MXPA06006185A - Inmunogeno de influenza y vacuna. - Google Patents

Abstract

Se describe una proteina de la nucleocapside del virus de hepatitis B (HBc) truncada, carboxi terminal, quimerica que contiene un inmunogeno para inducir la produccion de anticuerpos para la proteina de influenza M2. Una secuencia inmunogena de influenza en dos a cuatro copias preferentemente se expresa en o cerca del N terminal o en la secuencia asa inmunogena del HBc. La quimera HBc preferentemente contiene un epitope de celulas T espedifico de influenza y preferentemente se manipula para que tengan mejor estabilidad las particulas autoensambladas y mejor rendimiento las particulas quimericas. Tambien se describen los metodos para preparar y utilizar las moleculas quimericas.

Description

INMUNOGENO DE INFLUENZA Y VACUNA REFERENCIA A LA SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud es una continuación en parte de la solicitud serie No. 10/732,862, presentada el 10 de diciembre de 2003, la cual reclama prioridad ante la PCT/US 03/05196, presentada el 21 de febrero de 2003, que reclama prioridad ante la solicitud serie No. 10/274, 616 presentada el 21 de octubre de 2002, como una continuación en parte de la solicitud serie No. 10/082,014, presentada el 21 de febrero de 2002, y como una continuación en parte de la solicitud serie No. 10/080,299, presentada el 21 de febrero de 2002, cada una de las cuales fueron una continuación en parte de la solicitud serie No. 09/930,915, presentada el 15 de agosto de 2001.

CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere a la intersección de los campos de la inmunología y la manipulación de las proteínas, y particularmente a un inmunógeno y vacuna útiles para la prevención de la infección de influenza por el virus de influenza A.

ANTECEDENTE DE LA INVENCIÓN La familia de los hepadnavirus son virus animales que contienen DNA, que pueden causar hepatitis B en humanos (HBV) . La familia de los hepadnavirus incluye los virus de hepatitis B de otros mamíferos, como el virus de la marmota (WHV) y de la ardilla. (GSHV) , y los virus aviares encontrados en patos (DHV) y hurones (HeHV) . El virus de hepatitis B (HBV) que se utiliza en la presente se refiere a un miembro de la familia de los hepadnavirus que infecta a los mamíferos, si - se compara con un virus que infecte un hospedero aviar, ' "a" menos que la discusión se refiera a un ejemplo especifico de un virus no mamífero.

La nucleocápside o núcleo del virus de hepatitis B de mamífero (VHB o hepadnavirus) contiene una secuencia de 183 o 185 residuos de aminoácidos, dependiendo del subtipo viral, mientras que la cápside del virus de pato contiene 262 residuos de aminoácidos. Los monómeros de la proteina del núcleo del virus ' de hepatitis B de los diversos hepadnavirus se autoensamblan en células infectadas para formar agregados estables conocidos como partículas proteinicas del núcleo de hepatitis B (partículas HBc) . Están documentadas dos estructuras tridimensionales para las partículas HBc que tienen el C-terminal truncado. Una primera estructura que comprende una población menor contiene 90 copias de la proteina subunitaria HBc como dimeros o 180 proteínas monoméricas individuales, y una segunda población mayor que contiene 120 copias de la proteina subunitaria de HBc como dimeros o 240 proteínas monoméricas individuales. Estas partículas se conocen como partículas T = 4 ó T = 3, respectivamente, en donde ?NT" es el numero -de la triangulación. Estas partículas HBc del virus que infecta a humanos (virus humano) tienen aproximadamente 30 ó 34 nm de diámetro, respectivamente.' Fumpens y col.,' (1995) Intervirology, 38: 63-74; y Metzger y col. ,~ ' (1998) J. Gen . Viol . r 79: 587-590. ' ' ' -. : .- .

Conway y col., (1997) Nature, 386: 91-94, describen la estructura de las partículas HBc humanas en resolución de ángstrom, según se determinó a "partir de micrografias crioelectrónicas . Bottcher y col., (1997), Nature, 386: 88-91, describen el pliegue de los polipéptidos para los monómeros de las HBc humanas y proporcionan un esquema de numeración aproximado para los residuos de aminoácidos en los que se forman regiones ' alfa helicoidales "y sus regiones asa de unión. Zheng y col., (1992) J. Biol . Chem . , 267: 9422-9429 informan que la formación de las partículas núcleo no depende del dominio C-terminal, rico en arginina, la unión de los ácidos nucleicos o la formación de enlaces disulfuro con base en su estudio de las proteínas mutantes que carecen de una o más cisteinas y el trabajo de otros con proteínas que tienen el C-terminal truncad (Birnbaum y col., (1990), J. Virol . 64, 3319-3330) . La estructura de baja resolución de las partículas HBc reportadas con Conway y col., (1997) y Bottcher y col., (1997) ha sido confirmada por una estructura cristalina de resolución de 3.3 Á de las partículas T = 4 documentadas por Wynne y col., (1999) Mol . Cell . 3 (6) : 70-80.

La nucleocápside del virus dé hepatitis B o proteína del núcleo viral (HBc) ha sido descrita como una porción portadora inmunógena que estimula la respuesta ' de las células T de un animal hospedero inmunizado. Ver, por ejemplo, las Patentes US Nos. 4,818,527, la no'. 4/882,145 y 5,143,726. Una aplicación particularmente útil de este portador es su capacidad para presentar epítopes de células B extraños o heterólogos en el lugar de la asa inmunodominante que esté presente en aproximadamente las posiciones de los residuos 70-90, y más comúnmente mencionado como las posiciones aproximadas de 75 a 85 del amino terminal (N-terminal) de la proteína. Clarke y col., (1991) F. Brown y col., eds., Vaccines 91 Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New Cork, pp. 313-318.

Durante la reproducción viral, las nucleocápsides del HBV se asocian con el pregenoma del RNA viral, la transcriptasa inversa viral (Pol) , y la proteina terminal (derivada de Pol) para formar núcleos competentes para la reproducción. La asociación entre la nucleocápside y el pregenoma del RNA viral tiene como mediador un dominio rico en arginina en el carboxilo terminal (C-terminal) . Cuando se expresa en sistemas de expresión heterólogos, como puede ser E. coli donde no existe el pre-genoma del RNA viral, el C-terminal tipo protamina, es decir, los residuos de las posiciones 150 a la 183, se pueden unir al RNA de E. coli . Zhang y col., (1992) JBC, 267 (13) 9422-29.

HBcAg es una proteína particulada obtenida del virus de hepatitis B que ha sido propuesta como portador para epítopes heterólogos. La inmunogenicidad relativa de la HBsAg (HBs) ha sido comparada con HBcAg (HBc), y la posibilidad de que cada una desencadena respuestas inmunitarias en diferentes fondos genéticos [Milich y col., Science, (1986) 234 (4782): p. 1398-1402]. Estos datos destacan la mayor inmunogenicidad de HBc en relación con HBs, y la sensibilidad universal para HBc, independientemente del fondo genético.

Por ejemplo, HBc es más de 300 veces más inmunógena que HBs en ratones BALB/c; y, aunque ninguno de estos ratones G10.S y B10.M es sensible a HBs, ambas cepas son sensibles a HBc. Estos resultados vuelven a destacar la conveniencia de HBc como un portador de vacuna y específicamente, su superioridad sobre HBs, de ahi la selección de HBc en lugar de HBs para llevar epítopes heterólogos. Se piensa que estos aspectos de HBc son importantes en el desarrollo de la vacuna de influenza porque estos solucionan aspectos de restricción genética y títulos inadecuados de anticuerpos.

Otra ventaja del portador HBc es que no necesita adyuvantes complejos para su eficacia. Esto se debe a la elevada inmunogenicidad inherente de la partícula. Una comparación de la inmunogenicidad de las partículas HBc-P. berghei demostró que alum, que se ha aprobado para uso humano, fue más eficaz que IFA ó CFA [Schodel y col., J. Exp . Med. , (1994) 180 (3): p. 1037-46]. La importancia de esta observación es destacada por los problemas de toxicidad asociados con los adyuvantes más complejos, novedosos como se informó recientemente en estudios clínicos de la vacuna contra malaria de SKB [Stoute y col., N. Engl . J. Med. ,

[1997] 336 (2): p. 86-91].

En una aplicación como porción portadora de vacuna, puede ser preferible que las nucleocápsides de HBV no se unan al ácido nucleico obtenido del hospedero. Birbaum y col., (1990) J. Virol . , 64: 3319-3330 demostraron que el dominio C-terminal tipo protamina de las nuclecápsides de HBV pueden ser delecionadas sin interferir con la propiedad de la proteína para ensamblarse en partículas tipo virus. De este modo, se documenta que las proteínas truncadas cerca de la posición 144; es decir, que contienen la secuencias HBc desde la posición 1 hasta aproximadamente 144, pueden autoensamblarse, mientras que las deleciones más allá del residuo 139 anulan el ensamble de la cápside [Birnbaum y col., (1990) J. Virol . , 64: 3319-30] .

Zlotnick y col., (1997) Proc . Nati . Acad. Sci . , EUA 94: 9556-9561 estudiaron el ensamble de la longitud completa y las proteínas HBc truncadas en partículas. Además de discutir las moléculas de longitud completa, estos autores documentaron la preparación de una proteina truncada que contenia la secuencia de HBc desde la posición 1 hasta la 149 en la que las cisteinas en las posiciones 48, 61 y 107 cada una fue sustituida por alaninas y en la cual se adicionó un residuo de cisteína en el C-terminal (posición 150) . Se utilizó mercaptano C-terminal para enlazar un cúmulo de átomos de oro para etiquetar en microscopía electrónica.

En fechas recientes, Metzger y col., (1998) J. Gen . Viol . r 79: 587-590 documentaron que la prolina en la posición 138 (Pro-138 o P138) de la secuencia viral humana es necesaria para la formación de las partículas. Estos autores también documentaron que la capacidad de ensamble de las partículas truncadas en el carboxiterminal hasta longitudes de 142 y 140 residuos se vio afectada, perdiéndose por completo la capacidad de ensamble con las truncaciones resultantes en las longitudes de 139 y 137 residuos.

Algunos grupos han demostrado que las partículas truncadas presentan estabilidad reducida en relación con las partículas normales del núcleo de hepatitis B [Gallina y col., (1989) J. Virol . , 63: 4645-4652; Inada, y col., (1989) Virus Res . , 14: 27-48], lo que es evidente por la variación en los tamaños de partícula y la presencia de fragmentos de partículas en las preparaciones purificadas [Maassen y col., (1994) Arch .

Virol . , 135: 131-142]. Así pues, antes del informe de Metzger y col., anterior, Pumpens y col., (1995) Intervirology, 38: 63-71 resumieron los informes de la literatura estableciendo que el límite carboxi terminal para las secuencias de HBc necesario para el autoensamble fue ubicado entre los residuos de aminoácidos 139 y 144, y que los primeros dos o tres residuos amino terminales podían ser sustituidos por otras secuencias, para la eliminación de 4 u 11 residuos amino terminales dio como resultado la desaparición completa de la proteína quimérica o híbrida en las células de E. coli transformadas .

Las partículas HBc híbridas', producidas ' en forma recombinante que llevan inserciones internas (conocidas en la técnica como partículas HBc quiméricas o quimeras de HBc) que contienen diferentes secuencias de polipéptidas insertadas han sido preparadas por expresión heteróloga en una amplia variedad de organismos, en los que se incluye E. coli . B . subtilis , Vaccinia , Salmonella typhimurium , Saccharomyces cerevisiae . Ver , por ejemplo, Pumpens y col., (1995) Intervilogy, 38; 63- 71 , y las citas que se encuentran en ésta y que documentan el trabajo de algunos grupos de investigación. Las partículas HBc naturales también han sido producidas en plantas (Tsuda y col., 1998), Vox Sang, 74 (3): 148-155.

Estas quimeras de HBc muchas veces parecen tener una estructura menos ordenada, si se analizan por microscopía electrónica, en comparación con las partículas que carecen de epítopes heterólogos [Schodel y col, (1994) J. Exp. Med. , 180: 1037-1046]. En algunos casos, la inserción de epitopes heterólogos en las partículas HBc con el C-terminal truncado tienen un efecto desestabilizante drástico que las partículas híbridas no pueden ser recuperadas luego de la expresión heteróloga [Schodel y col, (1994) Infect . In munol . , 62: 1669-1676].

Asi pues, muchas partículas HBC quiméricas " son inestables que se deshacen durante la purificación a tal 'grado que no pueden ser recuperadas o muestran características de estabilidad muy deficientes, haciéndolas un problema para el desarrollo de una vacuna.

El articulo anterior de Pumpens y col., (1995) Intervirology, 38: 63-74 enlista quimeras formadoras de partículas en las cuales la secuencia polipeptídica insertada esté en el N-terminal, el C-terminal y entre los átomos terminales. Las longitudes de las inserciones documentadas en este articulo son de 24 a 50 residuos en el N-terminal, de 7 a 43 residuos en posiciones internas y de 11 a 741 residuos en el C-terminal.

Kratz y col., (1999) Proc. Na ti . Acad. Sci . , EUA 96: 1915-1920 describieron en fechas recientes la expresión de E. coli de partículas HBc quiméricas compuestas de una secuencia HBc truncada fusionada en posiciones internas a la proteína fluorescente verde (GFP) de 238 residuos. Esta quimera o híbrido contenía la secuencia GFP insertada flanqueada por un par de brazos ligadores flexibles, ricos en glicina, sustituyendo a 79 y 80 residuos de aminoácidos de HBc. Estas partículas, según se dijo, desencadenan efectivamente anticuerpos contra GFP natural en conejos como animales hospederos.' La Patente US No. 5,990,085 describe dos proteínas de fusión formadas a partir de un péptido antigénico de inhibina bovina fusionado en (i) el asa inmunógena entre los residuos 78 y 79, y (ii) después del residuo 144 de la HBc truncada en el carboxi terminal. Se dijo que las proteínas de fusión expresadas inducen la producción de anticuerpos contra inhibina cuando se administran a un animal hospedero. Los títulos 30 días después de la inmunización reportados en esa patente son relativamente bajos, siendo 1:3000-15,000 para la proteína de fusión con la inserción del asa y 1:100-125 para la inserción después del residuo 144.

La Patente US No. 6,231,864 enseña la preparación y uso de la proteina del núcleo de hepatitis B modificada de manera estratégica, que se enlaza a un hapteno. La proteína modificada del núcleo contiene una inserción de 1 a aproximadamente 40 residuos de longitud que contiene un residuo de aminoácido que muestra reacción química, al cual el hapteno está unido en forma pendiente .

La patente recién publicada WO 01/27281 enseña que la respuesta inmunitaria ha HBc se puede cambiar de una respuesta Thl a una respuesta Th2 por la presencia o ausencia, respectivamente, de la secuencia que contiene citeína, C-terminal de la molécula natural. Esta descripción también menciona que la formación de disulfuro a través de las cisteinas C-terminales podria ayudar a estabilizar las partículas. La presencia de algunos residuos de la secuencia HBc natural inmediatamente de la cisteina C-terminal, según se dijo, era preferida, pero no necesaria. Se dice que una alternativa que puede utilizarse para sustituir una secuencia HBc C-terminal, truncada consiste ' en una cisteína C-terminal y una secuencia optativa que defina un epítope procedente de otra molécula que no sea HBc.

La solicitud publicada de PCT WO 01/98333 enseña la deleción de una o más de las cuatro repeticiones de arginina presentes en el C-terminal de la HBc natural, manteniendo al mismo tiempo el residuo de cisteina C-terminal. Esta solicitud también enseña que la región delecionada puede ser sustituida por un epitope de una proteína que no sea HBc para que la porción de la HBc de la molécula así formada actúe como un portador para el epítope adicionado.

Las solicitudes publicadas del PCT que corresponden a WO 02/13765 A2 y WO 02/14478 A2 enseñan que la estabilización de las partículas de HBc con el C-terminal truncado se pueden obtener mediante el uso de ' uno o más residuos de cisteína adicionados en las proteínas quiméricas de las cuales se ensamblan las partículas. Estos residuos de cisteína adicionados, según se piensa, estarían en o cerca del C-terminal de la proteina quimérica.

Una particularidad estructural mediante la cual se conservaría la estabilidad de las partículas HBc de longitud completa, anulando al mismo tiempo la posibilidad de unión del ácido nucleico de las partículas HBc de longitud completa, sería muy benéfico en el desarrollo de vacunas utilizando el sistema de suministro de la nucleocápside hepadnaviral. En realidad, Ulrich y col., en su reciente revisión del uso de las quimeras de HBc como portadoras para epítopes heterólogos [Adv. Virus Res., 50: 141-182 (1998) Academia Press] mencionan tres problemas potenciales que deben solucionarse para utilizar estas quimeras en vacunas humanas. Un primer problema potencial es la transferencia inadvertida de los ácidos nucleicos en una vacuna de 'quimera a un hospedero inmunizado. Un segundo problema potencial es la interferencia de la inmunidad ya existente -ante la HBc. Un tercer problema posible se refiere al requisito de preparaciones que puedan ser reproducidas de partículas quimeras intactas que también puedan soportar el almacenamiento durante largo tiempo.

Al parecer, las cuatro solicitudes publicadas del PCT anteriores contienen las enseñanzas que pueden utilizarse para solucionar los problemas potenciales descritos por Ulrich y col., como se describe más adelante, la presente invención propone otra quimera de HBc que proporciona inesperadamente elevados títulos de anticuerpos contra influenza, y en un aspecto también proporciona una solución a los problemas de la estabilidad de la quimera de HBc así como la ausencia considerable de posibilidad de unión al ácido nucleico de la construcción. Además, una quimera recombinante considerada muestra reducida antigenicidad hacia anticuerpos contra HBc ya existentes.

Los hallazgos anteriores de la inestabilidad de las partículas relacionadas con las moléculas quiméricas de HBc truncadas en el N-terminal, no obstante, Neirynck y col., (octubre de 1999) Nature Med. , 5 (10): 1157-2263 documentaron que la formación de las partículas ocurrió en la expresión de E. coli de una quimera de HBc que contenía la porción de 24 residuos N-terminal de la proteína M2 de influenza (M2e) , incluida la metionina de iniciación, fusionada en el residuo 5 a la longitud completa de HBc.

Bachmann y col., [Jergerlehner y col., (2002) Vaccine N20N: 3104-3112] compararon una construcción de fusión prácticamente idéntica a la de Neirynck y col., anterior, con una construcción acoplada semejante a la descrita en US No. 6,231,864 en la que 26 residuos externos (después de una separación in vivo del residuo metionina) de la proteina M2 de influenza A se acople mediante un ligador a un residuo de lisina manipulado en el asa en una HBc con C-terminal truncado (1-149) que también tenia los residuos de cisteína en las posiciones 48 y 107 sustituidos por residuos de serina. Sus resultados indicaron un aumento en los títulos contra M2 y mejor supervivencia (6/6 contra 0/3) de la construcción acoplada respecto a la proteina de fusión N-terminal.

El uso ya descrito de las proteínas HBc híbridas con C-terminales truncados para aplicaciones de vacuna ofrece algunas ventajas sobre sus contrapartes de"' longitud completa, incluidos los niveles mejorados en la expresión y la ausencia de RNA de E. coli unido. No obstante, las partículas con C-terminal truncado manipuladas para mostrar epítopes heterólógos muchas veces son inestables, dando como resultado partículas que no se asocian en estructuras particuladas estables luego de la expresión, o que se disocian fácilmente en estructuras no particuladas durante y/o luego de la purificación. Una ausencia como esta de estabilidad se mostró en las partículas compuestas de moléculas HBc quiméricas que tienen C-terminales truncados respecto a la posición 149 de la HBc y también contienen los residuos anteriores 2-24 de la proteina M2 de influenza A.

Otros han documentado que en antígenos de núcleo hepadnavirales de tipo nativo un residuo de cisteína corriente arriba del codón de inicio HBcAg está directamente involucrado en la prevención de la formación de las partículas [Schodel y col., (15 de enero de 1993) J. Biol . Chem . , 268 (2): 1332-1337; Wasenauer y col., (Mar. 1993) J. Virol . , 67(3): 1315-1322; y Nassal y col., (Jul. 1993) J. Virol . , 67(7): 4307-4315;]. Los tres grupos documentaron que en HBeAg [sic] de tipo nativo, el residuo de cisteína en la posición -7 de la secuencia pre-núcleo, que esta presente cuando el gen del núcleo se traduce desde una metionina iniciadora corriente arriba en la posición -30, es responsable de prevenir la formación de las partículas, y por tanto de facilitar la transición del HBcAg particulado hasta el HBeAg no particulado, secretado. Con base en las tres publicaciones anteriores se esperarla la inclusión de uno o más residuos de cisteína en una posición anterior a la metionina iniciadora de HBc, es decir, en una posición de residuo de menos que 1 en relación con el N-terminal de la secuencia de SEQ ID NO: 1, para realmente desestabilizar las partículas híbridas truncadas en el C-terminal en lugar de estabilizarlas. Como se observará de la discusión siguiente, la presente invención proporciona resultados contrarios a las expectativas.

BREVE COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención toma en cuenta un inmunógeno a base de hepadnavirus para inducir anticuerpos hacia el dominio extracelular de la prótéína M2 de influenza A (M2e) , y un inoculo y una vacuna que contiene ese inmunógeno dispersado en un diluyente tolerado en el medio fisiológico. En adelante, las denominaciones "M2" y "M2e" se utilizan de manera indistinta. El inmunógeno considerado es una partícula autoensamblada compuesta de moléculas de proteina quiméricas del núcleo del virus de hepatitis B (HBc) recombinantes. Cada una de estas moléculas tiene una longitud de'" aproximadamente 150 a aproximadamente 375 residuos de aminoácidos, incluida una secuencia de 6 hasta aproximadamente 24 residuos de la SEQ ID NO: 9 y contiene cuatro dominios de secuencia de residuos de aminoácidos con enlaces peptídicos desde el N-terminal que se denominan dominios I, II," III y "IV.

El primer dominio, el dominio I, consiste en aproximadamente 75 a aproximadamente 160 residuos de aminoácidos. La secuencia de este dominio incluye por lo menos la secuencia de los residuos de la posición 4 hasta aproximadamente la posición 75 de la HBc. Uno a tres residuos de cisteina también ' están presentes en una posición en la molécula quimérica de aproximadamente 1 a -55, preferentemente hasta aproximadamente -30 y más preferentemente hasta aproximadamente -20, en relación con el N-terminal de HBc de la SEQ ID NO:l [el residuo o los residuos de cisteína N-terminales] . Los residuos de cisteína N-terminales están presentes dentro de una secuencia que no sea la secuencia previa al núcleo de HBc. También puede estar presente un residuo de cisteina del dominio I en dos a cuatro secuencias de aproximadamente 6 a aproximadamente 24 residuos de un polipéptido M2 de influenza A X2x3x4X5X6X7x8'rX10XllX12X13X14X15XldX17x18x19x20x2l ~ ^22 23 24 de SEQ ID N0. 9 f como puede ser un polipeptido preferido ? ~ => b ' e 15 16 17 18 19 20x21 22 23x24 de SEQ ID N0: ?0 que tienen uniones peptidicas a o dentro de aproximadamente 15 residuos de N-terminal de la secuencia de HBc, y cuyos residuos X con su subíndice se definen más adelante, asi como uno o más residuos 1-4 de HBc.

El segundo dominio, el dominio II, contiene aproximadamente 0 a aproximadamente 60 residuos de aminoácidos con enlaces peptidicos a aproximadamente 75 residuos del dominio I de los cuales (i) cero a todos los diez residuos de la secuencia de las posiciones 76 a la 85 de la HBc están presentes unidos mediante péptidos a (ii) una secuencia optativa de aproximadamente 6 a aproximadamente 48 residuos que constituyen una o más repeticiones del polipéptido M2 de influenza A anterior de SEQ ID NO: 9.

El tercer dominio, el dominio III, es una secuencia de HBc desde aproximadamente la posición 86 hasta el cuarto dominio, dominio IV consiste en (i) los residuos de las posiciones 136 a la 140 más hasta 9 residuos de una secuencia de residuos de aminoácidos de HBc desde la posición 141 hasta la 149 unidos mediante péptidos al residuo de la posición aproximadamente 135 del dominio III, (ii) de 0 a 3 residuos de cisteína, (iii) menos de 4 residuos de arginina o lisina, o mezclas de éstos, juntos entre si, y (iv) hasta aproximadamente 100 residuos de aminoácidos en una secuencia heteróloga para HBc desde la posición 144 hasta el C-terminal, y de preferencia una secuencia heteróloga para HBc desde la posición 156 al C-terminal .

Una molécula quimérica posible (i) contienen no más de 10% de residuos de aminoácidos sustituidos en forma conservativa en la secuencia de HBc, (ii) 'aut'oensambles en partículas que estén prácticamente libres de unión a ácidos nucleicos sobre la expresión en una célula hospedera, y aquellas partículas son más estables en la formación que las partículas formadas de una quimérica de HBc de otro modo idéntica que carezca de residuo o residuos de cisteína N-terminales o en las que un residuo de cisteina N-terminal presente en la molécula quimérica es sustituido por otro residuo.

Se prefiere que la secuencia de HBc del dominio I incluya los residuos de la posición 4 a la posición 75 sola más por lo menos un residuo de cisteina N-terminal. Además se prefiere que un inmunógéno posible contenga un residuo de cisteina dentro del dominio IV solo o en una secuencia de residuos de aminoácidos heteróloga a la de HBc desde la posición 164 hasta el C-términal. Se prefiere particularmente que esta secuencia heteróloga contenga un epítope de células T de influenza A.

Otra modalidad consiste en un inoculo o vacuna que contiene una partícula quimera de HBc anterior que se disuelve o dispersa en una composición diluyente aceptada para uso farmacéutico que normalmente también contiene agua. Si se administra en una cantidad eficaz como inmunógeno como un animal como un mamífero o ave, un inoculo induce anticuerpos que inmunorreaccionan específicamente con la partícula quimérica. Los anticuerpos asi inducidos también inmunorreaccionan específicamente con (se unen a) la porción N-terminal de la proteina M2.

