PIRROL-2.5-DIONAS SUSTITUIDAS COMO INHIBIDORES DE PROTE1NA CINASA C
La presente invención se refiere a derivados de indolilmaleimida, proceso para su producción y composiciones farmacéuticas que ios contienen. Más particularmente, ía presente invención proporciona un compuesto de la fórmula I:
en donde. Ra es H, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, o alquilo de 1 a 4 átomos de carbono sustituido por OH , NH2, NH-alquilo de 1 a 4 átomos de carbono o N(alquilo de 1 a 4 átomos de carbono)2; Rb es H; halógeno; alquilo de 1 a 6 átomos de carbono; o alcoxi de 1 a 6 átomos de carbono, y R es un radical de la fórmula (a):
(a) en donde cada uno de Ri y R2 es, independientemente, H o metilo; R3 es F, Cl, acetamida, nitro o amino; R4 es H, CH3, CF3, F o Cl; R que es diferente a H , CH3 o CF3 cuando R3 es Cl. En los compuestos de la fórmula I, se prefieren los siguientes significados individualmente o en cualquier sub-combinación: . Ra es H o metilo; 2. R es H, metilo o etilo; 3. RT es metilo; 4. R2 es H; 5. R3 es F , Cl o nitro: 6. R3 está unido en la posición 2; 7. R es H o F en donde R4 es diferente a H cuando R3 es Cl; 8. R4 está unido en la posición 4. Los compuestos de la fórmula l pueden existir en forma libre o en forma de sal. Por ejemplo, sales de adición con, por ejemplo, ácidos orgánicos o inorgánicos, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido acético o ácido trifluoroacético. Se apreciará que los compuestos de la fórmula I pueden existir en la forma de isómeros ópticos, racematos o diastereoisómeros. Por ejemplo, un átomo de carbono del anillo que lleva un sustituyente en la posición 3 del residuo de piperazinilo es asimétrico y puede tener la configuración D- o L-. Se entiende que la presente invención abarca todos los enantiómeros y sus mezclas. Consideraciones similares aplican en relación a los materiales de partida que exhiben átomos de carbono asimétricos como se mencionó. La presente invención incluye también un proceso para la preparación de un compuesto de la fórmula I, dicho proceso que comprende hacer reaccionar un compuesto de la fórmula II:
en donde Ra y Rb son como se definieron antes, con un compuesto de la fórmula Jll: en donde R es como se definió antes, y, cuando se requiere, convertir el compuesto resultante de la fórmula I obtenido en forma libre a una forma de sal o viceversa, según sea apropiado. El proceso se puede efectuar convenientemente en la presencia de una base fuerte, por ejemplo, t-BuOK, por ejemplo como se describe en la WO 02/38561 . Los compuestos de las fórmulas II y III se pueden preparar de acuerdo con métodos conocidos, por ejemplo como se describen en WO 02/38561 y wO 03/082859. En la medida en que la producción de los materiales de partida no se describe de manera particular, los compuestos son conocidos o pueden ser preparados de manera análoga a métodos conocidos en la técnica o como se describe posteriormente. Los siguientes ejemplos son ilustrativos de la invención. RT = temperatura ambiente DMF = dimetilformamida THF = tetrahidrofurano FCC = cromatografía de columna flash TLC = cromatografía de capa delgada TBAF = cloruro de tetrabutil amonio DBU = 1 , 8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno EtOAc = acetato de etilo MTBE = éter metil t-butílico Ejemplo 1 : 3-( 1 H-indol-3-il)-4-[5-(4-metil-piperazin-1 -il)-2-nitro-feniJJpirrol- 2,5-diona
A una solución de 2-[5-(4-metil-piperazin-1 -il)-2-n¡tro-fenil]- acetamida (278 mg, 1 .00 mmol) y éster metílico del ácido (1 H-indof-3-il)-oxo-acético (366 mg, 1 .80 mmol) en THF seco (8.0 mL) se agrega una solución de t-BuOK 1.0 M en THF (4.0 mL, 4.0 mmol) a 0° C bajo argón. Después de agitar durante 30 minutos a 0o C y una hora a RT, la TLC indica el consumo completo de la acetamida. La mezcla de reacción púrpura se divide entre EtOAc (50 L) y salmuera (50 L), las capas se separan, y la capa acuosa se extrae con EtOAc (50 mL). Las capas orgánicas combinadas se secan en Na2SO4 y se concentran a presión reducida. El producto crudo se purifica mediante FCC (EtOAc/AcOH/H2O 7.1 .1 ) para dar el compuesto del título como su sal de acetato soluble en agua. Sólido anaranjado. 