MXPA06014576A - Agonistas de lxr para promover homeostasis osea. - Google Patents

Agonistas de lxr para promover homeostasis osea.

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Peter Herwig Maria Tomme
Luc Van Rompaey
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Abstract

La presente invencion se relaciona con un metodo para promover osteogenesis al poner en contacto celulas progenitoras de osteoblastos con un agonista de LXR. Dicho metodo es util para el tratamiento o prevencion de un desequilibrio en la homeostasis osea en un sujeto utilizando composiciones que promueven la homeostasis osea que comprende una cantidad eficaz estimulante osteogenica de un agonista de LXR en mezcla con un portador farmaceuticamente aceptable. Un aspecto adicional es un metodo para producir tejido oseo in vitro al poner en contacto un agonista de LXR con una poblacion de celulas progenitoras de osteoblastos sobre un sustrato, durante un tiempo suficiente para estimular la generacion de una matriz de tejido oseo.

Description

AGONISTAS DE LXR PARA PROMOVER HOMEOSTASIS OSEA CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona con el campo del metabolismo óseo y en particular con métodos, tratamientos y composiciones útiles para la prevención y tratamiento de enfermedades asociadas con un desequilibrio o una alteración en la homeostasis ósea en humanos y otros animales. ANTECEDENES DE LA INVENCIÓN El hueso es un tejido dinámico que continuamente es destruido, (resorbido) y reconstruido y un intrincado proceso entre dos líneas de células distintas: las células formadoras de hueso conocidas como osteoblastos y las células de resorción ósea conocida como osteoclastos. La cascada de factores de transcripción y factores de crecimiento involucrados en la diferenciación o progreso de una célula progenitora a un osteoclasto funcional ha sido bien establecida. En contraste, se sabe poco acerca de los factores involucrados en el progreso de osteoblastos a partir de células progenitoras. Las células progenitoras de mesénquima o células madre (MPC, por sus siglas en inglés) representan los puntos de inicio de la diferenciación tanto de osteoclastos como de osteoblastos. Durante el desarrollo embriónico in vivo se produce formación de hueso mediante dos días distintas: osificación intramembranal y/o endocondrial (véase la figura Ref.: 178017 1; tomada de Nakashima y de Crombrugghe, (2003)). Durante la osificación intramembranosa se forman huesos planos tales como los del cráneo o las clavículas, directamente de condensación de células de mesénquima. Durante la osificación endocondrial, se forman huesos largos tales como los huesos de las articulaciones a partir de un cartílago intermedio que se forma durante la condensación del mesénquima, cartílago intermedio el cual es invadido durante el desarrollo posterior por células endoteliales, osteoclastos y células de mesénquima que se diferencian posteriormente en osteoblastos y osteocitos. Durante esta última diferfenciación en osteoblastos se regula por aumento la actividad de la fosfatasa alcalina ósea (BAP, por sus siglas en inglés) . Numerosas enfermedades son el resultado directo de una alteración en el equilibrio de ajuste fino entre la resorción y la formación ósea. Estas enfermedades en su mayor parte son enfermedades del esqueleto y afectan a una gran cantidad de pacientes. Las enfermedades ejemplares incluyen hipocalcemia o cáncer, enfermedad de Paget, enfermedades óseas inflamatorias tales como artritis reumatoide y enfermedad periodontal, osteogénesis focal que se produce durante la metástasis de esqueleto, síndrome de Crouzon, raquitismo, opsismodisplasia, picnodisostosis/enfermedad de Toulouse-Lautrec, osteogénesis imperfecta y osteoporosis. La enfermedad ósea única más prevalente es la osteoporosis la cual afecta a 1 de 5 mujeres con una edad mayor de 50 años y 1 de 20 hombres con edades de más de 50 años. DESARROLLOS REPORTADOS Se han desarrollado y se han vuelto disponibles muchos tratamientos para los pacientes quienes padecen osteoporosis y enfermedades relacionadas del esqueleto. Estos enfoques terapéuticos se dirigen principalmente a aumentar la formación ósea neta e incluyen: tratamiento de sustitución hormonal (HRT, por sus siglas en inglés) ; moduladores selectivos de receptor de estrógeno (SERM, por sus siglas en inglés); bisfosfonatos y calcitonina. Aunque estos tratamientos disminuyen la resorción ósea, no suprimen las fracturas debido a que la pérdida ósea no se reabastece lo suficiente. Se evitan fracturas únicamente si se incrementa lo suficiente la formación ósea. Por lo tanto, existe un gran interés en identificar vías osteogénicas para mejorar el anabolismo óseo, como una base para intervención terapéutica. La hormona paratiroidea (PTH, por sus siglas en inglés) 1-34 es el único tratamiento anabólico óseo en el mercado para el tratamiento terapéutico de osteoporosis. Aunque la PTH presente efectos anabólicos en hueso cuando se administra de manera intermitente, necesita ser inyectada diariamente y puede tener efectos secundarios tumorigénicos, en base en la observación de que se forman tumores en animales tratados con PTH a dosis elevadas.
Las proteínas morfogenéticas de hueso (BMP, por sus siglas en inglés) , son otra clase de sustancias terapéuticas anabólicas óseas, pero únicamente han sido aprobadas para mercados muy definidos . Los receptores de las proteínas morfogenéticas óseas se han identificado en muchos tejidos diferentes al hueso, y las BMP en si mismas se expresan en una gran variedad de tejidos en patrones temporales y espaciales específicos. Esto sugiere que las BMP puedan tener efectos sobre muchos tejidos diferentes al hueso lo que limita potencialmente su utilidad como agentes terapéuticos cuando se administran de manera sistémica. Existe una necesidad clara a identificar agentes adicionales que estimulan la diferenciación osteogénica y que pueden ser utilizados para el desarrollo de tratamientos anabólicos novedosos para el hueso. La presente invención se basa en el descubrimiento de que ciertos polipéptidos conocidos, que incluyen a las proteínas de XLR, son factores en lasub-regulación por aumento y/o inducción de diferenciación osteogénica en células de médula ósea, y que los agonistas conocidos para estos polipéptidos son eficaces en promover homeostasis ósea. SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un método para promover osteogénesis en una población de células que incluye células progenitoras de osteoblastos, o más particularmente, diferenciación celular para formar células de osteoblastos, que comprende poner en contacto células progenitoras de osteoblastos con una cantidad eficaz estimulante osteogénica de un agonista de LXR. El presente método se puede utilizar para el tratamiento o prevención de un desequilibrio en la homeostasis ósea en un sujeto quien padece de, o es susceptible de desequilibrio, que comprende administrar una cantidad eficaz estimulante osteogénica de un agonista de LXR al sujeto. Esta invención también se relaciona con una composición para el uso del método mencionado antes, tal como una composición que promueve la homeostasis ósea, que comprende una cantidad eficaz estimulante osteogénica de un agonista de LXR en mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable. Un aspecto adicional es un método para producir tejido óseo in vi tro que comprende poner en contacto una cantidad eficaz estimulante osteogénica de un agonista de LXR con una población de células progenitoras de osteoblastos sobre un sustrato, por un tiempo suficiente para estimular la generación de una matriz de tejido óseo. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 es una representación de la osificación intramembranosa y endocondrial; la figura 2 muestra el principio del ensayo de diferenciación de los osteoblastos; la figura 3 muestra el funcionamiento de la placa control sustituida (knoc-in) en el ensayo AP; la figura 4 muestra una representación de gráfica y puntos de los datos sin tratar de la placa de cribado FLeXeSelect; las figuras 5A-5C muestran lasub-regulación por aumento, dependiente de la dosis de la actividad AP por compuestos seleccionados; la figura 6 muestra el análisis de lasub-regulación por aumento de ARNm para BAP versus ARNm par PLAP o para IAP; la figura 7 muestra la mineralización de MPC humanos primarios; la figura 8 muestra la mineralización de MPC humanos primarios; la figura 9 muestra lasub-regulación por aumento, dependiente de la dosis de la actividad de AP por el agonista LXR, GW3965, en presencia de Ad-NR1H3 ; la figura 10 muestra lasub-regulación por aumento, dependiente de la dosis de la actividad de AP por el agonista de LXR T0901317 en presencia de Ad-NR1H2 ; la figura 11 muestra lasub-regulación por aumento, dependiente de la dosis de la actividad de AP por el agonista de LXR GW3965 en presencia de Ad-NR1H2 ; la figura 12 muestra la estructura del dímero acetilpodocárpico (APD, por sus siglas en inglés) utilizado en esta solicitud; la figura 13 muestra lasub-regulación por aumento, dependiente de la dosis de la actividad de AP por el agonista de LXR, APD, en presencia de Ad-NR1H2 o Ad-NR1H3 ; la figura 14A a la figura 14D muestran los valores CT y los niveles de expresión relativos de cuatro genes de la presente invención en comparación con la ß-actina para tipos de células relevantes con la formación de hueso; la figura 15 muestra los incrementos en peso en explantes de la bóveda craneal inducida por controles positivos Ad-BMP2 y Ad-BMP7 ; las figuras 16A-16C muestran los incrementos en peso en explantes de bóveda craneal inducidos por T0901317; la figuras 17A-17C muestran que DN-RUNX2 interfiere con la inducción des la actividad de AP por NR5A2 , NR1H3 + T0901317 y ESRRG; las figuras 18A-18D muestran que NR5A2 , NR1H3 + T0901317 y ESRRG inducen actividad de AP, independiente del aislado de MPC. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN se pretende que los siguientes términos tengan los significados presentados en la presente a continuación y son útiles para la comprensión de la descripción y el alcance propuesto de la presente invención. El término "agonista" se refiere, en su sentido más amplio, a un ligando que estimula el receptor con el cual se une. El término "cantidad eficaz" significa aquella cantidad de un medicamento o agente farmacéutico que inducirá la respuesta biológica o médica de un sujeto que está siendo observado por un doctor u otro profesional de la medicina. En particular, con respecto a tratar un desequilibrio en la homeostasis ósea, se pretende que el término "cantidad eficaz estimulanre osteogénica" signifique aquella cantidad eficaz de un agonista de LXR o precursor de agonista de LXR que lleve a cabo un incremento biológicamente significativo en la proporción de osteoblastos respecto a osteoclastos en el tejido óseo del sujeto. Un incremento biológicamente significativo es aquel incremento que se puede detectar indirectamente por medio de densidad ósea, resistencia ósea u otro signo de diagnóstico conocido por aquellos expertos en la técnica. El término "expresión" se relaciona tanto con la expresión endógena como con la sobreexpresión, por ejemplo, por trasnfección o transducción estable. El término "LXR" incluye todos los subtipos de este receptor como se conocen en la técnica anterior y los genes correspondientes que codifican para dichos subtipos. Específicamente, LXR incluye LXR-a y LXR-ß, y se debe entender que un agonista de LXR incluye un agonista de LXRa o LXRß. Se denomina a LXRa bajo una diversidad de nombres y, para propósitos de esta solicitud, debe entenderse que LXR-a significa cualquier gen al que haga referencia a LXR-a, LXRa, LXRalfa, LRD-1, NR1H3 o un gen con homología a el número de acceso U22662 o una proteína con homología con una proteína codificada por dicho polinucleótido. De manera similar, debe entenderse que LXR-ß incluye cualquier gen al que se haga referencia como LXRb, LXR-ß, LXRß, NER, NERl, UR, OR-1, R1P15, NR1H2 o un gen con homología al número de acceso U07132 o una proteína con homología con una proteína codificada por dicho polinucleótido. El término "homología" significa similitud de secuencia a un grado tal que los polinucleótidos de una secuencia "homologa" son capaces de hibridizar con la secuencia de LXR bajo condiciones de hibridación rigurosa, como se entiende por una persona experta en la técnica . El término "osteogénesis" significa un procedimiento que consiste de varios eventos sucesivos que incluyen inicialmente lasub-regulación por aumento de la fosfatasa alcalina ósea en una célula y la deposición de calcio (mineralización) que se produce en etapas posteriores del proceso. El término "diferenciación osteogénica" se refiere a cualquier procedimiento en donde las células no especializadas en una línea de células relacionadas con el hueso se vuelven más especializadas al presentar procedimientos anabólicos que resultan en la deposición de calcio y la formación de tejido oseo. El término "portador farmacéuticamente aceptable" incluye, por ejemplo, portadores farmacéuticamente aceptables tales como los siguientes : portadores sólidos tales como lactosa, estearato de magnesio, alabastro, sacarosa, talco, ácido esteárico, gelatina, agar, pectina, goma acacia o similar; y líquidos tales como aceites vegetales, aceite de cacahuate y agua estéril o similares. No obstante, la lista de portadores farmacéuticamente aceptables no se considera limitante. "Fármacos precursores farmacéuticamente aceptables", como se utilizan en la presente, se refiere a aquellos fármacos precursores de los compuestos útiles en la presente invención los cuales son adecuados, bajo el buen juicio médico, para uso en contacto con los tejidos de pacientes sin una forma indebida de toxicidad, irritación, respuesta alérgica, conmensurada con una proporción razonable de beneficio/riesgo eficaz para el uso propuesto de los compuestos de la invención. El término "fármaco precursor" significa un compuesto que se transforma in vivo para proporcionar un compuesto eficaz útil en la presente invención o una sal, hidrato o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo. La transformación puede ocurrir por diversos mecanismos por ejemplo a través de hidrólisis en sangre. Los compuestos que tienen grupos separables metabolicamente tienen la ventaja de que pueden presentar biodisponibilidad mejorada como un resultado de solubilidad y/o velocidad de absorción mejoradas, conferidas por el compuesto de origen en virtud de la presencia del grupo metabolicamente separable y de esta manera dichos compuestos actúan como fármacos precursores. Una exposición exhaustiva se proporciona en Design of Prodrugs, H. Bundgaard, ed., Elseiver (1985); Methods in Enzymology; K. Widder et al, Ed. , Academic Press, 42, 309-396 (1985); A Textbook of Drug Design and Development, Krogsgaard-Larsen and H. Bandaged, ed. , capítulo 5; "Design and Applications of Prodrugs" 113-191 (1991); Advanced Drug Delivery Revie s, H. Bundgard, 8, 1-38, (1992); J. Pharm. Sci., 77, 285 (1988); Chem. Pharm. Bull., N. Nakeya et al, 32, 692 (1984); Pro-drugs as Novel Delivery Systems, T. Higuchi and V. Stella, 14 A. C.S. Symposium Series, and Bioreversible Carriers in Drug Design, E. B. Roche, ed., American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987, las cuales se incorporan en la presente como referencia. Un ejemplo de los fármacos precursores es un fármaco precursor éster. Un "fármaco precursor éster" significa un compuesto que se puede convertir in vivo por medios metabólicos (por ejemplo mediante hidrólisis) a un agonista de LXR. Por ejemplo, un fármaco precursor éster de un compuesto que contiene un grupo carboxi se puede convertir por hidrólisis in vivo al grupo carboxi correspondiente. El término "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a sales de adición de ácidos inorgánicos y orgánicos, no tóxicos de compuestos de la presente invención. Estas sales se pueden preparar in si tu durante el aislamiento final y la purificación de los compuestos útiles en la presente invención. El término "polinucleótido" se refiere a ácidos nucleicos tales como ADN de cadena doble o de cadena sencilla y ARN (mensajero) y todos los tipos de oligonucleótidos. También incluye ácidos nucleicos con estructuras principales modificadas tales como ácido péptido nucleico (PNA, por sus siglas en inglés), polisiloxano y 2 ' -O- (2-meto-xi) etilfosforotioato. Los "derivados de un polinucleótido" significa moléculas de ADN, de ARN y oligonucleótidos que comprenden una cadena de residuos de ácido nucleico del polinucleótido, por ejemplo polinucleótidos que pueden tener mutuaciones de ácido nucleico en comparación con la secuencia de ácido nucleico de una forma del polipéptido como se encuentra en la naturaleza. Un derivado puede comprender adicionalmente ácidos nucleicos con estructuras principales modificadas tales como PNA, polisiloxano y 2'-0-(2-metoxi) etilfosforotioato, residuos de ácidos nucleicos que no se encuentran de manera natural, o uno o más sustituyentes de ácido nucleico, tales como metil-, tio-, sulfato, benzoil-, fenil-, amino-, propil-, cloro- y metanocarbanucleósidos o una molécula indicadora para facilitar su detección. Un "fragmento de un polinucleótido" significa oligonu-cleótidos que comprenden una secuencia de residuos de ácido nucleico contiguos que presentan actividad sustancialmente similar, aunque no necesariamente idéntica, como una secuencia completa . El término "polipéptido" se relaciona con proteínas, moléculas proteináceas, fracciones de proteínas, péptidos, oligopéptidos y enzimas (tales como cinasas, proteasas, GCPR) . El término "derivados de un polipéptido" se relaciona con aquellos péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que comprenden una cadena de residuos aminoácidos contiguos del polipéptido y que retienen la actividad biológica de la proteína, por ejemplo polipéptidos que tienen las mutaciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de una forma del polipéptido que se encuentra en la naturaleza. Un derivado puede comprender adicionalmente residuos aminoácidos como se encuentran en la naturaleza, alterados, glucosilados, acilados o que no se encuentren de manera natural, en comparación con la secuencia de aminoácidos de una forma del polipéptido como se encuentra en la naturaleza. También puede contener uno o más sustituyentes diferentes de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de una forma del polipéptido como se encuentra en la naturaleza, por ejemplo, una molécula indicadora u otro ligando, unido covalentemente o no covalentemente a la secuencia de aminoácidos . El término " fragmento de un polipéptido" se relaciona con péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que comprenden una cadena de residuos aminoácidos contiguos y que muestran una actividad funcional sustancialmente similar aunque no necesariamente idéntica en comparación con la secuencia completa. El término "solvato" significa una asociación física de un compuesto útil en esta invención con una o más moléculas de solvente. Esta asociación física incluye unión de hidrógeno. En ciertos casos el solvato será capaz de aislamiento, por ejemplo cuando una o más moléculas de solvente se incorporan en la retícula de cristal del sólido cristalino. El término "solvato" abarca tanto a solvatos en fase de solución como aislables. Los solvatos representativos incluyen hidratos, etanolatos y metanolatos. El término "sujeto" incluye humanos y otros mamíferos . El término "tratar" se refiere a aliviar el trastorno o condición al cual se aplica el término "tratar", que incluye uno o más síntomas de dicho trastorno o condición.