La presente invención tiene algunos beneficios y ventajas .

Un beneficio especifico de la invención es que su uso como vacuna proporciona títulos de anticuerpos extraordinarios contra influenza A.

Una ventaja de la invención es que estos títulos de anticuerpos muy elevados han sido producidos con la ayuda de un adyuvante aprobado para uso en humanos.

Otro beneficio de la invención es que el inmunógeno recombinante puede ser preparado fácilmente y en grandes cantidades utilizando técnicas de cultivo celular bien conocidas para crecer células hospederas transformadas.

Otra ventaja de la invención es que el inmunógeno se prepara fácilmente utilizando las técnicas recombinantes bien conocidas.

Todavía otro beneficio de la invención es que un inmunógeno preferido exhibe mayor estabilidad a temperaturas elevadas en comparación con otras quimeras de HBc.

Todavía otra ventaja de la invención es que un posible inmunógeno este prácticamente libre de inmunógenos nucleicos.

Todavía otros beneficios y ventajas serán evidentes para los trabajadores que tengan las habilidades ordinarias a partir de la descripción siguiente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS En los dibujos que forman una parte de esta descripción: La Figura 1 muestra en dos secciones como Figura ÍA y Figura IB, un alineamiento de 6 secuencias publicadas para proteínas HBc de mamífero de 6 virus. La primera (SEQ ID NO: 1) , la secuencia viral humana es del subtipo ayw y fue publicada en Galibert y col., (1983) Nature, 281: 646-650; la segunda secuencia viral humana (SEQ ID NO: 2), del subtipo adw publicada por Ono y col., (1983) Nucleic Acids Res . , 11 (6): 1747-1757; la tercera secuencia viral humana (SEQ ID NO: 3), del subtipo adw2 y fue publicada por Valenzuela y col., Animal Virus Genetics, Field y col., eds., Academia Press, New Cork (1980) páginas 57-70; la cuarta secuencia viral humana (SEQ ID NO: 4), es del subtipo adyw que fue publicada por Pasek y col., (1979) Nature, 282: 575-579; la quinta secuencia (SEQ ID NO: 5), es la del virus de marmota fue publicado por Galibert y col., (1982) J. Virol . , 41: 51- 65; y la sexta secuencia de mamífero (SEQ ID NO: 6) , es la de la ardilla terrestre que fue publicada por Seeger y col., (1984) J. Virol . , 51 : 367-375.

La Figura 2 muestras las modificaciones hechas al vector plásmido comercial pKK223-3 en la preparación del vector plásmido pKKK223-3N utilizado en la presente para la preparación de las quimeras de HBc recombinantes. La secuencia modificada (SEQ ID NO: 7) se muestra por debajo de la secuencia del vector disponible en el comercio (SEQ ID NO: 8) . Las bases del sitio Ncol adicionado se muestran en letras minúsculas y las bases adicionadas se muestran con doble subrayado, mientras que las bases delecionadas se muestran como líneas discontinuas. Los dos sitios de restricción presentes en este segmento de la secuencia (Ncol y HindIII) están indicados.

La Figura 3 es un perfil de elusión analítica por cromatografía de exclusión de tamaño para las partículas ICC-1603 en la cual se muestra absorbancia a 280 nm en las ordenadas y el tiempo en segundos se muestra en las abscisas.

La Figura 4 es un perfil de elusión analítico por cromatografía de exclusión de tamaño para las partículas ICC-1590 como se describe en la Figura 3.

La Figura 5 es un perfil de elución analítico por cromatografía de exclusión de tamaño para las partículas ICC-1560 como se describe en la Figura 3.

La Figura 6 es un perfil de elución analítico por cromatografía de exclusión de tamaño para las partículas ICC-1605 como se describe en la Figura 3.

La Figura 7 es un perfil de elución analítico por cromatografía de exclusión de tamaño para las partículas ICC-1604 como se describe en la Figura 3.

La Figura 8 es un perfil de elución analítico por cromatografía de exclusión de tamaño para las partículas ICC-1438 como se describe en la Figura 3.

La Figura 9 es un perfil de elución analítico por cromatografía de exclusión de tamaño para las partículas ICC-1492 como se describe en la Figura 3.

La Figura 10 Es una fotografía de un análisis SDS-PAGE en condiciones reductoras luego de la preparación de las partículas que muestra la construcción del monómero ICC-1438 que fue inestable después de envejecimiento (banda 2) en comparación con la construcción ICC-1492 (banda 3), con HBc-149 (banda 1), ICC-1475 (banda 4) e ICC-1473 (banda 5) sirviendo como controles de peso molecular adicionales.

La Figura 11 en dos secciones muestra fotografías del análisis SDS-PAGE de las partículas CV-1818 que contienen tres copias ligadas en serie del polipéptido M2e después del estudio de estabilidad utilizando EDTA 0, 1, 2, 5 y 10 mM en buffer de fosfato de sodio 20 mM, pH 7.2, para el almacenamiento de las partículas, como se muestra en cada columna a temperatura ambiente (RT; Figura HA) y a 37°C (Figura 11B) , y muestra la ausencia de clivaje o disociación con la adición de EDTA (1-10 mM) . El control (c) fue una muestra de las mismas partículas recuperadas del almacenamiento en congelación justo antes del uso.

La Figura 12 en dos secciones muestra fotografías del análisis SDS-PAGE demostrando proteólisis reducida de monómeros de las partículas CV-1818 luego del almacenamiento a temperatura ambiente (RT) , el tratamiento térmico a la temperatura que se muestra durante 1.5 o 3 horas, como se muestra, del control como en la Figura 11 (12A) o después de una semana de almacenamiento (Figura 12B) .

La Figura 13 en dos secciones muestra una serie de gráficas SEC superpuestas mostrando el análisis de las partículas termotratadas (3 horas) poco tiempo después del tratamiento (Figura 13A) y después del mantenimiento durante una semana a temperatura ambiente (Figura 13B) .

La Figura 14 es una fotografía de un gel SDS-PAGE reductor que muestra monómeros de partículas CV-1906 luego de la purificación utilizando el proceso descrito, incluido el paso térmico (banda 1) y la ausencia del paso térmico (banda 2) .

La Figura 15 es una fotografía de un análisis en gel SDS-PAGE reductor de partículas que contienen cero (1123, banda 1), 1 (1604, banda 2), dos (1817, bandas 3 y 4), y tres (1818, bandas 5 y 6) copias de M2e expresada, fusionada en cascada al N-terminal de las partículas HBc truncadas después de la posición 149 e incluido un residuo de cisteina adicionado en la posición 150.

La Figura 16 es una gráfica que muestra la supervivencia de ratones inmunizados con una u otras de las quimeras de HBc que contienen M2e de la Figura 15 o un control como se indica en la figura luego de desafio letal con virus de influenza A.

La Figura 17 es una gráfica que muestra la temperatura corporal de los ratones de la Figura 16 y como se indica en la Figura, desafiados con el virus de influenza A.

La Figura 18 es una gráfica que muestra el peso de los ratones anteriores desafiados con él * virus de influenza A.

Definiciones Los números utilizados juntos con las quimeras de HBc indican la posición de la secuencia de residuos de aminoácidos ayw de HBc de la SEQ ID NO: 1 en la que uno o más residuos ha sido adicionado a o delecionado de la secuencia, independientemente si las adiciones o deleciones a la secuencia de residuos de aminoácidos están presentes. Asi pues, HBc 149 indica que la quimera termina en el residuo 149, mientras que HBc 149 +C 150 indica que esa misma quimera contiene un residuo de cisteína en la posición 150 de HBc en relación con los números de secuencia de la SEQ ID NO: 1.

El término "anticuerpo" se refiere a una molécula que es un miembro de una familia de proteínas glucosiladas denominadas inmunoglobulinas, que puede unirse específicamente a un antígeno.

La palabra "antígeno" se ha utilizado normalmente para designar una entidad que es unida por un anticuerpo o receptor, y también designar la entidad que' induce la producción del anticuerpo. El uso más actual limita el significado del antígeno a aquella entidad unida por un anticuerpo o receptor, mientras que la palabra "inmunógeno" se utiliza para la entidad que induce la producción de anticuerpos o se une al receptor. Cuando una entidad descrita en la presente es inmunógena y antigena, la referencia a ésta como un inmunógeno o antígeno normalmente se hace de acuerdo con su utilidad propuesta.

"Determinante antígeno" se refiere a la parte estructural real del antígeno que se une inmunológicamente por un sitio de combinación del anticuerpo o receptor de células T. El término también se utiliza de manera indistinta con "epitope".

La palabra "conjugado" cuando se utiliza en la presente se refiere a un hapteno ligado de manera operativa a una proteína portadora, como a través de una cadena lateral de residuos de aminoácidos.

El término "sustitución conservativa" cuando se utiliza en la presente indica que un residuo de aminoácido ha sido sustituido por otro residuo biológicamente semejante. Los ejemplos de las sustituciones conservativas pueden ser la sustitución de un residuo hidrofóbico como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro, o la sustitución de un residuo polar por otro como entre arginina y lisina, entre los ácidos glutámico y aspártico o entre glutamina y arginina y similares .

El término "corresponde" en sus diversas formas gramaticales, cuando se utiliza en relación con las secuencias peptidicas significa la secuencia peptidica descrita más o menos hasta tres residuos de aminoácidos en el grupo amino o carboxi terminal, o ambos, y que contiene solo sustituciones conservativas en los residuos de aminoácidos particulares a lo largo de la secuencia del polipéptido.

El término "dominio" se utiliza en la presente para entender una parte de una molécula quimérica de HBc, recombinante, que se identifica por: (i) la numeración de la posición de los residuos en relación con los números de las posiciones del subtipo ayw de HBcAg como lo documenta Galibert y col., (1979) Nature, 281: 646-650 (SEQ ID NO: 1) . Las posiciones polipeptídicas de por lo menos las quimeras dominios I, II y III se "piensa que existen en forma terciaria semejante a las secuencias correspondientes del HBcAg natural.

Cuando se utiliza en la presente, el término "proteina de fusión" designa un polipéptido que contiene por lo menos dos secuencias de residuos de aminoácidos que normalmente no se encuentran ligadas entre sí en la naturaleza y que están ligadas de manera operativa juntas extremo a extremo (cabeza a cola) mediante un enlace peptídico entre sus residuos de aminoácidos carboxi y amino terminales, respectivos.

Las proteínas de fusión de la presente invención son moléculas quiméricas de HBc que inducen la producción de anticuerpos que inmuno-reaccionan con un polipéptido que corresponde en la secuencia de residuos de aminoácidos con la parte polipeptídica de la proteina de fusión.

La frase "hepatitis B" cuando se utiliza en la presente se refiere en su contexto más amplio a cualquier miembro de la familia de los hepadnaviridae de mamífero, como ya se mencionó.

Las palabras "polipéptido" y "péptido" se utilizan de manera indistinta a lo largo de la especificación y designa una serie lineal de residuos de aminoácidos conectados entre sí por enlaces peptídicos entre los grupos a alfa-amino y carboxi de aminoácidos contiguos. Los polipéptidos pueden ser de una variedad de longitudes, en sus formas . naturales (sin carga) o en forma de sus sales. Es bien sabido en la técnica que las secuencias de residuos de aminoácidos contienen grupos ácidos y básicos, y que el estado de ionización especifico mostrado por el péptido depende del valor de pH del medio que le rodea cuando el péptido esta en solución, o del medio del cual fue obtenido si el péptido esta en forma sólida. Así pues, "polipéptido" o su termino equivalente esta destinado a incluir la secuencia de residuos de aminoácidos apropiada, de referencia. Un péptido o polipéptido siempre se muestra en la presente de izquierda a derecha y en la dirección del amino terminal (N-terminal) a carboxi terminal (C-terminal) .

El termino "residuo" se utiliza de manera indistinta con la frase residuo de aminoácido. Todos los residuos de aminoácidos que se identifican en la presente están en configuración natural o L. De acuerdo con la nomenclatura de los polipéptidos normales, [ J. Biol . Chem . , 243, 3557-59 (1969)], las abreviaturas "para los residuos de aminoácidos se muestran en la siguiente tabla de correspondencia .

TABLA DE CORRESPONDENCIA letra .etras AMINOÁCIDO Y Tyr - i osina G Gly glísina F Phe L-fenilalanina M Met L-metíanina X Ala Is-alanína S Ser L-serina I lie L-isoleueina I* Leu L-leucina T Thr L-treonina V Val L-valina P Pro -L-prolina K Lys L-Iisina H - istidina Q Gl?l -glutamina s Glu l?- acido gl tamico Gl? L-acido glutamico ? - L-glutamina Trp L- riptofano Arg L-arginina Asp L-acido aspartico N Asn L- sparagi a B Asx L-aeido aspartico o - sparagina Cvs L-cisteína DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un inmünógeno y una vacuna o inoculo que contiene inmunógeno contra el virus de influeza A. Un inmunógeno considerado es una partícula que contenga molécula quiméricas de la proteina del núcleo del virus de hepatitis B (HBc) recombinantes con una longitud de aproximadamente 150 a aproximadamente 375, y preferentemente cerca de 150 a 235 residuos de aminoácido que contenga 4 dominios de secuencias de residuos de aminoácidos con enlaces peptídicos desde el N-terminal que se denominen dominios I, II, III y IV. Uno a tres residuos de cisteína están presentes en o cerca del N-terminal de la quimera y 2 a 4 polipéptidos que contienen 6 a aproximadamente 24 residuos del polipéptido del dominio extracelular M2 (o M2e) de influenza A de la SEQ ID NO: 9 como puede ser la de SEQ ID NO: 10, como se define más adelante, están presentes con enlaces peptídicos (fusionadas) a la molécula quimérica.

Cabe señalar que las secuencias M2e de los virus de influenza A humano, aviar y porcino son muy semejantes. Así pues, los residuos 1-9 de los virus humanos y aviar son idénticos, como también los residuos 1-7 y 9-10 de los virus humano y porcino. Los tres virus comparten las posiciones de las dos cisteínas (17 y 19) y tienen residuos idénticos en las posiciones 22-24. Aunque las demás posiciones pueden contener diferentes residuos en las demás posiciones de M2e, los residuos de la secuencia humana se han encontrado presentes en los diferentes aislados, de modo que la secuencia humana representa una secuencia consenso para los tres virus.

En una partícula quimérica inmunógena considerada, (a) el dominio I contiene aproximadamente 75 a cerca de 160 residuos de aminoácidos cuya secuencia incluye por lo menos la secuencia de los residuos de la posición 4 hasta aproximadamente la posición 75" de HBc. También están presentes de 1 a 3 residuos de cisteina en una 'posición de la molécula quimera dé ' aproximadamente' 1 a aproximadamente -55, de preferencia a aproximadamente -30 y más preferentemente a aproximadamente -20, respecto al N-terminal de la HBc de SEQ ID NO: 1 [residuo o residuos de cisteína N-terminales] . Los residuos de cisteína N-terminales están presentes dentro de una secuencia que no sea la de la secuencia prenúcleo .de ?Bc.

Un residuo de cisteína del dominio I también puede estar presente en, como una opción, pero preferentemente, (i) dos a cuatro secuencias de 6 a aproximadamente 24 residuos de un polipéptido M2 de influenza A antes mencionado, como puede ser : xlx2x3x4x5X6x7x8T?10xllx12x13x14xi5xiex17xld 19 20x21 -X22^23^?4 de SEQ ID NO: 9 o un polipéptido preferido como puede ser XlX2x3? ?5 x7x8TPIRN?X15X15X17?18 19?20_ 21 22 23 24 de la SEQ ID N0: 10 que están unidos por péptidos a o dentro de aproximadamente 15 residuos del N-terminal de la secuencia HBc (ver Tabla 4), así como (ii) uno o más de los residuos 1-4 de HBc. En una secuencia de polipéptidos M2 de influenza A como ésta, los residuos Xi a X8 están ausentes o presentes, y cuando están presentes son los residuos naturalmente presentes en la secuencia proteínica M2e que son metionina, serina, leucina, leucina [sic] , treonina o prolina, ácido glutámico, valina y ácido glutámico o ácido aspártico, respectivamente, con la condición de que cuando esté presente un residuo X con subíndice, también esté presente cualquier residuo X con subíndice, restante, con un número subíndice superior hasta 8, X?o esté presente y sea prolina, leucina o histidina, Xn esté presente y sea isoleucina o treonina, X?2 esté presente y sea arginina o licina, X?3 esté presente y sea arginina o serina, X14 esté presente y sea ácido glutámico o glicina, Los residuos X15 y X16 estén presentes o ausentes, y cuando estén presentes sea triptofano y glicina o ácido glutámico, respectivamente.

Los residuos X17 y X19 estén presentes o ausentes, y cuando estén presentes sean independientemente cisteína, serina o alanina, El residuo X?8 este presente o ausente, y cuando este presente sea arginina o lisina, y, Los residuos X2o a 2 estén presentes o ausentes, y cuando estén presentes sean los residuos naturalmente presentes en la secuencia proteínica M2 que son arginina, glicina o serina, ácido aspártico o glicina, serina, serina y ácido aspártico, respectivamente, con la condición que cuando esté presente un residuo X con subíndice, también esté presente cualquier residuo X con subíndice, restante, con un número subíndice menor a 15. (b) el dominio II contiene aproximadamente cero a cerca de 60 residuos de aminoácidos unidos mediante péptidos al aproximadamente residuos 75. Esta secuencia incluye: (i) cero a diez de los residuos de una secuencia de HBc desde la posición de la HBc 76 hasta 85 unido por enlaces peptídicos (ii) una secuencia optativa de aproximadamente 6 a aproximadamente 48 residuos que constituyen una o más repeticiones de 6 a aproximadamente 24 residuos de un polipéptido M2 de influenza A anterior de SEQ ID NO: 9. (c) el dominio III es una secuencia de HBc desde aproximadamente la posición 86 a aproximadamente la posición 135 que esta unido con péptidos a aproximadamente el residuo 85. (d) el dominio IV contiene (i) los residuos de las posiciones 136 hasta la 140 más hasta 16 residuos de una secuencia de residuos de aminoácidos de HBc desde la posición 141 hasta la 156 unido con enlace peptídico al residuo de la posición 135 del dominio III, (ii) de cero a tres residuos de cisteína, (iii) menos de 4 residuos de arginina o lisina, o mezclas de éstos, juntos entre sí, y (iv) hasta aproximadamente 100 residuos de aminoácidos en una secuencia heteróloga para HBc desde la posición 156 hasta el C-terminal. Así pues, el dominio IV contiene por lo menos 5 residuos de las posiciones 136-140.

Una molécula quimera considerada (i) contiene hasta aproximadamente 10% de residuos de aminoácidos sustituidos en forma conservativa en la secuencia HBc, (ii) autoensambles en partículas que están considerablemente libres de unión a ácidos nucleicos durante la expresión en una célula hospedera, y aquellas partículas son más estables durante la formación de lo que son las partículas formadas de una quimera HBc de otro modo idéntica que carezca de residuo o residuos de cisteína N-terminales o en las cuales el residuo de cisteina N-terminal presente en la molécula quimera sea sustituido por otro residuo.

Una molécula quimera preferida contiene un residuo de cisteína que está presente en una posición de aproximadamente -50 a aproximadamente +1 en relación con el N-terminal de HBc como se muestra en la Figura 1 y de SEQ ID NO: 1. El concepto de una posición negativa de aminoácido normalmente se asocia con una secuencia lider como puede ser la secuencia prenúcleo de HBc.

Este concepto se utiliza igualmente en la presente puesto que es posible simplemente alinear una determinada secuencia de moléculas quimeras con las de la SEQ ID NO: 1 para determinar la posición de la quimera que corresponda con la del residuo de metionina inicial de la posición +1 de la HBc. Puesto que las secuencias de residuos de aminoácidos normalmente se muestran de izquierda a derecha y en la dirección desde N-terminal a C-terminal, cualquier residuo de molécula quimera alineada a la izquierda de la posición ocupada por la metionina inicial de la HBc tiene una posición negativa. Un residuo de cisteína puede estar en una posición aproximadamente 20 residuos a la izquierda de la metionina inicial alineada de la HBc respecto a la posición correspondiente a esa metionina inicial.

Durante el examen de la longitud de una quimera de HBc considerada, una proteína recombinante como esta puede tener una longitud de aproximadamente 150 a aproximadamente 325 residuos de aminoácidos. Preferentemente, esa longitud es cerca de 150 a cerca de 235 residuos. Más preferentemente, la longitud es de aproximadamente 170 a aproximadamente 215 residuos. Estas diferencias de longitud surgen de los cambios en la longitud de los dominios I, II y IV, y particularmente el número de polipéptido s M2 presentes y sin estar presente una secuencia C-terminal heteróloga para HBc.

Las quimeras de HBc que tienen un dominio I que contiene más de una deleción de los primeros tres residuos amino terminales (N-terminal) , según se ha documentado, dan como resultado la desaparición completa de la proteína quimera de HBc en células de E. coli . Pumpens y col., (1995) Intervirology, 38:63-74. Por otra parte, un estudio reciente en el que un polipéptido de 23 monómeros inmunógenos de la proteína M2 de influenza se fusiono a la secuencia N-terminal de la HBc informó que la proteina de fusión resultante formó partículas cuando fueron sustituidos los residuos 1-4 de la secuencia HBc nativa. Neirynk y col., (octubre 1999) Nature Med. , 5(10): 1157-1163 y la solicitud de Patente WO 9907839. Así pues, la técnica enseña que las partículas pueden formarse cuando esta presente una secuencia de aminoácidos adicionada unida con enlace peptí'dico a uno de los residuos 1-5 de HBc, mientras que las partículas no se forman si no esta presente la secuencia adicional y se delecionan más de 1-3 residuos del N-terminal de HBc.

Una secuencia N-terminal unida con enlace peptidico a uno de los primeros cinco residuos N-termínales de HBc puede contener una secuencia de hasta aproximadamente 40 residuos heterólogos para HBc; es decir, una parte de una secuencia prenúcleo puede estar presente en una molécula quimera considerada. Las secuencias ejemplares pueden ser epítopes de células B o células T de influenza A como son las descritas más adelante, una secuencia de otra proteina (heteróloga) como ß-galactosidasa, como puede ocurrir en las proteínas de fusión como resultado del sistema de expresión utilizado.

El dominio I preferentemente tiene la secuencia de residuos de las posiciones -2, -3 ó -4 hasta la posición 75 de HBc. El dominio I también contiene 1 a 3, preferentemente un residuo de cisteína adicionado y también preferentemente tiene 2 a 4 secuencias de aproximadamente 6 a aproximadamente 24 residuos de la secuencia de la región extracelular de la proteína M2e de influenza A unida con enlace peptídico en el amino terminal como se describe más adelante. El dominio 1 por tanto normalmente contiene una deleción de al menos el residuo de metionina de la posición 1 de HBc y puede incluir deleciones de los residuos en las posiciones 2, 3, y 4 de HBc.

Uno a tres residuos de cisteína están presentes en una posición de la molécula quimera de aproximadamente 1 a aproximadamente -55, preferentemente en cerca de -30 y más preferentemente en cerca de -20, en relación con el N-terminal de HBc del SEQ ID NO: 1 [el o los residuos de cisteina N-terminales] . Así pues, con el uso de la secuencia de SEQ ID NO: 1 como punto de referencia, el o los residuos de cisteína N-terminales se ubican en la molécula quimera en una posición que corresponde a la metionina en la posición 1 de la SEQ ID NO: 1 (Figura 1) 0 en una posición hasta aproximadamente 50 residuos corriente arriba a partir de esta posición. Más preferentemente, una cisteína N-terminal se localiza en una posición de aproximadamente 1 a aproximadamente -14 en relación con la posición 1 de la SEQ ID NO: 1.

Uno o más residuos de cisteína N-terminales están presentes dentro de una secuencia que no sea lá secuencia prenúcleo de HBc. Como se indico anteriormente, la molécula HBeAg contiene la secuencia prenúcleo que contiene un residuo de cisteína. Esta molécula no forma partículas, mientras que en la' presente se desean las partículas. Así pues, aunque un residuo de cisteína N-terminal pueda estar junto a uña secuencia prenúcleo, tal residuo no esta presente dentro de una secuencia prenúcleo o una molécula quimera considerada.

El dominio I puede tener una longitud de aproximadamente 160 residuos. Preferentemente, el dominio 1 tiene una longitud de aproximadamente 95 a cerca de 145 residuos de aminoácidos, y tiene 2 a 4, y de preferencia 3 secuencias de epítope polipéptido M2 de influenza A de SEQ ID NO: 9, como puede ser una secuencia SEQ ID NO: 10, que preferentemente tiene 19 residuos C-terminales del polipéptido M2 de la SEQ ID NO: 9.

Estudios recientes han indicado que los residuos N-terminales corriente arriba del primer residuo de ácido glutámico (entre los residuos X5 y Xe en la secuencia anterior) están o pueden ser disociados durante la preparación y expresión mediante una o más proteasas hasta ahora desconocidas que se piensa e incluyen una serina proteasa [cuya actividad puede ser inhibida por fluoruro de fenilmetansulfonilo (PMSF) ] o una metaloproteasa [cuya actividad puede ser inhibida por el ácido etilendiamino tetraacético (EDTA) ] . Así pues, algunas modalidades preferidas utilizan uno o más secuencias M2 de 19 monómeros o menos cuyo residuo N-terminal es el ácido glutámico en X6 de la SEQ ID NO: 9.

