MXPA97000148A - Dispositivo implantable que contiene celulas detumor para el tratamiento del cancer - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un dispositivo implantable para la prevención o tratamiento del cáncer, comprende una cámara implantable que contiene células de tumor, o células somáticas preparadas por ingeniería para expresar al menos un antígeno que corresponde al antígeno de un tumor del paciente, la cámara tiene una pared porosa para suministrar en uso, una frontera porosa entre las células inmunes del paciente y las células contenidas;la porosidad de la frontera siendo suficiente para permitir que el material antigénico subcelular pase a través de la frontera, mientras se evita que las células contenidas y las células inmunes del paciente pasen a través de la frontera.

Description

DISPOSITIVO IMP ANTABLE QUE CONTIENE CÉLULAS DE TUMOR PARA EL TRATAMIENTO DEL CÁNCER Campo de la Invención 5 Esta invención se refiere al tratamiento y prevención del cáncer a través de la implantación de células de tumor dentro del paciente, en donde las células de tumor están contenidas en una cámara que segrega las células de tumor 10 desde los tejidos del paciente.

Antecedentes de la Invención Las terapias actualmente aceptadas para la mayoría de los 15 tumores son cirugía, quimioterapia, terapia por radiación, transplantes de médula espinal y diversas combinaciones de estas terapias. En general, estos tratamientos se dirigen a la destrucción de las células del tumor por mecanismos independientes de la activación 20 del sistema inmune del paciente. En el curso de la radiación y la quimioterapia, el daño significativo al sistema inmune es un efecto lateral desafortunado. Más aún, la efectividad a largo plazo de estos tratamientos para algunos tumores, es cuestionable. 25 Ref. 23786 a. Activación del Sistema Inmune Dentro de la última década, se han desarrollado enfoques terapéuticos con base en la activación del sistema inmune para mediar la actividad anti-tumores . Generalmente, una respuesta normal del huésped hacia las células de tumor comienza con el reconocimiento de las células T de los antígenos asociados al tumor sobre las células del tumor o por medio de células que presentan antígenos. El reconocimiento por medio del receptor de antígeno de células T, activa las trayectorias de transducción de señal que median la activación de las células T. Esto resulta en la secreción de interleucin-2 (IL-2) , gama-interferon, factor alfa de la necrosis del tumor, y otras citocinas de las células T y las células accesorias. El sistema huésped inmune, es de esta manera inmovilizado para eliminar a las células del tumor.

Una terapia designada para activar el sistema inmune, es la administración sistemática de IL-2. Sin embargo, las dosis de IL-2 requeridas para alcanzar la amplificación adecuada, han probado ser tóxicas para el paciente. Los enfoques de inmunoterapia celular para activar el sistema inmune, se han enfocado en dos tipos de células: células LAK y células TIL. Las células LAK (eliminador activado de la linfocina) son células del sistema inmune que han sido activadas no específicamente a través del uso de citocinas tales como IL-2 (Lotze et al., Cáncer Res, 41, p. 4420-4425 (1981); Grimm et al., J. Exp. Med. 155, p. 1823-1844 (1982)) y/o el uso de anticuerpos monoclonales tales como el anti-CD3 (Ochoa et al., Cáncer Res. 49, 9. 693-700 (1989)). Estas células pueden mediar en la promoción de una actividad antitumoral significativa sin las restricciones mayores relacionadas con el complejo de histocompatibilidad (MHC) , características del receptor de células T de las células T citolíticas clásicas (CTL) . En un estudio reciente, la infusión continua de células IL-2 y LAK para tumores avanzados, resulta en respuestas del 12% de pacientes con melanoma y 3% de pacientes con carcinoma de células renales (Lotze, Cell Transplantation 2, p. 33-47 (1993)). Mientras que la mayoría de las células LAK caracterizadas a la fecha consisten de células eliminadoras naturales activadas (NK) (Ortaldo et al., J. Exp. Med. 164, p. 1193-1205 (1986); Ferrini et al., J. Inmunol. 138, p. 1297-1302 (1987); Philips y Lanier, J. Exp. Med 164, p. 814-825 (1986)), las células LAK también se pueden regenerar de un subconjunto de células T conocidas como células T ?d (células T que carecen de las subunidades clásicas aß del receptor de células T y en su lugar expresa las subunidades ?d) (Ochoa et al., Cáncer Res. 49, p. 693-700 (1989)). Las células LAK también se pueden regenerar de células T aisladas CD4+ ó CD8+ que se hayan cultivado en presencia de anticuerpos monoclonales IL-2 y anti-CD3 (Geller et al., J. Inmunol. 146, p. 3280-3288 (1991)). Las células TIL (linfocitos infiltrantes de tumores) , son linfocitos que se han aislado in vi tro a partir de los tumores. Como las células LAK, estas células se pueden expandir mediante el cultivo en presencia de citocinas tales como IL-2 ó IL-4 pero, a diferencia de las células' LAK, estas células son específicas de tumor. Usando las células TIL, se ha observado una respuesta de 20-50% en pacientes con melanoma (Lotze, Cell Transplantation 2, p. 33-47 (1993)) . b. Inmunogenicidad aumentada de los tumores Otros enfoques para la inmunoterapia de tumores, involucran el incremento de la inmunogenicidad de las células de tumor, más que aumentar la actividad de los linfocitos de respuesta. Se cree que muchas células de tumor, carecen de un grado de inmunogenicidad requerida para inducir una respuesta inmune adecuada (Houghton y Lewis, "Inmunogenicidad de Tumores inducida por Citocina", ed. Forni et al., Academic Press, p. 35-54 (1994) ) .

Generalmente, las células de estimulador (tales como las células de tumor) activan las células T mediante el acoplamiento de un receptor T con péptidos asociados ya sea con moléculas MHC de la Clase I ó Clase II sobre la 5 célula del estimulador. Estos péptidos se pueden tomar del medio externo por la célula del estimulador, en cuyo caso se procesan y presentan junto con las moléculas MHC de Clase II o por otro lado, pueden ser péptidos producidos endógenamente mediante la célula del estimulador y presentarse entonces con las moléculas MHC "*"- de Clase I. La presentación de péptidos derivados exógenamente mediante la célula de estimulador, se refiere como una presentación indirecta, ya que los péptidos no se presentan sobre la célula de la cual han sido derivados. En el caso de la presentación directa, los péptidos se presentan sobre la superficie de las células a partir de las cuales se derivan los péptidos. La Figura 1, es un diagrama esquemático que muestra la -•*•""*». presentación directa vs . la indirecta. 20 Además del receptor de células T y los antígenos MHC, se ha identificado un número de antígenos de superficie de células, que pueden jugar un papel en las interacciones mediadoras entre las células que presentan antígenos y las células T respondientes. Estas moléculas coestimulatorias, incluyen moléculas de adhesión intercelular (ICAM) , molécula 1 de adhesión vascular a células (VCAM-1) , antígeno 3 asociado a la función linfocito (LFA-3) , antígeno estable al calor (HSA) y CD28 sobre linfocitos, y el ligando B7 que debe estar presente sobre la célula que presenta antígeno (Pardi et al., Immunol. Today 13, p. 224-230 (1992); Chen et al., Immunol. Today 14, p. 483-486 (1993)). El acoplamiento del receptor de células T con la célula que presenta el antígeno en ausencia de moléculas coestimulatorias, puede conducir a una falta de energía en la célula T y a la falla de la respuesta inmune contra el tumor (Gimmi et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 90, p. 6586-6590 (1993)).

Los antígenos de tumor únicos han estado definidos para diversos tumores incluyendo el MAGE (van der Bruggen et al., Science 254, p. 1643-1650(1991)) y MART (Kawakami, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 91, p. 3515-3519 (1994); Boon et al., Ann. Rev Immunol . 12, p. 337-365 (1994) antígenos para melanoma y mucinas para tumores del pecho y pancreáticos (Finn, J. Cellular Biochem. 17D, p. 92 (1993); Domenech et al., J. Cellular Biochem 17D, p. 108 (1993); Fontenot et al., J. Cellular Biochem. 17D, p. 125 (1993)). Ver también Brown, J.P. et al., Patente americana No. 5,141,742 (antígeno asociado a melanoma). Se ha observado que las células de tumor no presentan eficientemente auto-péptidos (presentación directa) aún cuando las células expresan antígenos MHC, sugiriendo que puede haber un defecto/deficiencia en otra molécula, necesario para la presentación efectiva directa de antígeno mediante células de tumor. Muchas células de tumor han demostrado expresar bajos niveles de B7. De conformidad, un enfoque terapéutico es restablecer la inmunogenicidad de las células de tumor por la introducción del gen para B7 dentro de las células de tumor del paciente, promoviendo así la presentación directa del antígeno del tumor (Chen et al., Cell 71, p. 1093-1102 (1993) y EPO 600591; Chen et al., J. Exp. Med. 179, p. 523-532 (1994) ; Townsend y Alison, Science 259, p. 368-370 (1993); Baskar et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 90, p. 5687-5690 (1993)). La introducción del ligando CD28 B7 al linfoma, mastocitoma, melanoma o sarcoma inmunogénico resulta en una actividad incrementada de CTL en contra del tumor de tipo natural y en la protección contra la inyección subsecuente con el tumor de tipo natural (Chen et al., Cell 71, p. 1093-1102 (1993) (melanoma); Chen et al., J. Exp. Med. 179, p. 523-532 (1994) (mastocitoma, fibrosarcoma, linfoma, melanoma, carcinoma); Townsend y Alison, Science 259, p. 368-370 (1993); Baskar et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 90, p. 5687-5690 (1993) (sarcoma)). Adicionalmente, la inyección de las células de linfoma EL4 expresando B7, resultaron en una tasa de cura del 60% en ratones con tumores establecidos derivados del E14 (Chen et al., J. Exp. Med. 179, p. 523-532 (1994)). Similarmente, la transfección del adenosarcoma o fibrosarcoma de colon de mur?no con genes para las moléculas de murino de Clase I, mediarían la regresión del tumor no modificado, aunque los tumores no fueran completamente eliminados (Plautz et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 90, p. 4645-4649 (1993) (fibrosarcoma, cáncer de colon)). Este enfoque está probándose actualmente en ensayos clínicos humanos (Nabel, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 90, p. 94-97 (1993) (melanoma) ) . En estos ambos ejemplos, la introducción de genes externos aumentó el reconocimiento directo mediado de la Clase I de las células de tumor, por las células del efectuador del huésped. La respuesta es específica al tumor. El tratamiento con el tumor genéticamente modificado no tiene efecto sobre el crecimiento de un tumor no relacionado. Esta respuesta se cree que requiere un contacto directo célula-célula. Ver también Hock et al., Gene Therapy eekly, p. 22 (Enero 9, 1995) (MHC de Clase II, expresando células de neuroblastoma de murino).

Un enfoque ligeramente diferente se tomó por Trojan et al. para el tratamiento de glioblastoma. Las células glioma expresan altos niveles de factor de crecimiento I similar a la insulina (IGF-1) . El tratamiento de las células glioma con un gen anti-sentido para IGF-1 parece invertir el fenotipo tumorogénico, resultando las células inmunogénicas. En estos estudios, la inyección de las células glioma que expresan la secuencia anti-sentido IGF-1 resultaron en la eliminación de tumores pre-existentes en todos los animales tratados (Trojan et al., Science 259, p. 94-97 (1993)). Aunque esta respuesta se mostró que mediaba por las células T CD8+, no está claro si se activan directamente por las células de tumor modificadas o indirectamente por medio de antígenos recolectados por las células que presentan antígenos o por ambas .

