MXPA06013483A - Modulacion de produccion de inmunoglobulina y trastornos atopicos. - Google Patents

Abstract

Un polipeptido IL-21 u otro agonista de senda IL-21 se pueden utilizar para tratar trastornos atopicos, por ejemplo, asma.

Description

del IgE es una estrategia terapéutica efectiva para el tratamiento de la enfermedad atópica. Ver, por ejemplo, Kawakami y Galli (2002) Nat Rev Immunol 2(10); 773-86; Prussin and Metcalfe (2003) J Allergy Clin Immunol 1 1 (2 Suppl); S486-94; Holgate (2000) Clin Exp Allergy 30 Suppl 1 ; 28-32; Busse and Neaville, (2001 ) Curr Opin Allergy Clin Immunol 1 (1 ); 105-8 BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Hemos descubierto, ínter alia, que el polipéptido IL-21 puede generar un ambiente protector contra las reacciones atópicas. De acuerdo con esto, los agonistas de la senda IL-21 , tal como el polipéptido IL-21 y otros agentes que regulan similarmente la senda de IL-21 , se pueden utilizar para regular el balance entre el IgE y el lgG4 producido en respuesta a la exposición al alérgeno. Por ejemplo, los agonistas de la senda de IL-21 se pueden utilizar para reducir los niveles o producción de IgE en un sujeto, mejorar al menos un síntoma de un trastorno atópico, y/o inhibir la producción de IgE en un sujeto. En un aspecto, la invención caracteriza un método para mejorar uno o más síntomas asociados con un trastorno atópico en un sujeto. El método incluye: Administrar, al sujeto, un agonista de la senda IL-21 , en una cantidad efectiva para mejorar uno o más síntomas del trastorno atópico. Trastornos atópicos de ejemplo incluyen: dermatitis atópica, asma, asma bronquial extrínseca, urticaria, eczema, rinitis alérgica, y enterogastritis alérgica. El término "senda IL-21" se refiere a los componentes biológicos que median la señalización IL-21. La senda incluye, por ejemplo, el polipéptido IL-21 mismo, el receptor IL-21 , y los componentes citoplasmáticos que son modulados mediante la activación del receptor, que incluyen el STAT3 y el STAT5, las quinasas, y/o los factores de trascripción. El término "agonista de la senda IL-21" se refiere a un agente que incrementa la actividad de la senda IL-21 , por ejemplo, un agente que potencia, induce o mejora de otra manera una o más actividades biológicas de un polipéptido receptor IL-21 , por ejemplo, una actividad biológica como se describe aquí. Por ejemplo, un agonista interactúa con, por ejemplo, se une a, un polipéptido receptor IL-21. En una modalidad, un agonista puede interactuar con el receptor IL-21 y otra cadena receptora, por ejemplo, la cadena receptora ? citoquina. Por ejemplo, el agonista retícula el receptor IL-21 y la cadena receptora ? citoquina. En una modalidad, el agonista de la senda IL-21 es un polipéptido IL-21 , un fragmento activo o una variante de este. Por ejemplo, el polipéptido IL-21 se administra en una dosis de aproximadamente 0.1 pg a aproximadamente 100 pg, aproximadamente 100 µg a aproximadamente 5 mg o aproximadamente 5 mg a aproximadamente 100 mg por kg de peso corporal. El polipéptido IL-21 puede ser, por ejemplo, humano o sustancialmente humano. El polipéptido IL-21 puede incluir la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO:2 a una secuencia de aminoácido que es al menos 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, o 99% idéntica a la SEQ ID NO:2. En otra modalidad, el agonista de la senda IL-21 es un agente que interactúa con el receptor IL-21. Un agente que interactúa con el receptor IL-21 puede activar el receptor o de otra manera agonizar la señalización de la senda. Por ejemplo, el agonista de la senda IL-21 es una proteína que interactúa con el receptor IL-21. La proteína puede comprender un anticuerpo receptor anti IL-2 agonista (por ejemplo un anticuerpo de longitud completa o un fragmento de unión de antígeno) que interactúa con y activa el receptor IL-21. En una modalidad, el agonista de la senda IL-21 es un agente que modula un componente de senda IL-21 citoplasmático. Un agente que modula un componente de senda IL-21 citoplasmático puede, por ejemplo, activar un componente de senda citoplasmático que actúe positivamente o inhibir un componente citoplasmático que actúe negativamente. Los componentes citoplasmáticos que actúen positivamente de ejemplo incluyen las quinasas STAT. El agente puede también ser un símil de un componente que actúa positivamente, por ejemplo, una forma constitutivamente activada de una quinasa STAT. En una modalidad, el agonista de la senda IL-21 es un ácido nucleico que codifica un polipéptido IL-21 , una proteína que interactúa con (por ejemplo se une y/o activa) el receptor IL-21 y una proteína que modula un componente de senda IL-21 citoplasmático. El agente puede codificar un componente que actúa positivamente, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica la quinasa STAT o una forma constitutivamente activada de una quinasa STAT. El sujeto puede ser un mamífero, y típicamente es humano (por ejemplo una hembra o un macho, y un adulto o un sujeto humano juvenil). Los niveles IgE en el sujeto se pueden disminuir en al menos 10, 20, 30, 40, 50, 70, 80, 85, 90, 95% en relación a un parámetro de referencia, local o sistémicamente. Por ejemplo, el parámetro de referencia puede ser un parámetro para un sujeto antes del tratamiento o puede ser un sujeto normal o de control o un valor estadístico característico de una población de sujetos (por ejemplo una cohorte de sujetos normales, por ejemplo, de edad y género similar). El agonista de senda IL-21 se puede administrar parenteral o localmente. Por ejemplo, el agonista se puede suministrar tópicamente a un sitio de una dermatitis atópica. Esta se puede suministrar a la mucosa respiratoria, por ejemplo, mediante inhalación, por ejemplo, de una composición atomizada. Esta se puede suministrar parenteralmente, por ejemplo, mediante inyección, por ejemplo, subcutánea, intramuscular, o intravenosa. Esta se puede suministrar, por ejemplo, mediante un implante u otro dispositivo médico. Otos modos de ejemplo se describen aquí. El método también puede incluir además evaluar uno o más síntomas del trastorno atópico en el sujeto, por ejemplo, antes, durante, o después de la administración. Ejemplos de tales síntomas se describen aquí.

El método pude además incluir evaluar un parámetro asociado con IL-21 en el sujeto, por ejemplo, un parámetro asociado con el nivel de polipéptido IL-21 , receptor IL-21 , o una actividad de senda IL-21. El término "parámetro" se refiere a la información, que incluye descriptores cualitativos y cuantitativos, por ejemplo, valores, niveles, mediciones, y así sucesivamente. Un "parámetro asociado a IL-21" se refiere a un parámetro que describe un componente de senda IL-21 , por ejemplo, la presencia, ausencia, nivel, expresión, estabilidad, localización subcelular, o actividad de tal componente, por ejemplo, un polipéptido IL-21 , un receptor IL-21 , u otro componente citoplasmático. El parámetro también puede describir el mARN que codifica un componente de senda IL-21. El método puede además incluir evaluar una inmunoglobulina endógena (por ejemplo IgG o IgE) en el sujeto, por ejemplo, evaluar los niveles de inmunoglobulina endógena. El método puede incluir otras características descritas aquí. En otro aspecto, la invención incluye un método para tratar o prevenir un trastorno atópico en un sujeto, el método incluye: Administrar, al sujeto, un agonista de senda IL-21 , en una cantidad efectiva para tratar o prevenir el trastorno atópico. Los trastornos atópicos de ejemplo incluyen: dermatitis atópica, asma, asma bronquial extrínseca, urticaria, eczema, rinitis alérgica, y enterogastritis alérgica. En una modalidad, el agonista de senda IL-21 es un polipéptido IL-21. Por ejemplo, el polipéptido IL-21 se administra en una dosis de aproximadamente 0.1 pg a aproximadamente 100 pg, aproximadamente 100 µ9 a aproximadamente 5 mg o aproximadamente 5 mg a aproximadamente 100 mg por kg de peso corporal. El polipéptido IL-21 puede ser, por ejemplo, humano o sustancialmente humano. El polipéptido IL-21 puede incluir una secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO:2 o una secuencia de aminoácido que es al menos 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% idéntico a la SEQ ID NO:2. En una modalidad, el agonista de senda IL-21 es un agente que interactua con el receptor IL-21 , un agente que modula un componente de senda IL-21 citoplasmático o un ácido nucleico que codifica un polipéptido IL-21 , una proteína que interactúa con (por ejemplo activa) el receptor IL-21 , y una proteína que modula un componente de sendas citoplasmático IL-2 . El sujeto puede ser un mamífero, y típicamente es un humano (por ejemplo una hembra o macho, y un adulto o un sujeto humano juvenil). Los niveles de IgE en el sujeto se pueden disminuir en al menos 10, 30, 40, 50, 70, 80, 85, 90, 95% con relación a un parámetro de referencia, ya sea localmente o sistémicamente. Por ejemplo, el parámetro de referencia puede ser un parámetro para el sujeto antes de tratamiento o puede ser un sujeto normal o de control o una característica de valor estadístico de una población de sujetos (por ejemplo una cohorte de sujetos normales, por ejemplo, de edad y género similar). El agonista de senda IL-21 se puede administrar parenteral o localmente. Por ejemplo, el agonista se puede suministrar tópicamente a un sitio de una dermatitis atópica. Esta se puede suministrar a la mucosa respiratoria, por ejemplo, mediante inhalación, por ejemplo, de una composición atomizada. Esta se puede suministrar parenteralmente, por ejemplo, mediante inyección, por ejemplo, subcutánea, intramuscular, o intravenosa. Esta se puede suministrar, por ejemplo, mediante un implante u otro dispositivo médico. Otros modos de ejemplo se describen aquí. El método puede incluir otras características descritas aquí. En otro aspecto, la invención caracteriza un método para modular la producción de IgG en una célula, (por ejemplo una célula B, por ejemplo, un mamífero, por ejemplo humano, murino u otra célula de roedor). El método incluye: poner en contacto un modulador de senda IL-21 , con la célula en una cantidad suficiente para modular la producción de IgG (por ejemplo expresión o secreción de una célula). La célula puede estar in vitro o in vivo durante la etapa de contacto. Por ejemplo, el contacto in vivo se puede desarrollar en un sujeto mamífero, por ejemplo, un sujeto humano. En una modalidad, la producción IgG se incrementa y los moduladores de senda IL-21 y un agonista de senada IL-21 , por ejemplo, un polipéptido IL-21 , un agente que interactúa con el receptor IL-21 , o un agente que modula un componente de senda citoplasmático IL-21. Los niveles IgG se pueden incrementar, por ejemplo, en al menos 10, 20, 30, 40, 50, 70, 80, 100, 120 o 150% con relación a un parámetro de referencia. Por ejemplo, el parámetro de referencia puede ser un parámetro para el sujeto antes del tratamiento o puede ser un sujeto normal o de control o un valor estadístico característico de una población de sujetos (por ejemplo, una cohorte de sujetos normales, por ejemplo, de edad y género similar). En otra modalidad, la producción IgG se disminuye y el modulador de la senda IL-21 es una antagonista de senda IL-21. Los niveles IgG se pueden disminuir, por ejemplo, en al menos 10, 20, 30, 40, 50, 70, 80, 85, 90, 95% con relación al parámetro de referencia (por ejemplo, un parámetro para el sujeto antes del tratamiento o puede ser un sujeto normal o de control o una característica de valor estadístico de una población de sujetos (por ejemplo una cohorte de sujetos normales, por ejemplo, de edad y género similares)). En un primer ejemplo, el antagonista es un agente que se une a IL-21 o a un receptor IL-21 , tal como un anticuerpo o un fragmento que se une antígeno de este que se une al IL-21 o a un agente que incluye una forma soluble del receptor IL-21 , por ejemplo, un dominio extracelular de éste (por ejemplo un dominio extracelular solo o como una fusión tal como una fusión Fe). En un segundo ejemplo, el antagonistas de senda IL-21 es un agente que se une a un componente del receptor IL-21 , por ejemplo, el agente evita la activación del receptor IL-21. Un anticuerpo que se une al receptor IL-21 y evita la unión del IL-21 al receptor es un agente que tiene estas propiedades. En un tercer ejemplo, el antagonista de senda IL-21 es un ácido nucleico (por ejemplo un ARN antisentido, un siARN, o una ribozima) que reduce la expresión del IL-21 , el receptor IL-21 , o un componente de la senda del IL-21. El método puede incluir otras características descritas aquí.

En otro aspecto, la invención caracteriza un método para modular la producción de IgE en una célula. El método incluye: poner en contacto un modulador de senda IL-21 a la célula en una cantidad suficiente para modular la producción de IgE. El término "modulador de senda IL-21" se refiere a un agente que altera la actividad de la senda del IL-21 y comprende los agonistas de la senda IL-21 y antagonistas. En una modalidad, la producción del IgE disminuye y el modulador de la senda del IL-21 es un agonista de la senda IL-21 por ejemplo, un agonista descrito aquí, por ejemplo, un polipéptido IL-21. Por ejemplo, los niveles de IgE disminuyen en al menos 10, 20, 30, 40, 50, 70, 80, 85, 90, 95% con relación a un parámetro de referencia (por ejemplo un parámetro para el sujeto antes del tratamiento o puede ser un sujeto normal o de control o un valor estadístico característico de una población de sujetos (por ejemplo una cohorte de sujetos normales, por ejemplo, de edad y género similares)). En otra modalidad, la producción IgE se incrementa y el modulador de senda IL-21 es un antagonista de senda IL-21 por ejemplo, un antagonista descrito aquí. Por ejemplo, los niveles se incrementan en al menos 10, 20, 30, 40, 50, 70, 80, 100, 120, 150% con relación al parámetro de referencia (por ejemplo un parámetro para un sujeto antes del tratamiento o puede ser un sujeto normal o de control o un valor estadístico característico de una población de sujetos (por ejemplo, una cohorte de sujetos normales, por ejemplo, de edad y género similares)). El método puede incluir otras características descritas aquí.

En otro aspecto, la invención caracteriza un método para modular los niveles relativos de senda IL-21 , con la célula en una cantidad suficiente para modular los niveles relativos de IgE e IgG. En una modalidad, la proporción de IgE/lgG disminuye y el modulador de senda IL-21 es un agonista de senda IL-21 , por ejemplo, un agonista descrito aquí, por ejemplo, un polipéptido IL-21. Por ejemplo, la proporción disminuye en al menos 10, 20, 30, 40, 50, 70, 80, 85, 90, o 95% en relación a la proporción de referencia (por ejemplo una proporción para el sujeto antes del tratamiento o puede ser un sujeto normal o de control o un valor estadístico característico de una población de sujetos (por ejemplo una cohorte de sujetos normales, por ejemplo, de edad y género similares)). En otra modalidad, la proporción IgE/lgG se incrementa y el modulador de senda IL-21 es un agonista de senda IL-21 , por ejemplo, un antagonista descrito aquí. Por ejemplo, la proporción se incrementa en al menos 10, 20, 30, 40, 50, 70 80, 100, 120, o 150% en relación con la proporción de referencia (por ejemplo, una proporción para el sujeto antes del tratamiento o puede ser un sujeto normal o de control o un valor estadístico característico de una población de sujetos, por ejemplo una cohorte de sujetos normales (por ejemplo, de edad y género similares)). Es posible modular los niveles relativos de IgE e IgG al inhibir una recombinación de cambio requerido para el transcrito ?e. Estos niveles relativos también se pueden modular en la presencia de células T.

En todavía otro aspecto la invención caracteriza una composición farmacéutica que incluye un agonista de senda IL-21 y un segundo agente para tratar un trastorno atópico. En una modalidad, el agonista de senda IL-21 es un polipéptido IL-21. Por ejemplo, el polipéptido IL-21 se administra en una dosis de aproximadamente 0.1 pg a aproximadamente 100 pg, aproximadamente 100 pg a aproximadamente 5 mg o aproximadamente 5 mg a aproximadamente 100 mg por kg de peso corporal. El polipéptido IL-21 puede ser., por ejemplo, humano o sustancialmente humano. El polipéptido IL-21 puede incluir la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO:2 o una secuencia de aminoácido que es al menos 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, o 99% idéntica a la secuencia de la SEQ ID NO:2. En una modalidad, el agonista de senda IL-21 es un agente que interactúa con el receptor IL-21 , un agente que modula un componente de senda citoplasmático IL-21 o un ácido nucleico que codifica un polipéptido IL-21 , una proteína que interactúa con (por ejemplo activa) el receptor IL-21 , y una proteína que modula un componente de senda citoplasmático IL-21. En otro aspecto, la invención caracteriza un recipiente que incluye una o más dosis de una composición farmacéutica de un agonista de senda IL-21 y una etiqueta, la etiqueta incluye instrucciones para administrar una dosis de la composición para tratar o evitar una enfermedad o trastorno atópico. En una modalidad, la composición incluye un segundo agente para tratar un trastorno atópico.

La invención también incluye un método para elaborar un farmacéutico. El método incluye suministrar un agonista de senda IL-21 y empacar el agonista en un recipiente. El método también puede incluir asociar (por ejemplo fijar) una etiqueta al recipiente, por ejemplo, una etiqueta que incluye las instrucciones para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno atópico. En una modalidad, el agonista de senda IL-21 es un polipéptido IL-21. El método puede incluir expresar recombinantemente el polipéptido IL-21 y al menos parcialmente purificar el polipéptido. En otro aspecto, la invención caracteriza un método para evaluar un sujeto que tiene o se sospecha que tiene un trastorno atópico, por ejemplo dermatitis atópica, asma, asma bronquial extrínseca, urticaria, eczema, rinitis alérgica, y enterogastritis alérgica. El método incluye: evaluar un parámetro asociado con IL-21 para un sujeto que tiene un trastorno atópico, comparar los resultados de la evaluación con un parámetro de referencia, y suministrar una recomendación para una terapia para el trastorno como una función de la comparación. Un "parámetro de referencia" se refiere a información correspondiente de un sujeto de referencia o célula, por ejemplo, un sujeto o célula de control, normal o tipo silvestre. Un parámetro de referencia también puede ser el promedio o la mediana de un grupo de control o un grupo normal de individuos. Por ejemplo, el parámetro asociado con IL-21 incluye un valor cuantitativo o cualitativo para la abundancia de polipéptido IL-21 o la abundancia de mARN IL-21. En otro ejemplo, el parámetro asociado con IL-21 incluye un valor cuantitativo o cualitativo para la proteína del receptor de IL-21 o el mARN, o para la actividad de la senda IL-21. La terapia recomendada puede incluir la administración de un agonista de senda IL-21 , por ejemplo, un polipéptido IL-21. El método puede incluir otras características descritas aquí. En otro aspecto, la invención caracteriza un método para evaluar un sujeto con riesgo de un trastorno atópico. El método incluye: evaluar un parámetro asociado con IL-21 para un sujeto, comparar los resultados de la evaluación con un parámetro de referencia, y suministrar una evaluación del riesgo para un trastorno atópico como una función de la comparación. Por ejemplo, la evaluación del riesgo puede ser una función de la desviación entre un parámetro evaluado y el parámetro de referencia. En una modalidad, la evaluación del riesgo se expresa como el número de desviaciones estándar de la norma. El método puede incluir otras características descritas aquí. A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el mismo significado que se entiende comúnmente para un experto en la técnica al cual pertenece esta invención. Aunque los métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos aquí se pueden utilizar en la práctica o ensayo de la invención, los métodos y materiales adecuados se describen adelante. Todas las publicaciones, solicitudes de patentes, patentes, u otras referencias mencionadas aquí se incorporan como referencia en su totalidad. La Solicitud U.S. Serie No. 10/806,611 , presentada en Marzo 22, 2004, y la US 2003-0108549 se incorpora aquí como referencia en su totalidad. En caso de conflicto, la presente especificación, incluyendo definiciones, domina. Además los materiales, métodos, y ejemplos son ilustrativos solamente y no pretenden ser limitantes.

DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Figuras 1A-1 D. El IL-21 potencia la liberación de IgE y el lgG4 de células B purificadas. Las células B se aislan de PBMC humano mediante separación de glóbulo magnético. Las células fueron tratadas con anti-CD40 más las citoquinas indicadas como se describió en Materiales y Métodos. El día 6, se cosechan las células y los sobrenadantes, (figuras 1A, 1 B) niveles de IgE en sobrenadantes de los micropozos individuales, (figura 1C) PCR para expresión de GAPDH, transcrito estéril de ?e, y el transcrito estéril de ??4. (figura 1 D) los niveles de lgG4 en pozos agrupados tratados con la citoquina indicada. Ningún lgG4 fue detectable en células tratadas con anti-CD40 solo. Figuras 2A y 2B. El IL-21 sinergiza con el IL-4 o el IL-13 para manejar la proliferación de células B. Las células B se aislan de PBMC humano mediante separación de glóbulo magnético. Las células fueron tratadas durante 48 horas con anti-CD40 más las citoquinas indicadas. Se agrega 3H-timidina durante las 24 horas finales, y se determina la incorporación mediante conteo de centelleo líquido. Figuras 3A-3D. El IL-21 potencia la liberación de IgE e lgG4 de PBMC estimulado con anti-CD40. PBMC humano no fraccionado se trata con anti-CD40 más las citoquinas indicadas, como se describió en Materiales y Métodos. (Figura 3A) los niveles IgE en sobrenadantes de micropozos individuales, ensayados el día 21 del cultivo. No hubo IgE detectable en los pozos tratados con IL-21 solo. (Figura 3B) los niveles IgE en pozos agrupados tratados con la citoquina indicada, ensayados el día 21 del cultivo. (Figura 3C) PCR para transcritos estériles y su ?e e ??4 se desarrollan utilizando células aisladas el día 3 del cultivo. El PCR para transcrito maduro Ce se desarrolla utilizando células aisladas el día 10. (Figura 3D) los niveles de lgG4 en pozos agrupados tratados con la citoquina indicada ensayada el día 21 del cultivo. Figuras 4A-4D. El IL-21 inhibe la producción de IgE pero no la liberación de lgG4 en PBMC estimulado con PHA. El PBMC humano no fraccionado se trata con PHA y citoquinas. (Figura 4A) los niveles de IgE en sobrenadantes de los micropozos individuales, ensayados el día 21 del cultivo. (Figura 4B) Niveles IgE en pozos agrupados tratados con la citoquina indicada, ensayados el día 21 del cultivo. (Figura 4C) PCR para los transcritos estériles ?e e ??4, utilizando células aisladas el día 3 de cultivo. (Figura 4D) Los niveles lgG4 en pozos agrupados tratados con la citoquina indicada ensayados el día 21 del cultivo. Figuras 5A y 5B muestran los cambios a la expresión CD40L como se describe infra. Figuras 6A-6D. Los niveles de citoquina en cultivos PBMC.

(Figura 6A) el PBMC no fraccionado se trata con PHA y citoquinas como se describió en Materiales y Métodos. Los niveles IL-10 se miden en sobrenadantes agrupados recolectados en día 7 del cultivo. (Figura 6B) el PBMC humano no fraccionado se trata durante 48 horas con anti-CD40 más las citoquinas indicadas. En el día 2 y cada 4 días posteriormente, la media cambia y se agregan citoquinas frescas. Los niveles IL-10 se miden en sobrenadantes agrupados recolectados el día 7. (Figura 6C) el PBMC estimulado por PHA se trata con las citoquinas indicadas. Los niveles IL-12 se miden en supernadantes agrupados recolectados el día 6 del cultivo. (Figura 6D) el PBMC estimulado por PHA se trata con las citoquinas indicadas. Los transcritos IL-12Rb se cuantifican mediante PCR en tiempo real en células recolectadas el día 6 del cultivo. Los datos se expresan como unidades TAQMAN™ relativas (RTU). Figura 7. Muestra cambios en el número de células apoptóticas CD19+ como se describe infra. Figuras 8A y 8B. El IL-13 no rescata la producción e IgE del PBMC estimulado con PHA tratado con IL-4 e IL-21. El PBMC humano no fraccionado se trata con PHA y citoquinas. Los niveles IgE se determinaron en pozos agrupados tratados con la citoquina indicada, ensayado el día 14 del cultivo. (Figura 8A) Efectos del IL-21 e IL-13 sobre la producción de IgE manejada por IL-4. (Figura 8B) Los efectos del IL-21 e IL-4 sobre la producción de IgE manejada por IL- 3. Figuras 9A y 9B. Muestran los cambios de los niveles de IgE bajo varias condiciones. Figuras 10A y 10B. El IL-21 no reduce la producción de IgE en PBMC irradiado. Los PBMC no fraccionados fueron: (Figura 10A) irradiados; o (Figura 10B) no irradiados. Las células se estimularon con PHA durante 2 días a 37° C, luego tratadas con IL-4 +/- IL-21 , como se describe en Materiales y Métodos. Los niveles IgE se miden en sobrenadantes agrupados recolectados el día 13 del cultivo. Los datos se expresan como porcentaje de niveles IgE encontrados en los cultivos estimulados con IL-4.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION El IL-21 es una citoquina que regula el comportamiento de la célula inmune. Hemos descubierto que el IL-21 se puede utilizar para modular la producción IgE. La reactividad causada por el IgE contribuye a un número de trastornos, incluyendo trastornos atópicos. El uso de un polipéptido IL-21 o un agonista de senda IL-21 que actúa de forma similar se puede utilizar, por ejemplo, para disminuir los niveles de IgE local o sistémicamente en un sujeto, mejorando de esta manera el trastorno atópico.

Agonistas de la Senda IL-21. En un aspecto de la invención, los agonistas de la senda IL-21 se utilizan para modular el sistema inmune, por ejemplo, para tratar, prevenir, o mejorar un trastorno atópico. Agonistas de senda IL-21 de ejemplo incluyen un polipéptido IL-21 , el receptor IL-21 , agentes que actúan o agonizan el receptor IL-21 , y agentes que modulan otros componentes de la senda IL-21 para activar la señalización de la senda IL-21. Los agonistas de ejemplo se unen al polipéptido IL-21 o al receptor IL-21 con alta afinidad, por ejemplo, con una afinidad constante de menos de aproximadamente 107 M"1, aproximadamente 108 M"1, o, aproximadamente 109 M"1, a 1010 M" o mayor. Los componentes de senda IL-21 de ejemplo incluyen polipéptido IL-21 , receptor IL-21 , cadena de receptor ß, cadena de citoquina ? común, y componentes de señalización intracelular, tal como Jak1 , Jak3, STAT1 , STAT3, y STAT5.

IL-21 En su forma madura, la citoquina IL-21 humana es de aproximadamente 131 aminoácidos de longitud y tiene una secuencia de homología IL-2, IL-4 e IL- 5 (Parrish-Novack et al. (2000) Nature 408:57-63). A pesar de la homología de secuencia baja entre citoquinas de interleuquina, estas citoquinas y el IL-21 comparten un doblez que incluye una estructura característica "manojo de cuatro hélices". Las secuencias de aminoácido de los polipéptidos IL-21 son públicamente conocidos. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácido de un IL-21 humano está disponible en el GENBANK® Acc. No. X_01 1082. Un ejemplo describe la secuencia de nucleótido IL-21 humana que se presenta adelante: 1 gctgaagtga aaacgagacc aaggtctagc tctactgttg gtacttatga gatccagtcc 61 tggcaacatg gagaggattg tcatctgtct gatggtcatc ttcttgggga cactggtcca 121 caaatcaagc tcccaaggtc aagatcgcca catgattaga atgcgtcaac ttatagatat 181 tgttgatcag ctgaaaaatt atgtgaatga cttggtccct gaatttctgc cagctccaga 241 agatgtagag acaaactgtg agtggtcagc tttttcctgc tttcagaagg cccaactaaa 301 gtcagcaaat acaggaaaca atgaaaggat aatcaatgta tcaattaaaa agctgaagag 361 gaaaccacct tccacaaatg cagggagaag acagaaacac agactaacat gcccttcatg 421 tgattcttat gagaaaaaac cacccaaaga attcctagaa agattcaaat cacttctcca 481 aaagatgatt catcagcatc tgtcctctag aacacacgga agtgaagatt cctgaggatc 541 taacttgcag ttggacacta tgttacatac tctaatatag tagtgaaagt catttctttg 601 tattccaagt ggaggag (SEQ ID NO:l) La información adicional de secuencia de nucleótido está disponible, por ejemplo, de la AF254069 [gi: 11093535] que suministra una secuencia de mARN de 642 bp que codifica un polipéptido IL-21 de ejemplo. En algunas modalidades, es suficiente utilizar la región de la secuencia de nucleótido que codifica IL-21 maduro, por ejemplo, sin una región que codifica una secuencia de señal. La secuencia de aminoácido de un polipéptido IL-21 humano maduro de ejemplo basado en Parrish-Novak et al. (2000) Nature 408:57-63, se presenta adelante: QD HMIRMRQLIDIVDQLK YV DLVPEFLPAPEDVETNCE SAFSCFQKAQLKSA T GN ERIINVSIK L RKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKM IHQHLSSRTHGSEDS (SEQ ID NO: 2 ) La secuencia de longitud completa de un polipéptido IL-21 humano de ejemplo es: I^SSPGl^RIVICLMVIFLGTLVHK^^ EFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQ KHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQK IHQHLSSRTHGSEDS (SEQ ID NO: 9) Las entradas adicionales que suministran las secuencias de aminoácido para los polipéptidos IL-21 son como sigue: Gi|1 1 141875|ref|NP_068575.1 | interleuquina 21 [Homo Sapiens]: gi|1 1093536|gb|AAG29348.1 | interleuquina 21 [Homo Sapiens]: gi|42542586|gb|AAH66259.1 | interleuquina 21 [Homo Sapiens]: gi|42542588|gb|AAH66260.1 | interleuquina 21 [Homo Sapiens]: gi|42542657|gb|AAH66261.1 | interleuquina 21 [Homo Sapiens]: gi|42542659|gb|AAH66258.1 | interleuquina 21 [Homo Sapiens]: y gi|42542807|gb|AAH66262.1 | interleuquina 21 [Homo Sapiens]. El polipéptido IL-21 humano puede ser una variante de un polipéptido descrito aquí, siempre y cuando este retenga la funcionalidad. Los polipéptidos IL-21 de ejemplo de otras especies incluyen lo siguiente: lnterleuquina-21 de Peromyscus maniculatus: WIFLGTVAHKTSPQRPDRLLIRLRHLVDNVEQLKIYV DLDPELLPAPQDV1 SAFACFQKA LKPANTGSN TIISDLVTQLRRRLPATKAE KQQSLVKCPSCI TPKEFLE (SEQ ID NO: 10) Interleuquina -21 de Mus musculus: PDRLLIRLRHLIDIVEQL IYENDLDPELLSAPQDVKGHCEHAAFACFQKA LKPSNP GNNKTFIIDLVAQLRRRLPARRGGK QKHIA CPSCDSYEKRTPKEFLERLK WLLQKMIHQHLS (SEQ ID: 4, forma madura), MERTLVCLWIPLGTVAHKSSPQGPDRLLIRLRHLIDIVEQLKIYENDLDPELLSAPQ DVKGHCEHAAFACFQKAKLKPSNPGN KTFIIDLVAQLRRRLPARRGGKKQKHIAKCP SCDSYEKRTPKEFLERLKWLLQKMIHQHLS (SEQ ID NO: 1 1 longitud completa) lnterleuquina-21 de Bos taurus: MRWPGN ERIVICL VlFSGTVAHKSSSQGQDRLPIRLRQLIDI\n.QLKNYVNDLDPE FLPAPEDVKRHCERSAFSCFQKVQLKSAN GDNEKi:INILTKQLKRKLPATMTGRRQK HEVTC SCDSYEKKPP BYLERLKSLIQKMIHQHLS (SEQ ID NO: 12) Los términos "interleuquina-21 ", "IL-21 " y "polipéptido IL-21 " se refiere a una proteína (por ejemplo, un mamífero, por ejemplo proteína murino o humana) que es capaz de interactuar con por ejemplo, la unión a, receptor IL-21 (por ejemplo un mamífero, por ejemplo, proteína de murino o humano) y que tiene una de las siguientes características: (i) una secuencia de aminoácido de un mamífero de ocurrencia natural IL-21 o un fragmento de este, por ejemplo, una secuencia de aminoácido mostrada como la SEQ ID NO:2 (humano, maduro), SEQ ID NO:9 (humana, longitud completa), SEQ ID NO:10, (Peromiscus), SEQ ID NO:12 {Bos), SEQ ID NO:4 (murino, madura), SEQ ID NO:11 (murino, longitud completa) o un fragmento de éste; (ii) una secuencia de aminoácido sustancialmente homologa a, por ejemplo, al menos 85%, 90%, 95%, 98%, 99% homologas con, una secuencia de aminoácido mostrada como la SEQ ID NO.2 (humano, maduro) la SEQ ID NO:9, (humano, longitud completa), SEQ ID NO:10, {Peromyscus), SEQ ID NO:12, (Bos), SEQ ID NO:4, (murina, maduro), o SEQ ID NO:1 1 , (murina, longitud completa), o un fragmento de esta; (iii) una secuencia de aminoácido que se codifica mediante una secuencia de nucleotido IL-21 de mamífero de ocurrencia natural o un fragmento de esta (por ejemplo SEQ ID NO:1 (humana) o la SEQ ID NO:3, (murina) o un fragmento de esta, por ejemplo, una región que codifica de una forma madura; (iv) una secuencia de aminoácido codificada por una secuencia de nucleotido que es sustancialmente homóloga a, por ejemplo, al menos 85%, 90%, 95%, 98%, 99% homologas a, una secuencia de nucleotido mostrada en la SEQ ID NO:1 , (humana) o la SEQ ID NO:3, (murina), o un fragmento de esta, (por ejemplo, una región que codifica una forma madura); (v) una secuencia de aminoácido codificada por una secuencia de nucleotido que degenera a una secuencia de nucleotido IL-21 de ocurrencia natural o un fragmento de esta, por ejemplo, SEQ ID NO:1 , (humana) o SEQ ID NO:3, (murina), o un fragmento de esta (por ejemplo, una región que codifica una forma madura); o (vi) una secuencia de aminoácido de al menos 115 de aminoácidos que se codifica por una secuencia de nucleotido que hibridiza al complemento de una de las secuencias de nucleotido anteriores bajo condiciones estrictas, por ejemplo, condiciones altamente estrictas (por ejemplo, la secuencia de nucleotido hibridiza en una región que codifica una proteína IL-21 madura). El IL-21 que se une al receptor IL-21 puede conducir a señalización STAT5 o STAT3 (Ozaki et al (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97:1 1439-11444). El polipéptido IL-21 se puede procesar de una proteína naciente que incluye una secuencia de señal a una proteina madura, de la cual la secuencia de señal ha sido removida. Secuencias similares u homologas (por ejemplo al menos aproximadamente 85% de identidad de secuencia) a las secuencias descritas aquí también son parte de esta solicitud. En alguna modalidad, la identidad de secuencia puede ser aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%; 97%, 98%, 99%, o mayor. Alternativamente, la identidad sustancial existe cuando los segmentos de ácido nucleico hibridizarán bajo condiciones de hibridización selectiva (por ejemplo condiciones de hibridización altamente estrictas), al complemento de la cadena. Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en las células completas, en un lisado de célula, o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. Los cálculos de "homología" o "identidad de secuencia" entre dos secuencias (los términos se utilizan intercambiablemente aquí) se desarrollan como sigue. Las secuencias se alinean para propósitos de comparación óptimos (por ejemplo, los espacios se pueden introducir en uno o ambos de un primer o un segundo aminoácido o secuencia de ácido nucleico para alineamiento óptimo y secuencias no homologas y las secuencias no homologas se pueden no tener en consideración para propósitos de comparación). En una modalidad preferida, la longitud de una secuencia de referencia alineada para propósitos de comparación es al menos 30%, preferiblemente al menos 40%, más preferible al menos 50%, aún más preferiblemente al menos 60%, y aún más preferiblemente al menos 70%, 80%, 90%, 100% de la longitud de la secuencia de referencia. Los residuos de aminoácido o nucleotidos en las correspondientes posiciones de aminoácido o posiciones de nucleótido son entonces comparadas. Cuando una posición en la primer secuencia se ocupa por el mismo residuo de aminoácido nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición (como se utiliza aquí aminoácido o "identidad" de ácido nucleico es equivalente a aminoácido u "homología" de ácido nucleico). La identidad porcentual entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartido por las secuencias, tomando en cuenta el número de espacios, y la longitud de cada espacio, que necesita ser introducida para alineamiento óptimo de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación de la identidad porcentual entre dos secuencias se puede lograr utilizando un algoritmo matemático. La comparación utiliza un programa GAP del paquete de software GCG (www.gcg.com) y los parámetros que incluyen una matriz de calificación Blossum 62 con una penalidad de espacio de 12, una penalidad de extensión de espacio de 4, y una penalidad de extensión de espacio de cambio de estructura de 5. Como se utiliza aquí, el termino "hibridiza bajo condiciones estrictas" describe condiciones para la hibridización y lavado. Las condiciones estrictas son conocidas por aquellos expertos en la técnica y se pueden encontrar en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Los métodos acuosos y no acuosos se describen en esa referencia y cualquiera puede ser utilizado. Un ejemplo preferido de condiciones de hibridización estrictas es la hibridización en cloruro de sodio /citrato de sodio 6X (SSC) a aproximadamente 45° C, seguido por uno o más lavados en 0.2X SSC, 0.1 % SDS a 50° C. Otro ejemplo de condiciones de hibridización estrictas son la hibridización en 6X SSC, aproximadamente a 45° C, seguido por una o más lavados en 0.2X SSC, 0.1 % SDS a 55° C. Un ejemplo adicional de condiciones de hibridización estrictas es la hibridización en 6X SSC, a aproximadamente 45° C, seguido por una o más lavados en 0.2X SSC, 0.1% SDS a 60° C. Preferiblemente, las condiciones de hibridización estrictas son hibridización en 6X SSC, a aproximadamente 45° C, seguido por una o más lavados en 0.2X SSC, 0.1% SDS a 65° C. Las condiciones altamente estrictas particularmente preferidas (y las condiciones que se deben utilizar si el practicante no tiene certeza a cerca de que condiciones se deben aplicar para determinar si una molécula está dentro de una limitación de hibridización) son 0.5M de fosfato de sodio, 7% SDS a 65° C, seguido por una o más lavados a 0.2X SSC, 1 % de SDS a 65° C. Un polipéptido IL-21 puede tener sustituciones de aminoácido conservadoras o no esenciales, que no tengan un efecto sustancial en sus funciones. Una "sustitución de aminoácido conservadora" es aquella en la cual el residuo de aminoácido reemplazado con un residuo aminoácido tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácido que tienen cadenas laterales similares han sido definidas en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, licina, arginina, histidina), cadenas laterales acídicas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). En una modalidad, el polipéptido IL-21 es sustancialmente humano. Un polipéptido IL-21 "sustancialmente humano" es un polipéptido IL-21 que incluye un número suficiente de posiciones de aminoácido humano tal que el polipéptido no elicita una respuesta inmunogénica en un humano normal y así de esta forma el polipéptido IL-21 interactúa con un receptor IL-21 humano. Las formas de los polipéptidos IL-21 de menos de longitud completa se pueden utilizar en los métodos y composiciones, descritos, siempre y cuando tales formas retengan la capacidad de unirse a un receptor IL-21. En una modalidad, la forma es un polipéptido IL-21 funcional, por ejemplo, una forma que puede activar la señalización de senda IL-21. Los polipéptidos IL-21 de menos de la longitud completa se pueden producir, por ejemplo, al expresar un fragmento correspondiente de un polinucleótido que codifica la proteína IL-21 de longitud completa en una célula huésped, o al expresar un polinucleótido que codifica una proteína modificada (por ejemplo si se remueven uno o más aminoácidos internos).

