MXPA97000149A

MXPA97000149A - Seroparaoxonasa

Info

Publication number: MXPA97000149A
Application number: MXPA/A/1997/000149A
Authority: MX
Inventors: Wu He Wei; L Hudson Peter; M Ruben Steven
Original assignee: Human Genome Sciences Inc
Priority date: 1994-07-05
Filing date: 1997-01-07
Publication date: 1998-01-01

Abstract

Se describe la enzima seroparaoxonasa humana y el ADN (ARN) que codifica para tales enzimas seroparaoxonasas. También se proporciona el procedimiento para producir tales polipéptidos por técnicas recombinantes. Los usos de tales polipéptidos incluyen su uso como un antídoto para el envenenamiento con organofosfato y para evitar la muerte celular neuronal. También se describen los ensayos de diagnóstico para identificar mutaciones en una secuencia deácido nucleico que codifica para un polipéptido de la presente invención y para detectar niveles alterados del polipéptido de la presente invención.

Description

SEROPARAQXON?SA Esta invención se relaciona con polinucleótidos recientemente identificados, los polipéptidos codificados por tales polinucleótidos, el uso de tales polinucleótidos y polipéptidos, así como con la producción de tales polinucleótidos y polipéptidos. De manera más particular, el polipéptido de la presente invención es la seroparaoxonasa. La invención también ser relaciona con la inhibición de la acción de tales polipéptidos. El parathion (fosfotioato de dietil-para-nitrofenilo) y el chlorpyrifos (0, 0-dietil-0-3, 5, 6-tricloro-2-piridinol) , son comúnmente usados como insecticidas organofosforados y están implicados en un gran número de envenenamientos de trabajadores agrícolas y otros cada año (Hayes, W. J., Pesticidas Estudiados en el Hombre, Wil ins y ilkins, Baltimore, pp. 284-435 (1982)). Ambos compuestos son bioactivados in vivo para formar los inhibidores de oxon tóxico respectivo de la colinesterasa. Esto conduce a la muerte celular neuronal y padecimientos neuronales relacionados. Ambos oxones son hidrolizados por la sero enzima paraoxonasa/arilesterasa, la mayoría, si no es que toda, la cual se localiza en las partículas de lipoproteína de alta densidad (HDL) (Mackness, M. I., et al., Biochem. Pharmacol., 32:2291-2296 (1983)).

Ref- 23814 En los humanos, esta enzima exhibe un polimorfismo en su actividad dependiente del sustrato (Mallinckrodt, M. G. y D,-epgen, T. L., Toxicol. Environ. Chem., 18:79-196 (1988)). La seroparaoxonasa/arilesterasa catalizan la hidrólisis de los organofosfatos, esteres de ácidos carboxílicos aromáticos, y carbamatos. Parecen existir dos alelos. Un producto alílico hidroliza el paraoxon con un alto índice de recambio y el otro con un bajo Índice de recambio. Otros sustratos tales como el fenilacetato, beta y naftilacetato (Gan, K. N., et al., Drug Metab. Dispos., 19:100-106 (1991)) y el oxon del chlorpyrifos (Furlong, C. E., et al., Anal. Biochem., 180:242-247 (1989)) son hidolizados por cualquier producto alélico a la misma o casi la misma razón. La enzima también hidroliza los agentes nerviosos somano y sarina (Gan, K. N., et al., Drug Metab. Dispos., 19:100-106 (1991)). La hidrólisis de los organofosfatos neurotóxicos es una actividad benéfica, fortuita de la paraoxonasa. De acuerdo con una aspecto de la presente invención, se proporciona un polipéptido maduro novedoso, así como fragmentos, análogos y derivados del mismo biológicamente activos y útiles para el diagnóstico o terapéuticamente. El polipéptido de la presente invención es de origen humano. De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas, que codifican para un polipéptido de la presente invención, " incluyendo ARNm, ADN, ADNc, ADN genómicos así como análogos y fragmentos de los mismos biológicamente activos y útiles para el diagnóstico o terapéuticamente. 5 De acuerdo con un aspecto adicional más de la presente invención, se proporciona un proceso para producir tal polipéptido por las técnicas recombinantes, que comprenden cultivar células huésped procarióticas y/o eucarióticas recombinantes, que contienen una secuencia de ] -. " ácido nucleico que codifica para un polipéptido de la presente invención, bajo condiciones que promueven la expresión de la proteína y la posterior recuperación de tal proteína. De acuerdo con otros aspecto adicional más de la presente invención, se proporciona un proceso para utilizar tal polipéptido, o polinucleótido que codifica para tal polipéptido para propósitos terapéuticos, por ejemplo, como un antídoto para la toxicidad del organofosfato (envenenamiento con plagicidas) y para prevenir la muerte celular neuronal. De acuerdo con un aspecto adicional más de la presente invención, se proporcionan anticuerpos contra tales polipéptidos . De acuerdo con un aspecto adicional más de la 5 presente invención, también se proporcionan sondas de ácido nucleico que comprenden moléculas de ácido nucleico de suficiente longitud para hibridarse de manera específica a una secuencia de ácido nucleico de la presente invención. De acuerdo con otro aspecto más de la presente 5 invención, se proporcionan los ensayos de diagnóstico para detectar enfermedades o la susceptibilidad a enfermedades relacionadas en mutaciones en las secuencias de ácido nucleico que codifican para un polipéptido de la presente invención. -.j De acuerdo con un aspecto adicional más de la presente invención, se proporciona un proceso para utilizar tales polipéptidos, o polinucleótidos que codifican para tales polipéptidos, para propósitos in vi tro relacionados con investigación científica, por ejemplo, síntesis de ADN y manufactura de vectores de ADN. Esos y otros aspectos de la presente invención serán evidentes a aquellos expertos en la técnica a partir de las enseñanzas de la presente. Los siguientes dibujos son ilustrativos de las modalidades de la invención y no significa que limiten el alcance de la invención abarcada por la reivindicaciones. La Figura 1 muestra la secuencia de ADNc y la secuencias de aminoácidos deducida para el polipéptido seroparaoxonasa maduro putativo. Se usó la abreviación 5 estándar de una letra para los aminoácidos.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un ácido nucleico (polinucleótido) aislado, el cual codifica para el polipéptido maduro que tiene la secuencia de aminoácidos deducida de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2) o para el polipéptido maduro codificado por el ADNc de la clona depositada como Depósito ATCC No. 75773 en Mayo 12, 1994. El polinucleótido de esta invención fue descubierto en una biblioteca de ADNc derivada de una amígdala humana. Este está estructuralmente relacionado con la familia de la seroparaoxonasa/arilesterasa humana. Contiene un marco de lectura abierta que codifica para una proteína de aproximadamente 356 aminoácidos residuales. La proteína exhibe el más alto grado de homología con la seroparaoxonasa de oryctolagus cuniculus con una identidad del 67 % y una similitud del 83 % sobre una extensión de 249 aminoácidos . El polinucleótido de la presente invención puede estar en forma de ARN o en forma de ADN, ADN el cual incluye ADNc, ADN genómico y ADN sintético. El ADN puede ser de doble hebra o de una sola hebra, y si es de una sola hebra puede ser la hebra codificadora o la hebra no codificadora (antisentido) la secuencia codificadora, que codifica para el polipéptido maduro puede ser idéntica a la secuencia codificadora mostrada en la Figura 1 (SE ID NO:l) o a la de la clona depositada o puede ser una secuencia codificadora diferente, secuencia codificadora, la cual, como resultado de la redundancia o degeneración del código genético, codifica para el mismo polipéptido maduro que el ADN de la Figura 1 (SEQ ID N0:1) o el ADNc depositado. El polinucleótido que codifica para el polipéptido maduro de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2) o para el polipéptido maduro codificado por el ADNc depositado puede incluir: únicamente la secuencia codificadora para el polipéptido maduro; la secuencia codificadora para el polipéptido maduro y la secuencia codificadora adicional tal como una secuencia líder o secretora o una secuencia de proteína; la secuencia codificadora para el polipéptido maduro (y opcionalmente la secuencia codificadora adicional) y la secuencia no codificadora, tal como los intrones o secuencia no codificadora 5' y/o 3' de la secuencia codificadora para el polipéptido maduro. De este modo, el término "polinucleótido que codifica para un polipéptido" abarca un polinucleótido, el cual incluye únicamente la secuencia codificadora para el polipéptido así como un polinucleótido, el cual incluye la secuencia codificadora y/o no codificadora adicional. La presente ihvención se relaciona además con las variantes de los polinucleótidos descritos aquí anteriormente, los cuales codifican para fra«gmentos, análogos y derivados del polipéptido que tiene la secuencia de " aminoácidos deducida de la Figura 1 (SEQ ID N0:2) o el polipéptido codificado por el ADNc de la clona depositada. La variante del polinucleótido puede ser una variante alélica natural del polinucleótido o una variante no natural del polinucleótido . De este modo, la presente invención incluye los polipéptidos que incluyen para el mismo polipéptido maduro mostrado en la Figura 1 (SEQ ID NO: 2) o el mismo polipéptido maduro codificado por el ADNc de la clona depositada, así como las variantes de tales polipéptidos, variantes las cuales codifican para un fragmento, derivado o análogo del polipéptido de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2) o el polipéptido codificado por el ADNc de la clona depositada. Tales variantes nucleotídicas incluyen variantes de supresión, variantes de sustitución y variantes de adición o inserción. Como se indicó aquí anteriormente, el polinucleótido puede tener una secuencia codificadora, la cual es una variante alélica natural de la secuencia codificadora mostrada en la Figura 1 (SEQ ID NO:l) o de la secuencia codificadora de la clona depositada. Como es sabido en la técnica, una variante alélica es una forma alternativa de una secuencia polinucleotídica que puede tener una sustitución, supresión o adición de uno o más nucleótidos, la cual no altera de manera sustancial la función del ""'polipéptido codificado. La presente invención también incluye los polinucleótidos, en donde la secuencia codificadora para el polipéptido maduro puede fundirse en el mismo marco de lectura abierta a una secuencia polinucleotídica que ayuda a la expresión y secreción de un polipéptido de una célula huésped, por ejemplo, una secuencia líder la cual funciona como una secuencia secretora para controlar el transporte de un polipéptido desde la célula. El polipéptido que tiene una secuencia líder es una preproteína y puede tener la secuencia líder escindida por la célula huésped para formar la forma madura del polipéptido. Los polinucleótidos también pueden codificar para una proteína que es la proteína madura más 5' aminoácidos residuales adicionales. Una proteína madura que tiene una prosecuencia es una proteína y es una forma activa de la proteína. Una vez que la prosecuencia es escindida permanece una proteína madura activa. De este ir-odo, por ejepplo, el polinucleóti«do de la presente invención puede codificar para una proteína madura, o para una proteína que tiene una prosecnencia o para una proteína que tiene tanto una prosecuencia como una presecuencia (secuencia líder) . Los polinucleótidos de la presente invención también pueden tener la secuencia codificadora fusionada en el marco a una secuencia marcadora, la cual permite la purificación del polipéptido de la presente invención. La secuencia marcadora puede ser una marca de exahistidina proporcionada por un vector pQE-9 para proporcionar la purificación del polipéptido maduro fusionado al marcador en el caso de un huésped bacteriano, o, por ejemplo, la secuencia marcadora puede ser una marca de hemaglutinina (HA) cuando se usa un huésped mamífero, por ejemplo las células COS-7. La marca de HA corresponde a un epitopo derivado de la proteína hemaglutinina de la influenza (Wilson, I., et al., Cell, 37:767 (1984) ) . El término "gen" significa el segmento de ADN implicado en la producción de una cadena polipeptídica; este incluye las regiones que preceden y siguen a la región codificadora (líder y de avance) así como las secuencias interventoras (intrones) entre los segmentos codificadores individuales (exones) . Los fragmentos del gen de longitud completa de la presente invención pueden usarse como una sonda de hibridación para una biblioteca de ADNc para aislar el ADNc de longitud completa y para aislar otros ADNc que tienen una alta similitud de secuencia con el gen o actividad biológica similar. Las sondas de este tipo preferiblemente tienen al menos 30 bases y pueden contener, por ejemplo, 50 o más bases. La sonda también puede ser usada para identificar una clona de ADNc que corresponde a un transcripto de longitud completa y una clona o clonas genómicas que contienen el gen completo, incluyendo las regiones reguladora y promotora, exones e intrones. Un ejemplo de un análisis comprende aislar la región codificadora del gen mediante el uso de la secuencia de ADN conocida para sintetizar una sonda oligonucleotídica. Los oligonucleótidos marcados que tienen una secuencia complementaria a la del gen de- la presente invención se usan para seleccionar una biblioteca de ADNc humano, ADN o ARNm genómico para determinar cuales miembros de la biblioteca híbrida la sonda. La presente invención se relaciona además con los polinucleótidos que se hibridan a las secuencias descritas aquí anteriormente si existe al menos 70%, de manera preferible al menos 90%, y de manera más preferible al menos 95% de identidad entre las secuencias. La presente invención se relaciona particularmente con los polinucleótidos que se hibridan bajo condiciones estrictas a los polinucleótidos descritos aquí anteriormente. Como se usa aquí, el término "condiciones estrictas" significa la hibridación que ocurrirá únicamente si existe al menos 95% y de manera preferible al menos 97% de identidad entre las secuencias. Los polinucleótidos que se hibridan a los polinucleótidos descritos aquí anteriormente en una modalidad preferida codifican para polipéptidos, los cuales ya sea que retengan sustancialmente la misma actividad o función biológica que el polipéptido maduro codificado por los ADNc de la Figura 1 (SEQ ID N0:1) o los ADNc depositados. De manera alternativa, el polinucleótido puede tener el menos 20 bases, de manera preferible 30 bases, y de 5 manera más preferible al menos 50 bases, la cual se híbrida a un polinucleótido de la presente invención y que tiene una identidad con este, como se describió aquí anteriormente, y que puede o no retener su actividad. Por ejemplo, tales polinucleótidos pueden ser empleados como sondas para el --O polinucleótido de la SEQ ID NO:l, por ejemplo, para recuperar el polinucleótido o cono una sonda de diagnóstico o como un cebador de PCR. De este modo, la presente invención está dirigida a los polinucleótidos que tienen al menos una identidad del 70%, de manera preferible al menos una identidad del 90% y de manera más preferible de al menos el 95% con el polinucleótido que codifica para el polipéptido de la SEQ ID NO: 2 así como los fragmentos del mismo, fragmentos los cuales tienen al menos 30 bases y de manera preferible al menos 50 bases y con los polipéptidos codificados por tales polinucleótidos . Los depósitos a los que se hace referencia aquí serán mantenidos bajo los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de 5 Microorganismos para los propósitos del Procedimiento de Patentes. Esos depósitos se proporcionan simplemente por conveniencia a aquellos expertos en la técnica y no porque se admita que se requiere un depósito bajo 35 U.S.C §112. La secuencia de los polinucleótidos contenidos en los materiales depositados, así como la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos codificados por estos, se incorporan aquí como referencia y están controlados en el caso de cualquier conflicto con cualquier descripción de las presentes secuencias. Puede requerirse un permiso para hacer, usar o vender los materiales depositados, y tal permiso no es proporcionado por la presente. La presente invención se relaciona además con un polipéptido seroparaoxonasa, el cual tiene la secuencia de aminoácidos deducida de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2) o que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el ADNc depositado, así como los fragmentos, análogos y derivados de tal polipéptido. Los términos "fragmentos", "derivado" y "análogo" cuando se refieren al polipéptido de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2) o al codificado por el ADNc depositado, significan un polipéptido el cual retiene esencialmente la misma función o actividad biológica de tal polipéptido. De este modo, un análogo incluye una proteína la cual puede ser activada mediante la escisión de la porción proteica para producir un polipéptido maduro activo.

