MXPA97003492A - Regulacion de proliferacion de celulas germinalesneurales - Google Patents

Abstract

La invención estádirigida a la regulación de la proliferación de células germinales neurales multipotentes in vitro e in vivo usando composiciones conteniendo varios factores biológicos. Más particularmente, la invención estárelacionada con un método y composiciones terapéuticas para regular en número de células precursoras que se producen dividiendo células germinales neurales, exponiéndolas las células germinales a factores biológicos específicos o su combinación.

Description

REGULACIÓN DE PROLIFERACIÓN DE CÉLULAS GERMINALES NEURALES Referencia a Solicitudes Relacionadas Esta es una continuación parcial de la solicitud Estadounidense Número de Serie 08/338,730 presentada el 14 de noviembre de 1994. Antecedentes de la Invención En tejidos activamente divisorios, como la médula ósea la cual da origen a las células sanguíneas, las células especializadas, conocidas como células germinales, están presentes. La característica critica de identificación de una célula germinal es su habilidad de presentar autorrenovación o generar más de si misma. La definición más simple de una célula germinal seria una célula con la capacidad de automantenimiento. Una definición más estricta (pero todavia simple) de una célula germinal es proporcionada por Potten y Loeffler [Development , 110: 1001 (1990)] quienes han definido las células germinales como "células no diferenciadas capaces de a) la proliferación, b) el automantenimiento, c) la producción de un gran número de progenie funcional diferenciada, d) la regeneración del tejido después de una lesión y e) una flexibilidad en el uso de estas opciones." Las células germinales se dividen, generando progenie conocida como células precursoras. Las células precursoras comprenden nuevas células germinales y células progenitoras. Las nuevas células germinales son capaces de dividirse otra vez, produciendo más células germinales, asegurando el automantenimiento y más células progenitoras. Las células progenitoras son capaces de la proliferación limitada, donde toda su progenie es sometida finalmente a la diferenciación irreversible en las células funcionales amitóticas. La FIG. 1 ilustra la relación entre células germinales, células progenitoras y células diferenciadas.

El papel de las células germinales es reemplazar las células que se pierden por muerte celular natural, lesión o enfermedad. La presencia de células germinales en un tipo particular de tejido generalmente se correlaciona con tejidos que tienen una alta producción de células. Sin embargo, esta correlación no siempre puede mantenerse ya que se cree que las células están presentes en tejidos, como el higado [Travis, Science, 259 : 1829 (1989)], que no tienen una alta producción de células. El sistema de células germinales mejor caracterizado es la célula germinal hematopoyética. La evidencia sugiere que una sola célula germinal hematopoyética, situada en la médula ósea, es capaz de dar origen, a través de una serie de células progenitoras, a todos los linajes de células sanguíneas. La Patente Estadounidense 5,061,620, expedida el 29 de octubre de 1991, proporciona un medio para aislar, regenerar y usar la célula germinal hematopoyética. Antes del nacimiento, las células germinales hematopoyéticas están activas en muchos sitios, incluyendo el saco vitelino fetal, médula ósea, higado y bazo. Poco antes del nacimiento, la médula ósea asume el papel como el sitio primario de la hematopoyesis. Las células germinales hematopoyéticas en el higado y bazo se vuelven quiescentes y no reanudan la producción de células sanguíneas a menos de que la actividad de las células germinales hematopoyéticas en la médula ósea sea suprimida u ocurra la destrucción extendida de las células sanguíneas. Las células diferenciadas del SCN de mamífero adulto presentan poca habilidad o ninguna a entrar al ciclo mitótico y generar nuevo tejido neural - esencialmente ocurre toda la neurogénesis durante los periodos prenatales y posnatales inmediatos . Mientras que se cree que hay una producción limitada y lenta de astrocitos [Korr et al . , J. Comp. Neurol . , 150 : 169 (1971) ] y que las células progenitoras las cuales dan origen a los oligodendrocitos están presentes [ olsqijk y Noble, Development, 105: 386-698 (1989)], la generación de nuevas neuronas normalmente no ocurre. Las ratas, sin embargo, presentan una habilidad limitada de generar neuronas nuevas en regiones restringidas del cerebro adulto como la fascia dentata y bulbo olfativo [Kaplan, J. Comp. Neurol . , 195 : 323 (1987)]; Bayer, S.A. NY. Acad. Sci . , 457: 163-172 (1985)], pero esto no se aplica a todos los mamíferos y la generación de neuronas nuevas en primates adultos no ocurre [Rakic, P., Science, 221: 1054 (1985) ] . Esta incapacidad de producir nuevas células neuronales en la mayoría de mamíferos (y especialmente primates) puede ser conveniente para la retención de memoria a largo plazo; sin embargo, es una desventaja cuando surge la necesidad de reemplazar las células neuronales perdidas debido a lesión o enfermedad.