Enfoques adicionales para aumentar la inmunogenicidad de los tumores, involucran la ingeniería de las células de tumor para expresar los genes de citocina tales como IL-2, IL-4, IL-6, factor de necrosis del tumor, ?-interferon o factor estimulante de colonias de granulocitos macrófagos (GM-CSF) (Dranoff et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90, p. 3539-3543 (1993); Golumbek et al., Science 254, p. 713-716 (1991) (carcinoma de célula renal); Gansbacher et al., Cáncer Res. 50, p. 7820-7825 (1990); Gansbacher et al., J. Exp. Med. 172, p. 1217-1224 (1990); Bannerji et al., J. Immunol . 152, p. 2324-2332 (1994) (fibrosarcoma); Fearon et al., Cell 60, p. 397-403 (1990) (carcinoma de colon); Columbo et al., J. Exp. Med. 173, p. 889-897 (1991) (adenocarcinoma); Haddada et al., Hum. Gene Therapy 4, p. 703-711 (1993) (mastocitoma); Lollini et al., Int. J. Cáncer 55, p. 320-329 (1993) (adenocarcinoma mamario); Watanabe et al., Proc. Nati.

Acad. Sci. USA 86, p. 9456-9460 (1989) (neuroblastoma); Pardoll, Curr. Opin. Oncol . 4, p. 1124-1129 (1992); Tepper y Mulé, Hum. Gene Therapy 5, p. 153-164 (1994) ; Porgador et al., Cáncer Res. 52, p. 3679-3686 (1992) (carcinoma de pulmón de Lewis) ; Ver también WO 92/05262 Universidad Hopkins de Texas. Aquí también, las células de tumor genéticamente modificadas pueden estimular una ""*" respuesta inmune en situaciones en las cuales las líneas del tumor padre son no-inmunogénicas . Los investigadores en esta área han observado que la respuesta inmune se extiende hasta la destrucción de las células de tumor no modificadas así como las células de tumor por ingeniería y pueden, en algunos casos resultar en una regresión completa del tumor preexistente en animales experimentales (Dranoff et al., Proc. Nat. Acad. Sci. EUA 90, p. 3539-3543 (1993); Golumbek et al., Science 254, p. 713-716 (1991); Gansbacher et al., Cáncer Res. 50, p. 7820-7825 (1990); Gansbacher et al., J. Exp. Med. 172, p. 1217-1224 (1990); Bannerji et al., J. Immunol . 152, p. 2324-2332 (1994) (fibrosarcoma); Fearon et al., Cell 60, p. 397-403 (1990); Columbo et al., J. Exp. Med. 173, p. 889-897 (1991); Haddada et al., Hum. Gene Therapy 4, p. 703-711 (1993); Lollini et al., Int. J. Cáncer 55, p. 320-329 (1993); Watanabe et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 86, p. 9456-9460 (1989); Pardoll, Curr. Opin. Oncol. 4, p. 1124-1129 (1992); Tepper and Mulé, Hum. Gene Therapy 5, p. 153-164 (1994); Porgador et al., Cáncer 5 Res. 52, p. 3679-3686 (1992); Vieweg et al., Gene Teraphy Weekly, p. 20 (Noviembre 21, 1994) (cáncer de próstata)).

En general, estos protocolos experimentales involucran la inmunización de animales una o más veces con células irradiadas de tumor, que han sido preparadas por ingeniería genética para expresar el gen exógeno. La irradiación evita que las células se dividan pero no disminuyen su antigenicidad. Las respuestas antitumorales son entonces probadas en una de tres formas: (i) los animales se desafían con células de tumor no modificadas después de que el proceso de inmunización está completo; (ii) los animales se desafían con células de tumor no modificadas durante el proceso de vacunación; ó (iii) los r^'^. tumores pequeños se establecen antes de la inmunización con células de tumor modificadas.

La mayoría de los estudios que utilizan células de tumor modificadas genéticamente, han involucrado la introducción de células de citocina dentro de diversos tumores (ver Pardoll, Curr, Opin. Oncol. 4, p. 1124-1129 (1992) ; Tepper y Mulé, Hum. Gene Therapy 5, p. 153-164 (1994) para revisiones) . Una de las moléculas más efectivas es GM-CSF (factor estimulante de la colonia de granulocitos macrófagos) que aumenta la inmunidad específica para diversos tipos de tumor (Dranoff et al., 5 Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 90, p. 3539-3543 (1993) (melanoma B16, cáncer de colon, cáncer de pulmón, fibrosarcoma, cáncer renal) ) . El GM-CSF es único en cuanto a que puede estar mediando este efecto antitumoral al estimular la proliferación y diferenciación de células dendríticas que son células que presentan antígenos extremadamente potentes, capaces de presentar antígenos de ambas células CD4+ y CD8+ (Steinman, Ann. Rev. Inmunol. 9, p. 271-296 (1991)). Metzinger ha sugerido recientemente que la única manera en que el sistema inmune se puede activar para responder a los tumores, es por medio de los antígenos colgantes que se recolectan y presentan por las células profesionales presentantes de antígenos tales como las células _" dendríticas (Metzinger, Ann. Rev. Immunol . 12, p. 991- 20 1045 (1994)). Similarmente, Bannerj i et al., han sugerido recientemente que el rechazo de las células de fibrosarcoma secretantes de IL-2 no está mediada por las células T aunque la inmunidad sistemática posterior depende de la presencia de ambas células CD4+ y CD8+ (Bannerji et al., J. Immunol . 152, p. 2324-2332 (1994)). Su hipótesis es que la destrucción de las células modificadas se media por las células NK que resultan en la liberación de antígenos de tumor que pueden tomarse por las células que presentan antígeno, expresando tanto moléculas de Clase I como de Clase II sobre sus 5 superficies de células. Estas células entonces serían capaces de activar ambas células T, CD4+ y CD8+. Un modelo similar ha sido discutido por Shoskes y Wood (Shoskes y Wood, Immunol . Today 15, p. 32-38 (1994)).

En experimentos recientes, Cohén y sus colaboradores han J?" podido prolongar la supervivencia de ratones con melanoma preexistente, al inyectar a los animales con fibroblastos alogénicos que han sido transfectados con el gen para IL- 2 y ADN aislado de células de melanoma (Kim y Cohén, Cáncer Res. 54, p. 2531-2535 (1994)). Al usar las células alogénicas, no hay necesidad de irradiar las células, las cuales afectarían la expresión de citocinas. Ya que las células transfectadas son fibroblastos, no forman tumores, y ya que son alogénicas, activan rápidamente el sistema inmune. Sin embargo, ya que son rápidamente rechazadas, no hay una estimulación a largo plazo del sistema inmune. Otros han mezclado fibroblastos que expresan citocinas con células de tumores irradiados y entonces se administra la mezcla como una vacuna (WO 93/07906, PCT US92/08999) . Otros todavía, han acoplado células de fibroblastos no tumorosos a un adyuvante y administrado las células como una vacuna de tumor (Eggers, patente americana No. 5,208,022).

Todavía otra terapaia para la prevención y tratamiento de tumores, es la inmunización con antígenos de tumor (WO 93/06867 Pardoll, Mulligan) . Otro protocolo de vacuna es la administración de células de tumores irradiados junto con un adyuvante bacterial (Pardoll, 5 Cur. Opin.

Immunology, p. 719-725 (1993). Otros han irradiado células de tumores sin modificar y administrado como una """* vacuna (Dranoff et al., 90 PNAS, p. 3539-3543, Figura 4A (1993) ) . c. Evolución del Tumor 15 La mayoría de los cánceres se cree que son de origen clonal, y que las nuevas subpoblaciones se elevan continuamente durante la evolución de un cáncer debido a r"" la selección Darwiniana de las variantes genéticas que tienen una ventaja en crecimiento. Algunas de las variantes genéticas, son características de un tipo particular de tumor y de hecho pueden servir como la base para clasificar la severidad del tumor, en otros casos los cambios son idiotípicos, esto es, específicos al tumor propio del individuo. Las mutaciones que dan lugar a la ventaja de crecimiento, incluyen mutaciones en genes reguladores del crecimiento, cambios en la morfología, dependencia de hormonas, patrones de enzimas y antígenos de superficie. Algunos de estos cambios pueden permitir que las células anormales se escapen de los controles homoestáticos del paciente o de la destrucción por tratamiento. Las quimioterapias convencionales son a menudo efectivas incialmente, al disminuir el avance de la enfermedad. Sin embargo, con el tiempo, los tratamientos repetidos se vuelven menos efectivos, tal vez a través de la evolución de clones sucesivamente menos sensibles (G. Klein y E. Klein, PNAS EUA 74, p. 2121 (1977)). Ver también Schreiber, H. , "Inmunología de Tumores" Capítulo 32 en Fundamental Inmunology W. Paul, de. (1993) . d. Cámaras de Difusión Las cámaras de difusión que evitan el contacto célula a célula, se han utilizado por muchos años para estudiar los mecanismos inmunológicos . Klein, et al., han usado las células de tumor en una cámara de difusión como un modelo para estudiar la respuesta inmune del huésped a las células de tumor. Concluyen que las células de tumor producen factores solubles que promueven la hipersensibilidad de tipo retrasado y también estimulan la angiogénesis que promueve el crecimiento del tumor (Tumor Biol., 15, p. 160-165 (1994)).

Stillstrom ha implantado células de tumor en las cámaras de difusión, con objeto de reducir la inmunidad en roedores, y encontró que después de diez semanas, el nivel de inmunidad inducido por las células de tumor en una cámara de difusión depositada subcutáneamente durante siete días, fue de 10-100 veces menor que aquel alcanzado con células inoculadas directamente. En otros experimentos, no encontró diferencias significativas en el estado inmune de los animales inoculados directamente y en aquellos que se les dieron cámaras de difusión que contenían células de tumor. También econtró que las cámaras se rechazaban si se dejaban subcutáneamente durante varias semanas (Acta Path. Microbiol. Scand. , Sect. B 82, p. 676-686 (1974)).

Biggs y Eiselein utilizaron cámaras de difusión para mostrar que cierto tipo de células de tumor, liberan una partícula viral que se difunde fuera de la cámara, proporcionando inmunidad a un desafío subsecuente con células de tumor. También muestran que una porosidad muy baja en la cámara puede evitar la inmunización (Cáncer Research, Vol 25, p. 1888-1893 (1965)).

Cochrum et al., en la patente americana U.S. 5,015,476 describe el uso de linfocinas o citocinas como un adyuvante cuando se presentan parásitos microencapsulantes y su implantación para obtener 5 inmunización contra la infección de parásitos.

Resumen de la Invención La terapia novedosa para el cáncer del solicitante, curó el 60% de los tumores experimentales que soportaban los **" animales. Cuando se usó para la prevención del cáncer, el método fue 100% efectivo. Ninguno de los animales experimentales desarrolló tumores independientemente del desafío con una inyección de 10 células de tumor. 15 La invención del solicitante, es un método para prevenir o tratar el cáncer en un paciente y comprende: la administración de un primer conjunto de células de tumor, en donde al menos algunas de las primeras células de 20 tumor tienen al menos un antígeno de tumor correspondiente al antígeno encontrado en las células de tumor del paciente, en donde las células de tumor están contenidas en una cámara implantable, y la cámara está definida por medios de pared que incluye un medio 25 limitante poroso entre las células inmunes del paciente y las células contenidas, el medio limitante siendo permeable al material antigénico subcelular, por lo que el medio limitante evita el contacto entre las células inmunes del paciente y las células de tumor contenidas, y por lo que el medio limitante permite que los materiales antigénicos celulares salgan de la cámara. Las células de tumor administradas pueden estar no modificadas o las células de tumor pueden estar modificadas para expresar y secretar una molécula inmunopotenciante (p.ej., linfocinas) .

Alternativamente, en lugar de las células de tumor, las células administradas pueden ser células somáticas no transformadas preparadas por ingeniería para expresar los antígenos asociados al tumor u otros antígenos; y pueden ser adicionalmente preparadas por ingeniería para expresar citocinas. Las células de tumor pueden estar vivas o irradiadas. Las células de tumor se pueden administrar profilácticamente para evitar el desarrollo de tumores, o terapéuticamente para tratar tumores existentes o metastasas. Las células de tumor pueden ser células de tumor autólogas administradas después de la separación quirúrgica de un tumor. Pueden ser alogénicas. O pueden ser de una línea de células de tumor desarrollada a partir de un donador alogénico. Las células de tumor pueden administrarse antes, durante o después de otras terapias de cáncer tales como la terapia de radiación o quimioterapia. Pueden administrarse junto con la administración local de citocinas usando por ejemplo, liposomas.