1H RMN (DMSO-d6, 400 MHzy. d 1 .84 (s, 6H , CH3COO , 1 .97-2.15 (m, 4H), 2.03 (s, 3H), 2.95-3.21 ( , 4H), 6.51 (d, J = 7.8 Hz, 1 H), 6.54 (d, J = 2.7 Hz, 1 H), 6.73 (t, J = 7.8 Hz, 1 H), 7.01-7.07 (m, 2H), 7.41 {ú, J = 8.1 Hz, 1 H), 8.00 (s, 1 H), 8.13 (d, J = 9.4 Hz, 1 H), 10.8-1 1 .4 (br, 1 H), 1 1 .95 (bs, 1 H). ES+-MS: 431 [M + HV\ Preparación de 2-[5-(4-metil-piperazin-1 -iJ)-2-nitro-fenil]-acetamida Se suspende el éster etílico del ácido [5-(4-metiJ-pjperazir)a-1 -il)-2-nitro-fenil]-acético (1 .54 g, 5.01 mmol) en una solución acuosa de NH4OH al 33% (400 mL), y se agita durante tres días a RT. El volumen se reduce cuidadosamente al vacío hasta que el compuesto del título permanece como un sólido amarillo, el cual se seca posteriormente bajo alto vacío. ES+-MS: 279 [M + HV\ Preparación del éster etílico del ácido [5-(4-metil-piperazina-1 - il)-2-nitro-fenil]-acético Bajo argón, una mezcla del éster etílico del ácido (5-bromo-2-npro-fenii)-acético (2.02 g, 7.00 mmol) y -metil-piperazina (1 .40 g, 14.0 mmol) se calienta a 6t5° C durante 24 horas. La mezcla de reacción se divide entre CH2CI2 (25 L) y H2O (25 mL) y la capa acuosa se extrae con CH2CI2 (2 x 25 mL). Las capas orgánicas combinadas se lavan con salmuera (25 mL), se secan en Na2SO4 y se concentran a presión reducida. El producto crudo se purifica mediante FCC (CH2Cl2/MeOH 97.5:2.5) para dar el compuesto del título como un aceite amarillo. ES+- S: 308 [M + H] Preparación del éster etílico del ácido (5-bromo-2-nitro-fenil)-acétíco A una solución 1 .0 M de t-BuOK en THF (60 mL, 60 mmol) se agrega lentamente durante 1 5 minutos una solución de 4-bromo-nJtro benceno (5.05 g, 25.0 mmol) y éster etílico del ácido cloro-acético (3.68 g, 30.0 mmol) en THF (30 mL) a -40° C bajo argón. La mezcla de reacción azul intenso se agita durante una hora a -40° C. El análisis de TLC indica la presencia de algún material de partida en este momento. Sin embargo, no se observa conversión adicional de material de partida con agitación prolongada. La mezcla de reacción se apaga cuidadosamente con una solución acuosa de HCl 2 M (40 mL) y se extrae con MTBE (2 x 1 00 mL). Las fases orgánicas combinadas se lavan con H2O (100 mL), se secan en Na2SO4 y se concentran a presión reducida. El producto crudo se purifica mediante FCC (cicIohexano/EtOAc, 97:3) para dar el compuesto del título como un aceite incoloro. ES+-MS: 289 [M + H]+. Ejemplo 2: 3-l2-Amino-5-(4-metil-piperazin-1 -ii)-fenii]-4-( H-indol-3-jl)-pirroi-2,5-diona
A una solución de 2-[2-Amino-5-(4-metil-piperazin-1 -il)-fenil]-acetamida (124 mg, 0.50 mmol) y éster metílico del ácido (1 H-indo)-3-il)-oxo-acético (183 mg, 0.90 mmol) en THF seco (4.0 mL) se agrega una solución de t-BuOK 1 .0 M en TH F (2.0 mL, 2.0 mmol) a 0o C bajo argón. Después de agitar durante 30 minutos a 0o C a RT, el TLC indica el consumo completo de la acetamida. La mezcla de reacción rojo intenso se dividió entre EtOAc (25 mL) y salmuera (25 mL) y las capas se separaron. El pH de la capa acuosa se ajusta a 6 con una solución acuosa, saturada de NH4CI. La capa acuosa se extrae con
EtOAc (2 x 25 mL) y las capas orgánicas combinadas se lavan con salmuera EtOAc (25 mL, .se secan en Na2SO y se concentran a presión reducida. El producto crudo se purifica mediante FCC (EtOAc/AcOH/H2O, 5.5:1:1) para dar el compuesto del título como su sal de acetato soluble en agua. Sólido rojo. H RMN (DMSO-d6, 400 MHz): d 1.70 (s, 9H, CH3COO), 2.25 (s, 3H), 2.22-2.38 (m, 4H), 2.78-2.84 (m, 4H), 6.51 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.63 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 6.64-6.68 (m, 2H), 6.77 (dd, J = 8.7 Hz, J = 2.8 Hz, 1H), 6.97-7.02 (m, 1H), 7.35 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.90 (s, 1H), 11.91 (bs, 1H). ES+-MS: 402 [M + H]+. Preparación de 2-[2-amino-5-(4-metii-piperazin-1 -il)-fenil -acetamida A una solución de 2-[5-(4-metil-piperazin-1-il)-2-nitro-fepil]-acetamida (468 mg, 1.68 mmol) en MeOH (8.0 mL) se agrega Pd 10% en carbón (59 mg). La mezcla de reacción se agita durante 18 horas bajo una atmósfera (1 atm.) de hidrógeno, se filtra a través de un microfiltro (0.45 µM) y el filtrado se concentra a presión reducida. El aceite café remanente se disuelve en MeOH (1 L), se agrega MTBE (5 L) y el solvente se elimina cuidadosamente a presión reducida para dar el compuesto del título como un polvo beige. ES+-MS: 249 [ + H]+. Ejemplo 3: N-[2-[4-(1H-indol-3-il)-2,5-dioxo-2,5-dihJdro-1H-pirrol-3-il]-4-(4-metil-piperazin-1-il)fenil]-acetamida
