MXPA97000658A - Proceso para el plegamiento de proteinas como hirudina recombinante o factor de crecimiento epidermico - Google Patents
Proceso para el plegamiento de proteinas como hirudina recombinante o factor de crecimiento epidermicoInfo
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Abstract
La invención se refiere a un proceso para la preparación de una proteína biológicamente activa y correctamente plegada, en la presencia de un agente desnaturalizante como ureaóclorhidrato de guanidina, y la separación de la proteína correctamente plegada del mismo directamente. Este proceso se puede aplicar, por ejemplo, en la renaturalización de proteínas recombinantes como hirudinaófactor de crecimiento epidérmico.
Description
PROCESO PARA EL PLEGAMIENTO DE PROTEÍNAS COMO HIRUDI A RECOMBINANTE O FACTOR OE CRECIMIENTO EPIDÉRMICO
La invención se refiere a un proceso para la preparación de una proteína biológicamente activa y correctamente plegada en la presencia de un agente desnaturalizante. El plegamiento correcto de las proteínas genéticamente diseñadas, es un importante asunto en la ciencia de las proteínas. El problema es particularmente agudo, por ejemplo, en el caso de las proteínas que contienen disulfuro, que con frecuencia necesitan desnaturalizarse y volverse a plegar para llegar a ser activas. La formación de disulfuro es un evento de modificación post-traslacional . Sigue la trayectoria del plegado de la protelna. y normalmente se presenta fielmente en vivo. Sin embargo, en los experimentos de renaturalización in vi tro. muchas proteínas se recuperan con rendimientos pobres, y algunas no se pliegan hasta la conformación nativa del todo. Para superar este problema. se han utilizado rutinariamente un número de compuestos, tales como la mezcla de glutationa reducida/oxidada (Creighton. Methods Enzymol. 131 (1986). 83-106), e iso erasa de disulfuro de proteína (IDP) (Morin. J.E. y Dixon. J. E. Methods Enzymol. 113 (1985). 541-547) para promover la formación de disulfuros. Pero a pesar de su uso ampliamente extendido, sigue sin definirse el mecanismo preciso de su función, y sus aplicaciones se han conducido de una manera de ensayo y error .
Han aparecido un número de publicaciones que informan los intentos por replegar las proteínas individuales producidas en huéspedes bacterianos, ó que de otra manera están en una forma desnaturalizada ó no nativa. La formación de un factor estimulante de colonias-1 (FEC-1) humano biológicamente activo, dimérico, después de la expresión en E. coli . se describe en la Patente Número WO 88/8003, y por Halenbeck y colaboradores. - Biotechnology, 7 (1989), 710-715. Los procedimientos descritos involucran los pasos de la sslubilización inicial de los monómeros del factor estimulante de colopias-1 aislados de cuerpos de inclusión bajo condiciones reductoras, en un medio ambiente caotrópico que comprende urea ó clorhidrato de guanidina, el replega iento. el cual se logra mediante la dilución por pasos de los agentes caotrópicos y la oxidación final de la molécula replegada en la presencia de un sistema de
''reducción-oxidación. En la Patente Número WO 88/8849 se describe un proceso para recuperar interleucina-2 (IL-2) reco binapte. caracterizado porque la IL-2 aislada a partir de cuerpos refráctiles se desnaturaliza bajo condiciones reductoras con clorhidrato de guanidina 6M. la IL-2 soluble se oxida mediante una oxidación controlada en la presencia de iones de Cu T y la IL-2 oxidada se repliega mediante la reducción de la concentración del desnaturalizante en la solución. La ipterleucipa-2 y el ipterferón-ß se han replegado utilizando SDS para la solubilización y iones de Cu^ como promotores de oxidación de la proteipa completamente reducida (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US-A-4,572,798) . El proceso para aislar proteínas refráctiles recombinantes. como se describe en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número US-A- 4,620,948, involucra fuertes agentes desnaturalizantes para solubilizar las proteínas, condiciones