Más preferentemente, se ha encontrado que la actividad de la proteasa se puede llevar al mínimo y probablemente eliminarse calentado una solución amortiguadora de las partículas quimera a una temperatura de aproximadamente 50°C hasta aproximadamente 70°C durante un tiempo de aproximadamente 1.5 a aproximadamente 3 horas. El efecto de la proteasa también se puede llevar al mínimo o eliminarse manteniendo las partículas en una composición acuosa que también contenga una cantidad inhibidora de la proteasa de EDTA (por ejemplo aproximadamente 1-10 mM) o secuestrador semejante. Un grupo ejemplar de otros secuestradores inhibidores de metaloproteasas útiles (queladores) puede 2,2' -bipiridilo, dimercaptopropanol, ácido etilenglicol-bis- (2-aminoetil-N,N,N' ,N' ' -tetraacético (EGTA), ácido nitrilotriacético (NTA) , orto-fenantrolina, ácido salicílico, trietanolamina (TEA) , bestatina y fosforamidon. El secuestrador y la proteasa se pueden eliminar de la composición por el pasaje de las partículas de otro modo purificadas sobre una columna de exclusión de tamaño o similar, seguido por diálisis o un tratamiento semejante. La proteasa también puede ser tratada con calentamiento similar de una composición acuosa que contenga secuestrador de las partículas quiméricas .

Cuando dos o tres secuencias M2e se unen entre sí con enlace peptídico y por tanto se un en serie, los residuos de cisteína presentes en una o ambas posiciones 17 y 19 de la secuencia M2 natural puede estar ausente y puede estar presente un residuo de cisteína N-terminal considerado entre una secuencia M2 adicionada y el N-terminal de la secuencia de HBc. Preferentemente, esta presente una cisteína N-terminal considerada en una o más de las secuencias de M2 en una o ambas de las posiciones 17 y 19 de la secuencia natural. Puede estar presente una cisteína en cada una de las dos o tres secuencias M2, en la secuencia M2 N-terminal (en la posición aproximadamente -52 ó -54), en una secuencia intermedia de tres (en aproximadamente la posición -30 ó -32) o en la secuencia unida a la secuencia HBc (en aproximadamente la posición -6 ó -8) . Cuando están presentes dos o tres secuencias M2, se prefiere que una o dos cisteínas, preferentemente dos cisteínas, estén presentes en la secuencia M2 con enlace peptídico a la secuencia HBc, es decir, la secuencia M2 que esta unida directamente a la secuencia HBc o que esta distante del N-terminal de la molécula.

El dominio II, que está unido por péptido al residuo aproximadamente 75, contiene cerca de 0 a cerca de 60 residuos de aminoácidos. Este dominio tiene cero (ninguno) , y preferentemente por lo menos 4 residuos, y más preferentemente al menos 2, hasta los 10 de los residuos de la secuencia HBc de aproximadamente las posiciones 76 hasta aproximadamente la posición 85. El dominio II también, como una opción, tiene una secuencia de aproximadamente 6 hasta aproximadamente 48 residuos que constituyen una o más repeticiones del polipéptido M2 de influenza A antes mencionado de SEQ ID NO: 9. La secuencia polipeptídica M2 de influenza A, si esta presente, preferentemente esta unido con péptido entre los residuos HBc 78 y 79, y todas la secuencia de HBc desde la posición 76 hasta la 85 esta presente.

Las secuencias polipeptídicas M2 de influenza A preferidas para la inserción en los dominios I ó II, o ambos, de una quimera de HBc recombinante, posible se enumeran en la tabla A, más adelante. Una secuencia que comienza con un residuo de metionina (M) esta designada como una secuencia N-terminal para la inserción en el N-terminal del dominio I, mientras que una secuencia libre de un residuo M N-terminal esta designada para la inserción en el dominio II.

Tabla A Epitopes de células B de la proteína M2 de influenza A Secuencia SEQ ID O SLLTBVBTPIRNEWGCRCMGSSD 11 SLLTEVETP?RNEWGCRCNDSSD 12 SLLTEVETPIE1?EWGAS ÍDSSD 13 SLLTEV?TPl?üNJEWGSRSNDS SD 14 SLIÍ EVETPIBNEWGSRCMDSSD 15 SLLTEVETPIRNEWGC SNDSSD 16 SLLTEVETPIRISGEWGCSANDSSD 17 SIJLTBVETPIRNEWGARCNDSSD 18 MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD 19 MSLLTEVETPIKNEWGSRSNDSSD 20 MGI8LLTEV?TPIRN?WGCRCND- 3SDELLG L GI 21 MSLLTEVETPIRNEWGARANDSSD 22 SLLTEVETPIRKE GCR?MDSSD 23 SLLTEVETPIRNE GARCKDSSD 24 MSLLTEVETPIRNE GCRSHDSSD 25 MSLLTBVETPIENBWGSRC3ÍDSSD 26 SLLTEVETPIRHB GSRSNPSSDSLL- TEVETPIRUEWGSRSN SSD 27 SLLTEVETPIRKE GSRSNDSSDSLL- TEVBTPIKMEWGSRSKDSSDSLL- T?VETPIEI€BWGCRCNDSSD 28 SLLTEV?TPIRE?EWGAEAIMDSSDSLL- TBVETP1HH3 GC CNLSSD 29 S LT3VETPIRN? Qft.RAHDSSDSI)I?- TEVETPIENEWGARMEDSSDSL - TEVETPXRMEWGCRCNDSSD 30 EVETP1RNEWGSRCNDSSD 31 EVETPIRNEWGSRCNDSSDEVET- PIRNE GS5.CNDSSD 32 5 EVETPIRNEWGSRCNDSSDEVET- PXRNE GSRCKDSSDEVE- TPIRN?WGCRCNDSSD 33 SLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDSL - TEVETPIRNEWGSRSNDSSDSLK TEVETPIRN?WGSRSNDSSDS L-1Q TEVETP1RNEWGCRCNDSSD . 130 SLliTEVSTPIR EWGSSSNDSSDSL - TSVETP1RNE GSRSNDSSDS - TEVETPIRRE GSRSNDSSDSL - TBVETPIRNE?ÍGSRSN SSDSL - TBVBTPIRNBWGCRCNDSSD 131 lX2x3x x5x6x7x8TPJRNE 15x16x17- 15 XÍSX19X20X21X22X23X2 10 X1X2X3?4 5xSx7 ßT?IRHE>:35X16X17- x18x19x20x21X22X23x24x2- X3X4X5X6X7X8GPIRMEX15X16- X17X18 19X20X21X22X23X24 34 X1X2X3?4 S 6x7x8T?IRNEX15X16X17- 20 x18x19x20X2 x22X23X24X2" 3X4 5 6X7 8TP?RNB ! 5 ?6Xl7" x18x19x20x21x22x23x24x2~ X3X4X5XsX7X8TPIRNJ3X15X1gX?7- x18x19x20x21x22x23x24 3S l 2x3x4x5X6X7xaT?10 llx12X1 14x15- 25 X1SX17X18X19X20X21X22X23X24 9 xlx2x3x x5x6x7x8?,Xl0xllXl2x133íl Xi5" x16x17x18x19 20x21x22x23x24x2~ X3X4X5X€X7X8 X10X11X12Xi3x14x15- X16x17x18x19x20x21x22x23x24 3í xlx2x3x4xSx6X7x8T?l?xllx22x13x14xi5- X1SX17X18X19X20x21x22x23x24x2- x3x4x5xSx7x8T?10x12x12x13x14x15- X16X17X18X19X2ÜX2IX22X23X24X2- X4x5x5x7x8TX10xllx12x13x14x15_ x16x17x18x19x2Gx21x22x23x24 ^ XlX2x3x4 5 &x7X8??10xllx12x13x14x15- x16x17xl8X19X20X2lx22x23x2 x2~ x3x4x5xSx7x8txlGxilx12xi3x14x15- X16X17X18X19X20X21X22X23X24X2- x3x4x5x6x7x8tx10x11x12x13x14x15- X16X17X18X19X20X21X22X23X24X2~ X3X4X5X6X7X8TX10X11X12X13X14X15~ xldx17x18x19x20x21x22 23x24 , 13 SIÍ TBVBTPTRNE GCRCNDSSD 13 SLLTEVETPTRNG SCRC?SDSSD 13 SL TEVETPIRKEWBCRCNG3SD 13 SLLTEVETPTKNE ECRCNDSSD . 13 En el polipéptido de SEQ ID NO: 9, los residuos Xi hasta X8 están ausentes o presentes, y cuando están presentes son los residuos naturales presentes en la secuencia de la proteina M2 que son metionina, serina, leucina, leucina, treonina o prolina, ácido glutámico, valina y ácido glutámico o ácido aspártico, respectivamente, con la condición de que cuando esté presente un residuo X con subíndice, también estará presente cualquier X con subíndice remanente con un número subíndice superior hasta 8, Xio esta presente y es prolina, " leucina, o histidina, Xn esta presente y es isoleucina o treonina, X?2 esta presente y es arginina o lincina, X?3 esta presente y es asparagina o serina, Xi4 esta presente y es ácido glutámico o glicina, Los residuos X15 y X?6 están presentes o ausentes, y cuando están presentes son triptofano y glicina o ácido glutámico, respectivamente, X17 y X19 están presentes o ausentes, y cuando están presentes son independientemente cisteina, serina o alanina, El residuo Xig esta presente o ausente, y cuando esta presente es arginina o lisina, y Los residuos X20 hasta X24 están presentes o ausentes, y cuando están presentes son los residuos naturalmente presentes en la secuencia de la proteina M2 que son asparagina, glicina o serina, ácido aspártico o glicina, serina, serina o ácido aspártico respectivamente, con la condición de que cuando este presente un residuo X con subíndice, también este presente cualquier residuo X son subíndice, restante, con un número subíndice menor a 15.

En el polipéptido similar de SEQ ID NO: 10, X hasta Xg están ausentes o presentes, y cuando están presentes son los residuos naturalmente presentes en la secuencia de la proteina M2 reportada, es decir, metionina, serina, leucina, leucina, treonina, ácido glutámico o ácido aspértico, valina y ácido glutámico, respectivamente, con la condición de que cuando están presente X son subíndice, también este presente cualquier residuo X son subíndice restante con un número subíndice superior hasta 8. Asi pues, cuando X*. esté presente, cada uno de X2 hasta Xa también esté presente. Del mismo modo, cuando esté presente X3, cada uno de X4 hasta Xs también esté presente, y similares. Por otra parte X8 puede estar presente sin que este presente cualquier otro de los residuos X restantes que tengan un número subíndice de menor valor. Los residuos X1 y X16 están presentes o ausentes, y cuando están presentes son triptofano y glicina o ácido glutámico, respectivamente. Los residuos X17 y X19 están presentes, y cuando están presentes son independientemente cisteina, serina o alanina. Se prefiere que por lo menos uno de X?7 y X19 sea cisteina, particularmente cuando esta presente un epitope del polipéptido M2 en el N-terminal de la molécula quimera. Se prefiere más que estén presentes dos cisteinas cuando este presente una pluralidad de secuencias M2e, y que estas dos cisteinas estén presentes en la secuencia M2 más cercana al residuo N-terminal de la parte de la secuencia HBc. El residuo Xie esta presente o ausente, y cuando esta presente es arginina o lisina. Los" residuos Xio hasta X24 están presentes o ausentes, y cuando están presentes son los residuos naturalmente presentes en la secuencia de la proteina M2 reportada; es decir, asparagina, glicina o serina, ácido aspértico o glicina, serina, serina y ácido aspértico, respectivamente, con la condición de que cuando esta presente una X son subíndice, también esté presente' cualquier residuo X restante con un número subíndice inferior hasta 15. Asi pues, por ejemplo, cuando esta presente X23, también están cada uno de los residuos X15 hasta X22.

El dominio III contiene la secuencia de la posición aproximadamente 86 hasta la posición aproximadamente 135 de HBc unida con enlace peptidico a su N-terminal en el residuo aproximadamente 85.

El cuarto dominio, el dominio IV, contiene: (i) los residuos de las posiciones 136 hasta 140 más hasta 16 residuos de una secuencia de residuos de aminoácidos de HBc desde la posición 141 hasta la posición 156, y preferentemente 9 residuos hasta el enlace peptidico 149 al residuo en la posición aproximadamente 135 del dominio III, (ii) de 0 a 3 residuos de cisteina, y preferentemente un residuo de cisteina, (iii) menos de cuatro residuos de arginina o lisina, y mezclas de estos juntos entre si y (iv) hasta aproximadamente 100 residuos de aminoácidos, preferentemente hasta 50 residuos de aminoácidos y más preferentemente hasta cerca de 25 residuos, en una secuencia heteróloga para HBc desde la posición 164, o preferentemente desde la posición 156, hasta el C-terminal.

Se prefiere que el dominio IV contenga hasta 14 residuos de una secuencia de HBc desde la posición 136 hasta la posición 149 unidos con enlace peptidico al residuo 135; es decir, una secuencia de HBc que comience con el residuo de la posición 136 que puede continuar hasta la posición 149. Asi pues, si el residuo de la posición 148 esta presente, también esta la secuencia de residuos de las posiciones 136 hasta la 147, o si esta presente el residuo 141, también esta la secuencia de residuos de las posiciones 136 hasta la 140.

El dominio IV también puede contener 0 a 3 residuos de cisteina, y estos residuos Cys están presentes dentro de aproximadamente 30 residuos del carboxiterminal (C-terminal) de la molécula quimera. Preferentemente, un residuo de cisteina (Cys) esta presente, y esta Cys preferentemente esta presente como el residuo carboxiterminal (C-terminal) , a menos que este presente un epitope de células T de influenza como parte del dominio IV. Cuando esta presente un epitope de células T como este, el aminoácido Cys preferido preferentemente estará dentro de los últimos 5 residuos C-terminales de la quimera HBc.

La presencia del residuo o los residuos de cisteina N-terminales antes mencionados permite un mejoramiento inesperado de la posibilidad de las moléculas quimeras para formar partículas inmunógenas estables (como se describe más adelante) . Asi pues, un inmunógeno quimera de HBc considerado tiende a formar partículas que permanecen reunidas después de la recolección y la purificación inicial, según se mide por la cromatografía de exclusión de tamaño, analítica, cuyos detalles se describen más adelante.

Las partículas previstas también pueden ser más estables a la descomposición a 37 °C después de envejecimiento en comparación con las partículas quimeras similares que carezcan de este residuo de cisteína. Este último tipo de estabilidad mejorada se "puede medir utilizando geles de SDS-PAGE al 15% con partículas dispersadas en buffer para muestra (reductor) . Los geles se tiñen utilizando azul de Coomassie, y luego se analizan. Este tipo de estabilidad, según se cree, se puede mostrar contra hidrólisis, mientras que la estabilidad determinada por cromatografía de exclusión de tamaño es la de la formación de partículas iniciales.

Las partículas que además contienen uno o más residuos de cisteína C-terminales muestran mejor estabilidad en la formación y también hacia la descomposición con el envejecimiento, en donde algunas partículas que contienen cisteínas N y C-terminales normalmente muestran mayor estabilidad en cualquier medida en comparación con aquellas partículas que solo tienen una cisteína adicionada en N-terminal o C-terminal .

El dominio IV contiene menos de 4 residuos de arginina o lisina, o mezclas de estos, juntos entre sí. La arginina y las Usinas están presentes en la región C-terminal de HBc que se extiende desde la posición 156 hasta el C-terminal de la molécula natural. Esta región muchas veces se conoce como la región "protamina" o "rica en arginina" de la molécula y se une a las ácidos nucleicos. Una molécula y partícula quimera de HBc considerada son prácticamente libres de ácidos nucleicos unidos.

La considerable libertad de unión a los ácidos nucleicos se puede determinar fácilmente mediante una comparación de la ausencia de las partículas en solución acuosa, medida a 280 y 260 nm; es decir, una relación de la absorbancia 280/260. Las partículas consideradas no se unen prácticamente a los ácidos nucleicos que son especies de DNA y RNA oligoméricas y/o poliméricas originalmente presentes en las células del organismo que se utilice para expresar la proteína. Estos ácidos nucleicos presentan una absorbancia a 260 nm y relativamente menos absorbancia a 280 nm, mientras que una proteina como una quimera considerada absorbe relativamente menos a 260 nm y tiene mayor absorbancia a 280 nm.

De este modo, las partículas de HBc expresadas en forma recombinante o las partículas de HBc quiméricas que contienen la secuencia rica en arginina en las posiciones de los residuos 150-183 (o 150-185) muestran una relación de absorbancia a 280 nm a la absorbancia a 260 nm (relación de absorbancia 280:260) de aproximadamente 0.8, mientras que las partículas libres de la región que se une al ácidos nucleico, rica en arginina 'de la HBc natural como las que contienen menos de 4 residuos de arginina o lisina o mezclas de estos juntos entre sí, y aquellos que tienen una secuencia nativa o quimera que termina en aproximadamente la posición del residuo 140 a la posición 149 de la HBc, muestran una relación de la absorbancia de 280:260 de aproximadamente 1.2 hasta aproximadamente 1.6.

Las partículas de HBc quiméricas de la presente invención están prácticamente libres de unión al ácido nucleico y muestran una relación de la absorbancia 280:260 de aproximadamente 1.2 hasta aproximadamente 1.7, y más comúnmente cerca de 1.4 a cerca de 1.6. Esta región se debe en gran parte al número de residuos de aminoácido aromáticos presentes en los dominios II y IV de una determinada partícula de HBc quimérica. Este intervalo también es en parte debido a la presencia de la Cys en el dominio IV de una quimera contemplada, cuya presencia puede disminuir la relación observada en aproximadamente 0.1 por una razón que actualmente se desconoce.

Las partículas de HBc quiméricas, contempladas son más estables en buffer acuoso a 37° durante un tiempo de aproximadamente 2 semanas a aproximadamente 1 mes en comparación con las partículas formadas de una quimera de HBc que contenga las mismas secuencias de los dominios II, III y IV unidas con péptidos y una secuencia del dominio I de otro modo idéntica en la que 1 a 3 residuos de cisteina [el residuo o los residuos de cisteína N-terminales] están ausentes o un solo residuo N-terminal presente se sustituye por otro residuo como un residuo de alanina.

Así pues, por ejemplo, las partículas que contienen un polipéptido de M2e de influenza A en el dominio I [por ejemplo las partículas ICC-1590] que contengan dos residuos de cisteína son más estables que las partículas de otro modo idénticas [las partículas ICC-1603] ensambladas a partir de moléculas quiméricas cuya secuencia variante M2 N-terminal contiene residuos de serina en lugar de las cisteínas. Del mismo modo, las partículas que contienen los epítopes de células B de influenza que contienen serina anteriores en el dominio I y una sola cisteína en el C-terminal [las partículas ICC-1605] son más estables que las partículas de otro modo idénticas en las que esta ausente la cisteína, pero son menos estables que las partículas que contienen las dos cisteinas N-terminales, las partículas ICC-1590 o aquellas partículas que contengan cisteínas N-terminales y C-terminales [partículas ICC-1604] .

Debe señalarse que las partículas y las moléculas quimera de las cuales estas están constituidas se mencionan de manera indistinta por el prefi'jo "ICC-", o el prefijo "CV-" seguido por un número de 4 dígitos, o solo por un número de 4 dígitos sin un prefijo. Asi pues, las partículas ICC-1590 anteriores también se podrían mencionar como las partículas CV-1590 o solo las partículas 1590. Todas las denominaciones tienen el mismo significado.

Una partícula prevista que contenga un residuo de cisteína N-terminal también normalmente se prepara con mayor rendimiento que una partícula ensamblada a partir de una molécula quimera que carezca de una cisteína N-terminal .

Aunque la célula T cooperadora producida por HBc es altamente eficaz para mejorar las respuestas de los anticuerpos (es decir, mediados por células B) a las secuencias inmunógenas "acarreadas" luego de la vacunación, la HBc no activa las células T específicas de influenza, excepto en algunas personas de quienes una secuencia que contenga el epítope de células B también contiene un epitope de células T. para el cebado universal que garantice cooperación de células T cooperadoras especificas de influenza, además de las células B, uno o más epítopes T cooperadores específicos de influenza se incorpora preferentemente en un inmunógeno previsto y se ubica en el dominio IV del inmunógeno .

Una pluralidad de los epítopes de células T anteriores u otros puede estar presente en el dominio IV o puede estar presente otro epitope de células B. En la práctica preferida, el dominio IV tiene hasta aproximadamente 50 residuos en una secuencia heteróloga para HBc. Mas preferentemente, esta secuencia tienen hasta aproximadamente 25 residuos e incluye un epítope de células T.

Debido a que M2 se expresa abundantemente por las células infectadas, tiene potencial de contribuir como objetivo para la actividad CTL especifica de influenza. El dominio extracelular es un sitio de unión posible para el anticuerpo, el cual puede funcionar para inmovilizar la función de M2 en una forma semejante a la sustancia activa terapéutica amantadina, o por la activación de la citotoxicidad celular dependiente de los anticuerpos (ADCC) y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) .

En realidad, se ha demostrado que el dominio extracelular de M2 tiene por lo menos dos epitopes CTL humanos diferentes, uno en 7-15 [Jamson y col., (1998) J. Virol . , 72 (11): 8682-8689] y otro en 3-11 [Gianfrani y col., (2000) Hum . Immunol . , 61 (5): 438-352]. La lisis en la que intervienen los anticuerpos contra M2e de las células infectadas por influenza a través de ADCC y/o CDC puede ser el mecanismo preferido de la lisis de las células diana, en comparación con CTL, porque, a diferencia de CTL, estas no son objeto de restricción MHC. Por tanto, la posibilidad de obtener títulos suficientes de anticuerpos contra M2 que muestren un perfil de la subclase IgG requerido, y la especificidad de M2e debe desencadenar amplia protección entre diversas poblaciones .

El efecto biológico que tienen los anticuerpos contra el dominio extracelular de M2 se describió por primera vez por Zebedee y Lamb, quienes demostraron que el anticuerpo monoclonal contra M2 14C2 hace más lento el crecimiento del virus en cultivo [Zebedee y col., (1998) J. Virol, 68 (8): 2762-2772]. En 1990, Treanor y col., demostraron que el mismo anticuerpo monoclonal inhibió con muy buenos resultados la multiplicación del virus de influenza A en ratones [Treanor y col., (1990) J. Virol , 64 (3): 1375-1377]. Palladino y col., determinaron que 14C2 no era neutralizante viral in vivo, pero unieron células infectadas e inhibieron el crecimiento viral in vitro; sin embargo, no curaron la infección [Palladino y col., (1990) J. Virol, 69 (4): 2075-2081] . Los autores de este último articulo indicaron debidamente que 14C2 es un anticuerpo de la subclase de las IgGl y que las IgG2a e IgG2b son más eficaces fijando el complemento; también son superiores a IgGl para unirse a los receptores de Fc?RIII en las células NK. En realidad, como se muestra más adelante, parece ser que títulos elevados de anticuerpos IgG2a en ratón, que son comunes de una respuesta inmunitaria Thl se correlacionan con la protección. Una respuesta inmunitaria que puede proporcionar lisis con intervención de anticuerpos contra M2e de las células infectadas con influenza a través de ADCC y/o CDC, de este modo, es una respuesta preferida.

Las respuestas anamnésicas contra M2 se han observado en repetidas ocasiones luego del desafío de ratones previamente inmunizados con partículas de HBc-M2, lo que indica que las partículas M2e-HBc ceban las células T específicas de M2. Para investigar esto, se realizaron estudios preliminares para investigar si los linfocitos de los ratones inmunizados pueden ser recordados por el péptido M2e, in vitro. Se observo un aumento significativo en la cantidad de células secretoras del interferón gama luego de la estimulación con péptidos obtenidos de M2, HBc p85-100, y HBcAg recombinante, pero no pl00-120 procedente de HBc. La recordación con HBcAg fue más evidente, cosa que se esperaba puesto que este es un inmunógeno de células T potente que contiene múltiples epítopes de células T funcionales para ratones BALB/c [Saito y col., (2001) Vaccine 20 (1-2): 125-133].

Parece ser que la recordación con todos los antígenos es más fuerte para los linfocitos aislados de ratones inmunizados con partículas ICC 1604 contra partículas ICC-1569. Este resultado indica que las partículas ICC-1604 pueden ser un inmunógeno de células T superior en comparación con las partículas ICC-1569. No obstante, es importante señalar que el antígeno de recordación M2 para estos estudios fue M2e (2-24), que contiene residuos de cisteína en 17 y 19, y por tanto fue solo realmente homólogo para las partículas ICC-1604 y no para las partículas ICC-1569, porque estas últimas contienen residuos de serina en lugar de los dos residuos de cisteinas.

El nivel reducido de reestimulación con M2e para ratones inmunizados con partículas ICC-1569 comparadas con las partículas ICC-1604 se puede explicar si los residuos de cisteína en las posiciones 17 y/o 19 son componentes de uno o más epítopes de células T. No obstante, la presencia de epítopes de células T que contengan residuos de cisteína no explica el nivel reducido de reestimulación con los antigenos obtenidos de HBc.

La observación de una respuesta anamnésica, con respecto a los títulos de los anticuerpos contra M2e, luego de desafío viral de ratones inmunizados con M2e- HBc, parece indicar la presencia de por lo menos un epitope de células T cooperadoras en el dominio M2e (posiciones 2-24) .

Los epítopes obtenidos de la nucleoproteína de influenza (NP 206-229) , que es ampliamente reactiva en humanos (HLA-DR1, HLA-DR2, HLA-DRwl3) [Brett y col., (1991) J. Im unol . 147 (3) : 984-991] y también funcional en ratones BALB/c son considerados para utilizarlos con epitopes de células T en la presente. Se han expresado y purificado partículas con este epítope fusionado al C-terminal de las partículas de HBc. También están considerados otros epítopes Th de influenza, como puede ser NP 341-362, NP 297-318 y NP 182-205 [Brett y col., (1991J J. Immunol . , 147 (3): 984-991]; estas secuencias finalmente pueden ser ligadas en seria al C-terminal de la partícula que expresa M2e. estas secuencias ejemplares se proporcionan a continuación.

