MXPA06015265A - Metodos para proteger plantas de hongos patogenicos - Google Patents

Abstract

Se proporcionan métodos para proteger a una planta de un hongo patogénico de planta. Además se proporciona un método para aumentar la resistencia a patógenos fungales en una planta utilizando las secuencias de nucleótidos divulgadas en la presente. El método comprende introducir en una planta un casete de expresión que comprende un promotor operablemente enlazado a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido antifungal de la invención. También se divulgan plantas, células de plantas, semillas y microorganismos transformados que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido antifungal de las modalidades, o variante o fragmento de las mismas.

Description

MÉTODOS PARA PROTEGER PLANTAS DE HONGOS PATOGÉNICOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona a métodos para proteger plantas de patógenos fúngales a través del uso de polipéptidos que tienen actividad antifungal y las secuencias de ácido nucleico que los codifican. Los métodos de la invención utilizan estos polipéptidos y secuencias de ácido nucleico para controlar patógenos fúngales de plantas y para incrementar la resistencia a los .patógenos fúngales en plantas. También se incluyen plantas y semillas transgénicas . ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La enfermedad en plantas resulta de causas bióticas y abióticas. Una multitud de procesos celulares permite a las plantas defenderse por si mismas de la enfermedad causada por agentes patogénicos. Estos procesos aparentemente forman un conjunto integrados de mecanismo de resistencia que es activado' mediante la infección inicial y luego limita la dispersión adicional del organismo patogénico invasor. Subsecuente al reconocimiento de un patógeno de planta, las plantas pueden activar un arreglo de respuestas bioquímicas. Generalmente, la planta responde al inducir varias respuestas locales en las .células que circundan inmediatamente el sitio de la infección. La respuesta de resistencia más común observada en ambas de las interacciones de no hospedero y especificas de la clase es llamada la "respuesta hipersensible" (HR) . En la respuesta hipersensible, las células contactadas por el patógeno, y frecuentemente las células vecinas, rápidamente se colapsan y se secan en una mancha necrótica. Otras respuestas incluyen la deposición de callosa, el engrosamiento físico de las paredes de la célula mediante lignificación, y la síntesis- de varias moléculas pequeñas antibióticas y proteínas. Los factores genéticos tanto en el hospedero como en el patógeno determinan la especificidad de estas respuestas locales, que pueden ser muy efectivas en limitar la dispersión de la infección . La incidencia de enfermedades de plantas se ha controlado tradicionalmente mediante prácticas agronómicas que incluyen la rotación de cultivos, el uso de agroquímicos y técnicas de reproducción convencionales. El uso de químicos para controlar patógenos de plantas, sin embargo, incrementa los costos a los granjeros y causa efectos perjudiciales en el ecosistema. Los consumidores y reguladores del gobierno igualmente están llegando a estar cada ves más interesados con los peligros ambientales asociados con la producción y el uso de agroquímicos sintéticos para proteger plantas de patógenos. Debido a tales problemas, los reguladores han prohibido o limitado el uso de algunos de los químicos más peligrosos. La incidencia de enfermedades fúngales se ha controlado en algún grado al reproducir cultivos resistentes.