De conformidad con la presente invención, las células de tumor administradas, se segregan de las células del paciente, utilizando cualquier cámara implantable apropiada contenedora de células, que pueda retener las células de tumor mientras permite que el material subcelular pase hacia y desde la cámara. La cámara evita "~*~ el contacto célula a célula entre las células administradas y las células inmunes del paciente. Las células de tumor se pueden implantar en el sitio de un tumor existente o en un sitio distante del tumor. 15 La presente invención proporciona además una cámara que contiene células de tumor.

En una modalidad alternativa, las células irradiadas de 20 tumor, se administran en la cámara, con o sin células vivas de tumor también en la cámara. Preferiblemente, la cámara es tal que permite que las células vivas de tumor sobrevivan después de la implantación, por un periodo mayor al que sobrevivirían si estuvieran en contacto con 25 células del sistema inmune del paciente.

En otra modalidad alternativa, la cámara es tal que * permite que las células de tumor irradiadas que están dentro de ella, sobi ¿vivan después de la implantación durante un periodo mayor al que sobrevivirían si estuvieran en contacto con las células del sistema inmune del paciente. En otras palabras, la cámara preferiblemente retrasa o evita el rechazo de las células contenidas. En una modalidad preferida, la cámara es de un tipo que provoca una inflamación de cicatrización de herida crónica en su superficie, que actúa como un adyuvante para aumentar la respuesta inmune del paciente a las células de tumor implantadas .

La presente invención proporciona adicionalmente, una terapia novedosa de cáncer que comprende (i) la administración de células de tumor en una cámara implantable que contiene células, en combinación con (ii) la administración de células de tumor que han estado resultando no tumorigénicas. Las células de tumor que han estado resultando no tumorigénicas, se administran fuera de la cámara como una inoculación de células "libres" .

Estas preferiblemente resultan no tumorigénicas por irradiación. Alternativamente, se puede utilizar cualquier método que las vuelva no tumorigénicas . Por ejemplo, se ha reportado que la administración de células de tumor no irradiadas en combinación con el IL-2, las vuelve no tumorigénicas. De conformidad con la presente invención, las células de tumor administradas fuera de la cámara, pueden ser no modificadas o pueden ser modificadas para expresar un polipéptido 5 inmunopotenciante. Alternativamente, en lugar de las células de tumor, las células administradas fuera de la cámara pueden ser células no transformadas preparadas por ingeniería para expresar antígenos asociados al tumor u otros antígenos, con o sin citocinas. Estos pueden ser 10 autólogos o alogénicos. 0, pueden ser de una línea de ,****, célula desarrollada a partir de células autólogas o alogénicas .

Las células de tumor implantadas dentro de la cámara o fuera de la cámara pueden ser autólogas, esto es, tomadas de un tumor existente del paciente. Alternativamente, pueden ser alogénicas : tomadas de otro individuo que tiene células de tumor que tienen antígenos de tumor correspondiendo a aquellos encontrados en las células de tumor del paciente. 0 pueden ser de una línea de célula de tumor correspondiente al tipo de tumor a ser tratado o prevenido en el paciente. También pueden ser células no tumorales preparadas por ingeniería para expresar antígenos asociados a tumores u otros antígenos, con o sin la expresión concurrente de citocinas.

Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1, es un diagrama esquemático que ilustra la presentación de antígeno directa vs . indirecta. 5 La Figura 2 , es un diagrama de la cámara usada en una modalidad preferida de la invención.

La Figura 3, es una tabla que muestra la respuesta de 10 ratones al desafío de tumores, que sigue después del tratamiento de conformidad con la presente invención, como se describe en el Ejemplo 1.

Se implantaron animales con dos dispositivos cada uno, conteniendo 10 células. Un animal recibió solamente un dispositivo. A todos los animales se les dió el primer desafío con 106 células libres MCA-38 tres semanas después del implante. En el Experimento I, un segundo ,-"•"- desafío fue a las 8 semanas después del implante; en el 20 Experimento II un segundo desafío se dió a las 11 semanas después del implante.

La Figura 4 muestra el número de días en los cuales el tumor se detectó en el sitio de desafío en animales desafiados con 103 células MCA-38 al tiempo de la implantación del dispositivo, como se describió en el Ejemplo 1. Los animales de control no recibieron dispositivos .

La Figura 5 muestra el tamaño de las masas subcutáneas remanentes en perros 142-3 después de la implantación de los dispositivos que contienen tejidos de una masa extirpada como se describe en el Ejemplo 2.

La Figura 6 ilustra el tamaño de la masa de tumor remanente en el perro 4008 después de la extirpación quirúrgica de >95% del tumor. El tumor extirpado se usó como fuente de tejido para cargar dispositivos que se implantaron subcutáneamente, como se describe en el Ejemplo 2.

La Figura 7 (del Ejemplo 3) muestra la tasa de supervivencia de ratones C57/B6 en los cuales el tumor MCA-38 preexistente se trató por administración de células de tumor irradiadas MCA-38 tanto adentro como afuera de la cámara. También muestra la tasas de supervivencia para tratamiento por administración de células no irradiadas dentro de la cámara en combinación con las células irradiadas fuera de la cámara.

La Figura 8 (del Ejemplo 3) muestra la tasa de supervivencia de los ratones C57/B6 en la cual el tumor preexistente MCA-38 se trató por administración de células de tumor irradiadas y no irradiadas MCA-38 dentro y fuera de la cámara.

La Figura 9 (del Ejemplo 3), muestra la tasa de supervivencia de los ratones C57/B6 en el cual el tumor preexistente MCA-38 en el espacio subcutáneo dorsal, se trató mediante la administración de células de tumor irradiadas, dentro y fuera de la cámara.

La Figura 10, muestra el protocolo para un experimento del Ejemplo 4.

La Figura 11 (del Ejemplo 4) muestra la tasa de supervivencia de los ratones C57/B6 en el cual el tumor preexistente MCA-38 se resecó y entonces se trató mediante administración de las cámaras que contenían las células de tumor no irradiadas MCA-38 y sin células fuera de la cámara.

La Figura 12 muestra el protocolo para el experimento del Ejemplo 5.

La Figura 13 (del Ejemplo 5) muestra la tasa de supervivencia de los ratones C57/B6 desafiados con melanoma B16 después de ser primeramente inmunizados con melanoma B16 crecido dentro de y transferido desde animales singénicos.

La Figura 14 (del Ejemplo 6) , muestra la tasa de supervivencia para los ratones C57/B6 desafiados con tumores ovarianos C57, cuatro semanas después de ser primeramente inmunizados con células de tumores ovarianos C57 irradiadas libres y con dispositivos que contenían tumor ovariano C57 irradiado.

Descripción Detallada de la Invención Se describe un método novedoso de terapia de tumores, que comprende la administración de células de tumor a un paciente, mientras que se evita el contacto célula a célula entre al menos algunas de las células de tumor administradas y las células inmunes del paciente. Como se usa aquí, "tumor" incluirá tumores sólidos, células de tumor metastático y cánceres no sólidos de los sistemas de la sangre, médula, y- linfático. "Tumor" incluirá: Carcinomas (cánceres derivados de las células epiteliales), sarcomas (derivados de los tejidos mesencimales) , linfomas (tumores sólidos de tejidos linfoides) , y leucemias (tumores transportados en la médula o en la sangre de linfocitos u otras células hematopoéticas) .

Como se usa aquí, el "tratamiento" o "terapia" del cáncer incluirá métodos del solicitante que eliminan los tumores existentes, retrasan el avance de la enfermedad, reducen el tamaño del tumor existente, evitan el agrandamiento de 5 tumores que ocurriría sin tratamiento o terapia, retrasan el comienzo de la formación de tumores, retrasan el agrandamiento de tumores, y métodos que evitan, reducen o retrasan las metastasas. Como se usa aquí "metastasas", quiere decir las células de tumor localizadas en sitios 10 discontinuos con el tumor original, usualmente a través -<•*- « de la repartición linfática y/o hematógena de células de tumor .

De conformidad con la presente invención, las células de tumor se implantan en el paciente que usa medios de cámara que evitan el contacto célula a célula entre las células de tumor y las células inmunes del paciente.

Preferiblemente esta segregación se efectúa utilizando un dispositivo como se describe en la solicitud de patente PCT publicada WO 92/07525, que se incorpora aquí como referencia en su totalidad, o el dispositivo descrito en la solicitud de patente americana pendiente, serie U.S. 8/179,860, que se incorpora también como referencia en su totalidad. El uso de un dispositivo de este tipo evita el contacto célula a célula, permite que el material subcelular pase a través de la cámara, y suministra al paciente la vascularización en el sitio del implante. Además, evita la formación de una cápsula clásica de cuerpo extraño y proporciona una inflamación crónica de cicatrización de herida en su superficie, que actúa como adyuvante .

Cualquier dispositivo para la segregación celular, que permita que las células de tumor implantadas interactúen con el sistema inmune del paciente en alguna forma diferente que a través del contacto directo célula a célula, será apropiado. Medios alternos incluyen fibras huecas, membranas de lámina o la encapsulación de células sencillas de tumor o grupos de células de tumor en, por ejemplo, macro- ó micro- cápsulas de alginato o en liposomas. Se prefiere el uso de una cámara que se puede recuperar intacta del paciente, especialmente si se administran células de tumor viables en la cámara. Esto ofrece la ventaja de poder separar las células de tumor contenidas del paciente. El uso de la cámara preferida también tiene la ventaja de permitir que se administren células de tumor autólogas vivas, células de tumor alogénicas vivas, o células autólogas o alogénicas no tumorosas vivas, preparadas por ingeniería para expresar antígenos de tumores.

Las vacunas de células de tumor del arte previo administradas a los pacientes, generalmente usan células /- de tumor irradiadas o células alogénicas sin cámaras o técnicas de encapsulación. De conformidad con una 5 modalidad de la presente invención, las células vivientes no irradiadas contenidas en la cámara, no se rechazan o destruyen por la respuesta inmune del paciente y se cree que tienen un efecto continuo inmunoestimulatorio mientras estas sobrevivan. En contraste, las células de 0 tumor no viables del arte previo, suministran solamente una estimulación transitoria ya que se eliminan rápidamente del huésped. La cámara se puede implantar en el paciente y posteriormente cargarse con células o la cámara se puede cargar antes de la implantación. 5 Sorprendentemente, las células de tumor administradas en la cámara, én combinación con la administración de células libres irradiadas, puede suministrar una terapia superior a cualquier técnica usada separadamente. Aunque 0 los solicitantes no conocen el mecanismo para este resultado, se piensa que el uso de las células libres permite un contacto temprano célula a célula, para iniciar una respuesta inmune aumentada y el uso de células en una cámara permite una respuesta inmune 5 aumentada prolongada posteriormente .

En el caso del tratamiento de un tumor existente, las células administradas son preferiblemente células autólogas, y preferiblemente comprenden una mezcla de todas las células diversas que pueden estar presentes en un tumor heterólogo. Preferiblemente, las células de tumor administradas, reflejan la heterogenicidad del tumor propio del paciente. El grueso del tumor (es) presente en el paciente, se separa utilizando técnicas quirúrgicas convencionales.

Las células separadas de tumor, se colectan, mezclan en un medio adecuado, y se cargan en una cámara o en cámaras múltiples, dependiendo de la dosis deseada de células. Las células en la cámara puede estar o no irradiadas . Las cámaras pueden ser implantadas subcutáneamente, intraperitonealmente, en o dentro del sitio del tumor independientemente del tipo de tejido, o en cualquier otro sitio apropiado. La cámara cargada puede o no ser administrada en combinación con la administración de células de tumor libre no viable (irradiado) en el sitio de implante de la cámara o distante del sitio de implante de la cámara. Se pueden usar cámaras múltiples y sitios múltiples .

Si se usan células de tumor alogénicas, preferiblemente son de una línea de célula de tumor que expresa al menos uno de los antígenos expresados por el tumor del paciente como se determina por la biopsia del tumor. Las células /'* alogénicas se administran en la cámara como aquí se describe. Las células contenidas pueden estar o no 5 irradiadas. Además, las células alogénicas pueden estar irradiadas y también ser administradas como células libres .