A una solución de 2-[2-acetifamino-5-(4-met?-piperazin-1-il)fenil]-acetamida (145 mg, 0.50 mmol) y éster metílico del ácido (1H-indol-3-il)-oxo-acético (183 mg, 0.90 mmol) en THF seco (6.0 mL) se agrega una solución de t-BuOK 1.0 M en THF (2.0 mL, 2.0 mmol) a 0o C bajo argón. La suspensión amarilla resultante se agita durante 18 horas a RT. La mezcla de reacción ahora rojo obscuro se divide entre EtOAc (25 mL) y salmuera (25 mL) y las capas se separan. El pH de la capa acuosa se ajusta a 6 con una solución acuosa, saturada de NH4CI. La capa acuosa se extrae con EtOAc (2 x 25 L) y las capas orgánicas combinadas se lavan con salmuera (25 mL), se secan en Na2SO4 y se concentran a presión reducida. El producto crudo se purifica mediante FCC (EtOAc/AcOH/H2O, 5.5:1:1) para dar el compuesto del título como su saJ de acetato soluble en agua. 1H RMN (DMSO-d6, 400 MHz): d 1.75 (s, 12H, CH3COO), 2.16 (s, 3H), 2.31-2.38 (m, 4H), 2.92-2.99 (m, 4H), 6.61 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 6.66 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 6.75 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 6.92 (dd, J = 9.0 Hz, J = 2.7 Hz, 1H), 6.99 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 7.32 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.47 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.75 (s, 1H), 8.69 (s, 1H), 11.86 (bs, 1H). ES+-MS: 444 [M + Hj+. Preparación de [2-acetilamino-5-(4-metil-piperazin-1-il)-fenil]-acetamida El éster etílico del ácido [2-acetilamino-5-(4-metil-p¡peraz¡n-1-il)-fenilj-acético (450 mg, 1.41 mmol) se suspende en una solución acuosa de NH OH al 33% (200 mL) y se agita durante 16 horas a RT. El volumen se reduce cuidadosamente bajo vacío hasta que el compuesto del título permanece como un sólido café, el cual se seca posteriormente bajo alto vacío. ES+-MS: 291 [M + H)+. Preparación del éster etílico del ácido [2-acetilamino-5-(4-metil-piperazin-1 -il)-fenil]-acético A una solución del éster etílico del ácido [2-amino-5-(4-metil-piperazin-1 -il)-fenil]-acético (438 mg, mmol) en CHCI3 (8.0 mL) se agrega anhídrido del ácido acético (322 mg, 3.16 mmol) y trietilamina (240 mg, 2.37 mmol) bajo argón. La mezcla de reacción resultante se agita durante 1 hora a RT a reflujo. La mezcla de reacción se divide entre CH2CI2 (25 mL) y agua (20 mL) y las capas se separaron. La fase acuosa se extrae con CH2CI2 (2 x 25 L) y las capas orgánicas combinadas se lavan con agua (2 x 25 mL), salmuera (25 mL), se secan en Na2SO4 y se concentran a presión reducida para dar un sólido rojo pálido. ES+-MS: 320 [M + H]+. Preparación del éster etílico del ácido [2-amino-5-(4-metil-piperazin-1 -il)-fenill-acético A una solución del éster etílico del ácido [5-(4-metil-piperazin-1 -il)-2-nitro-fenil]-acético (1 .1 0 g, 3.58 mmol) en MeOH (25.0 mL) se agrega Pd en carbón (1 14 mg). La mezcla de reacción se agita durante 4 horas bajo una atmósfera de hidrógeno (1 atm.), se filtra a través de un microfiltro (0.45 µM) y el filtrado se concentra a presión reducida para dar el compuesto del título como un aceite rojo. ES+-MS: 278 [M + H]+. Siguiendo los procedimientos de los Ejemplos 1 , 2 y 3 o como se describe en WO 02/38561 , pero usando los materiales de partida apropiados, se pueden obtener los compuestos de la fórmula A en donde Ra, Rb, 3 y como se indica en la Tabla 1 a continuación. Tabla 1
