MXPA96005018A - Proceso para la preparacion de doxorrubicina - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a la habilidad para convertir la daunorrubicina a doxorrubicina puede ser conferida a una célula huésped mediante transformación con un vector recombinante que comprende ADN que codifica para la daunorrubicina -14-hidroxilasa. La célula huésped puede ser luego usada para producir doxorrubicina.

Description

PROCESO PARA LA PREPARACIÓN DE DOXORRUBICINA La presente invención se refiere a un proceso para la producción de doxorrubicina a partir de daunorrubicina, usando una enzima obtenida a partir de una célula huésped transformada con el ADN recombinante . Las antraciclinas del grupo de las daunorrubicinas, tal como la doxorrubicina, car inomicina y aclacinoraicina, están entre los agentes más ampliamente empleados en terapia antitumoral [F. Arcamone, Doxorubicin, Academic Press, New York, 1981, pp 12-25; A. Grein, Process Biochem. 16:34 (1981); T. Kaneko, Chimicaoggi Mayo 11 (1988); C. E. Myers y., "Biochemical mechanisms of tumor cell kill". En: Anthracycline and Anthracenedione-Based Anti-Cancer Agents (Lown, J. W., y), Elsevier, Amsterdam, pp . 525-569, 1988; J. W. Lown, Pharmac. Ther. 60:185-214 (1933. Los derivados mejorados de la daunorrubicina y doxorrubicina han sido elaborados mediante síntesis químicas, para aumentar su actividad antitumoral, particularmente mediante la ruta de administración oral, y para combatir la toxicidad aguda y la cardiotoxicidad crónica asociada con el uso de estos fármacos en el REF: 23270 tratamiento del cáncer [Penco, Process Biochem. 15:12 (1980); T. Kaneko, Chimicaoggi Mayo 11 (1988).

La ' -Epidoxorrubicina (Epirrrubicina) , 4-desmetoxidaunorrubicina ( Idarrubicina) y la metoxi-morfolinodoxorrubicina son ejemplos de tales análogos. Las antraciclinas son compuestos de origen natural producidas por diversas cepas de Streptomyces (S. peucetius, S, coeruleorubidus, S. galilaeus, S. griseus, S. griseoruber, S. insignis, S. viridochromogenes, S. bifurcus y Streptomyces sp. cepa C5) y por Actinomyces carminata. La doxorrubicina es principalmente producida por S. peucetius subespecie caesius, mientras que la daunorrubicina es producida por S. peucetius, así como por los otros Streptomyces descritos anteriormente. Las cepas tipo S. peucetius subespecie caesius IMRU 3920 (la cual es la misma que la ATCC 27952 y es de aquí en adelante abreviada como "S. peucetius 3920"), S. peucetius ATCC 29050 ("S. peucetius 29050"), S. peucetius subespecie caesius ATCC 27952 ("S. peucetius 27952") y S. peucetius dnrN::aphII mutante no productora de daunorrubicina ["S. peucetius dnrN"; S. L. Otten, J. Ferguson y C.R. Hutchinson, J. Bacteriol., 177:1216-1224 (1995) son públicamente disponibles. En particular, S. peucetius ATCC 27952 se describe en la Patente Norteamericana US-A-3, 590, 028, S. peucetius en la Patente Norteamericana US-A-4, 012, 284 , y S. peucetius dnrN ha sido depositada en la Colección Norteamericana de Cultivos de Especies (American Type Culture Collection), Rockville, MD EUA, recibiendo el número-de índice ATCC 55607. S. peucetius ATCC 55607 es derivado de la cepa S. peucetius ATCC 29050 mediante el reemplazo del gen dnrN con un gen dnrN mutante dentro del cual ha sido insertado el gen aphll a partir de Tn5 (J. M. Ward y colaboradores, Mol. Gen. Genet. 203:468-475 (1986)) en el sitio Salí para interrumpir la función dnrN. La cepa S. peucetius ATCC 55607 es resistente a la neomicina o a la kanamicina, como se determina mediante el crecimiento en medio ISP4 (Difco Laboratories, Detroit, MI) que contiene 50 µg/ml de Kanamicina, y no produce doxorrubicina, daunorrubicina o ninguno de los intermediarios de su biosíntesis (S. L. Otten y colaboradores, enviado para publicación) . La antraciclina doxorrubicina es elaborada por S. peucetius 27952 a partir del ácido malónico, ácido propiónico y glucosa mediante la vía resumida en Grein, Advan. Appl. Microbiol. 32:203 (1987) y en Eckardt y Wagner, J. Basic Microbiol. 28:137 (1988). La e-rodomicinona, carminomicina y daunorrubicina son intermediarios establecidos en este proceso. El paso final en esta vía involucra la hidroxilación de la daunorrubicina a la doxorrubicina, lo cual se reporta que ocurra únicamente en S. peucetius 27952 [F. Arcamone y colaboradores, Biotechnol. Bioeng. 11:1101 (1969)]. En la Patente Europea EP-A-61737 se describe un método para la bioconversión de daunorrubicina a doxorrubicina con un rendimiento de aproximadamente 30%, usando un mutante de S. peucetius ATCC 31847 que no produce daunorrubicina, obtenido a partir del tratamiento de la cepa ATCC 27952 con N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina . Sin embargo, esta conversión es realizada usualmente químicamente a una escala industrial, de acuerdo a la Patente Norteamericana US-A-3, 803, 12 . Los genes para la biosíntesis de la daunorrubicina y la resistencia a la daunorrubicina han sido obtenidos a partir de S. peucetius 29050 y S. peucetius 27952 mediante experimentos de clonación [Stutz an-Engwall y Hutchinson, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:3135 (1988); Otten y colaboradores, J. Bacteriol. 172:3427 (1990)]. Estos estudios han mostrado que, cuando se introducen dentro de Streptomyces lividans 1326, los genes clonados contienen la habilidad para producir e-rodomicinona y para volverse resistentes a la daunorrubicina y a la doxorrubicina para este huésped. La presente invención proporciona una molécula aislada de ADN que codifica para una daunorrubicina-14-hidroxilasa . La daunorrubicina-14-hidroxilasa convierte la daunorrubicina a doxorrubicina. La molécula de ADN consiste típicamente esencialmente de la secuencia SEQ. ID. No: 1, cuya secuencia será denominada como la secuencia "dxrA". La secuencia deducida de aminoácidos de la daunorrubicina-14-hidroxilasa codificada por la SEQ. ID. No: 1, se muestra en la SEQ. ID. No: 2. La molécula de ADN de la invención puede comprender todo o parte del fragmento de 3.4 kb, Sphl de la Figura 1. La secuencia que codifica para la daunorrubicina-14-hidroxilasa está entre los sitios Kpnl y BamHI del fragmento Sphl. La molécula de ADN de la invención puede también comprender todo o parte del fragmento Ndel-BamHI de la Figura 2. El fragmento Ndel-BamHI de la Figura 2 fue derivado del fragmento Kpnl-BamHI ligeramente mayor, de la Figura 1. Cuando la molécula de ADN de la invención comprende sólo parte del fragmento Sphl de 3.4 kb o del fragmento Nde-BamHI, la parte debe de funcionar como una daunorrubicina-14-hidroxilasa (por ejemplo, esta debe de convertir la daunorrubicina a doxorrubicina) . La parte es típicamente al menos de 1.2 kb de longitud, preferentemente desde 1.2 hasta 3.4 kb de longitud, más preferentemente desde 1.2 hasta 1.4 kb de longitud. La parte puede ser un fragmento de enzima de restricción tal como el fragmento Kpnl-BamHI de la Figura 1. La invención incluye una molécula de ADN que codifica para una daunorrubicina-14-hidroxilasa que tiene una secuencia al menos 60% idéntica a la secuencia SEQ. ID. No: 2. La invención también incluye una daunorrubicina-14-hidroxilasa que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 60% idéntica a la secuencia SEQ. ID. No: 2. La secuencia puede ser al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 98% o al menos 99% idéntica a la secuencia de la SEQ. ID. No: 2. La secuencia de la SEQ. ID. No: 2 puede ser modificada mediante substitución, supresión, inserción, extensión, funcionalización o modificación química. Una substitución, supresión, inserción o extensión puede involucrar uno o más aminoácidos, por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco, ocho, quince o veinte aminoácidos. En general, la naturaleza fisicoquímica de la SEQ. ID. No: 2 debe de ser conservada en una secuencia modificada. La secuencia modificada debe de ser en general similar en carga, así como en hidrofobicidad/hidrofilicidad y en tamaño. Las substituciones candidatas son aquellas que conducen a un aminoácido de uno de los siguientes grupos, que están substituidos por un aminoácido diferente del mismo grupo: H, R y K I, L, V y M A, G, S y T D, E, P y N.