El término relacionado "tratamiento" como se utiliza en la presente, se refiere a la acción de tratar un trastorno, síntoma o condición, como lo indica el término "tratar" definido en lo anterior.
MÉTODOS DE LA PRESENTE INVENCIÓN La presente invención se relaciona con métodos para incrementar y/o inducir diferenciación osteogénica, el método comprende poner en contacto: (1) una población de células que expresan un polipéptido codificado por el gen objetivo LXR identificado en la tabla 1 siguiente, como NR1H3, o un fragmento funcional o derivado del mismo; con (2) un agonista de LXR; y (3) de esta manera incrementar el nivel de diferenciación osteogénica en la población de células. Los presentes inventores prepararon la tabla 1 a continuación a partir de los resultados obtenidos de los estudios de cribado descritos adicionalmente en lo siguiente. Tabla 1. Lista de genes objetivo identificados MÉTODOS UTILIZADOS PARA IDENTIFICAR LA RELACIÓN ENTRE LXR Y DIFERENCIACIÓN OSTEOGÉNICA Los genes objetivo relacionados con diferenciación osteogénica definidos en lo anterior se identifican utilizando una biblioteca denominada "sustituida", de la siguiente manera. Utilizando adenovirus recombinante, los presentes inventores sometieron a transducción moléculas de ADNc que codifican para un gen natural específico y un producto de gen, en células . Cada ADNc introducido en cada subpoblación de células separada indujo la expresión y actividad del gen correspondiente y el producto del gen en una célula. Al identificar un ADNc que induce o incrementa la diferenciación osteogénica, se establece un enlace directo con el gen objetivo correspondiente. Este gen objetivo posteriormente se utiliza en métodos para identificar compuestos que pueden ser utilizados para activar o estimular diferenciación osteogénica, en ,una afinidad de unión como máximo 10 micromolar (10 µM) . En realidad, los compuestos que se sabe se unen a genes objetivo utilizados en este cribado se encontraron que incrementan la diferenciación osteogénica de las células, lo que demuestra el papel de estos genes objetivo en este procedimiento. Este método se utilizó para identificar los polipéptidos que incluyen el receptor LXR, involucrado en el procedimiento de diferenciación de osteoblastos y el uso de agonistas de los mismos para promover o inducir diferenciación de osteoblastos. La población de células, en la cual se promueve la diferenciación de osteoblastos preferiblemente es cualquier tipo de célula o tipos de células no diferenciados, Las células no diferenciadas son células pluripotentes que se encuentran en etapa temprana de especialización, es decir, que aún no han adquirido su función final y que se pueden inducir para que formen casi cualquier tipo de célula dado. Dichas células son especialmente células sanguíneas y células presentes en médula ósea, así como células derivadas de tejido adiposo. Además, las células que aún se pueden diferenciar en células precursoras del mesénquima se contemplan en la presente invención tales como, por ejemplo, células madre totipotentes tales como células madre embriónicas . El polipéptido utilizado en la biblioteca de sustitución y que proporciona la base de la presente invención (utilizando un agonista de LXR) es una clase de receptores de hormona nuclear (NHR, por sus siglas en inglés) . A manera de antecedentes, las hormonas lipofílicas tales como esteroides, retinoides, tiroides y vitamina D2 modulan la transcripción de genes dentro de la célula. Una hormona esteroidea, por ejemplo, entrará en la célula y se unirá a su receptor complementario, iniciando una cascada de eventos compleja. El complejo hormona-receptor forma dímeros los cuales se unen a una secuencia de ADN denominada elemento de respuesta de hormona (HRE, por sus siglas en inglés) . Esta unión activa, o en algunos casos inhibe la transcripción del gen apropiado . Como tales, la actividad de los NHR se puede determinar con un gen indicador bajo el control de un promotor que contenga el elemento receptor de hormona (HRE, por sus siglas en inglés) apropiado. Otra clase preferida de los polipéptidos utilizados en la biblioteca de sustitución son los receptores acoplados a proteína G (GPCR, por sus siglas en inglés) en donde la expresión y/o actividad de dichos GPCR se puede medir al determinar el nivel de cualquiera de uno de los segundos mensajeros: AMP cíclico, Ca2+ o ambos. Preferiblemente, se determina el nivel del segundo mensajero con un gen indicador bajo el control de un promotor que es sensible al segundo mensajero. De manera más preferible, el promotor es un promotor sensible a AMP cíclico, un promotor sensible a NF-KB o un promotor sensible a NF-AT. En otra modalidad preferida, el gen indicador se selecciona del grupo que consiste de: fosfatasa alcalina, GFP, eGFP, dGFP, luciferasa y b-galactosidasa . Un método para medir la diferenciación osteogénica y que se encuentra útil en el cribado determina el nivel de expresión de algunas proteínas que están involucradas en la morfogénesis ósea y que se inducen durante el proceso de diferenciación tal como fosfatasa alcalina, colágeno tipo 1, osteocalcina y osteopontina. Los niveles de actividad de estas proteínas marcadoras se pueden medir mediante ensayos utilizando sustratos específicos. Por ejemplo, se puede medir la actividad de fosfatasa alcalina ósea (BAP o AP ósea) , al agregar una solución de heptafosfato de metilumbeliferilo (MUP) a las células. La fluorescencia generada ante la ruptura del sustrato MUP por la actividad de AP se mide en un lector de placa de fluorescencia, como se indica en los ejemplos que se proporcionan más adelante. La expresión de los genes objetivo también se puede determinar por métodos conocidos en ia técnica tales como la prueba de Western blotting utilizando anticuerpos específicos o ELISA utilizando anticuerpos específicos dirigidos contra los genes objetivo. Alternativamente, uno puede analizar los niveles de expresión de ARNm en las células utilizando métodos conocidos en la técnica tales como Northern blotting o PCR en tiempo real cuantitativa. Ante la incubación con un compuesto agonista, la promoción de diferenciación osteogénica se puede supervisar por la inducción del agonista de la expresión o actividad de una proteína marcadora. Aunque la inducción de niveles de expresión de proteína pueden variar a partir de un incremento de un pequeño porcentaje a dos, tres o cuatro ordenes de magnitud superiores, la inducción de expresión de proteína de por lo menos dos veces (o más) en un paciente (in vivo) es un nivel preferido. Una inducción preferida de la expresión y/o actividad por lo tanto es comparable con una inducción de 100% (o más) in vivo . No obstante, no se puede excluir que los niveles encontrados in vitro no se relacionen perfectamente con los niveles encontrados in vivo de manera tal que un nivel ligeramente reducido in vitro aún puede resultar en una inducción mayor in vivo cuando el compuesto agonista se aplica en un ámbito terapéutico. Por lo tanto, se prefiere tener niveles inducidos in vitro de por lo menos 20%, de manera más preferible más de 50%, incluso de manera más preferible más de 100% lo que puede significar una inducción doble de la expresión o actividad de la proteína marcadora osteogénica. Para el cribado de un compuesto que altera la diferenciación osteogénica de células por unión a cualquiera de los polipéptidos objetivo que se incluyen en la tabla 1 o un derivado o un fragmento del mismo tal como los fragmentos de dominio de proteína de los mismos indicados en la tabla ÍA siguiente, se pueden utilizar las bibliotecas de compuestos tales como péptidos (LOPAP™, Sigma Aldrich) , lípidos (BioMol) , compuestos sintéticos (LOPAC0, Sigma Aldrich) o compuestos naturales (Specs, TimTec) . La afinidad de unión del compuesto de prueba con el polipéptido o polinucleótido se pueden medir por métodos conocidos en el arte, por ejemplo mediante la utilización de biosensores de resonancia de plasmón de superficie (Biacore) , por análisis de unión de saturación con un compuesto marcado (por ejemplo análisis Scatchard y Lindmo) , por espectrofotómetro UV diferencial, ensayo de polarización de fluorescencia, un sistema Fluorometric Imaging Píate Reader (FLIPR1^) , transferencia de energía de resonancia de fluorescencia y transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia . La afinidad de unión de los compuestos también se puede expresar en constantes de disociación (Kd) o como CI50 o CE50. El valor de CI50 representa la concentración de un compuesto que se requiere para 50% de inhibición de la unión de otro ligando al polipéptido. La CE50 representa la concentración que se requiere para obtener 50% del efecto máximo en cualquier ensayo que mida la función de receptor. La constante de disociación, Kd es una medida de qué también el ligando se une al polipéptido, es equivalente a la concentración de ligando que se requiere para saturar exactamente la mitad de los sitios de unión en el polipéptido. Los compuestos con una afinidad elevada de unión tiene valores Kd, CI50 y CE50 bajos, es decir, en el intervalo de 100 nM a 1 pM; una afinidad de moderada a baja en la unión se relaciona con valores de Kd, CI50 y CE50 elevados, es decir, en el intervalo micromolar. Se pueden determinar afinidades de unión en ambientes in vivo así como en ambientes in vitro. La inducción de diferenciación osteogénica de células se puede obtener de diferentes maneras. Los compuestos que se encuentran útiles en la presente invención pueden dirigirse a los polipéptidos directamente e inducir o estimular su actividad. Estos compuestos también se dirigen a la maquinaria de transcripción/traducción involucrada en la transcripción y/o traducción del polipéptido a partir de su ácido nucleico codificante. Adicionalmente, los compuestos pueden dirigir sus ADN y ARNm respectivos y de esta manera inducir la presentación del polipéptido y por lo tanto su actividad. Por lo tanto, debe entenderse que los compuestos que se identifican mediante la utilización de los métodos de la presente invención pueden dirigir la expresión y/o la actividad de los polipéptidos a niveles diferentes, lo que finalmente resulta en la alteración de la diferenciación osteogénica de las células. Los compuestos agonistas de la presente invención pueden funcionar de acuerdo con cualquiera de estos mecanismos. Un aspecto preferido de la presente invención comprende poner en contacto dicha población de células con un agonista de LXR, o una mezcla de los mismos. El término "agonista de LXR" significa un compuesto que regula por aumento (es decir, activa o estimula) la actividad del receptor LXR y/o las concentraciones del mismo, en una célula, debe entenderse que incluye un agonista o agonista parcial de LXR. El agonista puede ser selectivo para LXR-a o LXR-ß, o puede temer una afinidad de unión mixta tanto para LXR-a como para LXR-ß. Particularmente, los compuestos dentro del alcance de esta invención incluyen aquellos que tienen una selectividad mayor, determinada por afinidad de unión para los receptores LXR-a y/o LXR-ß que la que pueden tener para cada uno de los receptores PPAR- a, ? y d. Más particularmente, los compuestos incluidos dentro del alcance de esta invención tienen una CI5o menor que o igual a 100 nM para por lo menos de, ya sea, los receptores LXR-a o LXR-ß, y tienen una CI50 igual a o mayor de 1 µM para cada uno de los receptores PPAR-a, PPAR-? y PPAR-d, e incluso de manera más particular tienen una CI50 igual a o mayor a 10 µM para cada uno de los receptores PPAR- a, PPAR-? y PPAR-d. Por ejemplo, la selectividad de los agonistas de receptor de LXR se puede determinar a partir de los resultados de CI50 obtenidos empleando los ensayos de proximidad de centelleo de competición de radio agonista de LXR en la solicitud de Patente E.U.A. publicada 20030086923 y de los ensayos de unión de competencia de PPAR descritos en Berger J, et al., Novel peroxisomeproliferator-activated receptory (PPAR-?) y PPAR-d agonists produce distinct biological effects, J biol Chem 274: 6718-6725 (1999), incorporada en la presente como referencia en su totalidad. Los agonistas ejemplares de LXR se describen en las publicaciones PCT W0224632 y WO03082198, las cuales describen derivados de ácido diarilalquilaminoalcoxi-2-fenilacético, de manera más específica el ácido 2- (3- (3- (N- (2-cloro-3-( trifluorometil) bencil) -N- (2, 2-difeniletil) amino) propoxi ) fe-nil)acético; publicación PCT WO0182917 y UA 20040018560, las cuales describen las bencensulfonamidas, N- (2,2,2-trifluoroetil) -N- [4- [2,2, 2-trifluoro-l-hidroxi-1- (trifluorometil) etil] fenil] -bencensulfonamida y N- (metil) -N- [4- [2 , 2, 2-trifluoro-l-hidroxi-1- (trifluorometil) etil] fenil] -bencensul-fonamida; la patente de E.U.A. No. 6,645,955 la cual describe agonistas de LXR esteroidilo que incluyen, por ejemplo, el ácido 3-ß-hidroxi-5-colesten-25 (R) -26-carboxílico; UA 20030086923, la cual describe agonistas de LXR que incluyen, por ejemplo, (4, 5-dihidro-l- (3- (3-trifluorometil-7-propilben-zisoxazol-6-iloxi)propil) -2 , 6-pirimidinadiona) ; UA 20030125357, la cual describe derivados de lOß-podo-carpano, de manera más específica (4ß, 5a) -12-hidroxi-N- [ (1-fenilciclobutil)metil]podocarpa-8, 11, 13-trien-16-amida; UA 20040072868, el cual describe derivados de aminopropoxiarilo sustituido, de manera más específica 2- (3-{3- [ [2-cloro-3- (trifluorometil) bencil] (2, 2-difeniletil) amino] propoxi} fenil) acetamida; UA 20030073614, N- (2,2,2-trifluoroetil) -N- [4(2,2, 2-trifluoro-1-hidroxi-l-trifluorome-tiletil) -fenil] -bencensulfonamida; publicación PCT WO2004001002 , [ácido 6a-hidroxi biliar o un compuesto de oxicolesterol] ; publicación PCT WO03090732, la cual describe un género de compuestos que incluyen la (4-cianobutil) - [4- (2,2,2, -trifluoro-1-hidroxi-l-trifluorometiletil) -fenil] -amida del ácido morfolino-4-carbotioico y el éster metílico del ácido 5- { (morfolino-4-carbotioil) - [4- (2 , 2 , 2-trifluoro-1-hidroxi-1-trifluorometiletil) -fenil] amino} -pentanóico; la publicación PCT WO03090746, la cual describe 3-tiazoles, más específicamente N- (2-mercapto-1, 3-benzotiazol-6-il) -N- (2-metilpropil) -N' - [4- (trifluorometil) fenil]urea; la publicación PCT WO03090869, la cual describe una clase de compuestos que incluyen el éster terbutílico del ácido 3-{ [5-2, 2, 2-trifluoro-l-hidroxi-l-trifluorometiletil) -4, 5-dihidroiso-xazol-3-carbonil] -amino}propíonico, éster terbutílico del ácido 3-metil-2- { [5-2 , 2 , 2-trifluoro-1-hidroxi-l-trifluo-rometiletil) -4, 5-dihidroisoxazol-3-carbonil] -amino} -butírico y N-piridin-4-ilmetil-N- [5- (2 , 2 , 2-trifluoro-1-hidroxi-l-trifluorometiletil) -tiazol-2-il] isonicotinamida; la publi-cación PCT WO03031408, la cual describe compuestos tricíclicos, de manera más específica la trans-8-hidroxi-9-hidro-l, 2- [a,b] [ (1-carboxietil-2-N-pirolidinil) benzo-4 , 5-il] -cis-10-metildecalina también denominada como éster etílico del ácido 5-hidroxi-8a-metil-2-pirrolidin-l-il-4b, 5 , 6, 7, 8, 8a, 9, 10-octahidrofenantreno-3-carboxílico; la 8-ceto-l, 2- [a,b] [ (1-carboxietil-l-N-pirolidinil)benzo-4, 5-il] -10-metildecalina también denominada éster etílico del ácido 8a-metil-5-oxo-2-pirrolidin-l-il-4b, 5,6,7,8, 8a, 9 , 10-octahi-drofenantreno-3-carboxílico y 8-hidroxi-l, 2- [a,b] [ (1-hidroximetil-l-N-pirolidinil)benzo-4, 5-il] -10-metildecalina, también denominada 6, 10a-dimetil-7-pirrolidin-l-il-l, 2 , 3 , 4, 4a, 9 , 10 , 10a-octahidrofenantren-4-ol, también denominado 6-hidroximetil-10a-metil-7-pirrolidin-1-il-l, 2 ,3, 4, 4a, 9, 10, 10a-octahidrofenantren-4-ol; la publicación PCT WO2004009091, la cual describe derivados de purina, de manera más específica 7-(2-cloro-6-fluorobencil) -1, 3-dietil-8-piperidin-l-il-3 , 7-dihidro-lH-purino-2, 6-diona; la publicación PCT WO2004024161, la cual describe 2-amino-4-oxoquinazolonas, de manera más específica identificadas en la presente como TR1040001892, TR1040011382, TR1040002211 y TR1040002212 ; publicación PCT WO2004024162, la cual describe 2-amino-4-quinazolonas, de manera más específica [MOLNAMES 3252, 6584, 7459 y 7364]; publicación PCT WO2004011448, la cual describe una clase de compuestos que incluyen más específicamente 1- (3-1 [7-propil-3- (neopentil) -1, 2-benzisoxa-zol-6-il] oxi}propil)pirrolidin-2 , 5-diona; publicación PCT WO03053352, la cual describe una clase de compuestos, de manera más específica el grupo que consiste de la monoamida del ácido [N-metil-N- (3- { [7-propil-3- ( trifluorometil) -1, 2-benzisoxazol-6-il] oxi}propil) ] isoftálico; monoamida del ácido N-metil-N- (3-{ [7-propil-3- (trifluorometil) -1 , 2-benzisoxazol-6-il] oxi}propil) succínico; 4-carboxi-3 , 3-dimetil- [N-metil-N- (3-f [7-propil-3- ( trifluorometil) -1, 2-benzisoxazol-6-il] oxi} -propil]butiramida; N-metil-N- (3-{ [7-propil-3- ( trifluoro-metil) -1, 2-benzisoxazol-6-il] oxi }propil) acetamida; monoamida del ácido [N-metil-N- (3-{ [7-propil-3- (trifluorometil) -1, 2-bencisaxazol-6-il] oxi}propil) ] tiofeno-1, 5-dicarboxílico; monoamida del ácido [N-metil-N- (3-{ [7-propil-3- (trifluorometil) -1, 2-benzisoxazol-6-il] oxi}propil) ] piridino-3 , 5-dicarboxílico; monoamida del ácido (N-metil-N- (3, 1 [7-propil-3- (trifluorometil) -1, 2-benzisoxazol-6-il] oxi}propil) ] -2 , 2-diclorociclopropano-l, 3-dicarboxílico y las sales y esteres farmacéuticamente aceptables de los mismos]; publicación PCT WO03045382, la cual describe una clase de compuestos que incluyen N,N-dimetil-4- {7-propil-3- (trifluorometil) -1, 2-benzisoxazol-6-iloxi }butiramida; N-metil-4-{7-propil-3- (trifluorometil) -1, 2-benzisoxazol-6-ilo-xi}butiramida; N,N-dimetil-4-{7-propil-3-neopentil-1, 2-benzosoxazol-6-iloxi}butiramida; N-metil-4- (7-propil-3-neopentil-l, 2-benzisoxazol-6-iloxi}butiramida; N-etil-4-{7-propil-3-neopentil-l, 2-benzisoxazol-6-iloxi }butiramida; N,N-dietil-4-{7-propil-3-neopentil-l, 2-benzisoxazol-6-iloxi} -butiramida; 4-{7-propil-3-neopentil-l, 2-benzisoxazol-6-butil}piperidina; N-propil-4- (7-propil-3-neopentil-1, 2-benzisoxazol-6-iloxi}butiramida; N- (2-furil) -metil-4- (7-propil-3-neopentil-l , 2-benzisoxazol-6-iloxi}butiramida; N-butil-4-r7-propil-3-neopentil-l, 2-benzisoxazol-6-iloxi} -butiramida; 4- (7-propil-3- (trifluorometil) -1, 2-benzisoxazol-6-iloxi}butiramida; N-propil-4-{7-propil-3- (trifluorometil) -1, 2-benzisoxazol-6-iloxi}butiramida; 4- {7-propil-3- ( trifluo-rometil) -1, 2-benzisoxazol-6-iloxi}butirilpiperidina; N-(4-carbometoxifenil) metilo, 4-{7-propil-3- (trifluorometil) -1, 2-benzisoxazol-6-iloxi}butiramida; N- (4-carboxifenil)metilo, 4-{-propil-3- (trifluorometil) -1, 2-benzisoxazol-6-iloxi}butira-mida; N-metil-N- (4-carboxifenil)metil-4- {7-propil-3-(trifluorometil) -1, 2-benzisoxazol-6-iloxi}butiramida; (N- (3-carboterbutiloxifenil) metil-4- (7-propil-3- (trifluorometil) -1, 2-benzisoxazol-6-iloxi}butiramida; N-metil-N- (3-carboxi-fenil)metil 4-{7-propil-3- (trifluorometil) -1, 2-benzisoxazol-6-iloxi}butiramida; N- (2-carboterbutiloxi)metilfenil)metil 4-{7-propil-3- (trifluorometil) -1, 2-benzisoxazol-6-iloxi}butira-mida; N- (3-carboxifenil)metil, 4-{7-propil-3- (trifluorometil) -1, 2-benzisoxazol-6-iloxi}butiramida; N-2- (carboximetil) fenilmetilo, 4-{7-propil-3- (trifluorometil) -1, 2-benzi-soxazol-6-iloxi}butiramida; N-metil-N-2- (carboximetil) fenil-metil-4- (7-propil-3- (trifluorometil) -1, 2-benzisoxazol-6-iloxi}butiramida; éster terbutílico de amida de valina del ácido 4- {7-propil-3- (trifluorometil) -1, 2-benzisoxazol-6-iloxi}butírico; amida de valina del ácido 4-{7-propil-3-( trifluorometil) -1, 2-benzisoxazol-6-iloxi}butírico; amida de N-metilvalina del ácido rac4-{7-propil-3- (trifluorometil) -1, 2-benzisoxazol-6-iloxi}butírico; N-metil-N- (4-piridil) 4-{7-propil-3- (trifluorometil) -1, 2-benzisoxazol-6-iloxi}butira-mida; N-metil-N- (2-piridil) 4- (7-propil-3- (trifluorometil) -1, 2-benzisoxazol-6-iloxi}butiramida; éster N- (4- {7-propil-3-(trifluorometil) -1, 2-benzisoxazol-6-iloxi}butanoil) -L-alani-no-terbutílico y N-metil-N- (4- {7-propil-3- (trifluorometil) -1, 2-benzisoxazol-6-iloxi}butanoil) -L-alanina; la publicación PCT WO03082205, la cual describe una clase de compuestos que incluyen 2- (3- {3- [ [2-cloro-3- ( trifluorometil) bencil] (2,2-difeniletil) amino]propoxi} fenil) etanol; éster metílico del ácido [3- (4-terbutildimetilsililhidroxi)but-l-inil] fenil-acético, éster metílico del ácido {3- [4-hidroxibutil] fenil}acético, éster metílico del ácido {3- [4- (tolueno-4-sulfoniloxi)butil] fenil}acético, (S) - (2-cloro-3-trifluorometilbencil) - (2-fenilpropil) -amina, (R) - (2-cloro-3-trifluorome ilbencil) - (2-fenilpropil) -amina, (2-cloro-3-trifluorometilbencil) - (naftaleno-1-ilmetil) -amina, (2-cloro-3-trifluorometilbencil) (fenetil) -amina, (2-cloro-3-trifluorometilbencil) - (bencil) -amina, (2-cloro-3-trifluorometil-bencilamino) -feniletanol, 3- (3-benciloxibencil) -1,2, 4-triazol, 3- (3-benciloxibencil) -etoximetil-1, 2 , 4-triazol, [3- (etoximetil) -1, 2, 4-triazol-3-ilmetil] -fenol, {3- [3- (3-bromopropoxi ) -bencil] }- (etoximetil) -1,2, 4-triazol, (2-cloro-3-trifluorometilbencil) - (2, 2-difeniletil) -{3- [3- (etoximetil) -1, 2 , 4-triazol-3-ilmetilfenoxi] -propil} -amina, 5- (3-bencilo-xibencil) -1,2,3, 4-tetrazol, 5- (3-benciloxibencil) -etoximetil-1,2,3, 4-tetrazol, 5- (3-hidroxibencil) -etoximetil-1, 2,3,4-tetrazol, 5- [3- (3-bromopropoxi) -bencil] - (etoximetil) -1,2,3,4-tetrazol y (2-cloro-3-trifluorometilbencil) - (2 , 2-dife-niletil) -{3- [3- (etoximetil-1, 2,3, 4-tetrazol-5-ilmetil) -fenoxi] -propil} -amina y sales o solvatos farmacéuticamente aceptables de los mismos; la publicación PCT WO03082192, la cual describe heterociclos de aminoalquilo sustituidos, de manera más específica el ácido 2- [2-{ [2-cloro-3-(trifluorometil) -bencil] (2, 2-difeniletil) amino} etil] -5-benzo-furanacético; al publicación PCT WO03082802, la cual describe una clase de compuestos que incluyen el éster metílico del ácido (R)-2-(3-{3-[ [2-cloro-3- ( trifluorometil)bencil] (2,2-difeniletil) mino] -2-metil-propoxi}-fenil) acético; la publi-cación PCT WO2004043939 , la cual describe una clase de compuestos que incluyen la 2- (3-{3- [ (2-cloro-3-trifluorometilbencil) -difeniletilamino] -propoxi} -fenil) -N- (2-morfolin-4-iletil) -acetamida; la publicación PCT WO2004058175, la cual describe una clase de compuestos que incluyen el ácido 3-cloro-4- (3- (7-propil-3-trifluorometil-6- (4,5) -isoxazolil)pro-piltio) -fenilacético; las publicaciones PCT WO0054759 y WO03074101, publicación PCT WO0160818; y la publicación de solicitud de patente Europea No. EP1398032, la cual describe 4-oxoquinazolinas, de manera más específica el compuesto se identifica como MOLNAME LN 7181, la descripción de cada uno de los compuestos agonistas de LXR y sus métodos de preparación se incorporan en la presente como referencia. MÉTODOS IN VITRO DE LA PRESENTE INVENCIÓN Una modalidad especial de la presente invención se relaciona con un método para la producción in vitro de tejido óseo, que comprende aplicar células progenitoras de osteoblastos a un sustrato y poner en contacto dichas células con una cantidad eficaz estimulante osteogénica de un agonista de LXR durante un tiempo suficiente para estimular la generación de una matriz de tejido óseo. Más específicamente, este método es útil para la producción in vitro de tejido óseo, al aplicar células progenitoras de osteoblasto de mamífero sobre un sustrato; agregar un agonista de LXR; permite que las células experimenten diferenciación osteogénica y que generen tejido óseo. Esto, in vitro, produce tejido óseo que se puede utilizar para el suministro de implantes que soportan carga, que incluyen prótesis de articulaciones tales como articulaciones artificiales de la cadera, articulaciones de la rodilla y articulaciones de los dedos así como implantes maxilofaciales tales como implantes dentales. También se puede utilizar para dispositivos de cirugía especial tales como separadores o materiales de relleno de huesos y para uso en aumento, obliteración o reconstitución de defectos óseos y hueso dañado o perdido. Los métodos de la invención también son muy adecuados en relación a la cirugía de revisión, es decir, cuando se han sustituido dispositivos quirúrgicos previos. Un aspecto adicional de este método comprende combinar un implante que soporta carga (preferiblemente recubierto con una matriz de tejido óseo, como se describe en lo anterior) con una composición de llenado óseo que comprende una matriz como se describe en lo anterior. Las células preferidas para uso para la producción in vitro de tejido óseo son células no diferenciadas. Las células no diferenciadas adecuadas son células de médula ósea que incluyen células hematopoyéticas y en particular células estromales. Las células de médula, y especialmente las células estromales se encuentra que son muy eficaces en los procedimientos de producción de hueso cuando se toman de su ambiente original. Las células no diferenciadas con frecuencia están disponibles en grandes cantidades y son más convenientes para utilizarse en comparación con los osteocitos maduros y presentan una morbilidad menor durante la recuperación. Además, las células no diferenciadas se pueden obtener de un paciente de quien se pretende colocar un implante. El hueso que resulta de estas células es autólogo para el paciente y por lo tanto no se inducirá respuesta inmunológica. Las células no diferenciadas se pueden aplicar directamente al sustrato o ventajosamente se pueden multiplicar en ausencia del sustrato antes de que se apliquen sobre el sustrato. En este último modo, las células aún están no diferenciadas en gran medida. Subsecuentemente, se permite que las células se diferencien al agregar el agonista de LXR, como se describe en la presente, u otro tipo de agonista que se ha identificado utilizando cualquiera de los métodos descritos en la presente. La formación de hueso se puede optimizar por variación en la mineralización, tanto por procedimientos inductivos como por conductivos. De esta manera, se pueden producir matrices de hasta 100 µl de espesor. Las células se cultivan por un tiempo suficiente para producir una capa de matriz, por ejemplo una capa de matriz que tiene un espesor de por lo menos 0.5 micrómetros (µm) , de manera preferible entre 1 y 100 µm, y de manera más preferible entre 10 y 50 µm. Las células se pueden poner en contacto con el medio de cultivo por cualquier período de tiempo. La producción de la matriz, cuando se aplica a un sustrato, resulta en un recubrimiento continuo o casi continuo que cubre al sustrato por al menos 50% de su área superficial. El sustrato sobre el cual se pueden aplicar y cultivar células no diferenciadas puede ser metal tal como titanio, aleación de cobalto/cromo o acero inoxidable, una superficie bioactiva tal como fosfato de calcio, superficies poliméricas tales como polietileno y similares. En otra modalidad, la presente invención se relaciona con células que han experimentado diferenciación a osteoblastos por tratamiento con compuestos, como se describen en la presente, e identificables de acuerdo con cualquiera de los métodos que se describen en la presente. MÉTODOS DE TRATAMIENTO Y COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS Los presentes inventores descubrieron que los polipéptidos que se incluyen en la tabla 1 están involucrados en un procedimiento de diferenciación osteogénica. En consecuencia, la presente invención se relaciona con el enlace entre ciertos polipéptidos presentes en la célula con la diferenciación osteogénica de células, algunas de las cuales están relacionadas estrechamente con el inicio, presentación y subsanado de enfermedades óseas metabólicas. En consecuencia, la presente invención se relaciona no solo con los compuestos que pueden ser utilizados para dirigir estos polipéptidos (muchos de los cuales se conocen en la técnica) sino también con el uso de dichos compuestos para propósitos terapéuticos relacionados con enfermedades del metabolismo óseo. Para los compuestos que ya se conocen que se unen a estos polipéptidos, el uso de los mismos en la presente invención es un uso nuevo (médico) . Un aspecto preferido de la presente invención se relaciona con un método para el tratamiento o prevención de un desequilibrio en la homeostasis ósea que comprende administrar una cantidad eficaz estimulante osteogénica de un agonista de LXR a un sujeto que padece o que es susceptible de dicho desequilibrio. Dicho desequilibrio está caracterizado por una reducción de la proporción de osteoblastos respecto a osteoclastos en el tejido óseo de un sujeto. Más particularmente, esta reducción en la proporción de osteoblastos es la que es eficaz en mineralizar la matriz