La producción baja de células en el SCN de mamífero junto con la incapacidad del SCN de mamífero adulto de generar nuevas células en respuesta a la pérdida de células después de una lesión o enfermedad ha conducido a la suposición de que el SCN de mamífero adulto no contiene células germinales. Sin embargo, las células que presentan características de células germinales in vi tro han sido aisladas recientemente del SCN. Esta célula está presente en el embrión [Reynolds et al . , J. Neurosci . , 12: 4565 (1992)] hasta el adulto [Reynolds y Weiss, Science, 255 : 1707 (1992)], sugiriendo que el SCN adulto, aunque no genere células nuevas en respuesta a una lesión o enfermedad, tiene la capacidad de generar nuevas células y repararse a través de la proliferación y diferenciación de células germinales y su progenie de una manera análoga al sistema hematopoyético. Recientes resultados de experimentos in vivo sugieren que existe una población de células germinales relativamente quiescentes en el forro subependimario de los ventrículos del cerebro adulto (Moreshead et al . , Neuron vol. 13(5): 1071-1082 (1994)). Es posible que estas células germinales, dados los estímulos adecuados, pudieran servir como una fuente de células de reemplazo en caso de daño neural o enfermedad. Se ha mostrado que la sobrevivencia, expansión y proliferación de las células germinales hematopoyéticas y los sistemas de células germinales en el higado, intestinos y piel están bajo el control de un número de distintos factores tróficos. En el sistema hematopoyético, por ejemplo, los factores de crecimiento como la eritropoyetina y el CSF de glicoproteina (factor de estimulación de colonias) y varias interleucinas se han identificado como factores que regulan la función de las células germinales [Metcalf, D., Bioassays, 14 (12) : 799-805 (1992) ] . La investigación en los efectos de factores tróficos en células neurales durante el desarrollo embriónico sugiere que las substancias que ocurren endogénicamente, como el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) , factor neurotrófico ciliar (CNTF) , factor de crecimiento fibroblasto básico (bFGF) , factor de crecimiento epidérmico (EGF) , factor alfa de crecimiento de transformación (TGFa) y factor de crecimiento de nervios (NGF) participan en el desarrollo prenatal del sistema nervioso. Por ejemplo, un tipo de célula progenitora neural embriónica, conocida como la célula 0-2A, da origen a oligodendrocitos y astrocitos tipo 2. En la presencia del PDGF, la célula 0-2A se divide y después de unas cuantas divisiones se diferencia en oligodendrocitos. La adición de CNTF y factores de substrato, mejor que el PDGF, empuja la célula progenitora 0-2A para diferenciarse en astrocitos tipo 1 [Raff et al . Nature (Lond.), 303: 390-396 (1983)]. bFGF produce un aumento doble en la proliferación de células progenitoras embriónicas las cuales se desarrollan en las neuronas [Gensberger et al . FEB Lett . , 211: 1-5 (1987)]. Cattaneo y McKay (1990) demostraron que los factores de crecimiento agregados juntos o en forma consecutiva producirán respuestas nuevas no vistas cuando los factores son agregados en forma individual. Demostraron que el NGF estimulaba la proliferación de neuroblastos embriónicos para producir neuronas sólo después de que se les haya aplicado previamente bFGF [Cattaneo, E. y McKay, R., Nature, 341: 762-765 (1990)]. También se ha demostrado que bFGF tiene influencia en la expresión del receptor del PDGF y bloquea la diferenciación de la célula progenitora 0-2A cuando se expone al PDGF [McKinnon et al . , Neuron, 5: 603-614 (1990)]. EGF o TGFa muestra efectos mitogénicos en células neuroepiteliales retinales embriónicas crecidas en cultivo, dando como resultado células progenitoras las cuales, en la presencia continua de los factores de crecimiento, dan origen a neuronas pero no a células guales [Anchan et al . , Neuron, 6: 923-936 (1991)]. En el mismo estudio, se reporta que las neuronas y células Müller ocurren en cultivos derivados del neuroepitelio posnatal de ratas. Los trastornos del SCN abarcan numerosas aflicciones como enfermedades neurodegenerativas (por ejemplo, mal de Alzheimer y de Parkinson) , lesión cerebral aguda (por ejemplo, ataque de apoplejía, lesión de la cabeza, parálisis cerebral) y un gran número de enfermedades asociadas con disfunción del SCN (por ejemplo, depresión, epilepsia y esquizofrenia) . En años recientes, las enfermedades neurodegenerativas se han convertido en una importante preocupación debido a la población de edad avanzada en expansión la cual está en gran riesgo de estos trastornos. Estas enfermedades, las cuales incluyen el Mal de Alzheimer, Esclerosis Múltiple, Mal de Huntington, Esclerosis Lateral Amiotrófica y Mal de Parkinson, han estado relacionadas con la degeneración de células neurales en sitios particulares del SCN, causando la incapacidad de estas células o la región cerebral de realizar su función propuesta. Además de las enfermedades neurodegenerativas, las lesiones cerebrales agudas a menudo dan como resultado la pérdida de células neurales, el funcionamiento inadecuado de la región cerebral afectada y anormalidades subsecuentes de conducta. Los tipos más comunes de disfunción del SCN (con respecto al número de personas afectadas) no se caracterizan por una pérdida de células neurales, más bien por un funcionamiento anormal de las células neurales existentes. Esto puede deberse a la descarga inadecuada de neuronas, o la síntesis, liberación y procesamiento anormales de neurotransmisores . Algunas de estas disfunciones son trastornos bien estudiados y caracterizados como depresión y epilepsia, otras son trastornos menos entendidos como neurosis y sicosis. A la fecha, el tratamiento de trastornos del SCN ha sido principalmente a través de la administración de compuestos farmacéuticos. Desafortunadamente, este tipo de tratamiento ha estado lleno de muchas complicaciones, incluyendo la habilidad limitada de transportar fármacos a través de la barrera de sangre y cerebro y la tolerancia a los fármacos la cual es requerida por pacientes a quienes estos fármacos se administran a largo plazo. Por ejemplo, se ha logrado la restauración parcial de la actividad dopaminérgica en pacientes con el mal de Parkinson con levodopa, la cual es una precursor de dopamina capaz de cruzar la barrera de sangre y cerebro. Sin embargo, los pacientes se vuelven tolerantes a los efectos de la levodopa y, por lo tanto, se necesitan dosis cada vez mayores para mantener sus efectos. Además, existen diversos efectos secundarios asociados con la levodopa como el movimiento aumentado e incontrolable. Una tecnología de emergencia para tratar trastornos neurológicos causa el trasplante de células al SCN para reemplazar o compensar la pérdida o funcionamiento anormal de las células nerviosas del huésped. Mientras las células embriónicas del SCN han dado los mejores resultados en experimentos en humanos [Winder et al . , New Eng. J. Med. , 321 1556 (1992)] y son el tejido de donante preferido, las consideraciones éticas y políticas, asi como la disponibilidad de cantidades suficientes de tejido, limitan el uso de estas células. Se están desarrollando otros tipos de tejido de donante para uso en el tratamiento de trastornos del SCN. Estos incluyen: lineas de células neurales genéticamente modificadas [Renfranz et al . , Cell , 66: 173 (1991); Synder et al . , Cell , 68: 1, (1992)], fibroblastos (Kawaja et al . , J. Neurosci . , 12 : 2849, (1992)], células musculares [Jiao et al . , Nature. , 363: 456 (1993)], células progenitoras guales [Groves et al . , Nature, 362: 453 (1993)] y células encapsuladas (Hoffman et al . , Exp. Neurol . , 132: 100 (1993)].

Mientras los métodos de trasplante representan una mejora significativa sobre tratamientos disponibles actuales para trastornos neurológicos, la tecnología todavia no se ha perfeccionado. Por ejemplo, en el trasplante, algunos tipos de células no se integran con el tejido del SCN del huésped. En particular, el uso de cultivos celulares primarios no neuronales limita la habilidad del material trasplantado para hacer conexiones con el tejido del huésped. Las células inmortalizadas de donante obtenidas del tejido neural primario podrían formar conexiones pero la expresión genética de los oncogenes incorporados a estas células transformadas es dificil de controlar y podria producir tumores y otras complicaciones. El donante y el huésped podrían dar como resultado el rechazo de las células implantadas. Existe también el riesgo potencial de que las células trasplantadas puedan dar como resultado la formación de tumores o pasar agentes infecciosos del tejido del donante al huésped. Gage et al . , en la Patente Estadounidense 5,082,670, revelan un método para tratar defectos, enfermedades o daño celular del SCN injertando células neurales genéticamente modificadas en las regiones adecuadas del SCN. Las células de donante reveladas en esta patente se obtuvieron de cultivos primarios no neuronales pero se sugirió que se podrían usar lineas de células neurales genéticamente transformadas. Estas fuentes de células de donante son inherentemente problemáticas. Gage et al . reconocen las limitaciones impuestas por las células de donante usadas en su técnica y reconocimiento de que hay una "...insuficiencia de sistemas de cultivos de células no transformadas duplicadas..." También reconocen "la resistencia al tratamiento de células neuronales no duplicadas a una infección virica." Esta última oración resume las dificultades asociadas con el intento de aplicar la metodología de la técnica anterior para modificar genéticamente células neurales, las cuales normalmente no son mitogénicas a menos de que se obtengan de tejido embriónico. Inherente en esta tecnología es el riesgo potencial de rechazo del tejido.