Una forma de polipéptido IL-21 que es menos que la longitud completa es IL-21 maduro, por ejemplo, IL-21 de la SEQ ID NO:2. Otra forma de polipéptido que es más corta que la longitud completa, el IL-21 maduro, por ejemplo menos de 131 , 130, 129, 128, o 125 aminoácidos, por ejemplo, entre 115 y 130 aminoácidos de longitud. Por ejemplo, el polipéptido IL-21 derivado de la SEQ ID NO: 2 puede perder los 8 finales aminoácidos, o un subconjunto de estos, por ejemplo, el polipéptido IL-21 comprende los aminoácidos 1-122 de la SEQ ID NO: 2. Los fragmentos de polinucleótidos correspondientes se pueden también utilizar en los métodos y composiciones descritas aquí. Los polinucleótidos modificados como se describieron anteriormente pueden ser hechos mediante técnicas de biología molecular estándar, que incluyen la construcción de mutantes de supresión deseados apropiados, métodos de mutagénesis dirigida al sitio o mediante reacción de cadena de polimerasa utilizando iniciadores de oligonucleótido apropiados. Un polipéptido IL-21 puede ser marcado. Por ejemplo, un polipéptido marcado se puede utilizar para monitorear los niveles del polipéptido en un sujeto cuando se administra al sujeto. De manera similar, el polipéptido marcado se puede utilizar para monitorear la distribución del polipéptido en el sujeto, por ejemplo, al sacar imágenes del sujeto. El polipéptido puede ser marcado radioactivamente o marcado con un marcador detectable con MRI. Las radiomarcas de ejemplo incluyen: 131l, 111ln, 23l, 99mTc> 32Rj 125, 3| 14^ y i88Rh Marcas detectables con MRI de ejemplo incluyen: agentes de contraste tales como agentes magnéticos, agentes paramagnéticos (que alteran principalmente el T1 ) y agentes ferromagnéticos o superparamagnéticos (que alteran principalmente las respuestas T2). (Por ejemplo los quelatos EDTA, DTPA, y NTA) se pueden utilizar para unir (y reducir toxicidad) de algunas sustancias paramagnéticas (por ejemplo, Fe+3, Mn+2, Gd+3). También es posible unir un átomo activo RMN tal como el átomo 19F. En una modalidad, el agonista de senda IL-21 es una proteína de fusión que incluye (i) un polipéptido IL-21 maduro, por ejemplo un polipéptido IL-21 de humano o de murino, o un fragmento de estos y (ii) una segunda porción, por ejemplo, un polipéptido, tal como un dominio Fe o una etiqueta de purificación. Como se utiliza aquí, una "proteína de fusión" se refiere a una proteína que contiene dos o más proteínas operablemente asociadas, por ejemplo, ligados, porciones, por ejemplo, porciones de proteína. Preferiblemente, las porciones se asocian covalentemente. Las porciones pueden ser directamente asociadas, o conectadas por vía de un espaciador o ligador. La descripción adicional de las proteínas de fusión IL-21 están disponibles en la Solicitud U.S. Serie No. 10/806,611 , presentada en Marzo 22, 2004.

El receptor IL-21 La mayoría de las citoquinas se unen a los receptores de citoquina clase I o clase II. Los receptores de citoquina clase II incluyen los receptores para IL-10 y los interferones, mientras que los receptores de citoquina clase I incluyen los receptores para IL-2, IL-7, IL-9, IL-1 1-13, IL-15, así como también los factores de crecimiento hematopoiéticos, leptina y la hormona de crecimiento (Cosman (1993) Cytokine 5: 95-106). El receptor IL-21 humano es un receptor de citoquina clase I que se expresa mediante células linfoides, particularmente mediante células NK, B y T (Parrish-Novak et al. (2000) supra). Las secuencias de ácido nucleico de ejemplo que codifican la interleuquina 21 de humano (IL-21 ) y su receptor (IL-21 R) se describen en la WO 00/53761 , WO 01/85792, Parrish-Novak et al. (2000) supra, y Ozaki et al. (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97: 1 1439-11444, como lo son las secuencias de aminoácido correspondientes. El receptor IL-21 muestra homología de alta secuencia a la cadena receptora ß IL-2 y a la cadena receptora a IL-4 (Ozaki et al (2000) supra). Luego de la unión del ligando, el receptor IL-21 se asocia con la cadena receptora de citoquina gama común, (yC) que se comparte por los receptores IL-2, IL-3, IL-4, IL-7, IL-9, IL-13 e IL-15 (Ozaki et al (2000) supra; Asao et al. (2001 ) J. Immunol. 167: 1 -5). Los términos "MU-1 ", "proteína MU-1 ", "receptor interleuquina 21", o "IL-21 R", se refiere a un receptor (por ejemplo, de mamífero, por ejemplo, de origen murino o humano) que escapaz de interactuar con, por ejemplo, unión a IL-21 (por ejemplo, de mamífero, por ejemplo, IL-21 de murino o humano) y que tiene una de las siguientes características: (i) una secuencia de aminoácido de un receptor IL-21 de mamífero de ocurrencia natural o un fragmento de estos, por ejemplo, una secuencia de aminoácido mostrada en la SEQ ID NO: 6 (humano) o SEQ ID NO: 8 (murino) o un fragmento de estos (por ejemplo la región madura); (ii) una secuencia de aminoácido sustancialmente homologa a, por ejemplo, al menos 85%, 90%, 95%, 98%, 99% homologas a, una secuencia de aminoácido mostrada en la SEQ ID NO: 6 (humano) o la SEQ ID NO: 8 (murino) o un fragmento de estos (por ejemplo la región madura); (iii) una secuencia de aminoácido que está codificada por una secuencia de nucleótido de receptor IL-2 de mamífero de ocurrencia natural (por ejemplo SEQ ID NO: 5) (humano) o la SEQ ID NO: 7 (murino)) o un fragmento de estas (por ejemplo al región madura); (iv) una secuencia de aminoácido codificada por una secuencia de nucleótido que es sustancialmente homologa a, por ejemplo, al menos 85%, 90%, 95%, 98%, 99% homologas a, una secuencia mostrada como la SEQ ID NO: 5 (humana) o SEQ ID NO: 7 (murino) o un fragmento de este (por ejemplo la región madura), (v) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótido que degenera con respecto a una secuencia de nucleótido de receptor IL-21 de ocurrencia natural o un fragmento de esta, por ejemplo, SEQ ID NO: 5 (humano) o SEQ ID NO: 7 (murino) o un fragmento de esta (por ejemplo la región madura); o (vi) una secuencia de aminoácido, de al menos 450 aminoácidos que es codificado por una secuencia de nucleótido que hibridiza a una de las secuencias de nucleótido anteriores bajo condiciones estrictas, por ejemplo, condiciones altamente estrictas. La región madura del receptor IL-21 listado en la SEQ ID NO: 6 es de aproximadamente 20-538 aminoácidos. Los fragmentos de ectodominio de ejemplo que se pueden utilizar incluyen aproximadamente los aminoácidos 20-218 o 20-232. La siguiente es una secuencia de aminoácido de ejemplo del receptor IL-21 humano (SEQ ID NO: 6) MP GWAAPLL LLLLQGGWGC PDLVCYTDYL OTVICILEMVI NLHPSTLTLT WGEK3YEELKD 60 EATSCStrHRG ???????????? CKMDVFHFMA DDIFSVNITD QSGNYSQECG SFLLAES1 P 120 APPFNVTVTF SGQYNISWRS DYEDPAFY L KGKLOYELOY SNRG PKAVS PRR LISVDS 1Ü0 RS SLLiLBF RKDSSYSJJQV RAGPMPGSSY QGTWSEWSDP VIFQ QSEEL KEGWNPHLLL 240 LLLLVIVFI P AFWSLKTHPL RLWKKIWAV PSPERFFMPL VKGCSGDPKK WVGAPFTGSS 300 LELGP SPEV PSTLEVYSCH P RSPAKRLQ LTELQEPAEL VESDGVPKPS FWPTAQNSGG 3 60 SAYSEERDRP YGLVSIDTVT VLDAEGPCTW PCSCEDDGYP ALDLDAGLEP SPGLEDPLLD 420 AGTTVLSCGC VSAGSPGLGG PLGSLLDRLK PPLADGEDWA GGLPV7GGRSP GGVSESEAGS 4 80 PLAGLDMDTF DSGFVGSDCS SPVECDFTSP GDEGPPRSYL RQWWIPPPL SSPGPQAS 53 8 La siguiente es una secuencia de aminoácido de ejemplo del receptor IL-21 de murino (SEQ ID NO: 8): MPRGPVAALL LLILKGAWSC LDLTCYTDYL WTITCVLETR SPNPSILSLT WQDEYEELQD QETFCSLHRS GHNTTHIWYT CHMRLSQFLS DEVFIV VTD QSGN SQECG SFVLAESIKP APPLNVTVAF SGRYDISWDS AYDEPSNYVL RGKLQYELQY R LRDPYAVR PVT UISVDS RNVSLLPEEF H DSSYQLQV RAAPQPGTSF RGT SEWSDP VI FQTQAGEP EAGWDPHMLL LLAVLIIVLV FMGLKIHLPW RLWKKIWAPV PTPESFFQPL YREHSGNFKK WVNTPFTASS IELVPQSSTT TSALHLSLYP AKEK FPGLP GLEEQLECDG MSEPGHWCI I PLAAGQAVSA YSEERDRPYG LVSIDTVTVG DAEGLCVWPC SCEDDGYPAM NLDAGRESGP NSEDLLLVTD PAFLSCGCVS GSGLRLGGSP GSLLDRLRLS FAKEGDWTAD PTWRTGSPGG GSESEAGSPP GLDMDTFDSG FAGSDCGSPV ETDEGPPRSY LRQWVVRTPP PVDSGAQSS Un IL-21 R/MU-1 cADN de ejemplo se deposita con el American Type Culture Collection en Marzo 10, 1998, como número de acceso ATCC 98687. Un receptor IL-21 puede tener sustituciones de aminoácido adicionales conservadoras o no esenciales, que no tienen un efecto sustancial en sus funciones, por ejemplo, la sustitución descrita aquí. El receptor IL-21 es un receptor de la familia de citoquina clase I, también conocido como NILR (WO 01/85792; Parrish-Novak et al. (2000) Nature 408:57-63; Ozaki et al. (2000 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97: 1 1439-11444). El receptor IL-21 se expresa en un tejido linfoide. El receptor IL-21 es homólogo a la cadena ß compartida de los receptores IL-2 e IL-15, y la cadena a del receptor IL-4 (Ozaki et al. (2000) supra). Luego de la unión del ligando el IL — 21 R/MU-1 es capaz de interactuar con la cadena receptora de citoquina ? común (yC) (Asao et al. (2000) J. Immunol. 167: 1-5), e induce la fosforilación del STAT1 y STAT3 ((Asao et al. (2001 ) J. Immunol. 167: 1 -5 o STAT5 (Ozaki et al. (2000). El término "complejo del receptor IL-21 " se refiere a un complejo de proteína que incluye el receptor IL-21 y al menos un componente de proteína asociado a la célula adicional, por ejemplo, la cadena ß o la cadena de receptor de citoquina ? común. Típicamente, el complejo receptor IL-21 incluye el receptor IL-21 , la cadena ß y la cadena de receptor de citoquina ? común. La frase "una actividad biológica de" un receptor 11-21 se refiere a una o más de las actividades biológicas del correspondiente receptor IL-21 maduro, que incluye, pero no está limitado a, (1 ) interactuar con, por ejemplo, unirse a, un polipéptido IL-21 (por ejemplo un polipéptido IL-21 humano); (2) asociarse con las moléculas de transducción de señal; por ejemplo, yC, jak1 ; (3) estimular la fosforilación y/o la activación de las proteínas STAT, por ejemplo STAT5 y/o STAT3; y/o (4) modular, por ejemplo, estimular o disminuir, proliferación, diferenciación, función de célula agonista, actividad citolítica, secreción de citoquina y/o supervivencia de células inmunes, por ejemplo, células T (Células T CD8+, CD4+), células NK, Células B, macrófagos y megacariocitos).

Agonistas de Senda IL-21 de Ejemplo Adicionales En una modalidad, un agonista de senda IL-21 es un agente que interactúa con el receptor IL-21 , pero es diferente de un polipéptido IL-21 . Por ejemplo, el agente puede ser una inmunoglobulina, por ejemplo, un anticuerpo de longitud completa o fragmento de anticuerpo, que interactúa con un receptor IL-21 y que dispara la actividad de señalización de la senda IL-21 , por ejemplo, al agonizar el receptor. En una modalidad, un agonista de senda IL-21 es un agente que interactúa con el receptor IL-21 y otra subunidad receptora, por ejemplo, yC. Por ejemplo, el agente puede ser una proteina que interactúa con el receptor IL-21 y otra subunidad receptora por ejemplo yC. La proteína puede ser, por ejemplo, un anticuerpo biespecífico que incluye un sitio de unión a antígeno que interactúa con el receptor IL-21 y otro sitio de unión a antígeno que interactúa con yC. La unión de tal proteína se puede utilizar para reticular y agonizar el receptor, por ejemplo, activar e incrementar la señalización del STAT3 o STAT5.

En una modalidad, un agonista de senda IL-21 es un agente, (por ejemplo, una inmunoglobulina) que estabiliza una interacción IL-21/IL-21 R, por ejemplo, al unir uno o ambos de los receptores IL-21 e IL-21. Un agonista de senda IL-21 se puede identificar, por ejemplo, al seleccionar librerías de proteína, librerías químicas, elaboradas por ingeniería y diseño, o evaluar un compuesto de ensayo, por ejemplo, para unión y/o activación de un receptor IL-21 utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Los ensayos de unión que utilizan una proteína de unión deseada, inmovilizada o no, son conocidos en la técnica y se pueden utilizar para este propósito utilizando la proteína receptora IL-21 como se describe aquí. Se pueden utilizar ensayos de selección (célula libre) basados en proteína o basados en células purificadas para identificar tales agonistas. Por ejemplo, se puede inmovilizar la proteína receptora IL-21 en forma purificada sobre un vehículo y se puede medir la unión o ligandos potenciales a la proteína receptora IL-21 purificada. Los ensayos basados en células para evaluar la actividad receptora IL-21 y las señalizaciones STAT (por ejemplo STAT1 , STAT3, o STAT5) son conocidos. Los ejemplos son descritos aquí y, en Asao et al. (2001 ) J. Immunol. 167; 1-5, Ozaki et al. (2000) supra, USSN 10/806,6 , presentada en Marzo de 2004. y US 2003-0108549.

Antagonistas de la senda IL-21 En otro aspecto de la invención, se puede utilizar un antagonista de la senda IL-21 para incrementar la producción de IgE y/o disminuir la producción de IgG. Un "antagonista de la senda IL-21" es un agente que disminuye la señalización de senda IL-21. Por ejemplo, tal un agente puede disminuir la actividad del receptor IL-2 . Los antagonistas de la senda IL-21 de ejemplo incluyen agentes que se unen al receptor IL-21 o IL-21. Un anticuerpo que se une al IL-21 puede evitar que el IL-21 interactúe con el receptor IL-21 o de activar el receptor IL-21. Otro agente que se une al IL-21 y puede funcionar como un antagonista de senda es una forma soluble de receptor IL-21 , por ejemplo, el ectodominio del receptor IL-21 , u otra región del receptor suficiente para interactuar con el IL-21. En una modalidad, el agente es una proteína de fusión Fe que incluye un dominio y región Fe del receptor suficiente para interactuar con el IL-21. Un anticuerpo que se une al receptor IL-21 también puede funcionar como un antagonista de senda. Tal anticuerpo puede evitar que el IL-21 interactúe con o active el receptor. Todavía otros antagonistas de senda incluyen inhibidores de molécula pequeña de los componentes de señalización citoplasmática, por ejemplo, inhibidores de molécula pequeña STAT3 y STAT5. Las moléculas de ácido nucleico que pueden funcionar como antagonistas de senda se describen adelante.

Inmunoqlobulinas Las moléculas de inmunoglobulina se pueden utilizar para modular la actividad de la senda IL-21. Por ejemplo, una clase de moléculas de inmunoglobulina incluyen moléculas que se unen al receptor IL-21 e incrementan la actividad de la senda IL-21. Otra clase de ejemplo de moléculas de inmunoglobulina incluyen moléculas que se unen al polipéptido IL-21 o al receptor IL-21 y disminuyen la actividad de la senda IL-21. Una inmunoglobulina típica es un anticuerpo. Como se utiliza aquí el término "anticuerpo" se refiere a una proteína que comprende al menos una, y preferiblemente dos, dominios de variable de cadena pesada (H) (abreviado aquí como VH), y al menos uno y preferiblemente dos dominios variables de cadena ligera (L) (abreviado aquí como VL) los dominios VL y VH pueden además estar subdivididos en regiones de hípervariabilidad, denominadas "regiones determinantes de complementariedad" ("CDR"), entremezclada con regiones que son más conservadas, denominadas "regiones marco" (FR). La extensión de la región marco y los CDR se han definido precisamente (ver, Kabat, E.A., et al. (1991 ) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Departament of Health and Human Services, Publicación NIH No 91 -3242, y Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917, que se incorpora aquí como referencia) cada VH y VL está compuesto de tres CDR y cuatro FR dispuestos del terminal amino al terminal carboxi en el siguiente orden: FR1 , CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Los anticuerpos de camélido pueden incluir un dominio de inmunoglobulina variable simple. El anticuerpo puede además incluir una región constante de cadena pesada y ligera, para formar por de esta manera una cadena de inmunoglobulina pesada y ligera, respectivamente. En una modalidad el anticuerpo es un tetrámero de dos cadenas de inmunoglobulina pesadas y dos cadenas de inmunoglobulina ligeras, en donde las cadenas de inmunoglobulina pesada y ligera están interconectadas mediante, por ejemplo, enlaces de disulfuro. La región constante de cadena pesada está comprendida de tres dominios, CH1 , CH2 y CH3. La región constante de cadena ligera está comprendida de un dominio, CL. El dominio variable de las cadenas pesada y ligera contiene un dominio de unión que interactúa con un antígeno. La región constante de los anticuerpos típicamente media en la unión del anticuerpo a los tejidos o factores huéspedes, que incluyen varias células del sistema inmune (por ejemplo células agonistas) y el primer componente (Clq) del sistema de complemento clásico. Como se utiliza, aquí el término "inmunoglobulina" se refiere a una proteína que incluye uno o más polipéptidos que tienen un dominio que forma un doblez de inmunoglobulina. Un dominio de inmunoglobulina es aproximadamente un cilindro (aproximadamente 4 x 2.5 x 2.5 nm) con dos capas de proteína extendidas: una capa contiene tres hebras de cadena de polipéptido y la otra contiene cuatro. En cada capa las hebras adyacentes son anti-paralelas y forman una lámina ß. Las dos capas son aproximadamente paralelas y están a menudo conectadas por un enlace disulfuro intracadena. Una inmunoglobulina puede incluir una región codificada por un gen de inmunoglobulina. Los genes de inmunoglobulina humano reconocidos incluyen los genes de región constante Kappa, lambda, alfa (lgA1 e lgA2), gamma (lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4) delta, épsilon y mu, así como también la miríada de genes de inmunoglobulina y de segmentos de gen. La inmunoglobulina de longitud completa "cadenas ligeras" (aproximadamente 25 kd o 214 aminoácidos) son codificados por un gen de región variable en el terminal NH2 (aproximadamente 110 aminoácidos) y el gen de región constante kappa o lambda en el terminal COOH. Las "cadenas pesadas" de inmunoglobulina de longitud completa (aproximadamente 50 kd o 446 aminoácidos), son similarmente codificados por un gen de región variable (aproximadamente 116 aminoácidos) y uno de los otros genes de región constante anteriormente mencionados, por ejemplo gamma (codifica aproximadamente 330 aminoácidos). Como se utiliza aquí, "isotipos" se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo IgM, lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4) que es codificado por los genes de región constante de cadena pesada. El término "fragmento de unión de antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de anticuerpo" o "fragmento") como se utiliza aquí se refiere a uno o más fragmentos de anticuerpo de longitud completa que retienen la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo receptor IL-21 ). Ejemplos de fragmentos de unión comprendidos dentro del término "fragmento de unión de antígeno" de un anticuerpo incluye (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios VL, VH, CL y CH1 ; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados por un puente de disulfuro en la región de articulación; (iii) un fragmento Fd consiste de los dominios VH y CH1 ; (iv) un fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un brazo simple de un anticuerpo, (v) un fragmento de dAb (Ward et al. (1998) Nature 341 : 544-546), que consiste de un dominio VH; y (vi) una región determinante de complementariedad aislada (CDR). Adicionalmente, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, ellos se pueden unir, utilizando métodos recom binantes, mediante un ligador sintético que les posibilita ser hechos como una cadena de proteína simple en la cual el par de dominios VL y VH forman moléculas monovalentes (conocidas como cadena simple Fv (scFv); por ejemplo. Bird et al. (1998) Science 242:423-426; y Huston et al. (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Tales anticuerpos de cadena simple también pretenden estar comprendidos dentro del término "fragmento de unión de antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen utilizando técnicas convencionales conocidas por aquellos expertos en el arte y los fragmentos se seleccionan para utilidad de la misma manera como lo son los anticuerpos intactos. Un dominio variable de inmunoglobulina "sustancialmente humano" es un dominio variable de inmunoglobulina que incluye un número suficiente de posiciones de aminoácido de estructura humana de tal forma que el dominio variables de inmunoglobulina no elicita una respuesta inmunogénica en un humano normal. Un anticuerpo "sustancialmente humano" es un anticuerpo que incluye un número suficiente de posiciones de aminoácido humano tal que el anticuerpo no elicita una respuesta inmunogénica en un humano normal. Los dominios variables de inmunoglobulina humana y sustancialmente humana y los anticuerpos se pueden utilizar. El polipéptido IL-21 y las proteínas receptoras IL-21 pueden ser utilizadas para inmunizar animales (por ejemplo animales no humanos y animales no humanos incluyen los genes de inmunoglobulina humana) para obtener anticuerpos policlonales y monoclonales que específicamente reaccionan con el polipéptido IL-21 o una proteína receptora IL-21 y que puede activar un receptor IL-21. Tales anticuerpos se pueden obtener utilizando la proteína madura completa como un inmunógeno, o al utilizar fragmentos de IL-21/IL-21 R (por ejemplo fragmentos solubles y péptidos pequeños). Los inmunógenos de péptido adicionalmente pueden contener un residuo de cisteína en el terminal carboxilo, y están conjugados a un hapteno tal como la hemocianina de lapa califomiana (KLH). Los inmunógenos de péptido adicionales se pueden generar al reemplazar residuos de tirosina con residuos de tirosina sulfatados. Los métodos para sintetizar tales péptidos son conocidos en la técnica, por ejemplo, como en R.P. Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85,2149-2154 (1963); J. L. Krstenansky, et al. FEBS lett. 211 ,10 (1987). Los anticuerpos monoclonales o humanos (mAbs) dirigidos contra el IL-21 o el receptor IL-21 se pueden generar utilizando ratones transgénicos que llevan los genes de inmunoglobulina humana en lugar del sistema de ratón. Los esplenocítos provenientes de estos ratones transgénicos inmunizados con el antígeno de interés se utilizan para producir hibridomas que secretan mAbs humano con afinidades especificas para los epítopos de la proteína humana (ver, por ejemplo, WO 91/00906, WO 91/10741 , WO 92/03918, WO 92/03917; Lonberg, N. et al. 1994 Nature 368:856-859; Green, L.L. et al. 1994 Nature Genet. 7:13-21 ; Morrison, S.L. et al. 1994 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81 :6851-6855; Bruggeman et al. 1993 Year Immunol 7:33-40; Tuaillon et al. 1993 PNAS 90:3720-3724; Bruggeman et al. 1991 Eur J Immunol 21 :1323-1326). Los anticuerpos monoclonales también se pueden generar mediante otros métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica de la tecnología de ADN recombinante. Un método alternativo, denominado como el método de "exhibición de anticuerpo combinatorio", se ha desarrollado para identificar y aislar fragmentos de anticuerpo que tienen una especificidad de antígeno particular, y se pueden utilizar para producir anticuerpos monoclonales (para las descripciones de exhibición de anticuerpo combinatorio ver por ejemplo Sastry et al. 1989 PNAS 86:5728; Huse et al. 1989 Science 246:1275; y Orlandi et al. 1989 PNAS 86:3833). Después de inmunizar un animal con un inmunógeno como se describió anteriormente, el repertorio del anticuerpo del grupo de célula B resultante se clona. Los métodos son generalmente conocidos para obtener la secuencia de ADN de los dominios variables de una población diversa de moléculas de inmunoglobulina al utilizar una mezcla de iniciadores de oligómero y PCR. Por ejemplo, los iniciadores de oligonucleótido que corresponden a las secuencias líder 5' (péptido de señal) y/o las secuencias de estructura 1 (FR1 ), así como también el iniciador a un iniciador de región constante 3' conservado se puede utilizar para amplificación PCR de los dominios variables de cadena pesada y ligera de un número de anticuerpos de murino (Larrick et al. 1991 , Biotechniques 1 1 :152-156). Una estrategia similar puede también haber sido utilizada para amplificar los dominios variables de cadena pesada y ligera de los anticuerpos humanos (Larrick et al. 1991 , Methods: Companion to Methods in Enzymology 2:106-1 10). Los anticuerpos quiméricos, que incluyen las cadenas de inmunoglobulina quimérica, se pueden producir mediante técnicas de ADN recombinante conocidas en el técnica. Por ejemplo, un gen que codifica una región constante Fe de una molécula de anticuerpo monoclonal de murino (u otras especies) se digiere con enzimas de restricción para remover la región que codifica el Fe de murino, y la porción equivalente de un gen que codifica una región constante Fe humana se sustituye (ver Robinson et al. Publicación de Patente Internacional PCT/US86/02269; Akira, et al., solicitud de Patente Europea 184,187; Taniguchi, M., solicitud de Patente Europea 171 ,496; Morrison et al., solicitud de Patente Europea 173,494; Neuberger et al., solicitud Internacional WO 86/0 533; Cabilly et al. Patente U.S. No. 4,816,567; Cabilly et al., solicitud de Patente Europea 125,023; Better et al.(1988 Science 240:1041-1043); Liu et al. (1987) PNAS 84:3439-3443; Liu et al., 1987, J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al. (1987)PAWS 84:214-218; Nishimura et al., 1987, Canc. Res. 47:999-1005; Word et al. (1985) Nature 314:446-449; y Shaw et al., 1988, J. Nati Cáncer Inst. 80:1553-1559).