ósea en relación a los osteoclastos que eficazmente resorben minerales del hueso, específicamente calcio. El presente método es útil para el tratamiento de sujetos susceptibles o que padecen de hipocalcemia (o cáncer) enfermedad de Paget, artritis reumatoide, enfermedad periodontal, osteogénesis focal que se produce durante metástasis esquelética, síndrome de Crouzon, raquitismo, opsismodisplasia, picnodisostosis/enfermedad de Toulouse-Lautrec, osteogénesis imperfecta y/u osteoporosis. El método más perferido de esta invención comprende la administración del agonista de LXR en cantidades farmacéuticamente eficaces a un sujeto susceptible y/o que padece de osteoporosis. Los agonistas de LXR útiles en la presente invención son eficaces en promover la diferenciación de células progenitoras de osteoblastos que incluyen células madre de mesenquimal en osteoblastos en la médula ósea de sujetos y de esta manera se incrementa la proporción de osteoblastos respecto a osteoclastos. Una clase preferida de agonista de LXR comprende un derivado de ácido diarilaquilaminoalcoxi-2-fenilacético o una sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable del mismo. Un compuesto preferido ejemplar es el agonista de LXR, el ácido 2- (3- (3- (N- (2-cloro-3-/trifluorometil) bencil) -N- (2, 2-difeniletil) amino) propoxi ) fenil) acético (GW3965) , un fármaco precursor del mismo o una sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable del mismo. Otro agonista de LXR preferido es la N- (metil) -N- [4- [2, 2, 2-trifluoro-l-hidroxi-1- (trifluorometil) etil] fenil] -bencensulfonamida, o un fármaco precursor del mismo o una sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable del mismo. Un agonista de LXR preferido adicional es N- (2 , 2 , 2-trifluoroetil) -N- [4- [2, 2, 2-trifluoro-l-hidroxi-1- (trifluorometil) etil] fenil] -bencensulfonamida (T0901317), un fármaco precursor del mismo o una sal , solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable del mis o . La administración del agonista de LXR al paciente sujeto incluye tanto la autoadministración como la administración por otra persona. El paciente puede estar en necesidad de tratamiento para una enfermedad o condición médica existente, o puede desear tratamiento profiláctico para evitar o reducir el riesgo de enfermedades y condiciones médicas afectadas por una alteración en el metabolismo de los huesos. El agonista de LXR se puede suministrar al paciente sujeto por vía oral, transdérmica, vía inhalación, inyección, nasalmente, por vía rectal, o vía formulación de liberación sostenida. Una cantidad terapéuticamente eficaz preferida del agonista de RLX para administrar a un paciente sujeto es aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg administrados de uno a tres veces al día. Por ejemplo, un régimen eficaz del presente método puede administrar aproximadamente 5 mg a aproximadamente 1000 mg del agonista de LXR desde una vez a tres veces al día. No obstante, se comprenderá que el nivel de dosis específica para cualquier paciente sujeto particular dependerá de una diversidad de factores que incluyen la edad, peso corporal, salud general, sexo, dieta, momento de administración, vía de administración, velocidad de excreción, combinación con otros medicamentos y gravedad de la deficiencia particular de osteoblastos. Una consideración de estos factores se encuentra dentro del alcance de un médico habitualmente experto, con el propósito de determinar la cantidad de dosificación terapéuticamente eficaz y profilácticamente eficaz que se necesita para evitar, contrarrestar o suprimir el avance de la condición. Un régimen preferido del presente método comprende la administración de una cantidad eficaz estimulante de diferenciación de osteoblastos de un agonista de LXR a un paciente sujeto durante un período de tiempo suficiente para reestablecer la homeostasis ósea normal y posteriormente mantener dicha homeostasis. Una modalidad especial del método comprende la administración de una cantidad eficaz estimulante de diferenciación de osteoblastos de un agonista de LXR a un paciente sujeto susceptible del desarrollo de osteoporosis para evitar el inicio de osteoporosis. Otro aspecto de la presente invención se relaciona con una composición que promueve la homeostasis ósea que comprende una cantidad eficaz estimulante osteogénica de un agonista de LXR en mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable.
La invención se relaciona con el uso de un agonista de LXR en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades relacionadas con las huesos . Un medicamento preferido es útil para el tratamiento de osteoporosis. Algunos de los agonistas de LXR útiles en la presente invención son básicos y tales agonistas son útiles en forma de la base libre o en forma de una sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable del mismo. Las sales de adición de ácido son una forma más conveniente de uso y en la práctica, el uso de la forma de sal inherentemente constituye el uso de la forma de base libre. Los ácidos los cuales pueden ser utilizados para preparar las sales de adición de ácido incluyen preferiblemente aquellos los cuales producen, cuando se combinan con la base libre, sales farmacéuticamente aceptables es decir, sales cuyos aniones son no tóxicos para el paciente en las dosis farmacéuticas de las sales, de manera que los efectos inhibidores benéficos inherentes en la base libre no son viciados por efectos secundarios adjudicables a los aniones . Aunque se prefieren sales farmacéuticamente aceptables de dichos compuestos básicos, todas las sales de adición de ácido son útiles como fuentes de la forma de base libre incluso si la sal particular, por sí misma, se desea únicamente como un producto intermediario, como por ejemplo, cuando la sal se forma únicamente con propósitos de purificación e identificación, o cuando se utiliza como un intermediario en la preparación de una sal farmacéuticamente aceptable por procedimiento de intercambio de iones . En particular, las sales de adición de ácido se pueden preparar al hacer reaccionar separadamente el compuesto purificado en su forma de base libre con un ácido orgánico o inorgánico adecuado y el aislamiento de la sal formada de esta manera. Las sales farmacéuticamente aceptables dentro del alcance de la invención incluyen aquellas derivadas de ácidos minerales y ácidos orgánicos. Las sales de adición de ácido ejemplares incluyen las sales de bromhidrato, clorhidrato, sulfato, bisulfato, fosfato, nitrato, acetato, oxalato, valerato, oleato, palmitato, quinatos, estearato, laurato, borato, benzoato, lactato, fosfato, tosilato, citrato, maleato, fumarato, succinato, tartrato, naftilato, mesilato, glucoheptonato, lactiobionato, sulfamatos, malonatos, salicilatos, propionatos, metilen-bis-ß-hidroxinaftoatos, gentisatos, isetionatos, di-p-toluiltar-tratos, metanosulfonatos, etanosulfonatos, bencensulfonatos, p-toluensulfonatos, ciclohexilsulfamatos y laurilsulfonato. véase, por ejemplo, S.M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts," J. Pharm . Sci . , 66, 1-19 (1977), la cual se incorpora en la presente como referencia . Cuando los compuestos agonistas de LXR útiles de la presente invención están sustituidos con una porción acida, se pueden formar sales de adición de base y simplemente son una forma para uso más conveniente y en la práctica, el uso de la forma de sal inherentemente constituye el uso de la forma de ácido libre. Las bases las cuales pueden ser utilizadas para preparar las sales de adición de base incluyen preferiblemente aquellas las cuales producen, cuando se combinan con el ácido libre, sales farmacéuticamente aceptables, es decir, sales cuyos cationes son no tóxicos para el paciente en dosis farmacéuticas de las sales, de manera que los efectos inhibidores benéficos inherentes en la base libre no se vician por los efectos secundarios adjudicables a los cationes. Las sales de adición de base también se pueden preparar al hacer reaccionar separadamente el compuesto purificado en su forma acida con una base orgánica o inorgánica adecuada derivada de sales de metal alcalino y alcalinoterreo y aislamiento de la sal formada de esta manera. Las sales de adición de base incluyen sales de metal y amina farmacéuticamente aceptables. La sales de metal adecuadas incluyen sales de sodio, potasio, calcio, bario, zinc, magnesio y aluminio. Se prefieren las sales de sodio y potasio. Las sales de adición de base inorgánicas adecuadas se preparan a partir de bases metálicas las cuales incluyen hidruro de sodio, hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de calcio, hidróxido de aluminio, hidróxido de litio, hidróxido de magnesio, hidróxido de zinc y similares. Las sales de adición de base de amina adecuadas se preparan a partir de aminas las cuales tienen basicidad suficiente para formar una sal estable y preferiblemente incluyen aquellas aminas las cuales se utilizan frecuentemente en química medicinal debido a su baja toxicidad y su aceptabilidad para uso médico. El amoníaco, etilendiamina, N-metil-glucamina, lisina, arginina, ornitina, colina, N,N' -dibencil-etilendiamina, cloroprocaína, dietanolamina, procaína, N-bencilfenetilamina, dietilamina, piperazina, tris (hidroxi-metil ) -aminometano. hidróxido de tetrametilamonio, trietil-amina, dibencilamina, efenamina, deshidroavietilamina, N-etilpiperidina, bencilamina, tetrametilamonio, tetraetilamonio, metilamina, dimetilamina, trimetilamina, etilamina, aminoácidos básicos, por ejemplo lisina y arginina y diciclohexilamina. Los agonistas de LXR o fármacos precursores de los agonistas de LXR utilizados de acuerdo con la presente invención, ya sea que se administren por separado o como una composición farmacéutica de la presente invención, se pueden formular de acuerdo con métodos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles. Las composiciones farmacéuticas basadas en los agonistas de LXR se pueden formular para una variedad de vía de administración que incluyen, por ejemplo, las formas administrables por vía oral tales como comprimidos, cápsulas similares, o vía parenteral, intravenosa, intramuscular, transdérmica, bucal, subcutánea, por supositorio u otra ruta.
En algunas formas de dosificación farmacéutica, algunos de los agonistas de LXR presentes pueden ser más apropiados que otros compuestos, dependiendo de la vía de administración y el sitio objetivo dentro del paciente. Las composiciones de la invención se pueden formular de manera que proporcionen liberación rápida, sostenida o retrasada del ingrediente activo después de la administración al paciente mediante la utilización de procedimientos conocidos en la técnica. Las formulaciones se describen en un gran número de fuentes que son bien conocidas y que están disponibles por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Science (Martín E W [1995] Easton Pa. , Marck Publishing Company, 19.sup.th ed. ) describe formulaciones las cuales pueden ser utilizadas en relación con la presente invención. Al preparar composiciones farmacéuticas en forma de dosificación oral de acuerdo con la presente invención, se puede utilizar cualquiera de uno o más de los medios farmacéuticos habituales. De esta manera, para preparaciones orales líquidas tales como suspensiones, elíxires y soluciones, los portadores y aditivos adecuados incluyen agua, glicoles, aceites, alcoholes, agentes saborizantes, conservadores, agentes colorantes y similares, son los que se pueden utilizar. Para preparaciones orales sólidas tales como polvos, comprimidos, cápsulas y para preparaciones sólidas tales como supositorios, los portadores y aditivos adecuados incluyen almidones, portadores de azúcar tal como dextrosa, manitol, lactosa y portadores relacionados, de los diluyentes, agentes granulantes, lubricantes, aglutinantes, agentes desintegrantes y similares son los que se pueden utilizar. Si se desea, las tabletas o cápsulas pueden someterse a recubrimiento entérico o liberación sostenida por técnicas estándar. Cuando sea apropiado, las formulaciones de dosificación unitaria para administración oral se pueden microencapsular . La formulación también se puede preparar para prolongar o sostener la liberación, tal como por ejemplo mediante recubrimiento o incrustación en material particulado en polímeros, cera o similares. Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen, por ejemplo soluciones para inyección estéril acuosa, la cual puede contener antioxidantes, amortiguadores, bacterioestáticos y solutos que vuelvan a la formulación isotónica con la sangre del receptor propuesto; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas las cuales pueden incluir agentes que mejoren la suspensión y agentes espesantes . Las formulaciones pueden presentarse en recipientes de dosis únicas o de dosis múltiples, por ejemplo ampolletas selladas y frascos y se pueden almacenar en condición liofilizada que requiere únicamente la condición del portador líquido estéril, por ejemplo agua para inyecciones, antes de su uso. Las soluciones y suspensiones de inyecciones extemporáneas se pueden preparar a partir de polvo estéril, granulos, tabletas, etcétera. Debe entenderse que además de los ingredientes mencionados de manera particular en lo anterior, las formulaciones de la presente invención pueden incluir otros agentes convencionales en la técnica que hayan considerado el tipo de formulación en cuestión. Las composiciones farmacéuticas tópicas pueden estar en forma de una solución, crema, ungüento, espuma, gel, loción, polvo o formulación en aerosol adaptada para aplicación en la piel. La preparación tópica que contiene los agonistas de LXR o fármacos precursores de los agonistas de LXR se pueden mezclar con una diversidad de materiales portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Cuando el excipiente sirve como un diluyente, puede ser un sólido, semisólido o líquido el cual actúa como un vehículo, portador o medio para el ingrediente activo. Por lo tanto, las composiciones pueden estar en forma de polvos, suspensiones, emulsiones, soluciones, jarabes, soluciones alcohólicas, ungüentos, limpiadores tópicos, cremas limpiadoras, geles para la piel, lociones para la piel, espumas, rodillos aplicadores, aerosoles o aspersores sin aerosol en formulaciones en crema o gel y cápsulas de gelatina suave .