Idealmente, las células trasplantadas genéticamente modificadas deberían ser derivadas de si mismas, evitando con ello complicaciones inmunológicas - es decir, seria benéfico que las células germinales neurales quiescentes de un paciente pudieran ser genéticamente modificadas y/o estimuladas para dividir y diferenciarse, in vi tro, en nuevas células neurales las cuales puedan entonces implantarse para reemplazar el tej ido neural perdido o dañado . Las células germinales neurales multipotentes, las cuales ahora se sabe que están presentes en el cerebro de mamíferos durante toda su vida [Reynolds y Weiss, Science, 255: 1707 (1992)], proporcionan una fuente de células neurales no transformadas las cuales pueden ser estimuladas, en la presencia de un factor de crecimiento como el factor de crecimiento epidérmico, para volverse mitóticamente activas. En el cultivo, las células germinales neurales pueden ser incitadas a proliferarse y pueden proporcionar grandes cantidades de células neurales no diferenciadas, las cuales son capaces de la diferenciación en los principales tipos de células neurales y pueden ser trasplantadas, genéticamente modificadas y después trasplantadas, o usadas para selección de fármacos u otros propósitos. Seria una ventaja poder capaz de regular la proliferación de células germinales neurales in vi tro, con el fin de poder aumentar, disminuir o de alguna otra forma, alterar, la actividad mitótica de las células germinales neurales y/o su progenie. Aumentar la actividad mitótica de células germinales neurales quiescentes tendría un beneficio obvio mientras que el número de progenie disponible para trasplante, modificación genética, selección de fármacos y similares, seria más grande. También seria conveniente determinar cuántas células germinales neurales proliferantes in vi tro en la presencia de un factor de crecimiento que incita la proliferación pueden ser reguladas para disminuir la cantidad de proliferación. Esta información puede usarse para regular, in vivo, los factores de crecimiento que incitan la proliferación, como los revelados en la Solicitud Estadounidense Número de Serie 08/149,508 presentada el 9 de noviembre de 1993. Seria conveniente poder regular no sólo los números de células germinales neurales las cuales se vuelven mitóticamente activas en la presencia de un factor de crecimiento o combinación de factores de crecimiento, sino también la velocidad de la mitosis de la progenie precursora de estas células germinales. En respuesta a una lesión del cerebro o tejido de la médula espinal, ocurre la gliosis. Se cree que la cicatriz glial que resulta de este proceso puede impedir que los axones neuronales reestablezcan conexiones a través de la región de la lesión, evitando asi la restauración de la función. Los astrocitos, los cuales se proliferan tanto en el sitio de la herida, como a cierta distancia lejos de la cercanía inmediata de la herida, son los componentes celulares de origen de una cicatriz glial (Reier, P.J. Astiocytes, vol. 3: 263-323 (1986) ) . La proliferación de células germinales neurales y su progenie en respuesta a una lesión puede ser un factor en el desarrollo de la gliosis. La reparación neural podria mejorarse si la extensión de la gliosis en el sitio de la lesión pudiera reducirse. Seria una ventaja poder reducir la gliosis evitando o disminuyendo la actividad mitótica la cual conduce a mayores números de astrocitos en la cercanía de la herida. Reducir la habilidad de las células germinales neurales y/o su progenie de proliferarse en respuesta a las señales inducidas por una herida puede ser una forma de limitar la extensión de la formación de cicatrices guales. La habilidad aumentada de los axones separados de hacer reconexiones a través del sitio de la lesión mejorarla la calidad del proceso de reparación neural y restaurarla la función. En vista de las deficiencias antes mencionadas acompañantes con fuentes de células del SCN para trasplante u otros usos, deberla ser aparente que exista la necesidad en la técnica de métodos confiables para cultivar grandes cantidades de células embriónicas y neurales adultas de fuentes humanas y no humanas que no han sido intencionalmente inmortalizadas por la inserción de un oncogén con el fin de inducir la proliferación ilimitada, eliminando con ello cualquier duda de la influencia de alteración genética en la función normal de las células. En ciertas circunstancias, existe también la necesidad de poder regular la proliferación de las células in vi tro e in vivo. En consecuencia, un objetivo de esta invención es proporcionar un método para la regulación in vi tro de la proliferación de células germinales del SCN, alterando el medio de cultivo en el cual las células germinales están viviendo a través de la adición de factores biológicos específicos, como factores de crecimiento o combinaciones de dichos factores. Otro objetivo de esta invención es proporcionar un método y composiciones terapéuticas para la regulación in vi tro de la proliferación de células germinales del SCN. Las composiciones comprenden factores biológicos específicos, como factores de crecimiento o combinaciones de dichos factores, los cuales son vertidos al sistema ventricular del SCN para regular la proliferación de células germinales. Estos y otros objetivos y características de la invención serán aparentes para aquellas personas especializadas en la técnica a partir de la siguiente descripción detallada y reivindicaciones anexadas .