Alternativamente, de conformidad con la presente 0 invención, las células de tumor que contiene la cámara, se pueden administrar con una dosis de moléculas inmunopotenciantes (p.ej., linfocinas) . La dosis se puede administar usando células no tumorosas (p.ej., fibroblastos) preparadas por ingeniería para expresar y 5 segregar moléculas inmunopotenciantes (p.ej., linfocinas) . Las cámaras cargadas se pueden administrar con o sin células de tumor libres irradiadas, con o sin moléculas inmunopotenciantes. Las células preparadas por ~ ingeniería, pueden expresar más de una citocina o 0 molécula inmunopotenciante. Se pueden usar otras fuentes para administración local directa de las moléculas inmunopotenciantes tales como liposomas, microcápsulas, cápsulas liberadoras de tiempo, o microbombas, todas las cuales se conocen en el arte de suministro de 5 medicamentos .

Como se usa aquí, "molécula inmunopotenciante" incluye cualquier molécula que estimula o enriquece la actividad del sistema inmune cuando se usa en combinación con la cámara y las células de tumor de la presente invención. Aquellos hábiles en el arte, reconocerán que esto puede incluir citocinas así como lípidos antigénicos incluyendo fosfolípidos, hormonas, carbohidratos, ácidos nucleicos, componentes de partículas de virus, antígenos de células bacteriales, y proteínas. Aquellos hábiles en el arte reconocerán que para ser de uso en la presente invención, la molécula inmunopotenciante se debe presentar en cantidades lo suficientemente altas y con un grado de antigenicidad adecuado para enriquecer, estimular o evocar una respuesta inmune. La molécula inmunopotenciante puede secretarse o desprenderse de células vivas o irradiadas, o puede ser un producto de la degradación de células muertas; o puede ser un medicamento purificado o sintético. Algunas moléculas inmunopotenciantes se describen en Frost et al . , WO 92/05262. El uso de citocinas como un adyuvante inmune sofisticado se conoce en el arte y se describe por Houghton y Lewis en "Inmunoterapia activa específica en humanos" Capítulo 5 de "Inmunogenicidad de Tumor Inducida por Citocinas", Eds. Forni G. et al. (1994). Golumbek, P.T., et al . describen la coinyección de células de tumor irradiadas más GMC-SF contenido en microcápsulas, como una vacuna de cáncer en un modelo de murina (Cáncer Research, 53, p. 5841-5844 (Diciembre 15, 1993)). / - Al determinar los protocolos que incluyen dosis 5 apropiadas, alguien hábil en el arte se puede referir a los diversos protocolos publicados por el Comité Consejero del ADN Recombinante de los Institutos Nacionales de Salud para vacunas de cáncer usando células de tumor modificadas o no modificadas irradiadas. Por 0 ejemplo, ver Human Gene Therapy, abril 1994 Vol. 5, p. 553-563 y referencias aquí a los protocolos publicados. Estos protocolos publicados incluyen: (i) Inmunización de Pacientes de Cáncer usando Células Autólogas de Cáncer Modificadas por Inserción del Gen para Factor de Necrosis 5 de Tumor, Investigador Principal S.A. Rosenberg, Human Gene Therapy 3, p. 57-73 (1992); (ii) Inmunización de Pacientes de Cáncer usando Células de Cáncer autólogas Modificadas por Inserción del Gen para Interleucin-2, Investigador Principal S.A. Rosenberg, Human Gene Therapy 0 3, p. 75-90 (1992); (iii) Un Estudio Piloto de Inmunización con HLA-A2 alogénico secretando interleucin- 2 empata las Células de Carcinoma de Células renales en pacientes con Carcinoma de Células Renales Avanzado, Investigador Principal B. Gansbacher, Human Gene Therapy 5 3, p. 691-703 (1992); (iv) Inmunización con Células de Melanoma Transfectado con Interleucin-2. Un estudio de Fase I-II en pacientes con Melanoma Metastático, Human Gene Therapy 4, p. 323-330 (1993); (v) Terapia de Cáncer con Genes: Un estudio piloto de Fibroblastos Modificados de Genes IL-4 mezclados con Tumor Autólogo para Evocar una Respuesta Inmune, Investigadores Principales M.T.

Lotze e I. Rubin, Human Gene Therapy 5, p. 41-55 (1994) (melanoma, carcinoma de células renales, pecho, colon) ; (vi) Se aprobó un protocolo el 17 de Febrero de 1995 para cáncer de colon que combina células de tumores más fibroblastos preparados por ingeniería para expresar IL-2 (San Diego Regional Cáncer) ; (vii) Estudio de Fase I de Células de Neuroblastoma Autólogas modificadas por genes de citocinas para el tratamiento de Neuroblastomas en Retroceso/Refractarios; Investigador Principal: M.K. Brenner; Aprobación RAC No. 9206-018; (viii) Estudio de Fase I de Inyecciones de Células de Tumor Autólogas No Replicantes usando Células Preparadas con o sin Transducción de Genes del Factor Estimulante de Colonias de Granulocitos-Macrófagos en Pacientes con Carcinoma de Células Renales Metastático; Investigador Principal: J. Simons; Aprobación RAC No. 9303-040; (ix) Ensayo de la Fase I de Células de Tumores Autólogos con Gama Interferon Humano en Pacientes con Melanoma Maligno Diseminado; Investigador Principal: H. F. Seigler; Solicitud RAC No. 9306-043; (x) Estudio de Fase I de Células de Cáncer Transfectadas Expresando el Producto de Genes Interleucin-2 en Cáncer de Pulmón de Células Pequeñas de Etapa Limitada; (xi) Inmunización de Pacientes de Melanoma Maligno con Células de Melanoma Secretantes que expresan Antígenos Definidos de* Histocompatibilidad Alogénica; Investigador Principal: T. K. Das Gupta; Solicitud RAC No. 9309-056; y (xii) Vacunas de Tumor Autólogas Preparadas por Ingeniería Genética Produciendo Interleucin-2 para el Tratamiento de Melanomas Metastáticos; Investigador Principal: J. S. Economon; Solicitud RAC No. 9309-058. Estos protocolos se incorporan aquí como referencia en su totalidad. Ver también la solicitud de PCT publicada WO 93/07906 en donde un protocolo de terapia de cáncer se describe para células que expresan IL-2, y la solicitud de PCT WO 94/18995 en donde se describe un protocolo para administrar células de melanoma alogénicas secretando IL-2 (Aprobación RAC No. 9206-021) . Alguien hábil en el arte reconocerá que las secciones de aquí relativas a la selección de pacientes, dosis, evaluación de pretratamiento, terapia concurrente, y tratamiento de la toxicidad potencial son todas aquí aplicables. Generalmente, la dosis deseada es el número de células que serán efectivas para evocar una respuesta inmune protectora por el paciente en contra de las células de tumor. Por ejemplo, para tratar un paciente de 70 kg que tiene un tumor que pesa aproximadamente 150 gramos, se administrarían aproximadamente 5 x 107 hasta 5 x 108 células de tumor autólogas irradiadas o no irradiadas contenidas en un total de 5 a 10 dispositivos que tienen 40µl de paso que se describe en la solicitud de patente americana pendiente U.S. No. 8/179,860 presentada el 11 de enero de 1994, o el número de tales dispositivos necesario para contener el número deseado de células de tumor. Hasta un número similar de células libres irradiadas se puede administrar concurrentemente. Una reducción en el tamaño de los tumores presentes en el paciente, debe ser aparente dentro de alrededor de tres semanas hasta unos cuantos meses. La eliminación de las metastasas puede ser difícil de detectar.

El implante se puede dejar en el paciente durante un periodo de semanas para un efecto transitorio. Para el tratamiento de un tumor existente, preferiblemente el implante debe permanecer en el paciente mientras haya la posibilidad de existencia de un tumor. Para la prevención de los tumores, el implante debe permanecer en el paciente durante el tiempo que el paciente continúe en riesgo por el desarrollo de tumores. Uno o más de los implantes pueden separarse de tiempo en tiempo para evaluar la viabilidad de las células de tumor implantadas. Las células libres irradiadas se pueden administrar al momento del implante y readministrarse nuevamente después de que un periodo de tiempo haya transcurrido, de manera que las células originales libres /-' irradiadas fueran probablemente destruidas por el sistema inmune del paciente, aproximadamente de 2 a 6 semanas. 5 Si, como en una modalidad, se desea la viabilidad continua de las células de tumor, los dispositivos de implante se pueden extirpar y reemplazar con nuevos dispositivos que contengan células de tumores frescos si es necesario. Alternativamente, el implante puede ser 0 vaciado y recargado en su lugar, sin extirpación. Las células de reemplazamiento del tumor pueden ser células recolectadas al momento de la resección del tumor original y congelarse para su uso posterior si las células autólogas de tumor se administraran. 5 En el caso de la administración de células de tumor alogénicos, se seguirán lineamientos similares. Al menos algunos de los antígenos o factores solubles de las células de tumor del donador, corresponden 0 preferiblemente a aquellas encontradas en las células de tumor del paciente como se determina por la biopsia del tumor.

De conformidad con la presente invención donde se desee, 5 las células de tumor pueden resultar no tumorigénicas por irradiación, mediante tratamiento con mitomicina C u otros tratamientos conocidos en el arte. / Las líneas de célula humana preparadas por ingeniería 5 para expresar los antígenos específicos conocidos de los tumores humanos, se pueden crear y entonces admnistrar de conformidad con la presente invención. Ejemplos de tales antígenos de tumor conocidos incluyen MAGE, MART y mucinas. La patente americana U.S. No. 5,141,742 concedida a Brown et al., describe antígenos asociados al r **" melanoma. Nuevamente, el (los) antígeno (s) de las células administradas corresponden preferiblemente, al menos en parte, con aquellos de las células de tumor del paciente como se determina por la biopsia del tumor. La preparación de líneas de célula humana y la ingeniería de dichas células para expresar los antígenos deseados, involucra técnicas conocidas por aquellos hábiles en el arte. Las células preferiblemente son de un tipo que r " expresa eficientemente el antígeno deseado o factores solubles. La modificación genética de las células se puede hacer por una o más técnicas bien conocidas en el campo de la terapia de genes (Human Gene Therapy, Abril 1994, Vol. 5, p. 543-563). Una técnica comúnmente usada para suministrar el ADN extrínseco dentro de las células, involucra el uso de vectores retrovirales. Estos vectores pueden infectar grandes porcentajes de células blanco y se pueden integrar dentro del genoma de célula. Los vectores retrovirales se construyen para ser defectuosos / en la replicación en las líneas de célula seleccionadas, y por lo tanto, incapaces de efectuar las células no 5 transducidas. Otros factores virales que han sido propuestos o usados para suministrar el ADN dentro de las células incluyen el adenovirus, adenovirus asociado, virus de herpes y poliovirus. Los vectores retroviral y del adenovirus asociado son los propuestos más a menudo o 10 usados para terapia de genes ex vivo, esto es, entrega de r *- ADN dentro de células separadas del cuerpo del paciente.

Las técnicas de suministro no retroviral que se hari utilizado o propuesto para la terapia de genes incluyen 15 complejos ADN-ligando, técnicas de bombardeo de genes y electroporación, y lipofección. Bajo la mayoría de las condiciones, estas técnicas de entrega así como ciertos vectores virales tales como los vectores de adenovirus, no conducen hacia una integración significativa del ADN 20 en el genoma de la célula. Esto significa que las transformaciones estables de las células recipientes con el ADN extrínseco, ocurren con muy poca frecuencia. Dependiendo de las condiciones particulares, los métodos virales o no virales serían apropiados para la 25 introducción de genes dentro de las células que son entonces implantadas de conformidad con la presente invención. La manipulación genética de las células primarias de tumor han sido descritas previamente (Patel f et al., Human Gene Therapy 5, p. 577-584 (1994)).

El método del solicitante para la prevención del cáncer, es particularmente apropiado para los pacientes con alto riesgo de desarrollo de tumores; por ejemplo, aquellos individuos identificados por monitoreo genético, de estar en alto riesgo para el desarrollo de tumores. Como una terapia para los pacientes diagnosticados con cáncer, la terapia del solicitante es especialmente apropiada para los pacientes que se han sometido a una resección exitosa de tumor y pacientes que están con alto riesgo por la presencia de micrometastasas. 15 La cámara utilizada en la presente invención, evita el contacto directo célula a célula entre las células del sistema inmune del paciente y las células en la cámara.