Las moléculas de ADN que codifican para las secuencias modificadas, se pueden elaborar usando técnicas convencionales. Por ejemplo, éstas se pueden elaborar usando síntesis convencional de ADN, mutagénesis dirigida al sitio y técnicas de ADN recombinante. Las técnicas apropiadas se describen en Sambrook y colaboradores (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a. Edición, Col Spring Harbor Laboratory, Col Spring Harbor, NY . Las proteínas que tienen secuencias derivadas pueden ser fácilmente probadas para la actividad de la daunorrubicina-14-hidroxilasa, por ejemplo usando el método descrito en los Ejemplos siguientes. Para la daunorrubicina-14-hidroxilasa codificada por las moléculas de ADN de la invención a ser expresadas, el ADN puede llevar su propia secuencia de control transcripcional y, en particular, • su propio promotor que está operablemente conectado a la secuencia de codificación, y la cual es reconocida por una ARN-polimerasa de la célula huésped. Alternativamente, el ADN puede ser ligado a una secuencia de control transcripcional heteróloga en la forma correcta, o clonado dentro de un vector en un sitio de restricción apropiadamente localizado en la cercanía de una secuencia de control transcripcional en el vector. Una molécula de ADN que codifica para la daunorrubicina-14-hidroxilasa puede ser un vector de clonación o expresión de ADN recombinante. Se puede usar cualquier agente de replicación y/o de integración autónoma que comprenda una molécula de ADN a la cual se puedan agregar uno o más segmentos de ADN adicionales. Típicamente, sin embargo, el vector es un plásmido. Un plásmido preferido es el plásmido pWHM3 o pIJ702 de alto número de copias [Katz y colaboradores, J. Gen. Microbiol. 129:2703 (1983)]. Otros plásmidos apropiados son pIJ385 [Mayeri y colaboradores, J. Bacteriol. 172:6061 (1990)], pIJ680 [Hopwood y colaboradores, Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, Reino Unido, 1985] , pWHM601 [Guilfoile y Hutchinson, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:8553 (991)] o pSET152 [Bierman y colaboradores, Gene 116:43-49 (1992)]. Se puede usar cualquier técnica apropiada para insertar el ADN dentro del vector. La inserción puede ser lograda mediante la ligadura del ADN dentro de un vector linearizado en un sitio de restricción apropiado. Para esto, se puede emplear la combinación directa o los extremos pegajosos o romos, la extensión de cola homopolimérica, o el uso de una molécula ligadora o adaptadora. El vector recombinante puede ser usado para transformar o transfectar una célula huésped apropiada. Las células huésped pueden ser aquellas que son sensibles a la daunorrubicina o a la doxorrubicina, por ejemplo, que no pueden desarrollarse en presencia de una cierta cantidad de daunorrubicina o doxorrubicina, o que son resistentes a la daunorrubicina o a la doxorrubicina. El huésped puede ser un microorganismo tal como una bacteria. Las cepas de S. peucetius, en particular S. peucetius dnrN y otras cepas de especies Streptomyces que producen o no producen antraciclinas, respectivamente, pueden por lo tanto ser transformadas. Los transformantes de las cepas de Streptomyces son típicamente obtenidos mediante transformación de protoplastos. Los vectores pueden ser expresados en microorganismos no Streptomycetos, como E. coli. La proteína daunorrubicina-14-hidroxilasa obtenida mediante el huésped transformado se puede emplear para la bioconversión de daunorrubicina a doxorrubicina. Este método podría permitir la preparación de doxorrubicina altamente pura, comenzando a partir de un extracto celular producido mediante un proceso de fermentación y que contiene daunorrubicina. El proceso de bioconversión se puede llevar a cabo ya sea mediante el uso directo de las células transformadas libres o inmovilizadas, o mediante el aislamiento de la proteína daunorrubicina-14-hidroxilasa, la cual puede ser usada en la forma libre o inmovilizada de acuerdo a las técnicas conocidas, a resinas, vidrio, celulosa o substancias similares mediante enlaces iónicos o covalentes, o injertadas a fibras permeables al substrato o insolubilizadas mediante reticulación. La proteína daunorrubicina-14-hidroxilasa puede también ser usada en el extracto celular crudo. El vector recombinante de la presente invención puede también ser usado para transformar una célula huésped adecuada, la cual produce daunorrubicina, con el fin de mejorar la bioconversión de la daunorrubicina a doxorrubicina. Las células huésped pueden ser aquellas que son resistentes a la daunorrubicina o a la doxorrubicina, por ejemplo, que pueden desarrollarse en presencia de cualquier cantidad de daunorrubicina o doxorrubicina. Las cepas de S. peucetius, en particular S. peucetius 29050 y otras cepas de especies de Streptomyces que producen antraciclinas, pueden por lo tanto ser transformadas. Los transformantes de cepas de Streptomyces se obtienen típicamente mediante transformación de protoplastos . La invención incluye un proceso para la producción de doxorrubicina, cuyo proceso comprende: (i) el cultivo de una célula huésped transformada o transfectada con un vector de la invención, en presencia de daunorrubicina bajo condiciones tal que la daunorrubicina es convertida a doxorrubicina, y (ii) el aislamiento de la doxorrubicina a partir del cultivo. En este proceso, la célula huésped puede ser cultivada desde 20 a 40°C, por ejemplo desde 30 hasta 37°C. La duración del cultivo en presencia de daunorrubicina puede ser de 6 a 96 horas, por ejemplo de 12 a 72 horas. El cultivo es preferentemente llevado a cabo con agitación. La concentración de la daunorrubicina del cultivo puede ser de 2 a 200 µg/ml, por ejemplo de 10 a 100 µg/ml. La daunorrubicina se puede agregar al medio de cultivo al comienzo del cultivo, o producida por la célula huésped durante el cultivo . Las moléculas de ADN de la invención pueden ser obtenidas a partir del ADN genómico de S. peucetius 29050. Esta cepa ha sido depositada en la Colección Norteamericana de Cultivos de Especies (American Type Culture Collection) , Rockville, MD, EUA bajo el número de acceso ATCC 29050. La cepa derivada de S. peucetius 29050, como S. peucetius 27952, puede también ser usada, la cual es típicamente capaz de convertir la daunorrubicina a doxorrubicina. Las moléculas de ADN pueden por lo tanto ser obtenidas mediante : (a) la preparación de una biblioteca de ADN genómico de S. peucetius 29050 o una cepa derivada de éste; (b) la selección a partir de la biblioteca, de un clon con la habilidad para convertir la daunorrubicina a doxorrubicina; y (c) el aislamiento de una molécula de ADN de la invención a partir del clon seleccionado.