Se cree que ninguna de las referencias anteriores revelan la presente invención como se declara y no se asume que sea la técnica anterior. Las referencias se ofrecen con el propósito de informar sobre los antecedentes. Sumario de la Invención Se describe un método para regular la proliferación in vitro de una célula germinal neural multipotente y/o la proliferación de la progenie de la célula germinal neural mencionada. El método comprende los pasos de la separación del tejido neural mamífero que contiene por lo menos una célula germinal neural multipotente capaz de producir progenie que sea capaz de diferenciarse en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos y la proliferación de la célula germinal neural multipotente en un medio de cultivo que contiene por lo menos un factor proliferativo que incita la proliferación de células germinales y un factor de regulación que regula la proliferación de la célula germinal neural multipotente y/o la proliferación de la progenie de la célula germinal neural multipotente. Además, se describen un método y composiciones para regular la proliferación in vi tro de una célula germinal neural multipotente y/o la proliferación de la progenie de la célula germinal neural mencionada. El método comprende los pasos de distribución a las regiones ventriculares de un mamífero de una composición terapéutica que contiene por lo menos un factor que tiene un efecto de regulación en la proliferación de una célula germinal neural multipotente y/o la proliferación de la progenie de la célula germinal neural multipotente . En una modalidad de la invención, el factor proliferativo es bFGF y el factor de regulación es EGF o heparansulfato los cuales aumentan la velocidad de proliferación de la progenie de células germinales. En otra modalidad de la invención, una composición terapéutica que contiene un factor o combinación de factores que inhiben la proliferación de células germinales neurales es administrada in vivo para reducir la proliferación de las células. Breve Descripción de los Dibujos FIG. 1: Un diagrama esquemático que ilustra la proliferación de una célula germinal neural multipotente. (A) En la presencia de un factor proliferativo, la célula germinal se divide y da origen a una esfera de células no diferenciadas compuestas de más células germinales y células progenitoras. (B) Cuando la esfera clónicamente derivada de células no diferenciadas es separada y cultivada en placa como células sencillas, sobre un substrato no adhesivo y en la presencia de un factor proliferativo, cada célula germinal generará una nueva esfera. (C) Si las esferas son cultivadas en condiciones que permiten la proliferación, las células progenitoras se diferencian en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. FIG. 2: (A) Fotografía (ampliación lOOx) de neuroesferas maduras de 10 dias cultivadas en 20 ng/ml de EGF. (B) Fotografía (ampliación lOOx) de neuroesferas maduras de 10 dias cultivadas en 20 ng/ml de FGF. (C) Fotografía (ampliación lOOx) de neuroesferas maduras de 10 dias cultivadas en 20 ng/ml de EGF + 20 ng/ml de FGF. FIG. 3: Gráfica mostrando el número de neuroesferas generadas de células primarias derivadas de las regiones cérvica, torácica y lumbar de la médula espinal de ratones adultos en la presencia de 20 ng/ml de EGF + 20 ng/ml de FGF ó 20 ng/ml de FGF + 2 µg/ml de heparansulfato. Descripción Detallada de la Invención La invención se basa en el desarrollo de procedimientos y composiciones para regular y manipular la proliferación de células germinales neurales multipotentes y está dirigida a la regulación de los números de progenie derivada de una célula germinal multipotente crecida in vi tro o in vivo. Como se usa en el presente, el término "célula germinal neural" o "célula germinal del sistema central nervioso (SCN) " se refiere a una célula germinal no diferenciada relativamente quiescente de tejido neural que es capaz de la proliferación, dando origen a más células germinales neurales (asegurando asi el automantenimiento) y a células progenitoras. El término "multipotente" se refiere a una célula germinal neural que es capaz de producir progenie que da origen a cada uno de los principales tipos de células neurales diferenciadas, es decir, neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. En comparación, una célula no diferenciada que da origen a dos tipos de células no diferenciadas, por ejemplo, la célula 0-2A, la cual da origen a oligodendrocitos y astrocitos, es llamada "bipotente" y una que da origen a sólo un tipo de célula diferenciada es llamada "unipotente" . El término "célula progenitora" también se refiere a una célula no diferenciada derivada de una célula germinal neural pero difiere de una célula germinal en que tiene habilidad limitada para proliferarse y no se mantiene a si misma. Cada intención de progenie de una célula progenitora neural, bajo condiciones adecuadas, se diferencia en una neurona, astrocito (tipo I o tipo II) u oligodendrocito. Los oligodendrocitos son células guales diferenciadas que forman la mielina que rodea a los axones en el sistema central nervioso (SCN) . Los oligodendrocitos tienen el galactocerebrósido fenotipo (+) , proteina básica de mielina (+) y proteina acida fibrilar glial (-) [GalC(+), MBP(+), GFAP(-)]. Las neuronas son células neuronales diferenciadas que tienen la enolasa especifica de neurona fenotipo (+) , neurofilamento (+) , proteina asociada de microtúbulo o Tau-1 (+) [NSE(+), NF(+), MAP-2(+), Tau-1 (+) ] . Los astrocitos son células gliales diferenciadas que tienen el GFAP(+), GalC(-) yMBP(-) de fenotipo. Se ha reportado que las células germinales del SCN y sus usos descritos [Reynolds y Weiss, Sci ence, 255 : 1707 (1992) ; Reynolds et al . , J. Neurosci . , 12: 4565 (1992); Reynolds y Weiss, Restorative Neurology and Neuroscience, 4 : 208 (1992); Reynolds y Weiss, "Neuronal Cell Death and Repair" ed. Cuello, A.C., Elsevier Science, páginas 247-255 (1993)]. Además, la utilidad de estas células se describe en solicitudes PCT publicadas números WO 93/01275, WO 94/16718, WO 94/10292 y WO 94/09119. Como las células germinales encontradas en otros tejidos de mamífero, la célula germinal del SCN es capaz del automantenimiento y generar un número grande de progenie incluyendo nuevas células germinales y células progenitoras capaces de la diferenciación en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos . Las células germinales del SCN pueden aislarse y cultivarse de cualquier tejido del SCN de mamífero antes o después del nacimiento mediante los métodos descritos por Reynolds y Weiss [ Science, 255: 1707 (1992)], las solicitudes PCT publicadas mencionadas anteriormente y en el Ejemplo 1 más adelante. Las células germinales multipotentes del SCN ocurren en una variedad de regiones del SCN, incluyendo las regiones conus medullaris, cérvica, torácica y lumbar de la médula espinal, tronco cerebral, striatum e hipotálamo. Las células germinales neurales pueden ser obtenidas del tejido de cada una de estas regiones e incitadas a dividirse in vi tro, presentando automantenimiento y generación de un número grande de progenie la cual incluye neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. En breve, la célula germinal neural multipotente se obtiene del tejido neural y crece en un medio de cultivo el cual de preferencia está libre de suero y el cual puede contener cualquier combinación de substancias conocidas para soportar la sobrevivencia de las células. Un medio de cultivo adecuado libre de suero, llamado en lo sucesivo en el presente como "Medio Completo", comprende el medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) y mezcla de nutrientes F-12 (Gibco) (1:1), glucosa (0.6%), glutamina (2 mM) , bicarbonato de sodio (3 mM) , HEPES (4- [2-hidroxietilo]-l-ácido piperacinaetanosulfónico) , amortiguador (5 mM) y una mezcla de hormonas definidas y mezcla de sales (10%; disponibles por Sigma) , usado para reemplazar el suero, el cual comprende insulina (25 µg/ml) , transferrina (100 µg/ml), progesterona (20 µM) , putrescina (60 µM) y cloruro de selenio (30 nM) . Se agrega por lo menos un factor biológico que incita la proliferación de células germinales multipotentes al Medio Completo. El término "factor biológico", como se usa en el presente, se refiere a una substancia biolóricamente activa que es funcional en las células del SCN, como una proteina, péptido, ácido nucleico, factor de crecimiento, esteroide u otra molécula, natural o artificial, que tiene un efecto de crecimiento, proliferativo, diferenciativo, trófico o de regulación (individualmente o en combinación con otros factores biológicos) en células germinales o progenie de células germinales. Los ejemplos de factores biológicos incluyen factores de crecimiento como factores de crecimiento de fibroblasto ácidos y básicos (aFGF, bFGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF) y ligandos similares a EGF, factor alfa de crecimiento de transformación (TGFa) , factor de crecimiento similar a la insulina (IGF-1), factor de crecimiento de nervios (NGF) , factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y factor beta de crecimiento de transformación (TGFß); factores tróficos como el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), factor neurotrófico ciliar (CNTF) y factor neurotrófico derivado del glial (GDNF) ; reguladores de trayectos intracelulares asociados con la actividad del factor de crecimiento como 12-miristato 13-acetato de forbol, estaurosporina, CGP-41251, tirfostina y similares; hormonas como hormona de liberación de activina y tirotropina (TRH) ; varias proteínas y polipéptidos como interleucinas, el producto de genes Bcl-2, proteina morfogénica ósea (BMP-2), proteínas inflamatorias de macrófago (MlP-la, MlP-lß y MIP-2) ; oligonucleótidos como hebras antisensorias dirigidas, por ejemplo, contra copias para receptores del EGF, receptores del FGF y similares; moléculas similares a la heparina como el heparansulfato y una variedad de otras moléculas que tienen un efecto en las células germinales neurales o progenie de células germinales incluyendo anfiregulina, ácido retinoico y factor alfa de necrosis de tumores (TNF ) . Los factores biológicos, como el EGF y bFGF, que tienen individualmente un efecto proliferativo en las células germinales neurales multipotentes, son llamados en el presente como "factores proliferativos". Generalmente, los factores proliferativos se unen a un factor de superficie celular, dando como resultado la incitación a la proliferación. Los factores proliferativos preferidos incluyen EGF, anfiregulina, aFGF; bFGF, TGFa y combinaciones de estos y otros factores biológicos, como heparansulfato. Una combinación particularmente preferida para incitar la proliferación de células germinales neurales es EGF y bFGF. Los factores proliferativos generalmente son agregados al medio de cultivo a una concentración en la gama de aproximadamente 10 pg/ml a 500 ng/ml, de preferencia de 1 ng/ml a 100 ng/ml. La concentración más preferida para EGF, aFGF y bFGF es aproximadamente 20 ng/ml de cada factor proliferativo. Las células germinales pueden cultivarse en recipientes de cultivo, por ejemplo 96 placas con receptáculo o frascos de cultivo. En la presencia de un factor de crecimiento que incita la proliferación o una combinación de factores, una célula germinal neural multipotente se divide, dando origen, dentro de 3-4 dias, a progenie de células germinales no diferenciadas. La progenie de células germinales, llamada en el presente como "células precursoras", incluye células germinales multipotentes recién generadas y células progenitoras. In vi tro, la progenie de una sola célula germinal forma un grupo de células precursoras llamadas en el presente como "neuroesfera"; sin embargo, las condiciones del cultivo pueden ser cambiadas (por ejemplo, proporcionando un substrato tratado sobre el cual las células proliferantes se adhieren) para que las células proliferantes no formen las neuroesferas características. Las células precursoras no son inmunoreactivas por alguno de los marcadores neuronales o celulares gliales, pero son inmunoreactivos para la nestina, una proteina de filamento intermedio encontrada en células no diferenciadas del SCN [Lehndahl et al . , Cell , 60: 585-595 (1990) ] . En la presencia continua del factor de crecimiento que incita la proliferación, las células precursoras dentro de la neuroesfera continúan dividiéndose dando como resultado un aumento en el tamaño de las neuroesferas como resultado de un aumento en el número de células no diferenciadas [nestina (+), NF(-), NSE(-), GFAP(-), MBP(-)]. Es posible hacer pasar las células precursoras en la presencia de los mismos factores de crecimiento o distintos factores de crecimiento que permiten que ocurra más proliferación sin promover la diferenciación. Las células pueden ser pasadas 30 veces o más usando métodos de cultivo proliferativo, dando como resultado un aumento exponencial en los números de células precursoras. Las técnicas de cultivo descritas anteriormente para la proliferación de células germinales del SCN in vi tro pueden modificarse a través del uso de factores biológicos adicionales o combinaciones de factores los cuales aumentan, disminuyen o modifican de alguna otra manera el número y la naturaleza de las células precursoras obtenidas de las células germinales en respuesta al EGF u otros factores proliferativos. Los cambios en la proliferación son observados por un aumento o disminución en el número de neuroesferas que forman y/o un aumento o disminución en el tamaño de las neuroesferas (lo cual es una reflexión de la velocidad de la proliferación - determinada por los números de células precursoras por neuroesfera) . Por lo tanto, el término "factor de regulación" se usa en el presente para referirse a un factor biológico que tiene un efecto de regulación en la proliferación de las células germinales y/o células precursoras. Por ejemplo, un factor biológico seria considerado un "factor de regulación" si aumenta o disminuye el número de células germinales que se proliferan in vi tro en respuesta a un factor de crecimiento que incita la proliferación (como el EGF) . Alternativamente, el número de células germinales que responden a factores que incitan la proliferación puede seguir siendo el mismo, sin embargo la adición del factor de regulación afecta la velocidad a la cual la célula germinal y la progenie de células germinales se proliferan. Un factor proliferativo puede actuar como un factor de regulación cuando se usa en combinación con otro factor proliferativo. Por ejemplo, las neuroesferas que se forman en la presencia de una combinación de bFGF y EGF son significativamente más grandes que las neuroesferas que se forman en la presencia del bFGF solo, indicando que la velocidad de proliferación de las células germinales y progenie de células germinales es más alta. Otros ejemplos de factores de regulación incluyen heparansulfato, factor beta de crecimiento de transformación (TGFß) , activina, proteina morfogénica ósea (BMP-2), factor neurotrófico ciliar (CNTF) , ácido retinoico, factor alfa de necrosis de tumores (TNFa) , proteínas inflamatorias de macrófago (MlP-la, MlP-lß y MIP-2), factor de crecimiento de nervios (NGF) , factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), interleucinas y el producto de genes Bcl-2. Las moléculas antisensorias que se unen a copias de factores proliferativos y las copias para sus receptores también regulan la proliferación de células germinales. Otros factores que tienen un efecto de regulación en la proliferación de células germinales incluyen aquellos que interfieren con la activación del trayecto c-fos (un gen prematuro intermedio, se sabe que es activado por EGF) , incluyendo 12 miristato 13-acetato de forbol (PMA; Sigma) , el cual regula hacia arriba el trayecto c-fos y la estaurosporina (Research Biochemical International) y CGP-41251 (Ciba-Geigy) , los cuales regulan hacia abajo la expresión y factores de c-fos, como tirfostina [Fallón, D. et al . , Mol . Cell Biol . , 11 (5) : 2697-2703 (1991)] y similares, los cuales suprimen la activación de la cinasa de tirosina incitada por la unión del EGF a su receptor. Los factores de regulación preferidos para aumentar la velocidad a la cual la progenie de células germinales neurales se prolifera en respuesta a FGF son heparansulfato y EGF. Los factores de regulación preferidos para disminuir el número de células germinales que responden a factores proliferativos son miembros de la familia de TGFß, interleucinas, MIPs, PDGF, BMP-2, TNFa, ácido retinoico (10~6 M) y CNTF. Los factores preferidos para disminuir el tamaño de las neuroesferas generadas por los factores proliferativos son miembros de la familia TGFß, ácido retinoico (10~6 M) y CNTF. Los factores de regulación son agregados al medio de cultivo a una concentración en la gama de aproximadamente 10 pg/ml a 500 ng/ml, de preferencia 1 ng/ml a 100 ng/ml. La concentración más preferida para factores de regulación es alrededor de 10 ng/ml. El ácido retinoico del factor de regulación se prepara de una solución de reserva de 1 mM y se usa en una concentración final entre 0.01 µM y 100 µM, de preferencia entre 0.05 a 5 µM. Para reducir los efectos proliferativos del EGF o bFGF en la generación de neuroesferas se prefiere una concentración de alrededor de 1 µM de ácido retinoico. Las hebras antisensorias pueden usarse en concentraciones de aproximadamente 1 a 25 µM. Se prefiere una gama de 2 a 7 µM. PMA y las moléculas relacionadas, usadas para aumentar la proliferación, pueden usarse a una concentración de 1 µg/ml a 500 µg/ml, de preferencia a una concentración de 10 µg/ml a 200 µg/ml. El glucosaminoglicano,, heparansulfato, es un componente que se encuentra en todas partes en la superficie de células de mamífero conocido para afectar una variedad de procesos celulares y el cual une las moléculas del factor de crecimiento como FGF y anfiregulina, promoviendo con ello la unión de estas moléculas a sus receptores sobre las superficies de células. Puede agregarse al medio de cultivo en combinación con otros factores biológicos, a una concentración de aproximadamente 1 ng/ml a 1 mg/ml; se prefiere más una concentración de 0.2 µg/ml a 20 µg/ml, se prefiere mucho más una concentración de 2 µg/ml. Las células precursoras se pueden usar para trasplante para tratar diversos trastornos neurológicos, según lo revelado en las solicitudes PCT números WO 93/01275, WO 94/16718, WO 94/10292 y WO 94/09119. Las células las cuales se usarán para trasplante pueden ser cosechadas del medio de cultivo y trasplantadas, usando medios conocidos en la técnica, a un animal con síntomas neurológicos o neurodegenerativos anormales, obtenidos de cualquier manera, incluyendo aquellos obtenidos como resultado de lesiones químicas, eléctricas, mecánicas u otras, como resultado de la aspiración experimental de áreas neurales o como resultado de enfermedad o procesos de envejecimiento. Los métodos revelados en el presente también se pueden usar para someter a prueba los efectos proliferativos o de regulación de los factores biológicos en la proliferación de células germinales neurales multipotentes de mamífero in vi tro, antes de usar los factores biológicos para la regulación in vivo de la proliferación de las células germinales normalmente quiescentes de un paciente. Las células germinales neurales pueden obtenerse de un humano con trastorno neurológico con el fin de someter a prueba los efectos proliferativos o de regulación de los factores biológicos en tejido disfuncional, enfermo, o lesionado. Las composiciones terapéuticas que contienen los factor de regulación pueden entonces prepararse para uso en el tratamiento de varios trastornos, enfermedades, o lesiones neurológicos. Las composiciones contienen uno o más factores de regulación en las concentraciones anteriores en una formulación fisiológicamente aceptable. Las composiciones terapéuticas pueden administrarse in vivo para regular la proliferación de células germinales neurales. Las células germinales neurales normalmente quiescentes se encuentran en todo el SCN cerca de las regiones ventriculares. Dentro del prosencéfalo se encuentran los ventrículos laterales (primero y segundo) . El tercer ventrículo es una cavidad de la parte inferior del prosencéfalo la cual está conectada al cuarto ventrículo situado en el metencéfalo. El canal central, continuo con las estructuras ventriculares antes mencionadas, es el componente ventricular de la médula espinal . El hecho de que las células germinales del SCN se encuentren en los tejidos que forran los ventrículos ofrece varias ventajas para la modificación y manipulación de estas células in vivo y el tratamiento final de diversos trastornos, enfermedades y lesiones neurológicos que afectan distintas regiones del SCN. En consecuencia, la terapia para los anteriores puede adaptarse de manera que las células germinales que rodean los ventrículos cerca de la región afectada serian manipuladas o modificadas in vivo usando los métodos descritos en el presente. El sistema ventricular se encuentra en casi todas las regiones del cerebro y por lo tanto da acceso más fácil a las áreas afectadas. Si uno quiere modificar las células germinales exponiéndolas a una composición que contiene un factor de crecimiento o un vector vírico, es relativamente fácil implantar un dispositivo que administra la composición al ventrículo. Por ejemplo, puede usarse una cánula adaptada a una bomba osmótica para distribuir la composición. Alternativamente, la composición puede inyectarse directamente a los ventrículos. Esto permitirla la migración de la progenie de células germinales del SCN a regiones que han sido dañadas como resultado de una lesión o enfermedad. Además, la estrecha proximidad de los ventrículos a muchas regiones del cerebro permitirla la difusión de un agente neurológico secretado por las células germinales o su progenie. La gliosis, la cual causa la formación de tejido cicatrizal glial, resulta del daño al tejido del SCN. Se considera que el tejido cicatrizal tiene un importante efecto inhibitorio en la excrecencia axonal y la reconexión de elementos separados, evitando asi la recuperación funcional después de una lesión del cerebro o médula espinal . Aunque no es el único componente de tejido cicatrizal del SCN, los astrocitos son uno de los principales elementos incluidos. (Reier, P.J. Astrocytes, vol. 3: 263-323 (1986)). Existe la posibilidad de que la gliosis resulta, al menos en parte, de la proliferación de células germinales anteriormente quiescentes. Después de la lesión al SCN, seria conveniente administrar un factor conocido para inhibir la proliferación de células germinales neurales al sistema ventricular. Reduciendo la proliferación de la progenie de células germinales la cual da origen a astrocitos, se reduce la formación de tejido cicatrizal en el lugar de la lesión y se mejoran las condiciones que permiten la reconexión de elementos axonales. Un factor inhibitorio preferido es BMP-2. Ejemplo 1 Proliferación in vitro de células germinales multipotentes del SCN derivadas del tejido cerebral embriónico - proliferación de neuroesferas en respuesta a EGF Se descabezaron ratones albinos CDi embriónicos de 14 dias (E14) (Charles River) y se retiraron el cerebro y striata usando un procedimiento estéril. El tejido se separó mecánicamente con una pipeta Pasteur pulida con fuego a un Medio Completo. Las células fueron centrifugadas a 800 r.p.m. durante 5 minutos, las células sobrenadantes aspiradas u las células resuspendidas en el Medio Completo para conteo. Las células fueron suspendidas a una densidad de 25,000 células/ml en el Medio Completo conteniendo 20 ng/ml de EGF.