Los compuestos de la fórmula I en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable exhiben propiedades farmacológicas valiosas, por ejemplo inhiben la proteína cinasa C (P C), por ejemplo actividad de las isoformas de PKC como a, ß, d, ? o ?, que inhiben la activación y proliferación de células T, por ejemplo mediante la inhibición de la producción de células T o citocinas, por ejemplo IL-2, mediante la inhibición de la respuesta proliferante de células T a citocinas, por ejemplo IL-2, por ejemplo como se indica en pruebas in vitro e in vivo y, por lo tanto, son indicados para terapia. A. In vitro 1 . Ensayo de proteina cinasa C Los compuestos de la invención se prueban para su actividad en diferentes isoformas de PKC de acuerdo con el siguiente método. El ensayo se realiza en una placa de microtitulación de 384 pozos , blanca, de fondo claro con superficie de no aglutinamiento. La mezcla de reacción (25 µl) contiene 1 .5 µM de un sustrato aceptor de tricapéptidos que disimula la secuencia de pseudo sustrato de PKC a con el reemplazo de Ala -> Ser, 33P-ATP 10 µM, Mg(N03)2 10 mM, CaCI2 0.2 mM , PKC a una concentración de proteína que varía desde 25 hasta 400 ng/ml (dependiendo del isotipo usado), vesículas de lípido (que contienen 30% en mol de fosfatidilserina, 5% en mol de DAG y 65% en mol de fosfatidilcolina) a una concentración final de lípido de 0.5 mM, en amortiguador de Tris-HCI 20 mM, pH 7.4 + 0.1 % de BSA. La incubación se realiza durante 60 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detiene agregando 50 µl de mezcla de detención (EDTA 100 mM, ATP 200 µM, Tritón X-100 0.1 %, perlas de SPA recubiertas con estreptavidin 0.375 mg/pozo en salina amortiguada con fosfato w/o Ca, Mg). Después de 10 minutos de incubación a temperatura ambiente, la suspensión se hace girar durante 10 minutos a 300 g. La radioactividad incorporada se mide en un contador Trilux durante un minuto. La medición de IC50 se realiza en una base de rutina mediante la incubación de una dilución en serie de inhibidor a concentraciones que fluctúan entre 1 a 1000 µM. Los valores de IC5s se calculan a partir de la gráfica mediante ajuste de curva con el software XL fit(R). 2. Ensayo de proteina cinasa Cß La PKCT recombinante humana se usa bajo las condiciones del ensayo como se describió antes. En este ensayo, los compuestos de la fórmula I inhiben PKC ? con un IC50 < 1 µM. Por ejemplo, el compuesto del Ejemplo 4 inhibe la PKC ? con un IC50 de 8.9 nM y el compuesto del Ejemplo 4 inhibe la PKCT con un IC50 de 10.2 nM. 3. Ensayo de proteina cinasa Ca Se obtuvo PKCa recombinante humana de Oxford Biomedical Research y se usó bajo las condiciones del ensayo como se describe en la Sección A.1 anterior. En este ensayo, los compuestos de la fórmula I inhiben la PKCa con un IC50 = 1 µM. Por ejemplo, el compuesto del Ejemplo 1 inhibe la PKCa con un IC50 de 2.6 nM y el compuesto del Ejemplo 4 inhibe la PKCa con un IC50 de 2.9 nM. 4. Ensayo de proteína cinasa Cßl Se obtuvo PKCßl recombinante humana de Oxford Biomedical Research y se usó bajo las condiciones del ensayo como se describe en la Sección A.1 antepor. En este ensayo, los compuestos de la fórmula l inhiben la PKCßl con un !C50 < 1 µM. 5. Ensayo de proteína cínasa Cd Se obtuvo PKCd recombinante humana de Oxford Biomedical Research y se usó bajo las condiciones del ensayo como se describe en la Sección A.1 anterior. En este ensayo, los compuestos de la fórmula I inhiben la PKCd con un IC5o = 1 µM. 6. Ensayo de proteína cinasa Ce Se obtuvo PKCe recombinante humana de Oxford Bíomedical Research y se usó bajo las condiciones del ensayo como se describe en la Sección A.1 anterior. En este ensayo, los compuestos de la fórmula I inhiben la PKCe con un IC5o = 1 µM. 7. Ensayo de proteína cinasa Cn Se obtuvo PKC? recombinante humana de PanVera y se usó bajo las condiciones del ensayo como se describe en la Sección A.1 anterior. En este ensayo, los compuestos de la fórmula I inhiben la PKC? con un IC50 = 1 µM . 