El polipéptido de la presente invención puede ser un polipéptido recombinante, un polipéptido natural o un polipéptido sintético, de manera preferible un polipéptido recombinante . 5 El fragmento, derivado o análogo del polipéptido de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2) o del codificado por el ADNc depositado puede ser (i) uno en el cual uno o más de los aminoácidos residuales estén sustituidos con un aminoácido residual conservado o no conservado (preferiblemente un '• aminoácido residual conservado) y tal aminoácido residual sustituido puede o no ser uno codificado por el código .genético, o (ii) uno en el cual uno o más de los aminoácidos residuales incluya un grupo sustituyente, o (iii) uno en el cual el polipéptido maduro esté fusionado con otro compuesto, 5 tal como un compuesto para incrementar la vida media del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol), o (iv) uno en el cual los aminoácidos adicionales estén fusionados al polipéptido maduro, tal como una secuencia lídero secretora o una secuencia la cual se emplee para la purificación del 0 polipéptido maduro o una secuencia de proteína. Se considera que tales fragmentos, derivados y análogos están dentro del alcance de aquellos expertos en la técnica a partir de las enseñanzas de la presente.

Los polipéptidos y polinucleótidos de la presente invención se proporcionan preferiblemente en forma aislada, y preferiblemente se purifican hasta quedar homogéneos. El término "aislado" significa que el material se 5 remueve de su ambiente original (por ejemplo, el ambiente natural se encuentra en la naturaleza) . Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido natural presente en un animal viviente no es aislado, pero el mismo polinucleótido o polipéptido, separado de algunos o todos los materiales * ?. coexistentes en el sistema natural, es aislado. Tales polinucleótidos podrían ser parte de un vector y/o tales polinucleótidos o polipéptidos podrían ser parte de una composición, y aún ser aislados dado que tal vector o composición no es parte de su ambiente natural. 15 Los polipéptidos de la presente invención incluyen el polipéptido de la SEQ ID NO: 2 (en particular el polipéptido maduro) así como los polipéptidos que tienen una similitud de al menos el 70% (de manera preferible una identidad de al menos el 70%) con el polipéptido de la SEQ ID NO: 2 y de manera más preferible una similitud de al menos el 90% (de manera más preferible una identidad de al menos el 90%) con el polipéptido de la SEQ ID NO: 2 y de manera aún más preferible una similitud de al menos el 95% (de manera aún más preferible una identidad de al menos el 95%) con el polipéptido de la SEQ ID NO: 2 y también incluye porciones de tales polipéptidos con tal porción del polipéptido '*'" conteniendo generalmente al menos 30 aminoácidos y de manera más preferible al menos 50 aminoácidos. Como es sabido en la técnica la "similitud" entre dos polipéptidos se determina comparando la secuencia de aminoácidos y sus aminoácidos sustitutos conservados de un polipéptido con la secuencia de un segundo polip.éptido. Los fragmentos o porciones de los polipéptidos de la presente invención pueden emplearse para producir el 1j polipéptido de longitud completa correspondiente mediante la síntesis de péptidos; por lo tanto, los fragmentos pueden emplearse como intermediarios para producir los polipéptidos de longitud completa. Los fragmentos o porciones de los polinucleótidos de la presente invención pueden usarse para sintetizar los polinucleótidos de longitud completa de la presente invención. La presente invención también se relaciona con los vectores que incluyen los polinucleótidos de la presente invención, células huésped las cuales se diseñaron genéticamente con los vectores de la invención y la producción de los polipéptidos de la presente invención por técnicas recombinantes . Las células huésped se diseñaron (tradujeron o transformaron o transfectaron) genéticamente con los vectores de esta invención los cuales pueden ser, por ejemplo, un vector de clonación o un vector de expresión. El vector puede estar, por ejemplo, en forma de un plásmido, una partícula viral, un fago, etc. Las células huésped diseñadas pueden ser cultivadas en medios nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para activar promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes de la seroparaoxonasa. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, el pH y similares, son aquellos anteriormente usados con las células huésped seleccionadas para la expresión, y serán evidentes a aquellos expertos en la técnica. Los polinucleótidos de la presente invención pueden emplearse para producir polipéptidos por técnicas recombinantes. De este modo, por ejemplo, el polinucleótido puede ser incluido en cualquiera de una variedad de vectores de expresión para expresar un polipéptido. Tales vectores incluyen secuencias de ADN cromosómico, no c-ratosómiao , y sintético, por ejemplo, derivados del SV40; plásmidos bacterianos; ADN de fago; baculovirus; plásmidos de levadura; vectores derivados de aaibinaciones de plá-=raidos y ACN de fago, ACN viral tal como el de vaccinia, adenovirus, virus de la viruela de las aves, y pseudorabies. Sin embargo, puede usarse cualquier otro vector en tanto sea duplicable y viable en el huésped. La secuencia de ADN apropiada puede ser insertada en el vector por medio de una variedad de procedimientos. En general, la secuencia de ADN se inserta en un sitio de endonucleasa de restricción apropiado por los procedimientos conocidos en la técnica. Se considera que tales procedimientos y otros están dentro del alcance de aquellos 5 expertos en la técnica. La secuencia de ADN en el vector de expresión está ligada de manera operativa a una secuencia de control de expresión apropiada (promotor) para dirigir la síntesis del ARNm. Como ejemplos representativos de tales promotores, Az pueden mencionarse: el LTR o promotor de SV40, el lac o trp ^e E. coli, el promotor PL del fago lambda y otros promotores que se sabe controlan la expresión de los genes en células procarióticas o eucarióticas o sus virus. El vector de expresión también contiene un sitio de unión ribosómico para 5 el inicio de la traducción o translación y un terminador de la transcripción. El vector también puede incluir las ,_ secuencias apropiadas para amplificar la expresión. Además, los vectores de expresión preferiblemente contienen uno o más genes marcadores seleccionables para 0 proporcionar un rasgo fenotípico para la selección de las células huésped transformadas tales como la resistencia a la dihidrofolato reductasa o neomicina para el cultivo de células eucarióticas, o tal como la resistencia a la tetraciclina o ampicilina en E . coli .