Una molécula quimera de HBc, recombinante, prevista normalmente esta presente y se utiliza en un inmunógeno o vacuna como una partículas autoensamblada. Estas partículas están compuestas de 180 a 240 -moléculas quimera que se separan en moléculas proteínicas en presencia de agentes reductores disulfuro como 2-mercaptoetanol y reactivos desnaturalizadotes como SDS. Las moléculas individuales se unen entre si en la partícula por interacciones proteina-proteina, y estas interacciones se estabilizan por la presencia de enlaces disulfuro. Estas partículas " son semejantes a las partículas que se observan en pacientes infectados con HBV, pero estas partículas no son infecciosas. Luego de la expresión en algunos hospederos procariotas y eucariotas, las moléculas quimera HBc recombinante, individuales se ensamblan en el hospedero en partículas que se pueden cosechar fácilmente de las células hospederas .

Además de las truncaciones en N y C antes descritas de los epitopes polipéptido M2 de influenza, una molécula quimera considerada también puede contener sustituciones conservativas en los residuos de aminoácidos que constituyen los dominios I, II, III y IV de HBc. Las sustituciones conservativas se definen en lo anterior.

Menos común, un cambio "no conservativo", por ejemplo, la sustitución de la glicina con un triptofano esta considerado. Variaciones menores semejantes también pueden incluir deleciones e inserciones de aminoácidos o ambas. La guia para determinar los residuos de aminoácidos que pueden ser sustituidos, insertados o delecionados sin anular la actividad biológica se pueden encontrar utilizando programas de computo bien conocidos en la técnica, por ejemplo, el software LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison Wis.).

La porción HBc de una molécula quimera de la presente invención [la parte que tiene la secuencia HBc que tiene además de una secuencia de un epítope adicionado, o residuo o residuos heterólogos que son un artefacto de encima de restricción] más preferentemente tiene la secuencia de residuos de aminoácidos en las posiciones 2 hasta la 149 del subtipo ayw que se muestran en la Figura 1 (SEQ ID NO: 1) si esta presente, poco menos preferidas son las secuencias de residuos de aminoácidos correspondientes de los subtipos adw, adw2 y adyw que también se muestran en la Figura 1 (SEQ ID NOS: 2, 3 y 4). Todavía menos preferidas son las secuencias de marmota y ardilla terrestre en las posiciones alineadas 2 hasta la 149 que son las últimas dos secuencias de la Figura 1 (SEQ ID NOS: 5 y 6) . Como se menciona en otra parte, partes de las diferentes secuencias de distintas proteínas de HBc de mamífero pueden utilizarse junto con una sola quimera.

Cuando la porción HBc de una molécula quimera o híbrida de la presente invención tiene además una secuencia de una molécula HBc de mamífero en las posiciones 2 hasta la 156 o hasta la posición 149, cuando esta presente, porque se ha hecho una o más sustituciones conservativas, se prefiere que no más de 10% y más preferentemente no más de 5%, y más preferentemente no más de 3% de los residuos de aminoácidos estén sustituidos en comparación con la SEQ ID NO: 1 desde la posición 2 hasta la 149 o 156. Una quimera prevista de 149 residuos de HBc, por tanto, puede contener hasta aproximadamente 15 o 16 residuos que sean diferentes de los de la SEQ ID NO: 1 en la posiciones hasta la 149, y preferentemente cerca de 7 u 8 residuos. Más preferentemente, hasta aproximadamente 5 residuos son diferentes de la secuencia ayw (SEQ ID NO: 1) en las posiciones de los residuos 2-149. Cuando una secuencia HBc esta truncada además en uno o ambos terminales, el número de residuos sustituidos es proporcionalmente diferente. Las deleciones en cualquier parte de la molécula son consideradas sustituciones conservativas para propósitos del cálculo de modo que, si por ejemplo, el dominio I tuviera un C-terminal en la posición 133 en lugar de 135, se supondría que están presentes dos residuos (134 y 135) para propósitos de cálculo.

Preparación de la quimera Un inmunógeno quimérico considerado se prepara utilizando las técnicas bien conocidas de la tecnología del DNA recombinante. Así pues, las secuencias de ácido nucleico que codifican las secuencias peptidicas particulares se adicionan y delecionan de la secuencia precursora que codifica el HBV.

Un inmunógeno quimérico considerado normalmente utiliza un residuo de cisteína presente en la secuencia M2 como la cisteina N-terminal. Los cebadores para la preparación de tales moléculas quiméricas por mutagenesia in vitro de un polinucleótido que codifica una molécula de HBc se describen más adelante. Cuando no esta presente un epitope polipéptido M2 que contenga cisteina en el N-terminal, la cisteina N-terminal puede ser proporcionada por mutagensia in vitro utilizando un cebador que codifique solo una parte que contenga cisteína del polipéptido M2 de una secuencia de inicio N-terminal, sencilla, como Met-Cys ó Met-Gly-Cys .

Como ya se mencionó, la asa inmunodominante de HBc normalmente se indica como ubicada en las posiciones aproximadas 75 hasta la 85 desde el amino terminal (N-terminal) de la proteina intacta. La secuencia que contiene el ' epítope de células B M2 de influenza A puede estar colocada en esta secuencia de la asa inmunodominante del dominio II. Esta colocación elimina considerablemente la inmunogenicidad de HBc y la antigenicidad de la secuencia asa de la HBc, presentando al mismo tiempo el epítope de células B M2 de influenza A en una posición extremadamente inmunogénica en las partículas quiméricas ensambladas.

Una de dos estrategias bien conocidas es particularmente útil para colocar la secuencia de células B M2 de influenza A en la secuencia asa en una ubicación deseada como puede ser entre los residuos 78 y 79. Una primera estrategia menos preferida se conoce como sustitución en la que el DNA que codifica para una parte de la asa se corta y se sustituye con DNA que codifica una secuencia de células B M2 de influenza A. La segunda estrategia se conoce como inserción, en la que una secuencia de células B M2 de influenza A se inserta entre residuos adyacentes en la asa.

La mutagenesia dirigida al lugar que emplea la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se utiliza en un enfoque de sustitución ejemplar para obtener una secuencia de DNA de la HBc quimérica que codifique un par de diferentes lugares de restricción, por ejemplo, EcoRI y Sacl, una cerca de cada extremo del DNA que codifica la asa inmunodominante. Los residuos ejemplares sustituidos del 76 al 81. La sección que codifica la asa se corta, una secuencia que codifique el epítope de células B M2 de influenza A flanqueada en cada lado por residuos de la secuencia de HBc apropiados se liga en los lugares de restricción y se utiliza el DNA resultante para expresar la quimera de HBc. Véase, por ejemplo, la Tabla 2 de Pumpens y col., (1995) Intervirology; 38: 63-74 para otros ejemplos de una técnica semejante.

De otro modo, uno o dos sitios de restricción puede ser codificada en la región, se corta el DNA con enzimas de restricción para obtener extremos "cohesivos" y en la zona cortada se liga un segmento de DNA heterólogo, de extremos cohesivos o romos, apropiado. Los ejemplos de este tipo de sustitución de secuencias en la HBc se pueden encontrar en el trabajo documentado en Schoel y col., (1991) F. Brown y col., eds., Vaccines 91 , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New Cork, pp. 319-325, Schodel y col., Behring Inst . Mitt . , 1997 (98): 114-119 y Schodel y col., JA Exp . Med. , (1994) 180 (3: p. 1037-4, estos dos últimos documentos describen la preparación de vacunas contra los patógenos de malaria P.

Yoelii y P. berghei, respectivamente. Una estrategia de sustitución que da como resultado una separación neta de residuos de la asa inmunodominante normalmente se utiliza en la presente.

Se prefiere la inserción. En un ejemplo de estrategia de inserción, se utiliza mutagenesia dirigida al sitio para crear dos sitios de restricción juntos entre si y entre codones que codifiquen residuos de aminoácidos contiguos, como pueden ser aquellos en las posiciones en las posiciones de los residuos 78 y 79. Esta técnica adiciona 12 pares de base que codifican para 4 residuos de aminoácidos (dos por cada sitio de restricción) entre residuos anteriormente contiguos en la asa de HBc.

Luego de la disociación con las enzimas de restricción, la ligación del DNA que codifica para la secuencia M2 del virus de influenza A ejemplar y la expresión del DNA para formar quimeras de HBc, se observa que la secuencia de aminoácidos de la asa de HBc se interrumpe en el lado N-terminal por dos residuos codificados por el sitio de restricción 5' , seguido hacia el C-terminal por la secuencia del epítope de células B M2 de influenza A, seguido por dos residuos más heterólogos, que no son de la asa, codificados por el sitio de restricción ' y luego el resto de la secuencia de la asa. Esta misma estrategia también se utiliza preferentemente para la inserción en el dominio IV de un epitope de células T o uno o más residuos de cisteína que no sean parte del epítope de células T. Una estrategia semejante que emplea una inserción entre los residuos 82 y 83 esta documentada en Schoedel y col., (1990) F. Brown y col., eds., Va ccines 90, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New Cork, pp . 193-198.

Por ejemplos, una secuencia de DNA que codifica una secuencia de HBc truncada en el C-terminal (HBc 149) es manipulada para que contenga los sitios EcoRI u Sacl contiguos entre los residuos 78 y 79. El clivaje o disociación de este DNA con ambas enzimas proporciona un fragmento que codifica las posiciones 1-78 de HBc terminado en 3' con un extremo cohesivo EcoRI, mientras que el otro fragmento tiene un extremo cohesivo Sacl 5' terminal y codificado residuo de las posiciones 79-149. La ligación de un ácido nucleico sintético que tenga un colgaje AATT 5' seguido por una secuencia que codifique un epítope de células B M2 de influenza A, deseado y un colgaje 3' de AGCT proporciona una secuencia quimera de HBc que codifica este epitope de células B flanqueado en cada lado por dos residuos heterólogos (Gl y EL, respectivamente) entre dos residuos 78 y 79, mientras que se destruye el sitio EcoRI se conserva el sitio Sacl.

Puede utilizarse una estrategia semejante para la inserción de una secuencia que contenga cisteina C-terminal. En este caso, se manipulan los sitios de restricción EcoRI y HindIII en la secuencia de DNA de la HBc después de la posición 149 de los residuos de aminoácidos. Después de la digestión con EcoRI y HindIII se cuelga en la posición 5' un DNA sintético que tenga la secuencia AATT anterior seguido por una secuencia que codifique el epítope de células T, se ligo un codón de detención y una saliente AGCT 3' en la secuencia digerida para formar una secuencia que codifico los residuos 1-149 de HBc seguido por dos residuos heterólogos (Gl) , el codón de interrupción y el sitio HindIII.

La amplificación por PCR utilizando un cebador delantero teniendo un sitio de restricción Sacl seguido por una secuencia que codifica" HBc comenzando en la posición del residuo 79, seguido por la digestión con Sacl y HindIII proporcionó una secuencia que codifica las posiciones 79-149 de HBc más los dos residuos adicionados y el epitope de células T en el C-terminal. La digestión de esta construcción con Sacl y la ligación proporciona el gen completo que codifica un inmunógeno quimera de HBc recombinante, deseado, con la secuencia, desde el N-terminal, de las posiciones 1-78 de la HBc, dos residuos adicionados, los epitopes de células B que contienen la secuencia M2 de influenza, dos residuos adicionados, las posiciones 79-149 de HBc, dos residuos adicionados y el epítope de células T.

Debe observarse que el uso preferido de dos residuos heterólogos en cualquier lado de (flanqueando) una secuencia inmunógena heteróloga que contenga epítopes de células B o de células T es por conveniencia. Como consecuencia, también es posible utilizar de 0 a 3 o más residuos adicionados que no sean parte de la secuencia de HBc en cualquiera o ambos lados de una secuencia insertada. Uno o ambos extremos de la inserción y el ácido nucleico de HBc pueden ser "nuevamente digeridos" con una nucleasa apropiada (por ejemplo la nucleasa SI) para obtener extremos romos que se puedan ligar entre si. Los residuos heterólogos adicionados que ni son parte de los epítopes de células B o de células T insertados ni una parte de la secuencia de HBc no se toman en cuenta en el número de residuos presentes en un dominio mencionado.

Asimismo debe señalarse que es posible también sintetizar todo o una parte de un ácido nucleico quimera de HBc recombinante utilizando los métodos de sintesis bien conocidos como se indica y se muestra en la Patente US No. 5,656,472 para la síntesis del DNA de 177 pares de bases que codifica el péptido señal ribulosa bis fosfato carboxilasa-oxigenasa de 59 residuos de Nicotiana tabacum . Por ejemplo, es posible sintetizar los dominios I y II con un extremo romo o "cohesivo" que se pueda ligar a los dominios III ó IV para obtener una construcción que exprese una quimera de HBc contemplada que contenga cero residuos adicionados en el lado N-terminal del epitope de células B y 0 a 3 residuos adicionados en el lado C-terminal o en la unión del dominio II/III o en algún otro lugar que se desee.

Una secuencia de ácido nucleico (segmento) que codifique una molécula quimera o hibrida de HBc antes descrita o un complemento de esta secuencia codificante también se prevé en la presente. Un segmento de ácido nucleico como este esta presente en forma aislada o purificada en algunas modalidades preferidas.

En organismos vivos, la secuencia de residuos de aminoácidos de una proteina o polipéptido esta directamente relacionada por el código genético con la secuencia del ácido desoxiribunucléico (DNA) del gen que codifica para la proteína. Así pues, aunque la degeneración bien conocida de los DNA adicionales del código genético y las secuencias de RNA correspondientes (ácidos nucleicos) pueden prepararse según se desee para que codifiquen las mismas secuencias de residuos de aminoácidos híbridas, pero que sean suficientemente diferentes de una secuencia génica antes descrita que las dos secuencias no hibriden en condiciones de alta severidad, pero hibriden con severidad moderada.

Las condiciones de alta severidad pueden ser definidas como consistentes en la hibridación a una temperatura mayor de 50°C-55°C en 6XSSC y un lavado final a una temperatura de 68 °C en 1-3 XSSC. Las condiciones de rigurosidad moderadas consisten en la hibridación a una temperatura de aproximadamente 50°C hasta aproximadamente 65°C en NaCl 0.2 a 0.3 M, seguido por lavado a aproximadamente 50°C hasta aproximadamente 55°C en 0.2 XSSC, 0.1% SDS (dodeciisulfato de sodio).

Una secuencia nucleica (secuencia de DNA o una secuencia de RNA) que: (1) por sí misma codifique, o su complemento codifique, una molécula quimera cuya parte HBc desde la posición del residuo 1 hasta el 136, si esta presente, es de las SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 y (2) hibride con una secuencia de DNA de las SEQ ID NOS: 43, 44, 45, 46, 47 ó 48 por lo menos en condiciones de rigurosidad moderadas (como ya se describió) ; y (3) cuya secuencia de HBc comparta por lo menos 80%, y más preferentemente por lo menos 90%, incluso más preferentemente por lo menos 95%, y más preferentemente 100% de identidad con una secuencia de DNA de SEQ ID NOS: 43, 44, 45, 46, 47 y 48, se define como una secuencia variante de DNA. Como es bien sabido, una secuencia de ácido nucleico como una secuencia de ácido nucleico considerada se expresa cuando se liga de manera operante a un promotor apropiado en un sistema, de expresión adecuado como se describen en otra parte de la presente.

Una secuencia de ácido nucleico análoga (DNA o RNA) que codifique una molécula quimera contemplada también se contempla como parte de . esta invención. Una secuencia de ácido nucleico quimera o su secuencia de ácido nucleico complementaria codifica una secuencia de residuos de aminoácidos de HBc que es por lo menos 80%, y más preferentemente por lo menos 90%, y más preferentemente por lo menos 95% idéntica a la "porción de la secuencia de HBc desde lá posición del residuo 1 hasta la posición del residuo 136 mostrado en las SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5 y 6. Este DNA o RNA se conoce en la presente como un "análogo de" o "análogo para" una secuencia de un ácido nucleico de SEQ ID NOS: 43, 44, 45, 46, 47 y 48, e hibrida con la secuencia de ácido nucleico de las SEQ ID NOS: 43, 44, 45, 46, 47 y 48 o sus complementos en la presente en condiciones de hibridación con rigurosidad moderada. -Una ácido nucleico que codifique una secuencia análoga, tras la transfección y expresión convenientes, también produce una quimera prevista.

Diferentes hospederos muchas veces tienen preferencias por un codón particular para utilizarlo para codificar un residuo de aminoácido específico. Tales preferencias por un codón son bien conocidas y una secuencia de DNA que codifique una secuencia quimera deseada puede ser alterada utilizando mutagenesia in vitro por ejemplo, de modo que los codones preferidos por el hospedero se utilicen para un hospedero especifico en el que se expresaría la enzima. Además, también es posible utilizar una degeneración del código genético para codificar la porción HBc de una secuencia de SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 que evite identidad considerable con un DNA de las SEQ ID NOS: 43, 44, 45, 46, 47 ó 48 o sus complementos. Así pues, una "secuencia de DNA análoga, útil no necesita hibridar con las secuencias de nucleótidos de las SEQ ID NOS: 43) 44, 45,' 46", 47 ó 48 o un complemento en condiciones "de rigurosidad moderada, pero todavía puede proporcionar una molécula quimera prevista. atggacatcg acccteataa agaatstgga gctactgtgg agt?tactctc gtettfcgeet SO tctgacctot ttccttcagt acgagatatt ctagataccg actcagctcc gtaccgggaa 120 gccttagagt ctcctgagca ttgttcacct caccatactg cactcacgca agcaattctt 180 tgotgggggg aaeeaatgac tctagctacc tgggtgggtg ttaafcttgga agatccagcg 240 tctag&gacc tagMgbca tbatgtcaac actaacatgg gcccaaagtt caggcaactc 300 btgtggtfctc acacttcttg tctcactttt ggaagagaaa cagptafcsga statctggtg 3SO tctttcggac cgtggatccg cactcctcca gcttatagac caccaaatgc •ccctafcocc.a 420 tcaacacfctc cggagaatac cgttgt aga cgscgaggca ggtcccctag aagaagaact 480 ocatcgcctc gcagacgaag gtctcaatcg ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa 540 tctcaacgfc ?BGAYT? 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Más específicamente, también se considera una molécula de DNA recombinante que contiene un vector que contiene un promotor para desencadenar la expresión de la quimera en las células del organismo hospedero ligado de manera operante a un segmento de DNA que define un gen para la porción HBc de una quimera o uña variante de DNA que tenga por lo menos 90% de identidad para el gen de la quimera de las SEQ ID NOS: 43, 44, 45, 46, Al " ó 48 e hibride con este gen en condiciones de rigurosidad moderada.

Además se considera una molécula de DNA recombinante que contenga un vector que contenga un promotor para desencadenar la expresión de una quimera en células de un organismo hospedero ligadas de manera operante a un segmento de DNA que sea una secuencia de ácido nucleico análoga que codifique una secuencia de residuos de aminoácidos de una porción quimera de HBc que sea por lo menos 80% idéntica, más preferentemente 90% idéntica y más preferentemente 95% idéntica a la porción HBc de la secuencia de SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. Esta molécula de DNA recombinante, tras la transfección y expresión convenientes en una célula hospedera, proporcionan una molécula quimera considerada.

Debe entenderse que debido a que la secuencia N-terminal de 30 residuos de aminoácidos de la HBc de la ardilla terrestre no se alinean con ninguna de las otras secuencias de HBc, esta secuencia y sus secuencias de ácidos nucleicos codificantes y sus complementos no están incluidos en los porcentajes de identidad anteriores, ni están las porciones de ácido nucleico que codifican esta secuencia de 30 residuos o su complemento utilizado en determinaciones de hibridación. Del mismo modo, las secuencias que están truncadas en cualquiera o ambos de los N y C-terminales de la HBc no están incluidos en los cálculos de identidad, ni están aquellas secuencias en las cuales los residuos de la asa inmunodominante se quitaron para la inserción de un epitope heterólogo. Asi pues, solo aquellas bases que codifican para HBc o los residuos de la secuencia de HBc que estén presentes en una molécula quimera están incluidos y se comparan con una secuencia de ácido nucleico o residuos de aminoácidos alineada en los cálculos del porcentaje de identidad.

En cuanto a las secuencias codificantes para el gen descrito en la presente se ilustran en las SEQ ID NOS: 43, 44, 45, 46, 47 y 48, los segmentos de ácido nucleico aislados, preferentemente las secuencias de DNA, variantes y análogos de estas pueden prepararse por mutagenesia in vitro, como es bien sabido en la técnica y se describe en Current Protocols in Molecular Biology, Ausabel y col., eds., John Wiley & Sons (New York: 1987) p. 8.1.1-8.1.6, que comienza en el codón ATG inicial para un gen y termina en o justo corriente abajo del codón de terminación para cada gen. Asi pues, un sitio de restricción deseado se puede manipular en o corriente arriba del codón de iniciación, y en o corriente abajo del codón de terminación para que otros genes puedan ser preparados, cortados y aislados.

Como se sabe bien en la técnica, siempre que esté presente el ácido nucleico necesario, como puede ser la secuencia de DNA (incluidas las señales de inicio y terminación) , otras pares de bases pueden normalmente estar presentes en cualquier extremo del segmento y este segmento todavia puede ser utilizado para expresar la proteina. Esto, desde luego, supone la ausencia del segmento de una secuencia de DNA ligadas de manera operante que reprima la expresión exprese otro producto que consuma la enzima que se desea expresar, que exprese un producto, que consuma un producto de reacción deseado, producido por esta enzima, o de otro modo interfiera con la expresión del gen del segmento de DNA.

Asi pues, siempre que el segmento de DNA este libre de estas secuencias de DNA interferentes, un segmento de DNA de la invención puede tener aproximadamente 500 a aproximadamente 15,000 pares de bases de longitud. El tamaño máximo de una molécula de DNA recombinante, particularmente un vector de expresión, se determina principalmente por conveniencia y el tamaño del vector que se pueda acomodar en una célula hospedera, una vez que toda la secuencia de DNA mínimas necesarias para la multiplicación y expresión, si se desea, estén presentes.

Los tamaños mínimos de los vectores son bien conocidos. Tales segmentos de DNA largos no son preferidos, pero es posible utilizarlos.

Los segmentos de DNA que codifican la quimera antes descrita pueden ser sintetizados por técnicas químicas, por ejemplo, el método del fosfotriéster de Matteucci y col., (1981) J. Am . Chem . Soc . , 103: 3185. Desde luego, si se sintetiza químicamente la secuencia codificante, se puede hacer cualquier modificación que se desee simplemente sustituyendo las bases apropiadas por aquellas que codifiquen la secuencia de los residuos de aminoácidos naturales. Sin embargo, los segmentos de DNA que incluyen las secuencias antes descritas son preferidos .

Una quimera de HBc considerada puede producirse (expresarse) en diversos sistemas hospederos transformados, normalmente células hospederas aunque la expresión en sistemas a celulares, in vitro, también esta considerada. Estos sistemas celulares hospederos incluyen, pero no se limitan a, microorganismos como bacterias transformadas con bacteriófago recombinante, vectores de expresión de DNA plásmido o cósmido; levadura transformada con vectores de expresión de levadura; sistemas de células de insecto infectadas con vectores de expresión de virus (por ejemplo baculovirus) ; sistemas de células vegetales transformadas con vectores de expresión de virus (por ejemplo el virus de mosaico de coliflor; el virus de mosaico de tabaco) o con vectores de" expresión bacterianos (por ejemplo el plásmido Ti);' o sistemas de células animales apropiadamente transformados como células CHO ó COS. La invención no se limita por la célula hospedera que se emplee.

Los segmentos de DNA que contienen un gen que codifica la quimera de HBc preferentemente se obtienen de moléculas de DNA recombinante (vectores plásmidos) que contengan ese gen. Los vectores capaces de dirigir la expresión de un gen quimera en la proteina de una quimera de HBc se conoce en la presente como un "vector de expresión".

Un vector de expresión contiene elementos que controlan la expresión que incluyen el promotor. El gen que codifica la quimera esta ligado de manera operante al vector de expresión para permitir que la secuencia promotora dirija la unión de la RNA polimerasa y la expresión del gen que codifica la quimera. Útiles para expresión del gen que codifica el polipéptido son los promotores que son inducibles, virales, sintéticos, constitutivos como se describe por Poszkowski y col., (1989) EMBO J. , 3: 2719 y Odell y col., (1985) Nature, 313: 810, asi como los regulados temporalmente, regulados espacialmente y regulados espacio temporalmente como se da en Chua y col., (1989) Science, 244: 174-181.

Un promotor preferido para utilizarlo en células procariotas como E. coli es el promotor Rec 7 que es inducible por el ácido nalidixico suministrado de manera exógena. Un promotor más preferido esta presente en el vector plásmido JHEX25 (disponible de Promega) que es inducible por isopropil-ß-D-tiogalacto-piranósido (IPTG) suministrado en forma exógena. Un promotor todavía más preferido, el promotor tac, esta presente en el vector plásmido pKK223-3 y también es inducible por IPTG suministrado en forma exógena. El plásmido pKK223-3 puede ser expresado con muy buenos resultados en diversas cepas de E. coli, como la XL-1, TB1, BL21 y BLR, utilizando para la inducción IPTG aproximadamente 25 a aproximadamente 100 µM. sorprendentemente, las concentraciones de aproximadamente 25 a aproximadamente 50 µM del IPTG han proporcionado resultados óptimos en matraces agitadores y termentadores de 2 litros.

La expresión de una molécula quimera contemplada en otros microbios como Salmonella tipo S . tiphi y S. typhimurium y los híbridos S . typhimur ium-E . coli , levaduras como S . cerevisiae o Pichia pastoris, en células de mamífero como las células de ovario de hámster chino (CHO) en células de plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, general y particularmente en organismos de almacenamiento de plantas dicotiledóneas como la raiz, semilla o fruta como puede ser, donde se desee una vacuna o inoculo oral, y en células de insecto como las de S . Frugiperda o Tri chopl usia mediante el uso de virus de poliedrosis nuclear de Autographa california (AcNPV) o baculovirus se describen con detalle en la solicitud precursora antes mencionada asi como en la Patente WO 02/14478 A2 publicada. Estos modos de expresión, aunque están considerados, no se describirán con mayor detalle en la presente.