** ~ La cámara preferida de la presente invención (figura 2) es un dispositivo que comprende dos membranas bicapa (1) rodeadas por una malla de poliéster (2) sónicamente soldadas en conjunto, con un puerto (3) para acceso del paso (4) . Cada bicapa comprende una membrana de PTFE de 5 µm, manufacturada por Gore, Flagstaff, Arizona, Producto No. L31324 y una membrana de PTFE de 0.45 µm manufacturada por Millipore, Bedford, Massachusetts, Producto No. SF1R848E1. En un extremo, existe un puerto de poliéster (PE 90 DI 0.8636 mm por DE 1.27 mm) para permitir el acceso al interior del dispositivo para las células cargantes. El dispositivo tiene un paso interior. 5 Este dispositivo se describe en la solicitud de patente copendiente, número de serie 8/179,860 presentada el 11 de enero de 1994, y las solicitud copendiente, número de serie 8/210,068 presentada el 17 de marzo de 1994. Estudios previos han mostrado que este dispositivo preferido tiene la ventaja (aunque no se requiere para r *'~ todas las modalidades de la presente invención) de poder proteger el tejido aloinjertado del rechazo inmune para periodos prolongados (Carr-Brendel et al., J. Cellular Biochem. 18A, p. 223 (1994) y Johnson et al., Cell Transplantation 3, p. 220 (1994)).

Otras cámaras que contienen células, las cuales aquellos hábiles en el arte pueden encontrar útiles en la presente invención incluyen: Microcápsulas de agarosa (Iwata et al., J. Biomed. Mater. Res. 26, p. 967-977 (1992); J. Bioact. And Comp. Polymers 3, p. 356-369 (1988), y Depuy et al., J. Biomed. Mater. Res. 22, p. 1061-1070 (1988)); Fibras huecas de XM50 (Winn et al.,. J. Biomed. Mater Res. 23, p. 31-44 (1989) y Altman et al., Proc. Of Third Meeting of ISAO, Supl.5, p. 776-779 (1981); Diabetes, 35, p. 625-633 (1986)); Alginato-polilisina (Wong et al., Biomat., Art. Cells and Inmob. Biotech. 19, p. 675-686 (1991)); Microcápsulas de alginato-polilisina (O'Shea et al., Biochim. et Biophy. Acta 804, p. 133-136 (1984), Sun et al., App. Biochem and Biotech. 10, p. 87-99 (1984), Chicheportiche et al., Diabetologia 31, p. 54-57 (1988) y Goosen et al., Patente americana U.S. No. 4,689,293, 25 de agosto de 1987; patente americana U.S. No. 4,487,758, 11 de diciembre de 1984; patente americana U.S. No. 4,806,355, 21 de febrero de 1989, y patente americana U.S. No. 4,673,566, 16 de junio de 1987); Quitosan-alginato (Me. Knight et al., J. Of Bioact . And Comp. Poly. 3, p. 334-355 (1988)); Poliacrilonitrilo u otras membranas de ultrafiltración en un dispositivo en forma de U (Moussy et al., Artif. Org. 13, p. 109-115 (1989), Lepeintre et al., Artif. Org. 14, p. 20-27 (1990), y Jaffrin y Reach, patente americana U.S. No. 4,578,191, 25 de marzo de 1986) ; Fibras huecas de poliacrilonitrilo (Aebischer et al., Biomat. 12, p. 50-56 (1991) y Lacy et al., Science 254, p. 1782-1784 (1991)); Cámaras de difusión de membranas de policarbonato grabadas en secuencia (Gates y Lazarus, Lancet, 17 de diciembre, p. 1257-1259 (1977) ) ; Dispositivos de membrana polimerizados de 2-hidroxietil metacrilato pHEMA (Ronel et al., J. Biomed., Mater., Res, 17, p. 855-864 (1983)); Microcápsulas de poliacrilatos (Douglas y Sefton, Biotech and Bioeng. 36, p. 653-664 (1990); Trans Am.Soc. Artif. ínter. Org.35, p. 791-799 (1989)); Fibras huecas de copolímero acrílico (Lanza et al., Proc. Nati. Acad. Sci. /-• 88, p. 11100-11104 (1991)); película de copolímero poliol WO 93/22427; Dispositivos intravasculares (Berguer, 5 patente americana U.S. No. 4,309,776, 12 de enero de 1982) y Gaskill, patente americana U.S. No. 4,911,717, 27 de marzo de 1990) ; membranas entrecruzadas catiónicas- aniónicas, p.ej., quitosán y ácido poliglutámico o poliaspártico (Jarvis, patente americana U.S. No. 0 4,803,168, 7 de febrero de 1989); capa puente enlazante que conforma una superficie de un material multifuncional y capa de polímero semipermeable para encapsulación de células (Cochrum, patente americana U.S. No. 4,696,286, 29 de septiembre de 1987) ; Dispositivos de perfusión 5 vascular (Chick et al., patente americana U.S. No. 5,002,661, 26 de marzo de 1991); Encapsulación de polímero de macrómero, Deasi et al. WO 93/16687; Microcápsulas entrecruzadas de alginato de bario (Zekorn et al., Acta. Diabetol. 29, p. 99-106 (1992)); otros 0 dispositivos de membrana (Ward et al., Fourth World Biomat. Con., Berlín, p. 152, 24-28 de abril 1992)); otros dispositivos de encapsulación (Aebischer, WO 94/07999 patente americana U.S. No. 5,283.187; WO 93/00128 WO 93/00127; WO 93/00063; WO 92/19195; WO 5 91/10470 WO 91/10425; WO 90/15637; WO 90/02580 y dispositivos de implante celular: patentes americanas Nos. US. 4,241,187; 4,892,538; y 4,391,909. "Transplante de Isleta con Inmunoaislamiento" , Lanza, R.P. et al., 41 Diabetes, p. 1503 (1992) , revisa diversas cámaras usadas para contener células; como hacen Langer y Vacanti en "Ingeniería de Tejidos", 260 Science, p. 920 (1993). En caso de que las cámaras particulares descritas arriba, no sean los suficientemente permeables para permitir el ingreso y egreso del material subcelular, hacia y desde las células de tumor implantadas, alguien hábil en el arte entenderá que la permeabilidad de dichas cámaras se puede alterar, sin cambiar el diseño básico de tales cámaras .

Adicionalmente, los solicitantes consideran que otros dispositivos, no mencionados aquí, se pueden utilizar en la invención si tienen la propiedad de alojar células implantadas de manera tal que eviten el contacto directo de células injertadas y células inmunes del huésped, y permitan la liberación de material antigénico subcelular que estimule la respuesta inmune del paciente. Ya que los solicitantes no han aislado o caracterizado el material subcelular que provoca la respuesta inmune del paciente, consideran que incluye moléculas inmunogénicas (antígenos) desprendidas o secretadas desde las células de tumor contenidas. Las células de tumor desprenden muchos antígenos, no solamente los antígenos asociados al tumor. Esto se piensa que acumula un alto número de macrófagos y células que presentan antígenos al sitio que a su vez, suministra una respuesta inmune aumentada. La administración de una molécula inmunopotenciante, tal como una citocina, aumenta adicionalmente las respuesta inmune en el sitio.

La invención del solicitante proporciona diversas ventajas sobre las inmunoterapias actuales de cáncer. Muchos de los estudios publicados a la fecha, requieren la administración única de células irradiadas "libres"; esto es, células no contenidas en una cámara. Las células no irradiadas como una precaución de seguridad para evitar que proliferen y provoquen tumores adicionales. Sin embargo, son sacadas del cuerpo dentro de 1 a 2 semanas, proporcionando solamente una dosis transitoria, y en algunos casos, la irradiación puede interferir con la producción de algunas citocinas preparadas por ingeniería dentro de las células. En la invención del solicitante, no siempre es necesario irradiar las células contenidas. Aún cuando se usen las células irradiadas, estas permanecen probablemente como inmunógenos dentro de la cámara, por periodos de tiempo mayores que las células irradiadas libres del arte previo. El uso de una cámara del solicitante, ofrece la seguridad de secuestrar las células de tumor de manera que, a diferencia del arte previo, las células libres de tumor no necesitan introducirse dentro de los pacientes. Más aún, en una modalidad preferida usando la cámara preferida, la cámara por sí misma, actúa como un adyuvante para los materiales antígenos subcelulares. Los macrófagos se atraen hacia la superficie externa del dispositivo, y así, están en una posición de recoger materiales antigénicos cuando se desprenden de las células de tumor dentro del dispositivo.

Ejemplos de las células preparadas por ingeniería, que pueden usarse de conformidad con la presente invención, incluyen células de tumor preparadas por ingeniería para segregar citocinas (Sobol et al., WO 95/07105; Addision et al., Gene Therapy Weekly, p. 19 (Noviembre 1994)); células preparadas por ingeniería para expresar antígenos extraños para incrementar la actividad antitumoral celular y/o humoral (Plantz et al., PNAS 90, p. 4645 (1993) (genes de histocompatibilidad alogénicos) ; Gansbacher WO 94/18995 (células de tumores alogénicos, preparadas por ingeniería para expresar citocinas, moléculas de adhesión, factores conestimulatorios o antígenos asociados a tumores); Allione et al., Gene Therapy Weekly, p. 20 (Enero 1995) (células de adenocarcinoma mamario preparadas por ingeniería para expresar IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, TNFoc, CMSCF) ; Hock et al., Gene Therapy Weekly, p. 22 (enero 1995) (MHC de Clase II expresantes de neuroblastomas de murina) (aunque este enfoque se piensa que requiere un contacto directo célula a célula, el MHC desprendido sería una molécula inmunopotenciante de conformidad con la presente invención) ) ; y coexpresión en células derivadas de tumor de moléculas inmunopotenciantes y un gen suicida (Frost et al. , WO 92/05262) .

Globalmente, los siguientes ejemplos y datos presentados en las figuras, demuestran la efectividad de la invención del solicitante en una diversidad de situaciones experimentales diferentes. Cuando una cámara que contiene células de tumor se usa como una vacuna (esto es, antes de la formación del tumor) puede ser efectiva para prevenir la formación del tumor tanto como en un 100% en animales experimentales. Cuando se implanta en presencia de un microtumor, se demuestra la efectividad en más de un 75% de los animales probados. Finalmente, cunado se combina con resección quirúrgica de tumores grandes, la implantación de dispositivos evitó el recrecimiento de tumores en un 60% de los animales implantados.

Tomadas en conjunto, diversas conclusiones se pueden obtener de estos datos. Primero, al revisar todos los ejemplos, se puede concluir que aunque la cura no se alcanza en 100% de los animales, es sin embargo mejor tener una cámara que no tenerla. En el peor de los casos, los tumores se desarrollan más lentamente, y en el mejor, los animales nunca desarrollan un tumor; en ningún caso los animales desarrollan tumores más rápidamente o tienen tumores más grandes en presencia de una cámara que los animales de control . Los datos demuestran adicionalmente que cuando se utiliza la cámara, las células de tumor sin modificación genética se pueden usar efectivamente para generar una respuesta inmune anti-tumor. Las células de tumor en una cámara son mucho más efectivas que las células libres de tumor al generar esta respuesta inmune y las células irradiadas en la cámara parecen ser más efectivas que las células vivientes. Se supone que esto se debe a un enriquecimiento de la inmunogenicidad de las células debido a los cambios inducidos por irradiación en las células.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustración de las diversas modalidades de la invención, y no deben interpretarse como limitativos del alcance de la invención.