El vector que contiene la secuencia de ADN apropiada como se mencionó aquí anteriormente, así como un promotor o secuencia de control apropiada, pueden emplearse para transformar un huésped apropiado para permitir que el huésped exprese la proteína. Como ejemplos representativos de huéspedes apropiados, pueden mencionarse: células bacterianas, tales como E. coli, Streptomyce s, Salmonella typhimurium; células de hongos, tales como levaduras; células de insectos tales _.j como Droaophila y Spodoptera Sf9; células animales tales como CHO, COS o melanoma de Bowes; adenovirus; células de plantas, etc. Se considera que la selección de un huésped apropiado está dentro del alcance de aquellos expertos en la técnica a partir de las enseñanzas de la presente. 5 De manera más particular, la presente invención también incluye los constructos recombinantes que comprenden una o más de las secuencias ampliamente descritas arriba. Los constructos comprenden un vector, tal como un plásmido o vector viral, en el cual una secuencia de la invención ha 0 sido insertada, en una orientación hacia adelante, o hacia atrás. En un aspecto preferido de esta modalidad, el constructo comprende además secuencias reguladoras, incluyendo, por ejemplo, un promotor, ligado de manera operable a la secuencia. Los expertos en la técnica conocen 5 un gran número de vectores y promotores adecuados, y están comercialmente disponibles. Los siguientes vectores se proporcionan a manera de ejemplo. Bacterianos: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen) , pbs, pDlO, phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene); 5 ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia) . Eucarióticos: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia) . Sin embargo, puede emplearse cualquier otro plásmido o vector en tanto sean duplicables y viables en el huésped. _, Las regiones del promotor pueden seleccionarse de cualquier gen deseado usando vectores de CAT (cloramfenicol transferasa) u otros vectores con marcadores seleccionables. Dos vectores apropiados son el PKK232-8 y el PCM7. Los promotores bacterianos nombrados, particulares, incluyen el lacl, lacZ, T3, T7, gpt, lambda PR PL y trp. Los promotores eucarióticos incluyen el CMV inmediato temprano, la timidina cinasa de HSV, el SV40 temprano y tardío, los LTR de retrovirus, y la metalotioneina-I de ratón. La selección del vector y promotor apropiados también está dentro del nivel de un experto en la técnica. En una modalidad adicional, la presente invención se relaciona con las células huésped que contienen los constructos descritos anteriormente. La célula huésped puede ser una célula eucariótica superior, tal como una célula de 5 mamífero, o una célula eucariótica inferior, tal como una célula de levadura, o la célula huésped puede ser una célula procariótica, tal como una célula bacteriana. La introducción del constructo en la célula huésped puede efectuarse mediante la transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-Dextran, o electroporación. (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Métodos Básicos en Biología Molecular, (1986)). Los constructos en las células huésped pueden usarse de manera convencional para producir el producto genético codificado por la secuencia recombinante. De manera alternativa, los polipéptidos de la invención pueden producirse sintéticamente por sintetizadores de péptidos convencionales . Las proteínas maduras pueden expresarse en células de mamífero, levadura, bacterias, u otras células bajo el control de los promotores apropiados. También pueden emplearse sistemas de traducción o translación libres de células para producir tales proteínas usando ARN derivados de los constructos de ADN de la presente invención. Los vectores de clonación y expresión apropiados para usarse con huéspedes procarióticos y eucarióticos son descritos por Sambrook, et al., Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio, Segunda Edición, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), la descripción del cual se incorpora aquí como referencia.

La transcripción del ADN que codifica para los polipéptidos de la presente invención por eucariotes superiores se incrementa insertando una secuencia amplificadora en el vector. Los amplificadores son elementos de ADN de acción cis, de manera usual de aproximadamente 10 a 300 pb que actúan sobre un promotor para incrementar su transcripción. Los ejemplos incluyen el amplificador SV40 sobre el lado tardío del origen de duplicación de 100 a 270 pb, un amplificador del promotor temprano de citomegalovirus, el amplificador de polioma del lado tardío del origen de duplicación, y los amplificadores de adenovirus. De manera general, los vectores de expresión recombinantes incluirán los orígenes de duplicación y marcadores seleccionables que permiten la transformación de la célula huésped, por ejemplo, el gen de la resistencia a la ampicilina de E . coli y el gen TRPÍ de S. cerevisiae, y un promotor derivado de un gen altamente expresado para dirigir la transcripción de una secuencia estructural corriente abajo. Tales promotores pueden derivarse de los operones que codifican para enzimas glicolíticas tales como la 3-fosfoglicerato cinasa (PGK) , factor a, fosfatasa acida, o proteínas de choque térmico, entre otras. La secuencia estructural heteróloga se monta en la fase apropiada con las secuencias de inicio y terminación de la traducción o translación, y de manera preferible, una secuencia líder capaz de dirigir la secreción de la proteína traducida en el espacio periplásmico o el medio extracelular. De manera opcional, la secuencia heteróloga puede codificar para una proteína de fusión que incluye un péptido de identificación n-terminal que imparte las características deseadas, por ejemplo, estabilización o purificación simplificada del producto recombinante expresado. Los vectores de expresión útiles para uso bacteriano se construyeron insertando una secuencia de ADN estructural que codifica para una proteína deseada junto con las señales de iniciación y terminación de la traducción o traslación adecuadas en la fase de lectura operable con un promotor funcional. El vector comprenderá uno o más marcadores fenotípicos seleccionables y un origen de duplicación para asegurar el mantenimiento del vector y para, si es deseable, proporcionar amplificación dentro del huésped. Las células procarióticas adecuadas para la transformación incluyen E. Coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y varias especies dentro del género de Pseudomonas, Streptomyces, y Staphylococcus, aunque también pueden emplearse otras como materia de elección. Como un ejemplo representativo pero no limitante, los vectores de expresión útiles para uso bacteriano pueden comprender un marcador seleccionable y un origen bacteriano de duplicación derivado de plásmidos comercialmente disponibles que comprenden elementos genéticos del vector de clonación pBR322 bien conocido (ATCC 37017) . Tales vectores comerciales incluye, por ejemplo, el pKK2123-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y el GEMÍ (Promega Biotec, Madison, Wl, EUA) . Esas secciones del "esqueleto" del pBR322 se combinan con un promotor apropiado y la secuencia estructural a ser expresada. Después de la transformación de una cepa huésped adecuada y el crecimiento de la cepa huésped a una densidad celular apropiada, el promotor seleccionado se induce a través de los medios apropiados (por ejemplo, desplazamiento de la temperatura o inducción química) y las células se cultivan durante un periodo adicional. Las células se cosechan típicamente por centrifugación, se rompen por medios físicos o químicos, y el extracto crudo resultante se retiene para su purificación adicional. Las células microbianas empleadas en la expresión de proteínas pueden ser rotas por cualquier método conveniente, incluyendo ciclos de congelamiento-descongelamiento, sonicación, rompimiento mecánico, o el uso de agentes para lisar células, tales métodos son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. También pueden emplearse varios sistemas de cultivo de células de mamífero para expresar la proteína recombinante. Los ejemplos de sistemas de expresión de mamíferos incluyen las líneas COS-7 de fibroblastos de riñon de mono, descritas por Gluzman, Cell, 23:175 (1981), y otras líneas celulares capaces de expresar un vector compatible, por ejemplo, las líneas celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK. Los vectores de expresión de mamífero comprenderán un origen de duplicación, un promotor y amplificador adecuados, y también cualesquier sitios de unión ribosómica necesarios, un sitio de poliadenilación, sitios de empalme del donador y receptor, secuencias de terminación trasncripcional, y secuencias no transcritas flanqueantes 5' . Las secuencias de ADN derivadas del empalme del SV40, y los sitios de poliadenilación pueden usarse para proporcionar los elementos genéticos no transcritos requeridos. Los polipéptidos de la seroparaoxonasa pueden recuperarse y purificarse de cultivos de células recombinantes por métodos que incluyen el sulfato de amonio o precipitación con etanol, extracción acida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía sobre fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad, cromatografía con hidroxilapatita y cromatografía con lectina. Pueden usarse pasos para replegar la proteína, según sea necesario, para completar la configuración de la proteína madura. Finalmente, puede emplearse cromatografía líquida de alta resolución (CLAP) para los pasos de purificación finales. Los polipéptidos de la presente invención pueden ser un producto purificado de manera natural, o un producto de procedimientos sintéticos químicos, o producidos por técnicas recombinantes a partir de un huésped procariótico o eucariótico (por ejemplo, por células de bacterias, levaduras, plantas superiores, insectos y mamíferos en cultivo) . Dependiendo del huésped empleado en un' procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención pueden estar glicosilados o pueden no estar glicosilados. Los polipéptidos de la invención también pueden incluir un aminoácido residual metionina inicial. Los polipéptidos de la seroparaoxonasa de la presente invención pueden emplearse como antídoto para el envenenamiento con organofosfato, puesto que los inhibidores del oxon tóxico de la colinesterasa son hidrolizados por la seroparaoxonasa. Los polipéptidos de la seroparaoxonasa pueden emplearse para prevenir la muerte celular neuronal debida a tal envenenamiento tóxico. Si el envenenamiento con organofosfatos se deja sin tratar, el resultado será la muerte celular neuronal. Las secuencias de la presente invención también son valiosas para la identificación de cromosomas. La secuencia es dirigida específicamente a y puede hibridarse con un lugar particular sobre un cromosoma humano individual . Ese gen de la seroparaoxonasa se localiza cerca del gen de la fibrosis quística sobre el cromosoma 7. Además, existe una necesidad actual de identificar sitios particulares sobre el cromosoma. Pocos reactivos para marcar cromosomas basados en los datos de secuencia actuales (polimorfismos repetidos) están actualmente disponibles para efectuar la localización cromosómica. El trazado de mapas de ADN para cromosomas de acuerdo a la presente invención es un primer paso importante en la correlación de aquellas secuencias con los genes asociados con la enfermedad. Los polipéptidos de la presente invención pueden emplearse en combinación con un portador farmacéutico. Tales composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva del polipéptido, y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Tal portador incluye pero no se limita a solución salina, solución salina amortiguada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de las mismas. La formulación deberá ser conveniente para el modo de administración. La invención también proporciona un paquete o equipo farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la invención. Asociada con tales recipientes puede estar una nota en el formulario prescrito por una institución gubernamental que regule la manufactura, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, nota la cual refleja la aprobación por la agencia de la manufactura, uso o 5 venta para administración humana. Además, los polipéptidos de la presente invención pueden emplearse en conjunto con otros compuestos terapéuticos. Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse en una forma conveniente tal como por las rutas -.ü oral, tópica, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal o intradérmica. La seroparaoxonasa se administra en una cantidad que es efectiva para tratar y/o la profilaxis de la indicación específica. En general, la seroparaoxonasa será administrada en una cantidad de al menos 10 µg/kg de peso corporal y en la mayoría de los casos se administrará en una cantidad que no exceda de aproximadamente 8 mg/kg de peso corporal por día. En muchos casos, la dosis es de aproximadamente 10 µg/kg hasta aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal diariamente, tomando en cuenta las rutas de 0 administración, síntomas, etc. Los polipéptidos también pueden emplearse de acuerdo con la presente invención por la expresión de tales polipéptidos in vivo, lo cual con frecuencia se conoce como "terapia genética".