La genoteca se puede preparar en el paso (a) mediante la digestión parcial del ADN genómico de S. peucetius 29050 o una cepa derivada de éste; o mediante la selección de una biblioteca de ADN genómico de S. peucetius que ha sido enriquecida, o que contiene específicamente el cúmulo de genes para la biosíntesis de la daunorrubicina. La enzima de restricción Mbol se usa preferentemente para el ADN genómico, pero para la genoteca que contiene el cúmulo de genes para la biosíntesis de la daunorrubicina, se prefieren las enzimas de restricción BamHI o Sphl.

Los fragmentos de ADN obtenidos de este modo pueden ser fraccionados en tamaño; los fragmentos de tamaño desde 3 hasta 5 kb son preferidos para el ADN genómico, y BamHI de 13.5 kb y Sphl de 3.4 a 4.9 kb para los fragmentos de ADN provenientes de la biblioteca que contiene el cúmulo de genes para la biosíntesis de la daunorrubicina. Estos fragmentos son ligados dentro de un vector linearizado tal como pWHM3, pIJ702 o pKC505 [M. A. Richardson y colaboradores, Gene 61:231 (1987)]. Las células huésped son transformadas con la mezcla de ligadura. Típicamente, las células huésped no pueden producir daunorrubicina y pueden ser sensibles a la daunorrubicina y a la doxorrubicina; por ejemplo, sensibles a 10 microgramos o menos de daunorrubicina o de doxorrubicina por ml . Por ejemplo, los protoplastos de S. lividans JI1326 (Hopwood y colaboradores, Genetic Manipulation of Streptomyces.

A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, Reino Unido, 1985) pueden ser transformados. En el paso (b) , los transformantes obtenidos de este modo son seleccionados para la habilidad de captar la daunorrubicina, convertirla a doxorrubicina, y excretar doxorrubicina. Los clones capaces de convertir la daunorrubicina a doxorrubicina son identificados por análisis cromatográfico de extractos de un medio de cultivo que contiene daunorrubicina para la presencia de doxorrubicina. Tales clones se aislan y se extraen los vectores recombinantes contenidos en éstos. Con la digestión de los vectores recombinantes con enzimas de restricción apropiadas en el paso (c), puede ser identificado el ADN de S. peucetius 29050 insertado dentro de cada vector, ajustado a tamaño y trazado en mapa. De esta manera, se puede verificar que el vector contiene la molécula de ADN de la invención. Además, se pueden aislar dos o mas insertos en traslape que son completa o parcialmente abarcados dentro del ADN de la invención. Estos pueden ser fusionados conjuntamente mediante escisión en un sitio de restricción común, y la ligadura subsecuente para obtener un ADN de la invención, apareado en longitud usando enzimas de restricción apropiadas, si es necesario. Los fragmentos de restricción de un ADN inserto que contiene un gen que codifica para la daunorrubicina-14-hidroxilasa, se pueden obtener en el paso (c) también mediante la escisión de un ADN inserto con una enzima de restricción apropiada. Los siguientes Ejemplos ilustran ia invención.