8. Ensayo de co-estimulación de CD28 El ensayo de realiza con células Jurkat transfectadas con un constructo de gen promotor/reportero de interleucina-2 humano como se describe por Baumann G. y colaboradores en Transplant. Proc. 1 992; 24:43-8, siendo reemplazado el gen reportero ß-galactosidasa por el gen luciferasa (de Wet J . , y colaboradores, Mol. Cell Biol. 1 987, 7(2), 725-737). Las células son estimuladas por anticuerpos acoplados en fase o acetato de forbol miristato (PMA) y la ionomicin ionófora de Ca++ como sigue. Para la estimulación mediada con anticuerpos se recubren placas de microtitulación Microlite TM 1 (Dynatech) con 3 µg/ml de anticuerpos IgG Fe antiratón de cabra (Jackson) en 55 µl de salina amortiguada con fosfato (PBS) por pozo durante tres horas a RT. Las placas se bloquean después de remover fos anticuerpos mediante incubación con albúmina de suero de bovino (BSA) en PBS (300 µl por pozo) durante dos horas a RT. Después de lavar tres veces con 300 µl de PBS por pozo, se agregan 1 0 ng/ml de anticuerpos de receptor de célula anti-T (WT31 , Becton & Dickinson) y 300 ng/ml de anticuerpos anti-CD28 (1 5E8) en 50 µl de BSA/PBS 2% como anticuerpos estimulantes y se incuban durante una noche a 4o C. Finalmente, las placas se lavan tres veces con 300 µl de PBS por pozo. Se preparan siete diluciones en series triples de compuestos de prueba por duplicado en medio de ensayo (RPMI 1640/suero de ternera fetal 10% (FCS) conteniendo 50 µM de 2-mercaptoetanol, 100 unidades/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina) en placas separadas, se mezclan con células Jurkat transfectadas (clon K22 290_H23) y se incuban durante 30 minutos a 37° C en CO2 5%. 100 µl de esta mezcla que contiene 1 x 1 05 de células se transfectan entonces a las placas de ensayo recubiertas con anticuerpos. En paralelo, se incuban 100 µl con 40 ng/ml de PMA y ionomicin 2 µM. Después de incubación durante 5 horas a 37° C en CO2 5%, se determina el nivel de luciferasa por medición de bioluminiscencia. Las placas se centrifugan durante 10 min a 500 g y se remueve el sobrenadante mediante sacudidas. Se agregan amortiguador de lisis que contiene Tris-fosfato 25 mM, pH 7.8, DTT 2 mM, ácido 1 ,2-diaminociclohexan-N ,N, N' ,N-tetracético, glicerol 10% v/v y Tritón X-100 1 % v/v (20 µl por pozo). Las placas se incuban a RT durante 10 minutos bajo agitación constante. La actividad de la luciferasa se evalúa con un lector de bioluminiscencia (Labsystem, Helsinki, Finlandia) después de la adición automática de 50 µl por pozo de amortiguador de reacción de luciferasa que contiene Tricina 20 mM , (MgC03)4Mg(OH)2 x 5H2O 1 .07 mM , MgSO4 2.67 mM, EDTA 0.1 mM, DTT 33.3 mM, coenzima A 270 mM, luciferín 470 µM (Chemie Brunschwig AG), ATP 530 µM, pH 7.8. El intervalo de tiempo es de 0.5 segundos, el tiempo total de medición es de 1 o 2 segundos. Los valores de control bajo son unidades ligeras de las células de receptor de células T o estimuladas con PMA, los controles altos son de células receptor/anti-CD28 de células T o estimuladas con PMA/ionomicin sin ninguna muestra de prueba. Los controles bajos se sustraen de todos los valores. La inhibición obtenida en la presencia de un compuesto de prueba se calcula como por ciento de inhibición del control alto. La concentración de los compuestos de prueba que resulta en 50% de inhibición (fC50) se determina a partir de fas curvas de dosis-respuesta. En este ensayo, los compuestos de la fórmula I inhiben células Jurkat receptor/apti-CD28 de células anti-T y estimuladas con PMA/ionomicin con un IC50 = 1 µM . Por ejemplo, el compuesto del Ejemplo 1 tiene un IC5o de 25.5 nM y el compuesto del Ejemplo 4 tiene un IC50 de 1 7.0 nM. 9. Reacción de Linfocito Mezclada Alogénica (MLR) La MLR de dos sentidos se realiza de acuerdo con procedimientos estándar (J . Inmunol. Methods, 1973, 2, 279 y Meo T. y colaboradores, Inmunological Methods, New York, Academia Press, 1979, 227-39). Brevemente, se incuban células del bazo de ratones CBA y BALB/c (1 .6 x 1 O5 células de cada cepa por pozo en placas de microtitulación de cultivo de tejido de fondo plano, 3.2 x 105 en total) en medio RPM I que contiene FCS 10%, 100 U/ml de penicilina, 100 µg/ml de estreptomicina (Gibco BRL, Basel, Suiza), 2-mercaptoetanol 50 µM (Fluka, Buchs, Suiza) y compuestos diluidos en serie. Se realizan siete pasos de dilución triple por duplicado por compuesto de prueba. Después de cuatro días de incubación se agrega 3H-timidina 1 µCi. Se cosechan células después de un periodo de incubación adicional