De este modo, por ejemplo, las células de un paciente pueden ser diseñadas con un polinucleótido (ADN o ARN) que codifica para un polipéptido ex vi vo, con las células diseñadas siendo proporcionadas entonces a un paciente a ser tratado con el polipéptido. Tales métodos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, las células pueden ser diseñadas por los procedimientos conocidos en la técnica mediante el uso de una partícula retroviral que contenga el ARN que codifica para un polipéptido de la presente invención. De manera similar, pueden diseñarse células in vivo para la expresión de un polipéptido in vivo por, por ejemplo, los procedimientos conocidos en la técnica. Como es sabido en la técnica, una célula productora para producir una partícula retroviral que contenga el ARN que codifica para el polipéptido de la presente invención puede administrarse a un paciente para diseñar células in vivo y la expresión del polipéptido in vivo . Esos y otros métodos de administración de un polipéptido' de la presente invención por tales métodos serán evidentes a aquellos expertos en la técnica a partir de las enseñanzas de la presente invención. Por ejemplo, el vehículo de expresión para diseñar células puede ser otro diferente a un retovirus, por ejemplo, un adenovirus el cual puede usarse para diseñar células in vivo después de la combinación con un vehículo de liberación adecuado.

Los retrovirus a partir de los cuales los vectores plasmídicos retrovirales mencionados aquí anteriormente pueden derivarse incluyen, pero no se limitan al Virus de la Leucemia Murina de Moloney, virus de la necrosis del bazo, 5 retrovirus tales como el Virus del Sarcoma Rous, Virus del Sarcoma de Harvey, virus de la leucosis de las aves, virus de la leucemia del gibón, virus de la inmunodeficiencia humana, adenovirus, Virus del Sarcoma Mieloproliferativo, y virus del tumor de mama. En una modalidad, el vector plasmídico -- retroviral se deriva del Virus de la Leucemia Murina de Moloney. El vector incluye uno o más promotores. Los promotores adecuados que pueden emplearse, incluyen, pero no se limitan al LTR retroviral; el promotor del SV40; y el 5 promotor del citomegalovirus humano (CMV) descrito en Miller, et al., Biotechniques, Vol. 7, No. 9, 980-990 (1989), o cualquier otro promotor (por ejemplo, promotores celulares tales como los promotores celulares eucarióticos incluyendo, pero sin limitarse a la istona, pol III, y promotores de la 0 ß-actina) . Otros promotores virales que pueden emplearse e incluyen, pero no se limitan a los promotores de adenovirus, promotores de timidina cinasa (TK) , y promotores del parvovirus B19. La selección de un promotor adecuado será evidente a aquellos expertos en la técnica a partir de las 5 enseñanzas contenidas en la presente.

La secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido de la presente invención está bajo el control de un promotor adecuado. Los promotores adecuados que pueden ser empleados incluyen, pero no se limitan a, promotores adenovirales, tales como el promotor tardío principal adenoviral; o promotores heterólogos, tales como el promotor del citomegalovirus (CMV) ; el promotor del virus sincital respiratorio (RSV) ; promotores inducibles, tales como el promotor de MMT, el promotor de la metalotioneína; promotores del choque térmico; el promotor de la albúmina; el promotor de ApoAI; los promotores de la globina humana, promotores de la timidina cinasa viral, tales como el promotor de la timidina cinasa del Herpes Simple; LTR retrovirales (incluyendo los LTR retrovirales modificados descritos aquí anteriormente) ; el promotor de la ß-actina; y promotores de la hormona del crecimiento humana. El promotor también puede ser el promotor nativo que controla al gen que codifica para el polipéptido. El vector plasmídico retroviral se emplea para transducir líneas celulares de empaque para formar líneas celulares productoras. Los ejemplos de células de empaque que pueden ser transfectadas incluyen pero no se limitan a, las líneas celulares PE501, pA317, ?-2 , ?-MA, PA12, T19-14X, VT- 19-17-H2, yCRE, yCRIP, GP+E-86, GP+envAml2, y líneas celulares DAN como se describen en Miller, Human Gene Therapy, Vol. 1, pgs . 5-14 (1990), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad. El vector puede transducir las células de empaque a través de cualesquier medios conocidos en la técnica. Tales medios incluyen, pero no se 5 limitan a, la electroporación, el uso de liposomas, y la precipitación con CaP04. En una alternativa, el vector plasmídico retroviral puede ser encapsulado en un liposoma, o acoplado a un lípido, y a continuación administrado a un huésped. ¿ La línea celular productora genera partículas de vector retroviral infecciosas, las cuales incluyen la . secuencia de ácido nucleico que codifica para los polipéptidos. Tales partículas de vector retroviral pueden emplearse entonces, para transducir células eucarióticas, ya sea in vi tro o in vivo . Las células eucarióticas transducidas expresarán las secuencias de ácido nucleico que codifican par el polipéptido. Las células eucarióticas que pueden ser transducidas incluyen, pero no se limitan, a células embriónicas no diferenciadas, células de carcinoma 0 embriónico, así como células no diferenciadas hematopoyéticas, hepatocitos, fibroblastos, mioblastos, queratinocitos, células endoteliales, y células epiteliales bronquiales . Esta invención también se relaciona con el uso del 5 gen de la presente invención para diagnóstico. La detección de una forma mutante del gen permitirá un diagnóstico de una enfermedad o una susceptibilidad a una enfermedad que resulte de la baja expresión de la seroparaoxonasa. Los individuos que contienen mutaciones en el gen de la presente invención pueden ser detectados a nivel del ADN por medio de una variedad de técnicas. Los ácidos nucleicos para el diagnóstico pueden obtenerse de las células de un paciente, incluyendo pero sin limitarse a la sangre, orina, saliva, biopsia tisular y material de autopsia. El ADN genómico puede usarse directamente para la detección o puede amplificarse enzimáticamente usando la PCR (Saiki et al., Nature, 324:163-166 (1986)) antes del análisis. El ARN o ADNc también puede usarse para el mismo propósito. Como ejemplo, pueden usarse los cebadores de la PCR complementarios al ácido nucleico que codifica para la seroparaoxonasa para identificar y analizar mutaciones. Por ejemplo, las supresiones e inserciones pueden detectarse por un cambio en el tamaño del producto amplificado en comparación con el genotipo normal. Las mutaciones puntuales pueden identificarse hibridando el ADN amplificado al ARN marcado radioactivamente o de manera alternativa, las secuencias de ADN antisentido marcadas radioactivamente. Las secuencias perfectamente apareadas pueden distinguirse de los dúplex no apareados por la digestión con ARNasa A ° por diferencias en las temperaturas de fusión.