reductoras para facilitar el plegado correcto y el reemplazo del desnaturalizante en la y presencia de aire u otros agentes oxidantes para reformar los enlaces de disulfuro. Un método para renaturalizar las proteínas desplegadas, incluyendo citocromo c, ovalbúmina, e inhibidor de tripsina, mediante la fijación reversible de la proteína desnaturalizada en una matriz sólida, y su renaturalización por pasos mediante la dilución del desnaturalizante, se describe en la Patente Número WO 86/5809. Las referencias anteriores son meramente representativas de la enorme cantidad de literatura que trata con el replegado de las proteínas no nativas derivadas a partir de diferentes fuentes. El experto en la técnica, por otra parte, sabe que no se puede predecir el éxito de los experimentos de replegado. Los experimentos que no tienen éxito, normalmente no son informados. No existe certidumbre de que cualquiera de las condiciones de replegado informadas funcione del todo con una proteína desnaturalizada dada que contenga varios residuos de cisteína, y por consiguiente, un número de enlaces de disulfuro intramoleculares que se requieren para la actividad. El clorhidrato de guanidipa (GdmCl) y la urea son los desnaturalizantes mejor conocidos para desplegar e inactivar proteínas. Aunque todavía falta entender completamente el mecanismo de sus acciones, en general es evidente que alteran las interacciones no covalentes que estabilizan la conformación nativa. El efecto perjudicial del clorhidrato de guanidina y la urea también se ha ilustrado durante el plegado de las proteínas, lo cual normalmente conduce a la formación de especies mezcladas ,, , inactivas (Haber y Anfinsen, J. Biol. Chem. (1962), 237, 1839- 1844; Weiss ap y Kim Science (1991), 253, 1386-1393). Por otra parte. los desnaturalizantes son potentes agentes para solubilizar proteínas intratables, tales como inmunoglobulinas y componentes de membrana, etc. Por ejemplo. las proteínas recombinantes expresadas en un sistema de Escherichia coli . con frecuencia enfrentan este problema de la solubilidad de la proteina. Estas proteínas con frecuencia se encuentran en cuerpos " de inclusión insolubles, y requieren de la solubilización por un fuerte desnaturalizante como el paso esencial para replegado y generar la conformación activa. De una manera sorprendente, ahora se ha descubierto que, en la presencia del desnaturalizante y bajo condiciones de equilibrio, se forma la protelna plegada correcta, y se puede aislar del mismo directamente. Este descubrimiento facilita mucho la preparación de proteínas recombinantes, ya que éstas proteínas se pueden solubilizar utilizando agentes desnaturalizantes, y se pueden aislar de los mismos en su conformación nativa plegada correcta sin remover el desnaturalizante solubilizante. Adicionalmente, la presencia de altas concentraciones de desnaturalizante, normalmente inactiva las proteasas, y hace innecesaria una adición de inhibidores de proteasa. Por consiguiente, la presente invención proporciona un proceso para la producción de una proteína plegada correcta ó una sal de la misma, caracterizado porque la proteína se trata con un regulador del pH que comprende un desnaturalizante, y la proteína plegada correcta se separa del mismo directamente, en donde el / desnaturalizante se selecciona a partir del grupo que consiste en clorhidrato de guanidina en una concentración de 3 a 7 M, y urea en una concentración de 6 a 10 M. La proteína plegada correcta es una proteína que está en la conformación nativa y/ó que muestra una actividad biológica como la actividad enzimática ó la propiedad fijadora de la proteína nativa. El proceso de la invención es aplicable a cualquier proteína ó fragmento de proteína que se tenga que plegar en una conformación plegada correcta, y que establezca un equilibrio entre una conformación plegada no correcta y una correcta en la presencia del desnaturalizante. Este es usualmente el caso para las proteínas que no se desnaturalizan de una manera irreversible mediante el desnaturalizante. La