de cinco horas, y la 3H-timidina incorporada se determina de acuerdo con procedimientos estándar. Los valores antecedentes (control bajo) de la MLR son la proliferación de células BALB/c solas. Los controles bajos se sustraen de todos los valores. Los controles altos sin ninguna muestra se toman como el 100% de proliferación. Se calcula el por ciento de inhibición por la muestra, y se determinan las concentraciones requeridas para inhibición del 50% (valores LC50). Por ejemplo, el compuestos del Ejemplo 1 tiene un LC5a de 17.5 nM y el compuesto del Ejemplo 4 tiene un LC50 de 24.0 nM. B. In vivo Trasplante de Corazón en Rata La combinación de sepas usada: macho Lewis (haplotipo RT1) y BN (haplotipo RT1). Los animales se anestesian usando inhalación de isoffurano. Después de la heparipisación de la rata donante a través de la vena cava inferior abdominal con exsanguinación simultánea vía la aorta, se abre el pecho y el corazón se enfría rápidamente. La aorta se liga y se divide distal a la primera rama y el tronco braquiocefálico se divide en la primera bifurcación. La arteria pulmonar izquierda se liga y se divide y el lado derecho dividido, pero el izquierdo abierto. Todos los otros vasos se disecan libres, se ligan y se dividen y el corazón del donante se remueve en salina helada. El recipiente se prepara mediante disección y sujetado transversal de la aorta abdominal intra-renal y la vena cava. Se implanta el injerto con anastomosis de extremo al lado, usando sutura con monofilamento 10/0, entre el tronco braquiocefálico del donante y la aorta del recipiente y la arteria pulmonar derecha del donante y la vena cava del recipiente. Las pinzas se remueven, el injerto se amarra retro-abdominalmente, se lavan los contenidos abdominales con salina tibia y se cierra el animal y se permite que se recupere bajo una lámpara de calentamiento. La sobrevivencia al injerto se monitorea mediante palpación diaria del latido del corazón del donante a través de la pared abdominal. Se considera que el rechazo está completo cuando el corazón deja de latir. Los aumentos de supervivencia al injerto se obtienen en animales tratados con un compuesto de la fórmula I administrado oralmente a una dosis diaria de 1 a 30 mg/kg bid. Injerto v. Modelo de Huésped Células del bazo (2 x 107) de ratas Wistar/F se inyectan subcutáneamente en la planta de pata trasera derecha de ratas híbridas (Wistar/F x Fisher 344)F? . La planta de la pata izquierda se deja sin tratar. Los animales se tratan con los compuestos de prueba en cuatro días consecutivos (0 a 3). Los nodos linfáticos popliteales se remueven en el día 7, y se determinan las diferencias de peso entre dos nodos linfáticos correspondientes. Los resultados se expresan como la inhibición de crecimiento de nodos linfáticos (dado en por ciento) en comparación con las diferencias de peso de nodos linfáticos en los grupos experimentales para la diferencia en peso entre los nodos linfáticos correspondientes de un grupo de animales dejados sin tratar con un compuesto de prueba. Los compuestos de la fórmula I, por lo tanto, son útiles en el tratamiento y/o prevención de enfermedades o desórdenes mediadas por linfocitos T y/o PKC, por ejemplo rechazo agudo o crónico de injerto de órgano o alo- o xenoinjertos de tejido, versus enfermedades huésped, aterosclerosis, oclusión vascular debido a daño vascular tales como angioplastia, restenosis, obesidad, síndrome X, tolerancia deficiente a la glucosa, síndrome de ovario policístico, hipertensión, falla cardiaca, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, enfermedades CNS tales como enfermedad de Alzheimer o una esclerosis lateral miotrófica, cáncer, enfermedades infecciosas tales como sida, choque séptico o síndrome de angustia respiratoria de adulto, daño por isquemia/reperfusión, por ejemplo infarto al miocardio, derrame, isquemia de intestino, deficiencia renal o choque hemorrágico, o choque traumático, por ejemplo daño cerebral traumático. Los compuestos de la fórmula I son útiles también en el tratamiento y/o prevención de enfermedades o desórdenes inflamatorios agudos o crónicos