Ejemplo l : Modelo de Adenocarcinoma en Roedores Líneas de célula usadas: MCA-38 (una donación generosa del Dr. Augusto Ochoa, NCI) es un carcinoma de colon de murino <3ue se puede mantener in vivo o in vi tro . Para el mantenimiento in vi tro, las células crecieron en RPMI (Sigma Chemical Company, St . Louis MO) complementadas con HEPES lmM , 1% de aminoácidos no esenciales, 1% de L-glutamina, 1% de piruvato de sodio, 1% de penicilina/estreptomicina (Sigma), 0.1% de ß-mercaptoetanol y 10% de suero bovino fetal (Irvine Scientific, Irvine CA) . Las células se pasaron rutinariamente por tripsinización dos veces a la semana.

Animales usados: Para la mayoría de los experimentos, se utilizaron ratones hembra C57/B6 (Harían Sprague Dawley) . Donder se indica, ratones atímicos (harían Sprague Dawley) se usaron. Todos los animales se mantuvieron de conformidad con los procedimientos normales para cuidado y uso de animales de laboratorio .

Dispositivo : Estos estudios utilizaron dispositivos porteados sónicamente sellados de 4.5µl ó 20µl, empleando membranas laminadas descritas arriba, y en la solicitud de patente americana U.S. Serie 8/179,860. Los dispositivos se esterilizaron durante la noche en etanol al 70% y después se separó el etanol mediante tres lavados en solución salina estéril (Baxter Scientific -* Products, Waukegan IL) .

Implantación de dispositivos : Para carga, se tripsinizaron células MCA-38, y se lavaron y peletizaron por centrifugación. Excepto en donde se indica, las células MCA-38 se encapsularon en dispositivos porteados de 4.5 µl al cargar 10 células en 3 µl dentro del paso central del dispositivo usando una jeringa Hamilton. El dispositivo más grande se cargó con 107 células en 20 µl . Los dispositivos se sellaron con un tapón de silicón dispuesto usando una aguja y jeringa de calibre 23. El puerto del dispositivo se llenó completamente con silicón y el puerto se cortó a la mitad. El puerto restante se remojó brevemente en 70% de etanol. Los dispositivos cargados se lavaron a través de tres cambios de solución salina. Los dispositivos se colocaron en RPMI 1640, suministrado como se describió arriba y se incubaron a 37°C hasta la implantación.

Los animales que recibieron los implantes, se anestesiaron mediante inyección intraperitoneal de 0.2- 0.3 ml de la mezcla de 1 ml de cetamina (Fort Dodge Laboratories, Fort Dodge, Iowa) y 0.75 ml de xilazina (Rugby Laboratories, Rockville Center, Nueva York) diluida en 1 ml de solución salina estéril. El área abdominal se limpió con betadina y se hizo una incisión /" ventral de línea media. Se preparó una pequeña bolsa subcutánea usando un he ostato, a cada lado de la 5 incisión de línea media y un dispositivo de 4.5 µl se insertó dentro de cada bolsa. Una vez que los dispositivos se insertaron, la incisión se cerró utilizando grapas estériles y el área abdominal se limpió nuevamente con betadina. Al usar el dispositivo de 20 µl, 0 solamente se insertó uno.

Desafío del tumor: En los tiempos indicados, los animales se desafiaron con una inyección de células MCA-38 sin encapsular. Para los desafíos después de la implantación, 5 se diluyeron 10 de células MCA-38 frescas tripsinizadas en 50 µl de solución salina estéril y se inyectaron dentro del músculo de la pata trasera derecha. En el caso del redesafío, se hizo la segunda inyección de 106 células dentro de la pata trasera derecha y en donde era 0 aplicable, se hizo la tercera inyección de 106 células dentro de la pierna derecha. Para el desafío al tiempo del implante, los animales se desafiaron con 103 de células libres de MCA-38. Los estudios preliminares mostraron que tan poco como 500 células libres MCA-38 son 5 sufcientes para la formación de tumores.

Histología: Al término de cada experimento, los dispositivos implantados se recuperaron, se fijaron en glutaraldehido, se seccionaron y analizaron por decoloración de hematoxilina y eosina, para la presencia de células de tumor sobrevivientes dentro del dispositivo, utilizando un microscopio de luz.

Supervivencia de células MCA-38 dentro de 1 os dispositivos d= inmunoaislamiento : Para evaluar la capacidad del MCA-38 para sobrevivir dentro del dispositivo en ausencia de un ataque inmune, se encapsularon 10 o 10 células dentro de dispositivos de 4.5 µl e implantados dentro de ratones atímicos. Al final del periodo de implantación de tres semanas, los dispositivos se explantaron, se procesaron histológicamente, y se analizaron para la presencia de tejido viviente. Las células MCA-38 sobrevivieron dentro del dispositivo. En todos los casos, se presentó un área necrótica substancial en el centro del dispositivo, pero las células que aparecían saludablemente se presentaron a lo largo de la periferia. La amplitud del área necrótica dependía del número inicial de células cargadas dentro del dispositivo (esto es, mayor necrosis en dispositivos que contenían 10 células que en aquellos que contenían 104 células) .

Uso de dispositivos conteniendo células MCA-38 como una vacuna de tumor : Ratones C57/B6 singénicos, se implantaron con dos dispositivos cada uno conteniendo 10 células MCA-38 durante tres o cuatro semanas. Estos animales fueron después puestos en desafío con una inyección de 10 células de MCA-38 como se describió arriba. Como se muestra en la Figura 3, 0/8 animales en dos experimentos desarrollaron tumores dentro de diez días a partir de la inyección. Dispositivos vacíos implantados dentro de los ratones, no los protegieron contra un desafío subsecuente con células libres MCA-38.

Cinco de estos animales recibieron un segundo desafío de 106 células, 8-11 semanas después del implante inicial. En este caso, 4/5 de los animales implantados, permanecieron libres de tumores en ambos sitios del implante; una vez más, todos los animales de control desarrollaron tumores en el sitio de la inyección. Un animal experimental desarrolló un tumor en el sitio de la segunda inyección, este animal se implantó con solamente un dispositivo.

Tres de los animales que permanecieron libres de tumores, se les proporcionó un tercer desafío siete meses después de que se implantaron los dispositivos. Para dos de los animales, los dispositivos subcutáneos se separaron antes de que se diera el desafío del tumor, el tercer animal se desafió con los dispositivos permaneciendo en su lugar. El animal con los dispositivos, permaneció libre de tumores después del tercer desafío, mientras que a ambos animales que se les retiraron los dispositivos, desarrollaron tumor, así como los animales de control que nunca habían recibido un dispositivo. Sin embargo, mientras que los animales que tenían sus dispositivos separados desarrollaron tumores, lo hicieron mucho más lentamente que los animales de control. Los controles desarrollaron tumor 10 días después del desafío. Uno de los animales experimentales desarrolló tumor 25 días después del desafío y el segundo desarrolló tumor 36 días después del desafío. La histología de los dispositivos separados, reveló que > del 90% de las células estaban muertas y que había una calcificación extensiva del material dentro del dispositivo. Sin embargo, había evidencia de unas cuantas células vivientes remanentes. Estos resultados sugieren que el dispositivo por sí mismo no media el efecto antitumor, ya que los animales cuyos dispositivos fueron retirados, no desarrollaron tumores a la misma velocidad que los de control los cuales nunca se les habían implantado dispositivos. Al mismo tiempo, el dispositivo parece ser necesario para mantener la protección inmunológica en contra del tumor,- mientras que los tumores aparecen más lentamente en animales cuyos dispositivos se han separado, parece no haber una inmunidad de largo plazo en animales que han sido implantados con un dispositivo en ausencia de aquellos /-*- dispositivos .

Uso de dispositivos que contienen células MCA- 8 como una terapia de tumor: En otra serie de experimentos, los animales se desafiaron con células MCA-38 libres al tiempo de implante de dispositivos que contenían células MCA-38. En este caso, los animales fueron desafiados con 0 103 células libres de tumor. En un experimento se pudo retrasar significativamente la formación de tumores (Figura 4) p=0.036. En este experimento, un animal estaba libre de tumores al momento del sacrificio en el día 32. En un segundo experimento, todos los animales sin 5 dispositivo habían desarrollado tumores para el día 16, tiempo en el cual solamente 1/10 de los animales implantados habían desarrollado un tumor en el sitio del desafío. Estos resultados sugieren que la implantación de un dispositivo que contiene células de tumor, puede 0 retrasar o evitar el crecimiento de tumores introducidos al momento de la implantación.

Ejemplo : Modelo Canino Animales Usados : Un perro en la instalación animal de Baxter (142-3) se identificó con diversas masas subcutáneas que estaban en tamaño desde cabeza de alfiler hasta alrededor del tamaño de un cuarto. El análisis histológico diagnosticó estas masas como quistes de inclusiones epiteliales. Un segundo perro (4008) se compró a un vendedor externo. Este perro tenía un tumor mamario de aproximadamente 10 cm. de diámetro, que había sido sometido a biopsia y diagnosticado como un carcinoma mamario intraductular .

Dispositivo: Estos estudios utilizaron el dispositivo porteado sónicamente sellado de 40 µl, empleando las membranas laminadas descritas arriba y en la solicitud de patente americana U.S. serie No. 8/179,860. Los dispositivos se esterilizaron durante la noche en 70% de etanol y entonces se separó el etanol mediante tres lavados en solución salina estéril (Baxter Scientific Products, Waukegan Illinois) .

Implantación de los dispositivos: Se anestesiaron perros mediante métodos normales. Se afeitó el área alrededor de los tumores. En el caso del perro 142-3, la masa mayor se extirpó quirúrgicamente y se colocó dentro de la solución salina estéril. La masa se cortó en piezas pequeñas, usando dos pares de tijeras quirúrgicas. Las piezas cortadas en pedazos se cargaron dentro del dispositivo de inmunoaislamiento como sigue: 80 µl de tejido asentado por gravedad se tomó dentro de una jeringa Hamilton. La aguja de la jeringa se insertó dentro del puerto del y- dispositivo y los contenidos se vaciaron dentro del paso del dispositivo. Los dispositivos se sellaron con un tapón de silicón dispuesto usando una jeringa y aguja calibre 23. El puerto del dispositivo se llenó completamente con silicón y el puerto se cortó por la mitad. Se preparó una pequeña bolsa usando un hemostato, a cada lado del sitio del cual se extirpó el tumor, y se insertó un dispositivo dentro de cada bolsa ( se implantaron un total de dos dispositivos) . Una vez que los dispositivos se insertaron, se cerró la incisión y se suturó, y el área abdominal se limpió nuevamente con betadina.

En el caso del perro 4008, alrededor del 95% de la masa del tumor fue extirpada quirúrgicamente, con la cauterización de los vasos sanguíneos involucrados. La incisión fue entonces suturada y una medición de la línea base del tumor remanente fue tomada. El tumor extirpado se cortó abierto y varias piezas de 0.5 cm de diámetro se separaron a diversas profundidades. Estas piezas fueron cortadas adicionalmente usando dos pares de tijeras quirúrgicas. Las piezas cortadas en pedazos, se cargaron 5 dentro de ocho dispositivos como se describió arriba. Cuatro incisiones subcutáneas ventrales pequeñas, se hicieron de forma dorsal al sitio desde el cual el tumor había sido extirpado, y se insertaron dos dispositivos /-"""-*- dentro de cada incisión. Las incisiones fueron entonces suturadas y el área abdominal limpiada con betadina. 5 Monitoreo d= los animales: Las masas remanentes en el perro 142-3 se midieron 2 a 3 veces por semana. Las mediciones se tomaron en dos dimensiones y se usaron para calcular el área total superficial de cada masa. Las 0 mediciones duplicadas se efectuaron por medios de dos técnicos diferentes, y los valores se promediaron por cada punto de tiempo. Similarmente, el tumor remanente en el perro 4008, se midió tres veces en una semana en dos dimensiones . 5 Siguiendo la extirpación de la masa más grande tiel perro 142-3, y la inserción del dispositivo que contenía el tejido de la masa extirpada, dos de los cuatro crecimientos restantes mostraron una dramática 0 disminución en tamaño (Figura 5) como fue determinado por dos mediciones independientes. Los otros dos, que fueron morfológicamente distintos, no mostraron cambio en tamaño. Esta disminución en tamaño en las masas restantes, ocurrió sin alguna manipulación adicional del 5 animal .