Los métodos de reproducción tradicionales, sin embargo, son consumidores de tiempo y requieren esfuerzo continuo para mantener la resistencia a la enfermedad conforme se desarrollan los patógenos. Ver, por ejemplo, Grover y Go thaman (2003) Curr. Sci. 84:330-340. Asi, hay una necesidad significante para alternativas novedosas para el control de patógenos de plantas que presenten un menor riesgo de contaminación y peligros ambientales que es característico de los métodos basados en agroquímicos tradicionales y que sean menos difíciles de manejar que las técnicas de reproducción convencionales. Recientemente, los científicos de la agricultura han desarrollado plantas de cultivo con resistencia a patógenos aumentada al diseñar genéticamente plantas para expresar proteínas antipatogénicas. Por ejemplo, las plantas de papa y de tabaco genéticamente diseñadas para producir una proteína de endoquitinasa antifungal se mostraron que exhiben resistencia incrementada a los patógenos fúngales foliares y portados por la tierra. Ver Lorito y colaboradores (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. 95:7860-7865. Además, también se ha desarrollado cebada transgénica que es resistente al hongo de roya de tallo. Ver Horvath y colaboradores, (2003) Proc. Nati. Acad. Sci. 100:364-369. Un esfuerzo continuo para identificar agentes antipatogénicos y para diseñar genéticamente plantas resistentes a enfermedad es llevado a cabo . Varios procedimientos para controlar patógenos se han experimentado incluyendo el uso de organismos biológicos que son típicamente "predadores naturales" de la especie que se busca controlar. Tales predadores pueden incluir otros insectos, hongos y bacterias tal como Bacillus thuringiensis . Alternativamente, colonias grandes de pestes de insectos se han criado en cautividad, esterilizado y liberado en el medio ambiente con la esperanza de que el apareamiento entre los insectos esterilizados y los insectos silvestres fecundos disminuirá la población de insectos . Mientras que estos procedimientos han tenido algo de éxito, ellos comprenden costo considerable y presentan varias dificultades mayores. Por ejemplo, es difícil tanto aplicar los organismos biológicos a áreas grandes y causar que tales organismos vivos permanezcan en el área tratada o sobre las especies de plantas tratadas durante un tiempo prolongado. Los insectos predadores pueden migrar y los hongos o bacterias pueden ser deslavados de una planta o removidos de un área tratada mediante la lluvia. Consecuentemente, ¦ mientras que el uso de tales controles biológicos tiene características deseables y ha cumplido con algo de éxito, en la práctica estos métodos no han logrado el objetivo de controlar el daño del patógeno a los cultivos . Los avances en biotecnología han presentado nuevas oportunidades para el control de patógenos a través de la ingeniería genética. En particular, los avances en la genética de plantas acoplada con la identificación de compuestos o agentes defensivos de' plantas' que ocurren naturalmente ofrecen la oportunidad para crear plantas de cultivo transgénicas capaces de producir tales agentes defensivos y de esta manera proteger a las plantas contra la enfermedad . Muchas enfermedades de plantas, incluyendo, pero no limitadas a, la roya del tallo de maíz y el moho de mazorca, pueden ser causadas por una variedad de patógenos. La roya del tallo, por ejemplo, es una de las enfermedades más destructivas y difundidas del maíz. La enfermedad es causada por un complejo de hongos y bacterias que atacan y degradan los tallos cerca de la madurez de la planta. La pérdida de rendimiento significante puede ocurrir como un resultado de la fijación de tallos debilitados así como la muerte prematura de la planta. La roya del tallo de maíz es típicamente causada por más de una especie fungal, pero la roya del tallo de Gibberella, causada por Gibberella zeae, la roya del tallo de Fusarium, causada por Fusarium verticillioides, F. proliferatum o F. subglutinans, y la roya del tallo de Anthracnose, causada por Colletotrichum graminicola son las más frecuentemente reportadas (Smith y White (1988); Diseases of corn, pp . 701-766 in Corn and Corn Improvement, Agronomy Series #18 (3rd ed. ) Sprague, C.F, y Dudley, J.W, eds . Madison, W) . Debido al hecho de que las enfermedades de plantas pueden ser causadas por un complejo de patógenos, se requiere resistencia de amplio espectro para mediar efectivamente el control de la enfermedad. Asi, existe una necesidad significante por composiciones antifungales que se dirijan a múltiples patógenos causantes de la roya del tallo .y del moho de mazorca. Asi, en vista del impacto significante de los patógenos fúngales de plantas en el rendimiento y la calidad de los cultivos, se necesitan nuevos métodos para proteger a las plantas de tales patógenos. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Las modalidades de la invención proporcionan plantas transgénicas con resistencia aumentada a patógenos fúngales, cada planta que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 95% idéntica a las SEQ ID NOs : 1, 2, 4, 5, 7 u 8, en donde la planta tiene resistencia mejorada a por lo menos un hongo patogénico de planta. La planta puede ser una monocotiledónea o una dicotiledónea. También se proporcionan semillas de tales plantas transgénicas. De manera similar, las modalidades proporcionan plantas transgénicas monocotiledóneas o dicotiledóneas y semillas con resistencia aumentada a patógenos fúngales en donde la planta comprende una secuencia de polinucleótido por lo menos 95% idéntica a las SEQ ID NOs : 3, 6 o 9, en donde la planta tiene resistencia mejorada a por lo menos un hongo patogénico de planta. Los polipéptidos expresados en las plantas transgénicas pueden o no pueden comprender una secuencia de señal . Las modalidades de la · invención también proporcionan métodos para aumentar la resistencia de una planta a un patógeno fungal, los métodos que comprende la introducción a una célula de planta de un cásete de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos operablemente enlazada a un promotor, en donde la secuencia de nucleótidos tiene por lo menos 95% de identidad a las SEQ ID NOs: 3, 6 o 9, o en donde la secuencia de nucleótido codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica o sustancialmente idéntica a las SEQ ID NOs: 1, 2, 4, 5, 7 u 8, y en donde el polipéptido tiene actividad contra por lo menos un hongo patogénico de planta. La célula de planta se utiliza para regenerar una planta ¦ transformada en donde el nivel de resistencia a patógenos fúngales en la planta transformada es incrementado en comparación a una planta que no comprende el cásete de expresión. Los polipéptidos de estas modalidades pueden o no pueden comprender una secuencia de señal. Los promotores utilizados en los casetes de expresión de las modalidades son seleccionados del grupo que consiste de promotores constitutivos, específicos de tejido, específicos de raíz, inducibles e inducibles por patógenos. En algunas modalidades, el polipéptido con actividad contra patógenos fúngales de plantas comprende una secuencia de señal. En donde algunas modalidades, el polipéptido carece de una secuencia de señal. En algunas modalidades, la secuencia de señal es una secuencia de señal de secreción, mientras que en otras es una secuencia de señal de organelo y/o plástida. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las modalidades de la invención proporcionan composiciones y métodos dirigidos a aumentar la resistencia de patógenos fúngales de plantas. Las modalidades proporcionan polinucleótidos que codifican secuencias de aminoácidos para polipéptidos antifungales . Específicamente, las modalidades proporcionan polipéptidos antifungales que tienen las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NOs: 1, 2, 4, 5, 7 y 8 y variantes y fragmentos de las mismas. Además se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas, y variantes y fragmentos de las mismas, que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID NOs: 1, 2, 4, 5, 7 y 8. Se proporcionan secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos de las SEQ ID NOs: 1, 2, 4, 5, 7 y 8. Estas secuencias de nucleótidos se exponen en las SEQ ID NOs: 3, 6, y 9. Algunas de estas secuencias de nucleótidos se han optimizado para la expresión en E. coli. También se divulgan en la presente plantas, células de plantas, semillas y microorganismos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido antifungal de las modalidades. Además se proporcionan composiciones antifungales que comprenden un polipéptido antifungal aislado o un microorganismo que expresa un polipéptido de las modalidades. Las composiciones de las modalidades encuentran uso en la generación de plantas resistentes a hongos y en la protección de plantas de hongos patogénicos de plantas. Los polipéptidos divulgados en la presente exhiben actividad antifungal contra una amplia gama de hongos patogénicos de plantas, tales como, por ejemplo, Alternaría brassícicola r Fusarium verticillioid.es, Botrytis cinérea, Fusarium graminearum, Diplodia maydis, Colletotrichum graminicola r Fusarium oxysporum y Verticillium dahliae. Las especies de origen de estos polipéptidos antifungales son especies de plantas. En particular, la fuente de los polipéptidos de las SEQ ID NOs: 1 y 2 es Capsicum chínense. La fuente de los polipéptidos de las SEQ ID NOs: 4, 5, 7 y 8 es ycopersicon lycopersicon. "Composiciones antifungales" o "polipéptidos antifungales" se proponen para dar entender que las composiciones o polipéptidos de las modalidades tienen actividad antifungal y de esta manera son capaces de suprimir, controlar y/o exterminar el hongo invasor. Un polipéptido antifungal de las modalidades reducirá los síntomas de enfermedad que resultan de la estimulación fungal por al menos aproximadamente 5% a aproximadamente 50%, al menos a aproximadamente 10%, a aproximadamente 60%, al menos a aproximadamente 30%, a aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 40%, a aproximadamente 80%, o al menos aproximadamente 50%, a aproximadamente 90% o más grande. Por consiguiente, los métodos de las modalidades se pueden utilizar para proteger plantas de hongos patogénicos. Los polinucleótidos y polipéptidos de las modalidades encuentran uso en métodos para inducir resistencia a patógenos fúngales en una planta. Por consiguiente, las composiciones y métodos divulgados en la presente son útiles en proteger plantas contra hongos patogénicos. "Resistencia a patógeno fungal" se propone para dar entender que la planta evita los síntomas de enfermedad que son el efecto de las interacciones de planta-hongo. Una planta con "resistencia a patógeno fungal mejorada" o "resistencia a patógeno fungal aumentada" se proponen para dar entender que una planta, que se ha transformado a una moléculas de ácido nucleico de las modalidades, y que esta expresando un polipéptidos de las modalidades, exhibe un nivel de resistencia o tolerancia a un patógeno fungal que es incrementado en comparación a · una planta que no comprende la molécula de ácido nucleico, tal como una planta de tipo silvestre. Esto es, los hongos se previenen de causar la enfermedad de la planta y los síntomas de enfermedad asociados en la planta transformada, o alternativamente, los síntomas de enfermedad causados por los hongos son minimizados o disminuidos, tales como, por ejemplo, la reducción del estrés y la perdida de rendimiento asociada. La resistencia puede variar de un incremento ligero en la tolerancia a los efectos del patógeno fungal a la resistencia total tal que la planta no es afectada por la presencia del patógeno fungal. Un nivel incrementado de resistencia contra un hongo particular o contra un espectro más amplio de hongos puede tanto constituir la actividad antifungal como la resistencia al hongo mejorada. Las plantas de las modalidades exhiben una mejora de por lo menos 5%, por lo menos 10%, por lo menos 20%, por lo menos 30%, por lo menos 40%, por lo menos 50%, por lo menos 55%, por lo menos 60%, por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, o hasta 100% de mejora comparada con una planta transformada. Tal mejora puede ser medida mediante cualquier medio adecuado conocido en la técnica, tal como, pero no limitado a, el conteo de las lesiones fúngales en plantas, mediciones de la biomasa fungal, comparación de los rendimientos de la planta y otros métodos descritos en los siguientes párrafos. Los ensayos que miden, la actividad antifungal son comúnmente conocidos en la técnica, como son los métodos para cuantificar la resistencia a la enfermedad en plantas después de la infección con el patógeno fungal. Ver, por ejemplo, la patente norteamericana No. 5,614,395, incorporada en la presente por referencia. Tales técnicas incluyen, la medición a través del tiempo, el diámetro de lesión promedio, la biomasa de patógenos y el porcentaje total de los tejidos de planta decaídos. Por ejemplo, una planta ya sea que expresa un polipéptido antifungal o que tiene una composición antifungal aplicada a su superficie muestra una disminución en la necrosis del tejido (es decir, diámetro de lesión) o una disminución en la muerte de la planta después de la estimulación con el patógeno fungal cuando se compara con una planta de control que no se expuso a la composición antifungal. Alternativamente, la actividad antifungal se puede medir mediante una disminución en la biomasa fungal. Por ejemplo, una planta que expresa un polipéptido antifungal o expuesta a una composición antifungal es estimulada con un patógeno fungal de interés. A través del tiempo, las muestras de tejido de los tejidos inoculados con patógeno fungal se obtiene y se extrae el RNA. El por ciento de un trascripto de RNA de patógeno fungal especifico con relación al nivel de un transcripto especifico de planta permite que sea determinado el nivel de biomasa fungal . Ver, por ejemplo, Thomma y colaboradores, (1998) Plant Biology 95:1507-15111, incorporada en la presente por referencia. Además, los ensayos antifungales in vitro incluyen, por ejemplo, la adición de concentraciones variables de la composición antifungal a discos de papel y la colocación de los discos sobre agar que contiene una suspensión del patógeno fungal de interés. Después de la incubación, zonas de inhibición claras se desarrollan alrededor de los discos que contiene una concentración efectiva del polipéptido antifungal (Liu y colaboradores, ¦ (1994) Plant Biology 91:1888-1892, incorporada en la presente por referencias). Adicionalmente, el análisis microespectrofotométrico se puede utilizar para medir las propiedades antifungales in vitro de una composición (Hu y colaboradores, (1997) Plant Mol. Biol. 34:949-959 y Cammue y colaboradores, (1992) J. Biol. Chem. 267: 2228-2233, ambas de las cuales son incorporadas en la presente por referencia) . Los ensayos que específicamente miden la actividad antifungal también son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Duvíck y colaboradores, (1992) J. Biol. Chem. 267:18814-18820; Lacadena y colaboradores, (1995) Arch. Biochem. Biophys . 324:273-281; Xu y colaboradores, (1997) Plant Mol. Biol. 34: 949-959; Lee y colaboradores, (1999) Biochem. Biophys. Res. Comm. 263:646- 651; Vila y colaboradores, (2001) Mol. Plant Microbe Interact. 14:1327-1331; Moreno y colaboradores, (2003) Phytpathol. 93:1344-1353; Kaiserer y colaboradores, (2003) Arch. Microbiol. 180:204-210; y la patente norteamericana No. 6,015,941. Las modalidades divulgan plantas transformadas con moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas antifungales . Las composiciones encuentran uso en métodos para inducir la resistencia al patógeno fungal en una planta y para proteger a una planta de un hongo. Un aspecto en la técnica' apreciará que las composiciones y métodos divulgados en la presente se pueden utilizar en combinación con otras composiciones y métodos disponibles en la técnica para proteger plantas del ataque por patógenos fúngales. En aspectos particulares, los métodos para inducir la resistencia fungal en una planta comprenden la introducción en una planta de por lo menos un cásete de expresión, en donde el cásete de expresión comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido antifungal de las modalidades operablemente enlazado a un promotor que induce la expresión en la planta. La planta expresa el polipéptido, exponiendo de esta manera el hongo al polipéptido en el sitio de ataque. La expresión de un polipéptido de las modalidades puede ser dirigida a tejidos de plantas específicos donde la resistencia fungal es particularmente importante, teles como, por ejemplo, raices, hojas o tallos. Tal expresión preferida del tejido se puede realizar mediante promotores preferidos de raíz, preferidos de hoja, preferidos de tejido vascular, preferidos de tallo o preferidos de semillas. Además, los polipéptidos de las modalidades también se pueden dirigir a localizaciones subcelulares especificas dentro 'de una célula de planta o, alternativamente, secretada de la célula, como es descrito en la presente enseguida. Precisamente como la expresión de un polipéptido de las modalidades puede ser dirigida a tejidos de plantas específicos o tipos de células a través del uso de promotores apropiados, ésta también se puede dirigir a localizaciones diferentes dentro de las células a través del uso de la información de dirección o "marcas de dirección". Distinto al promotor, que actúa en el nivel de transcripción, tal información de dirección es parte del producto de traducción inicial . Dependiendo el modo de infección del patógeno fungal o la función metabólica del tipo del tejido o célula, la localización de la proteína en diferentes compartimientos de célula puede hacerla más eficaz contra un patógeno dado o hacerla interferir menos con las funciones de las células. Por ejemplo, se puede producir una proteína precedida inducida por un péptido de señal, que dirige el producto de traducción en el retículo endoplásmico, al incluir en la construcción (es decir cásete de expresión) secuencias que codifican un péptido de señal (tales secuencias también puede ser llamadas las "secuencia de señal") . La secuencia de señal utilizada podría ser, por ejemplo, una asociada con el gen que codifica el polipéptido, o puede ser tomada de otro gen. Existen muchos péptidos de señal descritos en la literatura, y ellos son grandemente intercambiables (Raikhel y Chrispeels, "Protein sortig and vesicle traffic" en Buchanan y colaboradores, eds, (2000) Biochemistry and Molecular Biology of Plants (American Society of Plant Physiologists, Rockville, MD) , incorporada en la presente por referencia) . ¦ La adición de un péptido de señal dará por resultado que el producto de traducción entre al retículo endoplásmico (en el proceso del cual el péptido de señal mismo es removido del polipéptido) , pero la localización intracelular final de la proteína depende de otros factores, que pueden ser manipulados para dar por resultado la localización más apropiada para el patógeno fungal y el tipo de célula. La ruta de omisión, esto es, la ruta tomada por el polipéptido sí no se incluye en otras marcas de dirección, da por resultado a la secreción del polipéptido a través de la membrana de la célula (Raikhel y Chrispeels, supra) en el apoplasto. El apoplasto es la región externa del sistema de membrana de plasma e incluye paredes . de la célula, espacios intercelulares y los vasos de xilema que forman un sistema permeable, continuo a través del cual se puede mover el agua y los solutos. Esto frecuentemente será una localización adecuada . Otros patógenos fúngales puede ser combatidos más efectivamente al localizar el péptido dentro de la célula antes que afuera de la membrana de la célula. Esto se puede realizar, por ejemplo, al adicionar una secuencia de codificación de señal de retención de retículo endoplásmico a la secuencia del gen. Los métodos y secuencias para ser estos se describen en Raikhel y Chrispeels, supra; por ejemplo, adicionando secuencias que codifican los aminoácidos K, D, E y L en ese orden, o variaciones de los mismos descritos en la literatura, con la finalidad de que la porción de codificación de proteínas del polipéptido realizara esto. Las secuencias de retención de ER son bien conocidas en la técnica. Ver, por ejemplo, Denecke y colaboradores, (1992). EMBO J. 11:2345-2355; Wandelt y colaboradores, (1992) Plant J. 2:181-192; Denecke y colaboradores, (1993). J. Exp. Bot. 44:213-221; Vítale y colaboradores, (1993). J. Exp. Bot. 44:1417-1444; Gomord y colaboradores, (1996) Plant Physiol. Biochem. 34:165-181; Lehmann y colaboradores, (2001) Plant Physiol. 127 (2): 436-449. Como se utiliza en la presente, "ácido nucleico" incluye la referencia a un deoxiribonucleótido o polímero de ribonucleótido en la forma de una sola o doble hebra, que a menos que se limite de otra manera, comprende análogos conocidos (por ejemplo ácidos nucleótidos de péptidos) que tiene la naturaleza esencial de los nucleótidos naturales en que hibridan a ácidos nucleicos de una sola hebra de una manera similar de los nucleótidos que ocurren naturalmente. Los términos "polipéptido" , "péptido", y "proteína", se utilizan intercambiablemente en la presente para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los cuales son uno o más de residuos de aminoácidos son un análogo químico artificial de un aminoácido que ocurre naturalmente correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos que ocurren naturalmente. Los polipéptido de las modalidades se pueden producir ya sea de una molécula de ácido nucleico divulgada en la presente, o mediante el uso de técnicas de biología molecular estándares. Por ejemplo, una proteína truncada de las modalidades se puede producir mediante la expresión de una molécula de ácido nucleico recombinante de las modalidades en una célula hospedera apropiada, o alternativamente mediante una combinación de procedimientos ex vivo, tal como la digestión y purificación de proteasa. Como se utiliza en la presente, los términos "que codifica" o "codificado" cuando se utilizan en el contexto de una molécula de ácido nucleico específica significan que la molécula de. ácido nucleico comprende la información necesaria para dirigir la traducción de la secuencia de nucleótidos a una proteina especifica. La información mediante la cual una proteina es codificada es especificada por el uso de codones . Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteina puede comprender secuencias no traducidas (por ejemplo, intrones) dentro de las regiones traducidas de la secuencia de ácido nucleico o pueden carecer de tales secuencias no traducidas de intervención (por ejemplo, como en cDNA) . El termino "aminoácido" se refiere a aminoácidos que ocurren naturalmente y sintéticos, asi como análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que funcionan de una manera similar a los aminoácidos que ocurren naturalmente. Los aminoácidos que ocurren naturalmente son aquellos codificados por el código genético, asi como aquellos aminoácidos que son después modificados, por ejemplo, hidroxiprolina, y-carboxiglutamato y O-fosfoserina . Los aminoácidos pueden ser referidos en la presente por ya sea los símbolos de tres letras comúnmente conocidos o por los símbolos de una letra recomendados por la IUPC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Los nucleótidos, del mismo modo, pueden ser referidos por sus códigos de una sola letra comúnmente aceptados. Las modalidades comprenden métodos para utilizar composiciones de polinucleótido o de proteína aisladas o sustancialmente purificadas. Un polinucleótido o proteína, "aislado" o "purificado", o porción biológicamente activo del mismo, está sustancialmente o esencialmente libres de componentes que normalmente acompañan o interactúan con el polinucleótido o proteica como se encuentra en su medio ambiente en que ocurren naturalmente. Asi, un polinucleótido 0 proteina aislado o purificado está sustancialmente libre de otro material celular, o medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas recombinantes o sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos cuando se sintetizan químicamente. Óptimamente como un polinucleótido "aislado" esta libres de secuencias (óptimamente secuencias de codificación de proteínas) que naturalmente flanquean al polinucleótido (es decir secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del polinucleótido) en el DNA genómico del organismo del cual se deriva el polinucleótido. Por, ejemplo, en varias modalidades el polinucleótido aislado puede contener menos de aproximadamente 5 Kb, 4 Kb, 3 Kb, 2 Kb, 1 Kb, 0.5 Kb, o 0.1 Kb de secuencia de nucleótidos que naturalmente flanquea el polinucleótido en el DNA genómico de la célula de la cual se deriva el polinucleótido. Una proteína que está sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteína que tiene menos de aproximadamente 30%, 20%, 10%, 5% o 1% (en peso seco) de proteína contaminante. Cuando la proteína en las modalidades o una proporción biológicamente activa de la misma es recombinantemente producida, el modo de cultivo óptimamente representa menos de aproximadamente 30%, 20%, 10%, 5% o 1% (en peso seco) de precursores químicos o sustancias' químicas no de interés para la proteína. Los fragmentos y variantes de las secuencias de nucleótidos divulgadas y proteínas codificadas de esta manera también están comprendidos por las modalidades. "Fragmento" se propone para dar entender una porción de la secuencia de nucleótidos o una porción de la secuencia de aminoácidos y por consiguientes la proteína codificada de tal manera. Los fragmentos de una secuencia de nucleótidos pueden codificar fragmentos de proteína que retienen la actividad biológica de la proteína nativa, y por consiguiente tienen actividad antifungal. Alternativamente, los fragmentos de una secuencia de nucleótidos que son útiles como sondas de hibridación generalmente no codifican proteínas de. fragmento que retienen la actividad biológica. Así, los fragmentos de una secuencia de nucleótidos pueden variar de por lo menos aproximadamente 20 nucleótidos, aproximadamente 50 nucleótidos, aproximadamente 100 nucleótidos, y hasta la secuencia de nucleótidos de longitud completa que codifica los polipéptidos de las modalidades. Un fragmento de una secuencia de nucleótidos que codifica una porción biológicamente activa de un polipéptido antifungal de las modalidades codificará por lo menos 15, 25, , 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 aminoácidos contiguos, o hasta el número total de aminoácidos presentes en un polipéptido antifungal de longitud completa de longitud completa de las modalidades (por ejemplo, 107 aminoácidos para la SEQ ID NO: 1) . Los fragmentos de una secuencia, de nucleótidos que son útiles como sondas de hibridación o cebadores de PCR generalmente necesitan no codificar una porción biológicamente activa de una proteina antifungal. Como se dice en la presente, "secuencia de longitud completa" en referencia a un polinucleótido especificado significa que tiene la secuencia del ácido nucleico completa de una secuencia negativa. "Secuencia nativa" se propone para dar ha entender una secuencia endógena, es decir como una secuencia no diseñada encontrada en el genoma de un organismo. Asi, un fragmento de una secuencia de nucleótidos de las modalidades puede codificar una porción biológicamente activa de un polipéptido antifungal, o puede ser un fragmento que puede ser utilizado como una sonda de hibridación o cebador de PCR utilizando los métodos divulgados enseguida. Una porción biológicamente activa de un' polipéptido antifungal se puede preparar al aislar una porción de una de las secuencias de nucleótidos de las modalidades que expresan la porción codificada de la proteina antifungal (por ejemplo, mediante la expresión recombinante in vitro) , y al estimar la actividad de la porción codificado de la proteina antifungal. Las moléculas de ácido nucleico que son fragmentos de una secuencia de nucleótidos de las modalidades comprenden por lo menos 15, 20, 50, 75, 100 o 150 nucleótidos contiguos o hasta el número de nucleótidos presentes en una secuencia ' de nucleótidos de longitud completa divulgada en la presente. "Variantes" se propone para dar entender secuencias sustancialmente similares. Para polinucleótidos , una variante comprende una supresión y/o adición de uno o más nucleótidos en uno o más sitios internos dentro del polinucleótido nativo y/o una sustitución de una o más nucleótidos en uno más sitios en el polinucleótido nativo. Como se dice en la presente, un polinucleótido o polipéptido "nativo" comprende una secuencia de nucleótidos que ocurren naturalmente o secuencias de aminoácidos, respectivamente. Un experto en la técnica reconocerá que las variantes de las secuencias de ácido nucleico de las modalidades serán construidas tal que la estructura de lectura abierta es mantenida. Para polinucleótidos, las variantes conservativas incluyen aquellas secuencias que, debido a la degeneración del código genético, codifican las 'secuencias de aminoácidos de los polipéptidos antifungales de las modalidades. Las variantes alélicas que ocurren naturalmente tales como estas pueden ser identificadas con el uso de las técnicas de biología molecular bien conocidas, como, por ejemplo, con la reacción de cadena de polimerasa (PCR) y las técnicas de hibridación como se resumen enseguida. Los polinucleótidos variantes también incluyen polinucleótido sintéticamente derivados, tales como aquellos generados por ejemplo, al utilizar la mutagénesis dirigida al sitio pero que todavía codifica una proteína antifungal de las modalidades. Generalmente, las variantes de un polinucleótido particular de las modalidades tendrán por lo menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia a ese polinucleótido particular como es determinado con los programas de alineación de secuencias y los parámetros descritos en otra parte en la presente. Las variantes de un polinucleótido particular de las modalidades (es decir, el polinucleótido de referencia) también se pueden evaluar mediante la comparación del por ciento de identidad de secuencia entre el polipéptido codificado por un polinucleótido variante y el polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Así, por ejemplo, un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido con un por ciento de identidad de secuencia dado a los polipéptidos de la SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, y 9 son divulgados. El por ciento de identidad de secuencia entre cualquiera de dos polipéptidos se puede calcular utilizando programas de alineación de secuencia y parámetros descritos en otra parte en la presente. Donde cualquier par dado de polinucleótidos de las modalidades se evalúan mediante la comparación del por ciento de identidad de secuencia compartido por los dos polipéptidos ellos codifican, el por ciento de identidad de secuencia entre-' los polipéptidos codificados es de por lo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidades de secuencia. Proteina "variante" se propone para dar a entender una proteina derivada de la proteina nativa mediante la supresión o adición de uno o más aminoácidos en uno más sitios internos en la proteina nativa y/o sustitución de uno o más aminoácidos en uno o más sitios de la proteina nativa. Las proteínas variantes comprendidas por las modalidades son biológicamente activas, esto es continúan presentando la actividad biológica deseada de la proteína nativa, esto es, la actividad antifungal como es descrito en la presente. Tales variantes pueden resultar de, por ejemplo, el polimorfismo genético o de la manipulación humana. Las variantes biológicamente activas de una proteína antifungal nativa de las modalidades tendrá por lo menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia a la secuencia de aminoácido de la proteína nativa como es determinado por los programas de. alineación de secuencias y los parámetros descritos en otra parte en la presente. Una variante biológicamente activa de una proteina de las modalidades puede diferir de esa proteina por tan pocos como 1-15 residuos de aminoácidos, tan pocos como 1-10, tales como 6-10, tan pocos como 5, tan pocos como 4, 3, 2, o un 1 un residuo de aminoácido. Las proteínas de las modalidades se pueden alterar de varias maneras incluyendo, las sustituciones, supresiones, truncamientos e inserciones de aminoácidos. Los métodos para tales manipulaciones son generalmente conocidos en la técnica. Por ejemplo, las variantes y fragmentos de la secuencia de aminoácidos de las proteínas antifungales se pueden preparar mediante mutaciones en el DNA. Los métodos para la mutagénesis y alteraciones de polinucleótidos son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Kunkel (1985) Proc. 'Nati. Acad. Sci . USA 82:488-492; Kunkel y colaboradores, (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382; patente norteamericana No. 4,873,192; Walter y Gaastra, eds . (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York) y las referencias citadas en las mismas. La guía en cuanto la sustitución de aminoácidos apropiadas que no afectan la actividad biológica de la proteína de interés se pueden encontrar el modelo de Dayhoff y colaboradores, (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Nati. Biomed. Res. Found, Washington, D.C.), incorporada en la presente por referencia. Las sustituciones conservativas, tal como el intercambio de un aminoácido con otro que tiene propiedades similares, pueden ser óptimas. "Variantes conservativamente modificada" aplica a ambas secuencias de aminoácidos y de ácido nucleico. Con respecto a las secuencias de ácido nucleico particulares, las variantes conservativamente modificadas se refieren aquellos ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o donde el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, a esencialmente secuencias idénticas. Debido a la degeneración del código genético, un número grande de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteina dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU todos codifican el aminoácido alanina. Asi, en cada posición donde una alanina es especificada por un codón, el codón puede ser alterado a cualquiera de los colores correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Tales variaciones de ácido nucleico son "variaciones silenciosas" que son una especie de variaciones conservativamente modificadas. Cada secuencia de ácido nucleico en la presente que codifica un polipéptido también describe cada posible variación silenciosa del ácido nucleico. Un experto reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que es ordinariamente el único codón para metionina) se puede modificar para producir una molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita. En cuanto a secuencias de aminoácidos, un experto reconocerá que sustituciones individuales, en un ácido nucleico, péptido, polipéptido o secuencia de proteína que altera un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada es una "variante conservativamente modificada" donde la alteración da por resultado la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustitución conservativa que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Los siguientes seis grupos cada uno contiene aminoácidos que son sustituciones conservativas para otro: 1) Alanina (A), Serina (S) Treonina (T) ; 2) Ácido Aspártico (D) , ácido glutámico (E) ; 3) Asparagina (N) , Glutamina (Q) ; 4) Argirina (R) , Lisina (K) ; 5) Isoleucina (I), Leucina (L) , Metionina (M) , Valina (V) ; y 6) Fenilalanina (F) , Tirosina (Y) , Triptofano ( ) . (Ver por ejemplo, Creighton, Proteins (1984)). Así, los genes y polinucleotidos de las modalidades incluyen tanto las secuencias que ocurren naturalmente asi como formas imitantes. Del mismo modo, las proteínas de las modalidades comprenden proteínas que ocurren naturalmente así como variaciones y formas modificadas de las mismas. Tales variantes continuarán presentando la actividad antifungal deseada. Obviamente, las mutaciones que serán hechas en el DNA que codifica la variante no deben colocar la' secuencia fuera de la estructura de lectura y óptimamente no crearán regiones complementarias que podrían producir estructura de mRNA secundaria. Ver, la patente Europea No. 007544. En la naturaleza, algunos polipéptidos se producen como precursores complejos que, además de las marcas de dilección tales como los péptidos de señal discutidos en otra parte en esta solicitud, también contienen otros fragmentos o péptidos que son removidos (procesados) en algún punto durante la maduración de la proteína, dando por resultado una forma madura del polipéptido que es diferente del producto de traducción primaría (además de la remoción del péptido de señal) . "Proteína madura" se refiere a un polipéptido post-traduccionalmente procesado; es decir, uno del cual cualquiera de los pre-o propéptidos presentes en el producto de traducción primaria se ha removido. "Proteína precursora" o "prepropéptido" o "preproproteínas" todos se refieren al producto primario de traducción de mRNA; es decir, con pre- y propéptidos todavía presentes. El pre- y propéptidos pueden incluir, pero no están limitados a, señales de localización intracelulares . "Pre" en esta nomenclatura generalmente se refiere al péptido de señal. La forma del producto de traducción con solamente el péptido de señal removido pero sin procesamiento adicional todavía es llamado un "prepropéptido" o "proproteína". Los fragmentos o seguimientos que son removidos pueden ser por sí mismos también referidos como "propéptidos". Una proproteína o propéptido así ha tenido el péptido de señal removido, pero contiene propéptidos (aquí con referencias a segmentos de propéptidos) y las porciones que constituirán la proteína madura. La persona experta es capaz de determinar, dependiendo de la especie en la cual las proteínas están siendo expresadas y la localización intracelular deseada, sin niveles de expresión más altos podría ser obtenidos al utilizar una construcción de gen que codifica precisamente la forma madura de la proteína, la forma madura con un péptido de señal, o la proproteína (es decir, una forma que incluye propéptido) con un péptido de señal. Para expresión óptima en plantas u hongos, se pueden necesitar secuencias de pre- y propéptido. Los segmentos de propéptido pueden desempeñar una función en ayudar al plegamiento con el péptido correcto. Las supresiones, inserciones, y sustituciones de las secuencias de las proteínas comprendidas en la presente no se esperan que produzcan cambios radicales en las características de la proteina. Sin embargo, cuando es difícil predecir el efecto exacto de la sustitución, supresión o inserción por adelantado haciéndolo de esta manera, un experto en la técnica apreciará que el efecto será evaluado mediante los ensayos de clasificación de rutina. Esto es, la actividad se puede evaluar mediante ensayos que miden la actividad antifungal tales como, por ejemplo, ensayos de placa antifungal y otros métodos descritos en otra parte en esta descripción. Ver, por ejemplo, Duvick y colaboradores. (1992) J. Biol . Chem. 267:18841-18820, incorporada en la presente por referencia. Los polinucleotidos y proteínas variantes también comprenden secuencias y proteínas derivadas de un procedimiento mutagénico y recombinogénico tal como el entremezclado de DNA. Con tal procedimiento, una o más secuencias de codificación de proteína antifungales diferentes se pueden manipular para crear una nueva proteína antifungal que posee las propiedades deseadas. De esta manera, librerías de polinucleotidos recombinantes se generan de una población de polinucleotidos de secuencia relacionada que comprende regiones de secuencias que tienen identidad de secuencia sustancial y pueden ser homólogamente recombinadas in vitro o in vivo. Por ejemplo, utilizando este procedimiento, las porciones de secuencia que codifican un dominio de interés pueden ser entremezcladas entre el gen que codifica una proteina antifungal de las modalidades y otros genes conocidos que codifican proteínas antifungales para obtener una nueva codificación de gen para una proteína con una propiedad mejorada de interés, tal como la actividad antifungal incrementada. Las estrategias para tal entremezclado de DNA son conocidas en la técnica. Ver, por ejemplo, Stemmer (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. EÜA 911:10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri y colaboradores, (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore y colaboradores, (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang y colaboradores, (1997) Proc. Nati. Acad. Sci EU7A 94:4504-4509; Crameri y colaboradores, (1998) Nature 391:288-291; y las patentes norteamericanas Nos. 5,605,793 y 5,837,458. Los polinucleótidos de las modalidades se pueden utilizar para aislar secuencias correspondientes de otros organismos, particularmente otras plantas. De esta manera, métodos tales como PCR, hibridación y los similares se pueden utilizar para identificar tales secuencias basadas en su homología de secuencia a las secuencias expuestas en la presente. Las secuencias aisladas, basadas en su identidad de secuencia a las secuencias completas expuestas en la presente o variantes o fragmentos de las mismas están comprendidas por las modalidades. Tales secuencias incluyen secuencias que son ortólogas de las secuencias divulgadas. "Ortólogos" se proponen para dar entender genes derivados de un gen ancestral común y que se encuentran en diferentes especies como un resultado de la especiación. Los genes encontrados en diferentes especies se consideran ortólogos cuando sus secuencias de nucleótidos y/o sus secuencias de proteínas codificadas comparten por lo menos 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o identidad de secuencia más grande. Las funciones de los ortólogos son de manera frecuente altamente conservadas entre las especies. Así, los polinucleótidos aislados que codifican para una proteína antifungal y que hibridan bajo condiciones severas a las secuencias divulgadas en la presente, variantes o fragmentos de la misma, están comprendidos por las modalidades . En un procedimiento de PCR, los cebadores de oligonucleótido se pueden diseñar para el uso en reacciones de PCR para amplificar secuencias de DNA correspondientes a partir del cDNA o DNA genómico extraído de cualquier organismo de interés. Los métodos para diseñar cebadores de PCR y la clonación de PCR son generalmente conocidos en la técnica y son divulgados en Sambrook y colaboradores, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York) . Ver también Innis y colaboradores, eds . (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods y Applications (Academic Press, New York) ; e Innis y Gelfand eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New Cork); e Innis y Gelfand, eds . (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York) . Los métodos conocidos de PCR incluyen, pero no están limitados a; métodos utilizando cebadores . por pares, cebadores empalmados, cebadores específicos individuales, cebadores degenerados, cebadores específicos de gen, cebadores específicos de vector, cebadores parcialmente desigualados y los similares. En las técnicas de -hibridación, todo o parte de un polinucleótido conocido se utiliza como una sonda que selectivamente híbrida a otros polinucleótidos correspondientes presentes en una población de fragmentos de DNA genómico clonados o fragmentos de cDNA (es decir, librerías genómicas o de cDNA) a partir de un organismo seleccionado. Las sondas de hibridación pueden ser fragmentos de DNA genómico, fragmentos de cDNA, fragmentos de RNA u otros oligonucleótidos y pueden ser marcadas con un grupo detectable tal como 32p, o cualquier otro marcador detectable. Así, por ejemplo, las sondas para hibridación se pueden hacer al marcar oligonucleótidos sintéticos basados en los polinucleótidos de las modalidades. Los métodos para la preparación de sondas para la hibridación y para la construcción de librerías de cDNA y genómicas son generalmente conocidos en la técnica y son divulgados en Sambrook y colaboradores, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York) . Por ejemplo, un polinucleótido completo divulgado en la presente, o una o más porciones del mismo, se puede utilizar como una sonda capaz de hibridar específicamente a polinucleótidos correspondientes y RNAs mensajeros. Para lograr la hibridación especifica bajo una variedad de condiciones, tales sondas incluyen secuencias que son únicas entre las secuencias de polinucleótido antifungales y son óptimamente de por lo menos aproximadamente 10 nucleótidos en longitud, y más óptimamente por lo menos aproximadamente 20 nucleótidos en longitud. Tales sondas se pueden utilizar para amplificar polinucleótidos correspondiente de un organismo seleccionado mediante PCR. Esta técnica se puede utilizar para aislar secuencias de codificación adicionales de un organismo deseado o como un ensayo de diagnóstico para determinar la presencia de secuencia de codificación en un organismo. Las técnicas de hibridación incluyen la clasificación de hibridación de librerías de DNA en placas (ya sea placas o colonias, ver, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, supra) . La hibridación de tales secuencias se puede llevar a cabo bajo condiciones severas. "Condiciones severas" o "condiciones de hibridación severas" se proponen para dar a entender condiciones bajo las cuales una sonda hibridará a su secuencia objetivo a un grado detectablemente más grande que a otras secuencias (por ejemplo, por lo menos dos veces sobre el antecedente) . Las condicione severas son dependientes de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Al controlar la severidad de la hibridación y/o las condiciones de lavado, se pueden identificar secuencias objetivo que son 100% complementarias a las sondas (sondeo homólogo) . Alternativamente, las condiciones de severidad se pueden ajustar para permitir una desigualación en las secuencias de modo que grados menores de similitud son detectados (sondeo heterologo) . Generalmente, una sonda es de menos de aproximadamente 1000 nucleótidos en longitud, óptimamente menos de 500 nucleótidos en longitud. Típicamente, las condiciones severas serán aquellas en las cuales la concentración de sal es de menos de aproximadamente 1.5 M de ión Na, típicamente de manera aproximada 0.01 a 1.0 M de concentración de ión Na (u otras sales) en pH 7.0 a 8.3 y la temperatura es de por lo menos aproximadamente 30 °C para sondas cortas (por ejemplo 10 a 50 nucleótidos) y por lo menos aproximadamente 60 °C para sondas largas (por ejemplo mayor que 50 nucleótidos). Las condiciones severas también se pueden lograr con la adición de agentes desestabilizantes tal como formamida. Las condiciones de baja severidad ejemplares incluyen la hibridación con una solución reguladora de formamida al 30 al 35%, NaCl 1 M, SDS al 1% (dodecil sulfato de sodio) a 37°C, y un lavado IX a 2X SSC (20X SSC = NaCl 3.0 M/citrato de trisodio 0.3 ) a 50 a 55°C. Las condiciones de severidad moderada ejemplares incluyen la hibridación en formamida al 40 a 45%, NaCl 1.0 M, SDS al 1% a 37°C y un lavado en 0.5X a lx SSC a 55 a 60 °C. Las condiciones de alta severidad ejemplares incluyen la hibridación en formamida al 50%, NaCl, SDS al 1% a 37°C, y un lavado final 0. IX SSC a 60 a 65°C por al menos 30 minutos. Opcionalmente, las soluciones reguladoras de lavado pueden comprender aproximadamente 0.1% a aproximadamente 1% SDS. La duración de hibridación es generalmente menor que aproximadamente 24 horas, de manera usual aproximadamente 4 a aproximadamente 12 horas. La duración del tiempo de lavado será de por lo menos una duración de tiempo suficiente para .alcanzar el equilibrio. La especificidad es típicamente la función de los lavados de post-hibridación, los factores críticos que son la intensidad iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Para híbridos de DNA-DNA, el punto de fusión térmico (Tm) puede ser aproximado de la ecuación de einkoth y ahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm =81.5°C+16.6 (log M)+0.41 (%GC) - 0.61 (%form) -500/L; donde M es la molaridad de cationes monovalentes, % GC es el porcentaje de los nucleótidos guanosina y citosina en el DNA, % form es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación, y L es la longitud del híbrido en pares de bases. La Tm es la temperatura (bajo intensidad iónica de definida y pH) en la cual 50% de una secuencia objetivo complementaria hibrida a una sonda perfectamente igualada. Tm se reduce por aproximadamente 1°C por cada 1% de desigualación; asi, Tm, hibridación y/o las condiciones de lavado se pueden ajusfar para hibridar las secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si las secuencias con =90% de identidad son buscadas, la Tm puede ser disminuida 10 °C. Generalmente, las condiciones severas se seleccionan para ser de aproximadamente 5°C menor que la Tm para' la secuencia especifica y su complemento en una intensidad iónica definida y pH. Sin embargo, las condiciones severamente severas puede utilizar una hibridación y/o lavado en 1, 2, 3, o 4°C menor que la Tm; las condiciones moderadamente severas puede utilizar una hibridación y/o lavado en 6, 7, 8, 9, o 10°C menor que la Tm; las condiciones de baja severidad puede utilizar una hibridación y/o lavado en 11, 12, 13,· 14, 15, o 20°C menor que la Tm. Utilizando la ecuación, las composiciones de hibridación y de lavado, y la Tm deseada, aquellos expertos ordinarios entenderán que las variaciones en la severidad de hibridación y/o soluciones de lavado son inherentemente descritos. Si el grado deseado de desigualación da por resultado una Tm de menos de 45°C (solución acuosa) o 32°C (solución de formamida) , es óptimo incrementar la concentración de SSC de modo que se puede utilizar una temperatura más alta. Una guia extensiva para la hibridación de secuencias de ácido nucleico se encuentra en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry y Molecular Biology—Hibridization With Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York) ; y Ausubel y colaboradores, eds . (1995) Current Protocole in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing y Wiley-Intercience, New York). Ver Sambrook y colaboradores supra. Los siguientes términos se utilizan para describir las relaciones de secuencia entre dos o más polinucleótidos o polipéptidos : (a) "secuencia de referencia", (b) "ventana de comparación", (c) "identidad de secuencia", (d) "porcentaje de identidad de secuencia". (a) Como se utiliza en la presente, "secuencia de referencia" es una secuencia definida utilizada como una base para la comparación de secuencia. Una secuencia de referencia puede ser subcon unto o la totalidad de una secuencia especifica; por ejemplo, como un segmento de un cDNA de longitud completa o secuencia de gen, o es cDNA completo o secuencia de gen. (b) Como se utiliza en la presente, "ventana de comparación" hace referencia a un segmento contiguo y especifico de una secuencia de polinucleótido, en donde la secuencia de polinucleótido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir espacios) comparada a la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para la alineación óptima de los dos polinucleótidos . Generalmente, la ventana de comparación es de por lo menos 20 nucleótidos contiguos en longitud, y opcionalmente puede ser de 30, 40, 50, 100, o más larga. Aquellos expertos' en la técnica entienden que para evitar una alta similitud a una secuencia de referencia debido a la inclusión de espacios en la secuencia de polinucleótido, una sanción de espacio es típicamente introducida y es substraída del número de igualaciones. Los métodos de alineación de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. Así, la determinación del por ciento de identidad de secuencia entre cualquiera de dos secuencias se puede realizar utilizando un algoritmo matemático. Ejemplos no limitativos de tales algoritmos matemáticos son el algoritmo de Myers y Miller (1988) CABIOS 4:11-17; el algoritmo de alineación local de Smith y colaboradores, (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; el algoritmo de alineación global de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; el método de búsqueda para alineación local de Pearson y Lipman (1988) . Proc. Nati. Acad. Sci. 85:2444-2448; el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 872264, modificado como en Karlin y Altschul (1993) Proc. Nati. Acad. Sci EUA 90:5873-5877.

