MXPA96005550A - Metodo para detectar priones en una muestra, y animal transgenico utilizado para lo mismo - Google Patents

Abstract

La invención incluye un gen de PrP artificial, un animal transgénico que contiene al gen, y un ensayo en donde el animal transgénico se utiliza para detectar la presencia de priones patogénicos en una muestra,ópara diagnosticar una causa de muerte.

Description

MÉTODO PARA DETECTAR PRIONES EN ONA MUESTRA, Y ANIMAL TRANSGENICO UTILIZADO PARA LO MISMO Derechos del Gobierno El Gobierno de los Estados Unidos de Norteamérica puede tener ciertos derechos en esa solicitud de acuerdo con las Concesiones Números NS14069, AG02132, NS22786, AG08967 y AG10770 otorgadas por los Institutos Nacionales de Salud.

Campo de la Invención Esta invención se refiere en general a genes quiméricos, a métodos para ensayar, y a animales transgénicos utilizados en estos ensayos. De una manera más específica, esta invención se refiere a genes PrP artificiales y quiméricos, a muestras de ensayos para priones patogénicos, y a ratones transgénicos que contienen un gen PrP artificial ó quimérico.

Antecedentes de la Invención Los priones son patógenos infecciosos que causan encefalopatías espongiformes del sistema nervioso central en seres humanos y animales. Los priones son distintos de las bacterias, los virus y los viroides. La hipótesis predominante en el presente es que no es necesario un componente de ácido nucleico para la infectividad de la proteína del prión.

Además, un prión que infecta una especie de animal (por ejemplo, un ser humano) no infectará a otra (por ejemplo, un ratón) . Un paso importante en el estudio de los priones y las enfermedades que causan fue el descubrimiento y la purificación de una proteína designada como proteína de prión ("PrP") [Bolton y colaboradores, Science 218:1309-11 (1982); Prusiner y colaboradores, Biochemistry 21:6942-50 (1982); McKinley y colaboradores, Cell 35:57-62 (1983)]. Desde entonces los genes que codifican proteína de prión completos se han clonado, secuenciado y expresado en animales transgénicos. La PrPc es codificada por un gen huésped de una sola copia [Basler y colaboradores, Cell 46:417-28 (1986)], y normalmente se encuentra en la superficie externa de las neuronas. Una hipótesis de guía es que las enfermedades por priones resultan de la conversión de la PrPc en una forma modificada llamada PrPSc. Sin embargo, la función biológica y fisiológica real de la PrPc no se conoce. Parece que es necesaria la isoforma de raspadura de la proteína de prión (PrPSc) es necesaria tanto para la transmisión como para la patogénesis de las enfermedades neurodegenerativas transmitibles de animales y seres humanos. Ver Prusiner, S.B., "Molecular biology of prion disease" , Science 252:1515-1522 (1991). Las enfermedades priónicas más comunes de los animales son la raspadura de ovejas y cabras y la encefalopatía espongiforme bovina (BSE) de ganado [ ilesmith, J. y Wells, Microbiol. Immunol. 172:21-38 (1991)]. Se han identificado cuatro enfermedades priónicas de seres humanos: (1) kuru, (2) Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD) , (Enfermedad de Gerstmann-Strassler-Scheinker (GSS) , y (4) insomnio familiar fatal (FFI) [Gajdusek, D.C., Science 197:943-960 (1977); Medori y colaboradores, N. Enorl. J. Med. 326:444-449 (1992) ]. La presentación de enfermedades priónicas humanas como enfermedades esporádicas, genéticas e infecciosas, inicialmente daban un conundro que ha sido explicado por el origen genético celular de la PrP. La mayoría de los casos Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob son esporádicos, pero de aproximadamente el 10 por ciento al 15 por ciento se heredan como desórdenes dominantes autoso ales que son causados por mutaciones en el gen de PrP humano [Hsiao y colaboradores, Neurolocry 40:1820-1827 (1990); Goldfarb y colaboradores, Science 258:806-808 (1992) ; Kitamoto y colaboradores, Proc. R. Soc. Lond. (en impresión) 1994)]. La Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob iatrogénica ha sido causada por la hormona de crecimiento humana derivada a partir de pituitarias cadavéricas, así como de injertos de duramadre [Brown y colaboradores, Lancet 340:24-27 (1992)]. A pesar de numerosos intentos por ligar la Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob a una fuente infecciosa, tal como el consumo de carne de oveja infectada con raspadura, no se ha identificado ninguno hasta la fecha [Harries-Jones y colaboradores, J. Neurol. Neurosurq. Psychiatry 51:1113-1119 (1988)], excepto en los casos de la enfermedad y iatrogénicamente inducida. Por otra parte, el kuru, que durante muchas décadas devastó las tribus Fore y vecinas de las tierras altas de Nueva Guinea, se cree que se ha extendido por la infección durante el canibalismo ritualista [Alpers, M.P., Slow Transmissible Diseases of the Nervous System. Volumen 1, S.B. Prusiner y W.J. Hadlow, eds. (Nueva York: Academic Press), páginas 66-90 (1979)]. La transmisión inicial de la Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob a los primates experimentales tiene una rica historia, empezando con el reconocimiento por William Hadlow de la similitud entre el kuru y la raspadura. En 1959, Hadlow sugirió que los extractos preparados a partir de pacientes que morían de kuru, se inocularan en primates no humanos, y que observaran los animales por la enfermedad que se predecía que iba a ocurrir después de un período de incubación prolongado [Hadlow, W.J., Lancet 2:289-290 (1959)]. Siete años más tarde, Gajdusek, Gibbs y Alpers demostraron la transmisibilidad del kuru a chimpancés después de períodos de incubación de 18 a 21 meses [Gajdusek y colaboradores, Nature 209:794-796 (1966)]. La similitud de la neuropatologia del kuru con la de la Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob [Klatzo y colaboradores, Lab Invest. 8:799-847 (1959)] urgió experimentos similares con chimpancés, y se reportaron las transmisiones de la enfermedad en 1968 [Gibbs, Jr. y colaboradores, Science 161:388-389 (1968)]. Durante los últimos 25 años, se han transmitido aproximadamente 300 casos de Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, kuru y Enfermedad de Gerstmann-Strassler-Scheinker a una variedad de micos y monos. El gasto, la escasez y la inhumanidad con frecuencia percibida de estos experimentos han restringido este trabajo y, por consiguiente, han limitado la acumulación de conocimiento, aunque se ha dicho que los datos de transmisión más confiables surgen de los estudios que utilizan primates no humanos, se han transmitido muchos casos de enfermedad priónica humana a roedores, pero aparentemente con menos regularidad [Gibbs, Jr. y colaboradores, Slow Transmissible Diseases of the Nervous System. Volumen 2, S.B. Prusiner y W.J. Hadlow, eds. (Nueva York: Academic Press) , páginas 87-110 (1979) ; Tateishi y colaboradores, Prion Diseases of Hu ans and Animáis, Prusiner y colaboradores, eds. (Londres: Ellis Horwood) , páginas 129-134 (1992)]. La transmisión infrecuente de la enfermedad priónica humana a los roedores ha sido citada como un ejemplo de la "barrera de especie" primeramente descrita por Pattison en sus estudios de pasar el agente de raspadura entre ovejas y roedores [Pattison, I.H., NINDB Monograph 2 , D.C. Gajdusek, C.J. Gibbs Jr. y M.P. Alpers, eds. (Washington, D. C. : Imprenta del Gobierno de los Estados Unidos de Nortemérica) , páginas 249-257 (1965)]. En esas investigaciones, el paso inicial de los priones de una especie a otra se asoció con un tiempo de incubación prolongado, desarrollando solamente unos cuantos animales la enfermedad. El paso subsecuente en la misma especie se caracterizó porque todos los animales llegaron a enfermarse después de tiempos de incubación muy cortos. La base molecular para la barrera de la especie entre el hámster sirio (SHa) y el ratón, mostró que reside en la secuencia del gen de PrP utilizando ratones transgénicos (Tg) [Scott y colaboradores, Cell 59:847-857 (1989)]. La PrP de hámster sirio difiere de la PrP de ratón en 16 posiciones de 254 residuos de aminoácidos [Basler y colaboradores, Cell 46:417-428 (1986); Locht y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6372-6376 (1986)]. Los ratones Tg(SHaPrP) que expresan PrP de hámster sirio habían abreviado los tiempos de incubación cuando se inocularon con priones de hámster sirio. Cuando se realizaron estudios similares con ratones que expresaban los transgenes de PrP humanos u ovinos, no se abrogó a la barrera a la especie, es decir, el porcentaje de animales que llegaron a infectarse fue inaceptablemente bajo, y los tiempos de incubación fuero inaceptablemente largos. Por consiguiente, no ha sido posible utilizar animales transgénicos (tales como ratones que contengan un gen de PrP de otra especie) para probar confiablemente una muestra, para determinar si la muestra está infectada con priones. La seriedad del riesgo a la salud resultante de la falta de esta prueba se ejemplifica más adelante. Más de 45 adultos jóvenes previamente tratados con hormona de crecimiento humana derivada a partir de pituitarias humanas, han desarrollado la Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob [Koch y colaboradores, N. Enql. J. Med. 313:731-733 (1985); Brown y colaboradores, Lancet 340:24-27 (1992); Fradkin y colaboradores, JAMA 265:880-884 (1991); Buchanan y colaboradores, Br. Med. J. 302:824-828 (1991)]. Afortunadamente, ahora se utiliza la hormona de crecimiento humana recombinante, aunque se ha presentado la posibilidad aparentemente remota de que una mayor expresión de wtPrPc estimulada con una alta hormona de crecimiento humana podría inducir la enfermedad priónica [Lasmezas y colaboradores, Biochem. Biophs. Res. Commun. 196:1163-1169 (1993)]. Que la hormona de crecimiento humana preparada a partir de pituitaria que estaba contaminada con priones, es apoyado por la transmisión de la enfermedad priónica a un mono de 66 meses después de la inoculación con un lote sospechoso de hormona de crecimiento humana [Gibbs, Jr. y colaboradores, N. En l. J. Med. 328:358-359 (1993)]. Los largos tiempos de incubación asociados con las enfermedades priónicas no revelarán el grado completo de Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob iatrogénicas durante décadas en miles de personas tratadas con hormona de crecimiento humana de todo el mundo. La Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob iatrógenica también parece haberse desarrollado en cuatro mujeres infértiles tratadas con hormona gonadotropina derivada de pituitaria humana contaminada [Healy y colaboradores, Br. J. Med. 307:517-518 (1993); Cochius y colaboradores, Aust. N. Z. J. Med. 20:592-593 (1990); Cochius y colaboradores, J. Neurol. Neurosurq. Psychiatrv 55:1094-1095 (1992)], así como cuando menos 11 pacientes que recibieron injertos de duramadre [Nisbet y colaboradores, J. Am. Med. Assoc. 261:1118 (1989) ; Thadani y colaboradores, J. Neurosurq. 69:766-769 (1988); Willison y colaboradores, J. Neurosurq. Psychiatric 54:940 (1991); Brown y colaboradores, Lancet 340:24-27 (1992)]. Estos casos de Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob iatrogénica, no muestran suficientemente la necesidad de seleccionar productos farmacéuticos que posiblemente puedan estar contaminados con priones. Recientemente, dos doctores de Francia fueron acusados de homicidio involuntario de un niño que había sido tratado con hormonas de crecimiento extraídas de cadáveres. El niño desarrolló la Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob. (Ver New Scientist, 31 de julio de 1993, página 4). De acuerdo con el Instituto Pasteur, desde 1989 han habido 24 casos reportados de Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob en personas jóvenes que fueron tratadas con hormona de crecimiento humana entre 1983 y mediados de 1985. Quince de estos niños han muerto. Ahora parece que cientos de niños de Francia han sido tratados con hormona de crecimiento extraída de cuerpos muertos, con el riesgo de desarrollar Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ver New Scientist, 20 de noviembre de 1993, página 10) . En vista de esto, claramente existe una necesidad de un ensayo conveniente y efectivo por el costo para probar materiales de muestra por la presencia de priones que causen Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob. La presente invención ofrece este ensayo.