Breve Descripción de los Dibujos En los dibujos anexos: La Figura 1 muestra un mapa de restricción de un ADN de la invención. Este es un inserto en el plásmido recombinante pIS70 que fue construido mediante inserción de un fragmento de ADN de Sphl de 3.4 kb, que contiene el gen de la daunorrubicina-14-hidroxiiasa (dxrA) , el cual fue obtenido a partir del plásmido recombinante pIS62 mediante su digestión parcial con Sphl, dentro del sitio Sphl del plásmido pWHM3, un vector lanzadera de Escherichia coli-Streptomyces [Vara y colaboradores, J. Bacteriol. 171:5872 (1989)]. El mapa mostrado en la Figura 1 no proporciona necesariamente un listado exhaustivo de todos los sitios de restricción presentes en el segmento de ADN. Sin embargo, los sitios reportados son suficientes para un reconocimiento no ambiguo de los segmentos.

La Figura 2 también muestra un mapa de restricción de un ADN de la invención. Este es un inserto en el plásmido recombinante pWHM969 que fue construido mediante la inserción de un fragmento de ADN Ndel/BamHI de 1.33 kb, obtenido del fragmento de ADN Kpnl/BamHI de 1.36 kb de pIS70 mediante mutagénesis dirigida al sitio, dentro de los sitios Ndel y Ba HI del vector plasmidico de expresión pET14B de E. coli [Novagen, Madison, Wl]. En particular, un sitio de restricción Ndel ( 5 ' -CAT-ATG-3 ' ) fue insertado en el fragmento de ADN Kpnl/BamHI de 1.36 kb mediante xautagenización del codón de iniciación GTG del gen de ia daunorrubicina-14-hidroxilasa, así como los dos nucieótidos inmediatamente precedentes a este codón de iniciación, para reproducir la Secuencia objetivo reconocida por la enzima de restricción Ndel.

Con el fin de permitir la expresión eficiente del gen de la daunorrubicina-14-hidroxilasa en E. coli, la Secuencia de tipo silvestre mostrada en la SEQ. ID. No: 1 fue apropiadamente mutagenizada de acuerdo al uso del codón de E. coli. El mapa mostrado en la Figura 2 no proporciona necesariamente un listado exhaustivo de todos los sitios de restricción presentes en el segmento de ADN. Sin embargo, los sitios reportados son suficientes para un reconocimiento no ambiguo del segmento.

La Figura 3 es un gel de SDS-poliacrilamida teñido con Coomassie de los extractos celulares provenientes de Escherichia coli, transformado con los vectores de expresión dxrA e inducidos por IPTG por 4 horas . Banda 1, E. coli transformado con el vector de expresión pWHM969 (peso molecular de DxrA: 42,280);-banda 2, E. coli transformado con pET-14b (control negativo); banda 3, estándares de peso molecular.

Materiales y Métodos Cepas bacterianas y plásmidos: E. coli cepa DH5a, la cual es sensible a la ampicilina y a la apramicina, se usa para subclonar fragmentos de ADN. S. lividans ZX1 [Zhou y colaboradores, Nucleic Acids Res. 16:4341 (1988)] y S. peucetius dnrN [S. L. Otten, J. Ferguson y C.R. Hutchinson, J. Bacteriol., 177:1216-1224 (1995)] se usan para la expresión del gen dxrA. Los vectores de clonación plasmídicos son pUC18/19 [ (Yansch-Perron y colaboradores, Gene 33:103 (1985)] y pWHM3 [Vara y colaboradores, J. Bacteriol. 171:5872 (1989) ] .

Medios y amortiguadores: E. coli DH5a se mantiene sobre agar LB (Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2a ed. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) . Cuando se seleccionan para transformantes, se agregan ampicilina o apramicina a concentraciones de 100 µg/ml y 50 µg/ml, respectivamente. S. lividans se mantiene sobre agar R2YE (Hopwood y colaboradores, Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, Reino Unido, 1985) para la preparación de esporas, así como para la regeneración de protoplastos.

Subclonación de fragmentos de ADN: las muestras de ADN se digieren con las enzimas de restricción apropiadas y se separan sobre geles de agarosa mediante métodos estándares (Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2a ed. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) . Las rebanadas de agarosa que contienen los fragmentos de ADN de interés se extirpan de un gel y el ADN se aisla a partir de estas rebanadas usando el dispositivo GENECLEAN (BiolOl, La Jolla, CA) o un equivalente. Los fragmentos aislados de ADN son subclonados usando técnicas estándares (Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning. A. Laboratory Manual, 2a ed. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) dentro de los vectores lanzadera E. coli y E. coli/Streptomyces, para experimentos de expresión y biotransformación, respectivamente.

Transformación de especies de Streptomyces y E . coli : Células competentes de E. coli se preparan mediante el método de cloruro de calcio (Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2a ed. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring, Harbor, NY, 1989) y transformados mediante técnicas estándares (Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2a ed. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) . El micelio de S. lividans ZX1 se desarrolla en medio YEME (Hopwood y colaboradores, Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, RU, 1985) y se cosechan después de 48 horas. El botón de micelio se lava dos veces con solución de sucrosa al 10.3% y se usa para preparar protoplastos de acuerdo al método descrito en el manual Hopwood (Hopwood y colaboradores, Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, RU, 1985) . El botón de protoplastos se suspende en aproximadamente 300 µl de amortiguador P (Hopwood y colaboradores, Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, RU, 1985) y se usa una alícuota de 50 µl de esta suspensión para cada transformación. Los protoplastos se transforman con el ADN plasmídico de acuerdo al método de transformación a pequeña escala de Hopwood y colaboradores (Hopwood y colaboradores, Genetic Manipulation of Streptomyces. A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, RU, 1985) . Después de 17 horas de regeneración sobre medio R2YE a 30°C, las placas se recubren con 50 µl/ml de tiostreptona y se dejan desarrollar a 30°C hasta que esporulan.