Un anticuerpo o una cadena de inmunoglobulina se puede humanizar mediante métodos conocidos en la técnica. Los anticuerpos humanizados, que incluyen cadenas de inmunoglobulina inmunizada, se pueden generar al reemplazar secuencias del dominio variable Fv que no están directamente involucradas en la unión de antígeno con secuencias equivalentes de los dominios variables Fv humanos. Los métodos generales para generar anticuerpos humanizados se suministran en Morrison, S.L., 1985, Science 229:1202-1207, por Oi et al., 1986, Bio Techniques 4:214, y por Queen et al. US 5,585,089, US 5,693,761 y US 5,693,762, cuyos contenidos todos se incorporan aquí como referencia. Aquellos métodos incluyen aislar, manipular, y expresar las secuencias de ácido nucleico que codifican todo o parte de los dominios variables Fv de inmunoglobulina de al menos una cadena pesada o ligera. Las fuentes de tal ácido nucleico son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica y, por ejemplo, se pueden obtener de un hibridoma que produce un anticuerpo contra un blanco predeterminado. El ADN recombinante que codifica el anticuerpo humanizado, o fragmento de este, se puede clonar en un vector de expresión apropiado. Las moléculas de anticuerpo humanizadas o injertadas con CDR o las inmunoglobulinas se pueden producir mediante injerto CDR o sustitución CDR en donde una, dos, o todos los CDR de una cadena de inmunoglobulina se pueden reemplazar. Ver, por ejemplo, patente U.S. 5,225,539; Jones et al. 1986 Nature 321 :552,525; Verhoeyan et al. 1988 Science 239:1534; Beidler et al.1988 J. Immunol. 141 :4053-4060; Winter US 5,225,539), cuyos contenidos todos son incorporados expresamente aquí como referencia. Winter describe el método de injerto de CDR que se puede utilizar para preparar los anticuerpos humanizados (solicitud de Patente Británica GB 2188638A, presentada en marzo 26, 1987; Winter US 5,225,539), los contenidos se incorporan expresamente aquí como referencia. Todos los CDR de un anticuerpo humano en particular se pueden reemplazar con al menos una porción de un CDR no humano o solamente algunos de los CDR se pueden reemplazar con CDR no humano. Solo es necesario reemplazar el número de CDR requeridos para unir el anticuerpo humanizado a una región predeterminada. En algunas implementaciones, los anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados se pueden modificar mediante por ejemplo, suprimir, agregar, o sustituir otras posiciones del anticuerpo, por ejemplo, la región constante. Por ejemplo, un anticuerpo se puede modificar como sigue: (i) al suprimir la región constante; (ii) al reemplazar la región constante con otra región constante, por ejemplo, una región constante significa incrementar la vida media, estabilidad o afinidad del anticuerpo, o una región constante de otras especies o clases de anticuerpo; o (iii) al modificar uno o más aminoácidos en la región constante para alterar por ejemplo, el número de sitios de glicosilación, la función de célula agonista, la unión del receptor Fe (FcR), la fijación de complemento, entre otros. Se conocen métodos para alterar las regiones constantes de anticuerpo. Los anticuerpos con función alterada, por ejemplo, afinidad alterada para un ligando agonista, tal como FcR sobre una célula, o el componente C1 del complemento se pueden producir al reemplazar al menos un residuo de aminoácido en la porción constante del anticuerpo con un residuo diferente (ver por ejemplo., EP 388,151 A1 , US 5,624,821 y US 5,648,260). El tipo similar de alteraciones se puede describir el cual si se aplica al murino u otras especies de inmunoglobulina reducirían o eliminarían estas funciones.

Antagonistas de Ácido Nucleico de la Senda de IL-21 En ciertas implementaciones, los antagonistas de ácido nucleico se utilizan para disminuir la actividad de la senda IL-21 , por ejemplo, para disminuir la producción IgG. En una modalidad, el antagonista de ácido nucleico es un siARN que apunta a la mARN que codifica un polipéptido IL-21 o un receptor IL-21 , u otro componente de senda IL-21 que actúa positivamente se puede utilizar para disminuir la actividad de la senda IL-21. Otros tipos de ácidos nucleicos antagonistas también se pueden utilizar, por ejemplo, un aptámero de ácido nucleico, un dsARN, una ribozima, un formador de hélice triple, o un ácido nucleico antisentido. Los si ARN son ARN con hebras dobles pequeñas (dsARN) que opcionalmente incluyen sobresalientes. Por ejemplo, la región dúplex de un siARN es de aproximadamente 18 a 25 nucleótidos de longitud, por ejemplo, aproximadamente 19, 20, 21 , 22, 23 o 24 nucleótidos de longitud. Típicamente las secuencias de siARN son exactamente complementarias al mARN blanco.

Los dsARN y los siARN en particular se pueden utilizar para silenciar la expresión del gen en las células de mamífero (por ejemplo células humanas). Ver, por ejemplo, Clemens, J.C. et al. (2000) Proc. Nati. Acad Sci. USA 97,6499-6503; Billy, E. et al. (2001 ) Proc Nati Acad Sci USA 98, 14428-14433; Elbashir et al. (2001 ) Nature. 41 1 (6836):494-8; Yang. D. et al. (2002) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 99, 9942-9947, U.S. 20030166282, 20030143204, 20040038278, y 20030224432. Las descripciones de otros tipos de agentes de ácido nucleico también están disponibles. Ver, por ejemplo, patente. U.S. No. 4,987,071 ; patente U.S. No. 5,116,742; patente U.S. No. 5,093,246; Woolf et al. (1992) Proc Nati Acad Sci USA; Antisense RNA and DNA, D.A. Melton, Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998); 89:7305-9; Haselhoff and Gerlach (1988) Nature 334:585-59; Helene, C. (1991 ) Anticáncer Drug Des. 6:569-84; Helene (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36; y Maher, L.J. (1992) Bioassays 14:807-15.

Producción de Proteína Recombinante Las proteínas que codifican ácidos nucleicos que funcionan como agentes para los métodos descritos aquí pueden estar operablemente ligadas a una secuencia de control de expresión en un vector (tal como los vectores de expresión pMT2 o pED descritos en Kaufman et al., Nucleic Acids Res. 19, 4485-4490 (1991 )), con en el fin de producir la proteína recombinantemente. Se conocen muchas secuencias de control de expresión adecuada. Los métodos generales para expresar las proteínas recombinantes también son conocidos y son ejemplificados en R. Kaufman, Methods in Enzymology 185,537-566 (1990), Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001 ) and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing Associates y Wiley Interscience, N.Y. (1998). Como se define aquí "ligado operablemente" significa ligado enzimático o químicamente para formar un enlace covalente entre un polinucleótido particular que codifica una proteína de interés y la secuencia de control de expresión, de tal manera que la proteína de interés (por ejemplo IL-21 u otro agonista de senda IL-21 ) se expresa mediante una célula huésped que ha sido transformada (transfectada) con el polinucleótido/secuencia de control de expresión ligada. El término "vector" como se utiliza aquí, se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar, o sostener el mantenimiento o replicación de, otro ácido nucleico al que este ha sido ligado. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un aro de ADN con hebra doble en el cual pueden ser ligados los segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde los segmentos de ADN adicionales se pueden adicionar en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en la cual ellos son introducidos (por ejemplo los vectores bacteriales que tienen un origen bacterial de replicación y vectores de mamífero episomales). Otros vectores (por ejemplo vectores de mamífero no episomales) se pueden integrar en el genoma de una célula huésped luego de la introducción en la célula huésped, y de esta manera son replicados junto con el genoma huésped. Más aún ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de los genes a los cuales ellos están operablemente ligados. Tales vectores se denominan aquí como "vectores de expresión recombinante" o "vectores de expresión". Los vectores virales de ejemplo incluyen retrovirus defectuoso de replicación, adenovirus y virus adenoasociados. El término "secuencia reguladora" pretende incluir promotores, mejoradores y otros elementos de control de expresión (por ejemplo señales de poliadenilación) que controlan la transcripción o la traducción de los genes de cadena de anticuerpo. Tales secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academia Press, San Diego, CA (1990). La selección de las secuencias reguladoras pueden depender de tales factores como la escogencia de la célula huésped a ser transformada, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc. Las secuencias reguladoras de ejemplo para la expresión de célula huésped de mamífero incluyen elementos virales que dirigen altos niveles de expresión de proteína en células de mamífero tales como los promotores y/o mejoradores derivados de el promotor FF-1a y BGH poli A, citomegalovirus (CMV) (tal como el promotor/mejorador CMV), Virus de Simio 40 (SV40) (tal como el promotor/mejorador ESV40), adenovirus, (por ejemplo el promotor tardío mayor de adenovirus (AdMLP)) y polioma. Para descripciones de ejemplos adicionales de elementos reguladores virales, y secuencias de estos, ver, por ejemplo, patente U.S. No. 5,168,062, patente U.S. No. 4,510,245, y patente U.S. No. 4,968,615. Los vectores de expresión recombinante pueden llevar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicación del vector en las células huésped (por ejemplo orígenes de replicación) y los genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la selección de las células huésped en la cual ha sido introducido el vector (ver por ejemplo patente U.S. No. 4,399,216, 4,634,665 y 5,179,017). Por ejemplo típicamente el gen marcador seleccionable confiere resistencia a las drogas, tal como G418, higromicina o metotrexato, en la célula huésped en la cual ha sido introducido el vector. Los genes marcadores seleccionables preferidos incluyen el gen de didrofolato reductasa (DHFR) (para uso de células huésped dhfr con selección/amplificación de metotrexato) y el gen neo (para selección G418). Un número de tipos de células pueden actuar como células huéspedes adecuadas para la expresión de una terapéutica de proteína. Cualquier tipo de célula capaz de expresar el terapéutico de proteína se puede utilizar. Las células huéspedes de mamíferos de ejemplo incluyen, por ejemplo, células COS de mono, células de Ovario de Hámster Chino (CHO), células 293 de riñon humano, células A431 epidermales humanas, células Colo205 humanas, células 3T3, células CV-1 , otras líneas celulares de primate transformadas, células diploide normales, cepas de células derivadas de cultivo in vitro de tejido primario, explantes primarios, células HeLa, células L de ratón, BHK, HL-60, U937, HaK, Rat2, BaF3, 32D, FDCP-1 , PC12, M1x o células C2C12.

Una terapéutica de proteína se puede producir al ligar operablemente un polinucleotido que codifica tal proteína a secuencias de control adecuadas en uno o más vectores de expresión de insecto, y empleando un sistema de expresión de insecto. Los materiales y métodos para los sistemas de expresión de célula de baculovirus/insecto están comercialmente disponibles, por ejemplo, en forma de kit de, por ejemplo, Invitrogen, San Diego, California. U.S.A. (el kit MAXBAC®), por ejemplo, como se describió en Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No 155 (1987). Las formas solubles de la proteína receptora IL-21 también se pueden producir en las células de insecto utilizando los polinucleótidos aislados apropiados, por ejemplo, las formas en las cuales la región que codifica uno o más, o segmentos suficientes, del dominio de transmembrana y el dominio citoplasmático se remueven. Un terapéutico de proteína se puede producir en eucariotes inferiores tales como levadura o en procariotes tales como bacteria. En las cepas de levadura adecuada se incluyen Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccaharomyces pombe, cepas de Kluyeveromyces, Pichia, Candida, o cualquier otra cepa de levadura capaz de expresar proteínas heterologas. Las cepas bacteriales adecuadas incluyen Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, o cualquier cepa bacterial capaz de expresar proteínas heterologas En una modalidad, el polipéptido IL-21 es producido en una célula bacterial sin una secuencia de señal (por ejemplo sin una secuencia de señal procariótica o eucariótica). La expresión en bacterias puede resultar en la formulación de cuerpos de inclusión que incorporan la proteína recombinante. Así, el redoblar de la proteína recombinante se puede requerir con el fin de producir material activo o más activo. Varios métodos para obtener proteínas heterólogas correctamente dobladas de los cuerpos de inclusión bacterial son conocidos en el arte. Estos métodos involucran generalmente solubilizar la proteína de los cuerpos de inclusión, luego de desnaturalizar la proteína completamente utilizando un agente caotrópico. Cuando los residuos de cisteína están presentes en la secuencia de aminoácido primaria de la proteína, la proteína se puede redoblar en un ambiente que facilite la formación correcta de los enlaces de disulfuro (por ejemplo un sistema redox). Los métodos generales para redoblar se describen en Cono, Meth. Enzym., 185:187-195 (1990). EP 0433225 y U.S. 5,399,677. Asano et al. (2002) FEBS Lett. 528(1 -3):70-6 describen un método de ejemplo para redoblar IL-21 producido en células bacteriales. Por ejemplo, el rlL-21 (recombinante IL-21 ) se expresa como cuerpos de inclusión insoluble en E.coli, luego solubilizados (por ejemplo utilizando un desnaturalizante) y redoblados al utilizar un método de diálisis modificado en el cual se introducen los reactivos redox. La proteína agonista de la senda IL-21 o la proteína de fusión de esta también se puede expresar como un producto de animales transgénicos, por ejemplo, como un componente de la leche de las vacas, cabras, cerdos u ovejas transgénicas que se caracterizan por células somáticas o germinales que contienen una secuencia de polinucleótido que codifica la proteína de la senda IL-21 o la proteina de fusión de esta.

