de carbono.

2. La composición de conformidad con la rei-vindicación 1, caracterizada porque el aminoácido tiene la fórmula H - N en donde es hidrógeno, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono o alquenilo de 2 a 4 átomos de carbono; 2 R es alquilo de 1 a 24 átomos de carbono, alquenilo de 2 a 24 átomos de carbono, cicloalquilo de 3 a 10 átomos de carbono, cicloalquenilo de 3 a 10 átomos de carbono, fenilo, naftilo, (alquil de 1 a 10 átomos de carbono) -fenilo , (alquenil de 2 a 10 átomos de carbono )-fenilo , (alquil de 1 a 10 átomos de carbono)-naftilo, (alquenil de 2 a 10 átomos de carbono )naftilo , fenil-(alquilo de 1 a 10 átomos de carbono), fenil-(alquenilo de 2 a 10 átomos de carbono), naftil-(alquilo de 1 a 10 átomos de carbono), o naftil-( alquenilo de 2 a 10 átomos de carbono); 2 R está opcionalmente substituido con alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alquenilo de 2 a 4 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono, -OH, 3 -SH , -C0~R , cicloalquilo de 3 a 10 átomos de carbono, cicloalquenilo de 3 a 10 átomos de carbono, heterociclo que tiene 3 a 10 átomos en el anillo, en donde el hete-roátomo es uno o más de nitrógeno, oxígeno, azufre o cualquier combinación de los mismos, arilo, (ale- de 1 a 10 átomos de carbono)ar ilo , ar(alquilo de 1 a 10 átomos de carbono) o cualquier combinación de los mismos ; 2 R está opcionalmente interrumpido por oxígeno, nitrógeno, azufre o cualquier combinación de los mismos; y 3 R es hidrógeno, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, o alquenilo de 2 a 4 átomos de carbono.

3. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el aminoácido acilado tiene la fórmula 0 C — (R° — C) — OH en donde: R es (i) cicloalquilo de 3 a 10 átomos de carbono, opcionalmente substituido con alquilo de 1 a 7 átomos de carbono, alquenilo de 2 a 7 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 7 átomos de carbono, hidroxilo, fenilo, fenoxi o -C0 R en donde R es hidrógeno, alquilo de 1 a 4 átomos ?e carbono, o alquenilo de 2 a 4 átomos de carbono ; o (ii) alquilo de 1 a 6 átomos de carbono substituido con cicloalquilo de 3 a 10 átomos de carbono; R es hidrógeno, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, o alquenilo de 2 a 4 átomos de carbono; R es alquilo de 1 a 24 átomos de carbono, alquenilo de 2 a 24 átomos de carbono, cicloalquilo de 3 a 10 átomos de carbono, cicloalquenilo de 3 a 10 átomos, de carbono, fenilo, naftilo, (alquil de 1 a 10 átomos de carbono)-fenilo , (alquenil de 2 a 10 átomos de carbono) -fenilo , (alquil de 1 a 10 átomos de carbono)-naftilo, (alquenil de 2 a 10 átomos de carbono )-naftilo , fenil-(alquilo de 1 a 10 átomos de carbono), fenil- (alquenilo de 2 a 10 átomos de carbono), naftil-(alquilo de 1 a 10 átomos de carbono) o naftil-(alquenilo de 2 a 10 átomos de carbono); R está opcionalmente substituido con alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alquenilo de 2 a 4 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 4 átomos de carbono, -OH, -SH, -C0 R , cicloalquilo de 3 a 10 átomos de carbono, cicloalquenilo de 3 a 10 átomos de carbono, heterociclo que tiene de 3 a 10 átomos en el anillo, en donde el heteroátomo es uno o más de nitrógeno, oxígeno, azufre 0 cualquier combinación de los mismos, arilo, (ale de 1 a 10 átomos de carbono)arilo , ar(alquilo de 1 a 10 átomos de carbono), o cualquier combinación de los mismos ; R está opcionalmente interrumpido por oxígeno, nitrógeno, azufre, o cualquier combinación de los mismos; y R es hidrógeno, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, o alquenilo de 2 a 4 átomos de carbono.

4. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el agente biológicamente activo se selecciona del grupo que consiste de un péptido, un mucopolisacárido , un carbohidrato, y lípido, un plaguicida o cualquier combinación de los mismos

5. La composición de conformidad con la rei-vindicación 1, caracterizada porque el agente biológicamente activo se selecciona del grupo que consiste de hormona humana del crecimiento, hormona bovina del crecimiento, hormona de liberación de la hormona del crecimiento, un interferón, interleucina II, insulina, heparina, calcitonina, eritropoyetina , factor natruré-tico atrial, un antígeno, un anticuerpo monoclonal, somatostatina , adrenocorticotropina , hormona de liberación de gonadotropina, oxitocina, vasopresina, cromolín sódico, vancomicina, desferrioxamina (DFO), o cualquier combinación de los mismos.

6. La composición de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque el agente biológicamente activo se selecciona del grupo que consiste de un interferón, interleucina II, insulina, heparina, calcitonina, oxitocina, vasopresina, cromolín sódico, vancomicina, DFO o cualquier combinación de los mismos.

7. La composición de conformidad con la rei-vindicación 6, caracterizada porque el agente biológicamente activo es calcitonina.

8. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el aminoácido es un aminoácido de origen natural.

9. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el aminoácido es un aminoácido sintético.

10. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el aminoácido es un alfa-aminoácido.

11. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el aminoácido es un aminoácido no alfa.

12. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el aminoácido se selecciona del grupo que consiste de alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, citrulina, cisteína, cistina, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, ornitina, fenilalanina , fenilglicina , prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina, valina, hidroxiprolina, gamma-carboxiglutamato, 0-fosfoserina , beta-alanina , ácido alfa-aminoburírico , ácido gamma-aminobutírico , ácido alfa-aminoisobutírico , ácido 4-( 4-aminofenil )butírico , ácido ( aminofenil )-acético, ácido aminobenzoico , acido 4-aminohipúrico , ácido ( aminometil ) benzoico , ácido épsilon-aminocaproico, ácido 7-aminoheptanoico , ácido beta-aspártico , ácido gamma-glutámico , cisteína( ACM) , épsilon-lisina, épsilon-lisina( A-Fmoc ) , metionin-sulfona, norleucina, norvalina, ornitina, d-ornitina, p-nitro-fenilalanina , hidroxi-prolina y tioprolina.

13. La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque el aminoácido se selecciona del grupo que consiste de arginina, leucina, lisina, fenilalanina , tirosina, valina, fenil-glicina, ácido 4-(4-aminofenil ) butírico , ácido 4-(4-aminofenil)acético y ácido aminobenzoico .

14. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el péptido se selecciona del grupo que consiste de un di-péptido, un tri-péptido, un tetra-péptido o un pentapéptido .

15. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el péptido comprende al menos un aminoácido de origen natural.

16. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el péptido comprende al menos un aminoácido sintético.

17. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el péptido comprende al menos un alfa-aminoácido.

18. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el péptido comprende uno o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, citrulina, cisteína, cistina, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metio-nina, ornitina, fenilalanina , fenilglicina , prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina, valina, hidroxiprolina, gamma-carboxiglutamato, 0-fosfoserina , beta-alanina, ácido alfa-aminobutí rico , ácido gamma-amino-butírico, ácido alfa-aminoisobutí rico , ácido épsilon-aminocaproico, ácido 7-aminoheptanoico , ácido beta-aspártico, ácido gamma-glutámico , cisteína (ACM), épsilon-lisina, épsilon-lisina-( A-Fmoc) , metionin-sulfona, norleucina, norvalina, ornitina, d-ornitina, p-nitro-fenilalanina , hidroxiprolina y tioprolina.

19. La composición de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque el péptido se forma a partir de uno o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de arginina, leucina, lisina, fenilalanina , tirosina, valina y fenilglicina .

20. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el agente de acilación tiene la fórmula R — C — X Q en donde R es (i) cicloalquilo de 3 a 10 átomos de carbono, opcionalmente substituido con alquilo de 1 a 7 átomos de carbono, alquenilo de 2 a 7 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 7 átomos de carbono, hidroxilo, fenilo, fenoxi, 9 9 o -C0 R . en donde R es hidrógeno, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, o alquenilo de 2 a 4 átomos de carbono; o (ii) alquilo de 1 a 6 átomos de carbono subs-tituido con cicloalquilo de 3 a 10 átomos de carbono; y X es un grupo saliente.

21. La composición de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque R es ciclohexilo, ciclopentilo, ciclopropilo o cicloheptilo .

22. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el componente (b)(i) comprende una mezcla de dos o más aminoácidos acilados .

23. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende una microesfera .

24. Una forma de dosis unitaria, caracterizada porque comprende: (A) una composición de conformidad con la reivindicación 1; y (B) (a) un excipiente, (b) un diluyente, (c) un desintegrador, (d) un lubricante, (e) un plastificante , (f) un colorante, (g) un vehículo de dosificación, o (h) cualquier combinación de los mismos.

25. Una forma de dosis unitaria de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque comprende una tableta, una cápsula, o un líquido.

26. Un método para administrar un agente biológicamente activo a un animal en necesidad de dicho agente, caracterizado el método porque comprende el administrar oralmente a dicho animal una composición como se define de conformidad con la reivindicación 1.

27. Un método para la preparación de una composición, caracterizado el método porque comprende el mezclado de: (A) al menos un agente biológicamente activo, y (B) (a) al menos un aminoácido acilado; (b) al menos un péptido que comprende al menos un aminoácido acilado; o (c) una combinación de (a) y (b); en donde el aminoácido acilado se acila mediante (i) un agente de acilación de cicloalquilo de 3 a 10 átomos de carbono, estando dicho agente substituido con alquilo de 1 a 7 átomos de carbono, alquenilo de 2 a 7 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 7 átomos de carbono, hidroxilo, fenilo, fenoxi, o -C0«R, en donde R es hidrógeno, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono o alquenilo de 2 a 4 átomos de carbono ; o (ii) un agente de acilación de alquilo de 1 a 6 átomos de carbono substituido con cicloalquilo de 3 a 10 átomos de carbono; y (C) opcionalmente un vehículo de dosificación.

28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque comprende un aditivo de estabilización.

29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el aditivo de estabilización se selecciona del grupo que consiste de goma de acacia, gelatina, polietilenglicol o polilisina.

30, Un compuesto que tiene la fórmula caracterizado porque A es Try, Leu, Arg, Trp, o Cit.

31. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque A no es Leu, A está acilada en dos o más grupos funcionales.

32. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque A es Try.

33. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque A es Try.

34. Un compuesto de conformidad con la reivin-dicación 30, caracterizado porque A es Leu.

35. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque A es Arg.

36. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque A es Arg.

37. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque A es Trp.

38. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque A es Trp.

39. Un compuesto de conformidad con la reivin-dicación 30, caracterizado porque A es Cit.

40. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque A es Cit.

41. Un compuesto que tiene la fórmula caracterizado porque A y B independientemente son Arg o Leu .

42. Un compuesto de conformidad con la reivin-dicación 41, caracterizado porque si A, B o A y B son Arg, A, B o A y B están acilados en dos o más grupos funcionales .

43. Un compuesto que tiene la fórmula caracterizado porque A es Arg o Leu.

44. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque si A es Arg, A está acilado en dos o más grupos funcionales.

45. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque A es Arg.

46. Un compuesto de conformidad con la reivin-dicación 44, caracterizado porque A es Arg.

47. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque A es Leu.

48, Un compuesto que tiene la fórmula ?A, caracterizado porque A es Leu o fenilglicina.

49. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque A es Leu.

50. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque A es fenilglicina ,

51. Un compuesto que tiene la fórmula caracterizado porque A es fenilglicina ,

52. Un compuesto que tiene la fórmula caracterizado porque A es fenilglicína