Compendio de la Invención La invención incluye un gen de PrP artificial, un animal transgénico que contiene el gen, y la metodología de ensayo que utiliza al animal transgénico para detectar priones patogénicos en una muestra. El gen artificial incluye una secuencia tal que, cuando se inserta en el genoma de un animal (tal como un ratón) , el animal se hace susceptible a la infección con priones que normalmente infectarían solamente a una especie específica de un animal genéticamente diferente (tal como un ser humano, una vaca ó una oveja) . El gen de PrP artificial puede estar comprendido de una secuencia de polinucleótido completamente artificial. De una manera alternativa, el gen artificial puede estar comprendido de la secuencia de codón de un primer animal con una ó más sustituciones de codón hechas, en donde las sustituciones de preferencia son los codones del gen de PrP correspondientes a partir de un animal genéticamente diferente, con la condición de que no todos los codones diferentes sean reemplazados por codones del animal genéticamente diferente. Los priones patogénicos de una muestra pueden ser detectados mediante la inyección de la muestra que se vaya a probar, en un ratón transgénico. En un ejemplo preferido, el genoma del ratón incluye un gen de PrP quimérico, cuyo gen incluye una porción de un gen del animal (por ejemplo, un ser humano) en peligro de infección por los priones de la muestra. Por ejemplo, la Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD) es una enfermedad neurodegenerativa fatal de los seres humanos, causada por priones. Los ratones transgénicos preferidos (Tg) descritos en la presente, expresan una proteína de prión quimérica (PrP) , en donde un segmento de la PrP del ratón (Mo) fue reemplazado con la secuencia de PrP humana (Hu) correspondiente. La PrP quimérica, designada como MHu2MPrP difiere de la PrP de ratón por 9 aminoácidos entre los residuos 96 y 167. Todos los ratones Tg(MHu2MPrP) inyectados con priones humanos desarrollaron la animal neurológica. De una manera más específica, los ratones transgénicos de la invención desarrollaron la enfermedad aproximadamente 200 días después de la inoculación con homogenatos de cerebro de tres pacientes de Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob. Cuando se inocularon con los priones de la Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, se formó la MHu2MPrPSc; en contraste, se produjo la MoPrPSc si se inoculaban los priones de ratón. Los patrones de acumulación de MHu2MPrPSc y MoPrPSc en los cerebros de ratones Tg(MHu2M) fueron diferentes. Aproximadamente el 10 por ciento de los ratones Tg(HuPrP) que expresaron HuPrP, y los ratones no transgénicos, desarrollaron la enfermedad neurológica >500 días después de la inoculación con priones de Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob. Las diferentes susceptiblidades de los ratones Tg(PrP) y Tg(MHu2M) a los priones humanos, indica que hay factores específicos de la especie adicionales involucrados en la réplica del prión. Los ratones Tg(MHu2MPrP) descritos en la presente son útiles en el diagnóstico, prevención y tratamiento de enfermedades priónicas humanas. Los ratones transgénicos que contienen el gen de proteína de prión quimérica, que incluye una porción, pero no todo, el gen de PrP de un animal de un género diferente, se pueden utilizar para probar muestran por priones que podrían infectar a esos animales. Los ratones transgénicos descritos en la presente desarrollan consistentemente los efectos adversos de estos priones en un tiempo relativamente corto, y son sustancialmente más baratos y más fáciles de mantener que los modelos primates actualmente utilizados. Un objeto de la invención es proporcionar un gen que pueda ser artificial ó quimérico, cuyo gen, cuando se inserte en el genoma de un animal (por ejemplo, un ratón) haga al mamífero susceptible a las infecciones de priones que naturalmente sólo infectan a un mamífero genéticamente diferente, por ejemplo, un ser humano, un bovino ó un ovino. Otro objeto de la invención es proporcionar un ensayo para la detección de priones en una muestra. Otro objeto es proporcionar un gen de PrP artificial, en donde uno ó más codones (de preferencia de 1 a 50 codones) del gen de PrP de un primer animal (por ejemplo, un ratón) sean reemplazados con codones del gen de PrP de un animal genéticamente diferente (por ejemplo, un ser humano, una vaca ó una oveja) , de una manera tal que haga al primer animal susceptible a la infección con priones que normalmente infectan solamente al animal genéticamente diferente. Otro objeto es proporcionar un gen quimérico comprendido de codones que codifiquen el término C y N de una especie de mamífero, y codones medios de otra especie de mamífero. Otro objeto de la invención es proporcionar un mamífero transgénico, tal como un ratón, que incluya un gen de PrP quimérico, cuyo gen incluya una porción del gen de PrP de otro animal, tal como un ser humano, una vaca ó una oveja. Una ventaja de la presente invención es que el ratón transgénico se puede utilizar para ensayar por la presencia de priones en una muestra, de una manera que es sustancialmente más rápida, más eficiente y más barata que los métodos de ensayo actualmente disponibles. Otra ventaja es que los ratones transgénicos inoculados con priones de seres humanos se pueden utilizar como animales de prueba para probar fármacos por su eficacia en el tratamiento de seres humanos que sufran de enfermedades resultante de la infección con priones. Otra ventaja es que los ratones transgénicos pueden detectar priones en una muestra en niveles muy bajos, por ejemplo, una parte por millón, e inclusive tan bajos como una parte por mil millones. Todavía otra ventaja es que los ratones proporcionan un ensayo que es altamente preciso, es decir, no proporciona positivos falsos, y determina de una manera consistente la presencia de priones. Todavía otra ventaja es que, mediante el incremento del número de copia del gen de la invención en un mamífero transgénico, se disminuye el tiempo de incubación para la enfermedad causada por el prión. Una característica de la presente invención es que los ratones transgénicos inyectados con una muestra que contiene priones patogénicos, desarrollarán consistentemente los efectos de la enfermedad de los priones dentro de un tiempo relativamente corto, por ejemplo, de aproximadamente 200 días + 50 días después de la inyección, ó menos. Otra característica es que un gen artificial de la invención de preferencia contiene codones del gen de PrP de un primer animal (tal como un ratón) con algunos (pero no todos) de los codones que difieren del ratón, y un segundo mamífero genéticamente diferente (tal como un ser humano) que reemplaza a los codones del primer mamífero en las mismas posiciones relativas.. Estos y otros objetos, ventajas, y características de la invención llegarán a quedar más claros para las personas expertas en este campo, al leer los detalles del gen quimérico, el método de ensayo, y el ratón transgénico como se describen más completamente más adelante.

Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 es un dibujo esquemático que muestra la construcción de un gen MHu2M quimérico y un ratón transgénico que lo contiene. La Figura 2 es una vista esquemática de una porción de las proteínas PrP que muestra las diferencias entre una proteína PrP humana de tipo silvestre normal, y una proteína PrP de ratón de tipo silvestre normal. La Figura 3 muestra la secuencia de aminoácidos de PrP de ratones, junto con las diferencias específicas entre la PrP de ratones y la PrP humana. La Figura 4 muestra la secuencia de aminoácidos de la PrP de ratón, y muestra específicamente las diferencias entre la PrP de ratón y la PrP bovina. La Figura 5 muestra la secuencia de aminoácidos de la PrP de ratón, y muestra específicamente las diferencias entre la PrP y la PrP ovina.