mediados con células T o enfermedades autoinmunes, por ejemplo artritis reumatoide, osteoartritis, lupus eritematoso sistémico, tiroides de Hashimoto, esclerosis múltiple, miastenia gravis, diabetes tipo I o II y los desórdenes asociados con los mismos, enfermedades respiratorias tales como asma o daño de pulmón inflamatorio, daño de hígado inflamatorio, daño glomerular inflamatorio, manifestaciones cutáneas de desórdenes o enfermedades mediadas inmunológicamente, enfermedades de la piel inflamatorias e hiperproliferantes (tales como psoriasis, dermatitis atópica, dermatitis alérgica por contacto, dermatitis irritante por contacto y además dermatitis eczematosa, dermatitis seborreica), enfermedades inflamatorias de los ojos, por ejemplo síndrome de Sjoegren, queratoconjuntivitis o uveítis, enfermedad inflamatoria de intestino grueso, enfermedad de Crohn o colitis ulcerante. Para los usos anteriores, la dosificación requerida variará por supuesto dependiendo del modo de administración, la condición particular a ser tratada y el efecto deseado. En general, los resultados satisfactorios están indicados para ser obtenidos sistémicamente en dosis diarias desde aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. Una dosificación diaria indicada en el mamífero más grande, por ejemplo humanos, está el rango desde aproximadamente 0.5 mg hasta aproximadamente 2000 mg, administrada convenientemente, por ejemplo, en dosis divididas hasta cuatro veces al día o en forma de retardo. Los compuestos de la fórmula I pueden ser administrados por cualquier ruta conveniente, en particular de manera entérica, por ejemplo oralmente, por ejemplo en la forma de tabletas o cápsulas, o parenteralmente, por ejemplo en la forma de soluciones o suspensiones inyectables, tópicamente, por ejemplo en la forma de lociones, geles, ungüentos o cremas, o en una forma nasal o de supositorio. Se pueden elaborar composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de la fórmula I en forma libre o en forma de saJ farmacéuticamente aceptable en asociación, con por Jo menos un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable en una manera convencional mediante el mezclado con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. Las formas de dosificación unitaria para administración oral contienen, por ejemplo, desde aproximadamente 0.1 mg hasta aproximadamente 500 mg de sustancia activa. La administración tópica es, por ejemplo, en la piel. Una forma más de administración tópica es en el ojo. Los compuestos de la fórmula I pueden ser administrados en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, como se indica anteriormente. Tales sales pueden ser preparadas de manera convencional y exhiben el mismo grado de actividad que los compuestos libres. De acuerdo con lo precedente, la presente invención proporciona además: 1 . 1 Un método para evitar o tratar desórdenes o enfermedades mediadas por linfocitos T y/o PKC o GSK-3ß, por ejemplo tales como se indican anteriormente, en un sujeto que necesita tal tratamiento, dicho método comprende administrar a dicho sujeto una cantidad efectiva de un compuesto de la fórmula I o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable; 1 .2 Un método para evitar o tratar el rechazo de transplante agudo o crónico o enfermedades inflamatorias o autoinmunes mediadas por células T, por ejemplo como se indican anteriormente, en un sujeto que necesita tal tratamiento, dicho método comprende administrar a dicho sujeto una cantidad efectiva de un compuesto de la fórmula I o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable; 2. Un compuesto de (a fórmula I, en forma libre o en una forma de sal farmacéuticamente aceptable para uso como un producto farmacéutico, por ejemplo en cualquiera de los métodos que se indican en 1 .1 y 1 .2 anteriores. 3. Una composición farmacéutica, por ejemplo para uso en cualquiera de los métodos como en 1 .1 y 1 .2 anteriores que comprende un compuesto de la fórmula I en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable en asociación con un diluyente o portador del mismo farmacéuticamente aceptable.