Las implementaciones en computadora de estos algoritmos matemáticos se pueden utilizar para comparación de secuencias para determinar la identidad de secuencia. Tales implementaciones incluyen, pero no están limitadas a: CLUSTAL en el programa PC/Gene (disponible de Intelligenetics , Mountain View, California); el programa ALIGN (Versión 2.0) y GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, y TFASTA en el Paquete de Software de isconsin Genetics GCG, Versión 10 (disponible de Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, California, USA) . Las alineaciones utilizando estos programas se pueden realizar utilizando los parámetros de error. El programa CLUSTAL es bien conocido por Higgins (1988) Gene 73:237-244 (1988); Higgins y colaboradores (1989) CABIOS 5: 151-153; Corpet y colaboradores (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang y colaboradores (1992) CABIOS 8: 155-65; y Pearson y colaboradores (1994) Meth. Mol. Biol. -24:307-331. El programa ALIGN está basado en el algoritmo de Myers y Miller (1988) supra. Una tabla de residuo ponderado PAM120, una sanción de longitud de espacio de 12 y una sanción de espacio de 4 se puede utilizar con el programa ALIGN cuando se comparan secuencias de aminoácidos. Los programas BLAST de Altschul y colaboradores (1990) J. Mol. Biol. 215:403 están basados en el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) supra. Las búsquedas de nucleótidos BLAST se pueden realizar con el programa BLASTN, registro = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homologas a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteina de las modalidades. Las búsquedas de proteina BLAST se pueden realizar en el programa BLASTX, registro = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homologas a una proteina o polipéptido de la invención. Para obtener alineaciones espaciadas para propósitos de comparación, Gapped BLAST (en BLAST 2.0) se puede utilizar como es descrito en Altschul y colaboradores (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Alternativamente, PSI-BLAST (en BLAST 2.0) se puede utilizar para realizar una búsqueda iterada que detecta relaciones distantes entre las moléculas. Ver Altschul y colaboradores (1997) supra. Cuando se utiliza BLAST, Gapped BLAST y PSI-BLAST, los parámetros de error de los programas respectivos (por ejemplo, BLASTN para secuencias de nucleótidos, BLASTX para proteínas) pueden ser utilizadas. Ver www.ncbi.nlm.nih.gov. La alineación también se puede realizar manualmente mediante inspección. A menos que se establezca de otra manera, los valores de identidad de secuencia/similitud proporcionados en la presente se refieren al valor obtenido utilizando GAP Versión 10 utilizando los siguientes parámetros: % de identidad y % de similitud para una secuencia de nucleótidos utilizando la Ponderación de Gap de 50 y Ponderación de Longitud de 3, y la matriz de registro nwsgapdna . cmp; % de identidad- y % de similitud para una secuencia de aminoácidos utilizando la Ponderación de Gap de 8 y Ponderación de Longitud de 2, y la matriz de registro BLOSUM62; o cualquier programa equivalente del mismo. "Programa equivalente" se propone para dar a entender cualquier programa de comparación de secuencias que, para cualquiera de dos secuencias en cuestión, genera una alineación que tiene igualaciones de residuos de nucleótidos o de aminoácidos idénticas y un por ciento de identidad de secuencia idéntico cuando se compara con la alineación correspondiente generada mediante GAP Versión 10. GAP utiliza el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48-443-453, para encontrar la alineación de dos secuencias completas que maximiza el número de igualaciones y minimiza el número de espacios. GAP considera todas las alineaciones posibles y las posiciones de espacio y crea la alineación con el número más grande de bases igualadas y los menores espacios. Esto permite la provisión de una sanción de creación de espacio y una sanción de extensión de espacio en unidades de bases igualadas. GAP debe hacer un aprovechamiento del número de sanción de creación de espacio de las igualaciones para cada espacio que este inserta. Si se selecciona una sanción de extensión de espacio mayor que cero, GAP, debe hacer, además un aprovechamiento para cada espacio insertado en la longitud de los tiempos de espacio de la sanción de extensión de espacio. Los valores de sanción de creación de espacio de error y los valores de sanción de extensión de espacio en Versión 10 del paquete de Software isconsin Genetics GCG para secuencias de proteina son 8 y 2, respectivamente. Para secuencias de nucleótidos la sanción de creación de espacio de error es de 50 mientras que la sanción de extensión de espacio de error es 3. Las sanciones de creación de espacio de extensión de espacio se pueden expresar como un número entero seleccionado del grupo de números enteros que consiste de 0 a 200, Asi, por ejemplo, las sanciones de creación de espacio de extensión de espacio pueden ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o más grande. GAP presenta un miembro de la familia de mejores alineaciones. Pueden haber muchos miembros de esta familia, pero ningún otro miembro tiene mejor calidad. GAP exhibe cuatro figuras de mérito para alineaciones: Calidad, Relación, Identidad y Similitud. La Calidad es la métrica maximizada con el fin de alinear las secuencias. La Relación es la Calidad dividida entre el número de bases en el segmento más corto. Por ciento de identidad es el por ciento de los símbolos que realmente se igualan. El por ciento de Similitud es el por ciento de los símbolos que son similares. Los símbolos que están a través de los espacios son ignorados. Una similitud se registra cuando el valor de matriz de registro para un par de símbolos es mayor que o igual a 0.50, el umbral de similitud. La matriz de registro utilizada en la Versión 10 del Paquete de Software de Genética de Wisconsin GCG es BLOSÜM62 (ver Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:10915). (c) Como se utiliza en la presente, "identidad de secuencia" o "identidad" en el contexto de dos secuencias de polinucleótidos o de polipéptido hace referencia a los residuos en las dos secuencias que son las mismas cuando se alinean para correspondencia máxima ' sobre una ventana de comparación especificada. Cuando el porcentaje de identidad de secuencia se utiliza en referencia a proteínas se reconoce que las posiciones de residuo que no son idénticas f ecuentemente difieren por sustituciones de aminoácidos conservativas, donde los residuos de . aminoácido son sustituidos por otros residuos de aminoácidos con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad) y por lo tanto no cambian las propiedades funcionales de la molécula. Cuando las secuencias difieren en sustituciones conservativas, el por ciento de. identidad de secuencia se pueden ajusfar hacia arriba para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Las secuencias que difieren con tales sustituciones conservativas se dice que tienen "similitud de secuencia" o "similitud". Medios para hacer este ajuste son bien conocidos para aquellos expertos en la técnica. Típicamente este involucra registrar una sustitución conservativa como una desigualación parcial antes que completa, para de esta manera incrementar el porcentaje de identidad de secuencia. Asi, por ejemplo, donde un aminoácido idéntico se le da un registro de 1 y una sustitución no conservativa se le da un registro de cero, . una sustitución conservativa se le da un registro entre cero y 1. El registro de sustituciones conservativas se calcula, por ejemplo, como es implementado en el programa PC/GENE ( Intelligenetics , Mountain View, California) . (d) Como se utiliza en la presente, "porcentaje de identidad de secuencia" significa el valor determinado al comparar dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia de polinucleótido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, espacios) como es comparado con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula al determinar el número de posiciones en el cual la base de ácido nucleico idéntico o residuo de aminoácido ocurre en ambas secuencias para producir el número de posiciones igualadas, al dividir el número de posiciones igualadas entre el número total de posiciones en la ventana de comparación, y al multiplicar el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia. El uso del término "polinucleótido" no se propone para limitar las modalidades a polinucleótidos que comprenden DNA. Aquellos de habilidad ordinaria en la técnica reconocerán que los polinucleótidos, pueden comprender ribonucleótidos y combinaciones de ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos . Tales desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos incluyen tanto moléculas que ocurren naturalmente como análogos sintéticos.. Los polinucleótidos de las modalidades también comprenden todas las formas de secuencias que' incluyen, pero no limitadas a, formas de una sola hebra, formas de doble hebra y los similares. En algunas modalidades, además se proporcionan casetes de expresión que comprenden un promotor operablemente enlazado a una secuencia de nucleótidos heteróloga de las modalidades que codifica un polipéptido antifungal. Los casetes de expresión de las modalidades encuentran uso en la generación de plantas transformadas, células de plantas y microorganismos y en la práctica de los métodos para inducir resistencia a patógenos fúngales divulgados en la presente. El cásete de expresión incluirá secuencias regulatorias de 5' y 3' operablemente enlazadas a un polinucleótido de las modalidades. "Operablemente enlazado" se propone para dar a entender un enlace funcional entre dos o más elementos . Por ejemplo, un enlace operable entre un polinucleótido de interés y una secuencia regulatoria (es decir, un promotor) es un enlace funcional que permite la expresión del polinucleótido de interés. Los elementos operablemente enlazados pueden ser contiguos o no contiguos. Cuando se utilizan para referirse a la unión de dos regiones de codificación de proteína, por operablemente enlazado se propone que las regiones de codificación están en la misma estructura de lectura. El cásete adicionalmente puede contener por lo menos un gen adicional que es cotransformado en el organismo. Alternativamente, el (los) gen (es) adicional (es) se puede proporcionar sobre casetes de expresión múltiples. Tal cásete de expresión se proporciona con una pluralidad de sitios de restricción y/o sitios recombinantes para ' la inserción del polinucleótido que codifica un polipéptido antifungal que está bajo la regulación transcripcional de las regiones regulatorias . El cásete de expresión adicionalmente puede contener genes marcadores seleccionables . El cásete de expresión incluirá en la dirección 5' -3' de transcripción, una región de iniciación- de transcripción (es decir, un promotor) una región de iniciación de traducción, un polinucleótido de las modalidades, una región de terminación de traducción y, opcionalmente una región de terminación de transcripción funcional en el organismo hospedero. Las regiones regulatorias (es decir, promotores, regiones regulatorias transcripcionales y regiones de terminación traduccional ) y/o el polinucleótido de las modalidades pueden ser nativo/análogo a la célula hospedera o entre si. Alternativamente, las regiones regulatorias y el polinucleótido de las modalidades pueden ser heterólogas a la célula hospedera o entre si. Como se utiliza en la presente, "heterólogos" en referencia a una secuencia es una secuencia que se origina - de una especie foránea, o, si es de la misma especie, es sustancialmente modificada de su forma nativa en composición y/o sitio genómico mediante la intervención humana deliberada. Por ejemplo, un promotor operablemente enlazado a un polinucleótido heterólogo es una especie diferente de la especie de la cual se derivó el polinucleótido, o si es de la misma/especie análoga, uno o ambos son sustancialmente modificados de su forma original y/o sitio genómico, o el promotor no es el promotor nativo para el polinucleótido operablemente enlazado. La región de terminación opcionalmente incluida puede ser nativa con la región de iniciación de transcripción, puede ser nativa con el polinucleótido operablemente enlazado de interés, puede ser nativa con el hospedero de planta, o puede ser derivada de otra fuente (es decir foránea o heteróloga) al promotor, el polinucleótido de interés, el hospedero o cualquier combinación de los mismos.