capacidad de una proteína para establecer este equilibrio se puede supervisar fácilmente mediante los métodos convencionales que proporcionan información sobre el plegado de proteínas en solución, como RMN ó dicroísmo circular. La proteína que se va a replegar mediante el proceso de la invenpión, puede ser a partir de casi cualquier fuente, y no es necesario un tratamiento previo especial, pero no se excluye. Por ejemplo, una proteina recombinante que se almacene en el huésped productor en forma de cuerpos de inclusión, se puede ,*-, replegar simplemente separando los cuerpos de inclusión del resto del desecho celular, solubilizando las proteínas de los cuerpos de inclusión con desnaturalizante, y aislando la proteína plegada correcta a partir del mismo. En el caso de que la proteina no se almacene en forma de cuerpos de inclusión, es posible enriquecer la proteina solamente hasta algún grado utilizando, por ejemplo, un paso de precipitación, solubilizar la proteína con el desnaturalizante, y aislar la proteína plegada correcta y pura a partir del mismo. Para las proteínas recombinantes ó las proteínas naturales que no están en una conformación plegada correcta después del aislamiento, es posible solubilizar estas proteínas después del aislamiento en el desnaturalizante, y aislar la fracción plegada correcta de las mismas. Los ejemplos de las proteínas adecuadas son hirudina, factor de crecimiento epidérmico, inhibidor de carboxipeptidasa de papa (ICP), e inhibidor de tripsina pancreática bovina (ITPB), IGF-1, antagonista de C5a, TGF-ß. Las proteínas especialmente preferidas son hirudina y factor de crecimiento epidérmico (FCE) .
El término "hirudina", como se utiliza en esta invención, pretende abarcar todos los compuestos de desulfatohirudina descritos en la literatura ó que se puedan obtener de una cepa de un microorganismo transformado que contenga ADN que codifique para una desulfatohirudina ó un derivado de la misma. Estas hirudinas son, por ejemplo, derivados de desulfatohirudina HVI , HV2, y HV3 (PA) , asi como otras
^proteínas de hirudina, como son descritas, por ejemplo, por M.
Scharf y colaboradores (FEBS Lett., 255 (1989), 105-110), y en la Patente Europea EP-A-347376. Se debe entender que los derivados de hirudina ó los fragmentos más cortos que tienen actividad de hirudina, también están cubiertos por el término "hirudina". Estos fragmentos y derivados son, por ejemplo, desulfatohirudinas C-terminalmente acortadas. Ya que la especie plegada no correcta (mezclada) y la
"""proteína plegada correcta (nativa) existen en equilibrio bajo el desnaturalizante, se pueden diseñar condiciones para inclinar el equilibrio a favor de la conformación nativa. Un enfoque posible es remover la especie nativa continuamente durante el plegado. Otra estrategia es simplemente reciclar la especie mezclada. Esto se puede lograr mediante el aislamiento de la especie mezclada, y permitiéndole volverse a equilibrar en el desnaturalizante, con el objeto de generar la proteina nativa. Conociendo la constante de equilibrio bajo las condiciones de desnaturalización seleccionadas, se puede calcular el rendimiento total de la proteina nativa utilizando la siguiente fórmula: Rendimiento = A. (1 + B + B + ... + _ en donde n representa los tiempos de reciclado, A y B representan los porcentajes de la proteína nativa y la especie mezclada presentes en equilibrio. A y B son ambos menores que 1, y se pueden derivar fácilmente a partir de la constante de equilibrio. Otra posibilidad adicional para mover el equilibrio r- hacia la conformación plegada correcta, es la adición de sustancias que promuevan un plegado correcto, como sales de metal que estabilicen la conformación correcta, ó la remoción de la especie nativa utilizando un ligando fijado sólido que se fija específicamente a la estructura nativa. En una modalidad preferida de la invención, la protelna plegada correcta y la proteina plegada no correcta, se separan de una manera continua ó discontinua. En el proceso de acuerdo con la invención, se