Las diferencias de secuencia entre el gen de referencia y los genes que tienen mutaciones pueden ser reveladas por el método de secuenciamiento de ADN directo. Además, los segmentos de ADN clonados pueden ser empleados 5 como sondas para detectar segmentos de ADN específicos. La sensibilidad de este método se amplifica de manera general cuando se combina con la PCR. Por ejemplo, se usa un cebador de secuenciamiento con un producto de la PCR de doble hebra o una molécula patrón de una sola hebra generada por una PCR --j modificada. La determinación de la secuencia se efectúa por los procedimientos convencionales con nucleótidos marcados radioactivamente o por medio de procedimientos de secuenciamiento automáticos con marcas fluorescentes. La prueba genética basada en las diferencias de la secuencia de ADN puede lograrse mediante la detección de la alteración en la movilidad electroforética de los fragmentos _ de ADN en geles con o sin agentes desnaturalizantes. Las supresiones e inserciones de secuencia pequeñas pueden visualizarse por electroforesis sobre gel de alta resolución.

Los fragmentos de ADN de diferentes secuencias pueden distinguirse sobre geles en gradiente de formamida desnaturalizantes en los cuales las movilidades de los diferentes fragmentos de ADN se retardan en el gel en diferentes posiciones de acuerdo a sus temperaturas de fusión o fusión parcial específicas (véase, por ejemplo, Myers et al., Science, 230:1242 (1985)). Los cambios de secuencia en lugares específicos también pueden ser revelados por los ensayos de protección de nucleasa, tal como la ARNasa y la protección de Sl o el método de escisión química (por ejemplo, Cotton et al., PNAS, EUA, 85:4397-4401 (1985)). De este modo, la detección de una secuencia de ADN específica puede lograrse por métodos tales como la hibridación, protección con ARNasa, escisión química, secuenciamiento de ADN directo o el uso de enzimas de restricción, (por ejemplo, polimorfismos de la Longitud del Fragmento de Restricción (RFLP) ) y manchado Southern del ADN genómico. Además de la electroforesis sobre gel y el secuenciamiento de ADN más convencionales, las mutaciones también pueden detectarse por análisis in si tu . La presente invención también se relaciona con un ensayo de diagnóstico para detectar niveles alterados del polipéptido de la presente invención en varios tejidos, puesto que una sobre expresión de las proteínas comparada con las muestras de tejido control no puede detectar la presencia de seroparaoxonasa. Los ensayos usados para detectar los niveles de polipéptido de la presente invención en una muestra derivada de un huésped son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica e incluyen los radioinmunoensayos, ensayos de unión competitiva, análisis de Manchas Western y preferiblemente un ensayo de ELISA. Un ensayo de ELISA comprende inicialmente preparar un anticuerpo 5 específico para el antígeno de la seroparaoxonasa, preferiblemente un anticuerpo monoclonal. Además se preparó un anticuerpo reportero contra el anticuerpo monoclonal. Para que el anticuerpo reportero se una a un reactivo detectable tal como la radioactividad, fluorescencia o en este ejemplo -_ una enzima peroxidasa de rábano. Ahora se remueve una muestra de un huésped y se incuba sobre un soporte sólido, por ejemplo un disco de poliestireno, que une las proteínas en la muestra. Cualesquier sitios de unión de proteína libres sobre el disco se cubren a continuación incubando con una proteína no específica tal como la seroalbúmina bovina. A continuación, el anticuerpo monoclonal se incuba en el disco, tiempo durante el cual los anticuerpos monoclonales unidos a cualquiera de los polipéptidos de la presente invención se unen al disco de poliestireno. Todo el anticuerpo monoclonal no unido se lava con amortiguador. El anticuerpo reportero unido a la peroxidasa de rábano se coloca ahora en el disco dando como resultado la unión del anticuerpo reportero a cualquier anticuerpo monoclonal unido al polipéptido de la presente invención. El anticuerpo reportero no unido se lava entonces. Los sustratos de la peroxidasa se adicionan entonces al disco y la cantidad de color desarrollado en un periodo de tiempo dado es una medición de la cantidad del polipéptido de la presente invención presente en un volumen dado de muestra de paciente cuando se compara contra una curva estándar. Puede emplearse un ensayo de competencia en donde los anticuerpos específicos para el polipéptido de la presente invención están unidos a un soporte sólido y la seroparaoxonasa marcada y la muestra derivada del huésped se hacen pasar sobre el soporte sólido y la cantidad de marca detectada unida al soporte sólido puede correlacionarse con una cantidad de polipéptido de la presente invención en la muestra. Esta invención también proporciona un método para seleccionar fármacos para identificar a aquellos que aumentan (agonistas) la interacción de la seroparaoxonasa con su sustrato, el cual comprende, por ejemplo, poner en contacto una célula de mamífero que comprende una molécula de ADN que codifica para la seroparaoxonasa con una pluralidad de fármacos y parathion o chlopyrifos y detectar aquellos fármacos que aumentan la hidrólisis de los oxones tóxicos por la seroparaoxonasa y por lo tanto identificar los fármacos que actúan específicamente como agonistas. Pueden emplearse varios métodos de detección. Los oxones tóxicos pueden ser "marcados" por asociación con una sustancia marcadora detectable (por ejemplo, marcada radioactivamente o marcada no isotópicamente, tal como la biotina) de modo que su hidrólisis puede ser medida. Los fármacos candidatos se identifican eligiendo los . compuestos químicos que se unen con alta afinidad al polipéptido de seroparaoxonasa expresado en las células transfectadas, usando los métodos de unión de radioligando bien conocidos en la técnica. Las secuencias de la presente invención también son valiosas para la identificación de cromosomas. La secuencia está específicamente dirigida a y puede hibridarse con un lugar particular sobre un cromosoma humano individual. Además, existe la necesidad actual de identificar sitios particulares sobre los cromosomas. Pocos reactivos para marcar cromosomas basados en los datos de la secuencia actual (polimorfismo repetido) están actualmente disponibles para marcar la localización cromosómica. El trazado de mapas de los ADN de cromosomas de acuerdo a la presente invención es un primer paso importante para correlacionar aquellas secuencias con los genes asociados con enfermedades. De manera breve, el trazarse las secuencias de los cromosomas preparando cebadores de PCR (preferiblemente de 15-25 pb) a partir del ADNc. El análisis por computadora de la región no traducida o no trasladada 3' del gen se usó para seleccionar rápidamente los cebadores que no abarcan más de un exon en el ADN genómico, complicando de este modo el proceso de amplificación. Esos cebadores se usaron a continuación para la PCR para seleccionar los híbridos de células somáticas que contienen cromosomas humanos individuales. Únicamente aquellos híbridos que contienen el gen humano que corresponden al cebador producirán un fragmento amplificado. El trazado por PCR de los híbridos de células somáticas es un procedimiento rápido para evaluar un ADN particular para un cromosoma particular. Usando la presente invención con los mismos cebadores oligonucleotídicos, puede lograrse la subclonación con paneles de fragmentos de cromosomas específicos o conjuntos de clonas genómicas grandes en una forma análoga. Otras estrategias de trazado que pueden usarse de manera similar para trazar cromosomas incluyen la hibridación in si tu, preselección con cromosomas clasificados por marca y la preselección por hibridación para construir bibliotecas de ADNc específicas del cromosoma. La hibridación in si tu con fluorescencia (FISH) de una clona de ADNc a una metafase cromosómica difundida puede usarse para proporcionar una localización cromosómica precisa en un paso. Esta técnica puede usarse con un ADNc que tenga al menos 50 ó 60 bases. Para una revisión de esta técnica, véase Verma et al., Cromosomas Humanos: Un Manual de Técnicas Básicas, Pergamon Press, New York (1988) .