Las regiones de terminación convenientes son disponibles del plásmido Ti de A. turnefaciens, tal como las regiones de terminación de octopina sintasa y nopalina sintasa. Ver también Guerineau y colaboradores, (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon y colaboradores, (1991) Genes Dev 5:141-149; Mogen y colaboradores, (1990) Planta Cell 2:1261-1272; Munroe y colaboradores, (1990) Gene 91:151-158; Bailas y colaboradores, (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; y Joshi y colaboradores, (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639. En modalidades particulares, se utiliza el terminador del gen inhibidor de proteasa de papa II (pinll) . Ver, por ejemplo, Keil y colaboradores, (1986) Nucí. Acids Res. 14:5641-5650; y ?? y colaboradores, (1989) Plant Cell 1:115-122, incorporada en la presente por referencia en su totalidad. Donde es apropiado, los polinucleótidos se pueden optimizar para la expresión incrementada en el organismo transformado. Por ejemplo, los polinucleótidos se pueden sintetizar utilizando codones preferidos de plantas para la expresión mejorada. Ver, por ejemplo, Campbell y Go ri (1990) Plant Physiol. 92:1-11 para una descripción de la utilización de codón preferido por el hospedero. Métodos están disponibles en la técnica para sintetizar genes preferidos de plantas. Ver, por ejemplo, las patentes norteamericanas Nos. 5,380,831 y 5,436,391, y Murria y colaboradores, (1989) Nucleíc Acids Res. 17:477-498, incorporados en la presente por referencia. Las modificaciones de secuencia adicionales se conocen que aumentan la expresión de gen en un hospedero celular. Estas incluyen la eliminación de secuencias que codifican señales de poliadenilación espurias, señales de sitio de empalme de exón-intrón, repeticiones similares a transposón y otras de tales secuencias bien caracterizadas que pueden ser perjudiciales para la expresión del gen. El contenido de G-C de las secuencias se puede ajustar a niveles promedio para un hospedero celular dado, como es calculado por referencia a genes conocidos o expresados en la célula hospedera. Cuando es posible, la secuencia es modificada para evitar las estructuras de mRNA secundarias de horquilla predichas . Los casetes de expresión adicionalmente pueden contener secuencias guias 5' . Tales secuencias guia pueden actuar para aumentar la traducción. Las guias de traducción son conocidas en la técnica e incluyen: guias de picornavirus, por ejemplo, guia EMCV (región de no codificación 5' de Encefalomiocarditis ) (Elroy-Stein y colaboradores (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:6126-6130); guias de potivirus, por ejemplo, guia TEV (Virus de Grabado de Tabaco) (Gallie y colaboradores (1995) Gene 165 (2) : 233-238) , guia de MDMV (Virus de Mosaico de Maíz Enano) {Virology 154:9-20), y proteina de enlace de cadena pesada de inmunoglobulina humana (BiP) (Macej ak y colaboradores (1991) Nature 353:90-94); guia no traducida del mRNA de proteina de recubrimiento del virus de mosaico de alfalfa (AMV RNA 4) (Jobling y colaboradores (1987) Nature 325:622-625); guia de Virus de Mosaico de Tabaco (TMV) (Gallie y colaboradores (1989) in Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, New York), pp. 237-256); y guia de virus moteado clorótico de maíz (MCMV) (Lommel y colaboradores (1991) Virology 81:382-385). Ver También, Della-Cioppa y colaboradores (1987) Plant Physiol. 84:965-968. En la preparación del cásete de expresión, los diversos fragmentos de DNA pueden ser manipulados para proporcionar las secuencias de DNA en la orientación apropiada y, como sea apropiado, en la estructura de lectura apropiada. Hacia este fin, los adaptadores o enlazadores puede ser empleados para unir los fragmentos de DNA u otras manipulaciones pueden ser involucradas para proporcionar sitios de restricción convenientes, remoción de DNA superfluo, remoción de sitios de restricción o los similares. Para este propósito, la mutagénesis in vitro, reparación de cebador, restricción, recocido, resustituciones, por ejemplo, transiciones y transversiones, pueden ser involucradas. El cásete de expresión también puede comprender un gen marcador seleccionable para la selección de células transformadas. Los genes marcadores selecciónateles son utilizados para la selección de células o tejidos transformados. Los genes marcadores incluyen genes- que codifican resistencia a antibiótico, tales como aquellos que codifican neomicina fosfotransferasa II (NEO) e higromicina fosfotransferasa (HPT) , asi como genes que confieren resistencia a compuestos herbicidas, tales como glufosinato amonio, bromoxinilo, imidazolinonas , glifosato y 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D). Los marcadores seleccionables adicionales incluyen marcadores fenotipicos tales como ß-galactosidasa y proteínas fluorescentes tal como la proteína fluorescente verde (GFP) (Su y colaboradores, (2004) Biotechnol Bioeng 85:610-9 y Fetter y colaboradores, (2004) Plant Cell 16:215-28), y la proteína fluorescente de ciano (CYP) '(Bolte y colaboradores, (2004) J. Cell Science 117:943-54 y Kato y colaboradores, (2002) Plant Physiol 129:913-42) y la proteína fluorescente amarilla (PhiYFP™ de Evrogen, ver, Bolte y colaboradores, (2004) J. Cell Science 117:943-54). Para marcadores seleccionables adicionales, ver generalmente, Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech 3:506-511; Christopherson y colaboradores (1992) Proc. Nati. Acad. Sci . USA 89:6314-6318; Yao y colaboradores (1992) Cell 71:63-72; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6:2419-2422; Barkley y colaboradores (1980) in The Operon, pp. 177-220; Hu y colaboradores (1987) Cell 48:555-566; Brown y colaboradores (1987) Cell 49:603-612; Figge y colaboradores (1988) Cell 52:713-722; Deuschle y colaboradores (1989) Proc. Nati. Acad. Scí. USA 86:5400-5404; Fuerst y colaboradores (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:2549-2553-; Deuschle y colaboradores (1990) Science 248:480-483; Gossen (1993) Ph. D. Thesis, University of Heidelberg; Reines y colaboradores (1993) Proc. Acad. Scí. USA 90:1917-1921; Labow y colaboradores (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343-3356; Zambretti y colaboradores (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:3952-3956; Baim y colaboradores (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:5072-5076; yborski y colaboradores (1991) Nucleic Acids Res. 19:4647-4653; Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143-162; Degenkolb y colaboradores (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591-1595; leinschnidt y colaboradores (1988) Biochemistry 27:1094-1104; Bonin (1993) Ph. D. Thesis, üniversity of Heidelberg; Gossen y colaboradores (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:5547-5551; Oliva y colaboradores (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919; Hlavka y colaboradores (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlín); Gilí y colaboradores (1988) Nature 334:721-724; y WO 02/36782. Tales descripciones son incorporadas en la presente por referencia. La lista anterior de genes marcadores seleccionables no se propone para ser limitativa. Cualquier gen marcador seleccionable puede ser utilizado en la presente invención . El término "promotor" se refiere a regiones o secuencias localizadas corriente arriba y/o corriente abajo desde el inicio de transcripción que están involucradas en el reconocimiento y enlace del RNA polimerasa y otras proteínas para iniciar la transcripción. Los promotores incluyen secuencias de ácido nucleico cercanos al sitio de inicio de transcripción, tal como, en el caso del promotor de tipo polimerasa II, un elemento TATA. Un promotor también opcionalmente incluye elementos aumentadores o represores distantes, que pueden ser localizados tanto como varios miles de pares de bases desde el inicio de transcripción. Un promotor "constitutivo" es un promotor que es activo bajo la mayoría de las condiciones ambientales y de desarrollo. Un promotor "inducible" es un promotor que es. activo bajo la regulación ambiental o de desarrollo. El término "operablemente enlazado" se refiere a un enlace funcional entre de una secuencia de control de expresión de ácido nucleico (tal como un promotor, o arreglo de sitios de enlace de fa-ctor de transcripción) y una segunda secuencia de ácido nucleico, en donde la secuencia de control de expresión dirige la transcripción del ácido nucleico correspondiente a la segunda secuencia. Un número de promotores se puede utilizar en la práctica de las modalidades, incluyendo el promotor nativo de la secuencia del polinucleótido de interés. Los promotores se pueden seleccionar en base al efecto deseado. Una amplia gama de promotores de plantas se discuten en la revisión reciente de Potenza y colaboradores, (2004) In Vitro Cell Dev Biol-Plant 40:1-22, incorporada en la presente por referencia. Por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico se pueden combinar con promotores constitutivos, preferidos de tejido,- dnducibles de patógeno u otros promotores para la expresión en plantas. Tales promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, el promotor de núcleo del promotor Rsyn7 y otros promotores constitutivos divulgados en O 99/43838 y la patente norteamericana No. 6,072,050; el promotor 35S de CaMV de núcleo (Odell y colaboradores, (1985) Nature 313:810-812); actina de arroz (McElroy y colaboradores, (1990) Plant Cell 2:163-171); ubicuitina (Christensen y colaboradores, (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 y Christensen y colaboradores, (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMÜ (Last y colaboradores, (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Velten y colaboradores, (1984) EMBO J. 3:2723-2730); promotor ALS (patente norteamericana No. 5,659,026), y los similares. Otros promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, aquellos divulgados en las patentes norteamericanas Nos. 5,608,149; -5,608,144; 5,604,121; 5, 569, 597; 5, 466, 785; 5, 399, 680; 5,268, 463; 5, 608,142; y 6,177, 611.