Se han desarrollado algunos métodos para ligar de manera operante el DNA a los vectores a través de terminales cohesivas complementarias o extremos romos. Por ejemplo, es posible adicionar segmentos de homopolimeros complementarios al segmento de DNA que se insertarían en el DNA vector. El vector y el segmento de DNA entonces se unen por unión de hidrógeno entre las colas homopoliméricas complementarias para formar moléculas de DNA recombinante.

De otro modo, es posible' utilizar ligadores sintéticos que contengan uno o más sitios endonucleasa de restricción para unir el segmento de DNA al vector de expresión, como se menciona en lo anterior. Los ligadores sintéticos se unen a los segmentos de DNA con extremos romos incubando los segmentos de DNA con extremos romos con un exceso de moléculas ligadoras sintéticas en presencia de una enzima que pueda catalizar la ligación de las moléculas de DNA con extremos romos, como puede ser la DNA ligasa del bacteriófago T4.

Asi pues, los productos de la reacción son segmentos de DNA que llevan secuencias del ligador sintético en sus extremos. Estos segmentos de DNA entonces se disocian con la endonucleasa de restricción apropiada y se ligan en un vector de expresión que haya sido disociado con una enzima que produzca terminales compatibles con las del ligador sintético. Los ligadores sintéticos que contienen una variedad de sitios de endonucleasas de restricción están a la disposición en el comercio de diversas fuentes como New England Biolabs, Beverly, MA. Un segmento de DNA que se desee también se puede obtener utilizando la tecnología de la PCR en la que los cebadores de avance y retroceso contiene los sitios de restricción que se desea que se pueden cortar después de la amplificación para que el gen se pueda insertar en el vector. De otro modo, los productos de la PCR pueden ser directamente clonados en vectores que contengan dalientes T (Promega Corp., A3600, Madison Wl) como es bien sabido en la técnica.

La proteina quimérica expresada se autoensambla en partículas dentro de las células hospederas, bien sea en células individuales o en células dentro de un hospedero multicelular. Las células que contienen partículas son cosechadas utilizando procedimientos normalizados, y se lisan las células utilizando una celda de presión French, lisozima, sonicador, golpeador de perlas o microfluidizador (Micorfluidles International Corp., Newton MA) . Después de la clarificación del lisado, las partículas se precipitan con sulfato de amonio al 45%, se resuspenden en fosfato de sodio 20 mM,' pH 6.8 y se dializan contra el mismo buffer. El material dializado se clarifica por centrifugación breve y el sobrenadante se somete a cromatografía de filtración en gel utilizando Sepharose® CL-4B. Las fracciones que contienen partículas se identifican, se someten a cromatografía con hidroxiapatita y se vuelven a precipitar con sulfato de amonio antes de volverlas a suspender, dializar y filtrarlas estériles y almacenarlas a -70°C.

Inóculos y vacunas Un inmunógeno quimera de HBc recombinante antes descrito preferentemente en forma particulada se disuelve o dispersa en una cantidad inmunogénica eficaz de una composición vehículo aceptado para uso farmacéutico que preferentemente sea acuoso para formar un inoculo o vacuna. Cuando se administra a un animal hospedero que necesite inmunización o en el que se desee inducir los anticuerpos, como un mamífero (por ejemplo ratón, perro, cabra, oveja, caballo, bovino, mono, simio o humano) o ave (un pollo, pavo, pato o ganso) , un inoculo induce anticuerpos que inmunorreaccionan con un epitope de células B M2 de influenza A presente en el inmunógeno. En una vacuna, estos anticuerpos inducidos también inmunorreaccionan in vivo con (se unen a) el virus o las células infectadas por virus y protegen al hospedero contra la infección patógena de influenza. Una composición que es una vacuna en un animal puede ser un inoculo para otro hospedero, como cuando los anticuerpos se inducen en un segundo hospedero que no esté infectado por influenza A.

La cantidad del inmunógeno quimera hbc recombinante utilizado en cada inmunización se conoce como una cantidad inmunogénica eficaz y puede variar ampliamente, dependiendo, entre otras cosas, del inmunógeno quimera de HBc recombinante, el hospedero animal inmunizado y la presencia de adyuvante en la vacuna, como se describe más adelante. Las cantidades inmunogénicas eficaces para una vacuna y un inoculo proporcionan la protección o actividad de los anticuerpos, respectivamente, como se describe en lo anterior.

Las vacunas o inóculos normalmente contienen una concentración del inmunógeno quimera de HBc recombinante desde aproximadamente 1 microgramo hasta aproximadamente 1 miligramo por inoculo (dosis unitaria) , y preferentemente cerca de 10 microgramos hasta aproximadamente 50 microgramos por dosis unitaria. Las inmunizaciones en ratones normalmente contienen 10 a 20 µg de las partículas híbridas.

El término "dosis unitaria" cuando pertenece a una vacuna o inoculo de la presente invención se refiere a una unidad físicamente pequeña adecuada como dosis unitaria para animales, cada unidad conteniendo una cantidad predeterminada del material activo calculado para producir en forma individual o colectiva el efecto inmunogénico deseado asociado con el diluyente necesario; es decir, portador o vehículo. Una dosis unitaria individual o una pluralidad de dosis unitarias pueden utilizarse para obtener una cantidad inmunógena eficaz de las partículas inmunógenas quimera de HBc recombinante .

Las vacunas o inóculos normalmente se preparan a partir de una partícula inmunógena quimera de HBc recombinante recuperada dispersando las partículas en un diluyente que se pueda tolerar en el medio fisiológico (aceptable) como agua, salina amortiguada con fosfatos (PBS) , salina amortiguada con acetato (ABS) , solución de Ringer o similares para formar una composición acuosa. El vehículo diluyente también puede contener materiales oleaginosos como aceite de cacahuate, escualano o escualeno como ya se describe más adelante.

El ingrediente inmunógeno activo con frecuencia se mezcla con excipientes aceptados para uso farmacéutico, y compatibles con el ingrediente activo. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, salina, dextrosa, glicerol etanol y similares y combinaciones de estos. Además, se desea, un inoculo o vacuna puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares como humectantes y agentes emulsificadores, agentes amortiguadores de pH que mejoren la eficacia inmunógena de la composición.

Una vacuna o inoculo considerado también contiene ventajosamente un adyuvante. Los adyuvantes adecuados para vacunas e inóculos de la presente invención consisten en aquellos adyuvantes que pueden intensificar las respuestas de los anticuerpos contra epitopes de células B de la quimera, asi como adyuvantes que puedan intensificar las respuestas en las que intervienen células hacia epitopes de células T contenidos en la quimera, si esta presente. Los adyuvantes son bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Vaccine Desiqn - The Subunit and Adjuvant Approach, 1995, Pharmaceutical Biotechnology, Volumen 6, Eds., Powell, M. F., y Newman, M. J. Plenum Press, New York y London, ISBN 0-306-448967-X).

Los adyuvantes ejemplares pueden ser el adyuvante completo de Freund (CFA) que no se utiliza en humanos, el adyuvante incompleto de Freund (IFA) , escualeno, escualeno y alumbre [por ejemplo Alhydrogel™ (Superfos, Dinamarca) ] , los cuales son materiales bien conocidos en la técnica, y están a la disposición en el comercio de varios proveedores.

Los adyuvantes preferidos para utilizarlos con inmunógenos de la presente invención pueden ser sales de aluminio o calcio (por ejemplo sales hidróxido fosfato) . Un adyuvante particularmente preferido para utilizarlo en la presente es un gel de hidróxido de aluminio como Alhydrogel™. Para los geles de hidróxido de aluminio (alumbre) , la proteina quimera se mezcla con el adyuvante para que aproximadamente 50 a aproximadamente 800 microgramos de aluminio estén presentes por dosis, y preferentemente estén presentes cerca de 400 a cerca de 600 microgramos. Las nanoparticulas de fosfato de calcio (CAP) es un adyuvante que se esta desarrollando por Biosante, Inc. (Lincolnshire, IL) . El inmunógeno que interesa puede estar recubierto en el exterior de las partículas, o puede estar encapsulado dentro en el interior [He y col., (Noviembre 2000) Clin . Diagn . Lab.

Immunol . , 7 (6): 899-903].

Otro adyuvante particularmente preferido para utilizarlo con un inmunógeno de la presente invención es una emulsión. Una emulsión posible puede ser una emulsión aceite en agua o una emulsión agua en aceite. Además de las partículas de proteina quimérica inmunógena, estas emulsiones contienen una fase oleosa de escualeno, escualano, aceite de cacahuate o similares como es bien sabido en la técnica, y un agente dispersante. Los agentes dispersantes no iónicos son preferidos y estos materiales pueden ser esteres de ácidos mono- y digrasos de C12-C24 de sorbitan y mannide como monoestearato de sorbitan, monooleato de sorbitan y monooleato de mannide.

Una emulsión que contenga el inmunógeno se muestra como emulsión.

Preferentemente, estas emulsiones son emulsiones agua en aceite que contienen escualeno, glicerol y un tensoactivo como monooleato de mannite (Arlacel™ A) , opcionalmente con escualano, emulsificado con las partículas de las proteínas híbridas en una fase acuosa. La fase oleosa preferentemente contiene cerca de 0.1 a cerca de 10% de la vacuna, y más preferentemente cerca de 0.2 a cerca de 1%. Otros componentes de la fase oleosa pueden ser alfa-tocoferol, di y triglicéridos de cadenas mixtas y esteres de sorbitan. Los ejemplos bien conocidos de estas emulsiones pueden ser Montanide™ ISA-720, y Montanide™ ISA-703 (Seppic, Castres, Francia) , cada una de las cuales se entiende que contienen escualeno y escualano, principalmente en cada una escualeno, pero en menor grado en Montanide™ ISA-703. Más preferentemente, se utiliza Montanide™ ISA-720 y una proporción aceite a agua de 7:3 (p/p). Otros adyuvantes para la emulsión aceite en agua preferidos pueden ser los descritos en WO 95/17210 y EP 0 399 843.

El uso de adyuvantes moléculas pequeñas también esta considerado en la presente. Un tipo de adyuvante molécula pequeña útil en la presente es un derivado de 8-oxo- o 8-sulfo-guanosina sustituida en la posición 7, descrito en las Patentes US No. 4,539,205, 4,643,992, 5,011,828 y 5,093,318, cuyas descripciones se incorporan para referencia. De estos materiales se prefiere particularmente 7-alil-8-oxoguanosina (loxoribina) , esta molécula ha demostrado ser particularmente eficaz para inducir una respuesta especifica del antigeno (inmunógeno) .

Un adyuvante útil y preferido es monofosforil liquido A (MPL®) , 3-deacil monofosfaril lipido A (3D-MPL®) , un adyuvante bien conocido fabricado por Corixa Corp. de Seattle, anteriormente Ribi Immunochem, Hamilton, Montana. El adyuvante contiene tres componentes extraidos de bacterias: monofosforil lipido (MPL) A, dimicolato de trealosa (TDM) y el esqueleto de la pared celular (CWS) (MPL+TDM+CWS) en una emulsión 2% escualeno/Tween® 80. Este adyuvante puede prepararse por los métodos que se enseñan en GB 2122204B. Una forma preferida de monofosforil lipido A 3-de-O-acilado es en la forma de una emulsión que tiene un tamaño de partícula pequeño menor de 0.2 µm de diámetro (EP 0 689 454 Bl) .

Más preferidos son un compuesto de estructura relacionada con el adyuvante MPL® denominado fosfatos de aminoalquilglucosamida (AGP) como pueden ser los disponibles de Corixa Corp con las denominaciones adyuvante RC-529® {sal trietilamonio de 2- [ (R) -3-tetra-decanoiloxitetradecanoilamino] -etil-2-deoxi-4-0-fosfono-3-0- [ (R) -3-tetradecanoiloxitetradecanoil] -2- [ (R) -3-tetra-decanoiloxitetradecanoil-amino] -p-D-glucopiranósido} . Un adyuvante RC-529 está disponible en una emulsión de escualeno comercializada como RC-529SE y en formulaciones acuosas como RC-529AF disponible de Corixa Corp. (ver la Patente US NO. 5,355,257 y 6,303,347; US 6113918 y la publicación US No. 03-0092643).

Otros adyuvantes considerados pueden ser los adyuvantes de oligonucleótidos sintético que contienen el motivo del nucleótido CpG una o más veces (más las secuencias flanqueadoras) disponible de Coley Pharmaceutical Group. El adyuvante denominado QS21, disponible de Aquila Biopharmaceuticals, Inc., es fracciones de saponinas con actividad inmunológica que tienen actividad adyuvante derivada de la corteza de un árbol de Sudamérica Quillaja Saponaria Molina (por ejemplo, Quil™ A) , y el método de su producción está descrito en la Patente US NO. 5,057,440. Los derivados de Quil™ A, por ejemplo QS21 (un derivado de la fracción purificada por HPLC de Quil™ A también conocido como QA21) , y otras fracciones como QA17 también están descritas. Los derivados semi-sintéticos y sintéticos de las saponinas de Quillaja Saponaria Molina también son útiles, como las descritas en las Patentes US No. 5,977,081 y la No. 6,080,725. El adyuvante denominado MF590 disponible de CHiron Corp. esta descrito en las Patentes US No. 5,709,879 y la No. 6,086,901.

También están incluidos los adyuvante del dipéptido de muramilo e incluyen N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thur-MDP) , N-acetil-nor-muramil-L-alanil-D-isoglutamina [CGP 11637, conocido como nor-MDP] , y N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2- (1' -2' -dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi) etilamina [ (CGP) 1983A, conocido como MTP-PE] . Los denominados análogos del dipéptido muramilo " están descritos en la Patente US No. 4,767,842.

Las mezclas adyuvantes preferidas incluyen combinaciones de 3D-MPL y QS21 (EP 0 671 948 Bl) , emulsiones aceite en agua que contienen 3D-MPL y QS21 (WO 95/17210 PCT/EP98/05714) , ED-MPL formulado con otros portadores (EP 0 689 454 Bl) , QS21 formulado en liposomas que contienen colesterol (WO 96/33739) u oligonucleótidos inmuno-estimuladores (WO 96/02555) . El adyuvante es SBAS2 (ahora AS02) disponible de SKB (ahora Glaxo-SmithKline) contiene QS21 y MPL en una emulsión aceite en agua también es útil. Los adyuvantes alternativos pueden ser aquellos descritos en WO 99/52549 y suspensiones no particuladas de polioxietileno éter (solicitud de Patente UK No. 9807805.8) .

El uso de un adyuvante que contenga uno o más agonistas para el receptor -4 tipo toll (TLR-4) como puede ser un adyuvante MPL® o un compuesto estructuralmente relacionado como un adyuvante RC-529® o un mimético del lipido A, solo o junto con un agonista para TLR-9 como puede ser un oligodesoxinucleótido no metilado que contenga el motivo CpG es particularmente preferido.

Estos adyuvantes intensifican la producción de las células T CD 8+, CD 4+ gama-productoras y los linfocitos citotóxicos cuando se mezclan las partículas inmunógenas que contienen HBc contempladas o si se ligan químicamente a un inmunógeno como este. También puede estar presente alum en una mezcla adyuvante como esta. Los resultados iniciales indican que alum tiende a intensificar la respuesta inmunitaria de Th2 que favorece la producción de anticuerpos tipo IgGl, mientras que el adyuvante tiene RC-529 favorece una respuesta inmunitaria Thl que favorece la producción de anticuerpos IgG2a e IgG2b y una respuesta de células T cuando esta presente un inmunógeno de células T, como es el caso cuando las partículas de HBc contienen el inmunógeno.

Una mezcla adyuvante más preferida contiene una emulsión agua en aceite estable además contiene fosfatos de aminoalquilglucosamina como los descritos en la patente US No. 6,111,918. De los fosfatos de amino alquilglucosamina se prefiere más la molécula conocida como RC-529 {sal (2- [ (R) -3-tetra-decanoiloxitetradecanoilamino] -etil-2-deoxi-4-0-fosfono-3-0- [ (R) -3-tetradecanoiloxitetradecanoil] -2- [ (R) -3-tetra-decanoiloxitetradecanoil-amino] -p-D-glucopiranosido trietilamonio) } . Una emulsión agua en aceite preferida esta descrita en WO 9956776.

Los adyuvantes se utilizan en una cantidad adyuvante que puede variar con el tipo de adyuvante, el animal hospedero y el inmunógeno quimera de HBc recombinante. Las cantidades comunes pueden variar desde aproximadamente 1 µg hasta aproximadamente 1 mg por inmunización. Los expertos en la técnica saben que es posible determinar fácilmente las concentraciones apropiadas o las cantidades apropiadas.

Los inóculos y vacunas se administran normalmente por via parenteral, por inyección, por ejemplo, por via subcutánea o intramuscular. Otras formulaciones con son convenientes para otros modos de administración puede ser supositorios y, en algunos casos, formulaciones orales o por roció nasal. Para los supositorios es posible incluir los aglutinantes y portadores tradicionales, por ejemplo polialquilenglicoles o triglicéridos; tales supositorios pueden formarse de mezclas que contengan el ingrediente activo en el intervalo de 0.5 hasta 10%, preferentemente 1-2%. Las formulaciones orales incluyen los excipientes normalmente empleados como puede ser, por ejemplo los grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, ' celulosa, carbonato de magnesio y similares.

Una composición de inoculo o vacuna toma la forma de una solución, suspensión, tableta, pildora, cápsula, formulación o polvo de liberación sostenida, y contiene una cantidad inmunogénica eficaz de la quimera HBc, preferentemente como partículas, como ingrediente activo.

En una composición común, una cantidad inmunogénica eficaz de las partículas HBc quimera preferidas es aproximadamente 1 µg hasta aproximadamente 1 mg del ingrediente activo por dosis, y más preferentemente cerca de 5 µg hasta aproximadamente 50 µg por dosis, como ya se menciono .

Una vacuna o inoculo normalmente se formula para administración internasal (IN) o parenteral. Las inmunizaciones ejemplares se llevan a cabo por via subcutánea (SC) intramuscular (IM) , intravenosa (IV) , intraperitoneal (IP) o intradérmica (ID) .

Las partículas HBc quiméricas y los conjugados de las partículas HBc quiméricas pueden formularse en la vacuna como formas neutras o salinas. Las sales aceptadas para uso farmacéutico, incluidas las sales de adición acida (formadas con los grupos amino libres ' de la proteina o hapteno) y se forman ácidos inorgánicos como por ejemplo ácidos clorhídrico y fosfórico, o ácidos orgánicos como el ácido acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales que se forman con los grupos carboxilo libres también pueden ser obtenidas de bases inorgánicas como hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férricos, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaina y similares.

Los inóculos o vacunas se administran en una forma compatible con la formulación de dosificación, y en cantidades tales para que sean terapéuticamente eficaces e inmunogénicas (una cantidad inductora de anticuerpos o cantidad protectora, según se desee) . La cantidad que se administrarla depende del individuo de que se trate, la capacidad del sistema inmunitario del individuo para sintetizar los anticuerpos y el grado de protección que se desee. Las cantidades precisas del ingrediente activo necesario para administrarse depende del criterio del médico y son especificas para cada individuo. No obstante, los intervalo de dosificación convenientes son en el orden de algunos cientos de microgramos del ingrediente activo por individuo. Los esquemas convenientes para la administración inicial ' y los refuerzos también son variables, pero se tipifican por una administración inicial seguida en intervalos (semanas o meses) por una inyección posterior u otra administració .

Una vez inmunizado, el animal hospedero se mantiene durante un tiempo suficiente para que el inmunógeno HBc quimera recombinante desencadene la producción de un titulo suficiente de anticuerpos que se unan a la proteina M2. El tiempo de mantenimiento para la producción de los anticuerpos contra M2 normalmente tarda un tiempo de aproximadamente 3 a aproximadamente 12 semanas, y puede incluir un refuerzo, una segunda administración inmunizadora de la vacuna. También se considera una tercera inmunización, según se desee, en un tiempo de varias semanas a 5 años después de la primera inmunización. Se contempla especialmente que una vez que se alcance un titulo de anticuerpos a nivel de protección, el animal hospedero vacunado preferentemente se mantiene en o cerca de este titulo de anticuerpos mediante inmunizaciones de refuerzo periódicas administradas en intervalos de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 años.

La producción de los anticuerpos se comprueba fácilmente teniendo una muestra de plasma o suero del hospedero inmunizado y analizando los anticuerpos en la muestra por su capacidad para unirse a un antigeno polipéptido M2 sintético en un ensayo ELISA como se describe más adelante o por otro inmuno ensayo, como puede ser el análisis Western blot como es bien conocido en la técnica.

Debe señalarse que los anticuerpos anticuerpos antes descritos asi inducidos se pueden aislar de la sangre del hospedero utilizando técnicas bien conocidas, y luego pueden reconstituirse en una segunda vacuna para inmunización pasiva como se sabe muy bien. Se utilizan técnicas similares para inmunizaciones de gama-globulinas en humanos. Por ejemplo, el antisuero de uno o diversos hospederos inmunizados puede ser precipitado en sulfato de amonio acuoso (normalmente al 40-50% de saturación) , y los anticuerpos precipitados se purifican por cromatografía, como puede ser mediante el uso de cromatografía de afinidad en la que se utiliza el polipéptido M2 como el antígeno inmovilizado sobre la columna cromatográfica.

Los inóculos son preparados que son prácticamente idénticos a las vacunas, pero se utilizan en un animal hospedero en el que se desea inducir anticuerpos para influenza, pero en los cuales no se desea protección contra influenza.

Se considera que una persona experta' en la técnica puede, utilizando la descripción anterior y los ejemplos que se detallan más adelante, utilizar la presente invención en su alcance más amplío. Las siguientes modalidades específicas, preferidas, son por tanto, consideradas solo como ilustrativas y no para imitar el resto de la descripción en ningún sentido.

Ejemplo 1: Preparación de la quimera que contiene el epitope de células B A. Preparación del vector plásmido pKKK223- 3N, una forma modificada de PKKK223-3 El vector plásmido pKKK223-3 (Pharmacia) se modificó por establecimiento de un sitio de restricción único Ncol para habilitar la inserción de los genes de HBc como fragmentos de restricción NcoI-HindIII y la expresión posterior en células hospederas de E. coli . Para modificar el vector plásmido pKKK223-3, se preparó un nuevo fragmento Sphl-HindIII utilizando los cebadores de PCR plásmido pKKK223-3/433-452-F y plásmido pKKK223-3NcoI-mod-R, y como modelo plásmido pKKK223-3.

Este fragmento de PCR fue cortado con las enzimas de restricción Sphl y HindIII para obtener un fragmento de 467 pares de bases que fue luego ligado con uñ fragmento de 4106 pares de bases del vector plásmido pKKK223-3, sustituyendo efectivamente el fragmento de Sphl-HindIII original de 480 pb. El plásmido resultante (plásmido pKKK223-3N; de 45 a 73 pb) es, por tanto, 13 pb más corto que el plásmido precursor y contiene la secuencia de nucleótidos modificada corriente arriba del sitio Ncol introducido (ver Figura 2 en la que las rayas indican las bases ausentes) . Los sitios de restricción en el plásmido pKKK223-3N están indicados en la Figura 2 y los cambios de nucleótidos hechos al plásmido precursor pKKK223-3 están indicados por un subrayado como se muestra a continuación . pKK223~3/433-452-F GGTGCATGCAAGGAGATG SEQ ID NO: 49 pKK223-NcoI-mod-R GCGAAGCTTCGGATCccatggTTTTTTCCTCCTTATGTGAAATTGTTATCCGCTC SEQ ID NO: 50 B. Preparación de los vectores de clonación V2, V16 y V8 Los genes de HBc 149 (V2 y V16) o HBc 183 (V8) modificados, capaces de aceptar la inserción direccional de los fragmentos sintéticos de dsDNA en la región de la asa inmunodominante, se construyeron utilizando la PCR. (el plásmido aceptor de las inserciones entre D78 y P79 y truncado para V149 fue nombrado V2, el mismo plásmido con una cisteina adicional luego de V149 fue nombrado V16, y el plásmido aceptor de inserciones entre D78 y P79 y terminando en C183 fue denominado V8) . Los genes de HBc 149 y HBc 183 fueron amplificados en dos mitades utilizando dos pares de cebadores de PCR, uno de los cuales amplifica el amino terminal y el otro amplifica el carboxilo terminal. Para V2, los productos de las reacciones de la PCR son un fragmento de 249 pb (N-terminal) y uno de 243 pb (C-terminal) ; para VI6, los productos son un fragmento de 249 pb (N-terminal) y uno de 246 pb (C-terminal); para V8, los productos son un fragmento de 249 pb (N-terminal) y uno de 349 pb (C-terminal) .

Los fragmentos N-terminales preparados fueron digeridos con Ncol y EcoRI y los fragmentos C-terminales fueron digeridos con EcoRI y HindIII. Los pares de fragmentos V2, VI6 y V8 fueron entonces ligados entre si en las salientes EcoRI comunes. Los fragmentos Ncol-HindlII resultantes fueron luego ligados en el vector pKKK223-3N que habia sido preparado por digestión por Ncol y HindIII.

Para insertar epítopes de células B en los plásmidos V2, V16 y V8, el plásmido apropiado fue digerido con enzimas de restricción EcoRI y Sacl. Luego se insertaron los fragmentos sintéticos de dsDNA que contenían las salientes EcoRI 5' y Sacl 3' . En todos los casos, V2, vi6 y V8, los pares de aminoácidos glicina-isoleucina (EcoRI) y ácido glutámico-leucina (Sacl) , flanquean los epítopes de células B insertados. Los sitios de restricción insertados se subrayan en los cebadores siguientes.