Una vez que ha sido trazada una secuencia para una localización cromosómica precisa, la posición física de la secuencia sobre el cromosoma puede correlacionarse con lo datos del mapa genético. Tales datos se encuentran, por ejemplo, en V. McKusick, Herencia Mendeliana en el Hombre (disponible en línea a través de la Biblioteca Médica Welch de la Universidad John Hopkins) . La relación entre los genes y las enfermedades que han sido trazadas en la misma región cromosómica se identifican entonces a través del análisis de ligación (coherencia de genes físicamente adyacentes) . A continuación, es necesario determinar las diferencias en las secuencias del ADNc o genómico entre los individuos afectados y no afectados. Si se observa una mutación en algunos o todos los individuos afectados pero no en ningún individuo normal, entonces la mutación es probablemente el agente causante de la enfermedad. Con la resolución actual las técnicas de trazado físico y trazado genético, un ADNc localizado precisamente en una región cromosómica asociada con la enfermedad podría ser de entre 50 y 500 genes potencialmente causales. (Esto supone una resolución del trazado de 1 megabase y un gen por cada 20 kb) . Los polipéptidos, sus fragmentos u otros derivados, o análogos de los mismos, o células que los expresan pueden usarse como inmunógeno para producir anticuerpos contra estos. Esos anticuerpos pueden ser, por ejemplo, anticuerpos policlonales o monoclonales. La presente invención también incluye anticuerpos quiméricos, de una sola cadena y anticuerpos humanizados, así como fragmentos Fab, o el producto de una biblioteca de expresión de Fab. Pueden usarse varios procedimientos conocidos en la técnica para la producción de tales anticuerpos y fragmentos. Los anticuerpos generados contra los polipéptidos que corresponden a una secuencia de la presente invención pueden obtenerse por inyección directa de" los polipéptidos en un animal o mediante la administración de los polipéptidos a un animal, preferiblemente no humano. El anticuerpo así obtenido se unirá entonces a los polipéptidos por sí mismo. De esta manera, puede usarse aún una secuencia que codifica únicamente para un fragmento de los polipéptidos para generar anticuerpos que se unen a los polipéptidos nativos completos. Tales anticuerpos pueden usarse entonces para aislar el polipéptido del tejido que expresa ese polipéptido. Para la preparación de anticuerpos monoclonales, puede usarse cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos por cultivos de líneas celulares continuos. Los ejemplos incluyen la técnica del hibridoma (Kohier y Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), la técnica del trioma, la técnica del hibridoma de las células B humanas (Kozbor et al., 1983, Inmunology Today 4:72), y la técnica del hibridoma de EBV para producir anticuerpos monoclonales (Colé, et al., 1985, en Anticuerpos Monoclonales y Terapia del Cáncer, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). Las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de una sola cadena (Patente Norteamericana 4,946,778) pueden adaptarse para producir anticuerpos de una sola cadena para los productos polipeptícos inmunogénicos de esta invención. También, pueden usarse ratones transgénicos para expresar anticuerpos humanizados contra los productos polipeptídicos inmunogénicos de esta invención. La presente invención será descrita mejor con - referencia a las siguientes ejemplos; sin embargo, deberá comprenderse que la presente invención no está limitada a tales ejemplos. Todas las partes o cantidades, a menos que se especifique otra cosa, están en peso. Para facilitar la comprensión de los siguientes ejemplos se describirán ciertos métodos y/o términos que aparecen con frecuencia. Los "plásmidos" se designaron por una letra minúscula p precedida y/o seguida por letras mayúsculas y/o números. Los plásmidos de inicio aquí están, ya sea, comercialmente disponibles, públicamente disponibles sobre una base no restringida, o pueden ser construidos a partir de plásmidos disponibles de acuerdo con los procedimientos publicados. Además, los plásmidos equivalentes a aquellos descritos se conocen en la técnica y serán evidentes a los expertos en la técnica. En la "digestión" del ADN se refiere a la escisión catalítica del ADN con una enzima de restricción que actúa 5 únicamente en ciertas secuencias en el ADN. Las diferentes enzimas de restricción usadas aquí se encuentran comercialmente disponibles y sus condiciones de reacción, cofactores y otros requerimientos se usaron como podría saberlo un experto en la técnica. Para propósitos analíticos, --.d típicamente se usó 1 µg de plásmido o fragmento de ADN con aproximadamente 2 unidades de enzima en aproximadamente 20 µl de solución amortiguadora. Para el , propósito de aislar fragmentos de ADN para la construcción del plásmido, típicamente se digirieron de 5 a 50 µg de ADN con 20 a 250 unidades de enzima en un volumen más grande. Las cantidades apropiadas de amortiguadores y sustrato para las enzimas de restricción particulares fueron especificadas por el fabricante. De manera ordinaria se usaron tiempos de incubación de aproximadamente 1 hora a 37°C, pero pueden variar de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Después de la digestión la reacción se electroporó directamente sobre un gel de poliacrilamida o agarosa para aislar el fragmento deseado. La preparación por tamaño de los fragmentos 5 escindidos se efectuó usando 8 por ciento del gel de poliacrilamida descrito por Goeddel, D..et al., Nucleic Acids " Res., 8:4057 (1980) . "Oligonucleótidos" se refieren ya sea a un polidesoxinucleótido de una sola hebra o dos hebras de 5 polidesoxinucleótido complementarias, los cuales pueden ser sintetizados químicamente. Tales oligonucleótidos sintéticos no tienen fosfato 5' y de este modo no se ligarán a otro oligonucleótido sin agregar un fosfato con un ATP en presencia de una cinasa. Un oligonucleótido sintético se ""* ligará a un fragmento que no ha sido desfosforilado. La "ligación" se refiere al proceso de formar enlaces fosfodiéster entre dos fragmentos de ácido nucleico de doble hebra (Maniatis, T., et al., Id., p. 146). A menos que se establezca otra cosa, la ligación puede efectuarse 5 usando los amortiguadores y condiciones conocidas con 10 unidades a la ADN ligasa T4 ("ligasa") por 0.5 µg de cantidades aproximadamente equimolares de los fragmentos de ADN a ser ligados. A menos que se establezca otra cosa, las 0 transformación se efectuó como se describe en el método de Graham, F. y Van der Eb, A., Virology, 52:456-457 (1973).

Ejemplo 1 Expresión Bacteriana y Purificación de la Seroparaoxonasa La secuencia de ADN que codifica para la seroparaoxonasa, ATCC # 75773, se amplificó inicialmente usando cebadores oligonucleotídicos de PCR correspondientes al 5' y las secuencias de la proteína seroparaoxonasa procesada (menos la secuencia peptídica de señal) y las secuencias del vector 3' al gen de la seroparaoxonasa. Los nucleótidos adicionales correspondientes a la seroparaoxonasa se adicionaron a las secuencias 5' y 3' respectivamente. El cebador oligonucleotídico 5' tiene la secuencia 5' TCAGGATCCAGAAATCGACTTAAAGCCTCC 3' (SEQ ID NO: 3) que contiene un sitio de enzima de restricción de Bam Hl seguido por 21 nucleótidos de la secuencia purificadora de la seroparaoxonasa comenzando desde el aminoácido terminal presumido del codón proteico procesado. La secuencia 3' 5' TCAAAGCTTTTAGAGTTCACAATACAAGGC 3' (SEQ ID NO: 4) contiene secuencias complementarias a un sitio de restricción Hind III y está seguida por 21 nucleótidos de seroparaoxonasa. Los sitios de la enzima de restricción corresponden a los sitios de la enzima de restricción sobre el vector de expresión bacteriana pQE-9 (Qiagen, Inc. 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311) . El pQE-9 codifica para la resistencia a antibióticos (Amp' ) , un origen bacteriano de duplicación (ori), un operador del promotor regulable por IPTG (P/0) , un sitio de unión ribosómica (RBS) , una marca 6-His y sitios de enzimas de restricción. El pQE-9 se digirió entonces con Bam Hl y Hind III. Las secuencias amplificadas se ligaron al pQE-9 y se insertaron en el marco con la secuencia que codifica para la marca de histidina y el RBS. La mezcla de ligación se usó entonces para transformar la cepa de E. coli SURE (disponible de Stratagene Cloning Systems, 11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037) por el procedimiento descrito en Sambrook, J. et al., Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio, Cold Spring Laboratory Press, (1989) . Los transformantes se identificaron por su capacidad para crecer sobre placas LB y se seleccionaron las colonias resistentes a la ampicilina/canamicina. El ADN del plásmido se aisló y confirmó por análisis de restricción. Las clonas que contenían los constructos deseados se hicieron crecer durante la noche (O/N) en cultivo líquido y medio LB suplementado tanto con Amp (100 ug/ml) como con Kan (25 ug/ l) . El cultivo O/N se usó para inocular un cultivo mayor a una relación de 1:100 a 1:250. Las células se hicieron crecer hasta una densidad óptica de 600 (O.D.600) de entre 0.4 y 0.6. Se adicionó entonces IPTG ("Isopropil-B-D-tiogalacto piranósido") a una concentración final de 1 mM. El IPTG induce por inactivación al represor lacl, limpiando el P/O que conduce a la expresión genética incrementada. Las células se hicieron crecer de 3 a 4 horas extra. Las células se cosecharon entonces por centrifugación. La masa celular se solubilizó en el agente caotrópico 6 Molar Guanidina HCl. 5 Después de la clarificación, la seroparaoxonasa solubilizada se purificó de esta solución por cromatografía sobre una columna de Níquel-Quelato bajo condiciones que permitieron una fuerte unión por las proteínas que contienen la marcas 6-His. Hochuli, E. et al., J. Chromatography 411:177-184 J. J (1984) . La seroparaoxonasa se eluyó de la columna en guanidina HCl 6 molar pH 5.0 y con el propósito de la - renaturalizacíón se ajustó a guanidina HCl 3 molar, fosfato de sodio lOOmM, glutatión (reducido) 10 m olar y glutatión (oxidado) 2 mmolar. Después de la incubación en esta solución durante 12 horas la proteína se dializó a fosfato de sodio 10 mmolar.