Generalmente, será benéfico expresar el gen de un promotor inducible, particularmente de un promotor inducible por patógeno. Tales promotores incluyen aquellos de la proteina relacionadas a la patogénesis (proteínas PR) , que son inducidas después de la infección por un patógeno, por ejemplo, proteínas PR, proteínas SAR, beta-1, 3-glucanasa, quitinasa, etc. Ver, por ejemplo, Redolfi y colaboradores, (1983) Neth. J: Plant Pathol. 89:245-254; Uknes y colaboradores, (1992) Plant Cell 4:645-656; y Van Loon (1985) Plant Mol. Virol. 4:111-116. Ver también WO 99/43819, incorporadas en la presente por referencia. De interés son los promotores que dan por resultado la expresión de una proteína localmente en o cerca del sitio de la infección del patógeno. Ver, por ejemplo, Marineau y colaboradores, (1987) Plant Mol. Biol. 9:335-342; Matton y colaboradores, (1989) Molecular Plant-Microbe Interactions 2:325-331; Somsisch y colaboradores, (1986) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83:2427-2430; Somsisch y colaboradores, (1988) Mol. Gen. Genet. 2:93-98 y Yang (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:14972-14977. Ver también, Chen y colaboradores, (1996) Plant J. 10:955-966; Zhang y colaboradores, (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91:2507-2511; Warner y colaboradores, (1993) Plant J. 3:191-201; Síebertz y colaboradores, (1989) Plant Cell 1:961-968; Patente norteamericana No. 5,750,386; y las referencias citadas en las mismas, ün ejemplo adicional es el promotor inducible para el gen PRms de maiz, cuya expresión es inducida por el patógeno Fusarium verticillioid.es (ver, por ejemplo, Cordero y colaboradores, (1992) Physiol. Mol. Plant Path. 41:189-200). Adicionalmente, conforme los patógenos encuentran entrada en las plantas a través de lesiones o el daño por insectos, se puede utilizar un promotor inducible por lesión en las construcciones de las modalidades. Tales promotores inducibles por lesión incluyen el gen inhibidor de proteinasa de papa (pin II) (Ryan (1990) Ann. Rev. Phytopath. 28:425-449; Duan y colaboradores, (1996)' Nature Biotechnology 14:494-498); " wunl y wun2, patente norteamericana No. 5,428,148; winl y win2 (Stanford y colaboradores, (1989) Mol. Gen. Genet. 215:200-208); sistemina (McGurl y colaboradores, (1992) Science 225:1570-1573); WIP1 (Rohmeier y colaboradores, (1993) Plant Mol. Biol. 22:783-792; Eckelkamp y colaboradores, (1993) FEBS Letters 323:73-76); gen MPI (Corderok y colaboradores, (1994) Plant J. 6 (2) : 141-150) ; y los similares incorporados en la presente por referencia. Los promotores regulados químicamente se pueden utilizar para modular la expresión de un gen en una planta a través de la aplicación de un regulador químico exógeno. Dependiendo del objetivo, el promotor puede ser un promotor inducible químicamente, donde la aplicación del químico induce la expresión del gen, o un promotor reprimible o sustancia química, donde la aplicación de la sustancia química reprime la expresión del gen. Los promotores inducibles químicamente son conocidos en la técnica e incluyen, pero no son limitados al promotor ln2-2 de maíz, que es activado por los moderadores de herbicida de bencensulfonamida, el promotor GST de maíz, que es activado por compuestos electrofílieos hidrofóbicos que se utilizan como herbicidas pre-emergentes , y el promotor PR-la de tabaco, que es activado por ácido salicílico. Otros promotores regulados químicamente de interés, incluyen los promotores responsivos a esteroides (ver, por ejemplo, el promotor inducible por glucocorticoide en Schena y colaboradores, (1991) 'Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:10421-10425 y McNellis y colaboradores, (19'98) Plant J. 14(2) :247-257) y los promotores inducibles por tetraciclina y reprimibles de tetraciclina, ver, por ejemplo, Gatz y colaboradores, (1991) Mol. Gen. Genet. 227 : 229-237, y patentes norteamericanas Nos. 5,814,618 y 5,789,156), incorporadas en la presente por referencia. Los promotores preferidos de tejido se pueden utilizar para dirigir la expresión aumentada de los polipéptidos antifungales de las modalidades dentro de un tejido de planta particular. Por ejemplo, un promotor preferido de tejido se puede utilizar para expresar un polipéptido antífungal en un tejido de planta donde la resistencia a la enfermedades particularmente importante, tal como, por ejemplo, las raices, tallos o las hojas. Los promotores preferidos de tejido incluyen Yamainoto y colaboradores, (1997) Plant J. 12 (2) : 255-265; Kawamata ' y colaboradores, (1997) Plant Cell Physiol. 38 (7) : 792-803; Hansen y colaboradores, (1997) Mol. Gen Genet. 254(3) :337-343; Russell y colaboradores, (1997) Transgeníc Res. 6 (2) : 157-168; Rinehart y colaboradores, (1996) Plant Physiol. 112 (3) -.1331-1341; Van Camp y colaboradores, (1996) Plant Physiol. 112 (2 ): 525-535; Canevascini y colaboradores, (1996) Plant Physiol. 112 (2) : 513-524; Yamamoto y colaboradores, (1994) Plant Cell Physiol. 35 ( 5 ): 773-778 ; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181-196; Orozco y colaboradores, (1993) Plant Mol Biol. 23 (6) : 1129-1138; Matsuoka y colaboradores, (1993) Proc Nati. Acad. Sci. USA 90(20) :9586~ 9590; y Guevara-Garcia y colaboradores, (1993) Plant J. 4 (3) : 95-505. Tales promotores sé pueden modificar, si es necesario, para la expresión débil. Los promotores preferidos de tejido vascular son conocidos en la técnica e incluyen aquellos promotores que selectivamente inducen la expresión de proteina en, por ejemplo, xilema y el tejido de floema. Los promotores preferidos de tejido vascular incluyen, pero no están limitados a, el promotor de gen hidrolasa de prunasina de Prunus serótina (ver, por ejemplo, la publicación internacional No. O 03/006651), y también aquellos encontrados en la solicitud de patente norteamericana No. de serie 10/109,488. Los promotores preferidos de tallo se pueden utilizar para inducir la expresión de un polipéptido antifungal de las modalidades. Promotores preferidos de tallo ejemplares incluyen el promotor de gen MS8-15 de maíz (ver, por ejemplo, la patente norteamericana No. 5,986,174 y la publicación internacional No. WO 98/00533) , y aquellos encontrados en Graham y colaboradores, (1997) Plant Mol Biol 33 (4) : 729-735. Los promotores preferidos de hoja son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Yamamoto y colaboradores, (1997) Plant J. 12 ( 2 ) : 255-265 ; K on y colaboradores, (1994) Plant Physíol. 105:357-67; Yamamoto y colaboradores, (1994) Plant Cell Physiol. 35 (5) : 773-778; Gotor y colaboradores, (1993) Plant J. 3:509-18; Orozco y colaboradores, (1993) Plant Mol. Biol. 23 (6) : 1129-1138 ; y Matsuoka y colaboradores, (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90 (20) : 9586-9590. Los promotores preferidos de raiz son conocidos y se pueden seleccionar de los muchos disponibles de la literatura o aislados de novo de varias especies compatibles. Ver, por ejemplo, Hire y colaboradores, (1992) Plant Mol. Biol. 20 (2 ) : 207-218 (gen de glutamina sintetasa especifico de raiz de soya) ; Keller y Baumgartner (1991) Plant Cell 3 (10) : 1051-1061 (elemento de control especifico de raíz en el gen GRP 1.8 de judia verde); Sanger y colaboradores, (1990) Plant Mol. Biol. 14 (3) : 433-443 (el promotor especifico de raiz del gen manopina sintasa (MAS) de Agrobacterium tumefaciens) ; y Miao y colaboradores, (1991) Plant Cell 3(l):ll-22 (glutamina sintetasa (GS) citosólica que codifica el clon de cDMA de longitud completa, expresado en raices y nodulos de raiz de soya) . Ver también Bogusz y colaboradores, (1990) Plant Cell 2 ( 7 ) : 633-641 , donde dos promotores específicos de raíces aislados de los genes de hemoglobina de la no legumbre fijadora de nitrógeno Parasponia andersonli y la no legumbre no fijadora de nitrógeno relacionada a Trema tomentosa se describen. Leach y Aoyagi (1991) describen su análisis de los promotores de los genes de inducción de raíz rolC y rolD altamente expresados de Agrobacterium rhizogenes (ver Plant Science (Limerick) 79 (1) : 69-76) . Los promotores preferidos de raíz adicionales incluyen el promotor de gen VfENOD-GRP3 (Kuster y colaboradores, (1995) Plant Mol. Biol. 29 (4) : 759-772) ; y el promotor rolB (Capana y colaboradores, (1994) Plant Mol. Biol. 25 ( 4 ): 681-691. Ver también las patentes norteamericanas Nos. 5,837,876; 5,750,386; 5,633,363; 5,459,252; 5,401,836; 5,110,732 y 5,023,179. Los promotores "preferidos de semilla" incluyen tanto promotores "específicos de semilla" (a aquellos promotores activos durante el desarrollo de la semilla tales como promotores de proteínas de almacenamiento de semilla) así como promotores de "germinación de semillas" (a aquellos promotores activos durante la germinación de la semilla) . Ver Thompson y colaboradores,. (1989) BioEssays 10:108, incorporada en la presente por referencia. Tales promotores preferidos de semilla incluyen, pero no están limitados a, Ciml (mensaje inducido de citoquinina) ; CZ19B1 (zeína de 19 kDa de maíz; milps (mio-inositol-l-fosfato sintasa) (Ver WO 00/11177 y la patente norteamericana No. 6,225,529; incorporadas en la presente por referencia) . La gama-zeína es un promotor específico de endosperma preferido. Glob-1 es un promotor específico de embrión preferido. Para dicotiledóneas, los promotores específicos de semilla incluyen, pero no están limitados a, ß-faseolina de fríjol, napina, ß-conglicinina, lectina de soya, cruciferina y los similares. Para monocotiledóneas , los. promotores específicos de semilla incluyen, pero no están limitados a zeína de 15 kDa de maíz, zeína de 22 kDa, zeína de 27 kDa, g-zeína, ceroso, shrunken 1, shrunken 2, globulina 1, etc. Ver también WO 00/12733, donde los promotores preferidos de semilla de los genes endl y end2 son - divulgados; incorporada en la presente por referencia. En ciertas modalidades las secuencias de ácido nucleico de las modalidades pueden ser apiladas con cualquier combinación se secuencias de polinucleotido de interés con el fin de crear plantas con un fenotipo deseado. Por ejemplo, los polinucleótidos de las modalidades se pueden apilar con cualquiera de otros polinucleótidos de las modalidades, tal como cualquier combinación de la SEQ ID NOS: 3, 6, y 9, o con otros genes antifungales y los similares. Las combinaciones generadas también pueden incluir múltiples copias de cualquiera de los polinucleótidos de interés. Los polinucleótidos de las modalidades también pueden ser apilados con cualquier otro gen o combinación de genes para producir plantas con una ?/ariedad de combinaciones de atributos deseados incluyendo pero no limitados a atributos deseables para la alimentación animal tal como genes de alto contenido de aceite (por ejemplo, la patente norteamericana No. 6,232,529); aminoácidos balanceados (por ejemplo hordotioninas (patentes norteamericanas Nos. 5,990,389; 5,885,801; 5,885,802; y 5,703,409); cebada de alto contenido de lisina (Williamson y colaboradores, (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106; y WO 98/20122); y proteína de alto contenido de metionina (Pedersen y colaboradores, (1986) J. Biol. Chem. 261:6279; Kirihara y colaboradores, (1988) Gene 71:359; y Musumura y colaboradores, (1989) Plant Mol. Biol. 12: 123)); digestibilidad incrementada (por ejemplo, proteínas de almacenamiento modificadas (solicitud norteamericana No. de serie 10/053,410, presentada el 7 de noviembre del 2001) ; y tioredoxinas (solicitud norteamericana No. de serie 10/005,429, presentada el 3 de diciembre del 2001) ) , las descripciones de las cuales son incorporadas en la presente por referencia. Los polinucleótidos de las modalidades también se pueden apilar con atributos deseables para resistencia a insectos, enfermedades o herbicidas (por ejemplo, proteínas tóxicas de Bacillus thuringiensis (patentes norteamericanas Nos. 5,366,892; 5,747,450; 5,737,514; 5723,756; 5,593,881; Geiser y colaboradores, (1986) Gene 48:109); lectinas (Van Damme y colaboradores, (1994) Plant Mol. Biol. 24:825); genes de detoxificación de fumonisina (patente norteamericana No. 5,792,931); genes de resistencia a avirulencia y enfermedad (Jones y colaboradores, (1994) Science 266:789; Martin y colaboradores, (1993) Science 262:1432; indrinos y colaboradores, (1994) Cell 78:1089); mucantes de acetolactato sintasa (ALS) que conducen a la resistencia a herbicida tal como las mutaciones S4 y/o Hra; inhibidores de glutamina sintasa tales como fosfinotricina o basta (por ejemplo, gen bar) ; y resistencia a glifosato (genes EPSPS, genes GAT tales como aquellos divulgados en la publicación de la solicitud de patente norteamericana US2004/0082770, también WO02/36782 y WO03/092360) ) ; y atributos deseables para el procesamiento o productos de proceso tales como alto contenido en aceite (por ejemplo, la patente norteamericana No. 6,232,529); aceites modificados (por ejemplo, .genes de desaturasa de ácido graso {patente norteamericana No. 5,952,544/ WO 94/11516)); almidones modificados (por ejemplo, pirofosforilasas de ADPG (AGPasa) , sintasas de almidón (SS) , enzimas de ramificación de almidón (SDBE) y enzimas de desrramificación de almidón (SDBE) ) ; y polímeros o bioplástícos (por ejemplo, la patente norteamericana No. 5.602,321; beta-cetoquiolasa, polihidroxibutirato sintasa, y acetoacetil-CoA reductasa (Schubert y colaboradores, (1988) J. Bacterial. 170:5837-5847) facilitan la expresión de polihidroxialcanoatos (PHAs) ) , las descripciones de las cuales son incorporadas en la presente por referencia. También se podrían combinar los polinucleótidos de las modalidades con polinucleótidos que proporcionan atributos agronómicos tal como la esterilidad masculina (por .ejemplo, ver la patente norteamericana No. 5.583,210), resistencia del tallo, tiempo de florecimiento, o atributos de tecnología de transformación ¦ tal como la regulación del ciclo celular o la dirección del gen (por ejemplo WO 99/61619; WO 00/17364; WO 99/25821), las descripciones de las cuales son incorporadas en la presente por referencia. Estas combinaciones apiladas se pueden crear mediante cualquier método incluyendo pero no limitado a plantas de reproducción cruzada tal como mediante la metodología convencional o TopCross®, o la transformación genética. Sí los atributos se apilan al transformar genéticamente las plantas, las secuencias de polinucleótido de interés se pueden combinar en cualquier tiempo y en cualquier orden. Por ejemplo, una planta transgénica que comprende uno o más atributos deseados se puede utilizar como el objetivo para introducir atributos adicionales mediante la transformación subsecuente. Los atributos pueden ser introducidos simultáneamente en un protocolo de co-transformación con los polinucleótidos de interés proporcionados mediante cualquier combinación de casetes de transformación. Por ejemplo, si · se introdujeran dos secuencias, las dos secuencias pueden ser contenidas en casetes de transformación separados (trans) o contenidos en el mismo cásete de transformación (cis) . La expresión de la secuencia se pueden inducir mediante el mismo promotor o por diferentes promotores. En ciertos casos, puede ser deseable introducir un cásete de transformación que suprimirá la expresión del polinucleótido de interés. Este se puede combinar con cualquier combinación de otros casetes de supresión o casetes de sobreexpresión para generar la combinación deseada de ¦ atributos en la planta. Además se reconoce que las secuencias del polinucleótido pueden ser apiladas en una localización genómica deseada utilizando un sistema de recombinación especifica o del sitio. Ver, por ejemplo, W099/25821, W099/25854, WO99/25840, 099/25855, y W099/25853, .todas las cuales son incorporadas en la presente por referencia. Los métodos de las modalidades involucran la introducción de un polipéptido o polinucleótido en una planta. "Introducción" se propone para dar a entender que se. presenta la planta al polinucleótido. En algunas modalidades, el polinucleótido será presentado de tal manera que la secuencia gana acceso al interior de una célula de la planta, incluyendo su inserción potencial en el genoma de una planta. Los métodos de las modalidades no dependen de un método particular para introducir una secuencia en una planta, solamente que el polinucleótido gane acceso al interior de por lo menos una célula de la planta. Los métodos para introducir polinucleótidos en plantas son conocidos en la técnica incluyendo, pero no limitados a, métodos de transformación estable, métodos de t ansformación transiente y métodos mediados por virus. Los polipéptidos también se pueden introducir en una planta de tal manera que ellos ganen acceso al interior de la célula de planta o permanezcan externos a la célula pero en estrecho contacto con ésta. "Transformación estable" se propone para dar a entender que la construcción de nucleótidos introducida en una planta se integra en el genoma de la planta y es capaz de ser heredada por la progenie de la misma. "Transformación transiente" o "expresión transiente" se propone para dar a entender que un polinucleótido se introduce en la planta y. no se integra en el genoma de la planta o un polipéptido se introduce en una planta. Los protocolos de transforinación asi como protocolos para la introducción de polipéptidos o secuencias de polinucleótido en plantas pueden variar dependiendo del tipo de planta o célula de planta, es decir, monocotiledónea o dicotiledónea, dirigida para la transformación. Los métodos adecuados de introducción de polipéptidos y polinucleótidos en células de plantas incluyen la microinyección (Crossway y colaboradores, (1986) Biotechniques 4:320-334), electroporación (Riggs y colaboradores, (1986) Proc. Nati. Acad. Sel. USA 83:5602-5606', transformación mediada por Agrobacterium (patentes norteamericanas Nos. 5,563,055 y 5,981,840), transferencia de gen directa (Paszkowski y colaboradores, (1984) EMBO J. 3:2717-2722) , y la aceleración de partículas' balísticas (ver, por ejemplo, Sanford y colaboradores, patentes norteamericanas Nos. 4,945,050; 5,879,918; 5,886,244; y 5,932,782; Tomes y colaboradores, (1995) in Plant Cell r Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg y Phillips (Springer-Verlag, Berlín) ; McCabe y colaboradores, (1988) Biotechnology 6:923-926); y la transformación Lecl ( O 00/28058). También ver Weissinger y colaboradores, (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanford y colaboradores, (1987) Partícula te Science y Technology 5:27-37 (cebolla); Christou y colaboradores, (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (soya); McCabe y colaboradores, (1988) Bío/Technology 6:923-926 (soya); Finer y McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P-.175-182 (soya); Singh y colaboradores, (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (soya) ; Datta y colaboradores, (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein y colaboradores, (1988) Proc. Nati. Acad. Sel. USA 85:4305-4309 (maíz); Klein y colaboradores, (1988) Biotechnology 6:559-563 (maíz); patentes norteamericanas Nos. 5,240,855; 5,322,783 y 5,324,646; Klein y colaboradores, (1988) Plant Physiol. 91:440-444 (maíz); Fromm y colaboradores, (1990) Biotechnology 8:833-839 (maíz); Hooykaas-Van Slogteren y colaboradores, (1984) Nature ( ondon) 311 : 763- 64; patente norteamericana No. 5,736,369 (cereales); Bytebier y colaboradores, (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:5345-5349 (Liliáceas); De Wet y colaboradores, (1985) in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman y colaboradores, (Longman, New York) , pp. 197-209 (polen) ; Kaeppler y colaboradores, (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 y Kaeppler y colaboradores, (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (transformación mediada por whisker) ; D'Halluin y colaboradores, (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (electroporación) ; Li y colaboradores, (1993) Plant Cell Reports 12:250-255 y Christou y Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413 (arroz) ; Osjoda y colaboradores, (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (maíz por la vía de Agrobacterium turnefaciens) ; todas las cuales son incorporadas en la presente por referencia. En modalidades especificas, las secuencias antifungales de las modalidades se pueden proporcionar en una planta utilizando una variedad de métodos de transformación transiente. Tales métodos de. transformación transiente incluyen, pero no están limitados a la introducción de la proteina antifungal o variantes y fragmentos de la misma directamente en la planta o la introducción del transcripto de proteina antifungal en la planta. Tales métodos incluyen, por ejemplo, la microinyección o bombardeo de partículas. Ver, por ejemplo, Cross ay y colaboradores, (1986) Mol Gen. Genet. 202:179-185; Nomura y colaboradores, (1986) Plant Sci. 44:53-58; Hepler y colaboradores, (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. 91:2176-2180 y Hush y colaboradores, (1994) The Journal of Cell Science 107:775-784, todas las cuales son incorporadas en la presente por referencia. Alternativamente, el polinucleótido puede ser transformado transientemente en la planta utilizando técnicas conocidas en el arte. Tales técnicas incluyen un sistema de vector viral en la precipitación del polinucleótido en una manera que evita la liberación subsecuente del DNA. Así, la transcripción del DNA enlazado a partícula puede ocurrir, pero la frecuencia con la cual es liberado para llegar a ser integrado en el genoma es grandemente reducida. Tales métodos incluyen el uso de partículas recubiertas con polietiienimina (PEI; Sigma #P3143) . En otras modalidades, los polinucleótidos de las modalidades se pueden introducir en plantas al' poner en contacto las plantas con un virus o ácidos nucleicos virales. Generalmente, tales métodos involucran incorporar una construcción de nucleótidos de las modalidades dentro de una molécula de DNA o RNA viral. Se reconoce que el polipéptido antifungal de las modalidades puede ser inicialmente sintetizado como parte de una poliproteína viral, después puede ser procesada mediante proteólisis in vivo o in vítro para producir la proteína recombinante deseada. Además se reconoce que los promotores de las modalidades también comprenden promotores utilizados para la transcripción mediante RNA polimerasas virales. Los métodos para introducir polinucleótidos . en plantas y expresar una proteína codificada en las mismas, que involucran molécula de DNA o RNA virales, son conocidos en la técnica. Ver, por' ejemplo, las patentes norteamericanas Nos. 5,889,191, 5,889,190, 5,866,785, 5,589,367, 5,316,931, y Porta y colaboradores, (1996) Molecular Biotechnology 5:209-221; incorporados en la presente por referencia. Se conocen métodos en la técnica para la inserción dirigida de un polinucleótido en una localización específica en el genoma de la planta. En una modalidad, la inserción del polinucleótido en una localización genómica deseada se logra utilizando un sistema de recombinación especifico del sitio. Ver, por ejemplo, 099/25821, W099/25854, WO99/25840, W099/25855, y W099/25853 , todas las cuales son incorporadas en la presente por referencia. Brevemente, el polinucleótido de las modalidades puede ser contenido en un cásete de transferencia flanqueado por dos sitios de recombinación no recombinogénicos . El cásete de transferencia se introduce en una planta que tiene establemente incorporado en su genoma un sitio objetivo que es flanqueado por dos sitios de recombinación no recombinogénicos que corresponden a los sitios del cásete de transferencia. Se proporciona una recombinasa apropiada y él cásete de transferencia se integra en el sitio objetivo. El polinucleótido de interés es de esta manera integrado en una posición cromosomica especifica en el genoma de la planta. Las células que se han transformado pueden ser cultivadas en plantas de acuerdo con maneras convencionales. Ver, por ejemplo, McCormick y colaboradores, (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas luego pueden ser cultivadas y ya sea polinizadas con la misma cepa transformado o diferentes cepas, y la progenie resultante que tiene expresión constitutiva en la característica fenotípica deseada identificada. Dos o más generaciones pueden ser cultivadas para asegurar que la expresión de la característica fenotípica deseada es establemente mantenida y heredada y luego las semillas cosechadas para asegurar que se ha logrado la expresión de la característica fenotípica deseada. De esta manera, las modalidades proporcionan semilla transformada (también ¦ referida como "semilla transgénica" ) que tiene una construcción de nucleótido de las modalidades, por ejemplo, un cásete de expresión de las modalidades, establemente incorporado en su genoma. Como se utiliza en la presente, el término "planta" incluye plantas completas, células de plantas, protoplastos de plantas, cultivos de tejido de células de plantas de las cuales una planta de maíz puede ser regenerada, callos de plantas, agrupaciones de plantas y células de plantas que están intactas en las plantas o partes de plantas tales como embriones, polen, semillas, endospermas, recubrimiento de semilla, hojas, flores, órganos/estructuras florales (por ejemplo, brácteas, sépalos, pétalos, estambres, carpelos, anteras y óvulos) ramificaciones, frutos, núcleos, mazorcas, elotes, farfollas, tallos, tubérculos, raíz, puntas de raíz, anteras, tejido de plantas (por ejemplo tejido vascular, tejido de tierra y los similares) y células (por ejemplo células de protección, embriones, trichomas y los similares) y progenie de las mismas. El grano se propone para dar a entender la semilla madura producida por los cultivadores comerciales para propósitos diferentes al crecimiento o reproducción de las especies. La progenie, variantes y mutantes de las plantas regeneradas también se incluyen dentro del alcance de las modalidades, con la condición de que estas partes comprendan en los polinucleótidos introducidos. Las clases de plantas que pueden ser utilizadas en el método de las modalidades es generalmente tan amplia como la clase de plantas superiores o inferiores disponibles para las técnicas de transformación, incluyendo angiospermas (plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas) , gimnospermas, heléchos y algas multicelulares. Esto incluye plantas de una variedad de niveles ploides, incluyendo aneuploides, poliploides, diploides, haploides y hemicigotas . Los métodos de las modalidades se pueden utilizar para inducir la resistencia fungal en, o proteger del ataque de patógeno fungal a cualquier especie de planta, incluyendo, pero no limitado a monocotiledóneas y dicotiledóneas. Ejemplos de plantas de interés incluyen, pero no están limitadas a, maiz (Zea mays) , Brassica sp. (por ejemplo, B. napus, B. rapa, B. júncea) , particularmente aquellas especies de Brassica útiles como fuente de aceite de semilla, alfalfa (Medicago sativa), arroz {Oryza sativa), centeno (Sécale cereale,) sorgo {Sorghum bicolor, Sorghum vulgare) , mijo (por ejemplo, mijo perlado [Pennisetum glaucum) , mijo proso {Panicum miliaceum) , mijo de cola de zorra (Setaria itálica) , mijo extendido (Eleusine coracana) ) , girasol (Helianthus annuus) , cártamo (Carthamus tinctorius) , trigo {Triticum aestivum) , soya (Glycine max) , tabaco (Nicotiana tabacu ) , papa {Solanum tuberosum) , cacahuates {Arachis hipogaea) , algodón (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum) , camote {Ipomoea batatus) , casava {Manihot esculenta) , café {Coffea spp.)r coco (Cocos nucífera) , pina (Ananas comosus) , árboles cítricos (Cítrus spp. ) , cacao (Theobroma cacaco) , te (Camellia sinensis) , plátano (Musa spp.), aguacate (Persea americana) , higo (Ficus casica) , guayaba (Psidium guajava) , mango (Mangifera indica) , olivo (Olea europaea) , papaya (Carica papaya), anacardo (Anacardium occidentale) , macadamia (Macadamia integrifolia) , almendra (Prunus amygdalus) , betabeles (Beta vulgaris) , caña de azúcar (Saccharum spp.), avenas, cebada, vegetales, plantas ornamentales y coniferas. Los vegetales incluyen tomates (Lycopersicon lycopersicon) , lechuga (por ejemplo, Lactuca sativa) , habichuelas verdes (Phaseolus vulgaris) , habas (Phaseolus limensis) , guisantes (Lathyrus spp.), y miembros del género Cucumis tal como pepino (C. sativus) , cantalupo (C. cantalupensis) , y melón (C. meló) . Las plantas ornamentales incluyen azalea (Rhododendron spp.), hidrángea (Macrophylia hydrangea) , hibisco (Hibiscus rosasanensis) r rosas (Rosa spp.), tulipanes (Tulipa spp.), narcisos (Narcissus spp.), petunias (Petunia hybrida) , clavel (Dianthus caryophyllus) , pastora roja (Euphorbia pulcherrima) , y crisantemo.