V2 HBcX49/?ScoI-F 5 ' ^^QGGQCA GQ CA C ACCC'?' EQ ID NO .-51 HBc-D7ß/BcaRI-R 5 ! "GGGG CCA CT CCaaH Aa.CACCC&C SEQ 13 MOÍS2 KBe-P79/ScoRI-SacI-P SEQ ID HO.S3 5 ' -C<^?AQCT ^ 7 ?GTAQTC CCGß&AG SEQ ID NO: 54 Vl€ 5 r -TTGGSCC&TGG?CATCGACCCTTA SEQ ID NO: 51 HBc~D7 /Eco I-R 5 » -GCG ^ TCC?ÍCT CCaAA AACk CCAC SBQ ID NOr52 HBc- S79/Ec I - Sasl -F 5 ' -CQCG-^^CAAAM.GAgCTCCC?GCGTCT AGACCTAG SEQ ID NO: 53 S ! -CC3CA GCTTACrA<-ÍCAaAC ?CAGTAG C CGGGAa.G SEQ ID NO: 55 ¥8 HSsl45 lTcoI-F 3 ' -GGGCCAl^AC&TCGACCCTTA SEQ ?D HO:51 K C- 78/?coRI-R 5 ' "GCGGAATTCCATC TCCAAAT'GAACACCCAC SBQ ID M0:S2 E c-P7 /E!s RI -Sßtsl -F 5 ' -CGCGAA O;C&AA?ÍAGAGC CCCAGGGTCTAGA0ACCGAG SEQ ID NO i 53 HBcl83/RípdIXX~R S'-GOAAAgCTTAC AACA TGAGA TCCCG SEQ ID KOt56 C. Preparación de los vectores de clonación V34 y V55 Los genes de HBc 149 modificados, capaces de aceptar la inserción direccional de los fragmentos sintéticos de dsDNA en la región N-terminal, 5' para la secuencia prenúcleo LGWLWG, fueron construidos utilizando PCR. (El plásmido que codificó una secuencia de HBc terminando en V149 fue denominado V34, mientras que el plásmido que codificó una secuencia de HBc que alberga una cisteina adicional, C-terminal para V149, .fue denominado V55.) El gen de HBc 149 fue amplificado en dos mitades utilizando dos pares de cebadores para PCR, uno que amplifica el amino terminal, el otro amplifica el carboxilo terminal. Para V34, los productos de las reacciones de la PCR fueron un fragmento de 293 pb (N-terminal) y un fragmento de 484 pb (C-terminal) ; para V55, el mismo fragmento N-terminal se utilizó y se preparó un fragmento C-terminal de 490 pb.

El fragmento N-terminal -preparado por PCR fue digerido con Ncol y Sacl, y los fragmentos C-terminales fueron digeridos con Sacl y" HindIII. Los pares de fragmentos V34 y V55 fueron luego ligados entré sí en los salientes Sacl comunes. Los fragmentos NcoI-HindIII resultantes fueron luego ligados en el vector pKKK223-3N que había sido preparado por digestión con Ncol y HindIII.

La inserción que contenia el epitopes de células B fue llevado a cabo por un procedimiento llevado a cabo idéntico al antes descrito para los vectores de clonación V2, VI6 y V8. Los sitios de restricción se subrayan en los cebadores oligonucleótidos siguientes. pKK-Bapü-II-F 5 ' "GCGGGA CCGGAGCTTA'TCGA SEQ ID ?Q-. 57 HB?NcoI /BeoRl / Sac I - R B ' -GCGGA CTCT T TG A 2^CA GGT :,rT?SlCC CC? A SSQ ID NO: 58 Pr©C- Sacl -HBc- 5 * "GCGGAGCTCCTTGOGTGGCTT GQGGCA'l'l-'GACATCGACCCT A A^AG SEQ lO KO Í59 V34 HB 14 /HindI 11 - R S'-CaCAAGC AAACAACAG AGTeX'CCGGAAG SSQ ID NO: 54 V55 S ' -CGCA GCT ACTAGCAAACAACAG AG C CCGGAAG SEQ ID NO i 55 D. Preparación de los vectores de clonación V47, V48 y V54 Los genes de HBc 149 y HBc 183 modificados, capaces de aceptar la inserción direccional de los fragmentos sintéticos de dsDNA en la región N-terminal entre los residuos de aminoácidos 12 y D4 fueron construidos utilizando PCR. (el plásmido que codifica una HBc quimera terminando en V149 fue nombrado V47, el plásmido que codifica una HBc quimera albergando una cisteína adicional, C-terminal para V149, fue nombrado V54, y el plásmido que codifica una HBc quimera terminando en C183 fue denominado V48) . Para V47, V48 y V54, se utilizo el par de cebadores para PCR para amplificar el fragmento amino terminal desde la plantilla HBc 149, incluida una secuencia que precede el gen de HBc. Los fragmentos de la PCR resultantes tienen 190 pb. Para el fragmento C-terminal de V47, el gen de HBc fue amplificado utilizando un cebador de PCR dando como resultado un fragmento de 469 pb; para V54, el fragmento C-terminal tiene 475 pb. El C-terminal de V48, el gen de HBc 183 fue amplificado utilizando un par de cebadores de PCR, obteniéndose un fragmento de 574 pb.

El procedimiento de clonación utilizado para este punto fue idéntico al descrito antes para los vectores de clonación V34 y V55.

Para insertar secuencias heterólogas en los plásmidos V47, V48 y V54, los plásmidos fueron primero digeridos con enzimas de restricción Ncol y Sacl. Los fragmentos sintéticos de dsDNA que contenían las salientes Afllll 5' y Sacl 3' fueron luego insertados (nota, las enzimas de restricción Afllll y Ncol dejan salientes compatibles) . En todos los casos, V47, V48 y V54, los residuos de dos y tres HBc fueron delesionados para que la secuencia inmunógena heteróloga siga directamente el residuo Ml; los pares de aminoácidos ácido glutámico-leucina (EL) , codificados por el sitio de restricción Sacl, siga el epítope insertado. Los sitios de restricción insertados están subrayados en los cebadores oligonucleótidos siguientes.

V47/V48/V54 pKR{3.67~ l50) -F 5 ' -GCATAA CG Q CGC C SEQ ID SO . 60 5 ' "QCGG?A CGATGTCCATGG T TTCC SEQ ID 130 ? 61 HBc~EeoRI/SacI/D4 ~F 5 * "GCGG^T CAAAi^GA.GC CGAGCC ATAAAGAA TTGGA QEQ XD > : 62 V47 HBcl49/HindI?I-R S * -CGCAAGGT AAACAACAGTAGTC?CCGGAAG SEQ ID NOi 54 V5 HBcl d+C/Hi?idXXI -R 5' "C C ^CAGC Íi C ?C T G C CCGAAG V 8 HBcl83/Kln i?I-R 5* -GGAAAGC TACTAACAT AGA TCCCG SEQ ID ;56 E. Preparación del vector de clonación V7 Para permitir la fusión de los epítopes de células T al C-terminal de la HBc quimera, se construyo un nuevo vector, V7. Los sitios de restricción únicos de EcoRI y Sacl fueron insertados entre valina-149 y el sitio HindIII para facilitar la inserción direccional de los fragmentos sintéticos de los dsDNA en los sitios de restricción EcoRI-HindIII ó EcoRI-SacI. El par de cebadores de PCR que se presentan más adelante se utilizaron para amplificar el gen de HBc 149 con un sitio de restricción Ncol en el amino terminal y EcoRI, los sitios Sacl y HindIII en el carboxilo terminal. El producto de la reacción PCR (479 pb) fue digerido con NcoI/HindIII y se clonó en pKKK223-3N para formar V7.

Para insertar los epitopes de células T,- el plásmido (V7) fue digerido con EcoRI/HindIII (o EcoRI-SacI) y los fragmentos sintéticos dsDNA que tenían EcoRI/HindIII (o EcoRI/SacI) salientes, fueron ligados en V7. Para todas las construcciones V7, el aminoácido final de la HBc natural (valina-149) y el primer aminoácido del epítope de células T insertadas se separan mediante una secuencia de dipéptidos glicina-isoleuciná codificada por los nucleótidos que forman el sitio de restricción EcoRI .

Para los epitopes insertados en EcoRI/SacI, hay otros residuos de ácido glutámico-leucina después del '- epitope de células T, antes del codon de terminación,' 'en el que contribuye el sitio Sacl. Los sitios de restricción otra vez están subrayados en los cebadores que se muestran.

HBsl49/NcoI-F 5 ' -TTGGGCCATGGACATCGACCCTTA SEQ ID NO:51 KBcl49/SacI-EcoRI~H3-R 5 ' -CGCAAGCTTAGAGCTCT GAATTCCAACAACAGTAGTGTCCG ' " SEQ ID NO: 63 F. Sintesis de los vectores de expresión para expresar partículas parcialmente truncadas Para generar plásmidos de expresión para partículas HBc truncadas, se utilizó un cebador de PCR oligonucleótido amino terminal único en combinación con un cebador C-terminal único. Por ejemplo, para generar el plásmido de expresión HBc 156 (E.cR), se utilizaron los cebadores HBc 149/NcoI-F y HBc 156 (E.cR)-H3-R. Para generar los plásmidos de expresión HBc 156 (E.cR)-C se utilizaron los cebadores HBc 149/NcoI-F y HBc 156C (E.cR)-H3-R. Además de truncar las partículas —y en algunos casos incorporar un residuo de c'isteina C-terminal— también es posible utilizar codones que sean óptimos para la expresión en E. coli . Para permitir la sustitución secuencial de los codones de arginina raros encontrados en la secuencia de HBc natural, primero se sintetizo el gen de HBc 156, luego se utilizó como modelo para las construcciones de HBc 163; luego se utilizo la construcción de HBc 163 co o modelo para las construcciones de HBc 171. Las secuencias de todos los cebadores utilizados se muestran más adelante. Todos los productos de la PCR fueron disociados con enzimas de restricción en Ncol y HindIII y se clonaron en el vector de expresión pKKK223-3N, que habia sido cortado con las mismas enzimas.

HBcl49/NcsI-F 51 "TTGGGCCATGGACATCGACCCTTA SEQ ID NO:51 HBclS6(?.cR)-H3~Pv 5 ' -GCG GCTTACTAAGGGGAGCGGCCTCGTCGACGAACAACAGTAGTCTCCGG SEQ ID NO: 64 HBel56C{E.cR)-H3-R 5 ' -GCGAAGCTTACTAACAAGGGGAGCGGCCTCGTCGACGAACAACAGTAGTCTCCGG SEQ ID KQ:65 HBCl63(E.cR)-H3-R 4 5 ' -GCGAAGC TACTAAGGCGAGGGAGTGCGCCGACGAGGGGAGCGGCC CG SEQ ID NO: 66 HBC163C (E . CR) -H3 -R 5 ' -GCG AGCTTACTAACAAGGCGÍ^GGGAGTGCGCCGACGAGGGGAGCGGCCTCG SEQ ID NO: 67 HBcl71(E,cR}-H3-R 5 ' -GCGAAGCtTACTACGGCGATTOAGAGCG CGAGGGCGAGGGGAGGGAGT SEQ ID NO: 68 HBcl71C E.cR}-H3-R S ' -GCG^GCTTACTAACACGGCßAT GAGAGGGTCGACGGCGAGGCGAGGGAGT SEQ ID 170:69 Ejemplo 2: Preparación de las quimeras que contienen las secuencias del polipéptido M2 de influenza A A. Inserción del dominio N-terminal de influenza A en los vectores de clonación V2, V7, V8, V16, V34, V47, V48, V45 y V55 Para las construcciones de V2, V7, V8, V16, V34, y V55, los fragmentos sintéticos de dsDNA que codifican para una secuencia M2e (residuos 2-24 de la proteina M2 de influenza A; SEQ ID NO: 9) fueron insertados en los sitios de restricción EcoRI/Sac!, mientras que para las construcciones de V47, V48 y V54, los residuo's 1-24 de la misma fueron insertados en los sitios de restricción Ncol/Sacl. Se prepararon los fragmentos sintéticos de dsDNA mezclando oligonucleótidos de DNA monocatenarios, complementarios, en concentraciones equi olares, calentado a 95°C durante 5 minutos, y luego enfriando a temperatura ambiente a una velocidad de -1°C por minuto. Esta reacción de hibridación se hizo en buffer TE. Los DNA bicatenarios se muestran a continuación con la secuencia epítope codificada antes mostrada.

V2/V7/VB/V16/V34/V55 M2{2-24) I S L T B V E T P I R N E W G C R AATTAGCCTGTTAACCGAAGTGGAGACGCCGATCCGTAACGAATGGGGCTGCCG TCGGACAATTGGCTTCACC CTGCGGCTAGGCATTGCTTACCCCGACGGC C W D S S D ? 1 SEQ ID NO: 70 CTGTAATGATTCTTCCGACGAGCT SEQ ID NO: 71 GACATTACTAAGAS.GGC GC SEQ ID NO: 72 V 7 V48/V54 2(l-24) M S 1 L T E V 3? T P I R ?T E W G C R CATGTCTCTGGTGACCGAAGTTGAAACCCCTATCAGAAACGAATGGGGGTGCAGA AGAGACGACTGGCTTCAACTTTGGGGATAGTCTTTGCTTACCCCCACGTCT C N D S S D E L SEQ ID NO: 73 TGTAACGATTCATAG GATSAGCT SEQ ID NO: 74 B. Inserción de los dominios N-terminales [M2 (1-24/C17S), M2 (1-24/C19S)] de M2 de influenza A con mutación de cisteina en el vector de expresión V47 Los fragmentos de DNA hibridazos que codifican los residuos 1-24 de la proteina M2 con la cisteína en cualquier posición 17 o 19 mutada a serina se muestran a continuación. Estos fueron insertados en los sitios de restricción Ncol/Sacl de V47 como se describe en la parte A anterior. V 7 M S L T E V E T P I R N E W G S R CATGTCTCTGCTGACCGAAGTTGAaACCCCTATCAGAAACGAATGGGGGTCTAGA AGAGACGACTGGCTTCAACTT GGGGATAGTCrTTGCTTACCCCCAGATCT C N D S S D E L SEQ ID NO: 7 S N D S S D E L SEG ID NO: 79 TCGAACGATTCAAGTGATG&GCT SEQ ID NO: 80 AGCTTGCTAAGTTCACTAC SEQ ID NO: 81 C. Inserción del dominio [M2 (1-24/C17S, C19S)] N- terminal de M2 de influenza A con mutación de cisteína en el vector de expresión V8, V16, V47, V48 y V54 Para las construcciones de V8 y V16, los fragmentos sintéticos dsDNA que albergaban dos mutaciones de cisteína a serina y codificando para la secuencia inmunógena de M2e (los residuos 2-24 de la proteina M2 de influenza A) fueron insertados en los sitios de restricción EcoRI/SacI, mientras que para las construcciones de V47, V48 y V54, los residuos 1-24 de la misma fueron insertados en los sitios de restricción Ncol/Sacl. Se prepararon los fragmentos sintéticos de dsDNA como se describe en la parte anterior. - Vß, VI ß M2 (2-24/Cl7S,C19S) I S T E V E T P I R N E W G S R AATTTCTCTGTTAaCCGAAG GGAGACGCCGA TCGTAACGAATGGGGTAGCCGG AGAGACAATTGGCTTCACCTCTGCGGCTAAGCATTGCTTACCCCATCGGCG S N D S S D E L SEQ ID NO: 82 TCTA?TGATAGCTCTCACGAGCT SEQ ID NO: 83 AGATTACTATCGAGACTGC SEQ ID NO: 84 M2(l-24/C17S,C19S) M S L L T E V E T P I R N E W G S R CATGTCTCTGCTGACCGA?GTTGAaACCCCT?TCAGAA?CGAATGGGGGTCTAGA AGAGACGACTGGCTTCAACTTTGGGGATAGTCTTTGCT ACCCCCAGATCT TCGAACGATTCñAGTGATGAGCT SEQ ID NO: 86 AGCTTGGTAAGTTCACTAC SEQ ID NO: 87 D. Inserción de copias adicionales del dominio del N- terminal de M2 de influenza A sobre el N-terminal del vector de expresión V54.M2 (1-24) Una copia adicional de la secuencia natural M2 [M2 (1-24)] o la secuencia M2 mutada (M2 (1-24/C17S, C19S) se clono en el N-terminal a la secuencia M2 (1-24) existente. Durante la construcción de estos clones, se elimino la metionina original, de modo que la copia adicionada suministrada solo una metionina iniciadora. Se utilizó la PCR para preparar las construcciones en dos fragmentos. Para hacer el clon que contenia dos copias de M2 natural [M2 (1-24) /V54.M2 (2-24) ] , se utilizó el modelo V54.M2 (1-24) para amplificar primero el fragmento N-terminal, el cual se inserta en un sitio Xhol y por tanto, los aminoácidos leucina seguido por ácido glutámico) después del D24 de la secuencia M2 (del fragmento resultante es de 353 pb) , luego el fragmento C-terminal que se inserta en un sitio Xhol N-terminal para S2 de la secuencia M2, eliminando con ello la metionina (fragmento resultante es de 538 pb) . Para preparar el clon que contenía un mutante, seguido por una copia natural de M2 [M2 (1-24/C17S, C19S/V54.M2 (2-24)]), se utilizo el modelo V54.M2 (1-24/C17S, C19S) para generar el fragmento N-terminal, mientras que el fragmento C-terminal es idéntico al anterior (también son idénticos los tamaños de los fragmentos resultantes).

Los fragmentos N-terminales preparados fueron digeridos con BamHI y Xhol, y el fragmento C-terminal fue digerido con Xhol y HindIII.

Los pares de fragmentos fueron luego ligados entre sí en las salientes Xhol comunes. Los fragmentos BamHI-HindlII resultantes fueron luego ligados en el vector pKKK223-3N, el cual había sido preparado por digestión con BamHI y HindIII.

Dos copias adicionales de la secuencia M2 mutada fueron clonados en el N-terminal a la secuencia M2 (2-24) existente. Otra vez, solo se conservó una metionina iniciadora en la posición 1 del gen para producir la construcción M2 (1-24/C17S, C19S/M2 (2-24/C17S, C19S/V54.M2 (2-24). De nuevo el clon fue producido en dos fragmentos de PCR. El modelo V54.M2 (1-24/C17S, C19S) se utilizo para generar el fragmento N-terminal, el cual se inserta en un sitio PstI (y, por tanto, los aminoácidos leucina, seguido por glutamina) después del residuo D24 de la secuencia M2 mutante (fragmento resultante de 353 pb) . El modelo M2 (1-24/C17S, C19S/V54.M2 (2-24) anterior fue utilizado para generar el fragmento C-terminal, el cual se inserta en un sitio PstI -N-terminal para S2 de la secuencia M2 mutante, quitando con esto la metionina (fragmento resultante de 613 pb) .

El fragmento N-terminal preparado fue digerido con BamHI y PstI, y el fragmento C-terminal fue digerido con PstI y HindIII.

Luego los pares de fragmentos fueron ligados entre sí en los salientes PstI comunes. El fragmento BamHI- HindlII resultante fue luego ligado en el vector pKKK223- 3N, el cual habia sido preparado por digestión con BamHI y HindIII.

M2 {1-24 ) /V5 , 2 (2-24) ; M2 (1-24/C17S, C19S/V5 .M2 (2-24) pKK-BaraHX-F 5 ' -CGTAGAGGATCCGGAGC TATCGACTGCACGG S?Q ID NO: 88 5 • -GCGCTCGAGATGACTTGAATCGTT SEQ ID NO: 89 5 ' - GCGCTCGAGAGCTTATT-Gi?CCGi?AGTTGAAACC SEQ ID NO : 90 HBC149+C/Hindlll-R 5 ' -CGC JAGCT ACTAGCAAACAAGAGTAGTCTCCGGAAG SEQ ID NO: 55 A M2 (1-24/C17S, C19S) /M2 Í2-24/C17S, C19S) /V54.M2 (2-24) pKK-BamHI-F S ' -CGTAGAGG CCGGAGCTTATCGACTGCACGG SSQ ID NO:57 5' -GCGCTGCAGATCACTTGAATCGTT SEQ ID HO: 91 M2~PstI/S2-F 5 ' -GCGCTGCAGTCTCTGCTGACCGAAG SEQ ID NO: 92 HBcl49+C/HindIII~R 5 ' -CGC AGOTACTAGCAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG SEQ ID NO: 55 E. Construcción de la versión truncada de M2-HBc natural La construcción original M2-HBc [Neirync y col., (octubre 1999) Nature Med. , 5 (10): 1157-1163: WO 99/07839] que contenía el residuo 183, la secuencia de HBc de longitud completa se truncó a V149, y todo el gen se movió al vector de expresión pKKK223-3. Para lograr esto, el plásmido 3454, que fue provisto por la universidad de Gent, se utilizó como modelo para una reacción PCR que produjo un producto de 523 pb. Este producto fue digerido con enzimas de restricción Afllll y HindIII, y luego se ligó en el vector pKKK223-3N, que habia sido preparado por digestión con Ncol y HindIII.

AfllII-M2-F 5' -CGCGACATGTCTCTGCTGACCG SEQ XD NO : 9' HBcl49 -Hi?ldIII~R 5 ' -CGCAAGCTTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG SEQ ID NO : 5- Ej< coi (b. los pozos ae tiras o piacas I-JIÍJ? u pu-i/pozo ras tiras de ELISA fueron incubadas a temperatura ambiente durante la noche (aproximadamente 18 horas) . La mañana siguiente, los pozos fueron lavados con el buffer de lavado ELISA [salina amortiguada con fosfato (PBS), pH 7.4, 0.05% de Tween 20®] y se bloquearon con 3% BSA en PBS durante 1 hora (75 µL/pozo) . Las tiras ELISA fueron almacenadas, secas, a -20°C hasta su uso.

Para determinar la antigenicidad de las partículas, los antisueros fueron diluidos utilizando 1% de BSA en PBS y se adicionaron 50 µL/pozo a los pozos ELISA recubiertos con el antígeno. Los sueros fueron incubados durante 1 hora, se lavaron con el buffer de lavado ELISA (anterior) y se sondearon utilizando un conjugado (IgG)-HRP antiratón (The Binding Site, San Diego CA; HRP = peroxidasa de rábano) (50 µL/pozo) u otro anticuerpo secundario apropiado durante 30 minutos. Después de lavar con buffer de lavado ELISA, la reacción se observo por la adición del sustrato azul de TM (50 µL/pozo) . Después de 10 minutos se interrumpió la reacción por adición de H2S0 1N (100 µL/pozo) y se leyó en un lector de placas ELISA ajustado a 450 nm. 2. ELISA del péptido sintético ün péptido sintético de 24 residuos de aminoácidos M2 ser diluyó a una concentración de 2 µg/mL) en buffer de recubrimiento (bicarbonato de sodio 50 mM, pH 9.6) y se recubrió en los pozos de las tiras ELISA (50 µL/pozo) . Los péptidos se secaron en los pozos incubando durante la noche (aproximadamente 18 horas) en una campana con el escape encendido. A la mañana siguiente, los pozos se lavaron con buffer de lavado ELISA (salina amortiguada con fosfato, pH 7.5, 0.05% de Tween 20®) y se bloquearon con 3% de BSA en PBS (75 µL/pozo) durante 1 hora. Las tiras ELISA se almacenaron, secas, a -20°C hasta que se utilizaron.

Para determinar la unión de las partículas al anticuerpo, los antisueros (monoclonales o policlonales) se diluyeron utilizando 1% de BSA en PBS y 50 µL/pozo se adiciono a los pozos de ELISA recubiertos con el antigeno. Los sueros se incubaron durante 1 hora, se lavaron con el buffer de lavado ELISA y se sondearon utilizando un conjugado (IgG)-HRP antiratón u otro anticuerpo secundario (como el anterior a 50 µL/pozo) durante 30 minutos, se lavó otra vez con el buffer de lavado ELISA y luego se observó mediante la adición de azul TM (50 µL/pozo) u otro sustrato adecuado. Después de 10 minutos se termino la reacción por la adición de H2S04 1N (100 µL/pozo) y se leyó en un lector de 'placas ELISA ajustado a 450 nm.

B. Inmunogenicidad de las partículas Para ensayar la inmunogenicidad de las partículas, los ratones fueron inmunizados, IP, con 10 µg de partículas en el adyuvante de elección, y luego se reforzaron una o dos veces en intervalos de 3 semanas con 10 µg del mismo adyuvante. Los ratones fueron sangrados antes y a las 2, 4, 6 y 8 semanas después de cada inmunización.

Ejemplo 4. Determinación de las relaciones de absorbanciá 280:260 Para terminar la relación de la" absorbancia 280:260 de las partículas purificadas, las partículas fueron diluidas a una concentración de aproximadamente 0.1 mg/mL en buffer de fosfato de sodio 20 mM, pH 6.8, y los valores de la absorbancia se determinaron a las longitudes de onda de 260 y 280 nm. La absorbancia medida a 280 nm fue dividida entre el valor a 260 nm para determinar la proporción 280:260. Las proporciones fueron obtenidas para varias muestras, incluidas las partículas naturales (HBc 183) , las partículas HBc y truncadas después de la posición del residuo 149 (HBc 149) y algunas HBc quimeras que se identifican en otra parte de la presente, se muestran más adelante en la Tabla 1. Las partículas de longitud completa ICC-1559 son una preparación de las partículas que se documentaron primero en Neirynk y col., (octubre 1999) Nature Med. , 5 (10): 1157-1163 y la solicitud de Patente WO 9907839, mientras que las partículas de longitud completa ICC-1607 son partículas similares en las cuales las cisteínas del polipéptido M2 en las posiciones 17 y 19 del polipéptido (X17 y X19 de la SEQ ID NO: 9) fueron mutadas por residuos de serina.

Tabla 1 Número de Longitud completa, Proporción de partícula (F) ó C-terminal absorbancia truncada 280:260 NT, no probado. ^CV-lldg es idéntico a IM2-HBc descrito por Neirynck, 1999.