pueden utilizar todos los desnaturalizantes que permitan que la proteína solubilizada establezca un equilibrio entre la conformación plegada no correcta y la conformación plegada correcta. La concentración de clorhidrato de guapidina de preferencia es de 4 a 6 M, y la concentración de urea es de preferencia de 7 a 9 M. Si la proteína que se va a plegar comprende en la conformación plegada correcta, uno ó más enlaces de disulfuro, se recomienda la adición de un agente reductor ó de un sistema de reducción-oxidación. De una manera conveniente, el proceso se realiza en la presencia de un agente reductor con un potencial de reducción-oxidación de -0.20 a -0.30, tal como glutationa, cistelpa, ó ß-mercaptoetanol , que es el preferido. La concentración del agente reductor de preferencia es de 0.05 a 1 mM, y más preferiblemente de 0.1 a 0.5 M. El regulador del pH de desnaturalización, ó el
,-„ regulador para que se aisle la protelna plegada correcta, también puede contener un compuesto adicional que promueva el plegado ó que impida reacciones secundarias indeseadas. Los ejemplos son otros desnaturalizantes como SDS y Tritón, ó iones de metal, agentes reductores adicionales, agentes oxidantes, agentes complejantes como ácido etilendia inatetra-acético ó coepzi as. La proteina plegada correcta se puede separar de la proteina plegada no correcta mediante cualquier proceso que pueda ~ distinguir estas dos formas. Estos procesos, por ejemplo, se basan en una diferencia en la movilidad, la forma, la reactividad ó las propiedades de fijación. Los ejemplos para los procesos adecuados son separaciones basadas en anticuerpos, basadas en membrana, electroforéticas ó cromatográficas, como electroforesis de gel, filtración de gel, cromatografía en capa delgada (CCD), cromatografía de liquido con alto rendimiento, cromatografía por afinidad, ó separación por medio de una membrana selectiva. En una modalidad preferida de la invención, la proteina plegada correcta se separa mediante cromatografía de liquido con alto rendimiento, cromatografía en capa delgada, ó cromatografía por afinidad. En el caso de que la proteína plegada correcta se separe discontinuamente, nuevamente se tienen que adaptar las condiciones que sean necesarias para establecer este equilibrio, por ejemplo, mediante concentración ó dilución de la solución restante. Por ejemplo, es posible aislar la proteina plegada r correcta y la no correcta por separado, por ejemplo, con una columna de cromatografía de líquido con alto rendimiento, concentrar la fracción que contenga la proteípa plegada no correcta, y solubilizarla una vez más bajo condiciones desnaturalizantes. Si él proceso de separación se realiza continuamente, se pueden supervisar las concentraciones de los componentes esenciales, por ejemplo, utilizando un elemento espectroscópico, y adaptándose continuamente. /-'*' Las reacciones de plegado se realizan de preferencia a una temperatura que promueva el establecimiento de un equilibrio y que no desnaturalice de una manera irreversible la proteína. Por consiguiente, la temperatura aplicada depende principalmente de la estabilidad de la proteina y del procedimiento de separación para la proteína plegada correcta. Por ejemplo, ciertas proteínas de micro-organismos termófilos son estables a 60° C y más, mientras que las proteínas que se originan a partir de micro-organismos no termófilos, algunas veces podrían entrar en modificaciones irreversibles a 40° C ó menos.
Breve descripción de los dibulos En la siguiente parte experimental, se describen varias modalidades de la presente invención con referencia a los dibujos acompañantes, en los cuales: La Figura 1 es un protocolo de cromatografía de liquido con alto rendimiento, del dominio del núcleo de hirudina (Hir1-" en la presencia de clorhidrato de guanidina 5 M, y ß- ^ mercaptoetanol 0.25 mM. La Figura 2, es un protocolo de cromatografía con líquido de alto rendimiento, de factor de crecimiento epidérmico en la presencia de clorhidrato de guanidina 3 M, y ß- ercaptoetanol 0.25 mM.
PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES
, "" Ejemplo 1: Producción y aislamiento del dominio del núcleo de hirudina (Hir1~ ?) Se aisla hirudina desulfatada recombinante a partir de Saccharomyces cerevisiae, como se describe en Meyhack y colaboradores (Thro b. Res. Suppl. VII (1987), 33). La desulfatohirudina aislada se disuelve en un regulador de bicarbonato de amonio 50 M, pH de 8.0, a una concentración de 5 miligramos/mililitro, y se digiere con quimotripsina (0.25 miligramos/mililitro) a la temperatura ambiente durante 16 horas. La digestión se termina mediante la adición de ácido -trifluoroacético hasta una concentración final del 0.8 pon ciento, y el dominio del núcleo (Hir y se aisla mediante cromatografía de líquido con alto rendimiento.
Condiciones para la cromatografía de liquido con alto rendimiento: Columna Vydac C-18 Solvente A 0.1% de ácido trifluoroacético en agua
Solvente B 0.1% de ácido trifluoroacético en acetonitrilo. Gradiente : 10% de B a 48% de B en 30 minutos a 23° C Tiempo de retención para Hir 1 —49: 14.3 minutos
Ejemplo 2: Desnaturalización del dominio del núcleo de hirudina (Hir1"*1? El material de partida para los experimentos de plegado, el dominio del núcleo completamente reducido/ desnaturalizado de hirudina [R] , se prepara mediante el siguiente método: El domino del núcleo de hirudina del Ejemplo 1 (2 miligramos/mililitro) se disuelve en regulador de Tris-HCl (0.5 M, pH de 8.5) que contiene 5 M de cloruro de guanidina (Gd Cl) , y 30 mM de ditiotreitol. La reducción y la desnaturalización se realizan a 23° C durante 90 minutos. Para iniciar el plegado, la muestra se pasa a través de una columna PD-10 (Pharmacia) equilibrada en regulador de Tris-HCl 0.1 M (pH de 8.5). La desalación toma de aproximadamente 1 a 2 minutos, y la muestra se utiliza inmediatamente en los experimentos de plegado.
Ejemplo 3: Plegado de hirudina en la presencia de clorhidrato de guanidina. Las muestras se diluyen hasta una concentración de proteína final de 1 miligramo/mililitro; contienen regulador de Tris-HCl 0.1 M (pH de 8.5), clorhidrato de guanidina 5 M, y ß- mercaptoetanol 0.25 M. Después de 24 horas de incubación a la temperatura ambiente, se separa la hirudina nativa de la hirudina mezclada por medio de cromatografía de liquido de alto rendimiento.
Condiciones para la cromatografía de liquido >'~ con alto rendimiento: Columna Vydac c-18 Solvente A 0.1% de ácido trifluoroacético en agua Solvente B 0.1% de ácido trifluoroacético en acetonitrilo. Gradiente : 14% de B a 32% de B en 50 minutos a 23° C
Tiempo de retención para Hir 1 —¿10: 23 minutos
El protocolo de la cromatografía de líquido con alto rendimiento se da en la Figura 1.
A partir de la integración de los valores del protocolo de la cromatografía de líquido de alto rendimiento, la cantidad de la hirudina nativa se calcula en el 60 por ciento + 5 por ciento, y el Keqen 0.67 ± 0.15. La fracción que contiene la hirudina mezclada se liofiliza y se disuelve en regulador de Tris-HCl 0.1 M (pH de 8.5) que contiene clorhidrato de guanidina 5 M, y ß-,, mercaptoetanol 0.25 mM, hasta una concentración de proteina final de 1 miligramo/mililitro. Después de 24 horas de incubación, la hirudina nativa se separa de la hirudina mezclada por medio de cromatografía de líquido con alto rendimiento, como se describió anteriormente. La liofilizacióp y la renaturalización se realizan por tercera vez como se describió anteriormente. Todas las fracciones que contienen la hirudina nativa se combinan, y la recuperación total de hirudina nativa suma r hasta el 97 por ciento después de tres ciclos. La actividad de la hirudina recuperada se prueba por la capacidad para inhibir la ó-trombina humana de "Chromozym" de digestión (Boehripger Mannheim). La reacción se realiza a 22° C en regulador de Tris-HCl 67 mM (pH de 8.0) que contiene NaCl 133 mM, y glicol de polietileno 6000 al 0.13 por ciento. La velocidad de la digestión fue seguida a 405 nanómetros durante un período de 2 minutos. La concentración del sustrato es de 200 M. La concentración de la trombina se ajusta entre 2.5 y 25 nM. Para análisis estructural adicional. la proteína recuperada se carboximetila con ácido yodoacético 0.2 M en regulador de Tris^HCl (0.5 M, pH de 8.5) durante 30 minutos, y se desala a través de una columna PD-10 equilibrada con una solución de bicarbonato de amonio (50 mM, pH de 8.0). El contenido de disulfuro se determina mediante análisis de aminoácidos (Chan y Knecht, Anal. Biochem. (1991), 197, 52-58) y espectrometría de masas (Chatrenet y Chang, J. Biol. Chem. (1992), 267, 3038-3043).