Usando una pipeta de repetición Eppendorf con una punta de 5 mi, se agregaron 200 µl de la suspensión de células a cada receptáculo de las 96 placas sin tratamiento previo del substrato y se guardaron en una incubadora a 37°C, 100% de humedad, 95% de aire/5% C02. Cuando las células se proliferaron, dentro de las primeras 48 horas y por 3-4 dias in vi tro (DIV) , formaron grupos pequeños, conocidos como neuroesferas, que se despegaron del substrato entre 4-6 DIV. Se contó el número de neuroesferas generadas por receptáculo y se tabularon los resultados y se compararon con los números de neuroesferas generadas en respuesta a EGF después de pasar las células (ver Ejemplo 2) y en respuesta a otros factores biológicos solos, o en combinación con EGF (ver Ejemplo 3) . Ejemplo 2 Paso de neuroesferas proliferadas Paradigma 1 : Se prepararon las células y medios como se resume en el Ejemplo 1. Las células fueron cultivadas en placa en 0.2 x 106 células/ml a frascos de cultivo de tejido de 75 cm2 (Corning) sin tratamiento previo del substrato y se incubaron como se resume en el Ejemplo 1. Después de 7 DIV, las neuroesferas fueron retiradas, centrifugadas a 400 r.p.m. durante 2-5 minutos y la pildora fue separada mecánicamente en células individuales con una pipeta Pasteur de vidrio pulido con fuego en 2 mis de Medio Completo. Las células de 1 x 106 fueron cultivadas en placa a un frasco de cultivo de tejido de 75 cm2 con 20 mis del Medio Completo conteniendo EGF. Se reinició la proliferación de las células germinales y la formación de nuevas neuroesferas. Este procedimiento puede repetirse cada 6-8 dias. Paradigma 2 : Se siguieron los métodos del Ejemplo 1 y Ejemplo 2, paradigma 1, excepto que se agregaron 20 ng/ml de FGF al Medio Completo en lugar del EGF. Paradigma 3 : Se siguieron los métodos del Ejemplo 1 y Ejemplo 2, paradigma 1, excepto que se agregaron 20 ng/ml de FGF al Medio Completo además de los 20 ng/ml de EGF que se agregaron.