Tratamientos En un aspecto de la invención, un agonista de senda IL-21 se utiliza para tratar o evitar un trastorno atópico. Como se utiliza aquí, el término "tratar" o "tratamiento" se define como la aplicación o administración de una composición a un sujeto (por ejemplo un sujeto humano, por ejemplo, un paciente o persona en riesgo de un trastorno, por ejemplo, un trastorno atópico). En ciertas ¡mplementaciones los tratamientos pueden incluir la aplicación o administración del agente a un tejido aislado o célula, por ejemplo, líneas de células, de un sujeto, por ejemplo, un paciente. Generalmente, se suministra tratamiento a un sujeto que tiene un trastorno (por ejemplo un trastorno como se describió aquí), un síntoma de un trastorno, un riesgo elevado para un trastorno, o una predisposición para un trastorno, con un propósito de curar, sanar, aliviar, alterar, remediar, alentar, mejorar o afectar el trastorno, los síntomas del trastorno o la predisposición hacia el trastorno. Los tratamientos pueden incluir administrar o aplicar la composición sola o en combinación con, un segundo agente. El término "en combinación" en este contexto significa que diferentes agentes son dados sustancialmente contemporáneamente, o simultanea o secuencialmente. Si son dados secuencialmente, al arranque de la administración del segundo compuesto, el primero de los dos agentes es preferiblemente aún detectable en concentraciones electivas en el sitio de tratamiento. "Tratar una célula" se refiere a poner en contacto a un agente a una célula, por ejemplo, una célula inmune, por ejemplo, para cambiar el comportamiento o estado de la célula. En una modalidad, tratar una célula con un modulador de la senda IL-21 se puede utilizar para modular (por ejemplo, incrementar o disminuir) la producción de IgG o IgE. Como se utiliza aquí una cantidad de un agente efectivo para tratar un trastorno, o una "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad del compuesto que es efectiva, luego de administración de dosis simple o múltiple a un sujeto, para tratar un sujeto, por ejemplo, curando, aliviando, sanando o mejorando al menos un síntoma de un trastorno en un sujeto a un grado más allá del esperado en la ausencia de tal tratamiento. Por ejemplo, el trastorno puede ser un trastorno atópico, por ejemplo, un trastorno atópico descrito aquí. Una "cantidad localmente efectiva" se refiere a la cantidad (por ejemplo concentración) del compuesto que está efectivamente en las células detectablemente modulantes en un tejido, por ejemplo, en una región de un trastorno atópico, para modular la actividad de la célula. La evidencia de la modulación puede incluir, por ejemplo, la modulación de la producción IgG o IgE. Como se utiliza aquí, una cantidad de un agente "efectiva para prevenir un trastorno" o "una cantidad profilácticamente efectiva" de un compuesto que se refiere a una cantidad del agente que es efectiva, luego de administración de dosis simple o múltiple al sujeto, para prevenir o retrasar la ocurrencia del arranque o recurrencia de un trastorno, por ejemplo, un trastorno atópico. Una composición farmacéutica puede incluir una "cantidad terapéuticamente efectiva" o una cantidad "cantidad profilácticamente efectiva" de un agente descrito aquí, por ejemplo, un polipéptido IL-21 , un anticuerpo, o una forma de un receptor IL-21 . Una "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, en dosis y por periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de enfermedad, edad, sexo, y peso del individuo, y la capacidad del compuesto a elicitar, una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva también es aquella en la cual cualquier efecto tóxico o de detrimento de la composición es preponderado por los efectos terapéuticamente benéficos. Una "dosis terapéuticamente efectiva" preferiblemente modula un parámetro medible, por ejemplo, la producción de inmunoglobulina o un síntoma medible de un trastorno atópico con relación a sujetos no tratados, por ejemplo, a un grado estadísticamente significativo. La capacidad de un compuesto para inhibir un parámetro medible se puede evaluar en un sistema de modelo animal predictivo de la eficacia en un trastorno humano, utilizando ensayos in vitro, por ejemplo, un ensayo descrito aquí, o utilizando ensayos humanos apropiados. Efectos particulares mediados por un agonista de senda IL-21 o un antagonista pueden mostrar una diferencia que es estadísticamente significativa (por ejemplo el valor P<0.05 o 0.02) la significancia estadística se puede determinar mediante cualquier método conocido. Los ensayos estadísticos de ejemplo incluyen: el ensayo T de Student, el ensayo no paramétrico Mann Whitney U, y los ensayos estadísticos no paramétricos Wílcoxon. Algunas relaciones estadísticamente significativas tienen valores P de menos de 0.05 o 0.02. Los términos "induce", "inhibe", "potencia", "eleva", "incrementa", "disminuye" o similares, por ejemplo, que denotan diferencias cualitativas y cuantitativas distinguibles entre dos estados, y pueden referirse a una diferencia, por ejemplo, diferencia estadísticamente significativa (por ejemplo valor P<0.05 o 0.02), entre las dos estados. Los regímenes de dosis se ajustan para suministrar la respuesta deseada óptima (por ejemplo una respuesta terapéutica). Por ejemplo, un bolo simple se puede administrar, varias dosis divididas se pueden administrar durante el tiempo o la dosis se puede reducir o incrementar proporcionalmente como lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Es posible formular composiciones parenterales en forma de dosis unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosis. La forma de dosis unitaria como se utiliza aquí se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para sujetos a ser tratados; cada una de las unidades contiene una cantidad predeterminada al compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asocio con el vehículo farmacéutico requerido. Un rango no limitante de ejemplo, para una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de un agente descrito aquí, es 0.1-20 mg/kg, más preferiblemente 1- 0 mg/kg. El agente se puede administrar mediante infusión intravenosa a una proporción de menos de 20, 10, 5, o 1 mg/min para alcanzar una dosis de aproximadamente 1 a 50 mg/m2 o aproximadamente 5 a 20 mg/m2. Los valores de dosis pueden variar con el tipo y severidad de la condición a ser aliviada. Para cualquier sujeto individual, los regímenes de dosis específicos se pueden ajustar durante el tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones. De acuerdo con esto, los rangos de dosis establecidos aquí son solo ejemplos. Como se utiliza aquí el término "sujeto" pretende incluir humanos o animales no humanos. El término "animales no humanos" de la invención incluye todos los vertebrados, por ejemplo, no mamíferos (tales como pollos, anfibios, reptiles) y mamíferos, tales como primates no humanos, ratones, ovejas, perros, vacas, cerdos, etc. Algunos métodos de ejemplo para administrar compuestos se describen en "composiciones farmacéuticas". Las composiciones farmacéuticas también se pueden administrar utilizando un dispositivo médico. Por ejemplo, en una modalidad, una composición farmacéutica de la invención se puede administrar con dispositivos de inyecciones hipodérmicas sin aguja, tales como los dispositivos descritos en las patentes U.S. No. 5,399,163, 5,383,851 , 5,312,335, 5,064,413, 4,941 ,880, 4,790,824, o 4,596,556. Ejemplos de implante bien conocidos y módulos que se pueden utilizar incluyen: la patente U.S. No. 4,487,603, que describe una bomba de microinfusión implantable para dispensar medicación a una tasa controlada; la patente U.S. No. 4,486,194, que describe un dispositivo terapéutico para administrar agentes a través de la piel; la patente U.S. No. 4,447,233, que describe una bomba de infusión de un medicamento para suministrar medicación a una tasa de infusión precisa; la patente U.S. No. 4,447,224, que describe un aparato de infusión implantable de flujo variable para suministro de droga continuo, la patente U.S. No. 4,439,196, que describe un sistema de suministro de droga osmótica que tiene compartimientos multicámara; y la patente U.S. No. 4,475,196, que describe un sistema de suministro de droga osmótica. Por supuesto, muchos otros de tales implantes, sistemas de suministro, y módulos son también conocidos. En una modalidad, el agente se formula para suministro respiratorio o por mucosa por ejemplo, utilizando un dispositivo médico, por ejemplo un inhalador. Ver, por ejemplo, U.S. 6,102,035 (un inhalador en polvo) y 6,012,454 (un inhalador en polvo seco). En una modalidad, el inhalador es un inhalador de dosis medida. Tres sistemas comunes utilizados para suministrar drogas localmente a los pasajes de aire pulmonar incluyen inhaladores de polvo seco (DPI), inhaladores de dosis medida (MDI) y nebulizadores. Los MDI, el método más popular de administración por inhalación se puede utilizar para suministrar medicamentos en forma solubilizada o como una dispersión. Típicamente los MDI comprenden un Freon u otro propulsor de presión u otro propulsor de vapor de relativamente alta presión que fuerza el medicamento aerosilizado hacia el tracto respiratorio luego de la activación del dispositivo. A diferencia de los MDI, los DPI generalmente confían completamente en los esfuerzos ¡nspiratohos del paciente para introducir un medicamento en una forma de polvo seco a los pulmones. Los nebulizadores forman un aerosol del medicamento al ser inhalados al impartir energía a una solución liquida. El suministro pulmonar directo de drogas durante la ventilación líquida o lavado pulmonar utilizando medio fluoroquímico también es posible. En una modalidad un agonista de senda IL-21 se administra tópicamente. La "administración tópica" se refiere al suministro de un sujeto al tener en contacto la formulación directamente a la superficie del sujeto. La forma más común de suministro tópico es a la piel, pero una composición descrita aquí también se puede aplicar directamente a otras superficies del cuerpo, por ejemplo, al ojo, la membrana de mucosa, a las superficies de una cavidad del cuerpo o a una superficie interna. El término también comprende rutas transdérmicas de administración. Los modos tópicos de administración típicamente incluyen la penetración de la barrera de permeabilidad de la piel y el suministro eficiente al tejido o estrato objetivo. La administración tópica se puede utilizar como medios para penetrar la epidermis y la dermis y lograr el suministro local o sistémico de la composición. La administración tópica también se puede utilizar como unos medios para suministrar selectivamente un agonista de senda IL-21 a la piel (por ejemplo la epidermis o la dermis) de un sujeto, o a un estrato específico de este, o a un tejido subyacente. El término "piel", como se utiliza aquí, se refiere a la epidermis y/o la dermis de un animal. Varios factores determinan la permeabilidad de la piel a los agentes administrados. Estos factores incluyen las características de la piel tratada, las características del agente de suministro, las interacciones entre la droga y el agente de suministro y la droga y la piel, la dosis de droga aplicada, la forma de tratamiento, el régimen de postratamiento. Para apuntar selectivamente a la epidermis y la dermis, es algunas veces posible formular una composición que comprende uno o más mejoradores de penetración que posibilitarán la penetración de la droga a un estrato preseleccionado. El suministro transdérmico es una ruta valiosa para la administración de terapéuticos solubles de lípido. La dermis es más permeable que la epidermis y por lo tanto la absorción es mucho más rápida a través de la piel con abrasión, quemado o degradación. La inflamación u otras condiciones fisiológicas que incrementan el flujo sanguíneo de la piel también mejoran la absorción transdérmica. La absorción por vía de esta ruta se puede mejorar medíante el uso de un vehículo aceitoso (inunción) o a través del uso de uno o más mejoradores de penetración. Otras formas efectivas para suministrar una composición descrita aquí por vía de la ruta transdérmica incluyen la hidratación de la piel y el uso de parches tópicos de liberación controlada. La ruta transdérmica suministra unos medios potencialmente efectivos para suministrar una composición descrita aquí para terapia sistémica y/o local. Además, la iontofóresis (transferencia de solutos iónicos a través de membranas biológicas bajo la influencia de un campo eléctrico) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991 , p. 163). La fonoforesis y la sonoforesis (uso de ultrasonido para mejorar la absorción de varios agentes terapéuticos a través de membranas biológicas, notablemente la piel y la cornea) (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991 , p. 166), y la optimización de las características del vehículo con relación a la posición de la dosis y la retención del sitio de administración (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991 , p. 168) pueden ser métodos útiles para mejorar el transporte de agentes tópicamente aplicados a través de la piel y los sitios de mucosa.

Composiciones Farmacéuticas Los agonistas de senda IL-21 se pueden utilizar como una composición farmacéutica cuando se combinan con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tal una composición puede contener, además del agonista de la senda IL-21 y el vehículo, varios diluyentes, llenadores, sales, amortiguadores, estabilizadores, solubilizadores, y otros materiales bien conocidos en la técnica. El término "farmacéuticamente aceptable" significa un material no tóxico que no interfiere con la efectividad de la actividad biológica del o los ingredientes activos. Las características del vehículo dependen típicamente de la ruta de administración. La composición farmacéutica puede además contener otros agentes antiinflamatorios como se describe con más detalle adelante. Tales factores adicionales y/o agentes pueden ser incluidos en la composición farmacéutica para producir un efecto sinérgico con unos agonistas de senda IL-21 o minimizar los efectos colaterales causados por los agonistas de senda IL-21. Por lo contrario los agonistas de senda IL-21 pueden estar incluidos en formulaciones del agente antiinflamatorio particular para minimizar los efectos colaterales del agente antiinflamatorio. La composición farmacéutica puede estar en la forma de un liposoma en el cual se combinan los agonista de senda IL-21 , además de otros vehículos farmacéuticamente aceptables, con agentes amfipáticos tales como lípidos, que existen en forma agregada como micelas, monocapas insolubles, cristales líquidos, o capas lamelares que están en solución acuosa. Los lípidos adecuados para formulación liposomal incluyen sin limitación, monoglicéridos, diglicéridos, sulfatidos, lisolecitina, fosfolípidos, saponina, ácidos biliares, y similares. La preparación de tales formulaciones liposomales están dentro del nivel del experto en la técnica, como se describe, por ejemplo, en la patente U.S. No. 4,235,871 ; patente U.S. No. 4,501 ,728; patente U.S. No. 4,837,028; y patente U.S. No. 4,737,323, todas la cuales se incorporan aquí como referencia.

Para practicar el método de tratamiento o uso, una cantidad terapéuticamente efectiva de un agonista de senda IL-21 de un agonista o antagonista de senda IL-21 se administra un sujeto, por ejemplo, mamífero (por ejemplo un humano). Un agonista de senda IL-21 se puede administrar bien sea solo o en combinación con otras terapias tales como otros tratamientos para trastornos atópicos. Cuando se co-administra con uno o más agentes, el agonista de senda IL-21 se puede administrar bien sea simultáneamente con el segundo agente, o secuencialmente. Si se administra secuencialmente, el médico que atiende puede decidir la secuencia apropiada para administrar un agonista de senda IL-21 en combinación con otros agentes. Los agentes adicionales de ejemplo para uso en el tratamiento de trastornos atópicos incluyen: otros inmunomoduladores (por ejemplo ungüento tacrolimus (PROTOPIC™) y crema pimecromlimus (ELIDEL™)), corticosteroides (tópicos y sistémicos), antihistaminas, inmunosupresores (por ejemplo, ciclosporina, metotrexato o azatioprina). Los agentes adicionales de ejemplo para uso en el tratamiento de trastornos alérgicos incluyen: CLARITIN® (loratadina), difenhidramina, y otras antihistaminas, y cetotifen fumarato. La administración de un agonista de senda IL-21 se puede llevar a cabo en una variedad de formas, incluyendo, por ejemplo, ingestión oral, intracraneal, inhalación, o inyección o administración cutánea, subcutánea, o intravenosa. Por ejemplo, la composición se puede suministrar como un epidural o de otra forma como, por ejemplo, al fluido cerebroespinal. Para administrar oralmente una cantidad terapéuticamente efectiva de un agonista de senda IL-21 , el agente puede estar en la forma de una tableta, cápsula, polvo, solución o elíxir. Cuando se administra en forma de tableta, la composición farmacéutica puede contener adicionalmente un vehículo sólido tal como gelatina o u adyuvante. La tableta, cápsula, y polvo contienen desde aproximadamente 5 a 95% en peso del agente o desde aproximadamente 25% a 90% del agente. Cuando se administran en forma líquida, un vehículo liquido tal como agua, petróleo, aceites de animal o de origen vegetal tal como aceite de maní, aceite de soya, aceite de sésamo, o aceites sintéticos pueden ser agregados. La forma líquida de la composición farmacéutica puede además contener solución salina fisiológica, dextrosa u otras soluciones de sacárida, o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol, o polietilenglicol. Cuando se administran en forma líquida, la composición farmacéutica contiene desde aproximadamente 0.5 a 90% en peso del agente, y preferiblemente desde 1 a 50% del agente. Para administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un agonista de senda IL-21 , por ejemplo, mediante inyección intravenosa, cutánea, subcutánea, el agente puede estar en la forma de una solución acuosa libre de pirógeno parenteralmente aceptable. La preparación de tales soluciones de proteína parenteralmente aceptables, que se deben con relación al pH, e isotonicidad, estabilidad, y similares, son entendidas por el experto. Un ejemplo de composición farmacéutica para inyección intravenosa, cutánea, o subcutánea puede contener, además del agente un vehículo isotónico tal como una inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección de dextrosa y cloruro de sodio, inyección de Ringer lactada u otro vehículo como se conoce en la técnica. La composición farmacéutica de la presente invención también puede contener estabilizadores, preservativos, amortiguadores, antioxidantes, u otros aditivos conocidos por aquellos expertos en la técnica. La cantidad de un agonista de senda IL-21 en la composición farmacéutica de la presente invención puede depender de la naturaleza y severidad de la condición que es tratada, y de la naturaleza de tratamientos anteriores que el paciente ha sufrido. El médico que atiende puede decidir la cantidad de agonista con la cual tratar un paciente individual. Inicialmente, por ejemplo, el médico que atiende puede administrar dosis bajas del agente para observar la respuesta del paciente. Dosis mayores del agente se pueden administrar hasta que se obtenga un efecto terapéutico óptimo en el paciente, y en ese punto de dosis no se incremente adicionalmente en general, o al monitorear los niveles de inmunoglobulina (por ejemplo niveles de IgG o IgE) o uno o más síntomas. Las composiciones farmacéuticas de ejemplo pueden contener aproximadamente 0.1 µg a aproximadamente 100 mg del agonista de senda IL-21 por kg de peso corporal. Por ejemplo, las dosis útiles pueden incluir entre aproximadamente 10 µg-1 mg, 0.1-5 mg y 3-50 mg del agonista de senda IL-21 por kg de peso corporal. Las dosis útiles de IL-21 pueden además incluir entre aproximadamente 5 µg-1 mg 0.1-5 mg y 3-20 mg de agonista de senda IL-21 por kg de peso corporal. La duración de la terapia intravenosa utilizando la composición farmacéutica puede variar, dependiendo de la severidad de la enfermedad de ser tratada y de la condición y respuesta idiosincrática potencial de cada paciente individual. La duración de cada aplicación del agonista de senda IL-21 puede ser, por ejemplo, en el rango de 12 a 24 horas de administración intravenosa continua. El médico tratante puede decidir la duración apropiada de la terapia intravenosa utilizando la composición farmacéutica de la presente invención. En una modalidad, el agonista de senda IL-21 se formula como una micropartícula u otra formulación de liberación sostenida. Las micropartículas se pueden producir mediante secado por rociado, pero también se pueden producir mediante otros métodos que incluyen liofilización, evaporación, secado de lecho fluido, secado al vacío, o una combinación de estas técnicas. La liberación controlada sostenida se puede lograr al disponer el agonista dentro de la estructura o sustancia que impide su liberación. Por ejemplo, el agonista se puede disponer dentro de una matriz porosa o en una matriz erosionable, de la cual se permite la liberación del agonista durante un periodo de tiempo. En una modalidad, la formulación micelar mezclada que incluye el agonista de senda IL-21 se utiliza para suministrar el agente a través de las membranas transdérmicas. La formulación se puede preparar, por ejemplo, al mezclar una solución acuosa del agonista de senda IL-21 , y compuestos formadores de micela, y opcionalmente un metal alcalino, por ejemplo sulfato de alquilo C8 a C22. En los compuestos formadores de micela de ejemplo incluyen lecitina, ácido hialurónico, sales farmacéuticamente aceptables de ácido hialurónico, ácido glicólico, ácido láctico, extracto de camomila, extracto de cohombro, ácido oleico, ácido linoleico, ácido linolénico, monooleina, monooleatos, monolauratos, aceite de borraja, aceite de noche de primavera, mentol, trihidroxi oxo colanil glicina, y sales farmacéuticamente aceptables de estas, glicerina, poliglicerina, lisina, polilisina, trioleina, éteres de polioxietileno y análogos de estos, alquil éteres de polidocanol, y análogos de estos, quenodeoxicolato, desoxicolato, y mezclas de estos. Los compuestos formadores de micelas se pueden agregar al mismo tiempo o después de la adición de alquil sulfato de metal alcalino. Las micelas mezcladas se formaran con sustancialmente cualquier clase de mezcla de ingredientes pero la mezcla vigorosa se prefiere con el fin de suministrar micelas de tamaño más pequeño. "Micelas" se definen aquí como un tipo particular de montaje molecular en el cual las moléculas amfipáticas están dispuestas en una estructura esférica de tal forma que las porciones hidrófobas de las moléculas están dirigidas hacia el interior, dejando las porciones hidrofílicas en contacto con la fase acuosa circundante. La disposición contraria existe si el ambiente es hidrófobo. Los agonistas de senda IL-21 se pueden formular y preparar como una composición farmacéutica combinada con un vehículo farmacéuticamente aceptable de una manera similar a la descrita para las agonistas de senda IL-21. Con respecto a los agonistas de senda IL-21 y los antagonistas que son proteínas, la enfermedad o trastorno se puede tratar o prevenir mediante la administración o uso de polinucleótidos que codifican tales proteínas (tal como, por ejemplo, en terapias de gen o vectores adecuados para la introducción de ADN). Los polinucleótidos que codifican un agonista de senda IL-21 (por ejemplo un polipéptido IL-21 ) se puede insertar en vectores y utilizar como vectores de terapia de gen. Los vectores de terapia de gen se pueden suministrar a un sujeto mediante, por ejemplo, inyección intravenosa, administración local (ver patente U.S. 5,328,470), inyección (por ejemplo U.S 200400302050 o 20030212022) o inyección estereotáctica (por ejemplo, Chen et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 :3054-3057, 1994). La preparación farmacéutica del vector de terapia de gen puede incluir el vector de terapia de gen en un diluyente aceptable, o puede comprender una matriz de liberación lenta en el cual el vehículo de suministro de gen está embebido. Alternativamente, cuando el vector de suministro de gen completo se puede producir intacto de las células recombinantes, por ejemplo, vectores retrovirales, la preparación farmacéutica puede incluir una o más células que producen el sistema de suministro de gen.