Descripción Detallada de las Modalidades Preferidas Antes de que se describa el presente gen quimérico, la metodología de ensayo, y los ratones transgénicos utilizados en el ensayo, se debe entender que esta invención no se limita a métodos de ensayo particulares, genes quiméricos y artificiales, ó a los ratones transgénicos descritos, ya que esos métodos, genes quiméricos y ratones, por supuesto, pueden variar. También se debe entender que la terminología utilizada en la presente es para el propósito de describir las modalidades particulares solamente, y no pretende ser limitante, ya que el alcance de la presente invención se limitará solamente por las reivindicaciones adjuntas. A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que es entendido comúnmente por un experto ordinario en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque se pueden emplear cualesquiera métodos y materiales similares ó equivalentes a los descritos en la presente en la práctica ó en la prueba de la presente invención, ahora se describen los métodos y materiales preferidos. Todas las publicaciones mencionadas en la presente se incorporan a la presente como referencia para dar a conocer y describir los métodos y/ó materiales en relación con los cuales se citan las publicaciones. El término "prión" significará una partícula infecciosa que se sabe que causa enfermedades (encefalopatías espongiformes) en seres humanos y animales. El término "prión" es una contracción de las palabras "proteína" e "infección", y las partículas están comprendidas en gran parte, si no es que exclusivamente, de moléculas de PrPSc codificadas por un gen de PrP. Los priones son distintos de las bacterias, virus y viroides. Los priones conocidos incluyen aquellos que infectan a los animales para provocar raspadura, una enfermedad degenerativa transmisible del sistema nervioso de las ovejas y las cabras, así como encefalopatías espongiformes bovinas (BSE) , ó enfermedad de vaca loca, y encefalopatías espongiformes felinas de gatos. Cuatro enfermedades priónicas que se sabe que afectan a los seres humanos son (1) kuru, (2) Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD) , (3) Enfermedad de Gerstmann-Strassler-Scheinker (GSS) , y (4) insomnio familiar fatal (FFI) . Como se utiliza en la presente, el prión incluye todas las formas de priones que causan todas ó cualquiera de estas enfermedades u otras en cualesquiera animales utilizados - y en particular en seres humanos y en animales domésticos de granja. El término "gen de PrP" se refiere en general a cualquier gen de cualquier especie que codifique cualquier forma de una proteína de prión. El término "gen de PrP artificial" se utiliza en la presente para abarcar el término "gen de PrP quimérico", así como otros genes recombinantemente construidos que, cuando se incluyen en el genoma de un animal (por ejemplo, un ratón) hacen al mamífero susceptible a la infección de priones que solamente infectan de una forma natural a un animal genéticamente diferente, por ejemplo, un ser humano, un bovino ó un ovino. En general, un gen artificial incluirá la secuencia de codones del gen de PrP del mamífero que se esté alterando genéticamente con uno ó más (pero no todos, y generalmente menos de 50) codones de la secuencia natural, que son reemplazados con un codón diferente - de preferencia un codón correspondiente de un mamífero genéticamente diferente (tal como un ser humano) . El mamífero genéticamente alterado se utiliza para ensayar muestras por priones que solamente infectan al mamífero genéticamente diferente. Los ejemplos de los genes artificiales son genes de PrP de ratón que codifican la secuencia mostrada en las Figuras 3, 4 y 5, con uno ó más codones de reemplazo diferentes seleccionados a partir de los codones mostrados en estas Figuras para seres humanos, vacas y ovejas, que reemplazan a los codones de ratón en la misma posición, con la condición de que no todos los codones del ratón sean reemplazados con diferentes codones humanos, de vaca ó de oveja. Los términos "gen quimérico" , "gen de PrP quimérico" y similares, se utilizan intercambiablemente en la presente para significar un gen artificialmente construido que contiene los codones de un primer animal, tal como un ratón, siendo uno ó más de los codones reemplazado con codones correspondientes de un animal genéticamente diferente, tal como un ser humano, una vaca ó una oveja. En un ejemplo específico, el gen quimérico está comprendido de la secuencia de inicio y de terminación (es decir, los codones terminales en N y C) de un gen de PrP de un mamífero de una primera especie (por ejemplo, un ratón) , y que también contienen una secuencia de nucleótido de una porción correspondiente de un gen de PrP de un mamífero de una segunda especie (por ejemplo, un ser humano) . Un gen quimérico, cuando se inserte en el genoma de un mamífero de la primera especie, hará al mamífero susceptible a la infección con priones que normalmente infectan solamente a los mamíferos de la segunda especie. El gen quimérico preferido descrito en la presente es MHu2M que contiene la secuencia de inicio y de terminación de un gen de PrP de ratón, y una región de secuencia no terminal que es reemplazada con una secuencia humana correspondiente que difiere de un gen de PrP de ratón de una manera tal, que la proteína expresada por el mismo difiere en nueve residuos. Los términos "susceptible a infección" y "susceptible a infección por priones", y similares, se utilizan intercambiablemente en la presente para describir un mamífero transgénico de la invención que tiene un 80 por ciento ó más, de preferencia un 98 por ciento ó más, y más preferiblemente un 100 por ciento de oportunidad de desarrollar una enfermedad si se inocula con priones. Los términos se utilizan para describir un animal transgénico de la invención, tal como un ratón transgénico Tg(MHu2M) que, sin el gen de PrP quimérico, no sería susceptible a la infección con un prión humano (menos del 20 por ciento de oportunidad 'de infección) , pero con el gen quimérico es susceptible a la infección con priones humanos (del 80 al 100 por ciento de oportunidad de infección) . El término "tiempo de incubación" significará el tiempo desde la inoculación de un animal con un prión, hasta el tiempo en que el animal desarrolle primeramente síntomas detectables de la enfermedad resultante de la infección. Un tiempo de incubación reducido es de un año ó menos, de preferencia de aproximadamente 200 días + 50 días ó menos, más preferiblemente de aproximadamente 50 días ± 20 días ó menos. Las abreviaturas utilizadas en la presente incluyen CJD para Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob; GSS para Enfermedad de Gerstmann-Strassler-Scheinker; FFI para insomnio familiar fatal; prPSc para la isoforma de raspadura de la proteína de prión; MoPrP para una proteína de prión de ratón; SHa para un hámster sirio; BSE para encefalopatía espongiforme bovina; CNS para sistema nervioso central; MHu2M para un gen de PrP quimérico de ratón/humano, en donde una región del gen de PrP de ratón es reemplazada por una secuencia humana correspondiente que difiere del PrP de ratón en 9 codones; ratones Tg(MHu2M) son ratones transgénicos de la invención que incluyen al gen MHu2M; CNS para sistema nervioso central; CJD para Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob; GSS para Enfermedad de Gerstmann-Strassler- Scheinker; FFI para insomnio familiar fatal; Hu para humano; HuPrP para una proteína de prión humana; Mo para ratón; SHaPrP para una proteína de prión de hámster sirio; Tg para transgénico; Tg(SHaPrP) para un ratón transgénico que contiene al gen de PrP de un hámster sirio; Tg(HuPrP) para ratones transgénicos que contienen al gen de PrP humano completo; Tg(ShePrP) para ratones transgénicos que contienen al gen de PrP de oveja completo; Tg(BovPrP) para ratones transgénicos que contienen al gen de PrP de vaca completo; MoPrPsc para la isoforma de raspadura de la proteína de prión de ratón; MHu2MPrPSc para un gen quimérico en donde una porción de la isoforma de raspadura del gen de PrP humano se funde en la isoforma de raspadura del gen de PrP de ratón; prpCJD para ?a isoforma de Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob de un gen de PrP; PrP-n°/° para la ablación de ambos alelos del gen MoPrP; Tg(SHaPrP+/°)81/Prn-p°/0 para una línea particular (81) de ratones transgénicos que expresan SHaPrP, +/0 indica heterocigosos.

Aspectos Generales de la Invención La presente invención incluye varios aspectos, incluyendo: (1) un gen artificial comprendido de secuencias de codón que, cuando se insertan en el genoma de un primer animal (por ejemplo, un ratón ó rata) , harán al animal susceptible a infección con priones que normalmente infectan solamente a un animal genéticamente diferente (por ejemplo, un ser humano, una vaca, ó una oveja) , incluyendo de esta manera genes en donde de 1 a 50 codones de un gen de PrP que se presenta naturalmente de un primer animal, son reemplazados con codones correspondientes de un animal genéticamente diferente; (2) un gen quimérico, cuyo gen está comprendido de la secuencia de PrP de un gen de un mamífero de una primera especie, cuyo gen se ha modificado para incluir un segmento correspondiente de un gen de PrP de un mamífero de una segunda especie; (3) un mamífero transgénico que contiene un gen artificial ó quimérico de la invención, tal como un ratón transgénico que incluye un gen de PrP quimérico, en donde una porción del gen de ratón es reemplazada con una porción correspondiente de un gen de PrP humano, haciendo de esta manera al ratón susceptible a la infección con priones humanos; (4) un método para determinar si una muestra está infectada con priones, cuyo método involucra inocular un mamífero transgénico de la invención con una muestra que se vaya a probar, y observar al mamífero durante un período de tiempo suficiente para determinar si el mamífero desarrolla síntomas de una enfermedad normalmente asociada con los priones; (5) un método para probar la eficacia de un fármaco en el tratamiento de una enfermedad desarrollada como un resultado de la infección con priones, el cual comprende administrar un fármaco que se va a probar, a un cualquier transgénico infectado con priones, y observar y/ó probar al mamífero para determinar que el fármaco ayuda a promover ó a hacer más lento el progreso de la enfermedad ó de los síntomas; y (6) un método para determinar la causa de muerte de un animal, el cual comprende inocular un animal transgénico de la invención con tejido de cerebro extraído del animal que ha muerto, y observar al animal transgénico con el objeto de determinar si el animal transgénico desarrolla síntomas de infecciones de priones. Los animales huéspedes preferidos son ratones y ratas, siendo más preferidos los ratones, porque existe un conocimiento considerable sobre la producción de animales transgénicos. Otros animales huéspedes posibles incluyen los que pertenecen a un género seleccionado a partir de Mus, Rattus, Oryctolagus y Mesocricetus. El gen de PrP huésped puede incluir el codón de genes de PrP genéticamente diferentes, de animales que pertenezcan a un género seleccionado a partir de Bos, Ovis, Sus y Homo. De preferencia, se cambia un gen de PrP huésped de ratón para incluir un codón de un gen de PrP ser humano, de vaca ó de oveja, prefiriéndose más el de ser humano. Se conoce el material genético que forma el gen de PrP para un número de diferentes especies de animales. Además, existe una homología considerable entre los genes de PrP en diferentes mamíferos. Por ejemplo, ver la secuencia de aminoácidos de PrP de ratón comparándose con la PrP humana, de vaca y de oveja en las Figuras 3, 4 y 5, en donde solamente se muestran las diferencias. Además, note que el segmento de un gen de PrP utilizado para crear el gen MHu2M de la presente invención dará como resultado la codificación de la proteína que muestra una diferencia entre la proteína humana y de ratón de solamente nueve residuos. Aunque existe una homología genética considerable con respecto a los genes de PrP, las diferencias son significativas en algunos casos. De una manera más específica, debido a las pequeñas diferencias en la proteína codificada por el gen de PrP de diferentes mamíferos, un prión que infectará a un mamífero (por ejemplo, un ser humano) normalmente no infectará a un mamífero diferente (por ejemplo, un ratón). Debido a esta "barrera de la especie", generalmente no es posible utilizar animales tales como ratones como animales de prueba, con el objeto de determinar si una muestra particular contiene priones que normalmente infectarían a una especie diferente de animal, tal como un ser humano. La presente invención resuelve este problema de una manera sorprendente. Al principio, podría parecer que se podrían producir animales de prueba transgénicos útiles sustituyendo el gen de PrP del animal que actuaría como el animal de prueba (por ejemplo, un ratón) , con el gen de PrP de un animal diferente (por ejemplo, un ser humano) , y utilizar el animal de prueba para determinar si llega a infectarse con los priones del otro animal, es decir, los priones que normalmente infectarían solamente a un ser humano. Sin embargo, cuando se producen estos animales transgénicos y se utilizan como animales de prueba, no se infectan fácilmente con los priones que normalmente infectan al mamífero a partir del cual se tomó su gen transgénico. Por consiguiente, los genes artificiales ó quiméricos de la invención no tendrán todos los codones del huésped reemplazados con diferentes codones a partir del animal genéticamente diferente. Más adelante se proporciona una descripción más específica de la manera en que se rompió la barrera de la especie de conformidad con la presente invención.