Las neuroesferas, obtenidas después de pasar, pueden ser separadas mecánicamente y las células pueden ser cultivadas nuevamente en 96 placas con receptáculo como se resume en el Ejemplo 1. Los efectos de los factores biológicos específicos, o combustiones especificas de factores biológicos en la proliferación de neuroesferas de células derivadas de neuroesferas pasadas se pueden determinar y comparar con los resultados obtenidos de las células derivadas del tejido primario. Ejemplo 3 Ensayo de proliferación de neuroesferas derivadas de striatum en respuesta a varias combinaciones de factores proliferativos y de regulación Paradigma 1 : Las células estriadas primarias preparadas como se resume en el Ejemplo 1 fueron suspendidas en el Medio Completo, sin factores de crecimiento, cultivadas en 96 placas con receptáculo (Nunclon) e incubadas como se describe en el Ejemplo 1. Después de un periodo de incubación de una hora, un factor proliferativo especifico, o una combinación de factores proliferativos incluyendo EGF, o nFGF (bFGF humano recombinante: R & D Systems), o una combinación de EGF y bFGF, o EGF más FGF más heparansulfato (Sigma) , o bFGF más heparansulfato reunido en el Medio Completo a una concentración de 20 ng/ml para cada uno de los factores de crecimiento y 2 µg/ml para heparansulfato) , se agregó a cada receptáculo de la placa. La activina, BMP-2, TGF-ß, IL-2, IL-6, IL-8, MIP-1', MlP-lß, MIP-2 (todos obtenidos de Chiron Corp.), TNFa, NGF (Sigma), PDGF (R&D Systems), EGF y CNTF (R. Dunn y P. Richardson, McGuill University) se reunieron en frascos separados de medio completo a una concentración final de 0.2 µg/ml. Se agregó el ácido retinoico (Sigma) a una concentración de 10~6 M. Se agregaron 10 µm de una de estas soluciones conteniendo factores de regulación a cada receptáculo conteniendo factor proliferativo de las 96 placas con receptáculo. También se prepararon receptáculos de control, conteniendo sólo factores proliferativos . En otra serie de experimentos, la neuroesfera incitando las propiedades de cada uno de estos factores de regulación fue probada por las células en crecimiento en su presencia, en Medio Completo libre de factor proliferativo. Ninguno de estos factores de regulación, con la excepción de EGF, cuando se usan en la ausencia de un factor de incitación de proliferación como EGF o FGF, tiene un efecto en la proliferación de células germinales neurales. Las adiciones de activina, BMP-2, TGF-ß, IL-2, IL-6, IL-8, MIP-1', MlP-lß, MIP-2, TNFa y EGF y CNTF se repitieron cada segundo dia, CNTF el cual se agregó cada dia y ácido retinoico, NGF y PDGF se agregaron sólo una vez, al principio del experimento. Las células fueron incubadas por un periodo de 10-12 dias. Se contó el número de neuroesferas en cada receptáculo y se tabularon los conteos resultantes usando Cricket Graph III. También se observó otra información pertinente con respecto al tamaño y forma de la esfera. En general, bFGF tuvo un efecto proliferativo mayor que EGF en los números de neuroesferas generadas por receptáculo. En la presencia de 20 ng/ml de EGF, se generaron aproximadamente 29 neuroesferas por receptáculo. En la presencia de bFGF, se generaron aproximadamente 70 neuroesferas. Sin embargo, en bFGF solo (FIG. IB), las neuroesferas fueron únicamente el 20% del tamaño de las neuroesferas generadas en la presencia de EGF (FIG. 1A) . La combinación de EGF y bFGF (FIG. 1C) produce significativamente más neuroesferas que el EGF, pero menos que las vistas con bFGF solo. Las neuroesferas son más grandes que las vistas en bFGF solo, aproximándose a aquellas neuroesferas vistas en EGF. En el caso de esferas generadas de bFGF, la adición de heparansulfato aumentó el tamaño de las esferas a alrededor del 70% del tamaño de aquellas que ocurren en respuesta a EGF. Estos datos sugieren que EGF y FGF tienen distintas acciones con respecto a la incitación de la mitogénesis de células germinales.