Kits Un agonista de senda IL-21 descrito aquí, por ejemplo, un polipéptido IL-21 o una anticuerpo que se une a un receptor IL-21 , se puede suministrar en un kit. El kit incluye (a) un agonista de senda IL-21 , por ejemplo, una composición que incluye el agonista de senda IL-21 , y, opcionalmente (b) material de información. El material de información puede ser descriptivo, de instrucción, de comercialización u otro material que se relacione con los métodos descritos aquí y/o el uso de un agonista de senda IL-21 para los métodos descritos aquí. El material de información de los kíts no está limitado en su forma. En una modalidad, el material de información puede incluir información acerca de la producción del compuesto (es decir el agonista de senda IL-21 ), el peso molecular del compuesto, la concentración, la fecha de expiración, el lote o la información del sitio de producción, y así sucesivamente. En una modalidad, el material de información se relaciona con administración del compuesto para tratar o prevenir un trastorno atópico. En una modalidad, el material de información puede incluir instrucciones para administrar un agonista de senda IL-21 de una manera adecuada para desarrollar los métodos descritos aquí, por ejemplo, en una dosis adecuada, una forma de dosis, o un modo de administración (por ejemplo, una dosis, una forma de dosis, o un modo de administración descrito aquí) dosis de ejemplo, formas de dosis, o modos de administración son aproximadamente 10 µg-1 mg, 0.1-5 mg, y 3-50 mg de polipéptido IL-21 por KG de peso corporal. En otra modalidad, el material de información puede incluir instrucciones para administrar el agonista de senda IL-21 a un sujeto adecuado, por ejemplo, un humano, por ejemplo, un humano que tiene o está en riesgo de, un trastorno atópico. Por ejemplo, el material puede incluir instrucciones para administrar el agonista de senda IL-21 para mejorar al menos un sistema del trastorno atópico, por ejemplo, asma, dermatitis atópica, o rinitis alérgica. El material de información de los kits no está limitado en su forma. En muchos casos, el material de información, por ejemplo, instrucciones, se suministra en forma impresa, por ejemplo, un texto impreso, dibujo y/o fotografía, por ejemplo, una etiqueta o lamina impresa. Sin embargo, el material de información también se puede suministrar en otros formatos, tal como un material legible por computadora, una grabación de video o una grabación de audio. En otra modalidad, el material de información del kit es información de contacto, por ejemplo, dirección física, dirección de correo electrónico, pagina Web o número de teléfono, donde el usuario del kit puede obtener información sustantiva acerca del agonista de senda IL-21 y/o su uso en los métodos descritos aquí. Por supuesto, el material de información también se puede suministrar en cualquier combinación de formatos. Además del agonista de senda IL-21 , la composición del kit puede incluir otros ingredientes, tales como un solvente o amortiguador, un estabilizador, un preservativo, un agente saborizante (por ejemplo un antagonista amargo o un endulzante), una fragancia u otro ingrediente cosmético, y/o un segundo agente para tratar una condición o trastorno descrito aquí, por ejemplo, un trastorno atópico, por ejemplo, asma, dermatitis atópica o rinitis alérgica. Alternativamente, los otros ingredientes se pueden incluir en el kit, pero en diferentes composiciones o recipientes que el agonista de senda IL-21. En tales modalidades, el kit puede incluir instrucciones para administrar el agonista de senda IL-21 u otros ingredientes, para utilizar el agonista de senda IL-21 junto con otros ingredientes. El agonista de senda IL-21 se puede suministrar en cualquier forma, por ejemplo, líquida, seca o forma liofilizada. Se prefiere que IL-21 sea sustancialmente puro y/o estéril. Cuando el agonista de senda IL-21 se suministra en una solución líquida, la solución líquida preferiblemente es una solución acuosa, con una solución acuosa estéril siendo la preferida. Cuando el agonista de senda IL-21 se suministra en un forma seca, la reconstitución generalmente es mediante la adición de un solvente adecuado. El solvente, por ejemplo, agua estéril o amortiguador, puede ser opcionalmente suministrado en el kit. El kit puede incluir uno o más recipientes para la composición que contiene el agonista de senda IL-21. En algunas modalidades, el kit contiene recipientes separados, divisores o compartimientos para la composición y el material de información. Por ejemplo, la composición puede ser contenida en una botella, frasco, o jeringa, y el material de información puede estar contenido en un forro o paquete plástico. En otras modalidades, los elementos separados del kit están contenidos dentro de un recipiente simple, no dividido. Por ejemplo, la composición está contenida en una botella, frasco o jeringa que tiene unida a esta el material de información en la forma de una etiqueta. En algunas modalidades, el kit incluye una pluralidad (por ejemplo, un empaque) de recipientes individuales, cada uno contiene una o más formas de dosis unitarias (por ejemplo, una forma de dosis descrita aquí) del agonista de senda IL-21. Por ejemplo, el kit incluye una pluralidad de jeringas, ampollas, paquetes de láminas, o paquetes de ampollas, que contiene cada una, una dosis unitaria simple del agonista de senda IL-21. Los recipientes de los kits pueden ser herméticos, a prueba de agua (por ejemplo, impermeables a los cambios en humedad o evaporación), y/o herméticos a la luz. El kit opcionalmente incluye un dispositivo adecuado para la administración de la composición, por ejemplo, una jeringa, inhalante, pipeta, fórceps, cuchara medida, goteador (por ejemplo, goteador de ojo), esponjilla (por ejemplo, una esponjilla de algodón o esponjilla de madera), o cualquier dispositivo de suministro. En una modalidad preferida, el dispositivo es un inhalador o una bomba implantable.

Trastornos Atópicos y Síntomas de Estos "Atópicos" se refiere a un grupo de enfermedades que son a menudo una tendencia heredada a desarrollar una reacción alérgica.

Ejemplos de trastornos atópicos incluyen alergia, rinitis alérgica, dermatitis atópica, asma y fiebre de heno. El asma es un trastorno fenotípicamente heterogéneo asociado con síntomas respiratorios intermitentes tales como, por ejemplo, hipersensibilidad bronquial y obstrucción del flujo aéreo reversible. Las características inmunohistopatológicas del asma incluyen, por ejemplo, la denudación del epitelio de las vías aéreas, la deposición de colágeno inmediatamente por debajo de la membrana de base; edema; activación del mastocito; e infiltración de célula inflamatoria (por ejemplo, mediante neutrófilos, eosinófilos, y linfocitos). La inflamación de la vía aérea puede además contribuir a la hipersensibilidad de la vía aérea, la limitación del flujo de aire, la broncoconstricción aguda, la formación de tacos de moco, la remodelación de la pared de la vía aérea, y otros síntomas respiratorios. Un agonista de senda IL-21 se puede administrar para mejorar uno o más de estos síntomas. Los síntomas de la rinitis alérgica (fiebre de heno) incluyen prurito, goteo, estornudo, o narices con materia, y ojos con prurito. Un agonista de senda IL-21 se puede administrar para mejorar uno o más de estos síntomas. La dermatitis atópica es una enfermedad crónica (de larga duración) que afecta la piel. La información a cerca de la dermatitis atópica está disponible, por ejemplo, en la Publicación NIH No. 03-4272. En la dermatitis atópica, la piel puede tener prurito extremo, que conduce a enrojecimiento, hinchamiento, cuarteamiento, fluido claro acuoso, y finalmente, formación de costra y descamación. En muchos casos, existen periodos de tiempo en que la enfermedad se empeora (denominados exacerbaciones o brotes) seguidos por períodos cuando la piel mejora o clarifica completamente (denominados remisiones). La dermatitis atópica es a menudo denominada como un "eczema", que es el término general para varios tipos de inflamación de la piel. La dermatitis atópica es la más común de muchos tipos de eczema. Ejemplos de dermatitis atópica incluyen: eczema por contacto alérgico (dermatitis: una reacción roja, picante, acuosa donde la piel entra en contacto con una sustancia que el sistema inmune reconoce como extraña, tal como hiedra venenosa o ciertos preservativos en cremas y lociones); eczema de contacto (una reacción localizada que incluye enrojecimiento, prurito, y acaloramiento donde la piel entra en contacto con un alérgeno (una sustancia que origina la alergia) o con un irritante tal como un ácido, un agente de limpieza, u otro químico); eczema dishidrótico (irritación de la piel sobre las palmas de las manos y las plantas de los pies caracterizada por vejigas claras, profundas que pican y queman); neurodermatitis (parches escamosos de la piel sobre la cabeza, piernas, muñecas, o antebrazos originados por un prurito localizado (tal como picadura de insecto) que se irritan intensamente cuando se rascan); eczema numular (parches en forma de moneda de piel irritada - más común en los brazos, espalda, nalga, y piernas - que pueden tener costras, escamas, y causar prurito extremo); eczema seborreico (parches amarillosos, aceitosos, con costra de la piel sobre el pericráneo, cara y ocasionalmente otras partes del cuerpo). Síntomas adicionales particulares incluyen dermatitis estasis, pliegue atópico (doblez Dennie-Morgan), queilitis, palmas hiperlineales, párpados hiperpigmentados: párpados que se oscurecen en color por la inflamación o fiebre de heno, ictiosis, queratosis pilaris, liquenificación, pápulas, y urticaria. Un agonista de senda IL-21 se puede administrar para mejorar uno o más de estos síntomas.

Ensayos para Evaluar los Agentes Candidatos Una variedad de ensayos están disponibles para evaluar un agente candidato, por ejemplo, para el uso como un agonista de senda IL-21 o un antagonista de senda IL-21. Ensayos de actividad de ejemplo para los polipéptidos IL-21 y las proteínas receptoras IL-21 se describen, por ejemplo, en Kasaian et al. (2002) Immunity 16:1-20. Estos ensayos se pueden utilizar para evaluar la funcionalidad de un polipéptido IL-21 u otro agente. Por ejemplo, un polipéptido IL-21 puede tener actividad (por ejemplo, al menos 25, 50, 75, 80 o 95% de actividad específica de tipo silvestre) en uno o más de los siguientes ensayos de Kasaian et al (2002), supra: el ensayo de proliferación de célula T (por ejemplo, como en la Figura 7A de la referencia anteriormente mencionada), la producción de IFN-? (por ejemplo, como en la figura 7C de la referencia anteriormente mencionada), y el ensayo de citotoxicidad NK (por ejemplo, como en las Figuras 4A-4D de la referencia anteriormente mencionada, en la presencia de IL-15).

Los ensayos adecuados para citotoxicidad de timocito o esplenocito incluyen, sin limitación, aquellos descritos en: Current Protocols in Immunology, Ed by J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (Capítulo 3, In Vítro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19; Capítulo 7, Immunologic studies in Humans); Herrmann et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 78:2488-2492, 1981 ; Herrmann et al., J. Immunol. 128:1968-1974, 1982; Handa et al., J Immunol. 135:1564-1572, 1985; Takai et al., J. Immunol. 137:3494-3500, 1986; Takai et al., J. Immunol. 140:508-512, 1988; Herrmann et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 78:2488-2492, 1981 ; Herrmann et al., J. Immunol. 128:1968-1974, 1982; Handa et al., J. Immunol. 135:1564-1572, 1985; Takai et al., J. Immunol. 137:3494-3500, 1986; Bowmanet al., J. Virology 61 :1992-1998; Takai et al., J. Immunol. 140:508-512, 1988; Bertagnolli et al., Cellular Immunology 133:327-341 , 1991 ; Brown et al., J. Immunol. 153:3079-3092, 1994. Los ensayos para respuestas de inmunoglobulina dependientes de célula T y la cambio de isotipo (que identificará, entre otros, las proteínas que modulan las respuestas de anticuerpo dependientes de célula T y que afectan los perfiles ??1?G?2) incluyen, sin limitación, aquellos descritos en: Maliszewski, J. Immunol. 144:3028-3033, 1990; and Assays for B cell function: In vitro antibody production, Mond, J.J. and Brunswick, M. In Current Protocols in Immunology. J.E.e.a. Coligan eds. Vol 1 pp. 3.8.1-3.8.16, John Wiley and Sons, Toronto. 1994.

Los ensayos de reacción del linfocito mezclado (MLR) (que identificarán, entre otros, las proteínas que generan predominantemente respuestas Th1 y CTL) incluyen, sin limitación, aquellas descritas en: Current Protocols in Immunology, Ed by J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (Capítulo 3, In Vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19; Capítulo 7, Immunologic studies in Humans); Takai et al., J. Immunol. 137:3494-3500, 1986; Takai et al., J. Immunol. 140:508-512, 1988; Bertagnolli et al., J. Immunol. 149:3778-3783, 1992. Los ensayos dependientes de célula dendrítica (que identificarán, entre otros, las proteínas expresadas por las células dendríticas que activan células T intactas) incluyen, sin limitación, aquellas descritas en: Guery et al., J. Immunol. 134:536-544, 1995; Inaba et al., Journal of Experimental Medicine 173:549-559, 1991 ; Macatonia et al., Journal of Immunology 154:5071-5079, 1995; Porgador et al., Journal of Experimental Medicine 182:255-260,1995; Nair et al., Journal of Virology 67:4062-4069, 1993; Huang et al., Science 264:961-965, 1994; Macatonia et al., Journal of Experimental Medicine 169:1255-1264, 1989; Bhardwaj et al., Journal of Clinical Investigation 94:797-807, 1994; and Inaba et al., Journal of Experimental Medicine 172:631-640, 1990. Los ensayos para supervivencia/apoptosis de linfocito (que identificará, entre otros, proteínas que evitan la apoptosis después de la inducción de superantígeno y las proteínas que regulan la homeostasis de linfocito) incluyen, sin limitación aquellas descritas en: Darzynkiewicz et al., Cytometry 13:795-808, 1992; Gorczyca et al., Leukemia 7:659-670, 1993; Gorczyca et al., Cáncer Research 53:1945-1951 , 1993; Itoh et al., Cell 66:233-243, 1991 ; Zacharchuk, Journal of Immunology 145:4037-4045, 1990; Zamai et al., Cytometry 14:891 -897, 1993; Gorczyca et al., International Journal of Oncology 1 :639-648, 1992. Los ensayos para las proteínas que influencian las etapas tempranas del desarrollo y compromiso de célula T y incluyen, sin limitación, aquellas descritas en: Antica et al., Blood 84:11 1-1 17, 1994; Fine et al., Cellular Immunology 155:1 1 1-122, 1994; Galy et al., Blood 85:2770-2778, 1995; Toki et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 88:7548-7551 , 1991 . Los ensayos para evaluar la activación del STAT se describen, por ejemplo, en Gilmour et al. (1996) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92:10772-10776. Por ejemplo, las células evaluadas (por ejemplo, las células tratadas con un agonista o agonista candidato) pueden ser lisadas y las proteínas de tirosina fosforiladas se pueden inmunoprecipitar con un anticuerpo anti-fosfotirosina. Luego los materiales precipitados se pueden evaluar utilizando anticuerpos específicos para el componente de senda de señalización, por ejemplo, un anticuerpo para la proteína STAT, por ejemplo, STAT5.

Ensayos para Evaluar Niveles de Citoquina Cualquier ensayo estándar se puede utilizar para evaluar los niveles de citoquina en una muestra o en un sujeto, por ejemplo, para evaluar un parámetro IL-21. Por ejemplo, la muestra se puede obtener de un sujeto o puede incluir células de cultivo. Las muestras de ejemplo pueden ser obtenidas o derivadas de una o más células, tejido, o fluidos de cuerpo tal como sangre, orina, fluido linfático, fluido cerebroespinal o fluido amniótico, células cultivadas (por ejemplo, células de cultivo de tejido), esponjas bucales, lavados bucales, heces, cortes de tejido, y materiales de biopsia (por ejemplo, aspiración de biopsia). Los métodos para evaluar los niveles de citoquina incluyen evaluar los ácidos nucleicos para detectar el mARN O cADN que codifica la citoquina de interés (por ejemplo, IL-21 ) o evaluar las proteínas para detectar la citoquina misma. Los ácidos nucleicos se pueden evaluar, por ejemplo, utilizando RT-PCR (ejemplo, PCR cuantitativo) o microdisposiciones de ácido nucleico. Las proteínas se pueden evaluar, por ejemplo, utilizando espectroscopia de masa o un inmunoensayo. Los ELISAs suministran una forma conveniente de inmunoensayo. Por ejemplo, Biosource International, Camarillo CA suministra reactivos de ensayo que se pueden utilizar para detectar IL-21 , IL-10, y para IL-12. De manera similar, los Sistemas R&D suministran reactivos para detectar IFN-? con una sensibilidad < 8 pg/ml o TGF-beta1 con una sensibilidad de < 7 pg/ml. SEARCHLIGHT™ Proteome Array System (Pierce, Boston Technology Center) suministra reactivos comprensivos para evaluar citoquinas múltiples de una vez.

Estos métodos se pueden utilizar para evaluar un sujeto, por ejemplo, antes, durante, o después de la administración de un modulador de senda IL-21 (por ejemplo, agonista o antagonista). Por ejemplo, para determinar si tal agonista origina un cambio estadísticamente significativo en los niveles de una citoquina, por ejemplo, IL-21 , IL-10, o IFNy para determinar si este causa un cambio aceptable, por ejemplo, a un nivel en el rango de normal de una citoquina, por ejemplo, IL-21 , IL-10 o IFNy. La información de la evaluación se puede utilizar para modular la dosis del agonista. De manera similar, los métodos para evaluar los niveles de IgG e IgE están disponibles. Por ejemplo, Alpha Diagnostic International, Inc, (San Antonio, TX) suministra un kit ELISA para evaluar IgE humano, y también Bethyl Laboratories, Inc. En una modalidad, si los niveles IgE no disminuyen a niveles dentro del rango de un sujeto normal, la administración del agonista IL-21 se puede incrementar, por ejemplo, al incrementar la dosis o frecuencia, por ejemplo, mediante una cantidad proporcional o correspondiente, o mediante al menos aproximadamente 1.5, 1.8, o 2 veces.

EJEMPLO En una enfermedad atópica humana, el IgE sensibiliza la respuesta alérgica, mientras que el lgG4 es protector. En razón a que el IL-4 y el IL-3 disparan la recombinación de cambio Ig tanto para el IgE como para el lgG4, los agentes adicionales pueden regular el balance entre estos isotipos para influenciar la susceptibilidad o tolerancia a la atopia. El IL-21 reduce la combinación de recomposición IgE manejada por lgG4 pero incrementa la secreción de lgG4 mediante PBMC humano. En contraste a sus efectos en el sistema del murino, la inhibición de IL-21 de la producción de IgE de humano no fue un efecto directo sobre las células B, y podría ser solucionado al reticular el CD40 de la célula B con un anticuerpo anti-CD40. Adicionalmente, el IL-21 no bloquea el IgE producido en respuesta al IL-13. Las células T responden al IL-4 pero no al IL-13, y la expansión de la célula T parece contribuir a los efectos inhibidores del IL-21 sobre la producción de IgE. Ni la expresión del IFN-?, IL-10, IL-12, CD40 ni la apoptosis fueron responsables por el efecto inhibidor. En contraste a su inhibición indirecta de la producción de IgE, el IL-21 estimuló la secreción de lgG4 proveniente de PBMC. Encontramos que el IL-21 puede influenciar la producción de tanto IgE e lgG4 humano, y contribuir así a la regulación de las reacciones atópicas.

Materiales y Métodos Aislamiento y cultivo de PBMC La sangre periférica proveniente de donadores humanos saludables se llevó a tubos de VACUTAINER™ heparinizados (BD, Mountain View, CA). Las células mononucleares se aislan mediante centrifugación sobre HISTOPAQUE-1077™ (Sigma, St. Louis, MO). Para cultivo del PBMC completo, las células fueron puestas en placas en 2x106/ml en placas de fondo redondeado de 96 pozos que contienen 1x106/ml PBMC autólogas irradiados (1500 RAD) como alimentadores, en RPMI que contienen 10% de FCS inactivado con calor, 50 U/ml de penicilina, 50 pg/ml de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina. Para la activación PHA, el PBMC fue puesto en placa con 2 pg/ml de PHA-P (Sigma). Después de dos días, Se agrega medio fresco faltando el PHA pero conteniendo 25 ng/ml de IL-4 humano recombinante o 50 ng/ml de IL-13 humano recombinante, +/- 20 ng/ml de IL-21 humano recombinante (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN). Estos niveles fueron determinados por titulación de dosis para cada citoquina. Para la activación del anticuerpo monoclonal anti-CD40, el PBMC fue puesto en placa con 1 Mg/ml de CD40 antihumano (BD Pharmingen) en la presencia de citoquinas. Para ambos cultivos activados con PHA y anti-CD40, se agrega medio que contiene citoquinas frescas cada 4 días. En los días 14-21 de los cultivos PHA, o el día 6-12 de los cultivos de anticuerpo monoclonal anti-CD40, el medio fue cosechado para la determinación de los niveles de anticuerpo. Estos puntos de tiempo reflejan el curso más rápido de tiempo para la producción de IgE bajo condiciones de tratamiento anti-CD40 comparado con la estimulación PHA. Las células se aislan tempranamente (día 3-5) o tardíamente (día 10-14) en el curso del cultivo para el aislamiento de ARN.