Las coniferas que pueden ser empleadas en la práctica de las modalidades incluyen, por ejemplo, pinos tal como el pino del incienso {Pinus taeda) , pino de tala (Pinus elliotii) , pino ponderosa (Pinus ponderosa) , pino lodgepole {Pinus contorta) , y pino Monterrey (Pinus radiata) ; abeto de Douglas (Pseudotsuga menziesil) ; pinabete del occidente (Tsuga canadensis) ; abeto Sitka (Picea glauca); madera roja (Sequoia sempervirens) ; abetos típicos tales como abeto plateado (Abies amabilis) y abeto de bálsamo (Abies balsamea) ; y cedros tales como cedro rojo del occidente (Thuja plicata) y cedro amarillo de Alaska (Chamaecyparis nootkatensis) . En modalidades específicas, las plantas de las modalidades son plantas de cultivo (por ejemplo, maíz, alfalfa, girasol, Brassica, soya, algodón, cártamo, cacahuate, sorgo, trigo, mijo, tabaco, etc.)- En otras modalidades, las plantas de maíz y de soya son óptimas, y en todavía otras modalidades las plantas de maíz son óptimas. Otras plantas de interés incluyen plantas de grano que proporcionan semillas de interés, plantas de semilla de aceite y plantas leguminosas. Las semillas de interés incluyen semillas de grano, tales como maíz, trigo, cebada, arroz, sorgo, centeno, etc. Las plantas de semilla de aceite incluyen algodón, soya, cártamo, girasol, Brassica, maíz, alfalfa, palma, coco, etc. Las plantas leguminosas incluyen frijoles y guisantes. Los frijoles incluyen guar, algarroba, fenegreco, soya, frijoles de jardín, caupí, mungo, haba, fava bean, lentejas, garbanzo, etc. Las composiciones antifungales también están abarcadas por la presente invención. Las composiciones antifungales pueden comprender polipéptidos antifungales o microorganismos transformados que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido antifungal . Las composiciones antifungales de la invención se pueden aplicar al medio ambiente de un patógeno fungal de planta, como es descrito en la presente enseguida, para de esta manera proteger una planta del ataque de patógeno fungal. Además, como una composición antifungal se puede formular con un portador aceptable, esto es,' por ejemplo, una suspensión, una solución, una emulsión, un polvo para espolvorear, un gránulo dispersable, un polvo humectable y un concentrado emulsificable, un aerosol, un gránulo impregnado, un adyuvante, una pasta recubrible y también encapsulaciones en, por ejemplo, sustancias poliméricas. Un gen que codifica un polipéptido antifungal de las modalidades puede ser introducido en cualquier hospedero microbiano adecuado de acuerdo con los métodos estándares en la técnica. Por ejemplo, los hospederos de microorganismos que son conocidos que ocupan la "fitósféra" (filoplano, filósfera, rizósfera y/o rizoplana) de uno o más cultivos de interés pueden ser seleccionados. Estos microorganismos se seleccionan para ser capaces de competir exitosamente en el medio ambiente particular con los microorganismos de tipo silvestre, y para proporcionar mantenimiento y expresión estables del gen que expresa la proteina antifungal. Tales microorganismos incluyen bacterias, algas y hongos. De particular interés son los microorganismos tales como bacterias, por ejemplo, Pseudomonasr Erwinia r Serratia r Klebsiella , Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, y Alcaligenes, hongo, particularmente levadura, por ejemplo, Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula , y Aureobasidium . De interés particular son tales especies bacterianas de fitósfera como Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobactería , Rhodopseudomonas spheroidesr Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti , Alcaligenes entrophus, Clavibacter xyli y Azotobacter vinlandir y especies de levadura de fitósfera tales como Rhodotorula rubra, R-. glutinisr R. marina, R. aurantiaca , Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii , Saccharomyces rosei, S. pretoriensisr S. cerevisiae, Sporobolomyces rosues, S. Odorus, Kluyveromyces veronae y Aureobasidium pollulans. De particular interés son los microorganismos pigmentados. Las procariotas ilustrativas, tanto gram negativas y gram positivas, incluyen Enterobacteriaceae, tal como Escherichia , Erwinia, Shigella , Salmonella , y Proteus; Bacillaceae; Rhizobiceae, tal como Rhizobium; Spirillaceae, tal como photobacterium, Zymomonas, Serratia , Aeromonas, Vibrio, Desulfovibrio, Spirillu ; Lactobacillaceae; Pseudomonadaceae, tal como Pseudomonas y Acetobacter; Azotobacteraceae y Nitrobacteraceae . Entre las eucariotas están los hongos, tales como Phycomycetes y Ascomycetes, que incluye levadura, tales como Saccharomyces y Schizosaccharomyces; y levadura de Basidiomycetes, tales como Rhodotorula, Aureobasidiu , Sporobolomyees y los similares. Los organismos hospederos microbianos de interés particular incluyen levadura, tales como Rhodotorula spp. , Aureobasidium spp., Saccharomyces spp., y Sporobolomyees spp. , organismos filoplanos tales como Pseudomonas spp. , Erwinia spp. , y Flavobacterium spp. , y otros organismos de tal clase incluyendo Pseudomonas aeruginosa , Pseudomonas fluorescens, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus thuringiensis, Escherichia coli, Bacillus subtilis, y los similares . Los genes que codifican la proteínas antifungales de las modalidades se pueden introducir en microorganismos que se multiplican en plantas (epífitos) para suministrar proteínas antifungales a patógenos fúngales objetivos potenciales. Los epífitos, por ejemplo, pueden ser bacterias gram positivas o gram negativas. Las bacterias de colonización de raíz, por ejemplo, se pueden aislar de la planta de interés por métodos conocidos en la técnica. Específicamente, una cepa de Bacillus cereus que coloniza la, raíz se puede aislar de las raíces de una planta (ver, por ejemplo, Haldelsman y colaboradores (1991) Appl . Environ. Microbiol. 56..713-718 ) . Los genes que 'codifican los polipéptidos antifungales de las modalidades se pueden introducir en un Bacillus cereus de colonización de raíz mediante métodos estándares conocidos en la técnica. Los genes que codifican proteínas antifungales pueden ser introducidos, por ejemplo, en el Bacillus de colonización de raíz por medio de electrotransformación . Específicamente, los genes que codifican las proteínas pesticidas se pueden clonar en un vector de lanzadera, por ejemplo, pHT3101 (Lerecius y colaboradores (1989) FEMS Microbiol. Letts . 60:211-218). El vector de lanzadera pHT3101 que contiene la secuencia de codificación para el gen de proteína pesticida particular puede ser, por ejemplo, transformado en el Bacillus de colonización de raíz por medio de electroporación (Lerecius y colaboradores (1989) FEMS Microbiol. Letts. 60:211-218). Se proporcionan métodos para proteger una planta de un patógeno fungal que comprende aplicar una cantidad efectiva de una proteína o composición antifungal de la invención al medio ambiente del patógeno fungal. "Cantidad efectiva" se propone para dar a entender una cantidad de una proteína o composición suficiente para controlar un patógeno. Las proteínas antifungales y composiciones se pueden aplicar al medio ambiente del patógeno por métodos conocidos para aquellos de habilidad ordinaria en la técnica.. Las composiciones antifungales de la invención se pueden obtener mediante la adición de un agente activo en la superficie, un portador inerte, un conservador, un humectante, un estimulante de alimentación, un atrayente, un agente encapsulante, un aglutinante, un emulsificante, un tinte, un protector de UV, una solución reguladora, un agente de flujo o fertilizante, donadores de micronutrientes u otras preparaciones que influyen en el crecimiento de la planta. Uno o más agroquímicos que incluyen pero no limitados a, herbicidas, . insecticidas, funguicidas, bactericidas, nematicidas, molusquicidas , acaricidas, reguladores del crecimiento de plantas, auxiliares de cosecha y fertilizantes, se pueden combinar con portadores, surfactantes o adyuvantes usualmente empleados en la técnica de formulación u otros componentes para facilitar el manejo del producto y la aplicación para patógenos objetivos particulares. Los portadores y adyuvantes adecuados pueden ser sólidos o líquidos y corresponden a las sustancias ordinariamente empleadas en la tecnología de formulación, por ejemplo, sustancias minerales, naturales o regeneradas, solventes, dispersantes, agentes humectantes, pegaj osificantes , aglutinantes o fertilizantes. Los ingredientes activos de la presente invención normalmente se aplican en la forma de composiciones y se pueden aplicar al área de cultivo, planta o semilla a ser tratada. Por ejemplo, las composiciones de la presente invención se, pueden aplicar al grano en la preparación o durante el almacenamiento en un almacén o silo de granos, etc. Las composiciones de. la presente invención se pueden aplicar simultáneamente o en sucesión con otros compuestos. Los métodos para aplicar un ingrediente activo de la presente invención en una composición agroquimica de la presente invención que contiene por lo menos una de las proteínas antifungales de la presente invención incluyen, pero no están limitados a, la aplicación foliar, recubrimiento de semilla y la aplicación a la tierra. El número de aplicaciones y la proporción de aplicación dependen de la intensidad de ingestación por el patógeno fungal correspondiente. Los agentes activos en la superficie adecuados incluyen, pero no están limitados a, compuestos aniónicos tal como un carboxilato de, por ejemplo, un metal; carboxilato de un ácido graso de cadena larga; un N-acilsarcosinato; mono o di-ésteres de ácido fosfórico con etoxilatos de alcohol graso o sales de tales ásteres; sulfato de alcohol graso tales como dodecil sulfato de sodio, octadecil sulfato de sodio o cetil sulfato de sodio; sulfatos de alcohol graso etoxilados ; sulfatos de alquilfenol etoxilados; sulfonatos de lignina; sulfonatos de petróleo; sulfonatos de alquil arilo tales como sulfonatos de alquil-benceno o sulfonatos de alquilnaftaleno inferior, por ejemplo, sulfonato de butil-naftaleno; sales de condensado de naftaleno-formaldehídos sulfonados; sales de condensados de fenol-formaldehido sulfonados; sulfonatos más complejos tales como los sulfonatos de amida, por ejemplo, el producto de condensación sulfonado de ácido oleico y N-metil taurina; o los sulfosuc.cinatos de dialquilo, por ejemplo, el sulfonato de sodio o succinato de dioctilo. Agentes no iónicos incluyen productos de condensación de ésteres' de ácido graso, alcoholes grasos, amidas de ácido graso o fenoles sustituidos con alquilo graso o alquenilo con óxido ¦ de etileno, ésteres grasos de éteres de alcohol polihidrico, por ejemplo, ésteres de ácido graso de sorbitán, productos de condensación de tales ésteres con óxido de etileno, por ejemplo ésteres de ácido graso de polioxietilen sorbitán, copolimeros de bloque de óxido de etileno y óxido de propileno, glicoles acetilénicos tales como 2,4,7,9- tetraetil-5-decir-4 , 7-diol, o glicoles acetilénicos etoxilados. Ejemplos de un agente activo en la superficie catiónica incluyen, por ejemplo, una mono-, di- o poliamina alifática tal como un acetato, naftenato u oleato; o amina que contiene oxígeno tal como un óxido de amina de polioxietilen alquilamina; amina enlazada a amida preparada mediante la condensación de un ácido carboxílico con una di- o poliamina; o una sal de amonio cuaternaria. Ejemplos de materiales inertes incluyen, pero no están limitados a, minerales inorgánicos tales como caolín, filosilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos, o materiales botánicos tal como corcho, mazorcas de maíz en polvo, vainas de cacahuate, vainas de arroz y cáscaras de nuez. Las composiciones antifungales de la presente invención pueden estar en una forma adecuada para la aplicación directa como un concentrado de composición primaria que requiere dilución con una cantidad adecuada de agua u otro diluyente antes de la aplicación. La concentración del polipéptido antifungal variará dependiendo de la naturaleza de la formulación particular, específicamente, se hizo un concentrado o va a ser utilizada directamente. La composición contiene 1 a 98% de un portador inerte sólido o líquido, y de 0 a 50%, óptimamente 0.1 a 50% de un surfactante. Estas composiciones serán administradas en la proporción etiquetada para el producto comercial, óptimamente de manera aproximada 0.01 lb-5.0 Ib por acre cuando está en forma seca y en aproximadamente 0.01 pts.-lO pts . por acre cuando está en forma líquida.

En una modalidad adicional, las composiciones, asi como los microorganismos transformados y las proteínas antifungales, de la invención se pueden tratar antes de la formulación para prolongar la actividad antifungal cuando se aplica al medio ambiente de un patógeno objetivo mientras que el pretratamiento .no sea perjudicial a la actividad. Tal tratamiento puede ser por medios químicos y/o físicos mientras que el tratamiento no afecte perjudicialmente las propiedades de la(s) composición (es ) . Ejemplos de reactivos químicos incluyen, pero no están limitados a, agentes de halogenación; aldehidos tai como formaldehído y glutaraldehído; anti-infecciosos tal como cloruro de zefirán; alcoholes, tal como isopropanol y etanol; y fijadores histológicos, tal como el fijador de Bouin y el fijador de Helly (ver, por ejemplo, Humason (1967) Animal Tissue Techniques (W.H. Freeman and Co.). Las composiciones antifungales de la invención se pueden aplicar al medio ambiente de un patógeno de planta mediante, por ejemplo, rociado, atomización, espolvoreamiento, dispersión, recubrimiento o vaciado, la introducción dentro o sobre la tierra, la introducción en el agua de irrigación, mediante el tratamiento de semilla o la aplicación general o el espolvoreamiento en el momento cuando el patógeno ha comenzado a aparecer o antes de la aparición de los patógenos como una medida protectora. Por ejemplo, la proteina antifungal y/o un microorganismo transformado de la invención se puede mezclar con grano para proteger al grano durante el almacenamiento. Generalmente es importante obtener buen control de patógenos en las etapas tempranas del crecimiento de la. planta, ya que este es el tiempo cuando la planta puede ser más severamente dañada. Las composiciones de la invención convenientemente pueden contener un insecticida si esto se cree necesario. La composición se puede aplicar directamente a la tierra, en el momento de la plantación, en forma granular de una composición de un portador y células muertas de una cepa de Bacillus o el microorganismo transformado de la invención. Otra modalidad es una forma granular de una composición que. comprende un agroquimico tal como por ejemplo, un herbicida, un insecticida, un fertilizante, un portador inerte y células muertas de una cepa de Bacillus o microorganismo transformado de la invención. Las composiciones de la invención encuentran uso en la protección de plantas, semillas y productos de plantas en una variedad de maneras. Por ejemplo, las composiciones se pueden utilizar en un método que . involucra colocar una cantidad efectiva de una composición antifungal en el medio ambiente del patógeno mediante un procedimiento seleccionado del grupo que consiste de rociado, espolvoreamiento, dispersión o recubrimiento de semilla.