Bioconversión de daunorrubicina a doxorrubicina : Los transformantes S. lividans ZX1 y S. peucetius dnrN que albergan un plásmido de la invención son inoculados dentro del medio líquido R2YE que contiene 10 µl/ml de tiostreptona. Después de 2 días de crecimiento a 30°C, 2.5 ml de este cultivo se transfieren a 25 ml del medio de producción [McGuire y colaboradores, Process Biochem. 14:2-5(1979)] que contiene 20 µl/ml de tiostreptona. Los cultivos se desarrollan en matraces Erlenmeyer sobre un agitador rotatorio a 280 rpm a 30°C por 72 horas, después de lo cual se agrega la daunorrubicina (5 mg/ml en una solución acuosa) a 10 ml de los cultivos, para dar una concentración final de 20 µg/ml. Después de 24 horas de incubación adicional sobre un agitador, los cultivos se incuban en un baño de agua a 55°C por 60 minutos, después se realiza la adición de 25 mg/ml de ácido oxálico para hidrolizar las formas glucosídicas de los metabolitos de antraciclinas . Los metabolitos son extraídos de los cultivos con 10 ml de acetonitrilo ¡metanol (1:1) a 30°C por 30 minutos, en un agitador rotatorio a 280 rpm. El extracto se filtra y el filtrado se analiza mediante cromatografía líquida de alta presión de fase inversa (RP-HPLC) . La RP-HPLC se realiza mediante el uso de una columna Vydac C18 (4.6 x 250 mm; tamaño de partícula 5 mieras) a una velocidad de flujo de 0.385 ml/minuto. La fase móvil A es ácido trifluoroacético al 0.1% (TFA, de Pierce Chemical Company) en agua, y la fase móvil B es ácido trifluoroacético al 0.078% en acetonitrilo (de J. T. Baker Chemical Company). La elución se realiza con un gradiente lineal de 20 a 60% de la fase B en la fase A, en 33 minutos y se verifica periódicamente con un detector de arreglo de diodo ajustado a 488 nm (anchura de banda 12 mieras) . La daunorrubicina y la doxorrubicina (10 µg/ml en metanol) se usan como estándares externos para cuantificar la cantidad de estos metabolitos aislados a partir de los cultivos.

Ejemplo 1 Clonación del gen dxrA que codifica para la-daunorrubicina-14-hidroxilasa .

Varios de estos clones cósmidos descritos por Stutzman-Engwall y Hutchinson [(Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 86:3135 (1989)], tales como pWHM337 y pWHM338, o clones similares obtenidos de cepas equivalentes, que representan desde aproximadamente 20 hasta 90 kb de ADN genómico de S. peucetius 29050, son parcialmente digeridos con BamHI, los ADNs se combinan y se vuelven a ligar, y la mezcla resultante de plásmidos (que contienen el vector pKC505 o un vector equivalente que es capaz de efectuar la replicación en E. coli y Streptomyces spp), se usa para transformar E. coli DH5 para la resistencia a la apramicina (o la resistencia apropiada para la selección del vector usado) . Los ADNs plasmídicos provenientes de 16 clones de E. coli resistentes a la apramicina, se introducen dentro de S. lividans ZX1, y los transformantes se analizan para la bioconversión de la daunorrubicina a doxorrubicina, de acuerdo al método descrito en la sección de Materiales y Métodos. El plásmido pIS23 se aisla de un transformante que convierte hasta 3% de la daunorrubicina agregada a doxorrubicina, y se encuentra que contiene un inserto de 13.5 kb que abarca la región del mapa de restricción mostrado en la Figura 1. El inserto pIS23 se usa para subclonar un segmento de ADN BglII/Clal de 4.9 kb dentro de pUCld digerido con BamHI y AccI. Se obtiene un segmento EcoRI/HindIII de 4.9 kb a partir del plásmido resultante, y se subclona dentro de pWHM3 digerido con EcoRI y HindIII, para obtener el plásmido pIS62. Los transformantes de S. lividans ZXl(pIS62) son preparados como se describe en la sección de Materiales y Métodos, y estos se prueban para la habilidad de bioconvertir la daunorrubicina a doxorrubicina. Estos pueden convertir hasta 16% de la daunorrubicina agregada a doxorrubicina. Se clona un segmento de ADN Sphl de 3.4 kb a partir de pIS62 dentro del sitio Sphl de pWHM3, para dar el plásmido pIS70 (Figura 1). Los transformantes de S. lividans ZX1 (pIS70) se preparan como se describe en la sección de Materiales y Métodos, y se prueban para la habilidad de bioconvertir la daunorrubicina a doxorrubicina. Estos pueden convertir hasta 22% de la daunorrubicina agregada a doxorrubicina.

Ejemplo 2 Conversión de daunorrubicina a doxorrubicina mediante una célula que contiene el gen de la daunorrubicina-14-hidroxilasa, pero que carece de los productos de otros genes de la daunorrubicina.

Los plásmidos pIS62 y pIS70 se introducen dentro de la cepa de S. peucetius dnrN mediante transformación con la selección para la resistencia a la tiostreptona, de acuerdo a los métodos descritos en la sección de Materiales y Métodos. Los transformantes resultantes de S. peucetius dnrN(pIS62) son probados para la habilidad de bioconvertir la daunorrubicina a doxorrubicina. Estos pueden hasta 58% de la daunorrubicina agregada a doxorrubicina. Los transformantes resultantes de S. peucetius dnrN(pIS70) son probados para la habilidad de bioconvertir la daunorrubicina a doxorrubicina. Estos pueden convertir hasta 100% de la daunorrubicina agregada a doxorrubicina.