Ejemplo 5: Protocolo de estabilidad térmica Las partículas purificadas fueron diluidas a una concentración de 1 mg/ml utilizando NaP0 50 mM, pH 6.8 y acida de sodio se adiciono para una concentración final de 0.02% para evitar el crecimiento bacteriano. Las muestras se mezclaron con buffer para muestras SDS-PAGE (reductor) y se corrieron sobre geles de SDS-PAGE al 15%. Los geles fueron teñidos utilizando azul de cumasi y luego se analizaron.

Ejemplo 6: Filtración analítica en gel Análisis de las partículas híbridas El análisis analítico de filtración en gel de las partículas HBc híbridas purificadas se hizo utilizando una columna cromatográfica de 25 mL, Superóse® 6 HR 10/30 (Amersham Pharmacia # 17-0537-01) y un sistema de cromatografía de perfusión BioCAD™ SPRINT el detector UV fue ajustado para monitorizar una longitud de onda de 280 nm. La columna fue equilibrada con tres volúmenes de columna (CV; aproximado 75 ml) de buffer NaP0 , pH 6.8) a una velocidad de flujo de 0.75 mL/minuto.

Las partículas que iban a ser analizadas fueron diluidas a una concentración de 1 mg/ml utilizando NaP0 10 mM, pH 6.8. 200 microlitros (µL) de la muestra entonces fueron cargados sobre un bucle de 200 µL y se inyectaron en la columna. La muestra fue eluida de la columna con NaP0 50 mM, pH 6.8 a una velocidad de flujo de 0.75 ml/minuto.

Las partículas que contenían residuos de cisteína N-terminales o partículas semejantes libres de estas cisteínas fueron analizadas utilizando el procedimiento anterior. La integración de las traza a 280 nm se llevo a cabo utilizando el Software BioCAD™ (PerSeptive™) para obtener los resultados en [lacuna].

Ejemplo 7: Construcciones de M2 de influenza En fechas recientes, Neirynck y col., (octubre 1999) Na ture Med. , 5 (10): 1157-1163 y WO 99/07839' documentaron la fusión del dominio extracelular de 24 aminoácidos de M2 al N-terminal de las partículas HBc de longitud completa (HBc 183) , carentes de los residuos de aminoácidos 1-4. Una representación esquemática de esta construcción mencionada en la présente como IM2 HBc se muestra más adelante en la que el 24-mero se liga al N-terminal de HBc.

IM2HBc SL TEVETPI NE GCRCNDSSD-HBc (5-183) SEQ ID HO: 94 En una preparación ejemplar, el epítope M2 fue insertado en la asa inmunodominante del núcleo de hepatitis B y las partículas mencionadas como ICC-1475 fueron expresadas satisfactoriamente y purificadas utilizando las técnicas antes descritas para estas inserciones y purificaciones. Una versión mutada del epítope de M2, en la que dos residuos de cisteína en las posiciones 17 y 19 de M2 natural fueron sustituidas por residuos de alanina, también se expreso en la asa inmunodominante (las partículas ICC-1473) y las partículas resultantes purificadas. Estas dos partículas se muestran en el esquema siguiente.

ICC-1475 HBC (1-78) -GI-SLLTEVETPIRN? GCRCNDSSD-EL-HBc (79- 149) SEQ ID NO: 95 ICC-1473 HBC (1-78) -CT-SLLTEVETPIRNS TARANDSSD-EL-HBc (79- 149) -C SEQ ID NO: 96 La construcción de la partícula ICC-1473 produjo partículas aproximadamente 7 veces más purificadas si se comparan con la secuencia natural (ICC-1475) . Todavía no se determina si la mutación de los residuos de cisteina altera el potencial de protección de las partículas. No obstante, epítopes insertados en las asas inmunodominantes de HBc son normalmente mucho más inmunógenas en comparación de cuando estas se fusionan a otras regiones (incluido el N-terminal) y las partículas resultantes muestran reducida inmunogenicidad contra HBc.

También se han preparado partículas en las cuales la secuencia 24-mero N-terminal de M2 fue fusionada el N-terminal de las partículas núcleo de hepatitis B truncadas en el C-terminal. Esta construcción (ICC-1438) también contenía la secuencia prenúcleo N-terminal (SEQ ID NO: 66) . Se preparo una construcción semejante que contenía un residuo de cisteína único en el extremo de la proteína híbrida (ICC-1492), en'éste caso inmediatamente después de Val-149 del gen de HBc. Estas construcciones se muestran en el esquema siguiente.

?CC-1438 MGISL T?VETPIRNEWGCRCNDSSDELLGWL GI-HBc (2-149) SEQ ID NO: 97 ICC- 1492 MGXSltliTEVBTPIRI-TEWGCRCNDSSDELLG I.WGI-H G ( 2 - 149) -C * L SEQ ID NO : 98 Debe señalarse que para proteger contra el inicio de la traducción a partir de la metionina iniciadora HBc natural, el codon para ese residuo fue mutado para codificar para un residuo de isoleucina. Se subrayan los residuos que aportaron los sitios de restricción EcoRI (Gl) y Sacl (EL) . La secuencia prenúcleo esta mencionada entre los residuos EL subrayados y "-HBc (2-149)".

El análisis por SDS-PAGE como se describe en otra parte de la presente, mostró que luego de la preparación, la construcción del monómero ICC-1438 fue inestable (banda 2) en comparación con ICC-1492 (banda 3) con HBc-149 (bandas 1), ICC-1475 (banda 4) e ICC-1473 (banda 5) sirviendo como controles adicionales del peso molecular en el gel SDS-PAGE de la Figura 10. La inestabilidad de los monómeros de ICC-1438 no fue evidente utilizando la filtración de las partículas en el gel analítico.

Se esperaba que ICC-1475 (figura 10, banda 4) e ICC-1473 (figura 10, banda 5) tuvieran pesos moleculares levemente menores que ICC-1438 e ICC-1492, porque los anteriores dos contienen la secuencia de M2 insertada directamente en la asa inmunodominante, y por tanto carecen de la secuencia prenúcleo (SEQ ID NO: 66) presente en ICC-1438 e ICC-1498. Como se esperaba, ICC-1492 fue más grande que ICC-1475 e ICC-1473; no obstante, ICC-1438, que es idéntica a ICC-1492 si no fuera por el residuo de cisteína C-terminal, claramente no es más grande que ICC-1475 e ICC-1473 debido a una disociación evidente.

Una construcción que contenía una secuencia extracelular M2 N-terminal como se describe en lo anterior ligada al N-terminal de HBc (dominio I) o la asa (dominio II) y también contenía un residuo de cisteína en el C-terminal (dominio IV) de HBc también se contempla.

Para modificar el amino terminal de las partículas HBc híbridas que contienen fusiones de la asa inmunodominante para incorporar un residuo de cisteína, y la secuencia mínima derivada de "M2, se sintetizo una serie de oligonucleótidos sintéticos sintéticos. Para preparar V2. Pf1 (N-M2 (17-24/C17S) , los oligonucleótidos M2 (17-24/C17S)-NcoI-F y HBc 149/HindIII-R se utilizan para amplificar el gen de HBc híbrido desde el vector V2. Pf1. El fragmento resultante de 546 pb se disocia con Ncol y HindIII y se inserta en pKKK223-3N, el cual ha sido disociada con las mismas dos enzimas.

Para preparar V2.Pfl (N-M2 (17-24/C19S) , se utilizan los oligonucleótidos M2 (17-24/C19S) -Ncol-F y HBc 149/HindIII-R para amplificar el gen de HBc híbrido en el vector V2.Pfl. El fragmento resultante de 540 pb se disocia con Ncol y HindIII y se inserta en pKKK223-3N, que ha sido disociada con las mismas dos enzimas.

M2 (17-24/C17S) -Ncol-F M G S R C N D S S Ü 1 D P Y B F G .GGCGCCAtGGGGTCT&GATGTiyCGAT CaAG^g?CA^CGACCG 'l'& AM.GAa. TTCG SEQ ID BQ: 99 SEQ ID NO: 100 2 {17-24/C19S5 -Mcol-F M G C N D S . S D I D P Y E F G SEQ ID NO: 101 GCGCC TG GGTGTAACGA TCAAGTGACATCGACCC'rTATAAAGAATTTGG SEQ ID NO: 102 Ejemplo 8: Moléculas HBc quimera con y sin residuos de cisteína N y C-terminales Se preparó una serie de partículas que contenían la molécula HBc híbrida y que contenían 1-24 residuos de la proteína M2 de influenza A unidos con enlaces peptídicos a o cerca del N-terminal de HBc cuyo C-terminal fue truncado en el residuo 149. Las moléculas proteina quimérica componentes contenían diferentes secuencias N-terminales que incluían una secuencia variante de M2, y algunas contenían un residuo de cisteína C-terminal.

Todas las partículas purificadas se enlistan en la Tabla 2, siguiente, y fueron analizadas por cromatografía de exclusión de tamaño analítica para valorar la retención de la estructura particulada luego de la purificación. Las partículas denominadas ICC-1603, que no contenían residuos de cisteína N-terminales, mostraron evidencia de desensamble a las estructuras subparticuladas (figura 3) porque la proteína eluyo en el intervalo de 1500 segundos (las partículas correctamente formadas eluyen a aproximadamente 1000 segundos).

Un análisis parecido de las partículas ICC-1590, que son semejantes a las partículas ICC-1603 salvo por la mutación de dos residuos de serina a residuos de cisteína en la secuencia de M2 N-terminal, mostró que esta construcción permaneció particulada luego de la purificación, en la que la elusión se observó a aproximadamente 1000 segundos, lo cual es normal para una partícula híbrida (Figura 4). No hubo evidencia de desensamble para las partículas ICC-1590.

El análisis de las partículas ICC-1560, cuya proteína quimera también dos residuos de cisteina N-terminales, mostró que también era particulada luego de la purificación, aunque no mostró algún grado de desensamble (figura 5) , sugiriendo que la estabilización no fue tan robusta como las partículas ICC—1590. La comparación de las configuraciones N-terminales de las partículas ICC-1590 e ICC-1560 (Tabla 2, más adelante), demuestra que la posición relativa de los dos residuos de cisteína en las partículas ICC-1560 se deslazo tres residuos de aminoácidos en relación con las partículas ICC-1590 por la deleción de los tres residuos de aminoácidos (DEL) , indicando que los residuos de cisteina pueden ser necesarios para que exista una distancia mínima desde el inicio del gen del núcleo para permitir entrelazado óptimo.

Ejemplo 9: Partículas con una secuencia M2 para variante de M2 y un residuo de cisteína C- terminal Las partículas ICC-1603 mostradas en la Figura 3 se desensamblan rápidamente luego de la purificación. Las moléculas HBc quimera que contienen partículas ICC-1605 son semejantes a las partículas ICC-1603, salvo que las moléculas quimera componente de ICC-1605 tienen una sola cisteína estabilizadora C-terminal. El plásmido fue preparado para dirigir la expresión de las partículas de ICC—1605 para investigar sí la adición de un residuo de cisteína C-terminal a las partículas ICC-1603 impartiría mayor estabilidad en las partículas. Luego de la purificación se analizaron las partículas ICC-1605 utilizando cromatografía de exclusión de tamaño, analítica (Figura 6) .

Los resultados de este estudio demostraron que la estabilización de las partículas fue más completa que para las partículas ICC-1603, pero incompleta en comparación con las partículas ICC-1590, las cuales contienen dos residuos de cisteína amino terminales y ninguna cisteína estabilizadora C-terminal. Aunque una cantidad importante de ICC-1605 permaneció particulada, hubo evidencia de una mezcla heterogénea ' de estructuras subparticuladas que eluyeron en un amplio intervalo.

Estas observaciones sugieren que para estas partículas híbridas (ICC-1603) , la estabilización C-terminal como se encuentra en las partículas ICC-1605 fue menos completa que para la estabilización N-terminal que se encuentra en las partículas ICC-1590.

Para investigar la compatibilidad '" de la estabilización combinada de cisteína amino y carboxilo terminal de las partículas híbridas, se construyo un plásmido de expresión para dirigir la expresión de las partículas ICC-1604. Las moléculas quimera componentes de las partículas ICC-1604 contienen dos residuos de cisteína estabilizadores amino terminales presentes en una secuencia de polipéptido M2 natural (como en ICC- 1590) asi como una cisteína estabilizadbra C-terminal (como en las partículas ICC-1605) . El análisis de las partículas ICC-1604 demostró que estas conservaron un estado particulado homogéneo de la purificación (Figura 7), indicando que los dos métodos de estabilización son complementarios y se pueden utilizar en una forma armónica entre sí.

Las secuencias ligadores alternativas entre ' el N-terminal de HBc y los residuos de cisteína N-terminales fueron investigadas utilizando partículas ICC-1438 e ICC-1492. Ambas partículas contiene la secuencia de aminoácidos ELLGWLWGIDI (SEQ ID NO: 103) entre la fusión M2 y el aminoácido D4 de HBc. Los residuos de aminoácidos LGWLWGIDI proceden de los aminoácidos -6 del prenúcleo hasta el aminoácido 13 de HBc, con el codón iniciador de HBc mutado a una isoleucina para evitar el inicio de la traducción desde esta posición, lo que comprometería el estudio. La secuencia prenúcleo de HB incluye una cisteína en la posición -7.

Estas partículas difirieron solo en el hecho de que la molécula quimera componente ICC-1438 terminaba en la posición 149 de Be, mientras que la molécula quimera componente ICC-1492 terminada en 149 de HBc y contenía una cisteína terminal en la posición 150 en relación con la HBc de la SEQ ID NO: 1. Cuando se analizo por filtración en gel analítica, utilizando un método alternativo pero semejante al antes descrito, mediante el cual las partículas eluyen en aproximadamente 10 minutos, ambas construcciones demostraron estar particuladas luego de la purificación (ICC-1438 en la Figura 8 e ICC-1492 de la figura 10) . Este estudio demostró la compatibilidad de la estabilización de la cisteína amino y carboxilo terminal de las partículas truncadas, y la tolerancia de la variabilidad considerable en la secuencia de aminoácidos y la distancia entre los residuos de cisteína N-terminales y el inicio del gen de HBc. Los datos de los diferentes estudios se muestran en las Tablas 2A, 2B y 2C siguientes.

Tabla 2A ice-isas H2 - ] V1<S 9 Cl Í 3) 3L ilo Ko La Tabla 3, siguiente muestra un alineamiento que ejemplifica la configuración de los N-terminales de HbeAg, y las partículas que albergan fusiones N-terminales. Las secuencias están alineadas de acuerdo con la posición de los residuos de aminoácidos 4 desde el N-terminal de HBc de SEQ ID NO: 1 que se comparten en todas las construcciones. Los residuos de ci-steína N-terminales, cuando están presentes, están subrayados.

Tabla 3 Nombre construcción Secuencia SEQ ID HO HBeAg SKLCLGW WGMDID 103 ICC-1438/ICC-1492 MGISLLTEVETPIRNE GCRGNDSSDELLGWLWGIDID 104 ICC-1560 MSLLTEVETPIRK?WGCRCKÍDS3D IOS ICC-1590/ICC-1604/ICC-1606 MSLIiTEVETPIRWE GCRCMDSSDS D 106 ICC-1S03/ICC-1605/ICC-1607 M£5LLTEV?TPIR E GSRSSDSSDELD 107 ICC-1671 MSLLTEV2TPIRNEWGSROSIDSSDEI-D 108 ICC- 1672 MSL TEVETPIRNEWGCRSMDSSDELD 109 ICC-1816 MS LTEVETPIRH?WGCRCNDSSDLESLLTEVET- PIRN?WGCRCNDSSDELD 110 ICC-1817 MSI-LTEVETPIRNBWGSRSHDSSDL?S LTEVETPISN- E GCRCNDSSDE D 111 ICC-1818 SLLTEVETP1R EWGSRSNDSSDIIQSL *J.'3V?TP1KN- ? GSRSNDS SDLE SLLTEVETP IRNEWGCRCNDS SDELD 112 La Tabla 4 siguiente proporciona una tabulación de los resultados en los cuales se evaluó la estabilidad de las partículas que contienen una secuencia o variante de M2 de influenza A N-termmal previsto en la presente. Como se puede ver, las partículas estables an sido preparadas a partir de las moléculas HBc quimera que contienen el residuo de cisteina N-terminal en una posición de -14 (-14) en relación con el N-terminal de la secuencia HBc de SEQ ID NO: l a aproximadamente el propio N-terminal . * desde la segunda copia de M2 N terminal Ejemplo 10: Rendimiento y unión al ácido nucleico de las partículas que contienen M2 Los rendimientos se expresan como miligramos de las partículas purificadas de un cultivo de 500 ml . Se determino la presencia del ácido nucleico unido midiendo la relación A280:A260 de la partícula purificada. Una proporción mayor de 1.0 indica ácido nucleico no unido, y una proporción menor de 1.0 indica la presencia de ácido nucleico unido. La IM2HBc original, de longitud completa, descrita por Fiers y colaboradores [Neirynck y col., (1999) Na t . Med. , 5 (10): 1157-1163, y la solicitud de patente WO 9907839], es la misma que ICC-1559.

Ejemplo 11: Antigenicidad de las diferentes partículas que contienen M2 La antigenicidad de las diferentes partículas para el anticuerpo monoclonal 14C2 se examino utilizando ELISA. Para garantizar la retención de las partículas en su conformación natural, las placas ELISA fueron primero recubiertas con un anticuerpo policlonal (conejo) para capturar las partículas, las cuales entonces fueron sondeadas con diferentes diluciones del anticuerpo monoclonal 14C2 o dos anticuerpos monoclonales contra HBc con especificidad para la región de -la asa inmunodominante de las partículas HBc. Los datos, que se presentan en la tabla siguiente, demuestran " que la presentación de M2e en la asa inmunodominante de HBc no altera significativamente la accesibilidad del epitope M2e al anticuerpo monoclonal 14C2, en relación con la presentación en el N-terminal (IM2HBc/ICC-1559 e ICC-1604). Estas observaciones no fueron sorprendentes porque antes se habia demostrado que el 14C2 se une una región interna de M2e (los aminoácidos 8, 10, 11 y 14 de M2, contrario al N-terminal [Zebedee y col., (1998) J. Virol . , 62 (8): 2762-2772].

Además, todas las partículas, con la excepción de ICC-1569, conservaron la antigenicidad para los anticuerpos monoclonales contra HBc 3120 y 3105. La pérdida de reconocimiento por parte de 3105 es un fenómeno antes observado para las partículas con secuencias insertadas en la asa inmunodominante, y esto normalmente se traduce en respuestas contra HBc reducidas para estas partículas luego de las inmunización. Los anticuerpos monoclonales 3105 y 3120 fueron adquiridos al instito Tokio de inmunología, Japón.

Ejemplo 12: Inmunogenicidad de las diferentes partículas que contienen M2 La inmunogenicidad de las partículas ICC-1604 e ICC- 1569 se investigo en ratones. Hubo poca diferencia en los títulos contra M2e entre las dos partículas, mientras que se observo una diferencia importante en los títulos contra HBc entre las dos partículas. Las partículas ICC- 1604 con una asa inmunodominante natural, desencadenaron títulos contra HBc que, al igual que IM2HBc, fueron aproximadamente 100 veces superiores a los de las partículas ICC-1569. Estos datos vuelven a destacar el hecho de que la disrupción de la asa inmunodominante de HBc, mediante la inserción del epitope, lo cual condujo a la pérdida de reconocimiento por el anticuerpo monoclonal 3105 de HBc, disminuye drásticamente las respuestas de los anticuerpos contra HBc. Por el contrario, ambas partículas desencadenaron respuestas de anticuerpos contra M2e similares, y comparables con las antes observadas para IM2HB/ICC-1559, con títulos en el punto final de aproximadamente 1:100,000.

Las partículas fueron formuladas en Alhydr?gel™, y se inmunizaron grupos de 10 ratones con dos dosis' de 10 µg de las partículas formuladas en los dias 0 ' (cero) y 28. Los sueros combinados fueron analizados dos semanas después de la segunda inyección para respuestas de anticuerpos contra HBc y contra M2e utilizando ensayos ELISA. Los sueros combinados de 10 ratones a las dos semanas después del refuerzo fueron analizados en ensayos ELISA, en el que el péptido sintético M2e (2-24) y el HBc recombinante (ICC-1123) sirvieron como antigenos de captura.

Una comparación directa de las partículas ICC-1569 e ICC-1604 en el modelo de desafío letal en ratones mostró que ambas partículas, cuando se formularon en Alhydrogel1", produjeron protección completa contra una dosis de desafío letal. Estos resultados, por tanto, son congruentes con la observación de que ambas partículas desencadenas títulos semejantes de anticuerpos contra M2e.

La recopilación de datos obtenidos de múltiples estudios en ratones por Fiers y colaboradores en la universidad de Ghent, utilizando un arreglo de diferentes partículas y adyuvantes, ha revelado la evidencia de una posible correlación entre los títulos de un anticuerpo anti 2e de la subclase IgG2a y la eficacia protectora. Los ratones que mostraban títulos de IgG2a contra M2e mayores de 104 estaban confiablemente protegidos del desafío letal, mientras que los ratones que mostraron títulos de IgG2a contra M2e por debajo de 104, pero títulos de IgGl mayores de 104, normalmente muestran protección menos completa. Estos datos son relevantes para el mecanismo de protección potencial en cuanto a que sugieren que los anticuerpos contra M2e simplemente no bloquean la función de M2e, por el contrario, la protección sería independiente del sesgo de la subclase de IgG. En cambio, debido aque IgG2a de ratón (y también IgG2b) son la subclase más eficiente para fijar complemento y unir los receptores Fc?RIII, que expresan las células NK [Ravetch y col., (1991) Annu . Rev. Immunol . , 9(457-492)], los datos sugieren un mecanismo inmunitario que involucra CDC y/o ADCC.

Ejemplo 13: Subclase y protección de los anticuerpos Resumen de los diferentes estudios en los que fueron analizadas las diferentes construcciones M2e-HBc (10 µg/ratón) y diversos adyuvantes. Aproximadamente el 50% fue administración ip y aproximadamente el 50% in. Para cada grupo (14 ratones) se combinaron los sueros y se determino el titulo de los anticuerpos de la subclase IgG contra M2e. Los resultados son de sueros tomados una semana después del segundo refuerzo. Para ratones en los que el titulo de IgG2a fue más de 104, el titulo de IgGl fue > 104 (*) .

Se investiga cada vez más la capacidad de los adyuvantes para intensificar la magnitud y duración de las respuestas inmunitarias a las vacunas, así como para modular el sesgo Thl/Th2 de la respuesta inmunitaria. Aunque muchos adyuvantes experimentales están en investigación, el alumbre sigue siendo el único adyuvante que es un componente de vacunas aprobado por la FDA en EUA. Normalmente, el alumbre sesga las respuestas inmunitarias hacia un tipo de Th2, el cual se manifiesta por la producción de elevados niveles del anticuerpo IgGl en ratones.

Se encontró que las partículas M2e-HBc formuladas con alumbre desencadenan una respuesta IgGl significativa; sin embargo, los anticuerpos IgG2a e IgG2b, que son indicadores de Thl, también se producen. En un intento para intensificar la producción de las subclases de IgG2 tipo Thl, se probo en ratones la inmunogenicidad de las partículas formuladas con Alhydrogel™, suplementadas con RC-529, un compuesto de estructura relacionada con MPL® desarrollado por Corixa Corporation. Estos estudios mostraron que la inclusión de RC-529 en la formulación de Alhydrogel™ dio como resultado un mejoramiento drástico de los títulos de IgG2a contra M2e, aumentando la relación IgG2a: IgGa contra M2e aproximadamente 10 veces. Todos los ratones en ambos grupos estuvieron completamente prometidos del desafío letal; no obstante, hubo una indicación de morbilidad reducida (disminución de temperatura y peso) en los ratones inmunizados con ICC-1569 formulada con Alhydrogel™ más RC-529 en comparación con Alhydrogel™ solo.

Ejemplo 14: Partículas HBc parcialmente truncadas: síntesis de los vectores de expresión para expresar las partículas parcialmente truncadas Para preparar plásmidos de expresión para expresar partículas HBc parcialmente truncadas, se utilizo un solo cebador de PCR oligonucleótido aminoterminal (HBc 149/NcoI-F) en combinación con un cebador 'C-terminal único. Por ejemplo, para preparar el plásmido de expresión HBc 156 (E.Cr; partículas ICC-1600) , se utilizaron los cebadores HBc 149/NcoI-F y HBc 156 (E.Cr)-H3-R. Se utilizaron los cebadores HBc 149/NcoI-F y HBc 156 (E.Cr)-H3-R para preparar los plásmidos de expresión HBc 156 (E.cR)+C (partículas ICC-1601) . Más adelante se presentan las secuencias de todos los cebadores que se utilizaron.

Además de la truncación de las partículas —y en algunos casos la incorporación de los residuos de cisteína C-terminales— también se utilizaron codones que son óptimos para la expresión en E.coli. Se sabe que algunos codones de arginina, particularmente AGA y AGG son muy poco utilizados por E.coli y se cree que son problemáticos para la expresión eficiente de las proteínas en E.coli dando origen a la interrupción de la sintesis de polipéptidos durante la traducción, y con ello la terminación precoz. De los 16 codones de arginina entre 150 y 183 de HBc, 7 son codificados por el codon AGA poco común y dos son codificados por el codon AGG muy poco común. Por tanto, en este estudio, todos los codones AGA y AGG fueron sustituidos por codones que utiliza con mayor frecuencia E. coli .