Para formulaciones parenterales, el portador puede comprender agua estéril o una solución acuosa de cloruro de sodio en combinación con otros ingredientes que ayudan en la dispersión, tal como etanol y otros solventes farmacéuticamente aceptables. Por ejemplo, cuando las soluciones se van a utilizar y se mantienen como estériles, las composiciones y el portador también deben ser esterilizadas. Las suspensiones inyectables también se pueden preparar en cuyo caso se pueden utilizar portadores líquidos apropiados, agentes que mejoran la suspensión y similares. Ejemplo A Formulación de tableta oral Se preparan tabletas que comprenden los siguientes ingredientes, en partes en peso: GW3865 (como sal de K+) 10 partes Monohidrato de lactosa 64 partes Almidón de maíz 20 partes Polivinilpirrolidona (Polyvidone K 30) 5 partes Estearato de magnesio 1 parte El compuesto activo, el monohidrato de lactosa y el almidón de maíz se tamizan a través de un tamiz de 0.63 mm, se mezclan en un mezclador de cubo durante 10 minutos, se granulan con una solución acuosa de polivinilpirrolidona en agua (50 g en 200 ml de agua) , se secan, se les ajusta el tamaño a través de un tamiz de 0.8 mm junto con estearato de magnesio, se mezclan y se comprimen en comprimidos que tienen un diámetro de 6 mm y un peso promedio de 100 mg utilizando una prensa convencional de comprimidos tal como una prensa excéntrica Korsch EK 0. Ejemplo B Formulación liquida oral Se prepara una formulación líquida administrable por vía oral que comprende los siguientes ingredientes, en partes en peso: T0901317 10 partes Sorbato de potasio 10 partes Citrato de sodio 6 partes Ácido cítrico 2 partes Cloruro de sodio 2 partes Sacarosa 200 partes Se utiliza agua suficiente para obtener un volumen de solución que contiene 10 g de T0901317 por litro de solución. Todos los ingredientes sólidos se disuelven en agua, se filtran a través de una membrana de 0.23 micrómetros y se suministran como relleno en botellas. Una cantidad de 1 ml de la solución resultante contiene 10 mg de T0901317. Se puede obtener dosificación individual al administrar volúmenes individuales de la solución al paciente. Ejemplo 3 Formulación de aspersión nasal Se prepara una formulación de aspersión nasal que comprende los siguientes ingredientes, en partes en peso: T0901317 80 partes Cloruro de benzalconio 1 parte Monooleato de polioxietilensorbitan (20) (Polysorbate 80) 80 partes Carboximetilcelulosa de sodio 80 partes (Tylose, TM. C 30) Fosfato ácido disódico 72 partes Fosfato diácido de sodio 32 partes Dextrosa 240 partes Se utiliza suficiente agua purificada para obtener un volumen que contiene 10 g de T0901317 por litro de solución. Todos los ingredientes sólidos se disuelven en el agua, se filtran a través de una membrana de 0.5 micrómetros y se suministran como relleno en botellas tapadas por una bomba de aspersión con una cámara de suministro volumétrico de 100 µl, para administración nasal. Se pueden preparar supositorios que contienen el agonistas de LXR o un fármaco precursor del agonistas de LXR al fundir 95 g de base de supositorio disponible comercialmente a aproximadamente 40 a 45°C, agregar 3 g de ácido salicílico o mandélico, seguido por la adición, mientras se agita, de 2 g del ingrediente agonista de LXR y al verter la mezcla en moldes.
Estudio experimental detallado que relaciona los agonistas de LXR y la diferenciación de osteoblastos Ejemplo 1 Cribado de bibliotecas FLeXSelect para moduladores de fosfatasa alcalina endógena en MPC humanos primarios Materiales: Constructos adenovirales: Ad-BMP2 : descrito en el documento WO 03/018799 Ad-eGFP: al que se hace referencia como pIPspAdApt6-EGFP en WO 02070744 Ad-LacZ : al que se hace referencia como pIPspAdApt6-lacZ en WO 02070744 Ad-empty: al que se hace referencia como virus vacío (generado a partir de pIPspAdApt 6) en WO 02070744 Ad-hCAR: ADNc para hCAR que se aisla utilizando una metodología de PCR. Se utilizan los siguientes cebadores específicos para hCAR: HuCAR_for 5'-GCGAAGCTTCCATGGCGCTCCTGCTGTGCTTCG-3' y HuCAR_rev 5'-GCGGGATCCATCTATACTATAGACCCATCCTTGCTC-3 ' . El ADNc para hCAR es amplificado por PCR a partir de una biblioteca de ADNc de células HeLa (Quick clone, Clontech) . Se obtiene un fragmento único de 1119 pb (pares de bases) y se digiere con las enzimas de restricción HindIII y BamHI . El vector pIPspAdapt6 (W099/64582) se digiere con las mismas enzimas, se purifica en gel y se utiliza para ligarlo al fragmento de hCAR digerido por PCR. Se generan virus AdC20 (Ad5/Ad51) como se describe en WO02/24933; H4-2: descrito como DLL4_vl en WO03/018799 H4-291: SPINTl_vl . se prepara ADNc a partir de ARN aislado de placenta humana y se clona en el plásmido pIPspAdapt6 utilizando los sitios de restricción Sall-Notl como se describe en WO02/070744. La proteína codificada por H4-291 es idéntica a NP_003701. Principio del Ensayo Las células progenitoras de mesénquimal (MPC, por sus siglas en inglés) se diferencian en osteoblastos en presencia de factores apropiados (por ejemplo BMP2) . SE desarrolló un ensayo para el cribado de dichos factores al monitorear la actividad de la enzima fosfatasa alcalina (AP, por sus siglas en inglés) , un marcador temprano en el programa de diferenciación de osteoblastos. Se siembran los MPC en placas de 384 pozos y se coinfectan simultáneamente un día después con adenovirus que codifica para el receptor humano de coxsackie y de adenorivus (hCAR; Ad-hCAR) y adenovirus individuales (Ad-cDNA) a partir de la colección de sustitución adenoviral distribuida que contiene secuencias de ADNc que corresponden a los genes de las clases "sensibles a medicamentos" como GPCR, cinasas, proteasas, fosfodiesterasas y receptoras de hormona nuclear (la colección FLeXSelect) . La mayor parte de estos ADNc se obtienen por el enfoque basado en PCR. Brevemente, los cebadores de PCR se diseñan para amplificación del marco de lectura abierto completo a partir del codón de inicio ATG al codón de detención de genes sensibles a medicamentos, en base en datos de secuencias presentes en la base de datos RefSeq. Los cebadores se mezclan en un formato arregado en una concentración lista para PCR, en placas de 96 pozos. Como una plantilla para las regiones de PCR, se utilizan bibliotecas de ADNc de placenta, hígado fetal, cerebro fetal y médula espinal (de Invitrogen o Edge Biosystems) . Para los genes codificados por un exón único, las reacciones por PCR también se realizan en ADN genómico humano. Después de las reacciones de amplificación, los productos de PCR se purifican con un sistema de limpieza de PCR de 96 pozos (Wizard magnesil, Promega, Madison, Wl, E.U.A.), digerido con enzimas de restricción apropiadas (sitios de restricción AscI, Notl o Salí se incluyen en los cebadores) y se clonan directamente en el plásmido adaptador adenoviral pIspAdAdapt-10-Zeo (descrito en el documento de E.U.A. 6,340,595) utilizando el equipo de ligación de ADN, versión 2 (TaKaRa, Berkeley, Ca, E.U.A.). Después de una transformación y etapa de selección, los clones múltiples por gen, uno de los cuales se verifica su secuencia, se utilizan para la preparación del ADN plasmídico y generación subsecuente de adenovirus de acuerdo con el procedimiento descrito en WO 99/64582. Se encontró que la coinfección con AdC20-hCAR (MOI 250) incrementa la eficiencia de infección de AdCOl-cDNA. Se determina la actividad de AP celular 6 días después de la infección (o adición de ligando - véase abajo) . En la figura 2 se muestra el principio de los ensayos . Las células madre de mesénquimal derivadas de médula ósea se infectan con los virus de la biblioteca de ADNc FLeXSelect" en presencia del virus Ad5-C15-hCAR o Ad5C20-hCAR. Seis días después del inicio de la infección o tratamiento con un ligando, se mide la actividad de fosfatasa alcalina endógena seguido por adición de sustrato de heptafosfato de 4-metilumbeliferilo (MUP) . Desarrollo del Ensayo Se aislan los MPC de médula ósea de voluntarios sanos, que se obtiene después de consentimiento informado (Cambrex/Biowihttaker, Verviers, Bélgica) . En una serie de experimentos llevados a cabo en placas de 384 pozos se optimizan varios parámetros: densidad de siembra de células, multiplicidades de infección (MOI, por sus siglas en inglés) de los virus control (Ad-BMP2 o Ad-eGFP) , MOI de Ad-hCAR, duración de infección, toxicidad, eficiencia de infección (utilizando Ad-eGFP) en el día de lectura. El siguiente protocolo resulta en un intervalo dinámico más alto para el ensayo con la menor desviación estándar en la señal de fondo: se siembran: MPC en el día 0 a 1000 células por pozo de una placa de 384 pozos y se coinfectan al siguiente día utilizando una mezcla de AdC20-hCAR y 2 µl de virus control Ad- Los concentrados de los virus control Ad se generan en placas de 96 pozos (placa control) . El volumen de 2 µl corresponde a la MOI teórica de 5000. Los controles son: Pl=Ad-BMP2 ; P2=Ad-H4-2; P3=Ad.H4-291; Nl=Ad-LacZ; N2=Ad-empty; N3=Ad-eGFP. Lasub-regulación por activación de fosfatasa alcalina se lee a los 6 días después de la infección (6 dpi, por sus siglas en inglés) : se agregan 15 µl de fosfato de 4-metilumbeliferilo (MUP; Sigma) a cada pozo, las placas se incuban durante 15 min a 37°C y se monitorean para determinar actividad de AP utilizando un lector de placa de fluorescencia (Fluostar, BMG) . El pipeteo de los virus a partir de placas de 96 pozos (que contienen virus control) o placas de 384 pozos (que contiene virus FLeXSelect (véase el siguiente párrafo) ) en placas de 384 pozos que contienen MPC se realiza utilizando robótica (surtidor de canal 96/384 Tecan Freedom 200 equipado con TeM096, TeM0384 y RoMa, Tecan AG, Suiza) . La figura 3 muestra los resultados del procedimiento de cribado automatizado utilizando la placa control. La media y las desviaciones estándar de los controles negativos (N1-N3) se utilizan para calcular el límite para el análisis de aciertos. Los controles positivos (Pl, P2, P3) habitualmente calificados en 80-100% de pozos infectados (figura 3). Los virus de control negativo habitualmente califican con 0-5% de los pozos infectados (figura 3). Bibliotecas FLeXSelect Galápagos Genomics NV (Galápagos) construye bibliotecas adenovirales distribuidas de sustitución registradas (FLeXSelect) que codifican para la mayor parte de los genes sensibles a medicamentos presentes en el genoma humano. El ensayo de fosfatasa alcalina es útil para cribado de virus a partir de la colección FLeXSelect (Ad-cDNA) para aquellas clases de objetivos sensibles a medicamentos que pueden ser activados por un compuesto, por ejemplo receptores acoplados a proteína G (GPCR, por sus siglas en inglés) y receptores de hormona nuclear (NHR, por sus siglas en inglés) . Para un subconjunto de los Ad-GPCR presentes en la biblioteca FLeXSelect, una colección coincidente de ligandos se prepara en placas de 96 y 384 pozos, de manera tal que se puede utilizar el equipo robótico para pipetear un par coincidente de Ad-GPCR y un ligando desde los concentrados respectivos en un pozo de una placa de 384 pozos que contienen los MPC. Cribado Los virus FLeXSelect, en presencia o ausencia de ligandos coincidentes, se criban de acuerdo con el protocolo descrito en lo anterior por duplicado en dos cribas independientes, cada una con una muestra singular agregada sobre una placa diferente. Si se incluyen ligandos en el cribado, se modifica el protocolo: la infección por Ad-cDNA se lleva a cabo en el día 1, los ligandos se agregan en el día 2 y se miden las concentraciones de BAP endógeno en el día 8. En la figura 4 se muestra un resultado típico de una placa de cribado de 384 pozos. En la figura 4 se indican las posiciones en la placa de 384 pozos en el eje de las abscisas y las señales de fosfatasa alcalina relativa en el eje de las ordenadas. La señal de fosfatasa alcalina relativa para una muestra dada se calcula como el número de desviaciones estándar por encima de la media para todos los puntos de datos en un lote (o experimento) dado. Ejemplo 2 Identificación del Objetivo Utilizando el Ensayo AP Los objetivos se seleccionan de acuerdo con los siguientes criterios de selección: i) Señales AP mayores que la media más 3 veces la desviación estándar de todas las muestras (puntos de datos) en el lote. Los dos puntos de datos individuales dentro de cada lote se analizan independientemente. 2) Señales AP positivas, como se definen por el criterio 1, para al menos dos de cuatro o tres de las cuatro muestras de virus que son cribadas por duplicado en dos experimentos independientes (total de 4 mediciones por virus) . En la tabla 1 se incluyen los objetivos identificados de acuerdo con los criterios anteriores en el ensayo de fosfatasa alcalina. Para algunos de los objetivos, se conocen los ligandos agonistas. Estos pueden ser utilizados para validar el potencial osteogénico de los genes objetivo en los PMC: la adición de concentraciones cada vez mayores de ligando al medio de los MPC (sobre expresión de la proteína objetivo) puede incrementarse dependiendo de la dosis en lasub-regulación por aumento de la actividad endógena de fosfatasa alcalina. Esto se observa, por ejemplo, cuando los MPC se infectan con Ad-NR1H3 y se tratan con T0901317 y cuando los MPC se infectan con Ad-GPR65 y se tratan con 1-b-D-galactosilesfingosina y cuando los MPC se infectan con Ad-AVPR2 y se tratan con [desamino-Cysl, D-Arg8] -vasopresina. Ad-NR1H3 y T0901317 En las figuras 5A-5C se presentan estas curvas de dosis-respuesta. Una curva de dosis-respuesta para la actividad de AP se genera para los MPC infectados con Ad-NR1H3 y se trata con T0901317 (figura 5A) . Se siembran los MPC en el día 0 a 1000 células por pozo de una placa de 384 pozos y se coinfecta el día siguiente utilizando AdC51-hCAR (MOI 250) y diferentes MOI de Ad5-NR1H3 (MOI 12000, 4000, 1333, 444). En el día 1, 5 concentraciones (1 x 10"10M, 1 x 10"9M, 1 x 10"8M, 1 x 10"7M, 1 x 106M) del compuesto T0901317 (Cayman Chemical, Michigan, E.U.A., Cat. No. 71810) con concentración de vehículo fijo (el vehículo es DMSO a la concentración que es de 0.01%) se agregan a los pozos. Después de incubación durante 6 días a 37°C, C02 10% en un incubador humidificado, se lee lasub-regulación por aumento de fosfatasa alcalina: se agregan 15 µl de MUP a cada pozo, se incuban las placas durante 15 min a 37°C y se monitorean para determinar la actividad de AP utilizando un lector de placa de fluorescencia (Fluostar, BMG) . Se generan curvas de dosis-respuesta para actividad de AP de una manera similar para los MPC infectados con Ad-GPR65 y tratados con 1-b-D-galactosilesfingosina (figura 5B) ; para los MPC infectados con Ad-AVPR2 y tratados con [desaminao-Cysl, D-Arg8] -vasopresina (DDAVP) (figura 5C) . Se identifican tres objetivos que muestran unasub-regulación por aumento, dependiente de la dosis, de la actividad AP en el ensayo de AP, cuando se agregan ligandos respectivos en concentraciones diferentes. AdNRlH3 y GW3965 Se observa una relación de dosis-respuesta para la actividad de AP cuando los MPC se infectan con Ad-NR1H3 y se tratan con GW3965 (figura 9) . Se siembran los MPC en el día 0 a 1000 células por pozo de una placa de 384 pozos y se - 5? coinfectan el día siguiente utilizando AdC51-hCAR (MOI 250) a MOI diferentes y Ad5-NR1H3 (MOI 2000, 666) . En el día 1 se agregan a los pozos 8 concentraciones (3.43 x 10"9M, 1.34 x 10" 8M, 5.35 x 10"8M, 1.60 x 10~7M, 4.81 x 10"7M, 1.43 x 10"6M, 4.29 x 10~6M, 13 x 10"6M) del compuesto GW3965 (Chemovation, West Sussex) con concentración de vehículo fijo (DMSO a concentración final de 0.01%). Después de 6 días, se separa el medio y se sustituye con medio fresco que contiene las mismas concentraciones del compuesto GW3965. Se realizan las lecturas de la actividad de AP en diferentes puntos en el tiempo después del inicio del experimento, típicamente después de 7, 10 y 13 días. Lasub-regulación por aumento de la actividad de fosfatasa alcalina se lee, como sigue: se separa el medio a partir de las monocapas, se agregan a cada pozo 15 µl de MUP, las placas se incuban durante 15 min a 37°C y después se leen para actividad de AP utilizando un lector de placa de fluorescencia (Fluostar, BMG) . La figura 9 ilustra la actividad dosis-respuesta de GW3965 en presencia de Ad-NR1H3. AdNRlH2 y T0901317 se observa una relación de dosis-respuesta para la actividad de AP cuando se infectan los MPC con Ad-NR1H2 y se tratan con T0901317 (figura 10) . Se siembran los MPC en el día 0 a 1000 células por pozo de una placa de 384 pozos y se coinfectan a día siguiente utilizando AdC51-hCAR (MOI 250) y diferentes MOI de Ad5-NR1H3 (MOI 2000, 666). En el día 1, se agregan 5 concentraciones (1 x 1Q~9M, 1 x 10~8M, 1 x 10"7M, 1 x 10"6M, 1 x 10"5M) del compuesto T0901317 (Cayman Chemical, Michigan, E.U.A., Cat. No. 71810) con concentración de vehículo fijo (DMSO a concentración final de 0.1%) a los pozos. Después de 6 días, se retira el medio y se sustituye con medio fresco que contiene las mismas concentraciones del compuesto T0901317. La lectura de la actividad de AP se realizan en diferentes pulsos en el tiempo después del inicio del experimento, típicamente después de 7 , 10 y 13 días. Lasub-regulación por aumento de la actividad de fosfatasa alacalina se lee como sigue: se retira el medio de las monocapas, se agregan a cada pozo 15 µl de MUP, se incuban las placas durante 15 min a 37°C y después se leen para determinar la actividad de AP utilizando un lector de placa de fluorescencia (Fluostar, BMG) . La figura 10 ilustra la actividad de dosis-respuesta de T0901317 en presencia de Ad-NR1H2. En conclusión, la actividad de AP es regulada por aumento en células sometidas a traducción ya sea con NR1H3 y NR1H2 , de una manera dependiente de la dosis cuando se agregan los agonistas de LXR: GW3965 y T0901317, respectivamente, a las células en concentraciones diferentes en el ensayo de AP.