Barrera de la Especie Rota La transmisión de la Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob humana a micos y monos de 1.5 a 3 años, después de la inoculación intracerebral, proporcionó un interés considerable en las causas de las enfermedades neurodegenerativas [Gibss, Jr. y colaboradores, Science 161:388-389 (1968)]. Los seres humanos no son genéticamente diferentes de los micos y los monos, lo cual cuenta para la infectividad de especies cruzadas, aunque con un largo tiempo de incubación. Aunque el alto costo de cuidar primates no humanos impidió hacer estudios extensos de las enfermedades priónicas humanas, la transmisibilidad de estas enfermedades estimuló estudios de los análogos de priones del animal en roedores [Manuelidis y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3422-3436 (1978); Manuelidis y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73:223-227 (1976); Tateishi y colaboradores, Ann. Neurol. 5:581-584 (1979) ] . La presente descripción abre una nueva ' frontera en la investigación de las enfermedades priónicas humanas, ya que ahora se pueden realizar estudios de transmisión de una manera relativamente rápida en mamíferos genéticamente alterados, tales como ratones Tg(MHu2M) , que son relativamente económicos de mantener. Por primera vez, se pueden realizar titulaciones de punto final de priones en múltiples tejidos y fluidos corporales humanos, y se pueden construir curvas estándares para ensayos de tiempo de incubación más económicos. La información derivada a partir de estos estudios de priones humanos será útil en el manejo de los pacientes con Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, que se piensa que dan algún riesgo a los parientes, médicos, enfermeras y técnicos del laboratorio clínico [Berger y colaboradores, Neuroloqy 43:205-206 (1993); Ridley y colaboradores, Lancet 341:641-642 (1993)]. En los estudios de las enfermedades priónicas humanas con micos y monos, el uso de uno ó dos, ó raramente tres animales como receptores como un solo inoculo, ha presentado un problema significativo en la evaluación de la transmisibilidad de un inoculo particular desde un paciente individual. Los ratones Tg(MHu2M) descritos en la presente, obvian muchos de los problemas creados por la utilización de primates no humanos. Los resultados demuestran la "universalidad" del transgen MHu2M para los estudios de transmisión con otros tipos de animales transgénicos y otros inóculos de priones. Por ejemplo, puede ser más eficiente utilizar ratones que expresen transgenes MHu2MPrP que codifiquen, ya sea para una metionina. ó valina en el codón 129, y al hacerlo así, acoplar el genotipo del ratón transgénicos (con respecto al codón 129) con el genotipo del individuo, a partir del cual se deriva el inoculo. La homocigosidad en el polimorfismo del codón 129 tiene una influencia profunda sobre la incidencia de la Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob esporádica [Palmer y colaboradores, Nature 352:340-342 (1991)]. El transgen MHu2MPrP codifica una Met en el codón 129, y el caso de la Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob iatrógenica fue homocigoso para Met [Collinge y colaboradores, Lancet 337:1441-1442 (1991)]. Para romper la barrera de la especie, hemos creado un gen de PrP artificial que, cuando se inserta en un primer mamífero (tal como un ratón) hace que ese mamífero sea susceptible a la infección con priones que normalmente infectan solamente a un mamífero genéticamente diferente (por ejemplo, un ser humano, una vaca ó una oveja) . El gen de PrP artificial puede incluir la secuencia del gen de PrP natural del primer animal, siendo una ó más (de preferencia menos de 50) secuencias de codones emplazadas con otras secuencias de codones, tales como los codones correspondientes de un mamífero genéticamente diferente (por ejemplo, un ser humano, una vaca ó una oveja) . En un ejemplo específico de la invención, la barrera de la especie se rompe insertando en un mamífero (un ratón) el gen quimérico (MHu2M) , cuyo gen quimérico se muestra ensamblado esquemáticamente en la Figura 1. Con el objeto de producir el gen quimérico, primero es necesario obtener secuencias de nucleótidos que codifiquen PrP humana. Los genes de PrP humanos se someten entonces a los procedimientos de reacción de cadena de polimerasa convencionales con el objeto de producir grandes números de copias del gen ó de porciones del gen. Entonces se aisla el producto de la reacción de cadena de polimerasa, se agregan sitios de restricción específicos, y el producto copiado se someten a endonucleasas específicas con el objeto de remover una sección media del gen de PrP humano. Específicamente, se agregan sitios de restricción, de tal manera que, cuando se somete al producto de la reacción de cadena de polimerasa a los endonucleasas, tales como Asp718, así como BstEII, se corta una sección del gen. El uso de estas dos endonucleasas removerá una porción central del gen de PrP humano (codones 94-188) , cuya porción codifica los residuos de aminoácidos 94 a 188) . También se utilizan endonucleasas para remover una porción central correspondiente del gen de PrP de ratón. La porción central removida del gen de ratón se desecha entonces, y la porción central obtenida del gen de PrP humano se funde en el gen de ratón para producir un gen humano/de ratón quimérico. Los detalles de la manera en que se produjo el gen MHu2M específico se describen en el Ejemplo 1 y se muestran en la Figura 1. Como se muestra con la Figura 2, existe un alto grado de homología entre la porción central removida del gen de PrP humano y el segmento del gen de PrP de ratón que se reemplaza. Específicamente, los segmentos difieren en 9 codones. Por consiguiente, cuando se expresa el material genético, la proteína MHu2M quimérica resultante diferirá de la MoPrP en 9 residuos. Estos residuos y sus posiciones se muestran en la Figura 2. Después de que se produce el gen quimérico, se puede microinyectar en un huevo de ratón utilizando tecnología conocida, como se describe en Scott y colaboradores, Cell 59:847-857 (1989) y Scott y colaboradores, Protein Sci. 1:986-997 (1992), y ver también la publicación internacional de patente número W091/19810, publicada el 22 de diciembre de 1991, así como otras publicaciones relacionadas con la producción de ratones transgénicos citadas en la misma y conocidas por los expertos en este campo. El huevo de ratón inyectado se implanta entonces en un ratón empleando procedimientos conocidos. Se pueden implantar múltiples huevos en un solo ratón, y se pueden emplear los procedimientos conocidos para determinar si la progenie resultante es de ratones transgénicos que incluyan al gen quimérico dentro de su genoma. Los detalles de este procedimiento se describen en el Ejemplo 1.

No es posible hacer a un mamífero susceptible de infección con priones de un mamífero genéticamente diferente sustituyendo completamente el gen de PrP del mamífero con el gen de PrP completo del mamífero genéticamente diferente. Hemos roto con éxito la "barrera de la especie" mediante la producción de un gen de PrP quimérico, en donde una porción media del gen de PrP de ratón es reemplazada con una porción media correspondiente de un gen de PrP humano, dejando de esta manera los términos C y N del gen de PrP de ratón intactos. Sin embargo, se pueden reemplazar otros segmentos del gen de PrP de ratón con otros segmentos homólogos del gen de PrP humano, y obtener un ratón transgénico que se está sujeto a infectarse fácilmente con priones humanos. Por consiguiente, la invención no se limita al gen quimérico particular MHu2M ó a ratones quiméricos producidos utilizando este gen. La invención incluye todos los tipos de animales transgénicos que incluyen genes artificiales, en donde el gen artificial hace que el animal transgénico sea susceptible a la infección con priones que normalmente infectan solamente a un animal genéticamente diferente. Se pueden deducir numerosos ejemplos específicos de genes artificiales de la invención a partir de una revisión de las Figuras 3, 4 y 5. Específicamente, se puede empezar con el gen de PrP básico de un ratón (como el primer animal) , cuyo animal va a llegar a ser el animal transgénico.

Posteriormente, se pueden reemplazar uno ó más codones del gen de ratón con uno ó más codones correspondientes de un gen de PrP de ser humano, bovino ó de oveja, cuyo codón sea diferente del codón correspondiente del gen de ratón, pero en la misma posición relativa en el gen. Al mostrar que es posible romper la "barrera de la especie" mediante la creación de un gen quimérico particular, mediante el cual se puedan probar ratones transgénicos por la presencia de priones humanos, hemos abierto la puerta para la creación de otros animales transgénicos, que incluirán otros genes de PrP artificiales que, por ejemplo, pueden permitir la prueba por la presencia de priones bovinos u ovinos en una muestra.

Ratones Tq(MHu2M) con tiempos de incubación más cortos El tiempo de incubación de ratones Tg(MHu2M) inoculados con priones humanos, es ahora de aproximadamente 200 días + 50 días. Creemos que esto se puede reducir sustancialmente. En los ratones Tg(SHaPrP), se encontró que el nivel de expresión del transgen SHaPrP es inversamente proporcional a la longitud del tiempo de incubación de raspadura después de la inoculación con priones de hámster sirio [Prusiner y colaboradores, Cell 63:673-686 (1990)]. Por consiguiente, la producción de ratones Tg(MHu2M) , con niveles más altos de expresión transgénica, debe reducir sustancialmente los tiempos de incubación.

Basándose en otros estudios que hemos realizado utilizando un gen de PrP quimérico de hámster/ratón análogo, MH2M, es posible asignar un período de incubación óptimo teórico para la construcción MHu2M en un ratón que carece del gen de PrP de ratón endógeno. Obtuvimos períodos de incubación de aproximadamente 105 días con un inoculo de prión de hámster sirio heterólogo, acortándose hasta aproximadamente 62 días con un inoculo de prión MHu2M homólogo. El período de incubación más corto observado hasta ahora en cualquiera de nuestros estudios de ratón transgénico fue de aproximadamente 45 días para una línea que expresaba el gen de PrP de ratón. Asumiendo un período de incubación mínimo similar con priones MHu2M en ratones Tg(MHu2M PrP) que carecían de gen de PrP de ratón endógeno, podemos esperar con confianza períodos de incubación del orden de 45 x 105/62 = 76 días con priones humanos. Esta es una estimación conservadora, e inclusive son posibles períodos de incubación más cortos en líneas con números de copias muy altos. Los números de copias se pueden incrementar hasta 300-400, y el tiempo de incubación puede ser tan corto como de 50 días + 20 días. En adición, otras construcciones de PrP humana/de ratón quiméricas pueden exhibir tiempos de incubación todavía más cortos que la PrP MHu2M. En adición, la remoción de MoPrPc mediante el cruce de ratones Tg(MHu2M) sobre un fondo ablacionado (Prn-p°/°) también puede reducir el tiempo de incubación, ya que los ratones Tg(SHaPrP+/°)81/Prn-p°/0 exhiben una reducción del 30 por ciento en los tiempos de incubación, comparándose con los ratones Tg(SHaPrP+/°) 81/Prn-p+/+ [Büeler y colaboradores, Cell 73:1339-1347 (1993). Prusiner, S.B. y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10608-10612, noviembre de 1993. De conformidad con lo anterior, también hemos utilizado huevos fertilizados de ratones en donde se ha ablacionado el gen de PrP endógeno, como receptores para la microinyección de la construcción de PrP MHu2M. Mediante la alteración sistemática de la extensión y la posición de las sustituciones en otras construcciones de PrP humana/de ratón quiméricas, es posible mejorar adicionalmente la susceptible de los ratones transgénicos a los priones humanos, como se refleja por los tiempos de incubación acortados. El acortamiento del tiempo de incubación es una meta valiosa para facilitar muchos estudios futuros en la investigación de priones, y para la evaluación de productos farmacéuticos. En general, existe una relación inversa entre el número de copias de un gen de PrP quimérico ó artificial y el tiempo de incubación de la enfermedad después de la inoculación del animal transgénico con priones. Los ratones 2Hu2M específicos descritos en la presente tienen solamente 3 ó 4 copias del gen 2Hu2M. El número de copias se puede incrementar hasta 300 a 400, reduciendo de esta manera significativamente el tiempo de incubación desde aproximadamente 200 días hasta 50 días + 20 días.

Diferencias en la conversión de MHu2MPrPc y HuPrPc en la isoforma de raspadura en ratones El evento fundamental en la propagación del prión parece ser la conversión de PrPc, que contiene aproximadamente el 43 por ciento de hélice , y no tiene lámina ß, en PrPSc que tiene aproximadamente el 43 por ciento de lámina ß [Pan y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10962-10966 (1993)]. A partir de los resultados de los estudios de ratón Tg(SHaPrP) , se piensa que este proceso involucra la formación de un complejo ente PrPSc y del sustrato homotípico [Prusiner y colaboradores, Cell 63:673-686 (1990)]. Los intentos por mezclar PrPSc con PrPc han fracasado para producir PrPSc naciente [Raeber y colaboradores, J. Virol. 66:6155-6163 (1992)], elevando la posibilidad de que las proteínas, tales como chaperones, pudieran estar involucradas en la catalización de los cambios de conformación que se caracterizan en la formación de la PrPSs. Un explicación para la diferencia en la susceptible de ratones Tg(MHu2M) y Tg(HuPrP) a los priones humanos en ratones, puede ser que los chaperones de ratón que catalizan el repliegue de PrPc en PrPSc pueden reconocer MHu2MPrP, pero no HuPrP.

Otra posibilidad es que las secuencias en el término N ó C de la PrP humana, inhiben la formación de PrPSc en células de murino. Para probar esta posibilidad, se utilizan secuencias de PrP humana para sustituir las secuencias de ratón en cada término de MHu2MPrP.. La comparación de las secuencias de PrP en muchos mamíferos alrededor del sitio de adición de ancla GPI (codones 227-235) revela una diferencia interesante de cuatro aminoácidos entre los roedores y los primates [Stahal y colaboradores, Biochemistry 31:5043-5053 (1992)]. El apoyo de esta hipótesis es que los roedores también difieren de los rumiantes, incluyendo las ovejas y el ganado, en este sitio; los priones de oveja han fracasado para transmitir neurodegeneración a Tg(ShePrP) . En estos experimentos, todo el gen de PrP de ratón fue reemplazado con todo el gen de PrP de oveja. En contraste con los ratones Tg(MHu2M) , el índice de transmisión de inóculos de priones humanos desde una amplia variedad de fuentes fue menor del 10 por ciento en ratones Tg(HuPrP) , sin diferencia del índice observado en ratones no transgénicos. De la misma manera, la conversión de HuPrPc en HuPrPSc, en los ratones Tg(HuPrP) parece ser un evento relativamente infrecuente similar a la rara conversión de un MoPrPc en PrPSc en respuesta a los priones humanos. Los bajos índices de transmisión en estos ratones no parecen ser una consecuencia de bajas titulaciones de priones humanos: dos inóculos que fracasaron para provocar la enfermedad en ratones Tg(HuPrP) se transmitió al 100 por ciento de los animales Tg(MHu2M) inoculados.