Ejemplo 2 20 Expresión de la Seroparaoxonasa Recombinante en células CHO La expresión del plásmido, HA de seroparaoxonasa se derivó de un vector pcDNAI/Ap (Invitrogen) que contiene: 1) 25 el origen de duplicación del SV40, 2) el gen de resistencia a la ampicilina, 3) el origen de duplicación de E. coli, 4) el promotor de CMV seguido por una región de polienlazante, un intrón de SV40 y un sitio de poliadenilación. El fragmento de ADN que codifica para todo el precursor de la seroparaoxonasa y una marca HA fusionados en el marco a su extremo 3' se clonaron en la región polienlazante del vector, por lo tanto, la expresión de la proteína recombinante se dirigió bajo el promotor de CMV. La marca HA corresponde a un epitopo derivado de la proteína hemaglutinina de la influenza como se describió anteriormente (I. Wilson, H. Niman, R. Heighten, A Cherenson, M. Connolly, y R. Lerner, 1984, Cell 37, 767) . La infusión de la marca HA a nuestra proteína objetivo permite la fácil detección de la proteína recombinante con un anticuerpo que reconoce el epitopo HA. La estrategia de construcción del plásmido se describe como sigue: La secuencia de ADN que codifica para la seroparaoxonasa, ATCC # 75773, se construyó usando dos cebadores de PCR: el cebador 5' CGCGGGATCCACCATGGGGGCGGCTGGTGGCTCT 3' (SEQ ID NO: 5) que contiene un sitio de restricción Bam Hl seguido por 21 nucleótidos de la secuencia codificadora de la seroparaoxonasa comenzando desde el codón de inicio; la secuencia 3' 5' CGCGTCTAGACGGTTAGAGTTCACAATACAAGGC 3' (SEQ ID NO: 6) que contiene secuencias complementarias a un sitio Xba I y un codón de fin o alto de la traducción y los últimos 18 nucleótidos de secuencia codificadora de la seroparaoxonasa (sin incluir el codón de alto) . Por lo tanto, el producto de la PCR contiene un sitio de Bam Hl, la secuencia codificadora de la seroparaoxonasa, un codón de alto de terminación de la traducción y un sitio Xba I. El fragmento de ADN amplificado por PCR y el vector-, pcDNAI/Ap, se digirieron con enzima de restricción Bam Hl y Xba I y se ligaron. La mezcla de ligación se transformó en la cepa de E. coli SURE (disponible de Stratagene Cloning Systems, 11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037) el cultivo transformado se cultivó en placa sobre placas de medio con ampicilina y se seleccionaron las colonias resistentes. El ADN del plásmido se aisló de los transformantes y se examinó por análisis de restricción para detectar la presencia del fragmento correcto. Para la expresión de la seroparaoxonasa recombinante, las células CHO se transfectaron con el vector de expresión por el método de DEAE-DEXTRAN. (J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio, Cold Spring Laboratory Press, (1989)). La expresión de la proteína seroparaoxonasa HA se detectó por el método de marcado radioactivo e inmunoprecipitación. (E. Harlow, D. Lañe, Anticuerpos: Un Manual de Laboratorio, Cold Spring Laboratory Press, (1988)). Las células se marcaron durante 8 horas con 35S-cisteína dos días después de la transfección. El medio de cultivo se recolectó entonces y las células se Usaron con detergente (amortiguador RIPA (NaCl 150 mM, 1% de NP-40, 0.1% de SDS, 1% de NP-40, 0.5% de DOC, Tris 50mM, pH 7.5). (Wilson, I. et al., Id. 37:767 (1984)). Tanto el lisado celular como el medio de cultivo se precipitaron con un anticuerpo monoclonal específico para HA. Las proteínas precipitadas se analizaron sobre geles de SDS-PAGE al 15%.

Ejemplo 3 Patrón de expresión de la seroparaoxonasa en tejidos humanos Se llevó a cabo el análisis de manchas Northern para examinar los niveles de expresión de la seroparaoxonasa en tejidos humanos. Se aislaron muestras de ARN celular total con el sistema RNAzolMR B (Biotecx Laboratories, Inc. 6023 South Loop East, Houstn, TX 77033) . Aproximadamente lOµg del ARN total aislado de cada tejido humano especificado se separaron sobre gel de agarosa al 1% y se mancharon sobre un filtro de nylon. (Sambrook, Fritsch, y Maniatis, Clonación Molecular, Cold Spring Laboratory Press, (1989) ) . La reacción de marcado se efectuó de acuerdo al equipo Prime-It de Stratagene con un fragmento de ADN de 50ng. El ADN marcado se -aurificó con una columna Select-G-50. (5 prima - 3 prima, Inc. 5603 Arapahoe Road, Boulder, CO 80303) . El filtro se híbrido entonces con el gen de la seroparaoxonasa de longitud completa marcado radioactivamente a 1,000,000 de cpm/ml en NaP04 0.5 M, pH 7.4 y SDS al 7% durante la noche a 65°C. Después de lavar dos veces a temperatura ambiente y dos veces a 60°C con 0.5 x SSC, SDS al 0.1%, el filtro se expuso entonces a -70°C durante la noche con pantalla intensificadora.

Ejemplo 4 Expresión vía la Terapia Genética Se obtuvieron los fibroblastos de un sujeto por biopsia cutánea. El tejido resultante se colocó en medio de cultivo tisular y se separó en piezas pequeñas. Los trozos pequeños de tejido se colocaron sobre una superficie húmeda de un matraz de cultivo tisular, se colocaron aproximadamente diez piezas en cada matraz. El matraz se invirtió, se cerró herméticamente y se dejó a temperatura ambiente durante la noche. 24 horas después a temperatura ambiente, el matraz se invirtió y los trozos de tejido permanecieron fijos al fondo del matraz y se adicionó medio fresco (por ejemplo, medio F12 de Ham, con 10% de FBS, penicilina y estreptomicina) . Esto se ' incubó entonces a 37°C durante aproximadamente una semana. En ese momento, se adicionó medio fresco y posteriormente se cambió varios días. Después de dos semanas adicionales en cultivo, emergió una monocapa de fibroblastos. La monocapa se tripsinizó y desprendió en matraces más grandes. El pMV-7 (Kirsch eier, P. T. et al, ADN, 7:219-25 (1988)) flanqueado por las repeticiones terminales largas del virus del sarcoma murino de Moloney, se digirió con EcoRI y HindIII y posteriormente se trató con fosfatasa intestinal de carnero. El vector lineal se fraccionó sobre gel de agarosa y se purificó, usando perlas de vidrio. Al ADNc que codifica para un polipéptido de la presente invención se amplificó usando cebadores de PCR que corresponden a las secuencias 5' y 3', respectivamente. El cebador 5' contiene un sitio EcoRI y el cebador 3' incluye además un sitio HindIII. Se agregaron juntas iguales cantidades del esqueleto lineal del virus del sarcoma murino de Moloney y el fragmento EcoRI e HinlII amplificado, el presencia de ADN ligasa T4. La mezcla resultante se mantuvo bajo condiciones apropiadas para la ligación de los dos fragmentos. La mezcla de ligación se usó para transformar las bacterias HB101, las cuales se cultivaron en placa entonces sobre un agar que contenía canamicina con el propósito de , confirmar que el vector tenía el gen de interés apropiadamente insertado. El pA317 amfotrópico o las células de empaque GP+aml2 se hicieron crecer en cultivo tisular hasta una densidad confluente en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) con 10% de suero de carnero (CS) , penicilina y estreptomicina. El vector de MSV que contenía el gen se agregó entonces al medio y las células de empaque se transdujeron con el vector. Las células de empaque ahora producen partículas virales infecciosas que contienen el gen (las células de empaque ahora se llaman células productoras) . Se agregó medio fresco a las células productoras transducidas, y posteriormente, el medio se cosechó de una placa de 10 cm de células productoras confluentes. El medio usado, que contenía las partículas virales infecciosas se filtró, a través de un filtro de millipore para remover las células productores desprendidas y este medio se usó entonces para infectar células de fibroblasto. El medio se removió de una placa subconfluente de fibroblastos y se reemplazó rápidamente con el medio de las células productoras. El medio se removió y reemplazó con medio fresco. Si el título del virus es alto, entonces virtualmente todos los fibroblastos estarán infectados y no se requiere selección. Si el título es muy bajo, entonces será necesario usar un vector retroviral que tenga el marcador seleccionable, tal como neo o his . Los fibroblastos diseñados se inyectaron entonces al huésped, ya sea solos o después de haber sido crecidos hasta la confluencia sobre perlas microportadoras de cytodex 3. Los fibroblastos ahora producen el producto proteico. Son posibles numerosas modificaciones y variaciones de la presente invención a la luz de las enseñanzas anteriores y, por lo tanto, dentro del alcance de la reivindicaciones anexas, la invención puede ser practicada en otra forma a la particularmente descrita.