Ejemplo 3 Análisis de expresión de ARNm y de proteina para los objetivos identificados El ensayo que se presenta en el ejemplo 1 demuestra el descubrimiento de proteínas con potencial osteogénico ante la sobreexpresión. Con el fin de confirmar que estas proteínas se expresan de manera endógena en células formadoras de hueso tales como los MPC u osteoblastos humanos primarios (hOB, por sus siglas en inglés) se extrae ARNm de estas células y se analiza la expresión utilizando RT-PCR en tiempo real. Los niveles de expresión de los genes objetivo se determinan en 4 aislados diferentes de MPC y 2 aislados diferentes de hOB. Los MPC (obtenidos de médula ósea humana (Cambrex/Biowhittaker, Vervies, Bélgica) y los hOB (obtenidos de (Cambrex/Biowhittaker, Verviers, Bélgica) se siembran a 3000 resp, 5000 células/cm2 en matraces T180 y se cultivan hasta que alcanzan 80% de confluencia. Las células se lavan con PBS enfriado con hielo y se cosechan al agregar 1050 µl de amortiguador de Lysis ARN SV al matraz T180. Se prepara ARN total utilizando el sistema de aislamiento de ARN total SV (Promega, Cat # Z3100) . Se mide la concentración del ARN total con el equipo de cuantificación de ARN Ribogreen (Molecular Probes, Leiden, Países Bajos cat. No. R-11490) . Se realiza la síntesis de ADN utilizando 40 ng de ARN total por reacción utilizando la mezcla maestra de PCR universal TaqMan el equipo No AmpErase UNG (Applied Biosystems, Warrington. Reino Unido, número de parte 4324018) . Para cada reacción de transcriptasa inversa (RT) , se realiza una reacción de menos -RT (control negativo: no se incluyen enzimas en la reacción). La reacción de PCR de transcriptasa inversa en tiempo real (rtRT) se realiza con los cebadores específicos de gen (tabla 2) que muestra tanto de ADNc como menos-RT utilizando la mezcla maestra de PCR SYBR Green (Applied Biosystems, Warrington. Reino Unido, número de parte 4309155) . Los cebadores son de calidad controlada al realizar las reacciones de PCR sobre ADN genómico humano y sobre plásmidos que contienen el ADNc codificado por el gen estudiado. Si la calidad es insatisfactoria, se diseñan cebadores adicionales o se validan conjuntos de cebador que se adquieren (ABl) . Para la normalización de los niveles de expresión se realiza una reacción de RT-PCR en ß-actina humana utilizando el equipo de ß-actina humana (Applied Biosystems, Warrington. Reino Unido; parte humana 4310881E) . El siguiente programa se corre en un aparato de PCR en tiempo real (ABl PRISM 7000 Sequence Detection System) : 10 min a 25°C, 30 min a 48°C, 5 min a 95°C. Los niveles de expresión para los genes objetivo en los MPC múltiples y los aislados de hOB se comparan con los niveles de expresión de ß-actina.
Tabla 2 Cebadores utilizados para el análisis de expresión de los gene s ob j et ivo Ejemplo 4 Análisis de la sub-regulación por aumento de ARNm para AP óseo endógeno versus ARNm para AP placentario o intestinal La fosfatasa alcalina ósea (BAP, por sus siglas en inglés) es una fosfatasa alcalina fisiológicamente relevante (AP) involucrada en la formación de hueso. Con el fin de determinar si las actividades de AP medidas se deben asub- regulación por aumento de expresión de BAP o de otra AP, se analizan los niveles de ARNm para todos los genes de AP después de la infección de MPC . Se determinan los niveles de ARNm como se describe en la sección previa. La diferencia en el conjunto de cebador utilizado (tabla 3): un conjunto detecta la expresión de ARNm para BAP ALPL (fosfatasa alcalina humana de hígado/hueso/riñón) . Otro conjunto detecta la expresión de otros 3 genes de AP (ALPI (fosfatasa alcalina humana intestinal), ALPP (fosfatasa alcalina humana placentario (PLAP) ) , ALPPL2 (fosfatasa alcalina humana similar a placentaria) ) . ALPI, ALPP y ALPPL2 son altamente similares a nivel nucleotídico y por lo tanto se pueden amplificar utilizando un par cebador. Tabla 3 Conjuntos de cebador utilizados para analizar la expresión de ARNm de diferentes isoformas de fosfatasa alcalina Los pares de cebadores primero se validan en ARN aislado de los MPC infectados con Ad-eGFP y Ad-BMP2. La figura 6 ilustra la fuertesub-regulación por aumento de ARNm para BAP por Ad-BMP2 en ausencia desub-regulación por aumento de la expresión de cualquiera de los otros genes para AP. Ambos conjuntos de cebadores después se utilizan para medir los niveles de ARNm para todos los genes de AP en ARN aislado de los MPC infectados con ADN-objetivo . Ejemplo 5 Análisis de los niveles de expresión de NR5A2, NR1H3, NR1H2, ESRRG en tipos de células relevantes para la formación de hueso Para confirmar que los genes objetivo identificados se expresan de manera endógena en los tipos de células que se relacionan con la formación de hueso, se determinaron los niveles de ARNm para estos genes en los tipos de células relevantes . Las células primarias son líneas de células (figura 14A a la figura 14D) : aislados 1-4 de MPC, ostoblastos de bóveda craneal (MCOst pop 1+2, 3+4)), líneas de células de osteoblastos humanos (SaOS2, U20S) se cultivan o se cosecha tejido de bóveda craneana de ratones de 5 días de edad. Las monocapas de tejido de bóveda craneal se cosecha y el ARN total se extrae (sistema de aislamiento de ARN total SV Promega # Z3100) y se cuantifican (Ribogreen RNA Quantification kit, Molecular Probes, Leiden) . La síntesis de ADNc se realiza utilizando 20 ng de ARN total por reacción utilizando el mezclador maestro de PCR universal TaqMan, equipo No AmpErase UNG; (Applied Biosystems, Warrington. Reino Unido, parte número 4324018) . Para cada reacción de transcriptasa inversa (RT) , se realiza una reacción menos RT (control negativo: no se incluye enzima en la reacción) . La reacción de transcriptasa inversa en tiempo real (rtRT)-PCR se realiza con los cebadores específicos de gen en ambas muestras, de ADNc y menos-RT, utilizando la mezcla maestra de PCR SYBR Green (Applied Biosystems, Warrington, Reino Unido, parte número 4309155) . Los cebadores se someten a control de calidad al realizar reacciones de PCR sobre ADN genómico humano y sobre plásmidos que contienen el ADNc codificado por el gen estudiado, si está disponible. Si la calidad es insatisfactoria, se diseñan o validan cebadores adicionales y se adquieren conjuntos de cebadores (ABl) . Para la normalización de los niveles de expresión se realiza una reacción RT-PCR en ß-actina humana utilizando el equipo de ß-actina humana (Applied Biosystems, Warrington, Reino Unido, parte número 4310881E) . Se corre el siguiente programa en un aparato de PCR de tiempo real (ABl PRISM 7000 Sequence Detection System) : 10 min a 25°C, 30 min a 48°C, 5 min a 95°C. Se comparan los niveles de expresión para los cuatro genes con los niveles de expresión de ß-actina y los resultados se muestran en la figura 14A a la figura 14D. Las figuras muestran que los valores Ct obtenidos para analizar los niveles de ARNm en diferentes tipos o tejidos de célula para ß-actina o 4 genes objetivo: n.a.: no analizado; "Sybrgreen" o "cebador ABl" indican si se utiliza un conjunto de cebador desarrollado en el laboratorio respectivamente o un conjunto de cebador disponible comercialmente para evaluar la expresión de ARNm. También se muestra la representación gráfica de los niveles de expresión diferencial de los genes objetivo versus los niveles de expresión de ß-actina (se toman los valores de las columnas izquierdas a partir de las tablas de datos) . En conclusión, los genes objetivo identificados se expresan en tipos de células múltiples relevantes a la formación ósea. Debe hacerse notar que el gen objetivo ESRRG no se expresa en aislados de MPC probados. Ejemplo 6 Actividad de los agonistas de LXR en el ensayo de BAP, sobre la expresión excesiva de NR1H2 o NR1H3 Ad-NR1H2 y GW3965 Se observa una relación de dosis-respuesta para la actividad de AP cuando los MPC se infectan con Ad-NR1H2 y se tratan con GW3965 (figura 11) . Se siembran los MPC en el día 0 a 1000 células por pozo de una placa de 384 pozos y se coinfectan el día siguiente utilizando AdC51-hCAR (MOI 250) a MOI diferentes de Ad5-NR1H2 (MOI 2000, 666). En el día 1, se agregan a los pozos 9 concentraciones (1.52 x 10"9M, 4.57 x 10" 9M, 1.37 x 10"8M, 4.12 x 10"7M, 1.23 x 10"7M, 3.7 x 10"7M, 1.11 x 10"6M, 3.33 x 10"6M, 1 x 10"5M) del compuesto GW3965 con concentración de vehículo fija (DMSO a concentración final de 0.161%). Después de 6 días se retira el medio y se sustituye con medio fresco que contiene las mismas concentraciones del compuesto GW3965. Se realiza lectura de la actividad de AP en diferentes puntos en el tiempo después del inicio del experimento, típicamente después de 7 , 10 y 13 días. Lasub-regulación por aumento de la actividad de fosfatasa alcalina se lee como sigue: se retira el medio de las monocapas, se agregan 15 µl de MUP a cada pozo, se incuban las placas durante 15 min a 37°C y después se leen para actividad de AP utilizando un lector de placa de fluorescencia (Fluostar, BMG) . La figura 11 ilustra la actividad dosis-respuesta de GW3965 en presencia de Ad-NR1H2. Ad-NR1H2 , Ad-NR1H3 y dímero acetil-podocárpico (APD, por sus siglas en inglés) Se observa una relación dosis-respuesta para la actividad de AP cuando se infectan los MPC con Ad-NR1H2 o Ad-NR1H3 y se trata con dímero de acetilpodocárpico (APD - véase la figura 12 para estructura del compuesto; APD se describe como "Compuesto 1" en el documento publicado UA2003/0086923A1, del cual la preparación de APD se incorpora como referencia) .