"Cepas" de priones humanos Los estudios en roedores han demostrado que las cepas de priones producen diferentes patrones de acumulación de PrPSc [Hecker y colaboradores, Genes & Development 6:1213-1228 (1992) ; DeArmond y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6449-6453 (1993)]; que se pueden cambiar dramáticamente mediante la secuencia de PrPc [Carlson y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA en impresión (1994)]. La base molecular de la diversidad de priones se ha atribuido durante muchos años a un ácido nucleico específico de raspadura [Bruce y colaboradores, J. Gen. Virol. 68:79-89 (1987)], pero no se ha encontrado ninguno [Meyer y colaboradores, J. Gen. Virol. 73:1025-1029 (1992)]. Otras hipótesis para explicar las cepas de priones incluyen variaciones en las cadenas de azúcar enlazadas con Asn de la PrP [Hecker y colaboradores, Genes & Development 6:1213-1228 (1992)], y múltiples conformadores de Prpsc [prusiner, S.B. Science 252:1515-1522 (1991)]. Los patrones de PrPSc en ratones Tg(MHu2M) fueron notablemente similares para los tres inóculos de seres humanos que murieron de Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob. Los patrones de acumulación de prPSc en los cerebros de los ratones Tg(MHu2M) inoculados fueron notablemente diferentes para los priones RML y los priones Hu. Sin embargo, los inóculos de prión RML que contenían MoPrPSc estimularon la formación de más MoPrPSc, mientras que los inóculos de prión Hu que contenían HuPrPCJD dispararon la producción de MHu2MPrPSc. La distribución de los cambios neuropatológicos caracterizados por la vacuolación neuronal y la gliosis astrocítica es similar a los patrones de acumulación de PrPSc en los cerebros de ratones Tg(MHu2M) inoculados con priones RML ó priones Hu.

Nuevos enfoques para investigar las enfermedades priónicas humanas La notable sensibilidad de los ratones TG(MHu2M) a los priones humanos representa un avance importante en la investigación de las enfermedades neurodegenerativas.

Basándose en la presente descripción con respecto a los transgenes de PrP humana/de ratón quiméricos, hemos concebido un enfoque similar a la construcción de ratones transgénicos susceptibles a encefalopatía espongiforme bovina y a priones de raspadura de oveja. Esto sería útil para detectar enfermedades priónicas en animales domésticos. La importancia de las enfermedades priónicas de animales ilustrada por la encefalopatía espongiforme bovina ó "enfermedad de vaca loca" en Gran Bretaña, en donde ha muerto >150,000 cabezas de ganado. Esta enfermedad priónica de encefalopatía espongiforme bovina se piensa que se ha originado con el ganado que consume carne y alimento óseo producido de desechos de oveja que contienen priones de raspadura [Wiles ith, J.W. Semin. Viro. 2, 239-245]. La epidemia de la encefalopatía espongiforme bovina ha conducido a una preocupación considerable acerca de la seguridad de los seres humanos por la carne de res europea y otros productos de ganado. Los estudios epidemiológicos sobre las pasadas dos décadas han proporcionado muchos datos que argumentan que los seres humanos tienen pocas probabilidades de contraer la Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob de los productos de oveja infectados con raspadura [Harries-Jones y colaboradores, J. Neurol. Neurosurq. Psychiatry 51:1113-1119 (1988) ; Counsens y colaboradores, J. Neurol. Neurosurq. Psychiatry 53:459-465 (1990) ; Brown y colaboradores, Neurolocry 37:895-904 (198)]. Existen siete sustituciones de aminoácidos que distinguen a la PrP bovina de la de ovejas, que deben considerarse al sacar conclusiones de la raspadura de oveja acerca de los factores de riesgo para los seres humanos de la encefalopatía espongiforme bovina. El hecho de que cualquiera de estas siete sustituciones de aminoácidos hagan que los priones bovinos sean permisibles para los seres humanos, sigue esperando su establecimiento. Puede ser que los ratones Tg(MHu2M) sean susceptibles a los priones bovinos, así como a los de oveja. Tal vez más importante, es que los ratones Tg(MHu2M) tienen una aplicación inmediata en la prueba de productos farmacéuticos para la contaminación priónica humana. Los ratones Tg(MHu2M) descritos en la presente proporcionan un bioensayo sensible, confiable y económico para detectar la presencia de priones humanos.

Gen de PrP quimérico Ya que el evento fundamental subyacente a la propagación priónica parece ser un cambio de conformación en la PrP [Pan y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10962-10966 (1993)], y la PrP de ratón difiere de la PrP humana en 31 posiciones de 254 [Kretzschmar y colaboradores, DNA 5:315-324 (1986)], construimos transgenes de PrP modificados. Los transgenes de hámster sirio/ratón quiméricos han producido priones con nuevas propiedades, siendo las más útiles el transgen de hámster sirio/ratón quimérico etiquetado con MH2M que lleva 5 sustituciones de aminoácidos encontradas en SHaPrP que queda entre los codones 94 y 188. [Scott y colaboradores, Cell 73:979-988 (1993)]. Hicimos un gen de PrP humano/de ratón quimérico análogo, al que llamamos MHu2M, en donde la misma región del gen del ratón es reemplazada por la secuencia humana correspondiente que difiere de la PrP de ratón en 9 codones, como se muestra en la Figura 2. Hemos descubierto que los ratones que expresan el transgen quimérico MHu2M son susceptibles a los priones humanos después de tiempos de incubación abreviados. Más específicamente, los ratones transgénicos de la presente invención que incluyen al gen MHu2M quimérico, después de la inoculación con priones humanos, desarrollarán síntomas de enfermedad atribuidos a los priones dentro de aproximadamente 200 días + 50 días. Además, el 80 por ciento ó más de los ratones transgénicos de la invención inoculados con priones humanos, desarrollarán síntomas de la enfermedad, más preferiblemente el 98 por ciento ó más de los ratones desarrollarán síntomas de la enfermedad. De conformidad con los experimentos realizados, el 100 por ciento de los ratones MHu2M transgénicos inoculados con priones humanos realmente desarrollaron síntomas de la enfermedad en aproximadamente 200 días + 50 días. Estos descubrimientos indican que las células de murino no pueden convertir fácilmente la HuPrPc en HuPrPSc, pero pueden procesar la MHu2MPrPc en MHu2MPrPSc. Ya que los ratones Tg(MHu2M) desarrollan neurodegeneración más rápidamente que los monos, proporcionan un huésped preferido para los bioensayos de infectividad en tejidos de seres humanos que mueren de enfermedades priónicas. Los ratones TG(MHu2M) descritos en la presente proporcionan un excelente sistema para evaluar la esterilidad de los productos farmacéuticos preparados a partir de fuentes humanas. Otros ratones transgénicos que incluyen el gen de proteína de prión del animal en peligro de infección, se pueden utilizar para probar muestras por enfermedades priónicas que pueden infectar a los animales domésticos, tales como ovejas y ganado.

Gen MHu2M quimérico La Figura 1 se muestra con respecto a la manera de crear el gen MHu2M quimérico. Al principio, diseñamos un nuevo sitio Kpnl en el cásete de marco de lectura abierta HuPrP (mostrado sombreado) , cambiando el nucleótido 282 desde una citosina hasta un residuo de timina mediante mutagénesis medida por reacción de cadena de polimerasa. Este cambio mutagénico conserva la secuencia de aminoácidos de HuPrP. Se utilizó un segundo cebador de oligonucleótido complementario para las secuencias de ADN alrededor del producto cortado con BstEII para reemplazar el fragmento de gen MoPrP correspondiente (el gen MoPrP no está sombreado) , creando el gen híbrido MHu2M. La microinyección de una construcción cosSHa.Tet que llevaba este cásete de expresión, dio como resultado el animal fundador Tg(MHu2M)FVB-B5378. Una representación expandida de la región de MHu2MPrP entre los codones 94 y 188, está flanqueada por las secuencias MoPrP (Figura 2) . MHu2MPrP difiere de MoPrP por nueve aminoácidos en la región en donde están los aminoácidos 96 y 167. Estos residuos de aminoácidos que se derivan de HuPrP se muestran sobre la sección inferior del diagrama; los aminoácidos en la misma posición de MoPrP se muestran arriba. La discrepancia de las posiciones de aminoácidos se debe a que la MoPrP tiene un aminoácido menos que la HuPrP en la región inmediatamente corriente arriba desde el reemplazo.

Genes de PrP artificiales El poder real de la presente invención está en el entendimiento de que se pueden crear una variedad de diferentes genes de PrP artificiales que, cuando se insertan en un primer mamífero, harán que ese mamífero sea susceptible a la infección con priones que normalmente sólo infectan a un segundo mamífero genéticamente diferente. Hay casi un número infinito de genes de PrP artificiales posibles que satisfarían los criterios básicos de la invención, es decir, haciendo a un mamífero, tal como un ratón, susceptible a la infección con priones que normalmente infectarían sólo a un mamífero genéticamente diferente, tal como un ser humano. El gen MHu2M de la invención solamente es un ejemplo específico de un gen artificial que logra el objeto primario de la invención. Al realizar las Figuras 3, 4 y 5, otras numerosas posibilidades de genes artificiales serán deducidas por los expertos en este campo. Específicamente, haciendo referencia a la Figura 3, se pude determinar fácilmente la secuencia de aminoácidos de PrP de ratón, y observar las posiciones en donde la secuencia de PrP de ratón difiere con una secuencia de PrP humana. Por consiguiente, para crear un gen artificial, se puede sustituir un codón (ó secuencia de codones) de un gen de PrP de ratón con un codón (ó secuencia de codones) de un gen de PrP humana en la misma posición que codificará un aminoácido diferente -se puede utilizar cualquiera (pero no todos) de los codones en donde aparezcan secuencias diferentes para la sustitución. Haciendo referencia a la Figura 4, se puede ver la manera en que sería posible producir genes de PrP artificiales, en donde se podría insertar el gen resultante en un ratón, con el objeto de hacer que el ratón sea susceptible a la infección con priones bovinos. Se puede deducir una estrategia similar con respecto a la producción de un ratón que sea susceptible a la infección con priones de oveja, al revisar la Figura 5. En adición a estas posibilidades, los expertos en este campo reconocerán que, en ciertos casos, se pueden utilizar secuencias de nucleótidos completamente artificiales como sustitutos correspondientes para una porción de la secuencia natural, con el objeto de obtener un gen artificial útil que, al insertarse en un animal, haga que ese animal sea susceptible a la infección con priones que normalmente infectarían sólo a un mamífero genéticamente diferente.