Antes de que el material de propagación de plantas {fruto, tubérculo, bulbo, tallo bulboso, granos, semillas) , pero especialmente semilla, se ha vendido como un producto comercial, este usualmente se trata con un recubrimiento protector que comprende herbicidas, insecticidas, fungicidas, bactericidas, nematicidas, molusquicidas o mezclas de varias de estas preparaciones, si es deseado junto con portadores adicionales, surfactantes o adyuvantes promotores de aplicación usualmente empleados en la técnica de formulación para proporcionar protección contra el daño causado por patógenos fúngales. Con el fin de tratar la semilla, el recubrimiento protector puede ser aplicado a · la semilla ya sea al impregnar los tubérculos o granos con una formulación liquida o al recubrirlos con una formulación húmeda o seca combinada. Además, en casos especiales, otros métodos de aplicación en una planta son posibles, por ejemplo, el tratamiento dirigido en los brotes o el fruto. La semilla de planta de la invención que comprende una molécula de DNA que comprende una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido antifungal de la invención se puede tratar con un recubrimiento protector de semilla que comprende un compuesto de tratamiento de semilla, tal como por ejemplo, captan, carboxin, tirana, metalaxilo, pirimifos-metilo y otras que son comúnmente utilizadas en el tratamiento de semilla. Alternativamente, una semilla de la invención comprende un recubrimiento protector de semilla que comprende una composición antifungal de la invención que se utiliza sólo o en combinación con uno de los recubrimientos protectores de semilla usualmente utilizados en el tratamiento de semilla. Los polipéptidos antifungales de la invención se pueden utilizar para cualquier aplicación incluyendo el recubrimiento de superficies a microbios objetivo. De esta manera, los microbios objetivo incluyen patógenos o microorganismos de humanos. Las superficies que podrían ser recubiertas con los polipéptidos antifungales de la invención incluyen alfombras e instalaciones médicas estériles. Los polipéptidos enlazados a polímeros de la invención se pueden utilizar para recubrir superficies. Los métodos para incorporar composiciones con propiedades antimicrobianas en polímeros son conocidos en la técnica. Ver la patente norteamericana No. 5,847,047, incorporada en la presente por referencia. Los métodos de las modalidades pueden ser efectivos contra una variedad de patógenos f ngales de plantas, tales como, pero no limitados a Colletotríchum graminocola , Diplodía maydís, Verticíllium dahliae, Fusarium graminearum, Fusarium oxysporum y Fusarium verticillíoídes . Patógenos específicos para los cultivos mayores incluyen: Soyas : Phytophthora megasperma fsp. glycinea r Macrophomina phaseolina , Rhízoctonia soiani, Sclerotinla sclerotiorum, Fusarium oxysporum, Dlaporthe phaseolorum var. sojae (Phomopsis sojae), Diaporthe phaseolorum var . caulivora, Sclerotíum rolfsii, Cercospora kikuchii , Cercospora sojina, Peronospora anshuríca , Colletotríchum dematium (Colletotrichum truncatum) , Corynespora cassiicola, Septoria glycines, Phyllosticta sojicola , Alternaría alternata , Pseudomonas syringae p .v . gíycínea, Xanthomonas campestris p.v. phaseoli, Mícrosphaera diffusa, Fusarium semitectum, Phíalophora gregata , Glomerella glycines, Phakopsora pachyrhizi, Pythíu aphanidermatum, Pythium ultimumr Pythium debaryanumr Fusarium soiani; Cañóla : Albugo Candida, Alternaría brassicaer eptosphaería maculans, Rhízoctonia soiani, Sclerotinia sclerotiorum, Mycosphaerella brassicicola , Pythium ulti um, Peronospora parasítica , Fusarium roseum, Alternaría alternata; Alfalfa : Clavibacter michíganese subsp. ínsídiosum, Pythium ultimum, Pythium írregulare, Pythium splendens, Pythium debaryanum, Pythium aphanidermatum, ¦ Phytophthora megasperma, Peronospora trifoliorum, Phoma medicaginis var . medicaginís, Cercospora medicaginis, Pseudopeziza medicaginis, Leptotrochila medicaginis, Fusarium oxysporum, Verticiilium albo-atrum, Xanthomonas campestris p.v. alfalfae, Aphanomyces euteiches, Stemphylíum herbarum, Stemphylíum alfalfae, Colletotrichum trifolíí, Leptosphaerulína briosiana , Uromyces striatus, Sclerotinia trifollorum, Stagonospora meliloti , ' Stemphylium botryos m, Leptotrichila medicaginis; Trigo : Pseudomonas syríngae p.v. atrofaciens , Urocystis agropyri, Xanthomonas campestris p.v. translucens, Pseudomonas syringae p.v. syringae, Alternaría alternata, Cladosporium herbarum, Fusarium graminearu , Fusarium avenaceum, Fusarium culmorum, Ustilago tritici, Ascochyta tritici, Cephalosporium gramineum, Collotetrichum graminicola , Erysiphe graminis f.sp. tritici, Puccinia graminis f.sp. tritici, Puccinia recóndita f.sp. tritici, Puccinia striiformis, Pyrenophora tritici-repentis , Septoria nodorum, Septoria tritici, Septoria avenae, Pseudocercosporella herpotrichoides, Rhizoctonia solani, Rhizoctonia cereaíis , Gaeumannomyces graminis var. tritici, Pythium apha iderma tum, Pythium arrhenomanes, Pythium ultimum, Bipolaris sorokiniana , Clavíceps purpurea , Tilletia tritici, Tilletia laevis, Ustilago tritici, Tilletia indica, Rhizoctonia solani, Pythium arrhenomannes, Pythium gramicola , Pythium aphanidermatum, Girasol : Plasmopora halstedii, Sclerotinia sclerotiorum, Septoria helíanthi , Phomopsis helianthi , Alternaría helianthi , Alternarla zínniae, Botrytis cinérea, Phoma macdonaldií , Macrophomina phaseolina , Erysiph cichoracearum, Rhizopus oryzae, Rhizopus arrhízus, Rhizopus stolonifer, Puccinia helianthi , Verticíllium dahlíae, Erwinia carotovorum pv. carotovora , Cephaiosporium acremonium, Phytophthora cryptogea , Albugo tragopogonís; Maíz : Colletotrichum graminicola , Fusarlum verticillioid.es var. subglutinans , Erwinia stewartii , F. verticillioides, Gibberella zeae (Fusaríum graminearum) , Stenocarpella maydi (Diplodia maydis) , Pythíum irregulares Pythium debaryanum, Pythium graminicola , Pythium splendens, Pythíum ultimum, Pythium aphanidermatum, Aspergillus flavus, Bipolaris maydis 0, T (Cochliobolus heterostrophus) F Helmínthosporium carbonum 1, II y III (Cochliobolus carbonum), Exserohilum turcicum I, II y III, Helminthosporium pedicellatum, Physoderma maydis, Phyliosticta maydis, Kabatiella maydis, Cercospora sorghí, Ustilago maydis, Puccinia sorghi, Puccinia polysora , Macrophomina phaseolina , Peniciliium oxalicum, Nigrospora oryzae, Cladosporium herbarum, Curvularia lunata, Curvularia inaequalis, Curvularia pallescens, Clavibacter michiganense subsp. nebraskense, Trichoderma viride, Ciaviceps sorghi, Pseudomonas avenae, Erwinia chrysanthemi pv. zea, Erwinia carotovora , Corn stunt . spiroplasma , Diplodia macrospora , Seleroph thora macrospora , Peronosclerospora sorghi, Peronosclerospora philippinensis, Peronosclerospora maydis, Peronosclerospora sacchari , Sphacelotheca reilíana , Physopella zeae, Cephalosporíum maydis, Cephalosporíum acremonium; Sorgo : Exserohilum turcicum, C. sublineolum, Cercospora sorghi, Gloeocercospora sorghí, Ascochyta sorghína , Pseudomonas syringae p.v. syringae, Xanthomonas ca pestris p.v. holcicola, Pseudomonas andropogonxsr Puccinia purpurea , Macrophomína phaseolína , Perconia circinata, Fusaríum verticillioides, Alternaría aíternata , Bipolaris sorghicola , Helminthosporium sorghicola , Curvularia lunata, Phoma insidiosa , Pseudomonas avenae (Pseudomonas alboprecipitans) , Ramulispora sorghi , Ramulispora sorghicola, Phyllachara sacchari, Sporisorium reilianum (Sphacelotheca reiliana) , Sphacelotheca cruenta, Sporisorium sorghi, Claviceps sorghi, Rhizoctonia solani, Acremonium stríctum, Sclerophthona macrospora , Peronosclerospora sorghi, Peronosclerospora phiiippinensis, Sclerospora graminicoia, Fusarium gramineaxum, Fusaríum oxysporum, Pythium arrhenomanes, Pythium graminicoia, etc. El artículo "un" y "una" se utiliza en la presente para referirse a uno o más de uno (es decir, por lo menos uno) del objeto gramatical del artículo. A manera de ejemplo, "un elemento" significa uno o más elementos. Las unidades, prefijos y símbolos se pueden denotar en su forma aceptada de SI. A menos que se indique de otra manera, la secuencia 'de ácido nucleico se escriben de izquierda a derecha en la orientación 5' a 3r ; las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en la orientación de amino a carboxi, respectivamente. Los intervalos numéricos son inclusivos de los números que definen el intervalo. Los aminoácidos pueden ser referidos en la presente por sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o por los símbolos de una letra recomendados por la IÜPAC-IUB Biochemical Nomenchature Commission. Los nucleótidos, del mismo modo, pueden ser referidos por sus códigos de una sola letra comúnmente aceptado. Los términos definidos en lo anterior son más completamente definidos por referencia en la especificación como un conjunto. Se entiende que los ejemplos y modalidades descritas en la presente son para propósitos ilustrativos solamente y que varias modificaciones o cambios en vista de los mismos serán sugeridos para las personas expertas en la técnica y van a ser incluidos dentro del espíritu y punto de vista de la aplicación y el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas en la presente son incorporadas en la presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos . EXPERIMENTAL Ejemplo 1: Bioensayos antifungales Un número de polipéptidos se expresaron recombinantemente en E. coli y luego se clasificaron en un bioensayo antifungal. La expresión de los polipéptidos biológicamente funcionales involucró la producción de una proteina de fusión que incluyó una proteína de enlace de maltosa (MBP) y un polipéptido del interés y subsecuentemente la segmentación de la proteína de fusión en una secuencia de reconocimiento de proteasa para liberar el péptido de interés. El DNA que codifica el polipéptido de interés se fusionó al C-terminal del gen MelE en el vector de expresión de E. coli pMAL (New England Biolabs; ver, Guan y colaboradores, Gene 67:21-30 (1987); y Maina y colaboradores, Gene 74:365-73 (1988)). Las secuencias que codifican el sitio de segmentación de las proteasas Factor Xa o Genenase I se incorporaron entre ios genes de BP y el polipéptido de interés. Una marca de histidina también se adicionó al N-terminal de MBP. El vector de plásmido construido se transformó en células de E. coli XL-1 Azul y los transformantes se cultivaron en el medio 2YT que contiene 50 g/ml de carbenicilina a una densidad de células de O.D.eoo = 0.6-0.9. La expresión de la proteína de fusión se indujo mediante la adición de IPTG en el cultivo a una concentración final de i mM. Las células se cultivaron durante '4-16 horas a la saturación antes de la recolección. Las células se recolectaron mediante centrifugación y luego se lisaron con el reactivo B-PER (Pierce Chemicals, Rockford, IL) para obtener la fracción de proteínas solubles. La proteína de fusión se purificó del sobrenadante de lisado de células utilizando la marca de histidina al incubar el lisado de células con resinas de agarosa de Ni-NTA durante 20 minutos a 1 hora. Las resinas se lavaron con solución reguladora Tris para remover todas las proteínas no enlazadas. Dos-mercaptoetanol (10 mM) se incluyó en la lisis y soluciones reguladoras de lavado para permitir el replegamiento parcial de las proteínas. La elusión de la proteína de fusión enlazada se realizó con solución reguladora que contiene histidina 20-40 mM. Para liberar el polipéptido de interés, la proteína de fusión purificada se incubó con factor XA o Genease I (RT, 8-24 h) . La muestra de proteína segmentada luego se utilizó en ensayos de actividad antifungal. Todas las cepas fúngales se cultivaron y se mantuvieron en placas de agar de dextrosa de papa (PDA) en una incubadora a 30 °C. Estas placas se mantuvieron en contenedores secundarios más pequeños (por cepa fungal) , con toallas de papel húmedas para mantener alta humedad. Las esporas se recolectaron en un cuarto de concentración del caldo de dextrosa de papa (PDB) después de aproximadamente 2 semanas de crecimiento, se contaron utilizando un hemacitómetro y subsecuentemente se almacenaron en alícuotas pequeñas a -80 °C. Las esporas congeladas se diluyeron a la concentración de trabajo (determinada empíricamente para cada cepa fungal) , en un cuarto de concentración de PDB y 50 µ? (por cavidad) se adicionaron a placas de ensayo de 96 cavidades de fondo plano, estériles. Las placas de ensayo se incubaron en las cajas húmedas a temperatura ambiente durante 5-7 horas para permitir que germinen las esporas. Las diluciones en serie de las muestras de proteína de fusión segmentada con proteasa, purificada luego se adicionaron a las placas de ensayo, en volúmenes de 50 pL, para un volumen de ensayo final de 100 pL por cavidad. Las placas de ensayo se dejaron incubar durante la noche, en una caja húmeda, a 30 °C. La actividad antifungal se registró después de 18 a 48 horas, dependiendo de la cepa de hongo. La Tabla 1 ilustra aquellos polipéptidos identificados que tienen actividad contra por lo menos uno de los patógenos fúngales listados. Tabla 1 Clasificación antifungal primaria (registro: 0=sin efecto; l=inhibición de crecimiento parcial; 2=fuerte inhibición) : Dfn37, Dfn49 y Dfn56 además se caracterizaron en un ensayo de dosis-respuesta. Ver, Tabla 2. Tabla 2 Caracterización de Hit. IC5o's (en µ/mL) determinadas del ensayo de dosis-respuesta utilizando polipéptidos purificados y cuantificados de la invención: notable que Dfn37, Dfn49 y Dfn56 cada uno tiene una actividad antifungal potente contra una amplia gama de patógenos fúngales. Como se discutió anteriormente en esta descripción, debido al hecho de que las enfermedades de plantas pueden, ser causadas por un complejo de patógenos, la resistencia de amplio espectro es requerida para efectivamente mediar el control de la enfermedad. Ejemplo 2: Transformación y Regeneración de Plantas de Maiz Transgénicas Embriones de maiz inmaduros de plantas donadoras de invernadero se bombardean con un plásmido que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido antifungal expuesto en la SEQ ID NO: 1 operablemente enlazado a un promotor que induce la expresión en una célula de planta de maiz y un marcador seleccionadle (por ejemplo, el gen marcador seleccionable PAT (Wohlleben y colaboradores, (1988) Gene 70:25-37), que confiere resistencia al herbicida Bialafos) . Alternativamente, el gen marcador seleccionable se proporciona en un plásmido separado. La transformación se realiza como sigue. Las recetas de los medios se muestran enseguida. Preparación del Tejido Objetivo Las mazorcas se despinochan y se esterilizan en la superficie en blanqueador Clorox al 30% más 0.5% de Micro detergente durante 20 minutos, y se enjuagan dos veces con agua estéril. Los embriones inmaduros se extirpan y se colocan con el lado del eje del embrión hacia abajo (lado del escutelo hacia arriba) , 25 embriones por placa, en el medio 560Y durante 4 horas y luego se alinean dentro de la zona objetivo de 2.5 cm en la preparación para el bombardeo.

Preparación de DMA Se' hace un vector de plásmido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido antifungal expuesto en la SEQ ID NO: 1 operablemente enlazado a un promotor que induce expresión en una célula de maíz. Este DNA de plásmido más el DNñ de plásmido que contiene un marcador seleccionable {por ejemplo, PAT) se precipita sobre pelotillas de tungsteno de 1.1 prn (diámetro promedio) utilizando un procedimiento de precipitación de CaCl2 como sigue: 100 pL de partículas de tungsteno preparados en agua 10 pL (1 pg) de DNA en solución reguladora de Tris EDTA (1 pg de DNA total) 100 pL de CaCl22.5 M 10 pL de espermiclina 0.1 M Cada reactivo se adiciona secuencialmente a la suspensión de partículas de tungsteno, mientras que se mantiene en el aparato formador de vórtice de multitubos . La mezcla final se sónica brevemente y se deja incubar bajo formación de vórtice constante durante 10 minutos. Después del período de precipitación, los tubos se centrifugan brevemente, se remueve el líquido, se lavan con 500 mL de etanol al 100% y se centrifugan durante 30 segundos. Nuevamente el líquido se remueve, y 105 pL de etanol al 100% se adiciona a la pelotilla de partícula de tungsteno final.