Enriquecimiento de célula B El PBMC aislado como se describió anteriormente fue incubado con un cocktail de enriquecimiento de célula B (ROSETTESEP™, StemCell Technologies, Vancouver, British Columbia, Canadá), y las células B aisladas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La población resultante fue > 88% de CD20 + células B. Las células B fueron puestas en placa a 2x105/ml en medio que contiene 1x106/ml de PBMC irradiado (1500 RAD) antólogos PBMC como alimentadores, y tratados con un anticuerpo monoclonal anti-CD40 o citoquinas como se describió anteriormente. En el día 6-12 del cultivo, el medio fue cosechado para la determinación de los niveles de anticuerpo.

ELISA para isotipos Iq humanos Las placas ELISA (placas EIA RIA; Corning Costar, Acton, MA) fueron recubiertas con 1 pg/ml de IgE antihumano de cabra (KPL Inc., Gaithersburg MD) o 3 pg/ml de lgG4 antihumano de ratón (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL) en carbonato de sodio 0.1 M, amortiguador de bicarbonato de sodio 0.1 M, pH 9.6 durante toda la noche a 4°C. Las placas fueron bloqueadas durante 1 hora con 0.5% de gelatina y 1 % de polivinilpirrolidina (Sigma, St. Louis, MO) en PBS. Las placas fueron lavadas con PBS que contiene 0.05% de Tween-20 (PBS-Tween), luego incubadas con suero o IgE humano (Biodesign Int, Kennebunk, ME) o estándares de isotipo lgG4 (Sigma) durante 4 horas a temperatura ambiente. Después de lavar con PBS-Tween, las placas fueron incubadas durante 2 horas a temperatura ambiente con anticuerpo biotinilado dirigido contra IgE humano (KPL) o lgG4 (Southern Biotechnology Associates). Las placas fueron lavadas e incubadas con estreptavidina marcada con HRP (Southern Biotechnology Associates) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas fueron lavadas e incubadas con el sustrato de peroxidaza Sure Blue (KPL). La reacción se detuvo al agregar HCL 0.1 N, y la observancia a 450 nm se leyó en un lector de placa ESPECTRA AX™ (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA). Con el fin de demostrar la especificidad del isotipo, los isotipos IgM, IgG humanos purificados, o IgA (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA) fueron corridos en ELISA para IgE e lgG4 y no produjeron señal. El limite de la sensibilidad del ELISA para IgE fue de 0.3 ng/ml. El límite de la sensibilidad del lgG4 de ELISA fue 4 ng/ml.

Análisis de Citoquina Los niveles de citoquina en sobrenadantes de cultivo se determinaron utilizando kits de ensayo para IL-10 (Biosource International, Camarillo, CA; sensibilidad < 0.2 pg/ml), IL-12 (Biosource International; sensibilidad < 2 pg/ml), IFN-? (R&D Systems; sensibilidad < 8 pg/ml) o TGF-ß? (R&D Systems, sensibilidad < 7 pg/ml).

Ensayos de Proliferación Las células B humanas enriquecidas fueron cultivadas en RPMI que contiene 10% de FBS, 50 U/ml de penicilina, 50 pg/ml estreptomicina, 2 mM de L-glutamina a 2x105/pozo en placas de fondo redondeado de 96 pozos. El anticuerpo monoclonal anti-CD40 y las citoquinas se agregan como se describió anteriormente. En el día 3, los cultivos fueron pulsados con 0.5 pCi/pozo 3H-timidina (PerkinElmer NEN, Boston, MA), y cosechadas 5 horas después sobre mantas de filtro de fibra de vidrio. La incorporación de 3H-timidina se determina mediante conteo de centelleo líquido.

Ensayo de Apoptosis La apoptosis se midió mediante cítometría de flujo utilizando un Kit de Detección de Apoptosis V-FITC (Calbiochem, La Jolla, CA). El PBMC se cultivó como se describió anteriormente, y la apoptosis se midió a las 24 y 48 horas luego de la adición de citoquinas. Las células fueron incubadas con anexina V-FITC Y CD19 antihumano conjugado con APC (BD Pharmingen) durante 15 minutos a temperatura ambiente y lavadas. Se agrega yoduro de propidio y se analizó la fluorescencia utilizando un citómetro BD FACSCalibur y un software CelIQuest (BD Biosciences).

Aislamiento de ARN Al día 5 del PBMC o los cultivos de células B, las células fueron agrupadas de las paredes de microtítulo, lavadas con PBS, lísadas con amortiguador RLT (Qiagen Inc., Valencia, CA), y preparadas con QIASHREDDER™. El ARN se preparó utilizando un Kit ARN MINI™ (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Trascripción inversa y análisis de PCR de trascriptos estériles El mARN preparado como se describió anteriormente se trascribió a cADN utilizando el kit de Trascripción Inversa Promega (Promega Corp., Madison, Wl). El PCR se desarrolló utilizando el kit ADVANTAGE™ PCR de Clontech (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA) y las siguientes secuencias y condiciones iniciadoras. El GAPDH se amplificó en 25 ciclos de 1 minuto cada uno a 94° C, 65° C, y 72° C utilizando los iniciadores. El trascripto de línea germinal ?e se amplificó en 38 ciclos de 1 minuto cada uno a 94° C, 65° C, y 74° C utilizando iniciadores (42). El trascripto de línea germinal ??4 se amplificó en 38 ciclos de 1 minuto cada uno a 94° C, 65° C, y 76° C utilizando iniciadores (43). Los trascriptos IgE maduros se amplificaron en 38 ciclos de 1 minuto cada uno a 94° C, 69° C, y 74° C utilizando iniciador delantero de consenso JH: 5'(44) combinado con el iniciador inverso ?e. Los iniciadores se prepararon mediante Eurogentec (San Diego, CA). Los productos amplificados fueron procedidos sobre geles de agarosa 1.2% que contienen bromuro de etidio.

RT-PCR en Tiempo real El ARN total se aisló de las células utilizando el Mini kit RNEASY™ (Qiagen, Valencia, CA). Los oligonucleótidos fueron diseñados para GAPDH, IL-12P35, IL- 0 e IL-12R 2 humano utilizando el software PRIMER EXPRESS™ (Applied Biosystems División of Perkin Elmer Corp., Foster City, CA) y sintetizados por Eurogentec. Las ondas fueron marcadas sobre el extremo 5' con el tinte reportero, 6-carboxifluoresceina (FAM) y sobre el extremo 3' con el tinte apagador 6-carboxi-tetrametilrodamina (TAMRA). Las reacciones fueron establecidas utilizando una trascriptasa inversa q-PCR MASTERMIX™ (Eurogenetec) y 50 ng de ARN de molde por reacción. Las muestras fueron procedidas en duplicado sobre un Sistema de Detección de Secuencia PRISM 7000™ (Applied Biosystems) utilizando el siguiente programa RT-PCR: (1 ) 30'ciclo a 48° C, (50) 10' ciclos a 95° C, (1 ) 15" ciclo a 95° C y (1 ) 1 'ciclo a 60° C. Los datos fueron analizados utilizando un software PRISM 7000™. Cada resultado se ajustó a una curva de estándar generada de una fuente de control positivo de ARN y los valores de expresión fueron normalizados a GAPDH.

Análisis Estadístico Todas las observaciones fueron reproducidas en 2-6 experimentos separados. Los datos entre los grupos de tratamiento fueron comparados utilizando el ensayo de t de student. Para los efectos de análisis de citoquina sobre la producción de IgE en microcultivos, el nivel de IgE en cada micropozo con un tratamiento dado fue tomado como una determinación separada, con n=24-36 por tratamiento. Para análisis de los efectos de citoquina sobre IgE o la producción de citoquina en cultivos de masa, se establecieron replicas de cultivos por tratamiento. Los valores p de < 0.05 se consideraron significativos.

Resultados: IL-21 mejora IL-4 e IL-13 - controlan la síntesis de IgE en células B humanas La recombinación de cambio IgE se puede disparar mediante la exposición de células B a un agente de reticulación CD40 en la presencia de IL-4 o IL-13. Con el fin de investigar los efectos del IL-21 sobre este proceso, las células B fueron enriquecidas de PBMC humano a > 88% de pureza, y se estimularon con anti-CD40 mAb en la presencia de IL-4 o IL-13. Las células CD3+ no fueron detectables. Los cultivos individuales se establecieron en 24-36 pozos de microtítulo por tratamiento. En la ausencia de IL-4 o IL-13, ninguno de los pozos contenía IgE, consistente con la falta de células productoras de IgE detectables. Cuando Se agrega IL-4 o IL-13, la mayoría de los mícrocultivos que contenían células que producen IgE (Figura 1A), con IgE detectable en el sobrenadante (Figura 1B). Aunque el análisis de dilución limitante no se desarrolló para calcular la frecuencia exacta, un incremento en el número de los microcultivos positivos para IgE fue tomado para indicar una frecuencia creciente de células B productoras de IgE. La adición del IL-21 al IL-4 o IL-13 incrementó consistentemente la producción de IgE sobre los niveles vistos con IL-4 o IL-13 solo (Figuras 1A, 1 B). El porcentaje de pozos productores de IgE fue virtualmente del 100% con IL-4 o IL-4 + IL-21 , y se incrementó del 61% con IL- 3 solo al 78% con IL-13 + IL-21. El IL-4 y el IL-13 también indujeron la producción de el trascripto de línea germinal ?e (Figura 1C), que está asociado con la recombinación de cambio Ig novo al locus Cz. El IL-4 y el IL-13 también indujeron la generación de un trascripto de línea germinal ??4 (Figura 1 C), pero en nuestro sistema de cultivo, el IL-4 o IL-13 solos no fueron suficientes para soportar la producción de lgG4 y liberar las células (Figura 1 D). Como contraste, el IL-21 solo generó solamente niveles de trasfondo del trascripto de línea germinal ??4 (Figura 1 C), sino que estimularon los niveles bajos de liberación de lgG4 en el sobrenadante de las células B tratadas con anti-CD40 mAb. La adición de IL-21 a IL-4 o IL-13 mejoró fuertemente la producción de lgG4 sobre los niveles vistos con IL-4 o IL-13 solo (Figura 1 D). De hecho, muy poco lgG4 se liberó de las células a menos que el IL-21 se agregara a los cultivos. El IL-21 estimula la proliferación de las células B humanas que han sido tratadas con anti-CD40 mAb (22), y la proporción de las células que sufren recombinación de cambio de isotipo se incrementan con la división celular (34). Con el fin de determinar si la proliferación de la célula B incrementada puede ayudar a contar los niveles crecientes de IgE e lgG4 vistos en la presencia de IL-21 , evaluamos la incorporación de 3H-timidina mediante células B purificadas bajo las condiciones de cultivo utilizadas anteriormente. Los resultados muestran que el IL-21 mejoró la proliferación de la célula B por encima de los niveles vistos con el IL-4 o IL-13 solo (Figuras 2A y 2B).

IL-21 mejora la síntesis de IgE en PBMC no fraccionado estimulado con anti-CD40 mAb e IL-4 o IL-13 Además de sus efectos reportados en células B, el IL-21 tiene efectos potentes sobre las células T humanas. Esta induce la proliferación de célula T (22,23,35), y potencia la producción de citoquina en la presencia de agentes reticulantes TCR y la co-estimulación apropiada (23,36). Por lo tanto, fue de interés investigar los efectos del IL-21 sobre la producción de IgE bajo condiciones en las cuales las células T estuvieran también presentes y pudieran responder a la citoquina. El PBMC no fraccionado se trata con anti-CD40 mAb en combinación con IL-4 o IL-13 para manejar la producción de IgE. El IgE se midió en los sobrenadantes 7 a 14 días más tarde. En combinación con el IL-4 o el IL-13, el IL-21 produjo un incremento modesto en los niveles de proteína IgE e lgG4 (Figuras 3A, 3B, 3D). El porcentaje de pozos de producción de IgE se incrementó desde 86% con IL-4 solo a 100% con IL-4 + IL-21 , y se incrementó del 19% con IL-13 solo a 56% con IL-13 + IL-21. Consistente con esto, el IL-4 o el IL-13 indujeron trascripto de línea germinal ?e, trascripto maduro J-C , y trascripto de línea germinal ??4 todos fueron mantenidos en la presencia del IL-21 (Figura 3C).

El IL-21 bloquea la síntesis de IgE en PBMC no fraccionado estimulado con PHA e IL-4 Las células T activadas son solamente la fuente conocida de IL-21. En la siguiente serie de experimentos, los efectos del IL-21 fueron investigados bajo condiciones en las cuales la recombinación de cambio de la clase Ig era dependiente en la activación de la célula T. El PBMC no fraccionado fue tratado con mitógeno de célula T, PHA, para inducir la expresión CD40L (51 ). Luego de la adición del IL-4 o IL-13, el IgE se liberó en el sobrenadante a los 14-21 días. En este sistema dependiente de célula T, la producción de IgE manejada por IL-4 se bloqueó por el IL-21 , que redujo grandemente los niveles de IgE liberados en el sobrenadante (Figura 4A, 4B). El porcentaje de pozos que producen IgE disminuyó del 47% con IL-4 solo al 6% con IL-4 + IL-21. De manera interesante, este efecto no fue visto cuando la síntesis IgE se inició con IL-13. Las células tratadas con IL-13 + IL-21 produjeron más IgE que aquellas tratadas con IL-13 solo (Figura 4A, 4B), como habían sido vistas con células B purificadas (Figura 1A). El porcentaje de pozos que producen IgE se incrementó del 31 % con IL-13 solo al 68% con IL-13 + IL-21. Teniendo en cuenta que las células T responden al IL-4 pero no al IL-13, estas observaciones puntualizan al mecanismo dependiente de célula T para la actividad inhibidora del IL-21 sobre la producción IgE manejada por IL-4 en este sistema. Para investigar adicionalmente esta actividad inhibidora, la trascripción de la línea germinal ?e se examinó. Con la estimulación PHA, el trascripto de línea germinal ?e fue detectable tempranamente después de la adición del IL-4 o el IL-13 (días 3-5 de cultivo). Aunque el IL-21 bloqueó la producción del IgE en los cultivos tratados con IL-4, este no evitó la inducción adicional del trascripto de línea germinal ?e en IL-4 o IL-13 (Figura 4C).

El IL-21 incrementa la producción de lgG4 en PBMC no fraccionado estimulado con PHA En cultivos PBMC estimulados con PHA, el tratamiento con IL-4 o IL-13 indujo altos niveles de trascripto de línea germinal ??4. El PBMC tratado con IL-21 o sin citoquina agregada también mostró trascripto detectable (Figura 4C). El día 14-15, niveles mucho mayores de lgG4 fueron encontrados en cultivos que habían sido tratados con IL-21 que en aquellos tratados con IL-4 o IL-13 solos (Figura 4D). Además el IL-4 fue inhibidor para IL-21 -indujo producción de lgG4, mientras que la adición de IL-13 no lo fue (Figura 4D).

La expresión del CD40L se mantiene en la presencia de IL-21 Un efecto inhibidor del IL-21 sobre la producción del IgE e lgG4 fue vista cuando el PHA fue utilizado para inducir señales coestimuladoras para la producción de IgE impulsado por IL-4 (Figuras 4A-4D). Como contraste, cuando el CD40 se utilizó para reticular directamente CD40 en cultivos PBMC, el IL-21 no bloqueó la producción de IgE en respuesta al IL-4 (Figuras 3A-3D). Así, consideramos la posibilidad de que el IL-21 redujera la expresión del CD40L mediante PBMC estimulado con PHA e IL-4. El CD40L mARN es lábil, y la expresión se cree que es trascripcionalmente regulada (37,38). Utilizando PCR en tiempo real, examinamos los niveles de trascripto de CD40L en cultivos de PBMC estimulados con PHA después de la adición de citoquina (día 4), o en un punto de tiempo posterior (día 14), en el cual el IgE fue medible en las células sobrenadantes. En ambos puntos de tiempo, las células tratadas con IL-4 o IL-4 + IL-21 mostraron una fuerte expresión CD40L mARN, mientras que los niveles de trascripto con IL-21 solos no se elevaron sobre aquellos vistos con PHA (Figura 5A). Estos hallazgos fueron soportados mediante la amplificación PCR utilizando iniciadores que se esparcen en la región de codificación CD40L completa (Figura 5B). Este resultado demuestra claramente que la presencia del IL-21 no bloquea la trascripción de CD40L, indicando que la expresión del CD40L no se reduce bajo condiciones en las cuales la producción de IgE se inhibe.

IL-21 induce a expresión de IFN-? Varios experimentos fueron hechos para averiguar si el tratamiento de PBMC activado con IL-4 estimulado con PHA con IL-21 resultado en la generación de citoquinas que bloquean la producción de IgE. La capacidad del IFN-? para antagonizar la síntesis de IgE ha sido bien caracterizada (10, 13, 14, 39), y el IL-21 es conocido por estimular la trascripción del gen IFN-? en células T y NK humanas (36, 40). Por lo tanto, la expresión del trascripto IFN-? se examinó en PBMC estimulado con PHA tratado con IL-4, IL-13 o IL-21. Temprano en los cultivos, cuando el trascripto de la línea germinal ?e fue detectable, la expresión del gen IFN-? fue vista bajo todas las condiciones de tratamiento. Al día 14 de cultivo, cuando el IgE podría ser ensayado del sobrenadante, la expresión del gen IFN-? fue vista solamente en cultivos tratados con IL-4 o aquellos tratados con IL-21 (Figuras 5A-5B). Así, los trascriptos del IFN-? fueron encontrados ambos en cultivos tratados con IL-4 + IL-21 , en los cuales se redujo la producción de IgE, y en aquellos tratados con IL-13 + IL-21 , en los cuales se mantuvo la producción de igE.

El IL-21 induce la producción de IL-10 mediante PBMC, pero no afecta la producción de IL-12 o la expresión de IL-12RP El IL-10 es una citoquina multipotente que ha sido reportada por estimular (41 ) o inhibir (21) la síntesis IgE de célula B, dependiendo de la presencia de otras citoquinas o señales coestimuladoras. Nos preguntamos si el IL-10 era producido en cultivos PBMC tratados con IL-21 y podría ayudar a explicar la inhibición de la producción de IgE que era vista en la presencia de IL-4. El IL-21 se encontró que reforzaba la producción de IL-10 mediante PBMC, tanto en cultivos estimulados con PHA (Figura 6A), donde la producción de IgE estaba inhibida (Figuras 4A-4D), y en los cultivos estimulados anti-CD40 mAb (Figura 6B), donde la producción de IgE no estaba inhibida (Figuras 3A-3D). Adicionalmente, los niveles IL-10 comparables fueron vistos en la presencia de IL-4 o IL-13 (Figura 6A, 6B). El análisis PCR en tiempo real confirmó que el IL-21 incrementó la producción de IL-10, pero el incremento fue visto si o no se liberara IgE. Para averiguar el papel del IL-10 más directamente, se agrega anticuerpo neutralizante al IL-10 a los cultivos estimulados con PHA, y no se solucionó el efecto inhibidor del IL-21 sobre la producción de IgE. Varias otras citoquinas han sido reportadas por bloquear la producción de IgE, incluyendo el IL-12 (19), y el TGF-beta (10). Tanto el IL-12 (Figura 6C) como el TGF-beta se podría detectar en cultivos PBMC, pero los niveles fueron similares a las células tratadas con IL-4 o IL-13, en la presencia o ausencia de IL-21. El IL-21 no tuvo un efecto sobre la expresión del gen IL-12? inducida por PHA, IL-4, o IL-13 (Figura 6D). Así, ni el IFN-?, IL-10, IL-12, ni el TGF-beta podrían contar satisfactoriamente para el efecto inhibidor del IL-21 sobre la producción de IgE manejado por IL-4.