Evidencia de la enfermedad Se ha encontrado PrPSc en los cerebros de ratones Tg(MHu2M) afectados después de la inoculación con priones Hu (CJD) ó Mo (RML) . Los homogenatos de cerebro de Tg(MHu2M) se dejaron sin digerir, ó se digirieron con proteinasa K (BMB) hasta una concentración final de 20 microgramos/mililitro durante una hora a 37°C (pistas con número pares) . Las muestras se resolvieron mediante SDS/PAGE y luego se analizaron mediante mancha Western. La distribución de PrPc y PrPSc en ratones Tg(MHu2M) clínicamente enfermos, inoculados con priones Mo (RML) y Hu (CJD) se detectó mediante el método de histomancha. Las histomanchas incluyeron aquéllas de secciones coronales a través de la región del hipocampo y del tálamo. Se observan diferencias entre: (A) PrPc en ratón infectado Mo (RML) ; (B) PrPc en ratón infectado con CJD RG esporádica; (C) PrPSc en ratón infectado Mo (RML) ; (D) prPSc en ratón infectado con CJD RG esporádica; (E) PrPSc en ratón infectado con CJD EC esporádica; y (F) PrPSc en ratón infectado con CJD (#364) iatrógenica.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se estipulan para proporcionar a los expertos ordinarios en este campo, una revelación y descripción completa de manera de hacer y utilizar los genes quiméricos, los ratones transgénicos, y los ensayos de la presente invención, y no se pretenden para limitar el alcance de lo que los inventores consideran como su invención. Se han hecho esfuerzos por asegurar la precisión con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero se deben contar algunos errores experimentales y desviaciones. A menos que se indique de otra manera, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio en peso, la temperatura está en grados centígrados, y la presión está en ó cerca de la atmosférica.

Ejemplo 1 Construcción de Gen Quimérico (MHu2M) La fuente del marco de lectura abierta del HuPrP para la construcción de un cásete de expresión ya se ha descrito [Hsiao y colaboradores, Nature 338:342-345 (1989)]. La construcción del gen MHu2M se describe en relación con la descripción de la Figura 1. Todos los casetes de marco de lectura abierta de PrP estuvieron flanqueados por Salí y Xhol, que se disociación inmediatamente adyacentes a los codones de iniciación y de terminación de PrP del marco de lectura abierta de PrP, respectivamente, permitiendo una subclonación conveniente en el vector de expresión de cósmido cos.SHaTet [Sco*t y colaboradores, Cell 73:979-988 (1993)]. El aislamiento y la selección de los clones de cósmido recombinantes se lograron mediante métodos que ya se han descrito previamente [Scott y colaboradores, Cell 73:979-988 (1993) ].

Ejemplo 2 Producción de Ratones Transqénicos/Tq(MHu2M) Se verificaron las secuencias de nucleótidos de los marcos de lectura abierta de HuPrP y MHu2MPrP del Ejemplo 1. Los fragmentos del cósmido Notl, recuperados a partir de preparaciones de ADN a gran escala, se utilizaron para la microinyección en los pronúcleos de oocitos C57BL/6 X SJL ó FVB/N fertilizados, como fue descrito anteriormente [Scott y colaboradores, Cell 59:847-857 (1989); Scott Protein Sci 1:986-997 (1992)]. El ADN genómico aislado del tejido de la cola de animales destetados se seleccionó por la presencia de transgenes incorporados utilizando una sonda que se hibridiza en la región 3' -no trasladada del gen SHaPrP contenido en el vector cosSHa.Tet [Scott y colaboradores, Protein Sci. 1:986-997 (1992)]. La progenie obtenida se probó, y se confirmó que el gen MHu2M quimérico estaba integrado en el genoma de la progenie. Como se muestra en el Ejemplo 5 más adelante, se descubrió que estos ratones son susceptibles a la infección con priones humanos el 100 por ciento del tiempo.

Ejemplo 3 Preparación de Homoqenatos de Cerebro Se preparó un homogenato al 10 por ciento [peso/volumen] de una muestra de tejido de cerebro humano descongelado en suero regulado con fosfato que carecía de iones de calcio y de magnesio. El tejido inicialmente se disoció utilizando un homogeneizador desechable estéril, y esta suspensión se sometió a extrusión repetida a través de una aguja de jeringa calibre 18, seguida por una aguja calibre 22. Las muestras para la inoculación en los animales de prueba se diluyeron diez veces. Se prepararon homogenatos de cerebros de ratón transgénico y no transgénico clínicamente enfermos de la misma manera, excepto porque se omitió el paso de disociación inicial.

Ejemplo 4 Fuentes de los Inóculos de Priones Se derivan inóculos humanos a partir de tejidos de cerebro congelados de pacientes, en donde se había confirmado el diagnóstico clínico de Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob ó Enfermedad de Gerstmann-Strassler-Scheinker, mediante examen histopatológico de los tejidos cerebrales, y en la mayoría de los casos, mediante análisis de proteína de prión. En algunos casos, el gen de PrP se amplificó mediante reacción de cadena de polimerasa del ADN aislado de la sangre del paciente, y la secuencia de PrP se determinó mediante análisis de secuencia de ADN. No se detectaron mutaciones de HuPrP en los casos de Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob esporádica ó iatrogénica. El aislado RML se obtuvo de obtuvo de ratones suizos [Chandler, R.L. Lancet 1:1378-1379 (1961)], a partir de una colonia cerrada en el Rocky Mountain Laboratory, ó en ratones suizos CD-1 obtenidos de Charles River Laboratories.

Ejemplo 5 Determinación de Períodos de Incubación de Raspadura Se inocularon ratones transgénicos de acuerdo con el Ejemplo 2, intracerebralmente, con 30 microlitros de extracto de cerebro utilizando una aguja calibre 27 insertada en el lóbulo parietal derecho. La preparación de los inóculos y los criterios para el diagnóstico de raspadura en ratones ya han sido descritos [Carlos y colaboradores, Cell 46:503-511 (1986) ] . Empezando 50 días después de la inoculación, los ratones se examinaron por disfunción neurológica cada tres días. Cuando aparecieron los signos clínicos de raspadura, los ratones se examinaron diariamente. Cuando se identificaron algunos animales cuya muerte fue obviamente inminente, se tomaron sus cerebros para los estudios histopatológicos (de acuerdo con los procedimientos del Ejemplo 3) , y la confirmación del diagnóstico de raspadura.

Ejemplo 6 Análisis de Inmunomanchado Para la determinación de los niveles relativos de expresión de PrP en cerebros de ratón transgénico y humano, se determinaron las concentraciones de proteína mediante ensayos con ácido bicinconínico e inmunomanchas de puntos, como ha sido descrito anteriormente [Scott y colaboradores, Cell 73:979-988 (1993)]. Se prepararon muestras para análisis de mancha Western, y se realizaron manchas Western como se describió anteriormente [Towbin y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350-4354 (1979)], excepto que se utilizó el método de detección quimiluminescente mejorado (ECL) (Amersham) . La mancha se expuso a película de rayos X durante 5 a 60 segundos. Se utilizó antisuero de conejo a-PrP R073 en una dilución final de 1:5000, y también se empleó anticuerpo monoclonal 3F4 [Serban y colaboradores, Neurology 40:110-117 (1990)].

Ejemplo 7 Los Ratones Tq(MHu2MPrP) son Susceptibles a los Priones Humanos Utilizando la información de un estudio sistemático de genes de PrP de hámster sirio/ratón quiméricos, se construyó un gen de PrP humana/de ratón quimérico análogo al MH2M de acuerdo con el Ejemplo 1. Este gen, al que llamamos MHu2M, difiere del MoPrP en 9 posiciones, todas las cuales quedan entre los codones 94 y 188, como se muestra en la Figura 2. Se construyó un ratón transgénico que expresaba el gen de PrP MHu2M, y el fundador se designó Tg(MHu2M)FVB-B5378 de acuerdo con el Ejemplo 2. Mediante una dilución en serie del ratón Tg(MHu2M) y homogenatos de cerebro humano, estimamos que el nivel de MHu2MPrPc en los cerebros de estos ratones Tg(MHu2M)FVB-B5378 son similares a aquellos de HuPrPc encontrados en cerebro humano, utilizando un procedimiento de inmunomanchado de puntos. Los ratones Tg(MHu2M) de acuerdo con el Ejemplo 2, se inocularon con homogenatos de cerebro de tres pacientes caucasianos no relacionados que habían muerto de Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob. Dos de los tres pacientes murieron de Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob esporádica: uno (R.G.) fue una mujer americana de 56 años de edad; el otro (E.C.) fue una mujer canadiense de 61 años de edad. En ambos casos, la biopsia cerebrocortical mostró una severa degeneración espongiforme. El tercero (#364) fue un joven británico que había contraído la Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob iatrogénica después del tratamiento para hipopituitarismo con hormona de crecimiento humana (HGH) deriva a partir de pituitarias cadavéricas [Collinge y colaboradores, Lancet 337:1441-1442 (1991)]. Los homogenatos de cerebro de los tres pacientes de Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob exhibieron PrP resistente a proteasa mediante inmunomanchado Western. Esta isoforma de PrP resistente a la proteasa está designada como PrPSc, ó con frecuencia como PrPCJD, cuando se encuentra en seres humanos. Todos los ratones Tg(MHu2M) inoculados con homogenatos de los pacientes de Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob descritos anteriormente, desarrollaron signos de disfunción del sistema nervioso central (CNS) aproximadamente 200 días después de la inoculación (ver la Tabla 1 más adelante) . Los signos clínicos fueron similares a aquellos de la raspadura de murino. Después de desarrollar los signos clínicos, los ratones Tg(MHu2M) inoculados murieron rápidamente, con frecuencia dentro de un día. Dos de los ocho ratones Tg(MHu2M) no inoculados son ahora de >500 días de edad, y siguen bien; el más joven de los otros seis animales no inoculados es más viejo que la edad en la cual los ratones Tg(MHu2M) inoculados desarrollaron signos de disfunción del sistema nervioso central. La inoculación de los ratones Tg(MHu2M) con priones Mo (RM1) pasados en ratones, produjo la enfermedad en 178 + 3 días, que es aproximadamente 40 más que los priones Mo (RML) en ratones no transgénicos. La prolongación de los tiempos de incubación en los ratones que expresan transgenes que no son de murino, está bien establecida, y se presenta presumiblemente debido a que la molécula de PrPc extraña inhibe la conversión de MoPrPc en MoPrPSc [Prusiner y colaboradores, Cell 63:673-686 (1990)]. En contraste con los ratones Tg(MHu2M) , los tiempos de incubación para los priones RML en los ratones Tg(MH2M) fueron iguales a aquellos de los ratones no transgénicos [Scott Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número Cell 73:979-988 (1993)].

Tabla 1. Incubación de inóculos de priones humanos (CJD) yed ratón (RML) en ratones Tg(MHu2M)FVB-5378.

Tiempos de incubación (días promedio + error estándar) a Número de animales que desarrollan la enfermedad clínica (disfunción neurológica) dividido entre el número total de animales inoculados. En el caso del inoculo RG, se encontraron tres animales muertos después de 224, 238 y 243 días antes de que se pudiera hacer un diagnóstico clínico. En el caso del inoculo EC, se encontraron dos animales muertos después de 225 y 226 días antes de que se pudiera hacer un diagnóstico clínico. En cada caso, estos animales murieron al mismo tiempo en que se hizo el diagnóstico clínico en otros animales inoculados. b El número de ratones que murieron de raspadura se muestra entre paréntesis. Los ratones sacrificados para el examen patológico se excluyen de estos cálculos.