En la Tabla 1 se resumen los efectos de los factores de regulación agregados a los receptáculos que contienen factor proliferativo. En general, la familia TGFß, interleucinas, proteínas inhibitorias de macrófago, PDGF, TNFa, ácido retinoico (10~6 M) y CNTF significativamente redujeron los números de neuroesferas generadas en todos los factores proliferativos o combinaciones de factores proliferativos probados. BMP-2 (en una dosis de 10 ng/ml), suprimieron completamente la proliferación de neuroesferas en respuesta al EGF. El EGF y el heparansulfato ambos aumentaron en gran parte el tamaño de las neuroesferas formadas en respuesta a bFGF (aproximadamente 400%) . 51 TABLA I * Excluyendo BMP-2 (es decir, TGFa y activina) Los números de neuroesferas generadas (#) se dan como porcentajes que reflejan la disminución (-) aumento (+) en números de neuroesferas por receptáculo, en respuesta a un FACTOR PROLIFERATIVO en presencia de un FACTOR DE REGULACIÓN, en comparación con el número de neuroesferas proliferadas en ausencia del FACTOR DE REGULACIÓN. El tamaño de neuroesferas generadas en la presencia de FACTORES PROLIFERATIVOS y FACTORES DE REGULACI .en comparación con las neuroesferas generadas en la presencia de FACTORES PROLIFERATIVOS solos como indica a continuación: ++: demasiado grande; +: más grande; =: aproximadamente del mismo tamaño; ~: variable en tamaño; m pequeño; —: demasiado pequeño Paradigma 2: Experimentos antisensorios/sensorios: El tejido embriónico se preparó como se resume en el Ejemplo 1 y se cultivó en 96 placas con receptáculo en el Medio Completo. Se realizaron experimentos antisensorios y sensorios usando los siguientes oligodeoxinucleótidos (todas las secuencias escritas 5' a 3' ) : Receptor de EGF: Hebra sensoria: GAGATGCGACCCTCAGGGAC Hebra antisensoria: GTCCCTGAGGGTCGCATCTC EGF: Hebra sensoria: TAAATAAAAGATGCCCTGG Hebra antisensoria: CCAGGGCATCTTTTATTTA Cada oligodeoxinucleótido fue calentado y diluido en ddH20 y mantenido a -20°. Cada receptáculo de las 96 placas recibió 10 µl de oligodeoxinucleótido para dar una concentración final de 1, 2, 3, 4, 5, 10 ó 25 µM. Los oligodeoxinucleótidos fueron agregados cada 24 horas. El receptor de EGF (EGFr) y los oligodeoxinucleótidos de EGF fueron aplicados a cultivos crecidos en bFGF (20 ng/ml) y los oligodeoxinucleótidos de EGFr fueron aplicados a cultivos crecidos en EGF (20 ng/ml) . Las células fueron incubadas a 37°C, en una incubadora de C02 al 5% con 100% de humedad. Después de un periodo de 10 a 12 dias, se contó y se tabuló el número de neuroesferas por receptáculo. Una concentración de 3 µM de oligodeoxinucleótidos antisensorios produjo una reducción del 50% en el número de neuroesferas ?jeneradas por receptáculo, considerando que los oligodeoxinucleótidos sensorios no tuvieron ningún efecto en el número de neuroesferas generadas en respuesta a EGF y FGF. Tanto los oligodeoxinucleótidos sensorios, como los oligodeoxinucleótidos antisensorios fueron tóxicos para las células cuando se usaron 10 µM o concentraciones más altas . Pueden realizarse experimentos similares usando los siguientes oligonucleótidos : Receptor de FGF: Hebra sensoria: GAACTGGGATGTGGGGCTGG Hebra antisensoria: CCAGCCCCACATCCCAGTTC FGF: Hebra sensoria: GCCAGCGGCATCACCTCG Hebra antisensoria: CGAGGTGATGCCGCTGGC El receptor de FGF (FGFr) y los oligodeoxinucleótidos de FGF son aplicados a cultivos crecidos en EGF y los oligodeoxinucleótidos de FGFr son aplicados a cultivos crecidos en bFGF. Paradigma 3: El tejido embriónico se prepara como se resume en el Ejemplo 1 y se cultiva en 96 placas con receptáculo. El Medio Completo, conteniendo 20 ng/ml de EGF o bFGF es agregado a cada receptáculo. Se agregan una vez 10 µl de 12 miristato 13 acetato de forbol diluido (PMA) , al principio del experimento, a cada receptáculo de las 96 placas, usando una pipeta de repetición Eppendorf con una punta de 500 µl para dar una concentración final de 10, 20, 40, 100 ó 200 µg/ml.

Las células son incubadas a 37°C en una incubadora de C02 al 5% con 100% de humedad. Después de un periodo de 10 a 12 dias, se contó y se tabuló el número de neuroesferas por receptáculo . Paradigma 4 : El tejido embriónico se prepara como se resume en el Ejemplo 1 y se cultiva en 96 placas con receptáculo. Se agregan 10 µl de estaurosporina diluida a cada receptáculo de 96 placas, usando una pipeta de repetición Eppendorf con una punta de 500 µl para dar una concentración final de 10, 1, 0.1, 0.001 µM de estaurosporina. Las células son incubadas a 37°C en una incubadora de C02 al 5% con 100% de humedad. Después de un periodo de 10 a 12 dias, se contó y se tabuló el número de neuroesferas por receptáculo. Ejemplo 4 Proliferación de células germinales de médula espinal de adulto - respuestas in vitro a factores biológicos específicos o combinaciones de factores Se retiró el tejido de la médula espinal de ratones de 6 semanas a 6 meses de edad, de la siguiente manera: se quitó el tejido cérvico de la región de la columna vertebral rostral a la primera costilla; el tejido espinal torácico se obtuvo de la región caudal a la primera costiLla y aproximadamente 5 mm rostral a la última costilla; el tejido sacral lumbar constituyó el resto de la médula espinal. El tejido disecado se lavó en un fluido cerebroespinal artificial (aCSF) regular, se cortó en pequeños pedazos y después se colocó en un frasco giratorio conteniendo aCSF oxigenado con Mg2+ alto y Ca2+ bajo y una mezcla de tripsina/hialuronidasa y enzima de ácido quinurénico para facilitar la separación del tejido. El tejido fue oxigenado, agitado y calentado a 30°C durante 1 1/2 horas, después transferido a un frasco para tratamiento con inhibidor de tripsina en solución de medio (DMEM/12/mezcla de hormonas) . El tejido fue triturado 25-50 veces con una pipeta angosta pulida con fuego. Las células separadas fueron centrifugadas a 400 r.p.m. durante 5 minutos y después resuspendidas en solución fresca de medio. Las células se cultivaron en platos de 35 mm (Costar) y se dejaron asentar. Se aspiró la mayor parte del medio y se agregó medio fresco. Se agregaron EGF solo, o EGF y bFGF a algunos de los platos para dar una concentración final de 20 ng/ml cada uno y se agregó bFGF (20 ng/ml) , junto con 2 µg/ml de heparansulfato, al resto de los platos. Las células fueron incubadas en C02 al 5% con humedad del 100%, a 37°C durante 10-14 dias. Se contaron los números de neuroesferas generadas por receptáculo y se tabularon los resultados. EGF solo dio como resultado la generación de ninguna neuroesfera de las regiones de la médula espinal. En la presencia de EGF más bFGF, las neuroesferas fueron generadas de todas las regiones de la médula espinal, en particular la región sacral lumbar. Las combinaciones de EGF + FGF y FGF + heparansulfato produjeron números similares de esferas en la región cérvica, considerando que la combinación de bFGF más heparansulfato dio como resultado muy pocas neuroesferas de las regiones torácica y lumbar (ver FIG. 3) . Ejemplo 5 Generación de neuroesferas del tejido primario, in vitro, en respuesta a factores proliferativos Las neuroesferas de la primera pasada se obtuvieron de tejido humano adulto. Durante una biopsia de rutina, el tejido normal se obtuvo de una paciente femenina de 65 años de edad. El sitio de la biopsia fue el lóbulo delantero derecho, 6 mm desde la punta del cuerno delantero/anterior del ventrículo lateral. El tejido se preparó usando substancialmente el mismo procedimiento resumido en el Ejemplo 4 usando aCSF. Las células germinales se cultivaron en frascos T25 (Nunclon) en Medio Completo con 20 ng/ml de EGF, 20 ng/ml de bFGF, o 20 ng/ml de cada EGF más BFGF. Los frascos fueron examinados cada 2-3 dias para la formación de neuroesferas. Se generaron más neuroesferas de la combinación de EGF más EGF que con EGF o FGF solo.