El IL-21 no maneja la apoptosis de la célula B en cultivos PBMC estimulados con PHA El IL-21 ha mostrado inducir la apoptosis de células B primarias de murino (25). Así, es posible que las células B de los cultivos PBMC estimulados con PHA tratados con IL-21 fuera manejada hasta apoptosis, contando para la disminución en la producción de IgE. Con el fin de manejar este tema, el PBMC estimulado con PHA fue teñido con anti-CD19 para identificar las células B, y ensayado para la unión de Pl y FITC-anexina mediante citometría de flujo. Las células apoptóticas tardías (? / FITC- anex¡na+) se podrían distinguir de células B apoptóticas tempranas (Plne9/FITC-anexina+) o células B viables (Plne9/FITC-anexinaneg). Los resultados muestran que la adición de IL-21 dio como resultado un menor incremento en el porcentaje de células CD19+ apoptóticas en cultivos tratados con IL-4, pero que el nivel de apoptosis no fue diferente que el visto en los cultivos tratados con IL-13 o IL-13 + IL-21 (figura 7). Asi, la inducción de la apoptosis de la célula B no cuenta para el efecto inhibidor del IL-21 sobre la producción de IgE.

Agregar de nuevo IL-13 no restablece la producción de IgE en PBMC tratado con IL-4 e IL-21 En razón a que el IL-21 inhibió la producción de IgE del PBMC estimulado con PHA en respuesta al IL-4 pero no al IL-13 (Figuras 4A-4D), nos preguntamos si la presencia de todas las tres citoquinas tendría un efecto activante o inhibidor neto. Los resultados mostraron que la combinación del IL-4 y el IL-13 fue inhibidora para la producción de IgE. Así, el IL-13 no rescata la producción de IgE del PBMC estimulado por PHA tratado con IL-4 e IL-21 (Figura 8A), mientras que la adición del IL-4 redujo la producción de IgE que era normalmente vista en PBMC estimulado con PHA tratado con IL-13 e IL-21 (Figura 8B).

La ligación CD40 supera el efecto inhibidor del IL-21 sobre la producción de IgE. Hemos observado que en PBMC humano estimulado con anti-CD40 e IL-4, la adición de IL-21 refuerza la producción de IgE (Figuras 3A-3D). Como contraste, en el PBMC estimulado mediante PHA e IL-4, la adición del IL-21 bloquea la producción de IgE (Figuras 4A-4D). Con el fin de ayudar a reconciliar estas observaciones, el PBMC activado con PHA fueron tratados con anti-CD40 en combinación con IL-4 en la presencia o ausencia de IL-21. Bajo estas condiciones, el IL-21 no inhibió la producción de IgE, sino que en su lugar reforzó los niveles de IgE por encima de aquellos vistos con IL-4 solo (Figuras 9A-9B). Así, el anti-CD40 fue capaz de solucionar el efecto inhibidor del IL-21 sobre la producción de IgE mediante PBMC activado con mitógeno.

El IL-21 no reduce la producción de IgE mediante PBMC irradiado estimulado con PHA En estos estudios, la expansión de la célula T estimulada con PHA fue grandemente potenciada por la combinación de IL-4 + IL-21. En razón a que las células T pueden responder al IL-4, es posible que el IL-4 se agote de estos cultivos. De acuerdo con este escenario, el trascripto ?e inicial puede ser visto en los días 3-5 (Figura 4C), pero una vez que los números de célula T se vuelven demasiado altos, los niveles de IL-4 no pueden sostener la producción de IgE o lgG4 de la célula B. En razón a que las células T no ¡nteractúan con el IL-13, esta citoquina no se agotaría, y la producción de IgE de la célula B se podría sostener en cultivos tratados con PHA e IL-13. Con el fin de ensayar la hipótesis de que la expansión de la célula T contribuye a la producción IgE reducida en cultivos estimulados con PHA tratados con IL-4 e IL-21 , los PBMC fueron irradiados luego de la estimulación con PHA. Las células B purificadas fueron agregadas de nuevo hasta comprender 20% del cultivo, para aproximarse a la frecuencia de la célula B del PBMC normal. Las células fueron tratadas con citoquinas como anteriormente, y la producción IgE se examinó el día 13. Con la expansión de la célula T evitada mediante la irradiación, la adición de IL-21 no redujo el IL-4 mediado por producción de IgE (figura 10A). En cultivos no irradiados configurados en paralelo, sin embargo, el IL-21 no dio como resultado una producción IgE disminuida (Figura 10B), de acuerdo con los resultados mostrados en la Figura 4A, B. Estas observaciones sugieren que la disminución evidente en la producción de IgE resulta de la adición de IL-21 a PBMC estimulado con PHA tratado con IL-4 fue secundaria a la expansión de linfocito y no fue un efecto directo sobre las células B.

Discusión La recombinación de cambio de IgE in vitro requiere dos distintas señales: (i) las citoquinas IL-4 o IL-13 para manejar la generación del trascripto de línea germinal ?e; y (ii) acoplamiento del antígeno CD40 de la superficie de la célula B para promover la recombinación de cambio de supresión (42). Las citoquinas suministran regulación importante de este proceso. El IL-21 ha mostrado inhibir la producción de IgE en sistemas de murino (26, 27), pero su efecto en producción de IgE humano no ha sido explorado en detalle. Hemos examinado los efectos del IL-21 sobre la producción de IgE humano bajo tres diferentes modelos de activación y encontramos que, dependiendo de las condiciones, el IL-21 puede ser estimulador o inhibidor. El IL-21 es una citoquina pleiotrópica producida por las células T activadas, que tiene efectos sobre muchos tipos de célula inmune (22, 23). Bajo las condiciones apropiadas, esta induce la proliferación de la célula B (22) o la apoptosis de la célula B (25). En sistemas de murino, el IL-21 bloquea la producción de IgE tanto en respuesta al IL-4 como a la estimulación de mitógeno in vitro, y a la inmunización específica in vivo (26, 27). De acuerdo con esto, los ratones deficientes en IL-21 R han incrementado los niveles de descanso de suero IgE comparado con ratones tipo silvestre (23) , y producen niveles más altos de IgE luego de la inmunización o infección (26). En células B de murino aisladas, el IL-21 antagoniza directamente el IL-4 y la recombinación de cambio ?e inducida por LPS (27). Ahora reportamos que el IL-21 mejora la producción de IgE mediada por IL-4 o IL-13 mediante células B humanas aisladas. Las síntesis de IgE potenciada con IL-21 no solamente mediante células B purificadas sino también por PBMC tratado con IL-4 o IL-13 en las cuales la activación de célula B se logró con mAb anti-CD40. Las células B de sangre periférica humana inactivas expresan el receptor IL-21 , y el IL-21 puede potenciar la proliferación de célula B inducida por anti-CD40 (22). Observamos la incorporación creciente de 3H-timidina mediante células B tratadas con IL-4 o IL-13 en la presencia de IL-21. Así, el mejoramiento de la producción de IgE visto en la presencia de IL-21 puede ser una consecuencia, al menos en parte, de la expansión de la célula B mediada por IL-21. Como contraste, un efecto inhibidor del IL-21 se observó cuando las células T activadas con PHA fueron utilizadas como una fuente de señales coestimuladoras para la producción de IgE. Bajo estas condiciones, el IL-21 bloquea la síntesis de IgE manejada por IL-4 pero no IL-13. Aunque no es concluyente, estas observaciones apuntan a un mecanismo dependiente de célula T, en razón a que el PHA es un mitógeno de célula T y las células T responden al IL-4 pero no al IL-13. En razón a que el anticuerpo anti-CD40 podría superar la inhibición, la función o expresión del CD40L está implicada. Más aún, observamos que el trascripto de línea germinal ?e en la ausencia de síntesis de IgE, que es característica de defectos en la expresión del CD40L (43,44) o a la señalización del CD40 (45). Sin embargo, los trascriptos CD40L, que son lábiles y limitan la expresión de proteína (37,38) no disminuyeron por el IL-21. Así, especulamos que el IL-21 puede elícitar las señales de superficie celular adicionales que bloquean la interacción de célula T - célula B en este sistema, o reducen la resistencia de la señal CD40L. Se han descrito varias citoquinas para antagonizar con la producción de IgE, que incluyen TGF-beta (10, 46, 47), IFN-? (10, 13, 14, 46), IL-10 (21 , 48), e IL-12 (18). Hemos comparado los niveles de estas citoquinas en cultivos en los cuales se produjo o se inhibió IgE. El TGF-beta se detectó en todos los cultivos, pero no mostró asociación con los niveles de IgE. La trascripción de IFN-? se elicitó mediante IL-21 en cultivos PBMC estimulados por PHA, de acuerdo con los reportes previos (36, 40), pero no asociados con la pérdida de síntesis de IgE. Esta se mantuvo con tratamiento IL-4 + IL-21 , en el cual la producción de IgE se bloquea, o tratamiento de IL-13 + IL-21 , en el cual no hubo inhibición. El IL-10 bloquea la producción de IgE de una manera dependiente de monocito, de tal forma que este no tiene actividad inhibidora sobre las células B purificadas (49), similares a los hallazgos corrientes con IL-21. Aunque el IL-10 se encontró en los cultivos PBMC, este no estuvo asociado con la inhibición de la producción de IgE. Los niveles equivalentes fueron vistos en cultivos estimulados con anti-CD40 mAb o PHA, aunque el IgE no solo se inhibió con PHA. En el PBMC tratado con PHA, los niveles comparables de IL-10 fueron producidos con IL-4 + IL-21 , que fue inhibidor para la producción de IgE, y con IL-13 + IL-21 , que fue estimulador. El anticuerpo neutralizante al IL-10 no reversó el efecto inhibidor del IL-21. Estas observaciones indican que el IL-10 no es responsable de los efectos del IL-21 vistos en este sistema. El IL-12 también se ha reportado por reducir la producción de IgE manejada por IL-4 mediante PBMC no fraccionado, pero no mediante célula B purificada (18), similar a las observaciones habituales con IL-21.

Adicionalmente, el IL-21 puede influenciar las respuestas del linfocito al IL-12. El IL-21 sobreregula la trascripción de IL-12RP2 en línea celular NK humana y en células T humanas primarias (40), mejora grandemente la secreción de IFN-? mediada por IL-12 mediante células NK de ratón (23), y promueve la unión de STAT4 mediada por IL-12 a la secuencia activada IFN-? del gen IL2Ra (40). El IL-21 maneja la apoptosis de las células B de murino, aún aquellas que han sido estimuladas con LPS (25, 50). El IL-4 no puede rescatar las células B tratadas con IL-21 de la apoptosis, sino que la pre-activación con anti-CD40 mAb es protectora (25). Así, el PBMC no fraccionado estimulado con IL-4 y PHA ha reducido la producción de IgE en razón a que las células B han sufrido apoptosis, mientras que aquellas estimuladas con anti-CD40 mAb fueron protegidas. Encontramos que la apoptosis de las células B en los cultivos PBMC, se incrementaban marginalmente con IL-21 , pero la adición del IL-4 no produjo más apoptosis que el IL-21 solo o el IL-13 + IL-21. Así, las condiciones que conducen a la producción IgE reducida no se asociaron con la apoptosis de célula B mejorada. A los ratones a los que les falta IL-4 o IL- 3 no generan niveles tipo silvestre de IgE (51 , 52), sugiriendo que una citoquina sola no puede compensar completamente la pérdida de la otra. De hecho, el IL-13 puede ser el principal manejador de respuestas atópicas, como la neutralización selectiva (53) o la supresión (54) de los ratones protegidos de IL-13 provenientes del desarrollo de patología de asma a pesar de la presencia del IL-4. Recientemente, Hajoui et al. (55) ha mostrado que la producción de IL-13 mediante las células B mismas se requiere para la generación de IgE en respuesta al IL-4, y propone que la producción de célula B del IL-13 sea necesaria para la síntesis de IgE inducida por IL-4. Observamos que la producción de IL- 3 en PBMC estimulado con PHA tratado con IL-4, el cual se redujo a la mitad con IL-21 agregado. Adicionalmente, nuestros hallazgos de que el IL-21 antagonizó la generación de IgE inducida por IL-4 en PBMC estimulado con PHA, mientras que la respuesta de IL-13 permaneció robusta, podrían señalizar un papel para el IL-21 en regulación de esta senda autocrina. Mientras que el IgE dirigido contra los alérgenos es necesario y suficiente para el desarrollo de una enfermedad atópica (56), el lgG4 se ha considerado como protector (4, 5, 6, 7). Encontramos que el tratamiento de PBMC se ha activado con mitógeno con IL-21 solo estimuló la liberación de lgG4. Ningún IgE fue producido bajo estas condiciones, sugiriendo que el IL-21 puede ser capaz de cambiar el balance entre el lgG4 y el IgE bajo circunstancias apropiadas. Como contraste, aunque el IL-4 o el IL-13 generó niveles altos de trascripto de línea germinal ID4, nosotros y otros (57) encontramos que estas citoquinas solas no dan como resultado la liberación de proteína lgG4 detectable proveniente de células B periféricas humanas. En la redisposición del gen Ig y la secreción de anticuerpo son eventos diferencialmente regulados (58). El IL-4 induce recombinación de cambio lgG4 en células B originales, pero pueden represar la secreción de proteína madura en aquellas células que ya han cambiado a lgG4 (59). Lo opuesto fue visto con el IL-21 solo, el cual no indujo el trascripto de línea germinal ??4 por encima de los niveles no estimulados, sino que mejora fuertemente la secreción de proteína lgG4. El IL-21 induce la secreción de todos los isotipos IgG humanos, aunque promueve de novo la recombinación de cambio específicamente solamente para lgG1 e lgG3 (57). La liberación de la protema sin la trascripción de novo sugiere que el IL-21 promueve la activación o expansión de los clones de célula B que han estado comprometidos en la generación in vivo de lgG4, un proceso previamente mostrado por contar para la generación independíente de IL-4 / IL-13 de lgG4 in vitro (60). Tomados juntos, estos estudios muestran que el IL-21 estimula o inhibe la producción de IgE e lgG4 mediante las células B humanas dependiendo de las condiciones de activación. El IL-21 tiene respuestas contradictorias similares en otros sistemas. Bajo condiciones apropiadas, este puede inducir la activación de célula NK y/o la apoptosis, estimular o limitar la expansión de célula T, e inducir o inhibir la producción IFNy (61 ). En el sistema de murino, el IL-21 dispara la apoptosis de las células B tratadas con LPS, pero coestimula la proliferación de células B tratadas con anti-CD40 o anti-lgM (25, 50, 62). Se ha propuesto que el IL-21 actúa como un punto de revisión para respuestas inmunes productivas, manejando la activación y la proliferación bajo condiciones permisivas, aunque promoviendo la apoptosis de linfocítos activados ¡napropiadamente o en un ambiente desfavorable (50, 61 , 62). En el contexto del presente estudio, el IL-21 parece ejercer una influencia reguladora sobre la producción IgE humano, bien sea reforzando los niveles o asegurándolos contra sobre-producción de esta molécula efectuadora crítica.

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Immunol. 73(2004)5361-5371. Aquellos expertos en la técnica reconocerán, o podrán determinar utilizando no más que la experimentación de rutina, muchos equivalentes de las modalidades específicas de la invención descrita aquí.

Tales equivalentes están destinados a ser comprendidos por las siguientes reivindicaciones.

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1.- El uso de un agonista de senda IL-21 en la fabricación de un medicamento para mejorar un síntoma de un trastorno atópico de un sujeto. 2. - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde el agonista de senda IL-21 es un polipéptido IL-21. 3. - El uso como se reclama en la reivindicación 2, en donde el polipéptido IL-21 es humano. 4. - El uso como se reclama en la reivindicación 2, en donde el polipéptido IL-21 comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID No: 2. 5. - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde el agonista de senda IL-21 es un ácido nucleico que codifica un polipéptido IL-21. 6. - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde el trastorno atópico se selecciona del grupo que consiste de: dermatitis atópica, asma, asma bronquial extrínseca, urticaria, eczema, rinitis alérgica, y enterogastritis alérgica. 7.- El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde el sujeto es humano. 8. - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde los niveles IgE disminuyen al menos 40% con relación a los niveles en un sujeto antes de la administración. 9. - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde se evalúa uno o más síntomas del trastorno atópico en el sujeto. 10. - El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde se evalúa un parámetro asociado a IL-21 en el sujeto. 11. - El uso como se reclama en la reivindicación , en donde se evalúan los niveles de IgE endógeno en el sujeto. 2.- El uso de un agonista de senda IL-21 en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir un trastorno atópico en un sujeto humano. 13. - El uso como se reclama en la reivindicación 12, en donde el agonista de senda IL-21 es un polipéptido IL-21. 14. - El uso como se reclama en la reivindicación 13, en donde el polipéptido IL-21 es humano. 15. - El uso como se reclama en la reivindicación 14, en donde el polipéptido IL-21 comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID No: 2. 16. - El uso como se reclama en la reivindicación 12, en donde el trastorno atópico se selecciona del grupo que consiste de: dermatitis atópica, asma, asma bronquial extrínseca, urticaria, eczema, rinitis alérgica, y enterogastritis alérgica. 17. - Un método para modular la producción de IgG en una célula ex vivo o in vitro, el método comprende: poner en contacto un modulador de senda IL-21 , con la célula en una cantidad suficiente para modular la producción de IgG. 18. - El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque la producción de IgG se incrementa y el modulador de senda IL-21 es un agonista de senda IL-21. 19. - El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque el agonista de senda IL-21 es un polipéptido IL-21. 20. - El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque la producción de IgG disminuye y el modulador de senda IL-21 es un antagonista de senda IL-21. 21. - El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque el antagonista de senda IL-21 es un anticuerpo que se une a IL-21 o un agente que comprende una forma soluble del receptor IL-21. 22. - El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque el antagonista de senda IL-21 es un ácido nucleico que reduce la expresión de IL-21 , el receptor IL-21 , o un componente de senda IL-21. 23.- El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque la célula es in vitro. 24.- El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque la célula es ex vivo. 25. - Un método para modular la producción de IgE en una célula, el método comprende: poner en contacto un modulador de senda IL-21 , con la célula en una cantidad suficiente para modular la producción de IgE. 26. - El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque la producción de IgE disminuye y el modulador de senda IL-21 es un agonista de senda IL-21. 27. - El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque los niveles de IgE disminuyen en al menos 40%. 28. - El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque la producción de IgE se incrementa y el modulador de senda IL-21 es un antagonista de senda IL-21. 29. - El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque los niveles de IgE se incrementan en al menos 20%. 30. - Un método para modular los niveles relativos de IgE e IgG, el método comprende: poner en contacto un modulador de senda IL-21 , con la célula en una cantidad suficiente para modular los niveles relativos de IgE e IgG. 31. - El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque la proporción IgE/lgG disminuye y el modulador de senda IL-21 es un agonista de senda IL-21. 32.- El método de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque el agonista de senda IL-21 es un polipéptido IL- 21. 33.- El método de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque la proporción disminuye en al menos 40%. 34.- El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque la proporción IgE/lgG se incrementa y el modulador de senda IL-21 es un antagonista de senda IL-21. 35.- El método de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque la proporción se incrementa en al menos 20%. 36.- El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque los niveles relativos son modulados al inhibir una recombinación de cambio requerida para el trascripto ?e. 37.- El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque los niveles relativos son modulados en la presencia de células T. 38.- Una composición farmacéutica que comprende un agonista de senda IL-21 y un segundo agente para tratar un trastorno atópico. 39.- Un recipiente que comprende una o más dosis de una composición farmacéutica de un agonista de senda IL-21 y una etiqueta, la etiqueta comprende la instrucción para administrar una dosis de la composición para tratar una enfermedad o trastorno atópico. 40. - Un método para evaluar un sujeto que tiene o que se sospecha que tiene un trastorno atopico, el método comprende: evaluar un parámetro asociado con IL-21 para un sujeto que tiene un trastorno atópico; comparar los resultados para evaluar un parámetro de referencia, y suministrar una recomendación de una terapia para el trastorno como una función de la comparación. 41. - El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado además porque el parámetro asociado a IL-21 comprende un valor cuantitativo o cualitativo para abundancia de polipéptido IL-21 o mARN de IL-21. 42. - El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado además porque el parámetro asociado a IL-21 comprende un valor cuantitativo o cualitativo para proteína receptora o mARN de IL-21 , o para una actividad de senda IL-21. 43.- El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado además porque el trastorno atópico se selecciona del grupo que consiste de: dermatitis atópica, asma, asma bronquial extrínseca, urticaria, eczema, rinitis alérgica, y enterogastritis alérgica. 44.- Un método para evaluar un sujeto para riesgo de un trastorno atópico, el método comprende: evaluar un parámetro asociado a IL-21 para un sujeto, comparar los resultados de la evaluación con un parámetro de referencia, y suministrar una evaluación del riesgo para un trastorno atópico como una función de la comparación.