Ejemplo 8 Ejemplo Comparativo Ratones Tq(HuPrP) Resistentes a Priones Humanos Se produjeron ratones transgénicos que expresan HuPrP utilizando el marco de lectura abierta del gen HuPrP, que se había clonado en el vector de expresión cosSHA.Tet [Scott y colaboradores, Protein Sci. 1:986-997 (1992)]. La microinyección de embriones de ratón FVB hexógamos C57B6/SJL y endógamos dio como resultado dos animales transgénicos fundadores designados como Tg(HuPrP)B6SJL-110 y Tg(HuPrP)FVB-152. Estimamos, mediante dilución en serie de homogenatos de cerebro e inmunomanchado de puntos, que el nivel de PrPc en los cerebros de la progenie de estos fundadores, expresa HuPrP en niveles de 4 a 8 veces más altos que en lugar de HuPrP encontrada en el cerebro humano. Para determinar si la expresión de HuPrP en Tg(HuPrP)B6SJL-110 y Tg(HuPrP) FVB-152 confería susceptibilidad a los priones humanos, se midieron los períodos de incubación después de la inoculación de Tg(HuPrP) y ratones no transgénicos con extractos de cerebro de 18 pacientes que habían muerto de Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob esporádica, Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob iatrogénica, Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob familiar, ó Enfermedad de Gerstmann-Strassler-Scheinker. A partir de los experimentos realizados durante los pasos 2.5 años, concluimos que las dos líneas de ratones Tg(HuPrP) no respondían más que los ratones no transgénicos a los priones humanos (ver la Tabla 2 más adelante) . El índice de transmisión a los ratones Tg(HuPrP) fue del 8.3 por ciento (14 ratones clínicamente enfermos de 169 ratones) , que fue similar a un índice de transmisión del 10.3 por ciento en los ratones no transgénicos de control (6 ratones clínicamente enfermos de 58 ratones) . En el evento infrecuente de una transmisión positiva, los tiempos de incubación eran extremadamente largos, siendo de 590 días a 840 días, tanto en ratones Tg(HuPrP) como no transgénicos. Para este último tiempo, muchos animales habían muerto de enfermedades intercorrientes que complicaban el diagnóstico. La dificultad de interpretar las transmisiones que se presentaban después de períodos de incubación extremadamente largos, aumentaba por el más alto potencial de resultados artificiales, debido a bajos niveles de priones contaminantes.

El análisis estadístico muestra que la frecuencia de la transmisión del prión humano a los ratones Tg(MHu2MPrP) comparándose con los ratones Tg(HuPrP) y no transgénicos, es altamente significativo, utilizando la prueba exacta de Fisher, p<10~7 [Metha y colaboradores, J. Am. Stat. Assn. 78: (392) 427-434 (1983)]. Cuando se comparó la transmisión del prión humano a los ratones Tg(HuPrP) , con los ratones no transgénicos, las frecuencias fueron similares p=0.79. Para confirmar el diagnóstico clínico de la enfermedad priónica, se sacrificaron 5 ratones Tg(HuPrP) enfermos y un ratón no transgénico, y se examinaron los extractos de cerebro por la presencia de PrPSc mediante mancha Western, con anticuerpos a-PrP, 3F4 mAb y antisuero R073 [Kascsak y colaboradores, J. Virol. 61:3688-3693 (1987); Serban y colaboradores, Neuroloqy 40:110-117 (1990)]. El 3F4 mAb reacciona específicamente con HuPrP, permitiendo la discriminación de MoPrP. Se detectó MoPrPSc en el cerebro del ratón no transgénico inoculado con el inoculo de Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob esporádica #87011, que desarrolló signos clínicos después de 756 días, mientras que se detecto PrPSc reactiva con 3F4 en los cerebros de dos ratones Tg(HuPrP) que desarrollaron signos clínicos después de 589 días después de la inoculación con inoculo de Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob iatrogénica #170. Es notable el descubrimiento de que los fragmentos resistentes a proteasa de cualquier HuPrPSc de ratones Tg(HuPrP) enfermos emigran más rápidamente en SDS/PAGE que aquellos de HuPrPCJD de cerebro humano con Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob y MoPrPSc de cerebro de ratón no transgénico. El hecho de que esto refleje ó no una proteólisis más extensa del término N, debido a las diferencias en la conformación que resultan de un pliegue alterado de HuPrP en una célula de ratón, todavía falta por establecerse. Los índices de transmisión equivalentes de priones humanos en ratones Tg(HuPrP) no transgénicos, indican que éste es un evento raro con la misma frecuencia de presentación que en la conversión estocástica de MoPrPc en MoPrPSc inducida por priones humanos. La ausencia de PrPSc que reacciona con R073 ó con 3F4 en los cerebros de 3 de los 6 ratones analizados, puede reflejar la dificultad de diagnosticar precisamente la enfermedad priónica en los animales viejos. Algunos de los ratones heredaron enfermedades priónicas tanto de humanos como de ratones transgénicos que exhibían niveles pequeños ó no detectables de PrP resistente ala proteasa; no obstante, basándose en los estudios de transmisión, sus cerebros contienen priones, y muestran una clara degeneración espongiforme [Medori, R. y colaboradores, N. Engl. J. Med. 326, 444-449 (1992); Hsiao y colaboradores (en preparación (1994) ] . En contraste con los ratones Tg(MHu2M), los priones humanos del paciente RG no se han transmitido a ratones Tg(HuPrP) ó no transgénicos después de >330 días (ver la Tabla 2 más adelante) . Los intentos por transmitir preparaciones enriquecidas para bastones de priones humanos preparadas a partir del cerebro del paciente RG, de la misma manera han sido negativos durante >300 días. En adición, el inoculo del caso de Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob iatrogénica (#364) no ha producido enfermedad en los ratones Tg(HuPrP) ni en los ratones no transgénicos después de >780 días (como se muestra en la siguiente Tabla 2) .

Tabla 2. Tiempos de incubación en ratones Tg(HuPrP)FVB-152 y Tg(HuPrP)B6SJL-110 después de inoculación con extractos de cerebro de pacientes con enfermedades priónicas humanas.

Huésped Inoculo (n/n0) Tiempos de incubación (días + error estándar E)b CJD esporádica (#87011) 1/10 706 Tg 152 CJD esporádica (#87011) 3/5 697.3+51 No TG CJD esporádica (#88037) 3/10 680+28 Tg 152 CJD esporádica (RG) 0/10 Tg 152 CJD esporádica (RG) 0/10 No Tg Bastones esporádicos (RG) 0/8 Tg 152 Bastones esporádicos (RG) 0/8 No Tg Codón 102 GSS (#87027) 4/10 724+16 Tg 152 Codón 102 GSS (#87027) 0/10 679 No Tg Codón 102 GSS (#87031) 0/10 Tg 152 Codón 102 GSS (#87031) 1/5 742 No Tg Codón 178 F-CJD 0/8 Tg 152 Codón 178 F-CJD 0/8 No Tg CJD esporádica (#87036) 0/8 Tg 110 CJD esporádica (#87036) 1/5 838 No Tg CJD iatrogénica (#703) 0/10 Tg 110 CJD iatrogénica (#703) 0/5 No Tg Tg 110 CJD iatrogénica (#170) 2/10 589+0 CJD iatrogénica (#170) 0/5 No Tg CJD iatrogénica (#364) Tg 110 0/10 CJD iatrogénica (#364) 0/5 No Tg Codón 200 F-CJD 1/8 Tg 110 791 Codón 217 GSS 1/8 Tg 110 874 a Número de animales que desarrollaron enfermedad clínica dividido entre el número de animales inoculados. b Se refiere al tiempo para diagnosticar la enfermedad. c_f Pacientes a partir de los cuales se derivó el inoculo, que se describen en las siguientes publicaciones: [Collinge Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número Lancet 337:1441-1442 (1991); Hsiao y colaboradores, Nature 338:342-345 (1989); Hsiao y colaboradores, Neuroloqy 41:681-684 (1991)].

Ejemplo 9 Formación de MHu2MPrPSc ó MoPrPSc en los Cerebros de Ratones Tq(MHu2M) Algunos ratones Tg(MHu2M) clínicamente enfermos inoculados con cada uno de los tres inóculos de priones de Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob ó priones RML, se sacrificaron para la verificación histopatológica de la enfermedad, y para el análisis de proteína de prión. Las manchas Western de los homogenatos de cerebro de los ratones Tg(MHu2M) infectados con priones humanos sondeados con anticuerpos R073 y 3F4 aPrP revelaron la presencia de PrPSc resistente a la proteasa, que reaccionó con el anticuerpo monoclonal 3F4, mostrando que este producto resistente a la proteasa es PrPSc MHu2M. El epítopo reconocido por este anticuerpo consiste en un par de residuos de metionina en las posiciones 109 y 112 en PrP [Rogers y colaboradores, J. Immunol. 147:3568-3574 (1991)] que están contenidos en MHu2M, pero no en MoPrP, como se puede ver por la comparación de ratón/humano de la Figura 2. El antisuero R073 de a-PrP de conejo policlonal diluido a 1:5000 fue pobremente reactivo con MHu2MPrPSc, así como con HuPrP0 y HuPrPSc de cerebros humanos enfermos. Los homogenatos de cerebro de ratones Tg(MHu2M) infectados con priones RML contenían prPSc que fue detectable solamente con R073, y no con los anticuerpos 3F4 a-PrP, indicando que los ratones Tg(MHu2M) son capaces de producir MoPrPSc, pero no MHu2MPrPSc en respuesta a los priones RML previamente pasados a los ratones. Aunque estos descubrimientos son similares a aquellos reportados para ratones Tg(SHaPrP) [Scott y colaboradores, Cell 59:847-857 (1989)], contrastan con aquellos encontrados para ratones Tg(MH2MPrP) , en donde se formó MH2MPrPSc en respuesta a los priones RML [Scott y colaboradores, Cell 73:979-988 (1993)].

Ejemplo 10 Distribución Regional de PrPSc y Patrones de Neuropatoloqía La distribución de PrPc y PrPSc de ratón y MHu2M se muestra en histomancha de secciones de cerebro coronal a través del hipocampo y el tálamo de ratones Tg(MHu2M) inoculados con priones RML ó CJD. La débil inmunorreactividad de la PrP de MHu2M con R073 permitió un grado de análisis que no había sido anteriormente posible en los ratones transgénicos que expresaban SHaPrP ó MH2MPrP, debido a que estas especies de PrP reaccionan con este anticuerpo. El patrón de depósito de PrPSc dependió mucho de la especie de origen de los priones infecciosos. Cuando se inocularon con priones RML, las histomanchas de los cerebros de Tg(MHu2M) fueron similares a aquéllas de los ratones CD-1 infectados con priones MRL, revelando un patrón difuso de depósito de MoPrPSc en el hipocampo, en el tálamo, en el hipotálamo y en todas las capas de la neocorteza. El patrón de histomancha fue sorprendentemente diferente para los ratones Tg(MHu2M) inoculados con priones CJD. El depósito de MHu2MPrPSc se confinó primariamente a las capas profundas de la neocorteza, el tálamo, particularmente el núcleo talámico medial posterior ventral, el hipotálamo y el putamen. La región del hipocampo y las capas externas de la neocorteza estaban dispersas. Es interesante que, aunque el hipocampo estaba completamente vacío de MHu2MPrPSc, esta región mostró la señal más intensa de MHu2MPrPc. Se observó consistentemente el mismo patrón de depósito de MHu2MPrPSc en histomanchas de ratones Tg MHu2M) inoculados con los tres aislados del prión CJD preparados a partir de cerebro humano. Vale la pena notar que el patrón de depósito de MHu2MPrPSc es similar al patrón de depósito de PrpCJD observado en histomanchas del cerebro, a partir del cual se derivó el inoculo RG [Taraboulos y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7620-7624 (1992)]. La degeneración espongiforme en los cerebros de los ratones Tg(MHu2M) infectados con los priones Mo (RML) y Hu (CJD) reflejó los patrones de acumulación de PrPSc descritos anteriormente. La presente invención se muestra y se describe en la presente, en lo que se considera como las modalidades más prácticas y preferidas. Sin embargo, se reconoce que se pueden hacer apartamientos que estén dentro del alcance de la invención, y que un experto en la técnica pensará en modificaciones al leer esta descripción.