Ejemplo 3 Expresión de DxrA en Escherichia coli.

El vector de expresión pET-14b (comercialmente disponible de Novagen-Madison, Wl) está basado en el sistema impulsado por el promotor T7. Cuando el sitio de restricción Ndel es usado, pET-14b permite la expresión de una proteína clonada, fusionada con un His-Tag en el extremo N. Se clonó en pUC19 un fragmento Kpnl-BamHI de 1373 pares de bases proveniente del vector pIS70 (Figura I) que contiene el gen de dxrA completo [Yanish-Perron C. y colaboradores, (1985) Gene:33, 103-119] . A partir del plásmido resultante, se retiró un fragmento SalI-BamHI y se ligó a un ligador Kpnl-Sall elaborado usando dos oligonucleótidos (51-mer SEQ. ID. No:3, y 59-mer SEQ. ID. No : 4 ) sintetizados de modo que el primer codón de dxrA fue cambiado a ATG, el cual creó un sitio Ndel, y la tercera posición del cuarto, sexto y séptimo codones fueron cambiados para reflejar el codón más frecuentemente usado en los genes de E. coli altamente expresados, como un medio para mejorar la expresión de dxrA. El fragmento resultante de Ndel-BamHI se clonó en pET-14b.

El huésped E. coli usado para la expresión del gen dxrA fue un lisógeno ?DE3 de la cepa BL21 (comercialmente disponible de Novagen-Madison Wl). La expresión de dxrA fue inducida por la adición de IPTG de acuerdo al siguiente procedimiento: se inocularon 100 ml de 2xYT y ampicilina (50 µl/ml) con una colonia simple de una placa recién rayada de pWHM969 (Figura 2) . Las células se desarrollaron a 37°C hasta una DO.;:-., = 0.4-1.0. La expresión de dxrA fue inducida por la adición de IPTG 4 mM, y la incubación fue continuada por 3-4 horas. Se centrifugaron 0.5 ml de cultivo a 14,000 rpm en una microcentrí fuga por 1 minuto, el sobrenadante se desechó y el botón se resuspendió en 50 µl de amortiguador Laemmli [Laemmli, Nature (Londres), 227: 608 (1970)] y se ebulló por 5 minutos. Las proteínas contenidas en la muestra hervida se analizaron en un gel de SDS-poliacrilamida al 10% (Figura 3) usando métodos estándares [Laemmli, Nature (Londres), 227: 680 (1970)] mediante comparación con el vector pET 14b que no contiene el gen dxrA. La proteína daunorrubicina-14-hidroxilasa migra a Mr 42,280.

LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: PHARMACIA S.P.A. (B) CALLE: VIA KOCH 1.2 (C) CIUDAD: MILÁN (E) PAÍS: ITALIA (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 20152 (G) TELEFONO: *39-2-48385045 (H) TELEFAX: *39-2-48300578 (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: PROCESO PARA LA PREPA- RACIÓN DE DOXORRUBICINA (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 4 (iv) FORMA LEGIBLE EN COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disquete flexible (B) COMPUTADORA: computadora personal compatible con IBM * (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.30 (EPO) (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO. 1 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1269 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE /CLAVE: CDS (B) LOCALIZACION: 1..1269 (ix) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 1 GTG AGC GGC GAG GCG CCC CGG GTG GCC GTC GAC CCG TTC GCG TGT CCC 48 Val Ser Gly Glu Ala Pro Arg Val Ala Val Asp Pro Phe Ala Cys Pro 1 5 10 15 ATG ATG ACC ATG CAG CGC AAG CCC GAG GTG CAC GAC GCC TTC CGG GAG 96 Met Mee Thr Met Gln Arg Lys Pro Glu Val His Asp Ala Phe Arg Glu 20 25 30 GCG GGC CCG GTC GTC GAG GTG AAC GCC CCC GCG GGC GGA CCC GCC TGG 144 Ala Gly Pro Val Val Glu Val Asn Ala Pro Ala Gly Gly Pro Ala Trp 35 40 45 GTC ATC ACC GAT GAC GCC CTC GCC CGC GAG GTG CTG GCC GAT CCC CGG 192 Val He Thr Asp Asp Ala Leu Ala Arg Glu Val Leu Ala Asp Pro Arg 50 55 60 TTC GTG AAG GAC CCC GAC CTC GCC CCC GCC GCC TGG CGG GGG GTG GAC 240 Phe Val Lys Asp Pro Asp Leu Ala Pro Ala Ala Trp Arg Gly Val Asp 65 70 75 80 GAC GGT CTC GAC ATC CCC GTT CCG GAG CTG CGT CCG TTC ACG CTC ATC 2T8 Asp Gly Leu Asp He Pro Val Pro Glu Leu Arg Pro Phe Thr Leu He 85 90 95 GCC GTG GAC GGC GAG GCC CAC CGG CGC CTG CGC CGC ATC CAC GCA CCT 336 Ala val Asp Gly Glu Ala His Arg Arg Leu Arg Arg He His Ala Pro 100 105 110 GCG TTC AAC CCG CGC CGG CTG GCC GAG CGG ACG GAT CGC ATC GCC GCG 384 Ala Phe Asn Pro Arg Arg Leu Ala Glu Arg Thr Asp Arg He Ala Ala 115 120 125 ATC GCC GGC CGG CTG CTC ACC GAA CTC GCC GAC GCC TCC GGC CGG TCG 432 He Ala Gly Arg Leu Leu Thr Glu Leu Ala Asp Ala Ser Gly Arg Ser 130 135 140 GGC AAA CCG GCC GAG CTG ATC GGC GGC TTC GCG TAC CAC TTC CCG CTG 480 Gly Lys Pro Ala Glu Leu He Gly Gly Phe Ala Tyr His Phe Pro Leu 145 150 155 160 TTG GTC ATC TGC GAG CTG CTC GGT GTG CCG GTC ACC GAT CCG GCG ATG 528 Leu Val He Cys Glu Leu Leu Gly Val Pro Val Thr Asp Pro Ala Met 165 170 175 GCC CGC GAG GCC GTC AGC GTT CTC AAG GCA CTC GGC CTC GGC GGC CCG 576 Ala Arg Glu Ala Val Ser Val Leu Lys Ala Leu Gly Leu Gly Gly Pro 180 185 190 CAG AGC GGC GGG GGT GAC GGC ACG GAC CCT GCC GGG GGC GTG CCG GAC 624 Gln Ser Gly Gly Gly Asp Gly Thr Asp Pro Ala Gly Gly Val Pro Asp 195 200 205 ACC TCG £CC CTG GAG AGC CTG CTC CTC GAA GCC GTG CAC TCA GCC CGG 672 Thr Ser Ala Leu Glu Ser Leu Leu Leu Glu Ala Val His Ser Ala Arg 210 215 220 CGG AAC GAC ACC CCG ACC ATG ACC CGC GTG CTG TAC GAG CGC GCG CAG 720 Arg Asn Asp Thr Pro Thr Met Thr Arg Val Leu Tyr Glu Arg Ala Gln 225 230 235 240 GCC GAG TTC GGC TCG GTC TCC GAC GAC CAG CTC GTC TAC ATG ATC ACC 768 Ala Glu Phe Gly Ser Val Ser Asp Asp Gln Leu Val Tyr Met He Thr 245 250 255 GGG CTC ATC TTC GCC GGC CAC GAC ACC ACC GGC TCC TTC CTG GGC TTC 816 Gly Leu He Phe Ala Gly His Asp Thr Thr Gly Ser Phe Leu Gly Phe 260 265 270 CTG CTC scs GAG GTC CTG GCG GGC CGC CTC GCG GCG GAT GCC GAC GAG 864 Leu Leu Ala Glu Val Leu Ala Gly Arg Leu Ala Ala Asp Ala Asp Glu 275 280 285 GAC GCC GTC TCC CGG TTC GTG GAG GAG GCG CTG CGC TAC CAC CCG CCG 912 Asp Ala Val Ser Arg Phe Val Glu Glu Ala Leu Arg Tyr His Pro Pro 290 295 300 GTG CCC TAC ACG TTG TGG AGG TTC GCT GCC ACG GAG GTG ACC ATC GGC 960 val Pro Tyr Thr Leu Trp Arg Phe Ala Ala Thr Glu Val Thr He Gly 305 310 315 320 GGC GTC CGG CTG CCC CGC GGA GCG CCG GTG CTG GTG GAC ATC GAG GGC 1008 Gly Val Arg Leu Pro Arg Gly Ala Pro Val Leu Val Asp He Glu Gly 325 330 335 ACC AAC ACC GAC GGC CGC CAT CAC GAC GCC CCG CAC GCC TTC CAC CCG 1056 Thr Asn Thr Asp Gly Arg His His Asp Ala Pro His Ala Phe His Pro 340 345 350 GAC CGT CCC TCG TGG CGG CGG CTC ACC TTC GGC GAC GGG CCG CAC TAC 1104 Asp Arg Pro Ser Trp Arg Arg Leu Thr Phe Gly Asp Gly Pro His Tyr 355 360 365 TGC ATC GGG GAG CAG CTC GCC CAG CTG GAG TCG CGC ACG ATG ATC GGC 1152 Cys He Gly Glu Gln Leu Ala Gln Leu Glu Ser Arg Thr Met He Gly 370 ^ 375 380 GTA CTG CGC AGC AGG TTC CCC GAG GCC CGA CTG GCC GTG CCG TAC GAC 1200 Val Leu Arg Ser Arg Phe Pro Glu Ala Arg Leu Ala Val Pro Tyr Asp 385 390 395 400 GAG TTG CGG TGG TGC CGG AAG GGG GCC CAG ACO GCG CGG CTC ACC GAA 1248 Glu Leu Arg Trp Cys Arg Lys Gly Ala Gln Thr Ala Arg Leu Thr Glu 405 410 415 CTG CCC GTC TGG CTG CGC TGA 1269 Leu Pro Val Trp Leu Arg * 420 (2) INFORMACIÓN PARA LA S?Q ID NO. 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 423 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 2: Val Ser Gly Glu Ala Pro Arg Val Ala Val Asp Pro Phe Ala Cys Pro 1 5 10 15 Met Met Thr Met Gln Arg Lys Pro Glu Val His Asp Ala Phe Arg Glu 20 25 30 Ala Gly Pro Val Val Glu Val Asn Ala Pro Ala Gly Gly Pro Ala Trp 35 40 45 Val He Thr Asp Asp Ala Leu Ala Arg Glu Val Leu Ala Asp Pro Arg 50~ 55 60 Phe Val Lys Asp Pro Asp Leu Ala Pro Ala Ala Trp Arg Gly Val Asp 65 "* 70 75 80 Asp Gly Leu Asp He Pro Val Pro Glu Leu Arg Pro Phe Thr Leu He 85 90 95 Ala Val Asp Gly Glu Ala His Arg Arg Leu Arg Arg lie His Ala Pro 100 105 no Ala Phe Asn Pro Arg Arg Leu Ala Glu Arg Thr Asp Arg He Ala Ala 115 120 125 He Ala Gly Arg Leu Leu Thr Glu Leu Ala Asp Ala Ser Gly Arg Ser 130 135 140 Gly Lys Pro Ala Glu Leu He Gly Gly Phe Ala Tyr His Phe Pro Leu 145 150 155 160 Leu Val He Cys Glu Leu Leu Gly Val Pro Val Thr Asp Pro Ala Met 165 170 175 Ala Arg Glu Ala Val Ser Val Leu Lys Ala Leu Gly Leu Gly Gly Pro 180 185 190 Gln Ser Gly Gly Gly Asp Gly Thr Asp Pro Ala Gly Gly Val Pro Asp 195 200 205 Thr Ser Ala Leu Glu Ser Leu Leu Leu Glu Ala Val His Ser Ala Arg 210 215 220 Arg Asn Asp Thr Pro Thr Met Thr Arg Val Leu Tyr Glu Arg Ala Gln 225 230 235 240 Ala Glu Phe Gly Ser Val Ser Asp Asp Gln Leu Val Tyr Met He Thr 245 250 255 Gly Leu He Phe Ala Gly His Asp Thr Thr Gly Ser Phe Leu Gly Phe 260 265 270 Leu Leu Ala Glu Val Leu Ala Gly Arg Leu Ala Ala Asp Ala Asp Glu 275 280 285 Asp Ala Val Ser Arg Phe Val Glu Glu Ala Leu Arg Tyr His Pro Pro 290 295 300 Val Pro Tyr Thr Leu Trp Arg Phe Ala Ala Thr Glu Val Thr He Gly 305 310 315 320 Gly Val Arg Leu Pro Arg Gly Ala Pro Val Leu Val Asp He Glu Gly 325 330 335 Thr Asn Thr Asp Gly Arg His His Asp Ala Pro His Ala Phe His Pro 340 345 350 Asp Arg Pro Ser Trp Arg Arg Leu Thr Phe Gly Asp Gly Pro His Tyr 355 360 365 Cys He Gly Gl? Gln Leu Ala Gln Leu Glu Ser Arg Thr Met He Gly 370 375 380 Val Leu Arg Ser Arg Phe Pro Glu Ala Arg Leu Ala Val Pro Tyr Asp 385 390 395 400 Glu Leu Arg Trp Cys Arg Lys sly Ala Gln Thr Ala Arg Leu Thr Glu 405 410 415 Leu Pro Val Trp Leu Arg * 420 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO. 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 51 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal ( x i ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEQ ID NO . 3 : OCCGCGGCGG CGGGCGGTGC CATATG?GCG GCGAAGCGCC GCGTGTGGCC G 51 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO. 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 59 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 4: TCGACGGCCA CACGCGGCGC TCGCCGCTC ATATGGCACC GCCCGCCGCC GCGGGGTAC 59 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:

Claims (27)

REIVINDICACIONES

1. Una molécula aislada de ADN, caracterizada porque codifica para una daunorrubicina-14-hidroxilasa .

2. Una molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende todo o parte del segmento Sphl de 3.4 kb de la Figura 1.

3. Una molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende todo o parte del fragmento Ndel-BamHI de la Figura 2.

4. Una molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque codifica para una daunorrubicina-14-hidroxilasa que tiene la secuencia SEQ. ID. No : 2.

5. Una molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque codifica para una daunorrubicina-14-hidroxilasa que tiene una secuencia al menos 60% idéntica a la secuencia SEQ. ID. No: 2.

6. Una molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque consiste esencialmente de la secuencia SEQ. ID. No: 1.

7. Un vector, caracterizado porque codifica para una daunorrubicina-14-hidroxilasa .

8. Un vector de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque comprende todo o parte del fragmento Sphl de 3.4 kb de la Figura 1.

9. Un vector de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque comprende todo o parte del fragmento Ndel-BamHI de la Figura 2.

10. Un vector de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque codifica para una daunorrubicina-14-hidroxilasa que tiene la secuencia de la SEQ. ID. No: 2.

11. Un vector de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque codifica para una daunorrubicina-14-hidroxilasa que tiene una secuencia al menos 60% idéntica a la secuencia de la SEQ. ID. No: 2.

12. Un vector de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque comprende una secuencia que consiste esencialmente de la secuencia de la SEQ. ID. No: 1.

13. Un vector de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque es un plásmido.

14. Un plásmido de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque es pIS23, pIS62 o pIS70.

15. Una célula huésped, caracterizada porque es transformada o transfectada con un vector de conformidad con la reivindicación 7.

16. Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque es una célula bacteriana que produce daunorrubicina.

17. Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque es una célula de Streptomyces.

18. Un proceso para la producción de doxorrubicina, caracterizado el proceso porque comprende : (i) el cultivo de una célula huésped de conformidad con la reivindicación 15, en presencia de doxorrubicina bajo condiciones tales que la daunorrubicina es convertida a doxorrubicina, y (ii) el aislamiento de la doxorrubicina a partir del cultivo.

19. Un proceso para la producción de doxorrubicina, caracterizado el proceso porque comprende : (i) el cultivo de una célula huésped de conformidad con la reivindicación 16 bajo condiciones tales que la daunorrubicina es convertida a doxorrubicina, y (ii) el aislamiento de la doxorrubicina a partir del cultivo.

20. Una daunorrubicina-14-hidroxilasa, caracterizada porque tiene una secuencia de aminoácidos al menos 60% idéntica a la secuencia SEQ. ID. No: 2.

21. La daunorrubicina-14-hidroxilasa de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque tiene la Secuencia de aminoácidos de la SEQ. ID. No: 2.

22. Un extracto celular que contiene daunorrubicina-14-hidroxilasa, caracterizado porque la daunorrubicina-14-hidroxilasa contiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 60% idéntica a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ. ID. No: 2.

23. La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la molécula de ADN es de al menos 1.2 kb de longitud.

24. La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque la molécula de ADN es de entre 1.2-2.4 kb de longitud.

25. La daunorrubicina-14-hidroxilasa de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos tiene la misma hidrofobicidad/hidrofilicidad y tamaño que la SEQ. ID. No: 2.

26. Una molécula de ADN que codifica para la daunorrubicina-14-hidroxilasa, caracterizada la molécula de ADN porque comprende un fragmento Sphl de 3.4 kb de acuerdo a la figura 1, o un fragmento que corresponde a un fragmento de Sphl de 3.4 kb de acuerdo a la figura 1, dentro de la degeneración del código genético.

27. Un proceso para la producción de una molécula aislada de ADN de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado el proceso porque comprende : (a) la preparación de una biblioteca del ADN genómico de S. peucetius 29050 o una cepa derivada de ésta; (b) la selección de un clon a partir de la genoteca, con la habilidad para convertir la daunorrubicina a doxorrubicina; y (c) el aislamiento de una molécula de ADN de la invención a partir del clon seleccionado.