Para el bombardeo con pistola de partículas, las partículas de tungsteno/DNA se sonican brevemente y 10 pL se mancha sobre el centro de cada macroportador y se dejan secar aproximadamente 2 minutos antes del bombardeo. Tratamiento con Pistola de Partículas Las placas de muestra se bombardean en el nivel #4 en la pistola de partículas #HE34-1 o #HE34-2. Todas las muestras reciben un solo disparo a 650 PSI, con un total de diez alícuotas tomada de cada tubo de partículas/DNA preparadas. Tratamiento Subsecuente Después del bombardeo, los embriones se conservan en el medio 650? durante 2 días, luego se transfieren al medio de selección de 560R que contiene 3 mg/L de Bialafos, y se subcultivan cada 2 semanas. Después de aproximadamente 10 semanas de selección, los clones de callos resistentes a la selección se transfieren al medio a 288J para iniciar la regeneración de. la planta. Después de la maduración del embrión somático (2-4 semanas) , los embriones somáticos bien desarrollados se transfieren al medio para la germinación y se transfieren al cuarto de cultivo alumbrado. Aproximadamente 7-10 días después, las plantitas en desarrollo se transfieren al medio libre de hormona 272V en tubos durante 7-10 días hasta que las plantitas son bien establecidas. Las plantas luego se transfieren a insertos en cajones semilleros (equivalente a una maceta de 2.5") que contiene tierra para maceta y se cultivan durante 1 semana en una cámara de crecimiento, subsecuentemente se cultivan 1-2 semanas adicionales en el invernadero, luego se transfieren a 600 macetas clásicas (1.6 galones) y se cultivan a la madurez. Las plantas se monitorean y se registran para la resistencia fungal. Medio de Bombardeo y de Cultivo El medio de bombardeo (560Y) comprende 4.0 g/L de sales básales N6 (SIGMA C-1416) , 1.0 mL/L de Mezcla de Vitamina de Eriksson (1000X SIGMA-1511) , 0.5 mg/1 de HCl de tiamina, 120.0 g/L de sacarosa, 1.0 mg/L de 2,4-D y 2.88 g/L de L-prolina (llevado al volumen con ?20 de D-I después del ajuste a pH 5.8 con KOH) .2.0 g/L de Gelrite (adicionado después de llevar al volumen con H20 D-I); y 8.5 mg/L de nitrato de plata (adicionado después de la esterilización del medio y el enfriamiento a temperatura ambiente) . El medio de selección (560R) comprende 4.0 g/L de sales básales N6 (S'IGMA C-1416), 1.0 mL/L de Mezcla de Vitamina de Eriksson (1000X SIGMA-1511), 0.5 mg/L de HCl de tiamina, 30.0 g/L de sacarosa y 2.0s mg/L de 2,4-D (llevado a volumen con H20 D-I después del ajuste a pH 5.8 con KOH); 3'.0 g/L de Gelrite (se adicionó después de llevar a volumen con H20 D-I); y 0.85 mg/L de nitrato de pata y 3.0 mg/L de bialafos (ambos adicionados después de la esterilización · del medio y el enfriamiento a temperatura ambiente) . El medio de regeneración de planta (288J) comprende 4.3 g/L de sales MS (GIBCO 11117-074), 5.0 mL/L de solución de extracto de vitamina MS (0.100 g de ácido nicotinico, 0.02 g/L de HCl de tiamina, 0.10 g/L de HCl de piridoxina y 0.40 g/L de glicina llevado a un volumen con H20 D-I purificado) (Murashige y Skoog (1962), Physiol. Plant. 15:473), 100 mg/L de mio-inositol, 0.5 mg/L de zeatin, 60 g/L de sacarosa y 1.0 mL/L de ácido abscisico 0.1 mM (llevado a volumen con H20 D-I purificada después de ajusfar al pH 5.6); 3.0 g/L de Gelrite (se adicionó después de llevar al volumen con el H20 D-I) ; y 1.0 mg/L de ácido indolacético y 3.0 mg/L de bialafos (adicionados después de la esterilización del medio y el enfriamiento a 60 °C) . El medio libre de hormona (272V) comprende 4.3 g/L de sales MS (GIBCO 11117-074), 5.0 mL/L de solución de extracto de vitaminas MS (0.100 g/L de ácido nicotinico, 0.02 g/L de HCl de tiamina, 0.10 g/L de HCl de piridoxina y 0.40 g/L de glicina llevado a volumen con H20 D-I purificada), 0.1 g/L de mio-inositol y 40.0 g/L de sacarosa (llevado a volumen con H20 D-I purificada después de ajusfar el pH a 5.6); y 6 g/L de bacto-agar (se adicionó después de llevar al volumen con H20 D-I purificado) , esterilizado y enfriado a 60 °C. Ejemplo 3: Transformación del Maíz Mediada por Agrobacterium y Regeneración de Planbas Transgénicas Para la transformación del maíz mediada por Agrobacterium con la construcción de polinucleótido que contiene la SEQ ID NO: 1, se emplea el método de Zhao (patente norteamericana No. 5,981,840 y la publicación de patente de PCT W098/32326; los contenidos de los cuales son incorporados en la presente por referencia) . Brevemente, los embriones inmaduros se aislan del maíz y los embriones se ponen en contacto con una suspensión de Agrobacterium, donde las bacterias son capaces de transferir la construcción de polinucleótido a por lo menos una célula de por lo menos uno de los embriones inmaduros (etapa 1:1a etapa de infección). En esta etapa los embriones inmaduros se sumergen en una suspensión de Agrobacterium para la iniciación de la inoculación. Los embriones de co-cultivan durante un tiempo con el Agrobacterium (etapa 2:1a etapa de co-cultivo) . Los embriones inmaduros se cultivan en medio sólido después de la etapa de infección. Después de este periodo de co-cultivo se realiza una etapa de "reposo" opcional. En esta etapa de reposo, los embriones se incuban en la presencia de por lo menos un antibiótico conocido que inhibe el crecimiento del Agrobacterium sin la adición de un agente selectivo para transformantes de plantas (etapa 3:1a etapa de reposo). Los embriones inmaduros se cultivan en el medio sólido con el antibiótico, pero sin un agente de selección, para la eliminación de Agrobacterium y para una fase de reposo para las células infectadas. Enseguida, los embriones inoculados se cultivan en el medio que contiene un agente selectivo y se recupera el callo transformado en el crecimiento (etapa 4 :-la etapa de selección) . Los embriones inmaduros se cultivan en un medio sólido con un agente selectivo que da por resultado el crecimiento selectivo de las células transformadas. El callo luego se regenera en plantas (etapa 5:1a etapa de regeneración) y los callos crecidos en el medio selectivo se cultivan sobre el medio sólido para regenerar las plantas. Ejemplo 4: Transformación de Cultivo de Embrión de Soya Somático y Regeneración de Plantas de Soya Las siguientes soluciones de extracto y medios se utilizan para la transformación y regeneración de plantas de soya. 'Soluciones de extracto Extracto 100 X Sulfato: 37.0 g MgS0 .7H20, 1.69 g MnS04.H20, 0.86 g ZnS04.7H20, 0.0025 g CuS04.5H20. Solución 100 X de Haluros : 30.0 g CaCl2.2H20, 0.083 g Kl, 0.0025 g CoCI2.6H20. Solución 100X de P,B, Mo: 18.5 g KH2P04, 0.62 g H3B03, 0.025 g Na2Mo04.2¾0 Solución 100X de EDTA: 3.724 g Na2EDTA, 2.784 g FeS04.7H20. Extracto de 2,4-D: 10 mg/mL. Extracto 1000X de Vitamina B5 : 10.0 g myo-inositol, 0.10 g de ácido nicotinico, 0.10 g de piridoxina HCl, 1 g de tiamina.

Medio (por Litro) SB196: 10 mi de cada una de las soluciones de extracto anteriores, 1 mL de extracto de vitamina B5, 0:463g de (NH4) 2S0 , 2.83 g KN03, 1 mL de extracto de 2,4- D, 1 g asparagina, 10 g sacarosa, pH 5.7. SB103: 1 pk. Mezcla de sales de Murashige & Skoog, 1 mL de extracto de vitamina B5, 750 mg de hexahidrato de MgCl2, 60 g de maltosa, 2 g de gelrite, pH 5.7. SB166: SB103 suplernentado con 5 g por litro de carbón vegetal activado. SB71-4: Sales B5 de Gamborg (Gibco-BRL catálogo No. 21153- 028), 1 mL de extracto de vitamina B5, 30 g de sacarosa, 5 g de agar TC, pH 5.7. Los cultivos de suspensión embriogénicos de soyas se mantienen en 35 mL de medio liquido (SB 196) en un agitador rotatorio (150 rpm) a 28 °C con luces fluorescentes que proporcionan' un ciclo de 16 horas de día/8 horas de noche. Los cultivos se subcultivan cada 2 semanas al inocular aproximadamente 35 mg de tejido en 35 mL de medio líquido fresco. Los cultivos de suspensión embriogénicos de soya se transforman mediante el método de bombardeo con pistola de partícula (ver Klein y colaboradores, (1987) Nature 327:70-73) utilizando un instrumento DuPont Biolistic PDS 1000/He. En los procedimientos de bombardeo con pistola de partículas es posible utilizar 1) DNA de plásmido completo purificado o, 2) fragmentos de DNA que contienen solamente el (los) cásete (s) de expresión de DNA recombinante de interés. Por cada ocho transformaciones de · bombardeo, 30 µ? de suspensión se prepara que contiene 1 a 90 picogramos (pg) de fragmento de DNA por par de base de fragmento de DNA. El plásmido o fragmento de DNA recombinante utilizado para expresar el gen antifungal está en un plásmido de DNA recombinante separado - o fragmento del gen marcador seleccionable . Tanto los plásmidos de DNA recombinantes o fragmentos se precipitan en partículas de oro como sigue. Los DNAs en suspensión se adicionan a 50 pL de una suspensión de partículas de oro de 0.6 pm de 20-60 mg/mL y luego se combinan con 50 pL de CaCl2 (2.5 M) y 20 pL de espermidina (0.1 M) . La mezcla se pulsa con vórtice 5 veces, se gira en una microcentrífuga durante 10 segundos. y el sobrenadante se remueve. Las partículas recubiertas con DNA luego se lava una vez con 150 pL de etanol al 100%, se pulsa con vórtice y se giran en una microcentrífuga nuevamente y se resuspenden en 85 pL de etanol anhidro. Cinco pL de las partículas de oro recubiertas de DNA luego se cargan en cada disco macropo.rtador . Aproximadamente 150 a 250 mg de cultivo de suspensión de dos semanas se coloca en una placa petri vacía de 60 mm X 15 mm y el líquido residual se remueve del tejido utilizando una pipeta. El tejido se coloca aproximadamente 3.5 pulgadas lejos de la criba de retención y cada placa de tejido se bombardea una vez. La presión de ruptura de la membrana se ajusta a 650 psi y la cámara se evacúa a -28 pulgadas de Hg. Dieciocho placas se bombardean y, después del. bombardeo, el tejido de cada placa se divide entre dos matraces, se colocan nuevamente en el medio liquido y se cultivan como es descrito en lo anterior. Siete dias después del bombardeo, el medio liquido se intercambia con medio SB196 fresco suplementado con 50 mg/mli de higromicina o 100 ng/mL de clorosulfurón, dependiendo del gen marcador seleccionable utilizado en la transformación. El medio selectivo se renueva cada semana o bisemanalmente . Siete semanas después del bombardeo, el tejido transformado verde se observa creciendo de las agrupaciones embriogénicas necróticas, no transformadas. El tejido verde aislado se remueve y se inocula en matraces individuales para generar nuevos cultivos de suspensión embriogénicos transformados, clonalmente propagados. Asi, cada nueva linea se trata como evento de transformación independiente. Estas suspensiones luego se pueden mantener como suspensiones de embriones agrupadas en una etapa de desarrollo inmadura a través del subcultivo o se pueden regenerar en plantas completas mediante la maduración y germinación de embriones somáticos individuales.

Las agrupaciones embriogénicas transformadas se remueven del cultivo liquido y se colocan en el medio agar sólido. (SB166) que no contiene hormonas o antibióticos por una semana. Los embriones se cultivan a 26°C con luces fluorescentes e incandescentes mezcladas en un programa de 16 horas de día: 8 horas de noche. Después de una semana, los cultivos luego se transfieren al medio SB103 y se mantiene en las mismas condiciones de crecimiento . durante 3 semanas adicionales. Antes de la transferencia del cultivo líquido al medio sólido, el tejido de las líneas seleccionadas se analiza mediante PCR o el análisis de Southern para la presencia del gen antifungal. Los embriones somáticos se . vuelven adecuados para la germinación después de 4 semanas y luego se remueven del medio de maduración y se secan en placas petri vaciadas durante 1 a 5 días. Los embriones secados luego se plantan en un medio SB71-4 donde se permiten germinar bajo las mismas condiciones de luz y germinación descritos en lo anterior. Los embriones germinados se transfieren a tierra estéril y se cultivan hasta la madurez. Todas las publicaciones y- solicitudes de patente mencionadas en la especificación son indicativas del nivel de aquellos expertos en la técnica a la cual esta invención pertenece. Todas las publicaciones y solicitudes de patentes son incorporadas en la presente por referencia al mismo grado como si cada publicación individual o solicitud de patente fuera específicamente e individualmente indicada que es incorporada por referencia. Aunque la invención anterior se ha descrito en algún detalle a manera de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad de entendimiento, será obvio que ciertos cambios y modificaciones se pueden practicar dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (46)

1. REIVINDICACIONES 1. Una planta transgénica, caracterizada porque tiene establemente incorporada en su genoma un polinucleótido que codifica un poiipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 95% idéntica a las SEQ ID NOs : 1, 2, 4, 5, 7 u 8, en donde la planta tiene resistencia de patógenos mejorada a por lo menos un hongo patogénico de planta.
2. 2. La planta de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la planta es una monocotiledónea .
3. 3. La planta de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la planta es una dicotiledónea.
4. 4. Semilla t ansformada de la planta de la reivindicación 1, caracterizada porque la semilla comprende la secuencia de aminoácidos.
5. 5. La planta de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el polinucleótido es operablemente enlazado a un promotor que induce la expresión en una célula de la planta, en donde el promotor es seleccionado del grupo que consiste de: a) un promotor constitutivo; b) un promotor especifico de tejido; c) un promotor especifico de raiz; d) un promotor inducible ; y e) un promotor inducible por patógeno .
6. 6. La planta de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el polipéptido comprende una secuencia de señal.
7. 7. La planta de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el polipéptido carece de una secuencia de señal.
8. 8. La planta de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la secuencia de señal es una secuencia de señal de secreción.
9. 9. La planta de conformidad con la reivindicación 6, .caracterizada porque la secuencia de señal es una secuencia de señal de organelo.
10. 10. La planta de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque la secuencia de señal es una secuencia de señal de-plástida.
11. 11. La planta de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos es seleccionada del grupo de secuencias que consisten de la secuencia expuesta en las SEQ ID NOs: 1, 2, 4, 5, 7 y 8.
12. 12. Un método para aumentar la resistencia de una planta a un patógeno fungal, el método caracterizado porque comprende : (a) transformar establemente una célula de planta con por lo menos un cásete de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos operablemente enlazada a un promotor que induce la expresión en una célula de la planta, en donde la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene por lo menos 95% de identidad de secuencia a las SEQ ID NOs : 1, 2, 4, 5, 7 u 8, y además en donde el polipéptido tiene actividad contra por lo menos un patógeno fungal de planta; y (b) regenerar una planta transformada de la célula de planta, en donde el nivel de resistencia al patógeno fungal en la planta se incrementa en comparación a la planta que no comprende el cásete de expresión.
13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el hongo es Alternaría brassicicola . 1 .
14. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el hongo es Fusarium verticillioid.es .
15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el hongo es Fusarium oxysporum.
16. 16. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el hongo es Verticillium dahliae.
17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el hongo es Botrytis cinérea.
18. 18.· El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el hongo es Colletrotrichum graminicola.
19. 19. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el hongo es Diplodia maydis .
20. 20. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el hongo es Fusarium graminearum.
21. 21. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido seleccionado del grupo que consiste de las secuencias de polipéptido expuestas en. las SEQ ID NOs: 1, 2, 4, 5, 7 y 8.
22. 22. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el promotor es seleccionado del grupo que consiste de: a) un promotor constitutivo; b) un promotor especifico de tejido; c) un promotor especifico de raíz; d) un promotor inducible; y e) un promotor inducible por patógeno.
23. 23. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el polipéptido comprende una secuencia de señal.
24. 24. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el polipéptido carece de una secuencia de señal.
25. 25. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la secuencia de señal es una secuencia de señal de secreción.
26. 26. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la secuencia de señal es una secuencia de señal de organelo.
27. 27. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la secuencia de señal es una secuencia de señal de plástida.
28. 28. Un método para aumentar la resistencia de una planta a un patógeno, el método caracterizado porque comprende : (a) transformar establemente una célula de planta con por lo menos un cásete de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos operablemente enlazada a un promotor que induce la expresión en una célula de la planta, en donde la secuencia de nucleótidos tiene por lo menos 95% de identidad de secuencia a las SEQ ID NOs : 3, 6 o 9, y además en donde la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad contra por lo menos un patógeno fungal de planta; y (b) regenerar una planta transformada de la célula de planta, en donde el nivel de resistencia al patógeno fungal en la planta se incrementa en comparación a la planta que no comprende el cásete de expresión.
29. 29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el promotor es seleccionado del grupo que consiste de: a) un promotor constitutivo; b) un promotor específico de tejido; c) un promotor específico de raíz; d) un promotor inducible; y e) un promotor inducible por patógeno.
30. 30. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el polipéptido comprende una secuencia de señal.
31. 31. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el polipéptido carece de una secuencia de señal.
32. 32. El método de conformidad con la .reivindicación 30, caracterizado porque la secuencia de señal es una secuencia de señal de secreción.
33. 33. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la secuencia de señal es una secuencia de señal de organelo.
34. 34. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la secuencia de señal es una secuencia de señal de plástida.
35. 35. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos es seleccionada del grupo que consiste de las secuencias de nucleótidos expuestas en las SEQ ID NOs : 3, 6 y 9.
36. 36. Una planta transgénica, caracterizada porque tiene establemente incorporada en su genoma una secuencia de polinucleótido por lo menos 95% idéntica a las SEQ ID NOs: 3, 6 o 9, en donde la secuencia de polinucleótido codifica un polipéptido con actividad contra patógenos f ngales de plantas, además en donde la planta tiene resistencia de patógeno fungal mejorada a por lo menos un hongo patogénico de planta.
37. 37. La planta de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque la planta es una monocotiledonea.
38. 38. La planta de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque la planta es una dicotiledónea.
39. 39. Semilla transformada de la planta de la reivindicación 36, caracterizada porque la semilla comprende la secuencia de polinucleótido.
40. 40. La planta de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque el polinucleótido es operablemente enlazado a un promotor que induce la expresión en una célula de la planta, en donde el promotor es seleccionado del grupo que consiste de: a) un promotor constitutivo; b) un promotor especifico de tejido; c) un promotor especifico de raiz; d) un promotor inducible; y e) un promotor inducible por patógeno.
41. 41. La planta de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque el polipéptido comprende una secuencia de señal.
42. 42. La planta de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque el polipéptido carece de una secuencia de señal.
43. 43. La planta de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque la secuencia de señal es una secuencia de señal de secreción.
44. 44. La planta de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque la secuencia de señal es una secuencia de señal de organelo.
45. 45. La planta de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque la secuencia de señal es una secuencia de señal de plástida.
46. 46. La planta de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque la secuencia de polinucleotido es seleccionada del grupo que consiste de las secuencias de polinucleotido expuestas en las SEQ ID NOs : 3, 6 y 9.