LISTADO DE SECUENCIA (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: HUDSON, ET AL. (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: Seroparaoxonasa (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 6 (iv) DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO: CARELLA, BYRNE, BAIN, GILFILLAN, CECCHI, STEWART & OLSTEIN (B) CALLE: 6 BECKER FARM ROAD (C) CIUDAD: ROSELAND (D) ESTADO: NEW JERSEY (E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL: 07068 (v) FORMA LEGIBLE EN COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: DISCO DE 3.5 PULGADAS (B) COMPUTADORA: IBM PS/2 (C) SISTEMA OPERATIVO: MS-DOS (D) PROGRAMA: WORD PERFECT 5.1 (vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL: (A) NUMERO DE SOLICITUD: (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: CONCURRENTE (C) CLASIFICACIÓN: (vii) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR (A) NUMERO DE SOLICITUD: 08/270,583 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 5 DE JULIO DE 1994 (viii) INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE (A) NOMBRE: FERRARO, GREGORY D. (B) NUMERO DE REGISTRO: 36,134 (C) NUMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 325800- (ix) INFORMACIÓN POR TELECOMUNICACIÓN: (A) TELEFONO: 201-994-1700 (B) TELEFAX: 201-994-1744 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:l (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD: 1079 PARES DE BASES (B) TIPO: ACIDO NUCLEICO (C) HEBRA: SENCILLA (D) TOPOLOGÍA: LINEAL ( ii ) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc ( Xl ) DESCRI PCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : l CCCATGGGGC GsCTGOTGGC TsTGGGCTTG CTGO WATCO CCCTGGCCCT CCT--GGCGAG 60 AGGCTTCTGG CACtCAGAAA T GACTTAAA GCCTCCAGAG AAflTAGAATC TGTA---ACCT-. 120 CCACACTGCC ACCTGATTAA AGGAATTGAA GCTsGCTeTs AAGATATTGA CATACTTCCC 180 AATGGTCTGG CT-T- TAAO TaTOGOTCTA AAATrCCCAG GACTCCACAG C?TCCACCA 240 GATAAGCCTG GAßGTATACT AATGATQGTT CTAAAAGAAO CAAAACCAAG GGGACGGGAA 300 TTAAGAATCA GTC -tGGGTT TGArrTGGCC TCATTCAATC CACATOOGAT CAGCACTTTC 360 ATAGACAACG ATGACACAGT TTATCTCTTG GTTGTAAACC ACCCAGAATT CAAGAATACA 420 GTGGAAATTT TTAATTTOGA AOAAGCAGAA AATTCTCTGT TGCATCTGAA AACAGTCAAA 4 T0 CATCAGCTTC TTCCAAGtsT GAATQACATC ACAOCWITG GACCGaCACA T-TCTATGCC 540 ACAAATGACC ACTACTTCTC TGATCCTTTC TTAAAGTATT TA-3AAACATA CrTGGAATTA 600 CACTGGGCAA ATGTTGTTTA CTACAGGCCA AATGAAGTTA AAGGT- 7TAG CAGGAAGGAT 660 TTGGATTCAG CAAATGGGAT CAATATTTCA CCTGGATOGA TAAGT?TTC TATGTTGGCT 720 GACATATTGG CTCATGAAAT TCATGTTTGG GGAAAACACA CTAATATGAA TTTAACTCAG 780 tTGAAGGTAC TGGACCTGGA TACACTGGtG GATAATTTAT CTA-rTC-ATCC •-TCCTC--GGG 840 GACATCTGGG TAGscrstcA TCCGAATGGC CAGAAGCTCG tcststAt--A CCCGAACAAT 900 CCTCCCTC-TT CAGAGGTTCT CCGCATCCAG AACATTCTAT CTGAGAAGCC tACAGTGACT 960 ACAGT-TATG CCAACAATGG GTCtaTT tC CAAGGAAGTT CTGTAGGC C AGTstATGAT 1020 GGGAAGCtsC TCATAGGCAC TTTATACC-AC AGAGCCTTGT ATTGtGAACT CTAAATTGT 1079 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD: 356 AMINO CIDOS ( B ) TIPO : AMINOÁCIDO ( C ) HEBRA: ( D) TOPOLOGÍA: LINEAL (ii) TIPO DE MOLÉCULA: PROTEINA (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2 Met Gly Arg Leu Val Ala Val Gly Leu Leu Gly He Ala Leu Ala 5 10 15 Leu Leu Gly Glu Arg Leu Leu Ala Leu Arg Aßn Arg Leu Lys Ala 20 25 30 Ser Arg Glu Val Glu Ser Val Asp Leu Pro His Cys His Leu He 35 40 45 Lys Gly He Glu Ala Gly Ser Glu Aßp He Aßp He Leu Pro Asn 50 55 60 Gly Leu Ala Phe Leu Ser Val Gly Leu Lyß Phe Pro Gly Leu Hiß 65 70 75 Ser Phe Ala Pro Aßp Lys Pro Gly Gly He Leu Met Met Val Leu 80 85 90 Lys Glu Ala Lys Pro Arg Gly Arg Glu Leu Arg He Ser Arg Gly 95 100 105 Phe Aßp Leu Ala Ser Phe Asn Pro His Gly He Ser Thr Phe He 110 115 120 Aßp Aßn Aßp Aßp Thr Val Tyr Leu Leu Val Val Asn His Pro Glu 125 130 135 Phe Lys Asn Thr Val Glu He Phe Aßn Leu Glu Glu Ala Glu Aßn 140 145 150 Ser Leu Leu His Leu Lys Thr val Lys Hiß Glu Leu Leu Pro Ser 155 160 165 Val Asn Asp He Thr Ala Val Gly Pro Ala His Phe Tyr Ala Thr 170 175 180 Asn Asp His Tyr Phe Ser Asp Pro Phe Leu Lys Tyr Leu Glu Thr 185 190 195 Tyr Leu Glu Leu His Trp Ala Asn Val Val Tyr Tyr Arg Pro Asn 200 205 210 Glu Val Lys Gly Gly Ser Arg Lys Aßp Leu Asp Ser Ala Asn Gly 215 220 225 He Asn He Ser Pro Gly Trp He Ser Phe Ser Met Leu Ala Asp 230 235 240 He Leu Ala His Glu He His Val Trp Gly Lys His Thr Asn Met 245 250 255 Asn Leu Thr Gln Leu Lys Val Leu Glu Leu Asp Thr Leu Val Asp 260 265 270 Asn Leu Ser He Asp Pro Ser Ser Gly Aßp He Trp Val Gly Cyß 275 280 285 His Pro Asn Gly Gln Lys Leu Phe Val Tyr Aßp Pro Asn Asn Pro 290 295 300 Pro Ser Ser Glu Val Leu Arg He Gln Asn He Leu Ser Glu Lyß 305 310 315 Pro Thr Val Thr Thr Val Tyr Ala Aßn Aßn Gly Ser Val Leu Gln 320 325 330 Gly Ser Ser Val Gly Ser Val Tyr Aßp Gly Lyß Leu Leu He Gly 335 340 345 Thr Leu Tyr Hiß Arg Ala Leu Tyr Cys Glu Leu 350 355 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD: 30 PARES DE BASES (B) TIPO: ACIDO NUCLEICO (C) HEBRA: SENCILLA (D) TOPOLOGÍA: LINEAL (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido TCAGGATCCA GAAATCGACT TAAAGCCTCC 30 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD: 30 PARES DE BASES (B) TIPO: ACIDO NUCLEICO (C) HEBRA: SENCILLA (D) TOPOLOGÍA: LINEAL (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido TCAAAGCTTT TAGAGTTCAC AATACAAGGC 30 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD: 34 PARES DE BASES (B) TIPO: ACIDO NUCLEICO (C) HEBRA: SENCILLA (D) TOPOLOGÍA: LINEAL (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido CGCGGGATCC ACCATGGGGG CGGCTGGTGG CTCT 34 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD: 34 PARES DE BASES (B) TIPO: ACIDO NUCLEICO (C) HEBRA: SENCILLA (D) TOPOLOGÍA: LINEAL (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido CGCGTCTAGA CGGTTAGAGT TCACAATACA AGGC 34 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polinucleótido aislado, caracterizado porque comprende miembros seleccionados del grupo que 5 consiste de: (a) un polinucleótido que codifica para el polipéptido que comprende del aminoácido 1 al aminoácido 356 como se expone en la SEQ ID NO: 2; (b) un polinucleótido capaz de hibridarse a y que --o es al menos 70% idéntico al polinucleótido (a) ; y (c) un fragmento polinucleotídico del polinucleótido de (a) , (b) o (c) .

2. El polinucleótido de conformidad con la 15 reivindicación 1, caracterizado porque el polinucleótido es ADN.

3. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polinucleótido es 0 ARN.

4. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polinucleótido es ADN genómico. 5

5. El polinucleótido de • conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque codifica para el polipéptido que comprende del aminoácido 1 al 356 de la SEQ ID NO: 2.

6. Un polinucleótido aislado, caracterizado porque comprende un miembro seleccionado del grupo que consiste de: (a) un polinucleótido, el cual codifica para un polipéptido maduro que contiene la secuencia de aminoácidos expresada por el ADN contenido en el Depósito ATCC No. 75773; (b) un polinucleótido, el cual codifica para un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expresada por el ADN contenido en el Depósito ATCC No. 75773; (c) un polinucleótido capaz de hibridarse a y que es al menos 70% idéntico al polinucleótido de (a) o (b) ; y (d) un fragmento polinucleotídico del polinucleótido de (a) , (b) o (c) .

7. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID N0:1 del nucleótido 1 al nucleótido 1079.

8. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID N0:1 del nucleótido 4 al nucleótido 1069. 5

9. Un vector, caracterizado, porque contiene el ADN de conformidad con la reivindicación 2.

10. Una célula huésped, caracterizada porque es -.-J transformada o transfectada con el vector de conformidad con la reivindicación 9.

11. Un proceso para producir un polipéptido, caracterizado porque comprende: 15 expresar de la célula huésped de conformidad con la reivindicación 10, el polipéptido codificado por tal ADN.

12. Un proceso para producir células capaces de expresar un polipéptido, caracterizado porque comprende 20 células genéticamente diseñadas con el vector de conformidad con la reivindicación 9. 13. Un polipéptido, caracterizado porque comprende un miembro seleccionado del grupo que consiste de (i) un 5 polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos deducida de la SEQ ID NO: 2 y fragmentos, análogos y derivados de la misma; y (ii) un polipéptido codificado por el ADNc del Depósito ATCC No. 75773 y fragmentos, análogos y derivados de tal polipéptido. 14. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el polipéptido comprende del aminoácido 1 al aminoácido 356 de la SEQ ID NO: 2. 15. Un método para el tratamiento de un paciente que tiene la necesidad de seroparaoxonasa, caracterizado porque comprende: administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva del polipéptido de conformidad con la reivindicación 13. 16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la cantidad terapéuticamente efectiva del polipéptido se administra proporcionando al paciente el ADN que codifica para tal polipéptido y expresando tal polipéptido in vivo . 17. Un proceso para diagnosticar una enfermedad o susceptibilidad a una enfermedad relacionada con una subexpresión del polipéptido de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque y comprende : determinar una mutación en la secuencia de ácido nucleico que codifica para tal polipéptido. 18. Un proceso de diagnóstico, caracterizado porque comprende: analizar la presencia del polipéptido de conformidad con la reivindicación 13 en una muestra derivada de un huésped. 19. Un método para identificar compuestos, los cuales son agonistas para el polipéptido de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque comprende: poner en contacto un sustrato para el polipéptido, el cual es un compuesto a ser seleccionado; y determinar si el compuesto hidroliza el sustrato. 20. Un anticuerpo, caracterizado porque está dirigido al polipéptido de conformidad con la reivindicación

13.