El tamaño del tumor restante en el perro 4008, parecía incrementarse incialmente, pero esto fue probablemente debido al edema resultante del trauma quirúrgico (incremento notorio en el día 7, Figura 6) . Posteriormente, hubo una disminución estable en el tamaño del tumor restante como se determinó por dos conjuntos de mediciones independientes con algún nivelamiento a los >30 días después de la cirugía.

Ejemplo 3: Pequeños Tumores Pre-existentes Líneas de célula empleadas: MCA- 38 es un carcinoma de colon de muri.no, que se puede mantener in vivo o in vi tro . Para su mantenimiento in vi tro, las células crecieron en RPMI (Sigma Chemical Company, St . Louis MO) complementada con lmM de HEPES, 1% de aminoácidos no esenciales, 1% de L-glutamina, 1% de piruvato de sodio, 1% de penicilina/estreptomicina (Sigma), 0.1% de P-mercaptoetanol y 10% de suero bovino fetal (Irvine Scientific, Irvine CA) . Las células se pasaron rutinariamente por tripsinización dos veces a la semana.

Animales usados: Hembras C57/B6 (Harían Sprague Dawley) se usaron. Todos los animales se mantuvieron de acuerdo con los procedimientos normales para el cuidado y uso de animales de laboratorio.

Dispositivo de Inmunoaialamien n: Estos estudios utilizaron dispositivos porteados sellados sónicamente de 4.5 µl , empleando membranas laminadas como se describen en las solicitudes de patente copendientes americanas U.S. Nos. 7/735,401 y 7/861,512. Los dispositivos se esterilizaron durante la noche en 70% de etanol y entonces el etanol se separó mediante tres lavados en solución salina estéril (Baxter Scientífic' Products, Waukegan IL) Implantación de dispositivos: Para carga, se tripsinizaron las células MCA-38, lavaron y ' peletizaron por centrifugación. Excepto donde se indicó, 106 células MCA-38 se encapsularon dentro de dispositivos porteados de 4.5 µl al cargar 3 µl de las células peletizadas dentro del paso central del dispositivo de inmunoaislamiento usando una jeringa Hamilton.

En donde se indicó, las células se expusieron a 3500 rads antes de cargarse. Los dispositivos se sellaron con un tapón de silicón dispuesto utilizando una jeringa y aguja calibre 23. El puerto del dispositivo se llenó completamente con silicón y el puerto se cortó por la mitad. El puerto restante se remojó brevemente en etanol al 70%. Los dispositivos cargados se lavaron a través de tres cambios de solución salina. Los dispositivos se colocaron en RPMI 1640 proporcionada como se describió anteriormente e incubada a 37°C hasta la implantación.

Los animales que recibieron los implantes, se anestesiaron mediante una inyección intraperitoneal de 0.2-0-3 ml de la mezcla de 1 ml de cetamina y 0.75 ml de rompum diluida en 1 ml de solución salina estéril. El área abdominal se limpió con betadina y se realizó una incisión ventral de línea media. Se preparó una pequeña bolsa usando un hemostato, en cada lado de la incisión de línea media y se insertó un dispositivo dentro de cada bolsa. Una vez que los dispositivos se insertaron, se cerró la incisión usando grapas estériles y el área abdominal se limpió nuevamente con betadina.

Inyección de Las células libres irradiadas: Al momento del implante, se les proporcionó a algunos animales experimentales, una inyección de células de tumor libres irradiadas. Para irradiación, las células se prepararon como se describió arriba para carga. Las células se suspendieron a una concentración de 10 células en 50 ml . Las células recibieron 3500-4000 rads de una fuente de cobalto 60. Se inyectaron 106 células.

Desafío del tumor: Para los tumores iniciando antes del implante, se inyectaron animales con 10 células MCA-38 libres, 3-7 días antes de la implantación. Se hicieron inyecciones ya sea por inyección intramuscular dentro de la pata trasera derecha o dentro del espacio dorsal subcutáneo. Los estudios preliminares han mostrado que tan pocas como 500 células libres MCA-38 son suficientes para la formación de tumores. En el caso del segundo desafío que siguió al implante, se realizó una segunda inyección dentro de la pata trasera izquierda.

Tratamiento d= tumores pre-existßntes : Se inyectaron animales con 103 células de tumor libres, tres días antes de su implantación. Al momento del implante, recibieron dos dispositivos conteniendo células MCA-38 irradiadas y también se les dió una inyección de 106 células de tumor libres irradiadas, de forma exterior a los dispositivos. Como se muestra en la Figura 7, ninguno de los cinco animales tratados con células irradiadas tanto adentro como afuera del dispositivo, desarrollaron tumores en los primeros 90 días. En el día 90, dos de estos animales se desafiaron con 10 células de tumor, uno de estos dos animales desarrolló un tumor a partir de este desafío. Todos los otros animales han permanecido libres de tumor por >150 días. Como se ilustró en la Figura 8, este tratamiento trabaja mejor con la combinación de células irradiadas en el dispositivo y una inyección de células libres irradiadas fuera del dispositivo. Aunque se permite alguna protección al administrar las células de tumor no irradiadas en el dispositivo, en combinación con las células libres irradiadas, es menos efectivo que administrar las células irradiadas en el dispositivo en 5 combinación con las células libres irradiadas. La inyección de células libres irradiadas solamente, no tiene efecto sobre el desarrollo de tumores.

Cuando los tumores se iniciaron en el espacio subcutáneo 0 dorsal, la implantación de los dispositivos que contenían las células irradiadas junto con una inyección de células libres irradiadas, pudo rescatar a 60% de los animales - tratados ( todos los animales sin tratamiento desarrollaron tumor en el sitio en donde los tumores 5 originales se iniciaron) (Figura 9) .

Ejemplo 4: Terapia con dispositivo después de la -..„_ resección del tumor 0 Líneas de células usadas: El MCA-38 es un carcinoma de colon de murino que se puede mantener in vi vo o in vi tro . Para el mantenimiento in vi tro , las células crecieron en RPMI (Sigma Chemical Company, St . Louis MO) complementadas con HEPES lmM, 1% de aminoácidos no 5 esenciales, 1% de L-glutamina, 1% de piruvato de sodio, 1% de penicilina/estreptomicina (Sigma), 0.1% de P- mercaptoetanol y 10% de suero bovino fetal (Irvine Scientific, Irvine CA) . Las células se pasaron rutinariamente por tripsinización dos veces a la semana.

Animales usados : Se utilizaron hembras C57/B6 (Harían Sprague Dawley) . Todos los animales se mantuvieron de conformidad con los procedimientos normales para el cuidado y uso de animales de laboratorio.

Dispositivo de Inmunoaislami ent : Estos estudios '* utilizaron los dispositivos porteados sónicamente sellados de 4.5 µl, empleando membranas laminadas descritas en la solicitud de patente americana copendiente U.S. Nos. 7/735,401 y 7/861,512. Los dispositivos se esterilizaron durante la noche en etanol al 70% y después el etanol se separó mediante tres lavadas en solución salina estéril (Baxter Scientific Products, Waukegan IL) Implantación d= L?S dispositivos: Para carga, se tripsinizaron las células MCA-38, se lavaron y peletizaron por centrifugación. Excepto en donde se indicó, se encapsularon 10 células MCA-38 dentro de los dispositivos porteados de 4.5 µl, al cargar 3 µl de células peletizadas dentro del paso central del dispositivo de inmunoaislamiento usando una jeringa Hamilton. Los dispositivos se sellaron con un tapón de silicón dispuesto utilizando una aguja y jeringa de calibre 23. El puerto del dispositivo se llenó completamente con silicón y el puerto se cortó por la mitad. El puerto remanente se remojó brevemente en 70% de etanol. Los dispositivos cargados se lavaron mediante tres cambios de solución salina. Los dispositivos se colocaron en RPMI 1640 complementado como se describió arriba e incubado a 37°C hasta implantación.

Los animales que recibieron los implantes se anestesiaron mediante una inyección intraperitoneal de 0.2-0-3 ml de mezcla de 1 ml de cetamina y 0.75 ml de rompum diluida en 1 ml de solución salina estéril. El área abdominal se limpió con betadina y se hizo una incisión ventral de línea media. Se preparó una pequeña bolsa usando un hemostato a cada lado de la incisión de línea media y se insertó un dispositivo dentro de cada bolsa. Una vez que los dispositivos se insertaron, se cerró la incisión usando grapas estériles y se limpió el área abdominal con betadina nuevamente.

Desafío del tumor: Para iniciar los tumores, se inyectaron los animales con 105 células MCA-38 libres, 3-7 días antes de la implantación. Las inyecciones se realizaron dentro del espacio subcutáneo dorsal. Los estudios preliminares han mostrado que tan pocas como 500 células MCA-38 libres son suficientes para la formación de tumor .

Uso de un dispositivo d= inmunoaislamiento conteniendo células MCA- 8 como una terapia de tumor para tratamiento siguiendo la resección del tumor: El protocolo para este experimento se describe en la Figura 10. Brevemente, se inyectaron animales con 10 células en el espacio subcutáneo dorsal y se monitorearon, hasta que se observaron tumores palpables. En el día 10, los tumores se retiraron quirúrgicamente de todos los animales. La mitad de los animales (n=5) no recibieron tratamiento adicional. La otra mitad (n=5) se implantaron con dos dispositivos cada uno conteniendo 10 células no irradiadas de MCA-38. Los dispositivos se implantaron subcutáneamente en el lado ventral . Ambos grupos de animales se monitorearon para el redesarrollo de tumores en el sitio original del tumor. Como se muestra en la Figura 11, todos los animales de control (sin implantes) redesarrollaron tumores en el sitio original del tumor dentro de treinta días a partir de la cirugía. Mientras que dos de los animales con implantes también redesarrollaron tumores, tres no lo hicieron y han permanecidos libres de tumor durante >180 días. Las diferencias entre estos grupos son altamente significativas (p<0.05).

Ejemplo 5: Modelo de Melanoma en Roedores Líneas de célula usadas: El B16 es un melanoma de murino que puede mantenerse in vivo o in vi tro . Para el mantenimiento in vi tro, las células crecieron en RPMI (Sigma Chemical Company, St . Louis MO) complementadas con lmM de HEPES, 1% de aminoácidos no esenciales, 1% de L-glutamina, 1% de piruvato de sodio, 1% de penicilina/estreptomicina (Sigma), 0.1% de P-mercaptoetanol y 10% de suero bovino fetal (Irvine Scientific, Irvine CA) . Las células se pasaron rutinariamente por tripsinización dos veces a la semana.

Animales usados: Se usaron hembras C57/B6. Todos los animales se mantuvieron de conformidad con los procedimientos normales para el cuidado y uso de animales de laboratorio.

Dispositivo dS Inmunoaislamiento : Estos estudios utilizaron los 4.5 µl sónicamente sellados, empleando membranas laminadas descritas en la solicitud de patente americana copendiente U.S. serie Nos. 7/735,401 y 7/861,512. Los dispositivos se esterilizaron durante la noche en etanol al 70% y entonces el etanol se separó mediante tres lavados en solución salina estéril (Baxter Scientific Products, Waukegan IL) .

Implantación de los dispositivos: Para carga, las células B16 se tripsinizaron, lavaron y peletizaron por centrifugación. Excepto donde se indicó, 10 células B16 se encapsularon dentro de dispositivos porteados de 4.5 µl al cargar 3 µl de las células peletizadas dentro del paso central del dispositivo de inmunoaislamiento usando una jeringa Hamilton. Los dispositivos se sellaron con un tapón de silicón dispuesto usando una jeringa y aguja calibre 23. El puerto del dispositivo se llenó completamente con silicón y el puerto se cortó a la mitad. El puerto restante se remojó brevemente en etanol al 70%. Los dispositivos cargados se lavaron mediante tres cambios de solución salina. Los dispositivos se colocaron en RPMI 1640 complementado como se describe arriba e incubado a 37°C hasta la implantación.