4. Un compuesto de la fórmula I o una sai del mismo farmacéuticamente aceptable para uso en la preparación de una composición farmacéutica para uso en cualquiera de los métodos como en 1 .1 y 1 .2 anteriores. Los compuestos de la fórmula I pueden ser administrados como el único ingrediente activo o conjuntamente con otros fármacos en regímenes de inmunomodulación u otros agentes anti-inflamatorios, por ejemplo para el tratamiento o prevención de rechazo agudo o crónico de alo- o xenoinjerto o desórdenes inflamatorios o autoinmunes. Por ejemplo, pueden ser usados en combinación con ciclospo nas, o ascomicinas o sus análogos o derivados inmunosupresores, por ejemplo , ciclosporina A, ISA Tx247 , FK-506 , ASM 981 ; un inhibidor mTOR, por ejemplo, rapamicin, 40-O-(2-hidroxi) etil-rapamicina, CC1779, ABT578 o un rapalog , por ejemplo AP23573, etc.; corticosteroides; cicJofosfamida; azatiopreno; metotrexato; un agonista de receptor S 1 P por ejemplo FTY720 o un análogo de los mismos; leflunomida o análogos de la misma; mozoribina; ácido micofenólico o una sal del mismo, por ejemplo sal de sodio; micofenolato de mofetilo; 1 5-deoxispergualina o análogos de la misma; anticuerpos monoclonales inmunosupresores, por ejemplo, anticuerpos monoclonales para receptores de leucocitos, por ejemplo, MHC, CD2, CD4, CD 1 1 a/CD1 8, CD7, CD25, CD27, B7, CD40, CD45, CD58, CD137, ICOS, CD150 (SLAM), OX40, 4-1 BB o sus ligandos, por ejemplo CD154; u otros compuestos inmunomodulatorios, por ejemplo una molécula recombinante de aglutinación que tiene por lo menos una porción del dominio extracelular de CTLA4 o un mutante de la misma, por ejemplo una porción por lo menos extracelular de CTLA4 o un mutante de la misma unida a una secuencia de proteína no de CTLA4, por ejemplo CTLA4lg (por ejemplo, designada ATCC 68629) o un mutante de la misma, por ejemplo LEA29Y, u otros inhibidores de moléculas de adhesión, por ejemplo mAbs o inhibidores de bajo peso molecular que incluyen antagonistas LFA- 1 , antagonistas Selectin y antagonistas VLA-4. Los compuestos de la fórmula I pueden ser administrados también conjuntamente con un fármaco anti-proliferante, por ejemplo un fármaco quimioterapéutico, por ejemplo en el tratamiento contra el cáncer, o con un fármaco antidiabético, un secretagogue de insulina, un aumentador de secreción de insulina o un sensibilizador de insulina, en la terapia contra la diabetes. De acuerdo con lo anterior, la presente invención proporciona en todavía un aspecto más: 5. Un método como se define anteriormente que comprende la coadministración, por ejemplo de manera concomitante o en secuencia, de una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de activación y proliferación de GSK-3ß, PKC o de células T, por ejemplo un compuesto de la fórmula I en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable, y una segunda sustancia de fármaco, dicha segunda sustancia de fármaco que es un fármaco inmunosupresor, inmunomodulador, anti-inflamatorio, anti-proliferante o antidiabético, por ejemplo como se indica anteriormente.
6. Una combinación terapéutica, por ejemplo un paquete, que comprende a) un inhibidor de activación y proliferación de GSK- 3ß , PKC o de células T, por ejemplo un compuesto de la fórmula 1 en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable, y b) por lo menos un segundo agente seleccionado de un fármaco inmunosupresor, inmunomodulador, anti-inflamatorio, anti-proliferante o antidiabético. El componente a) y el componente b) puede ser usado de manera concomitante o en secuencia. El paquete puede comprender instrucciones para su administración. Cuando un inhibidor de activación y proliferación de GSK-3ß, PKC o de células T, por ejemplo un compuesto de la fórmula I, se administra en conjunto con otra terapia ¡nmunosupresora/ inmunomodulatoria, anti-inflamatoria, anti-proliferante o antidiabética, por ejemplo para prevenir o tratar el rechazo agudo o crónico de injerto o desórdenes inflamatorios o a?toinm?nes como se especifica antes en la presente, las dosificaciones del compuesto inmunosupresor, inmunomodulatorio, anti-inflamatorio, antiproliferante o antidiabético co-administrado variarán, por supuesto, dependiendo del tipo de co-fármaco empleado, por ejemplo si es un esferoide o una ciclosporina, o del fármaco específico empleado, de la condición a ser tratada y así sucesivamente.