Se siembran MPC en el día 0 a 1000 células por pozo de una placa de 384 pozos y se coinfectan al siguiente día utilizando AdC51-hCAR (MOI 250) y diferentes MOI de Ad5-NR1H2 o Ad-NRlH3 (MOI 2000, 6000) . En el día 1 se agregan a los pozos 12 concentraciones (5.65 x 10"11 M, 1.69 x 10"10 M, 5.08 x 10"10 M, 1.52 x 10"9 M, 4.57 x 10"9 M, 1.37 x 10"8 M, 4.12 x 10"8 M, 1.23 x 10"7 M, 3.7 x 10"7 M, 1.11 x 10"6 M, 3.33 x 10"6 M, 1 x 10"5 M) del compuesto APD con concentración de vehículo fija (DMSO a concentración final de 0.1%). Después de 6 días se retira el medio y se sustituye con medio fresco que contiene las mismas concentraciones del compuesto APD. Se realizan lecturas de la actividad AP en diferentes puntos en el tiempo después del inicio del experimento, típicamente después de 7, 10 y 13 días. Lasub-regulación por aumento de la actividad de fosfatasa alcalina se lee como sigue: se separa el medio de las monocapas, se agregan a cada pozo 15 µl de MUP y se incuban las placas durante 15 min a 372C y después se leen para determinar la actividad de AP utilizando un lector de placa de fluorescencia (Fluostar, BMG) . La figura 13 ilustra la actividad dosis-respuesta de APD en presencia de Ad-NR1H2 o Ad-NR1H3. En conclusión, la actividad de AP se regula por aumento en células sometidas a transducción ya sea con NR1H3 o NR1H2 de una manera dependiente de la dosis cuando se agregan los agonistas de LXR: APD, GW3965 y T0901317, respectivamente, a las células a diferentes concentraciones en el ensayo AP. Ejemplo 7: Análisis de la vía osteogénica: NR5A2 y NR1H3 + T0901317 regulan por aumento las concentraciones de ARNm de marcadores osteogénicos La diferenciación osteogénica de los MPC en osteoblastos está acompañada por unasub-regulación por aumento de las proteínas osteogénicas . Estas últimas son útiles para estudiar la inducción de diferenciación osteogénica por un objetivo novedoso utilizando, por ejemplo, RT-PCR en tiempo real. Los MPC que se utilizan en este estudio se perfilan para lasub-regulación por aumento de un conjunto limitado de marcadores osteogénicos por BMP2. Los marcadores que muestran expresión diferencial para BMP2 posteriormente se prueban contra ARNm derivado de células infectadas con Ad-NR5A2 o derivadas de células tratadas con Ad-NR1H3+T0901317. Se siembran 100,000 MPC en cada pozo de una placa de 6 pozos en 2 ml de medio MPC que contiene FCS 10%. Al día siguiente, después de incubación de 372C, C02 10% en un incubador humidificado, se coinfectan células con AdC15-hCAR (MOI final de 750) y Ad-NR5A2 , Ad-NR1H3+T0901317 (1 µM) o Ad-BMP2 (control positivo) de Ad-eGFP o Ad-luciferasa como controles negativos (MOI finales de 1250 y 2500) . Las células se incuban a 37%, C02 10% en un incubador humidificado durante 6 días adicionales a menos que las células se hayan cosechado de antemano para aislamiento de ARN. Se retira el virus y se sustituye por 2 ml de medio OS fresco (medio registrado que contiene FCS 10%) . Durante las siguientes 3 semanas se refresca el medio 3 veces por 2 semanas. De manera alternada, se refresca en medio la mitad o completamente. Se cosechan las monocapas en diferentes puntos en el tiempo (véase la Tabla 4) , el ARN total se cosecha y cuantifica y se corre como sigue rtRT-PCR: se lavan las monocapas con PBS enfriado con hielo y se cosechan al agregar amortiguador de lisis ARN SV. El ARN total se prepara utilizando el sistema de aislamiento de ARN total SV (Promega, Cat # Z3100) . Se mide la concentración de ARN con el equipo de cuantificación de ARN Ribogreen (Molecular Probes, Leiden, Países Bajos, Cat No. R-11490) . Se realiza síntesis de ADNc utilizando 20 ng de ARN total por reacción utilizando la mezcla maestra de PCR universal TaqMan, equipo No AmpErase UNG, (Applied Biosystems, Warrington, Reino Unido, Parte número 4324018) . Para cada reacción de transcriptasa inversa (RT) se realiza una reacción menos-RT (control negativo: no se incluye enzima en la reacción). La reacción de transcriptasa inversa en tiempo real (rtRT)-PCR se realiza con cebadores específicos de gen tanto en ADNc como en muestras menos-RT, utilizando la mezcla maestra PCR SYBR Green (Applied Biosystems, Warrington, Reino Unido, Parte número 4309155). Los cebadores se someten a control de calidad al realizar reacciones de PCR sobre ADN genómico humano y sobre plásmidos que contienen el ADNc codificado por el gen estudiado, si está disponible. Si la calidad es insatisfactoria, se diseñan cebadores adicionales o se validan conjuntos del cebador y se adquieren (ABl) . Para la normalización de estos niveles de expresión se realiza una reacción RT-PCR en ß-actina humana utilizando el equipo de ß-actina humana (Applied Biosystems, Warrington, Reino Unido, Parte número 4310881E) . Se corre el siguiente programa en un aparato de PCR de tiempo real (ABl PRISM 7000 Sequence Detection System) : 10 min a 252C, 30 min a 48aC, 5 min a 952C.
Tabla 4 NR5A2 y NR1H3+T0901317 regula por aumento las concentraciones de ARNm de marcadores osteogénicos ?F* 15 ND: no determinado Los niveles de expresión para los genes de marcador osteogénico primero se normalizan para niveles de ß-actina. Los datos resultantes para las muestras de Ad-BMP2, Ad-NR5A2 y Ad-NR1H3+T0901317 (1 µM) después se comparan con los de Ad-eGFP y Ad-luciferasa como muestras de control negativo, se cosechan en los mismos puntos de tiempo para células infectadas a la misma MOI. Los múltiplos desub-regulación por aumento del ARNm para el gen marcador inducido por sobreexpresión de NR5A2 o BMP2 se calculan y se presentan en la Tabla 4. Los marcadores osteogénicos se considera que son regulados por aumento por la sobreexpresión de BMP2 , NR5A2 o NR1H3+T0901317 si su expresión es 4 veces mayor que la que se encuentra en una muestra de control negativo (Ad-eGFP O Ad-luciferasa) . Se estudió la expresión, regulada por aumento, por Ad-NR5A2 , de PTHRl, BAP, osteopontina, aromatasa y RANKL en uno o más puntos en el tiempo. Se estudió la expresión regulada por aumento por Ad-NR1H3+T0901317 de PTHRl, BAP, osteopontina, aromatasa y RANKL. Ejemplo 8 Análisis de la vía osteogénica: sub-regulación por aumento de los niveles de ARNm para NR5A2 y NR1H3 por activadores osteogénicos Se tratan los MPC con inductores establecidos de osteogénesis y se determinan los niveles de ARNm para NR5A2 o NR1H3 en un esfuerzo de colocar a NR5A2 o NR1H3 en las vías osteogénicas conocidas. Se siembran 100,000 MPC en cada pozo de una placa de 6 pozos en 2 ml de medio MPC que contiene FCS 10%. Al día siguiente, después de incubación a 37 SC, C02 10% en un incubador humidificado, las células se coinfectan con AdC15-hCAR (MOI final de 750) y Ad-BMP2 , Ad-RUNX2 , Ad-MSX2 y Ad-PTHR1/PTHLH o Ad-eGFP o Ad-luciferasa como controles negativos (MOI finales de 1250 y 2500) . De manera alternativa, las células se tratan con dexametasona (concentración final, 0.1 µM) , VitD3 (concentración final de 0.1 µM) o los controles de vehículo (EtOH 0.1% o DMSO). Las células se incuban a 372C, C02 10% en un incubador humidificado durante 6 días adicionales a menos que las células se hayan cosechado de antemano para aislamiento de ARN. Se separa el virus y se sustituye por 2 ml de medio OS fresco (medio registrado que contiene FCS 10%) . En los siguientes 18 días se refresca el medio 3 veces durante 2 semanas. De manera alternada, el medio se cambia a la mitad o completamente. Se cosechan las monocapas en varios puntos en el tiempo (véase la Tabla 5) se cosecha el ARN total y se cuantifica y se corre rtRT-PCR como se describe en el Ejemplo previo "niveles de ARNm regulados por aumento por NR5A2 y NR1H3+T0901317 de marcadores osteogénicos" . Lasub-regulación por aumento de ARNm para NR5A2 o NR1H3 en comparación con los controles negativos (vehículo para dexametasona o tratamiento con VitD3) o Ad-luciferasa - ll ¬ a ara infecciones por Ad) se calcula (Tabla 5) Tabla 5 Regulación por aumento de NR5A2 y NR1H3 de las concentraciones de ARNm por activadores osteogénicos tratamiento Los niveles de ARNM para NR5A2 se vuelven regulados por aumento por tratamiento con VitD3 en diversos puntos en el tiempo y los niveles de NR1H3 y NR5A2 por infección con Ad- PTHRl/PTHLH en el punto de tiempo 4 dpi. Ejemplo 9 Ensayo de mineralización El procedimiento de osteogénesis consiste de varios eventos sucesivos . Durante las fases iniciales de osteogénesis, BAP se vuelve regulado por aumento, mientras que la mineralización es un evento específico que se produce en etapas posteriores de osteogénesis. El tejido óseo consiste de células que se incrustan en una matriz de materiales orgánicos (por ejemplo colágeno) y materiales inorgánicos (Ca2+ y fosfato) . La mineralización ósea se muestra in vi tro por tinción de células óseas diferenciadas para la matriz que deposita. Las tinciones de Von Kossa y Alizarin RedS permite la visualización de fosfato depositado y calcio, respectivamente. En el día 1 se siembran MPC humanos en una placa de 6 pozos (Costar o Nunc) a una densidad de 50,000 a 250,000 células por pozo, típicamente 100,000 células por pozo. Se coinfectan los MPC un día después con Ad5-hCAR (MOI 750) y Ad-control (eGFP o BMP2) o virus de acierto (Ad5) (a MOI entre 250 y 20,000, típicamente a MOI de 5000 y 2500). Para los experimentos de Ad-GPCR y Ad-NHR, las células pueden ser tratadas adicionalmente con ligandos específicos. Estos se agregan a una concentración de CE50 y las concentraciones 5-10 veces mayores y menores. Los ligandos se agregan 2-3 veces a la semana. El medio suplementado con 100 µg/ml de L-ascorbato y ß-glicerofosfato 10 mM, se refresca 2 veces a la semana. 20 ó 30 días después del inicio del experimento se tiñen las células con tinción de Von Kossa o con tinción de alizarina Reds . La tinción con alizarina RedS se lleva a cabo como sigue: se lavan las células una vez con PBS, se fija con paraformaldehído 10% durante 45 minutos a 4°C y se lavan 2 veces con PBS . Las células se incuban con una solución acuosa de alizarina RedS 40 mM, pH 4.1-4.3 durante 10 minutos seguido por 5 lavados con agua destilada. Se evalúa la tinción y se fotografía utilizando luz blanca. Los ejemplos se muestran en las figuras 7 y 8. En conclusión, dos objetivos son identificados de antemano que inducen mineralización, en presencia o ausencia de sus ligandos respectivos: NR5A2 (figura 7) y NR1H3 (figura 8) . Los estudios llevados a cabo con tejido de bóveda craneal, la administración únicamente de los agonistas LXR induce la formación ósea, y de esta manera se demuestra que los agonistas de LXR son útiles en los métodos de la presente invención, incluyendo métodos para diferenciar células precursoras en osteoblastos, para estimular formación de tejido óseo y tratar o evitar enfermedades de los huesos, que incluyen tratar o prevenir osteoporosis. Los datos presentados en la figura 9 y 10 indican que los agonistas de LXR no inducen el mismo nivel de actividad de fosfatasa alcalina en ausencia de Ad-NR1H3 o Ad-NR1H2 , como en presencia de Ad-NR1H3 o Ad-NR1H2. Este hallazgo, el cual parece no concordar con los hallazgos de tejido de bóveda craneal, puede ser el resultado de muchos factores, tales como, por ejemplo, la sobreexpresión de la proteína NR1H3 o NR1H2 que puede resultar un conjunto diferente de proteínas coactivadoras de las proteínas NR1H3 o NR1H2 endógenas.
Ejemplo 10 Ensayo en bóveda craneal: actividad del agonista de NR1H3, T0901317 El hueso adulto consiste de material orgánico (por ejemplo colágeno tipo I) e inorgánico (fosfato de calcio) , de tipos de células formadoras de hueso (MPC, osteoblastos y osteocitos) y tipos de células que degradan hueso (osteoclastos) . Dado que las monocapas de MPC, utilizadas en la identificación y validación inicial de los aciertos de objetivo, no limitan el ambiente multicelular tridimensional in vivo, se desarrollaron modelos de cultivo de órgano de hueso. Los elegantes modelos ex vivo que imitan estrechamente el ambiente de los huesos in vivo son cultivos de órganos de hueso, tales como los modelos de cultivo de órgano del metatarso o de la bóveda craneal. En el primer modelo, se utilizan huesos del pie formado por osificación endocondrial. En el último modelo, se utilizan huesos de la bóveda craneal que se forman por osificación intramembranosa (véase también la figura 1) . Este ejemplo describe el último modelo, que utiliza huesos en la bóveda craneal. Se cosechan cachorros CD1 alrededor del nacimiento de ratones hembra CDl (recibidos de Janvier (Le Genest St Isle, Francia) cuando tienen 11 días de embarazo) . Los cachorros se decapitan y se extirpa la bóveda craneal y se divide en 2 mitades de bóveda craneal. Las mitades de bóveda craneal se puntean utilizando una base estéril, se pesan y se cultivan en placas de 24 pozos (medio MEMa o BGJb-Fitton-Jackson que contiene 50 µg/ml de ácido L-ascórbico (Sigma, A-4034), ß-glicerofosfato 5 mM (Sigma, G-9891) y penicilina-estreptomicina (Invitrogen Cat # 15140-122)). Se prueban moléculas pequeñas (ligandos, agonistas, antagonistas) en por lo menos tres veces a un mínimo de 3 concentraciones. Cada molécula pequeña se agrega al medio en el día 0 y se agrega nuevamente cuando se refleja el medio (cada 2-3 días) . De tres a 16 días después del inicio del experimento se pesan las bóvedas craneales nuevamente después de colocarlas en puntos utilizando una base estéril. Se calcula la diferencia en peso, se expresa como cambio de por ciento en peso y se calcula la media y las desviaciones estándar (SD, por sus siglas en inglés) para las mediciones por triplicado. Los datos se analizan utilizando una prueba t de Student. Los incrementos en peso para los controles positivos Ad-BMP2 y Ad-BMP7 se muestran en la figura 15. La formación de osteoide nuevo se analiza histológicamente como sigue: se fijan las mitades de bóveda craneal en formalina amortiguada 10% durante por lo menos 2 días, se descalcifica en EDTA 10% durante la noche, se procesa a través de alcoholes graduados y se incrusta en cera de parafina. Se preparan tres cortes de 10 µm de la bóveda craneal y se tiñen con hematoxilina y eosina (H y E) .