Ejemplo 4: Plegado de hirudina en la presencia de urea La renaturalización se realiza como se describe en el
Ejemplo 3, con la única diferencia de que se utiliza urea 8 M en lugar de clorhidrato de guanidina 5 M. A partir de la integración de los valores del protocolo de la cromatografía de líquido de alto rendimiento, la cantidad de hirudina nativa se calcula en el 90 por ciento + 5 por ciento, y el Keqen 0.11 + 0.06. Después de dos ciclos, la recuperación total de hirudina nativa es del 99 por ciento.
Ejemplo 5: Desnaturalización de factor de crecimiento epidérmico. El factor de crecimiento epidérmico (FCE) es proporcionado por Protein Institute Inc. (Broo all, EUA), y se desnaturaliza como se describe para la hirudina en el Ejemplo 2.
Ejemplo 6: Plegado de factor de crecimiento epidérmico en la presencia de clorhidrato de guanidina. La renaturalización se realiza como se describe en el
Ejemplo 3, con la única diferencia de que se utiliza factor de crecimiento epidérmico en lugar de hirudina, y se utiliza clorhidrato de guanidina 3 M en lugar de clorhidrato de guanidina
M. El protocolo de la cromatografía de líquido de alto rendimiento se da en la Figura 2. A partir de la integración de los valores del protocolo de la cromatografía de líquido de alto rendimiento, la cantidad de factor de crecimiento epidérmico nativo se calcula en el 89 por ciento + 5 por ciento, y el K en 0.12 + 0.07. Después de dos ciclos, la recuperación total del factor de crecimiento epidérmico nativo es del 99 por ciento. '*""- El contenido de disulfuro se determina como se describe en el Ejemplo 3.
Claims (13)
1. Un proceso para la producción de una proteína plegada correcta ó una sal de la misma, caracterizado porque la proteína se trata con un regulador del pH que comprende un desnaturalizante, y la proteína plegada correcta se separa del mismo directamente, en donde el desnaturalizante se selecciona a partir del grupo que consiste en clorhidrato de guanidina en una concentración de 3 a 7 M, y urea en una concentración de 6 a 10 M.
2. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la proteína plegada correcta se separa de una manera continua ó discontinua.
3. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la proteína plegada correcta se separa de una manera discontinua.
4. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la proteína es hirudina ó factor de crecimiento epidérmico.
5. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la concentración de clorhidrato de guanidina es de 4 a 6 M.
6. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la concentración de urea es de 7 a 9 M.
7. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde está presente un agente reductor. !8
8. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el agente reductor tiene un potencial de reducción- oxidación de -0.20 a -0.30.
9. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el agente reductor es ß-mercaptoetanol .
10. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la concentración del agente reductor es de 0.05 a 1 M.
11. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la concentración del agente reductor es de 0.1 a 0.5 M.
12. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la proteína plegada correcta se separa mediante separaciones basadas en anticuerpos, basadas en membrana, electroforéticas ó cromatográficas.
13. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la proteína plegada correcta se separa mediante " cromatografía de líquido con alto rendimiento, cromatografía en capa delgada, ó cromatografía por afinidad.
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