Ejemplo 6 Inhibición de Célula Germinal y Proliferación de Progenie de Células Germinales en el SCN Lesionado A: Lesión en la Médula Espinal Se anestesiaron ratones CD1 machos adultos (Charles River, St. Constant, Quebec) usando pentobarbital sódico (80 mg/kg, i.p). Se hace una laminectomia en el nivel cérvico, torácico o lumbar y el cordón umbilical dorsal es cortado con tijeras microquirúrgicas. En el mismo dia en que se hizo la lesión, se hace una infusión de una composición que contiene un factor de regulación que inhibe la proliferación de las células germinales al cuarto ventrículo, usando una minibomba osmótica de 100 µl de capacidad (ALZA; con una velocidad de distribución de 0.5 µl/h/7 días; modelo 1007D) adaptada a una cánula calibre 30. La cánula es implantada, usando un estereotaxis, al cuarto ventrículo a AP -6.0 mm posterior a bregma, L -0.3 mm y DV -4.3 mm abajo de dura, con una posición plana del cráneo entre lambda y brecfma. La cánula es asegurada con cemento acrílico dental. Se hace una infusión de la composición que contiene un factor de regulación el cual inhibe la proliferación de las células germinales en respuesta a un estímulo de lesión durante 1-28 días a una velocidad de flujo de 0.5 µl/h. La composición comprende 0.9% de solución salina, 1 mg/ml de albúmina sérica de ratón (Sigma) y BMP-2 en 10 ng/ml. Otros factores de regulación que podrían usarse incluyen aquellos que tienen un efecto inhibitorio en la proliferación de células germinales neurales in vitro, como CNTF, ácido retinoico, miembros de la familia TGF-ß y MIP y oligonucleótidos antisensorios contra receptores de EGF y de FGF. La respuesta de las células en la región de la lesión es determinada como se resume en el Ejemplo 7. B. Lesión en el Cerebro Se anestesiaron ratones CD1 machos adultos (Charles River, St. Constant, Quebec) usando pentobarbital de sodio (80 mg/kg, i.p) . Se retira una pequeña sección de cráneo para exponer una región de la corteza cerebral. Se hace una herida de escisión en la corteza, de acuerdo con el método de Cavanagh, J.B. J. Anatomy 106: 471-487 (1970) . En el mismo día en que se hizo la lesión, se hace una infusión de los factores que inhiben la proliferación de las células germinales al ventrículo ipsilateral, usando una minibomba osmótica de 100 µl de capacidad (ALZA; con una velocidad de distribución de 0.5 µl/h/7 días; modelo 1007D) adaptada a una cánula calibre 30. La cánula es implantada, usando un estereotaxis. La cánula es asegurada con cemento acrílico dental. Se hace una infusión de los factores que inhiben la proliferación de las células germinales en respuesta a un estímulo de lesión durante 1-28 días a una velocidad de flujo de 0.5 µl/h. La solución vehículo es 0.9% de solución salina, conteniendo 1 mg/ml de albúmina sérica de ratón (Sigma) . Los factores de regulación incluyen aquellos que tienen un efecto inhibitorio en la proliferación de células germinales neurales in vitro, como BMP-2, CNTF, ácido retinoico, miembros de la familia TGF-ß y MIP y oligonucleótidos antisensorios contra receptores de EGF y de FGF. La respuesta de las células en la región de la lesión es determinada como se resume en el Ejemplo 7. Ejemplo 7 Detección de Células Proliferantes en una Región Lesionada del SCN Después de terminar los períodos de infusión en el Ejemplo 6, los ratones son inyectados con bromodeoxiyuridina (BrdU; Sigma, 120 mg/kg, i.p.) cada dos horas por un total de 5 inyecciones, para marcar las células proliferantes en la región de la lesión. Loa animales son sacrificados 30 minutos, 2 días, 4 días, 1 semana, 6 semanas o 6 meses después de la última inyección por una sobredosis anestésica y se les penetra transcardíacamente paraformaldehído al 4%. La región adyacente a e incluyendo el sitio de la lesión y la región ventricular adyacente al sitio de la lesión es retirada y agregada toda la noche a 4°C en solución de perfusión, después crioprotegida. Se cortan secciones sagitales del crióstato de 30 µm y directamente se colocan sobre portaobjetos gelificados. Para la detección de BrdU, el tejido es procesado para inmunocitoquímica después de tratar primero las secciones con 1 M HCl durante 30 minutos a 65°C para desnaturalizar el DNA celular. La anti-BrdU de ratas (Seralab) se utiliza con FITC anti-rata de burro para inmunocitoquímica. El antisuero a GFAP (expresado por astrocitos) se usa seguido por un FITC anti-ratón de burro para visualizar la expresión de GFAP u la producción de cicatrices guales. El efecto del tratamiento en la expresión de nestina es cuantizada marcando secciones con un antisuero a nestina seguido por un FITC anti-ratón de burro y contando el número de células inmunoreactivas de nestina cerca del área ventricular y el sitio de la lesión. La especificidad de la inmunocoloración es confirmada por la ausencia de anticuerpos primarios. Los resultados en animales tratados son comparados con los controles que recibieron tratamiento intraventricular solamente con el vehículo. Todas las referencias citadas en el presente son incorporada en el mismo por referencia.

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para regular la proliferación in vi tro de una célula germinal neural multipotente y/o la proliferación de progenie de la célula germinal neural comprendiendo los pasos de: (a) separación del tejido neural mamífero que contiene por lo menos una célula germinal neural multipotente capaz de producir progenie que sea capaz de diferenciarse en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos y (b) proliferación de la célula germinal neural multipotente en un medio de cultivo que contiene por lo menos un factor proliferativo que incita la proliferación de células germinales y un factor de regulación que regula la proliferación de la célula germinal neural multipotente y/o proliferación de la progenie de la célula germinal neural multipotente.
2. 2. El método de la reivindicación 1 en donde el factor proliferativo es seleccionado del grupo que consta de EGF, anfiregulina, aFGF, bFGF y TGFa.
3. 3. El método de la reivindicación 1 en donde el factor proliferativo es bFGF.
4. 4. El método de la reivindicación 1 en donde el factor de regulación es seleccionado del grupo que consta de heparansulfato, CNTF, ácido retinoico, activina, interleucinas y EGF.
5. 5. El método de la reivindicación 3 en donde el factor de regulación es heparansulfato.
6. 6. El método de la reivindicación 3 en donde el factor de regulación es EGF.
7. 7. El método de la reivindicación 1 en donde la célula germinal neural multipotente es derivada de un mamífero.
8. 8. El método de la reivindicación 1 en donde la célula germinal neural multipotente es derivada de un donante humano.
9. 9. El método de la reivindicación 1 en donde la célula germinal es derivada de un humano.
10. 10. El método de la reivindicación 8 en donde la célula germinal es derivada de un humano con un trastorno neurológico.
11. 11. una composición terapéutica para regular la proliferación de células germinales neurales en el SCN de un paciente, la composición conteniendo una cantidad terapéuticamente efectiva de un factor de regulación de células germinales neurales.
12. 12. La composición de la reivindicación 11 en donde el factor de regulación inhibe la proliferación de células germinales neurales.
13. 13. La composición de la reivindicación 12 en donde el factor de regulación se seleccionado del grupo que consta de BMP-2, CNTF, ácido retinoico, miembros de la familia TGF-ß y MIP y oligodeoxinucleótidos antisensorios contra receptores de EGF y de FGF.
14. 14. La composición de la reivindicación 13 en donde el factor de regulación es BMP-2.
15. 15. Uso de la composición de alguna de las reivindicaciones de la 12 a la 14 para la prevención de formación de tejido cicatrizal en un paciente con lesión en el cerebro o médula espinal.