Las células sanas, las células muertas, el hueso viejo y nuevo y el colágeno se identifican por su morfología y coloración distintivas que se observan después de la tinción con H y E. Las superficies tomadas por estas se miden estereológicamente (lectura en µm2) y se denomina el área de osteoblastos, el área de residuos, el área de hueso nativo y nuevo, el área de colágeno y el área total (la suma de las 5 áreas anteriores) respectivamente. Además, se mide el espesor (lectura en µm) en 8 posiciones, separadas uniformemente sobre el corte. La lectura histológica del ensayo de bóveda craneal se desarrolla utilizando agentes osteogénicos conocidos. Se tratan mitades de bóveda craneal con hormona paratiroidea humana recombinante (rhPTH, por sus siglas en inglés) . La PTH tiene una acción doble en hueso: se necesita administrar PTH in vivo de manera intermitente en vez de continuamente dado que este último régimen de tratamiento resulta en resorción ósea, mientras que el primero resulta en acumulación ósea. Esta acción doble también se observa en el modelo de bóveda craneal como se esperaba: PTH a 10"7M tiene un efecto de resorción sobre tejido óseo pero induce acumulación de hueso a 10"nM. Dado que NR1H3 y T0901317 califican bien en el ensayo de AP y de mineralización, el agonista de NR1H3 , T0901317, disponible comercialmente, se prueba en el modelo de bóveda craneal para mostrar adicionalmente el potencial osteogénico del agonismo de NR1H3. Se agrega T0901317 al medio de cultivo de las mitades de bóveda craneal extirpadas, en el día de la diserción a diversas dosis (19.5, 78.1 y 313 nM) por cuadruplicado. La concentración del solvente (vehículo), DMSO, se fija a una concentración final de 0.05%. El medio, que contiene T0901317 o vehículo control se refresca cada 2-3 días. Las mitades de bóveda craneal se cosechan 7 días después del inicio del experimento y se someten al análisis histológico descrito antes. Se observan incrementos estadísticamente significativos para áreas del osteoblasto, colágeno y hueso nuevo. La actividad de dosis-respuesta del compuesto se observa hacia áreas del osteoblasto, el área total (suma de todas las áreas medidas) y el espesor (figuras 116A-16C) . Además de las tinciones con H y E, se realizan de manera habitual otras tinciones. En un método se visualiza la actividad de AP como sigue: se fijan cortes durante 10 min utilizando paraformaldehído 4% y se lavan con PBS y agua MilliQ. Los cortes se incuban durante 5 min con amortiguador ALP (amortiguador ALP: Tris-HCl 0.1M, pH 9.5, MgCl2, 20 mM, NaCl 100 mM) , se puntean utilizando tejido y se incuban con sustrato (NVT/BCIP (cloruro de nitroazul de tetrazolio / formato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo, Roche) en amortiguador ALP) . La tinción se detiene por lavado con agua MilliQ cuando el color cambia de amarillo a café. Ejemplo 11 El mutante RUNX2 dominante negativo interfiere con lasub- regulación por aumento de AP por NR5A2, NR1H3 + T0901317 y ESRRG RUNX2 es un factor de transcripción osteogénico clave que retransmite muchos activadores osteogénicos recibidos por los MPC u osteoblastos en la salida de transcipción osteogénica apropiada. Los estudios de bloqueo en ratones muestran que RUNX2 es crucial para la osificación del esqueleto durante el desarrollo (Franceschi rt and Xiao G (2003) ) . Una herramienta útil para estudiar la biología de RUNX2 y las señales osteogénicas que retransmite son los mutantes de RUNX2. Una proteína RUNX2 truncada que carece de la región transactivante C terminal, pero que retiene el dominio de unión de ADN de homología Runt N terminal actúa como una proteína RUNX2 dominante negativa (DN-RUNX2, por sus siglas en inglés) . Este tipo de mutante puede interferir con la actividad de RUNX2 in vitro e in vivo (Zhang et al., 2000) . Los MPC expresan concentraciones significativas de ARNm para RUNX2 (las concentraciones son aproximadamente 10 veces menores que las concentraciones de ARNm para b-actina) . Dado que se conoce que la actividad de BMP2 funciona a través de RUNX2 , se utilizaron los virus Ad-BMP2 y Ad-DN-RUNX2 para desarrollar el ensayo DN-RUNX2. El ADNc para RUNX2 de longitud completa, humano se obtiene por RT-PCR a partir de ARN total extraído de los MPC . La parte 5 ' del ADNc que codifica para los aminoácidos 1-214 se obtiene por PCR a partir del ADNc para RUNX2 clonado y subclonado en un plásmido adaptador adenoviral. La identidad del fragmento clonado se verifica por secuenciado. Este plásmido se utiliza para generar un concentrado adenoviral, como se describe en WO 9964582. Se siembran los MPC a 1000 células/pozo en una placa de 384 pozos infectada el día siguiente con adenovirus que codifican para hCAR (MOI 250), Ad-BMP2 (moi 6000, 2000, 666) y uno de Ad-DN-RUNX2 o Ad-luciferasa (MOI 2000 ó 666) . La actividad de fosfatasa alcalina se lee 6 días después de la infección. A partir de la figura 17 (A) es evidente que la sobreexpresión de DN-RUNX2 reduce significativamente lasub-regulación por aumento, inducida por BMP2 , de la actividad de AP. Este resultado muestra la funcionalidad del constructo DN-RUNX2 utilizado. se utiliza el ensayo DN-RUNX2 para probar la relación de RUNX2 en lasub-regulación por aumento de la actividad de AP por NR5A2 , NR1H3 y ESRRG. Se siembran MPC a 1000 células/pozo en una placa de 384 pozos y se infectan el día siguiente con adenovirus que codifican para hCAR (MOI 250), Ad-BMP2, Ad-ESRRG, Ad-NR5A2 , Ad-NR1H3 (MOI 6000, 2000, 666) y uno de Ad-DN-RUNX2 o Ad-luciferasa (MOI 1000 o los MOI de 2000 y 666) (véase la figura 17 (C) ) . La actividad de fosfatasa alcalina se lee a los 6 días después de la infección y se analizan los datos sin tratar. A partir de la figura 17 (B) , es evidente que la sobreexpresión de DN-RUNX2 reduce de manera significativa lasub-regulación por aumento, inducida por ESRRG y NR5A2 , de la actividad de AP. A partir de la figura 17 (C) , es evidente que la sobreexpresión de DN-RUNX2 reduce de manera significativa lasub-regulación por aumento de la actividad de AP inducidas por NR1H3 en presencia de T0901317. Ejemplo 12 Inducción de actividad de fosfatasa alcalina por NR5A2, NR1H3 + T0901317, ESRRG, independiente del aislado de MPC Se puede aislar los MPC, con consentimiento informado, de médula ósea fresca aislada de donadores sanos (Cambrex Bioscience/Biowhittaker, Verviers, Bélgica) . Los MPC son un tipo de células fisiológicamente relevante para aislar factores osteogénicos in vitro, utilizando, por ejemplo, el ensayo para AP (véase ejemplo 2) . Para excluir objetivos que funcionan en únicamente un aislado de MPC (es decir, de un donador) , los objetivos también se prueban en varios aislados de MPC diferentes para eliminar la influencia de un fondo genético en el procedimiento de descubrimiento objetivo utilizando los MPC.
Se prueban los factores osteogénicos NR5A2, NR1H3 y ESRRG en 3 aislados de MPC independientes, diferentes de los utilizados para el descubrimiento objetivo en el ensayo AP de acuerdo con un protocolo descrito en el ejemplo 2. Se siembran los MPC a 1000 células/pozo de una placa de 384 pozos y se infectan al día siguiente con adenovirus que codifica para hCAR (MOI 250), Ad-BMP2 , Ad-ESRRG, Ad-NR5A2 y Ad-NRlH3 (MOI ,000, 2500, 625). Los MPC infectados con el virus Ad-NR1H3 a MOI 2500 también se tratan un día después de la infección con T0901317 a diferentes concentraciones (figura 18) o vehículo.
Los MPC aislados de 4 donadores diferentes (A,B,C,D) se infectan con Ad-hCAR, Ad-BMP2 (control positivo) , Ad-eGFP (control negativo), Ad-NR5A2 , Ad-ESRRG (datos presentados en los paneles izquierdo de A,B,C,D) y Ad-NR1H3 + T0901317 (datos presentados en los paneles derechos de A,B,C,D) junto con Ad-luciferasa o Ad-DN-RUNX2. A los 6 días después del inicio de la infección se mide la actividad de AP endógena. A partir de la figura 18, es evidente que NR5A2, NR1H3 + T0901317 y ESRRG inducen actividad de AP en grados similares en la totalidad de los 4 aislados de MPC probados. Ejemplo 13: Análisis de los agonistas de LXR para el tratamiento de osteoporosis en el modelo animal de extirpación de los ovarios El modelo en animales, estándar de oro para análisis de la terapéutica potencial para osteoporosis es el modelo de extirpación de los ovarios. La extirpación de los ovarios (OVX) resulta en una disminución en la producción de estrógenos lo cual es un factor causal importante de osteoporosis. Este ejemplo utiliza la rata como el modelo animal, pero habitualmente se utiliza por los expertos en la técnica otros modelos animales tales como ratones o primates. Se mantienen a ratas Lewis hembra de tres meses de edad bajo condiciones constantes de temperatura (20 ± 1°C) y luz (ciclo de luz-oscuridad de 12 h) con acceso libre a alimento y agua. A las ratas se les opera en falso o experimentan extirpación bilateral de los ovarios después de ser anestesiadas con quetamina y xilazina. Se extirpan los ovarios después de ligación de las astas uterinas. Se forman los siguientes grupos: ratas control, operadas en falso (N = 10) , ratas en quienes se realiza la extirpación de los ovarios que reciben únicamente solución salina (OVX, N = 12) , ratas a las que se les extirpan los ovarios que reciben 17ß-estradiol (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, E.U.A.) disuelto en cantidades pequeñas de etanol con el volumen ajustado con aceite de oliva para proporcionar una concentración de 30 µg/kg de peso corporal y que se les administra diariamente por vía subcutánea durante 6 semanas (OVX-E, N = 11) , ratas a las que se les extirpan los ovarios que reciben agonistas de LXR suspendidos en el vehículo apropiado (por ejemplo agua y lecitina) y que se administran diariamente p.o. durante 6 semanas a una dosis de 0.1 a 100 mg/kg de peso corporal (OVX-A, N = 8) . Todas las ratas fueron matadas después de 6 semanas. En el segundo, tercer y vigésimo octavo día antes de la matanza, las ratas recibieron xitetraciclina (Terramycin, Pfizer) administrada intramuscularmente a una dosis de 20 mg/kg para marcado de huesos. Se obtienen los fémures para histología ósea mineralizada e histomorfometría. Se mide la densidad ósea mineral (BMD, por sus siglas en inglés) por absorciometría de rayos X de energía doble (utilizando, por ejemplo, el aparato de CTI Concord Microsystems, Knoxville TN) adaptado para la medición de BMD en animales pequeños. Se realiza una exploración de fémur distal. Se evalúa la capacidad de reproducción in vivo al medir el coeficiente de variación (CV = 100 x SD/medio) de cinco mediciones de BMD en una rata que pesa aproximadamente 220 g, cada vez volviendo a colocar la rata en dos sitios diferentes. La variación es 1.4% en el fémur distal. Además, se evalúa la estructura alveolar ósea. Todos los parámetros se miden dos veces, es decir, en valores iniciales y después de 6 semanas. El fémur derecho distal se fija en etanol 70%, se deshidrata, se embebe en metacrilato de metilo y se corta longitudinalmente utilizando un microtomo Policut S (Reichert-Jung, Heidelberg, Alemania) . Se obtienen cortes de 5 y 10 µm desde el centro de cada espécimen. El corte de 5 µm se tiñe con azul de toluidina 0.1%, pH 6.4 y se examinan para cada muestra por lo menos dos secciones no consecutivas . Los parámetros estáticos y estructurales de la formación y resorción óseas se miden en un sitio estandarizado por debajo de la placa de crecimiento en la parte esponjosa secundaria. Se recolecta orina en jaulas metabólicas. Se mide la desoxipiridinolina urinaria por la prueba de ELISA y creatinina vía un laboratorio de diagnóstico ajeno. Se evalúan otros marcadores plasmáticos por ELISA que incluyen osteocalcina, sialoproteína ósea, BMP (proteína ósea morfométrica) y el marcador catabólico telopéptido carboxiterminal . Se mata a las ratas por exanguinación mientras se encuentran bajo anestesia con éter. Todos los datos animales se obtienen por mediciones por personas quienes desconocen el objetivo del estudio. Los datos se presentan como media ± desviación estándar (SD, por sus siglas en inglés) . Se utiliza la prueba t de Student pariada para analizar valores dentro del mismo grupo con valores iniciales y después de 6 semanas. se utiliza la prueba de ANOVA seguida por la prueba posterior de Newman-Keuls para comparar grupos diferentes. Se calcula la regresión lineal entre variables histomorfométricas y mediciones de masa ósea no invasiva y se aplica la prueba de Pearson. Se establece la significancia estadística en valores p inferiores a 0.05.
Referencias: Cortez-Retamozo et al. (2004), Cáncer Res 64: 2853-7. Lipinsky, CA, et al. (2001), Adv "Drug Deliv Rev 46: 3-26. Nakashima, K. and de Crombrugghe, B., (2003), Trends Genet 19(8) : 458-66 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (21)

  1. REIVINDICACIONES
  2. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Un método para promover osteogénesis en una población de células de vertebrado, que incluye células progenitoras de osteoblasto, caracterizado porque comprende poner en contacto células progenitoras de osteoblasto con una cantidad estimulante osteogénica eficaz de un agonista de LXR. 2. Un método para el tratamiento o prevención de un desequilibrio en la homeostasis ósea caracterizado porque comprende administrar una cantidad eficaz estimulante osteogénica de un agonista de LXR a un sujeto que padece o que es susceptible de dicho desequilibrio.
  3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el desequilibrio en la homeostasis ósea tiene una reducción en la proporción de osteoblastos respecto a osteoclastos en el tejido óseo de dicho sujeto.
  4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el agonista de LXR promueve la diferenciación de células madre de mesénquima en osteoblastos en la médula ósea del sujeto por lo que se incrementa la proporción de osteoblastos respecto a osteoclastos .
  5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el sujeto es susceptible o padece de hipocalcemia (o cáncer) , enfermedad de Paget, artritis reumatoide, enfermedad periodontal, osteogénesis focal que se presenta mediante metástasis en esqueleto, síndrome de Crouzon, raquitismo, opsismodisplasia, picnodisostosis/enfermedad de Toulouse-Lautrec, osteogénesis imperfecta u osteoporosis.
  6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el tratamiento comprende administrar a un sujeto que padece de osteoporosis.
  7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agonista de LXR es un derivado de ácido diarilaquilaminoalcoxi-2-fenilacético, un fármaco precursor del mismo o una sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable del mismo.
  8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el agonista de LXR es ácido 2- (3- (3-N- (2-cloro-3- (trifluorometil) bencil) -N- (2, 2-difenil-etil) amino)propoxi) fenil) acético, un fármaco precursor del mismo o una sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable del mismo.
  9. 9. El método de conformidad con la reivin-dicación 1, caracterizado porque el agonista de LXR es N- (metil) -N- [4- [2 , 2 , 2-trifluoro-l-hidroxi-1- (trifluorometil) e-til] fenil] -bencensulfonamida, un fármaco precursor del mismo o una sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable del mismo.
  10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agonista de LXR es N-(2,2, 2-trifluoroetil) -N- [4- [2 , 2 , 2-trifluoro-l-hidroxi-1- (trifluorometil) etil] fenil] -bencensulfonamida, un fármaco precursor del mismo o una sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable del mismo.
  11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque se administran aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg del agonista de LXR, de una vez a tres veces al día.
  12. 12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque se administran aproximadamente 5 mg a aproximadamente 1000 mg del agonista de LXR de una vez a tres veces al día.
  13. 13. El método de conformidad con la reivin-dicación 4, caracterizado porque el agonista LXR se administra por vía oral, transdérmica, por inhalación, inyección, por vía nasal, rectal o vía una formulación de liberación sostenida.
  14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el agonista de LXR se administra al paciente por un período de tiempo suficiente para reestablecer la homeostasis ósea normal y posteriormente mantener dicha homeostasis.
  15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el agonista de LXR se administra a un sujeto susceptible del desarrollo de osteoporosis para evitar el inicio de osteoporosis.
  16. 16. Una composición que promueve la homeostasis ósea, caracterizada porque comprende una cantidad eficaz estimulante osteogénica de un agonista de LXR en mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable.
  17. 17. La composición de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque el agonista de LXR es ácido 2- (3- (3-N-(2-cloro-3-(trifluorometil)bencil)-N- (2 , 2-difenil-etil) amino) ropoxi) fenil) acético, un fármaco precursor del mismo o una sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable del mismo.
  18. 18. La composición de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque el agonista de LXR es una N- (metil)-N-[4- [2 , 2 , 2-trifluoro-l-hidroxi-1- (trifluorometil) -etil] fenil] -bencensulfonamida, un fármaco precursor del mismo o una sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable del mismo .
  19. 19. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque el agonista de LXR es N-(2,2,2-trifluoroetil)-N-[4-[2,2,2-trifluoro-l-hidroxi-l- (trifluorometil) etil] fenil] -bencensulfonamida, un fármaco precursor del mismo o una sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable del mismo.
  20. 20. El método de conformidad con la reivin-dicación 16, caracterizado porque el agonista de LXR es el dímero acetil podocárpico, un fármaco precursor del mismo o una sal, solvato o hidrato farmacéuticamente aceptable del mismo.
  21. 21. El método de conformidad con la reivin-dicación 1, caracterizado porque comprende la producción in vitro de tejido óseo, que comprende aplicar células progenitoras de osteoblasto sobre un sustrato, poner en contacto a las células con una cantidad eficaz estimulante osteogénica de un agonista de LXR durante un tiempo suficiente para estimular la generación de una matriz de tejido óseo.
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