Los animales recibiendo los implantes, se anestesiaron mediante inyección intraperitoneal de 0.2-0-3 ml de la mezcla de 1 ml de cetamina y 0.75 ml de rompum diluida en 1 ml de solución salina estéril. El área abdominal se limpió con betadina y se efectuó una incisión ventral de línea media. Usando un hemostato, se preparó una bolsa pequeña a cada lado de la incisión de línea media y se insertó un dispositivo dentro de cada bolsa. Una vez que los dispositivos se insertaron, se cerró la incisión usando grapas estériles, y el área abdominal se limpió nuevamente con betadina.

Inyección de las células Lbres irradiadas.: Al momento del implante, a todos los animales con dispositivos implantados, se les proporcionó una inyección de 10s células B16 libres, cultivadas e irradiadas en el sitio del desafío. Para la irradiación, las células se prepararon como se describen arriba para la carga. Las células se suspendieron a una concentración de 106 células en 50 ml . Las células recibieron 3500-4000 rads de una fuente de cobalto 60.

Desafío del tumor: Cuatro semanas después de la implantación de los dispositivos, los animales se desafiaron con una inyección de células B16 no irradiadas. Para el desafío, se diluyeron 5 x 10s células B16 frescamente tripsinizadas en 50 µl de solución salina estéril e inyectadas dentro del músculo de la pata trasera derecha. Los estudios preliminares han mostrado que 104 células libres B16 son suficientes para la formación de tumores .

Uso de dispositivos d= J munQ JSl i n P que contienen tejidos de tumor derivados in vivo como una vacuna para el tumor: El protocolo para este experimento se describe en la Figura 12, brevemente, los animales se trataron en una primera ronda con cualquiera de los dispositivos que contenían células B16 no irradiadas, o mediante inyección de células B16 irradiadas y libres. Todos estos animales desarrollaron tumores después del desafío con 5 x 104 células B16. Los tumores de ambos grupos de animales se extirparon quirúrgicamente, se cortaron en aproximadamente piezas de 1 mm y se cargaron dentro de los dispositivos de 4.5 µl . Un tercer conjunto de dispositivos también se preparó conteniendo células B16 cultivadas no irradiadas. Estos tres conjuntos de dispositivos se implantaron dentro de un segundo conjunto de animales inocentes, y todos los tres grupos recibieron también una inyección de células B16 libres cultivadas e irradiadas; los animales de control no recibieron tratamiento. Los animales se desafiaron con células cultivadas B16 cuatro semanas después. Como se muestra en la Figura 13, uno de cada tres animales inmunizados con dispositivos que contenían tumores, crecieron en animales tratados solamente por inyección de las células libres irradiadas, que permanecieron libres de tumor por > 140 días después del desafío. Así, las células de tumor usadas para inmunizar a los animales inocentes no eran células cultivadas, sino más bien eran células sujetas a evolución mientras crecieron en la primera ronda de r- animales. Estos datos indican que las cámaras que contienen células de tumor que han estado sujetas a evolución, tales como las células de tumor humano autólogas, es probable que sean útiles para practicar la invención del solicitante.

Ejemplo 6: Tumor Ovariano de Roedores Líneas de célula usadas: El C57ov es un tumor murina que se puede mantener in vivo o in vi tro . Se identificó en el laboratorio en un animal al que se le aplicó una inyección I.V. de células B16 (5 x 105) . El Examen histológico sugiere que no fue derivado de B16. Para el mantenimiento in vi tro, las células crecieron en RPMI (Sigma Chemical Company, St . Louis MO) complementada con lmM de HEPES, 1% de aminoácidos no esenciales, 1% de L- glutamina, 1% de piruvato de sodio, 1% de penicilina/estreptomicina (Sigma), 0.1% de P- mercaptoetanol y 10% de suero bovino fetal (Irvine Scientific, Irvine CA) . Las células se pasaron rutinariamente por tripsinización dos veces por semana.

Animales usados: Se usaron hembras C57/B6. Todos los animales se mantuvieron de acuerdo con los procedimientos normales para el cuidado y uso de animales de laboratorio.

Dispositivo d= Inmunoaislamiento : Estos estudios utilizaron los 4.5 µl sónicamente sellados empleando membranas laminadas descritas en la solicitud de patente americana copendiente U.S. serie Nos. 7/735,401 y 7/861,512. Los dispositivos se esterilizaron durante la noche en 70% de etanol y entonces el etanol se separó mediante tres lavadas en solución salina estéril (Baxter Scientific Products, Waukegan IL) .

Implantación d= lOS dispositivos: Para carga, se tripsinizaron las células C57ov, lavaron y peletizaron por centrifugación. Excepto en donde se indicó, 106 células C57ov se encapsularon dentro de dispositivos porteados de 4.5 µl al cargar 3 µl de las células peletizadas dentro del paso central del dispositivo de inmunoaislamiento usando una jeringa Hamilton. Los dispositivos se sellaron con un tapón de silicón dispuesto usando una aguja y jeringa calibre 23. El puerto del dispositivo se llenó completamente con silicón y el puerto se cortó por la mitad. El puerto remanente se remojó brevemente en etanol al 70%. Los dispositivos cargados se lavaron mediante tres cambios de solución salina. Los dispositivos se colocaron en RPMI 1640 complementados como se describe arriba e incubados a 37°C hasta su implantación. *"*"• Los animales que recibieron los implantes, se anestesiaron mediante una inyección intraperitoneal de una mezcla de 0.2-0-3 ml de 1 ml de cetamina y 0.75 ml de rompum diluida en 1 ml de solución salina estéril. El área abdominal se limpió con betadina y se efectuó una incisión ventral de línea media. Se preparó una pequeña bolsa usando un hemostato, a cada lado de la incisión de línea media, y se insertó un dispositivo dentro de cada bolsa. Una vez que los dispositivos se insertaron, se cerró la incisión usando grapas estériles y se limpió el área abdominal nuevamente con betadina.

Inyección de células Lija es irradiadas: Al momento del implante, todos los animales con dispositivos implantados, se les proporcionó una inyección de 106 células C57ov libres, cultivadas e irradiadas en el sitio del desafío. Para la irradiación las células se prepararon como se describe arriba para carga. Las células se suspendieron a una concentración de 10 células en 50 µl . Las células recibieron 3500-4000 rads de una fuente de cobalto 60.

Desafío del tumor: Cuatro semanas después de la implantación de los dispositivos, los animales se desafiaron con una inyección de células C57ov no irradiadas. Para el desafío, se diluyeron 5 x 104 células C57ov frescas y tripsinizadas en 50 µl de solución salina estéril y se inyectaron dentro del músculo de la pata trasera derecha. Los estudios preliminares han mostrado que 103 células C57ov libres son suficientes para la formación del tumor.

Usa de dispositivos d= inmunoaislamiento conteniendo C57ov como una vacuna de tumor: Se implantaron animales con dos dispositivos cada uno, conteniendo 106 células irradiadas C57ov. Al momento de la implantación, los animales también recibieron una inyección de 10 células C57ov irradiadas. Los animales fueron desafiados con C57ov cuatro semanas después. Los resultados se muestran en la Figura 14, 60% de los animales han permanecido libres de tumores por >30 días.

Ya que la presente invención ha sido descrita en términos de métodos y dispositivos específicos, se entiende que variaciones y modificaciones ocurrirán para aquellos hábiles en el arte al considerar la presente invención.

Diversas modificaciones y variaciones de la invención, como se describe en los ejemplos ilustrativos anteriores, son posibles que ocurran por aquellos hábiles en el arte y consecuentemente, se colocan sobre los mismos solamente tales limitaciones como aparecen en las revindicaciones adjuntas. De conformidad, se pretende que las reivindicaciones adjuntas cubran todas las variaciones equivalentes que vienen dentro del alcance de la invención como está reivindicada.

Claims (26)

REIVINDICACIONES

1. Un dispositivo implantable para la prevención o tratamiento del cáncer, caracterizado porque comprende: a) una cámara implantable que contiene células de tumor, o células somáticas preparadas por ingeniería para expresar al menos un antígeno que corresponde al antígeno del tumor del paciente ; b) la cámara tiene una pared porosa para suministrar, en uso, una frontera porosa entre las células inmunes del paciente y las células contenidas; c) la porosidad de la frontera es suficiente para permitir que el material antigénico subcelular pase a través de la frontera, mientras que evita que las células contenidas y las células inmunes del paciente pasen a través de la frontera.

2. El dispositivo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende adicionalmente una fuente de moléculas inmunopotenciantes ya sea separadas o contenidas en la cámara.

3. El dispositivo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque las moléculas inmunopotenciantes son linfotoxina, factor inhibitorio de la migración de macrófagos (MIF) , GM-CSF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IFN-?, TNF, TGB-ß o un antígeno de tumor.

4. El dispositivo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la fuente de liposomas contiene las moléculas inmunopotenciantes .

5. El dispositivo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la fuente son moléculas inmunopotenciantes que contienen microcápsulas.

6. El dispositivo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la fuente son células somáticas también contenidas en la cámara, que han sido preparadas por ingeniería para expresar y secretar moléculas inmunopotenciantes .

7. El dispositivo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las células de tumor han sido preparadas por ingeniería para expresar y secretar moléculas inmunopotenciantes.

8. El dispositivo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las células de tumor son viables.

9. El dispositivo de conformidad con alguna de las reivindicaciones 1 a la 7, caracterizado porque las ***". células de tumor son no tumorigénicas. 5

10. El dispositivo de conformidad con alguna de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque las células de tumor han sido irradiadas.

11. El dispositivo de conformidad con la reivindicación 0 1, caracterizado porque las células de tumor son autólogas .

12. El dispositivo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las células de tumor son 5 alogénicas.

13. El dispositivo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las células de tumor son de una línea de células de tumor alogénicas. 0

14. El dispositivo implantable de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque está en combinación con segundas células de tumor administrables, que son no tumorigénicas 5 y no están contenidas en la cámara.

15. El dispositivo de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque las células de tumor son yJ autólogas . 5

16. El dispositivo de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque las segundas células de tumor son alogénicas.

17. El dispositivo de conformidad con la reivindicación 0 14, caracterizado porque las segundas células de tumor son de una línea de célula de tumor alogénica.

18. El dispositivo de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque al menos alguna de las segundas 5 células de tumor son preparadas por ingeniería para expresar y secretar moléculas inmunopotenciantes.

19. El dispositivo de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque las segundas células de tumor 0 son células humanas no tumorosas preparadas por ingeniería para expresar al menos un antígeno que corresponde al antígeno de las células de tumor del paciente . 5

20. El dispositivo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque las células de tumor son un método para prevenir o tratar un cáncer en una paciente que comprende células humanas no tumorosas preparadas por ingeniería para expresar al menos un antígeno que corresponde al antígeno de las células de tumor del paciente.

21. El dispositivo de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque las células humanas no tumorosas son células mesoteliales, epiteliales, endoteliales, hepatocitos, mioblastos o fibroblastos.

22. El dispositivo de conformidad con alguna de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la cámara comprende microcápsulas, fibras huecas, cámara de membrana de ultrafiltración, cámara de difusión de membrana o dispositivo de perfusión vascular.

23. El dispositivo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la cámara incluye medios de puerto para suministrar el acceso a la cámara.

24. El uso en la fabricación de un dispositivo implantable, caracterizado porque comprende una cámara que tiene una pared porosa para suministrar en uso, una forntera porosa la cual evita que las células inmunes del paciente pasen a través de la frontera mientras permiten que el material antigénico subcelular pase a través de la frontera, de células contenidas en la cámara e incapaces de pasar a través de la frontera para el propósito de tratar o prevenir el cáncer en un paciente, las células siendo células de tumor que tienen al menos un antígeno correspondiente al antígeno de las células de tumor del paciente, células humanas no tumorosas preparadas por ingeniería para expresar al menos un antígeno correspondiente al antígeno de las células de tumor del paciente, u otras células somáticas preparadas por ingeniería para expresar al menos un antígeno correspondiente al antígeno de las células de tumor del paciente .

25. El uso de conformidad con la reivindicación 24, para el propósito de tratar o prevenir un tumor sólido, un tumor metastático o cáncer leucémico.

26. El uso de conformidad con la reivindicación 24, pare el propósito de tratar o prevenir linfoma, melanoma, carcinoma de colon, carcinoma mamario, carcinoma de pulmón, fibrosarcoma, carcinoma renal o neuroblastoma.