LISTADO DE SECUENCIA (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: The Regents of the University of California, (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: MÉTODO PARA DETECTAR PRIONES EN UNA MUESTRA, Y ANIMAL TRANSGENICO UTILIZADO PARA LO MISMO, (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 4 (iv) DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO: Robbins, Berlinger & Carson (B) CALLE: 201 N. Figueroa Street, 5th Floor (C) CIUDAD: Los Angeles (D) ESTADO: CA (E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL; 90012-2628 (V) FORMA LEGIBLE POR COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disco flexible (B) COMPUTADORA: IBM PC compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentin Reléase #1.0, Versión #1.25 (vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL: (A) NUMERO DE SOLICITUD: (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: (C) CLASIFICACIÓN (viii) INFORMACIÓN DE ABOGADO/GENTE: (A) NOMBRE: Berliner, Robert (B) NUMERO DE REGISTRO: 20,121 (C) REFERENCIA/NUMERO DE CASO: 5555-313 (ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN: (A) TELEFONO: (213) 977-1001 (B) TELEFAX : (213) 977-1003 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:l: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 254 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: PROTEINA DE PRION DE RATÓN MoPrP (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:l: Met Ala Asp Leu Gly Tyr Trp Leu Leu Ale Leu Phe Val Thr Met Trp 1 5 10 15 Thr Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Trp Asn 20 25 30 Thr Gly Gly Ser ?rg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly Gly Asn Arg 35 40 45 Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Thr Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp 50 55 60 Gly Glp Pro H.s Gly Gly Ser Trp Gly Glp Pro Hiß Gly Gly Ser Trp 65 70 75 80 Gty Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Gly Thr His Aßn 85 90 95 Gin Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Leu Lys His Vel Ala 100 105 110 Gly AU Ala Ala Ala Gly Ale Val Val Gly Gly Leu Gly Gly Tyr Met 115 120 125 Leu Gly Ser Ala Met Ser Arg Pro Met ]le His Phe Cly Asn Asp Trp 130 135 K0 Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Tyr Arg Tyr Pro Asn Gln Val K5 150 155 160 Tyr Tyr Arg Pro Val Asp Gln Tyr Ser Asn Gln Asn Asn Phe Val His 165 170 175 Asp Cys val Asn He Thr He Lys Gln His Thr Val Thr Thr Thr Thr 180 185 190 Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp Val Lys Mee Met Glu Arg Val 195 200 205 Val Glu Gln Met Cys Val Thr Gln Tyr Gln Lys Glu Ser Gln Ala Tyr 210 215 220 Tyr Asp Gly Arg Arg Ser Ser Ser Thr Val Leu Phe Ser Ser Pro Pro 225 230 235 240 Val He Leu Leu lie Ser Phe Leu He Phe Leu He Val Gly 245 - 250 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 253 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: PROTEINA DE PRION HUMANA, HuPrP (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 2: Met Ala Asn Leu Cly Cys Trp Met Leu Val Leu Phe Val Ala Thr Trp 1 5 10 15 Ser Asp Leu Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly Trp Asn 20 25 30 Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly Gly Asn Arg 35 ¿0 ¿5 Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly 50 55 . 60 Trp Gly Gln Pro H.s Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly *5 70 75 80 Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Gly Thr His 85 90 9$ Ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Mßt 100 105 no Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Gly Tyr 115 120 125 Het eu Gly Ser Ala ?e> er Arg Pro He i le His Phe Gly Ser Asp l3U 135 uo Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met His Arg Tyr Pro Asn Gln K5 1S0 155 160 Val Tyr Tyr Arg Pro Met Asp Glu Tyr Ser Asn Gln Asn ASn Phe Val 165 170 1 5 His Asp cys val Asn He Thr He Lys Glp His Thr val Thr Thr Thr 180 185 190 Thr Lys Gly .Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp Val Lys Met Met Glu Arg 195 200 205 Val Val Gtu Olp Het Cys He Thr Gln Tyr ßlu Arg Gl? Ser ßln a £i? 21 220 Tyr Tyr Glp Arg Gly ser Ser Met Val Leu Phe Ser Ser Pro Pro Val 225 30 235 240 He Leu ?.eu He Ser Phe Leu He Phe Leu He Val Gly 245 ?<50 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 263 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: PROTEINA DE PRION BOVINA, BoPrP (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 3: Met Val Lys Ser H?s He Gly Sßr Trp He Leu Val Leu Phß vai Ala 1 5 10 5 Met Trp Ser Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gty 20 25 30 Trp Asn Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Glp Gly Ser Pro Gly Gly 35 40 45 Asn Arg Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Cly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly 50 55 60 Gly Gly Trp Gty Gtn Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly 65 70 75 80 Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly 85 90 95 Gly Gly Gly Trp Gly Gln Gly Gly Thr His Gly Gln Trp Asn Lys Pro 100 105 110 Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His Val Ala Gly Ala Ala Ala Ale 115 120 125 Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Gly Tyr Met Leu Gly Ser Ala Met 130 135 140 Ser Arg ro Leu He His Phe Gly Ser Asp Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr 145 150 155 160 Arg Giu Asn Met His Arg Tyr Pro Asn Gtn Vat Tyr Tyr Aro Pro vat 165 170 175 Asp Gln Tyr Asn He Thr val Lys Glu His Thr Val Thr rhr Thr Thr Lys Gly Glu Asn Phe 105 200 205 Thr Glu Thr Asp He Lys Met Met Glu Arg Val Val Glu Gln Met Cys «»s 215 220 Val Thr Gtn Tyr Gln Lys Glu Sßr Gln Ala Tyr Tyr Asp Gln Gly Ala 225 230 235 2¿0 Ser val He Leu Phe Ser Ser Pro Pro Val He Leu Leu He Ser Phe ^5 250 255 Leu He Phe Leu He Val Gly 260 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 255 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADENA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: PROTEINA DE PRION DE OVEJA, ShPrP (ix) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: : Met Val Lys ser His He Gly Ser Trp He Leu val Leu Phe Val Ala 1 5 10 15 Met Trp Ser Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro Gly Gly 20 25 30 Trp Asn Thr Gly Gly Ser Arg Tyr Pro Gly Gln Gly Ser Pro Gly Cly 35 40 45 Asn Arg Tyr Pro Pro Gln Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro Hís Gly 50 55 60 Gly Gly Trp Gly Glp Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gln Pro His Gly 65 70 75 B0 Gly Ser Trp Gly Gln Pro His Gly Gly Gty Gly Trp Gty Gtn Gly Gly B5 90 95 Ser His ser Gln Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lvs Thr Asn Met Lys 100 105 110 His Val Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Vat Gly Gly Leu Gly 115 120 125 Gly Tyr Met Leu Gly $ttr Ala Met Ser Arg Pro Leu He His Phe Gly 130 135 H0 Asp Asp Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Tyr Arg Tyr ro 1¿5 150 155 160 Asn Gln Vat Tyr Tyr Arg Pro Val Asp Gln Tyr Ser Asn Gln Asn Asn 165 170 175 Phe Val MIS Asp C^S Val Asn Hß Thr Val Ly Cln His Thr Val Thr 180 185 190 Thr Thr Thr Lys Gty Glu Asp Phe Thr Glu Thr Asp He Lys He Met 19S 200 205 Glu Arg Val Val Glu Gln Met Cys He Thr Gln Tyr Gln Arg Glu Ser 210 215 220 Glp Ala Tyr Tyr Gln Arg Gly Ala Ser Val He Leu Phe Ser Ser Prc 225 230 235 2 0 Pro Val He Leu Leu He Ser Phe Leu He P e Leu He Val Gly 2<-5 250 255

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Un gen de PrP artificial caracterizado de tal manera que, cuando se inserta en el genoma de un primer mamífero, hace al mamífero susceptible a la infección con priones que normalmente infectan sólo a un segundo animal genéticamente diferente.

2. El gen de PrP artificial de la reivindicación 1, en donde el primer mamífero es un ratón ó una rata, y el segundo mamífero genéticamente diferente se selecciona a partir del grupo que consiste en un ser humano, una vaca y una oveja; y en donde el gen está comprendido de una secuencia de codón natural de un gen de PrP del primer mamífero con uno ó más, pero no todos, de sus codones reemplazados con un codón diferente de un gen de PrP natural del segundo animal genéticamente diferente.

3. Un gen quimérico, el cual comprende: secuencias de codón de término C y término N de un gen de PrP de un mamífero de un primer género; secuencias de codón de un gen de PrP de un mamífero de un segundo género operativamente conectadas entre las secuencias de codón del término N y el término C del mamífero del primer género, en donde el gen quimérico hace que un mamífero del primer género sea susceptible a la infección con un prión normalmente infeccioso solamente para un mamífero del segundo género, cuando se inserta operablemente el gen quimérico en el genoma de un mamífero del primer género; además, en donde el primer género se selecciona a partir del grupo que consiste en Mus, Rattus, Oryctolagus y Mesocricetus; y todavía además, en donde el segundo género se selecciona a partir del grupo que consiste en Bos, Ovis, Sus y Homo.

4. Un mamífero transgénico que tiene un genoma comprendido de un gen de PrP artificial, en donde el mamífero es susceptible a la infección con un prión que normalmente no infecta a una especie del mamífero que carezca del gen de PrP artificial.

5. El mamífero transgénico de la reivindicación 4, el cual pertenece a un género seleccionado a partir del grupo que consiste en Mus, Rattus, Oryctolagus y mesocricetus; en donde el género diferente de mamífero se selecciona a partir del grupo que consiste en Bos, Ovis, Sus y Homo; en donde el tiempo de incubación es de aproximadamente 200 días + 50 días.

6. El mamífero transgénico de la reivindicación 4, en donde el gen de PrP endógeno se ablaciona.

7. Un método para probar una muestra por la presencia de priones, el cual comprende: inocular un mamífero transgénico con la muestra, en donde el mamífero tiene un genoma comprendido de un gen de PrP artificial, y es susceptible a la infección con un prión que normalmente no infecta a una especie de un mamífero que carezca del gen de PrP artificial; y observar el mamífero transgénico con el objeto de determinar si el mamífero desarrolla síntomas de la infección priónica.

8. El método de la reivindicación 7, en donde el gen de PrP endógeno del mamífero se ablaciona.

9. El método de la reivindicación 7, en donde la formulación farmacéutica es una formulación seleccionada a partir del grupo que consiste en formulaciones inyectables, orales, cremas, supositorios, y formulaciones de aplicación intrapulmonar.

10. Un método para determinar la causa de muerte de un animal, el cual comprende: extraer tejido de cerebro de un animal que ha muerto; inocular un mamífero transgénico con el tejido de cerebro extraído, en donde el mamífero transgénico tiene un genoma comprendido de un gen de PrP artificial, y es susceptible a la infección con un prión del animal que ha muerto, cuyo prión normalmente no infecta a una especie de un mamífero que carezca del gen de PrP artificial; y observar el mamífero transgénico con el objeto de determinar que el mamífero transgénico desarrolla síntomas de infecciones priónicas.