Para permitir la sustitución secuencial de los codones de arginina poco comunes, se sintetizaron primero los genes de HBc 156 (las partículas ICC-1600 y HBc 156 +C ICC-1601) , y luego se utilizaron como un modelo para las construcciones de HBc 163 (partículas ICC-1634 y HBc 163+C ICC-1632); después las construcciones de HBc 163 se utilizaron como modelo para las construcciones de HBc 171 (partículas ICC-1642 y he 171+C 1CC-1643) ; por ultimo, se utilizaron las construcciones de HBc 171 como modelos para las construcciones de HBc 182 y HBc 183 optimizados con codones de arginina. La construcción de HBc 182 no optimizada (ICC-1575) también se preparo para propósitos de control. Todos los productos de la PCR se disociaron con las enzimas de restricción Ncol y HindIII y se clonaron en el vector de expresión pKKK223-3N, el cual había sido cortado con las mismas enzimas antes descritas .

Secuencia del cebador amino terminal (el sitio de restricción Ncol esta subrayado) : 5 ' -TTGGGCCATG5&CATCGa.CCCT?A • secuencias del cebador hidroxilo terminal (los sitios de restricción HindIII están subrayados.)': HBcl56{E.cR)-H3~R s' "GCGAAGCTTACTA?GGGGAGGGGCCTCGTCGACGAACI-?CASG?GTCTCCG-- SEQ ID NO:í HBcl56C(E,CE -H3-R 5 ' -GCGAAGGTACTAACAAGGGGAGCGGCGTCGTCGACGAACAACAGTAGT- CTCCGG SEQ ID MO:í HBcl63(E.cR)»H3-R 5 ' -GCGAAGC TACTAAGGCGAGGGAGTGCGCCGACGAGGGGAGCGGCCTCG SEQ SD NO: 66 HBcI63C(E.cR) -H3-R 5 ' -GCGAAGCTTACt?ACAAGGCGAGGGAGTGCGGCGACGAGGGGAGCGGCCTCG SEQ ID 210:67 HBcl71(E.cR)-H3-R 5 ' - CGAAGCTTAC ACGGCGATTGAGAGGGTCGACGGCGAGGCGAGGGAGT SEQ ID MO:68 H3cl7lC{E.cR) -H3-R 5 ' -GCGAAGCTTACTAB.CACGGCGATTGAGAGCGTCGACGGCGAGGCGAGGGAGT SEQ ID SO: 69 H3cl83(E.cR) -H3-R 5' -GGGAAGC ACTAACATTGAGATTCCCGAGATTGiGA CGCCGGCGACGCGG- CGATTGAGAGCGTC SEQ ID NO:113 HBC182-H3-R 5' -GCGAAGCTTACTAT GAGATTCCCGAGATTGA SEQ ID NO:114 HBC183-H3-R 5' ""GGAAAGCTTACTAAGATTGAGATTCCCG SEQ ID NO:115 HB0149/Híndlll-R 5r "CGCAAGGTTAAACAACAGTAGGCTCCGGAAG SEQ ID MÍO:54 HBcl49H-C/HindXII-K S'-CGCAAGCTTACTAGCAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG SEQ ID HO:55 La Tabla 5, siguiente, muestra un alineamiento que ejemplifica la configuración de los C-terminales de la HBcAg de longitud completa (HBc 183) , y todas las partículas que albergan truncaciones C-terminales. Las secuencias están alineadas de acuerdo con la posición del residuo aminoácido 149 desde el N-terminal de HBc de SEQ ID NO:l que es compartida por todas las instrucciones. Los residuos de cisteína C-terminales, si están presentes, están subrayados.

Tabla 5 Nombre construcción Secuencia SEQ ID NO HBcl83 VRRRGRSPRR TPSPRRRRSQSPRRRRSQSRRSQC 11í HBC182 WRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQ ' H", HBcl 71 (E . cR) +C VRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPC US HBcl 71 {E . cR) VS.RRGRSPRRRTPSPRRRRSQSP US HBcl ßS (E . cRj +C VR.RR<3RfiPRR1?TK?pp i on HBC183 VRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRBSQC 116 HBC182 VRRRGRSPRKRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSRESQ 117 HBsl71{E.cR)+C VRRRCRSPRRRTPSPRRRRSQSPC 118 BBcl71{S.cR) VRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSP 119 HBC163 (E.CR) +C VRRRGRSPRRRTPSPC 120 HBcl63 (E.CR) VRRRGRSPRRRTPSP 121 HBcl56(E.cR)+C VRRRGRSPC 122 HBsl5S(E.cR) VRRRGRSP 123 Ejemplo 15: Formación de partículas y estabilidad utilizando quimeras de HBc con y sin cisteinas N-terminales Se preparó una serie D4 proteínas quimera que contenían fusiones cortas N-terminales al aminoácido D4 del núcleo de hepatitis B truncadas en la posición 149 que contenían 0 (partícula 1891) , 1 (partículas 1892 y 1893) o 2 (partícula 1890) residuos de cisteína. Las quimeras fueron analizadas utilizando cromatografía de exclusión de tamaño, analítica (SEC) para .evaluar la integridad de las partículas después de la -purificación.

En la tabla 6 siguiente se muestran las secuencias de estas fusiones N-terminales y los rendimientos de los aislados .

Tabla 6 Las proteínas quimera o híbridas que contenían una o más cisteínas fueron purificadas satisfactoriamente con rendimientos que abarcaban desde 1.9 hasta 6.8 mg/500 mL de cultivo de células. La quimera que contenía 2 cisteínas (partículas 18-90) en las posiciones 3 y 5, en relación con la metionína iniciadora, o la única cisteína en la posición 3 (partículas 1893) fue purificadas con mayores rendimientos en comparación con la quimera que tenía una sola cisteína en la posición 5 (partícula 1892). Las proteínas quimera que no contenían la cisteína 3 ó 5 no pudieron ser purificadas como partículas, sugiriendo que la molécula de la proteína quimera no forma partículas estables.

Cuando fueron analizadas por SEC analítica, las tres proteínas mostraron un pico dominante que eluía en aproximadamente 5-8 ml, lo que representa partículas. Este hallazgo es contrario a las partículas de las moléculas de proteínas quiméricas que carecen de cisteína o cisteinas N-terminales, como la partícula quimera ICC-1048, la cual existe como mezcla de partículas y estructuras de orden inferior (material no particulado) . ün análisis más detallado de los perfiles de SEC reveló que la molécula de la proteína quimera 1890 formab a partículas superiores, con estructuras de orden inferior no detectables, mientras que la quimera 1892 revelo la una pequeña cantidad de material no particulado, y la quimera 1893 mostró todavía más material no particulado.

Para examinar la habilidad de los residuos de cisteína N-terminales para estabilizar las partículas que presentan epítopes heterólogos, se construyo una molécula de proteína quimera que contiene la misma configuración N-terminal que la quimera 1890, con repetición es SEC procedentes de P. falciparum (NANPNVDPNANPNANPNANP; SEQ ID NO: 128); insertadas en la asa inmunodominante entre los aminoácidos 78 y 79. Luego de la purificación se comparo la integridad de las partículas de la quimera resultante (1894) con las partículas de una proteína quimera semejante que carecía de la fusión N-terminal (1045) .

El análisis SEC de estas construcciones demostró que la quimera 1045 presentaba picos para ambas partículas y estructuras de orden inferior. Un análisis semejante de los datos para la quimera 1894 demostró una ausencia inexplicada de formación de partículas que se esta investigando .

Ejemplo 16: Inmunogenicidad de las partículas con péptidos M2 N-terminales ligados en serie Se ensayó en conejos las inmunogenicidades de las partículas genéticamente manipuladas para que contengan copias variables de M2 [1,1604 (ejemplo 12); 2,1817 (Ejemplo 9); o 3, 1818 (Ejemplo 9)] fusionadas al N-terminal. Estas partículas fueron congeladas después de su preparación para llevar al minimo el efecto de una proteasa' que se consideraba presente, como se describe antes y en el siguiente ejemplo. Los grupos de 4 conejos fueron inmunizados, por vía intramuscular, con tres dosis de partículas (25 µg/dosis) formuladas con Alhydrogel™ (500 µg de aluminio por dosis) /RC-529-AF (25 µg por dosis) . Los conejos fueron inmunizados en los días 0, 28 y 56, y se tomaron las muestras de sangre los días 0 (antes de tomar la muestra), 14, 28, 56 y 70. Se analizaron los sueros en cuanto a los ' niveles del anticuerpo contra M2e utilizando ELISA.

El análisis ELISA se hizo utilizando placas de microtitulación recubiertas con él epitopes M2e (2-24/C17S, C19S) (2 µg/mL), durante aproximadamente 18 horas) y se bloquearon con 3% BSA. Los sueros fueron adicionados a las placas, por duplicado, comenzando con una dilución 1:100 y continuando con diluciones triples, excepto las muestras del día 0, los cuales fueron analizados por triplicado. Para detectar los anticuerpos inmovilizados, se adicionó un conjugado de IgG HRP anticonejo seguido por el sustrato cromogénico azul TM. Mediante el uso de los datos del dia 0 se calcularon los "cortes", para cada conejo, en cada dilución de suero, determinando el fondo más tres desviaciones estándar de la muestra de suero de sangrado previo del dia cero) . Se determinaron los títulos en el punto final identificando la última dilución del suero que proporciono un valor de absorbancia mayor que el corte como una dilución de suero determinada. Si un determinado conejo no respondía (es decir, titulo de cero) en un grupo donde otros conejos daban títulos detectables (es decir, mayores que cero) , al conejo que respondía se le asignaba un titulo de diez para permitir el calculo de un titulo en la media geométrica (GMT) para el grupo.

Sorpresivamente, las partículas con solo una copia de M2e fusionada al N-terminal (1704) no produjo una respuesta contra M2e detectable (Tabla 11) ; sin embargo, las partículas 1817 y 1818 produjeron respuestas inmunitarias contra M2e detectables solo 14 días después de una inyección primaria (Tabla 7) . El título máximo para las partículas 1817 de 14,030 se observó el día 70, mientras que el título máximo para las partículas 1818, de 24,300, se observó el día 56. No se detectaron títulos contra M2e en ninguno de los conejos inmunizados con 1604 después de 1, 2, ó 3 dosis.

Tabla 7 GMT para conejos inmunizados con diferentes partículas que contenían M2e Ejemplo 17: Evitación de la actividad de proteasa endógena El trabajo continuo ha demostrado que las partículas que contienen M2 son segmentadas por una proteasa desconocida que parece ser una metaloproteasa, porque la proteólisis de estas partículas se puede evitar mediante la inclusión de EDTA 10 mM en una solución amortiguadora que se utiliza para aislar y almacenar las partículas. Para determinar si concentraciones inferiores de EDTA también eran eficaces, se hizo un estudio de estabilidad empleando las partículas ICC-1818 preparadas en el Ejemplo 9 y antes descritas. Estas partículas fueron colocadas en buffer de almacenamiento que contenia fosfato de sodio 20 mM, a pH 7.2, y también contenían EDTA 0, 1, 2, 5 ó 10 mM. Los resultados, que se presentan en la figura 11, muestran claramente que EDTA 1 mM es tan eficaz como el EDTA 10 mM evitando la proteólisis. En realidad, también pueden ser eficaces concentraciones menores de 1 mM.

Sorprendentemente, en ausencia de EDTA se reduce la proteólisis en incubación a 37°C en comparación con a temperatura ambiente. Esta observación sugiere que la proteasa puede ser altamente lábil y por tanto objeto de inactivación a temperaturas relativamente bajas (40-60°C) . Por tanto, se inicio un estudio para determinar si se podía destruir la actividad proteolítica por tratamiento térmico, manteniendo al mismo tiempo la integridad de las partículas.

Para evaluar la posiblidad de utilizar un paso de calor para inactívar la proteasa, las partículas fueron calentadas a 40, 50, 60 ó 70°C durante 1.5 ó 3 horas. La integridad de los monómeros, evaluada utilizando SDS-PAGE (Figura 12A) , y los datos muestran que todos los monómeros parecen ser semejantes después del tratamiento. ün segundo gel, presentado en la Figura 12b, demuestra claramente que las partículas no tratadas se fragmentan completamente después de una semana a temperatura ambiente (TA) , mientras que las partículas que fueron tratadas con calor a 40°C muestran fragmentación reducida, las incubadas a 50°C muestran fragmentación mínima y las que se incubaron a 60 ó 70 °C parecen imperceptibles frente a los controles no incubados.

Para evaluar el efecto del tratamiento térmico sobre la integridad de las partículas, las partículas tratadas con calor fueron analizadas utilizando SEC analítico. Los datos, que se presentan en la figura 13A, demuestran que el tratamiento térmico a 60°C y 70°C tuvo un efecto menor sobre la integridad de las partículas, como se demuestra por un leve aumento en los picos del monómero/dímero que eluyen después de un pico principal de las partículas. El tratamiento térmico a 50°C y menor no tuvo efecto evidente en el perfil de elusión de la SEC, sugiriendo que las partículas soportan el paso de calor sin efectos adversos .

El análisis SEC de las partículas termotratadas luego de una semana de incubación a temperatura ambiente revela claramente la proteólisis del control no termotratado, como se demuestra por el tiempo de elusión aumentado del pico de las partículas (Figura 13B) muestra a TA) . Este dato fue congruente con la proteólisis observada utilizando SDS-PAGE (Figura 12B) y sugiere que la fragmentación de M2e a partir de las partículas da como resultado tamaño de partícula reducido. Las muestras termotratadas todas exhiben picos de partículas dominantes, intactos, lo que de nuevo es congruente con la ausencia de fragmentación mostrada por SDS-PAGE (Figura 12) .

Estos datos sugieren que el tratamiento térmico que se utiliza para inactívar la actividad proteolítica responsable de la fragmentación de las partículas que contienen M2e puede ser una opción viable para" limitar la proteólisis. Estudios preliminares sugieren ' que una incubación de 3 horas a 55-60°C puede ser óptima para lograr la inactivación de la proteólisis, manteniendo la integridad de las partículas. Más aún, en términos del proceso de fabricación, tal vez sea preferible que el paso de calor se realice antes del paso de Sepharose® CL-4B para que los monómeros y dímeros que se liberan como consecuencia del paso térmico se eliminen eficazmente. El uso de este método puede habilitar a las partículas para que sean almacenadas en ausencia de EDTA. ' Ejemplo 18: Purificación utilizando EDTA y un paso de calentamiento produce partículas estables Con base en los datos que se muestran en lo anterior, un proceso de purificación ejemplar que incorpora EDTA e inactivación por calor de la actividad de la proteasa que fragmenta M2e se probo utilizando partículas CV-1906 que contienen 3 copias N-terminales de M2e como en las partículas 1CC-1818, ligadas a una secuencia de HBc que comienza en el residuo 4 (ácido aspártico) y en la que las cisteínas en las posiciones 48 y 107 son sustituidas con residuos de serina, las secuencia de HBc esta truncada para eliminar residuos C-terminales para la posición 149, y un residuo de cisteína se adiciono en la posición 150 (HBc 149C48S/C107S, C150) . De los 6 residuos de cisteína que podrían estar presentes en las tres copias de M2e, de hecho solo estarían presentes las dos cisteínas de la secuencia M2e más cercana a la secuencia HBc, estando las otras cuatro cisteinas sustituidas por residuos de serina.

El proceso de purificación involucra el uso de EDTA 10 mM en todas las soluciones amortiguadoras hasta la inactivación de la proteasa por el tratamiento térmico, en cuyo momento se retira el EDTA durante la cromatografía con Sepharose® CL-4B. Se hizo una comparación del proceso que contenia y carecía del paso de inactivación térmica. El proceso empleado se detalla a continuación: • Lisis utilizando microfluidizador en buffer Tris/EDTA • Centrifugación • Precipitación con sulfato de amonio al 20% • Centrifugación • Resuspensión del sedimento en NaCl 1M/EDTA 10 mM • Fenil HIC en presencia de EDTA (elusión en NaCl ~ 300 mM) • +/- inactivación térmica (60°C, 3 horas) • cromatografía en Sepharose® C1-4B en ausencia de EDTA • cromatografía HA cerámica Este estudio comparativo revelo que, como se esperaba, las partículas CV-1906 no sometidas al paso térmico comenzaron a fragmentarse tan pronto como se eliminó el EDTA; es decir, luego del paso por Sepharose® CL-4B (Figura 14, banda 2) . Por el contrario, las partículas CV-1906 purificadas utilizando el proceso que incluyo el paso térmico permanecieron intactas (Figura 14, banda 1) .

Ejemplo 19: Estudios de tamaño con quimeras que contenían 1, 2 ó 3 péptidos M2 en cascada Las partículas híbridas HBc-M2e con 0, 1, 2, ó 3 copias en cascada de M2e fusionadas al N-terminal de HBc fueron expresadas en E. coli y purificadas (tabla 8) .

Estas partículas también fueron congeladas después de su preparación y descongeladas antes de su uso, como se describe en lo anterior. El tamaño de los diferentes monómeros fue comparado utilizando SDS-PAGE reductor (figura 15) . Las movilidades relativas de los híbridos M2e-HBc fueron congruentes con sus pesos moleculares esperados (Tabla 8) .

Tabla 8 Detalles de las artículas híbridas M2e-HBc Ejemplo 20: Estudios de inmunogenicidad con quimeras que contienen 1, 2, ó 3 péptidos M2 en cascada La inmunogenicidad y eficacia protectora de las partículas genéticamente manipuladas para que contengan diferentes copias de M2 [1, 1604; 2, 1817 ó 3, 1818] fusionadas al N-terminal se compararon en ratones BALB/c utilizando el modelo de desafío letal. Ratones BALB/c hembra, libres de patógenos, obtenidas de Charles River (Alemania) se utilizaron para la inmunización a las 8 semanas de edad. Los animales fueron alojados en un ambiente con control de temperatura con ciclos de luz oscuridad de 12 horas y recibieron alimento y agua a voluntad.

Todos los ratones 814 por grupo) fueron vacunados ip con 100 µL de vacuna utilizando el siguiente protocolo de inmunización: primera vacunación, primero y segundo refuerzo con 19 µg de partículas M2e-HBc, formuladas con Alhydrogel™ (100 µg por dosis) y RC-539-Af (10 µg/dosis) en intervalos de 3 semanas. Estas partículas también fueron congeladas después de su preparación y descongeladas poco antes de su uso para llevar al mínimo el efecto de la proteasa. Antes y dos semanas después de cada inmunización se recolectaron muestras de sangre perforando la vena ventral de la cola. La toma de la muestra final se realizo por punción cardiaca. Se permitió que la sangre coagulara durante 30 minutos a 37 °C y se recolecto el suero tomando el sobrenadante de 2 centrifugaciones sucesivas. Se determino por ELISA los títulos de la IgG específica de M2e.

Los ratones inmunizados con partículas 1817 o 1818 mostraron total supervivencia luego del desafío letal, mientras que los ratones inmunizados con las partículas 1604 presentaron alguna mortalid d (ver figura 16) . Los ratones inmunizados con las partículas que no contenía M2e (1123) , o PBS, presentaron 100% de mortalidad (figura 16), destacando la eleva severidad del desafio. La protección mejorada en los ratones inmunizados con las partículas 1817 y 1818 se complemento por la morbilidad reducida (reducción en el peso y temperatura corporal) en relación con las partículas 1604, indicando que la protección fue más robusta en los ratones inmunizados con las partículas que expresaban dos o tres copias de M2e (1917 y 1818) en comparación con solo una (1604) (Figura 17 y Figura 18 ) .

Se determinaron los títulos anti M2e utilizando ELISA. Las placas ELISA fueron recubiertas durante la noche (aproximadamente 18 horas) a 37 °C con 50 µl de una solución de 2 µg/mL del péptido M2e en buffer de bicarbonato de sodio 50 mM, pH 9.7. Las placas de microtitulación (tipo II F96 MaxiSorp®) fueron las utilizadas. Después de lavar las placas, para el bloqueo se utilizo 200 µl de una solución de PBS +2% BSA. Después de 1 hora de incubación, se cargaron en los pozos recubiertos con péptido una serie de diluciones 1/3 de las diferentes muestras de suero, comenzando con una dilución 1/50. Los anticuerpos unidos fueron detectados con un anticuerpo etiquetado con peroxidasa dirigido contra IgGl e IgG2a de ratón, respectivamente (Southern Biotechnology Associates, Inc.), diluido 1/6000 en PBS +1% BSA +0.05% Tween® -20. Después de lavar, las placas de microtitulación fueron incubadas durante 5 minutos con [lacuna] de sustrato TMB. La reacción se terminó adicionando H3P04 1M y se midió la absorbancia a 450 nm. Para obtener el valor de la unión específica a M2e, las absorbancias obtenidas para los sueros antes de la inmunización fueron restadas de las absorbancias obtenidas de los sueros inmunizados en la dilución equivalente.

Los datos ELISA mostraron que las partículas 1817 y 1818 desencadenaron títulos de IgGl contra M2e que fueron 10.4 y 8.4 veces mayores, respectivamente, que los observados en las partículas 1604. Del mismo modo, las partículas 1817 y 1818 mostraron títulos de IgG2a contra M2e que fueron 5.5 y 7.6 veces mayores, respectivamente, que los observados para la 1604 (Tabla 9) .

Tabla 9 Comparación de los títulos contra M2e para partículas * Se analizaron muestras de suero de ratones individuales. Las desviaciones estándar se presentan entre paréntesis.

Para la determinación anti HBc, las placas ELISA (tipo II F96 MaxiSopr®) fueron recubiertas con 100 µL de una solución de 10 µg/mL de anticuerpo ' policlonal de conejo dirigido contra HBc (DAKO) . Después de lavar las placas se utilizó una solución de PBS +3% BSA para bloquear. Después de lavado, se permitió la captura del antígeno HBc (10 µg/mL en buffer de bicarbonato) durante 1 hora. Después de lavado, se cargó en los pozos una serie de diluciones 1/3 de las diferentes muestras de suero, comenzando con una dilución 1/1000. Se detectó a los anticuerpos unidos con un anticuerpo etiquetado con fosfatasa alcalina dirigido contra IgG de ratón (Sigma) , diluido 1/10,000 en PBS +1% BSA. Después de otro lavado, las placas de microtitulación fueron incubadas durante 30 minutos con sustrato. Se midió la absorbancia a 415 nm.

Para obtener el valor de la reactividad específica para el antígeno del núcleo de hepatitis B, las absorbancias obtenidas para el suero antes de la inmunización fueron restadas de las absorbancias antes obtenidas del suero inmunizado en la dilución equivalente. Para la determinación de los títulos de IgGl contra HBc para muestras individuales, los anticuerpos unidos fueron detectados con un anticuerpo etiquetado con peroxidasa dirigido contra IgGl de ratón (Southern Biotechnology Associates, Inc.), diluido 1/6000 en PBS +0.5% BSA +0.05% de Tween® 20. Después del lavado, las placas de microtitulación fueron incubadas durante 5 minutos con sustrato TMB. La reacción se terminó adicionando H3P04 1M y se midió la absorbancia a 450 nm.

Los datos ELISA mostraron que las partículas 1817 y 1818 produjeron títulos de IgGl contra HBc que fueron 2.4 y 10.1 veces inferiores, respectivamente. Que los observados para las partículas 1604 (tabla 10) . Estos datos indican que la densidad aumentada de M2e en la superficie de las partículas HBc suprime activamente las respuestas de los anticuerpos al portador HBc. Por consiguiente, las proporciones anti-M2e: anti-HBc (IgGl) fueron 75 veces mayores para las partículas 1818, y 23 veces superiores para las partículas 1817, en comparación con las partículas 1604 (Tabla 10) . Así pues, la respuesta inmunitaria contra M2e de influenza en el hospedero vacunado es incluso mayor que contra la partícula portadora HBc, conocida por ser altamente inmunógena .

Tabla 10 Comparación de los títulos anti M2e y anti-HBc* (subclase IgGl) Se analizaron las muestras de suero de ratones individuales * Las desviaciones estándar se muestra entre paréntesis.

Cada una de las patentes y artículos mencionados en la presente se incorporan para referencia. El uso del artículo "un" o "uno" se sugiere para incluir uno o más.

La descripción anterior y los ejemplos están propuestos como ejemplares y no deben tomarse como limitación. Todavía otras variaciones dentro del espíritu y alcance de esta invención son posibles y serán fácilmente evidentes para los expertos en la 'técnica.

Claims (53)

REIVINDICACIONES

1. una molécula hibrida de la proteina del núcleo del virus de hepatitis B (HBc) recombinante con una longitud de aproximadamente 150 a aproximadamente 375 residuos de aminoácidos que contiene 4 dominios de secuencias de los residuos de aminoácidos ligados con enlaces peptídicos desde el N-terminal, que se denominan dominios I, II, III y IV, en donde: (a) El dominio I contiene (i) aproximadamente 75 a aproximadamente 160 residuos de aminoácidos cuya secuencia incluye al menos la secuencia de los residuos de la posición 4 hasta aproximadamente la posición 75 de HBc, (ii) 1 a 3 residuos de cisteína, presentes en una posición en la molécula híbrida de aproximadamente 1 a aproximadamente 55 en relación con el N-terminal de HBc de SEQ ID NO: 1 [residuo o residuos de cisteína N-terminales] , uno o más residuos de cisteína N-terminales estando presentes dentro de una secuencia que no sea la de la secuencia prenúcleo de HBc, y (iii) incluye 2 a 4 secuencias de aproximadamente 6 a aproximadamente 24 residuos del polipéptído M2 de influenza A de SEQ ID NO: 9 que esta unido con enlace peptidico a o dentro de aproximadamente 15 residuos de N-terminal de la secuencia de HBc; (b) dominio II contiene aproximadamente cero a aproximadamente 60 residuos de aminoácidos unidos con enlaces peptídicos al residuo aproximado 75 de la cual: (i) cero a toda la secuencia de HBc esta presente desde la posición 76 hasta la 85, y (ii) una secuencia optativa de 6 a aproximadamente 48 residuos que constituyen una o más repeticiones de 6 a aproximadamente 24 residuos de un polipéptido M2 de influenza A de SEQ ID NO: 9. (c) dominio III es una secuencia de HBc desde la posición aproximadamente 86 hasta la posición aproximadamente 135 unida con enlace peptídico al residuo aproximado 85; d) El dominio IV contiene (i) los residuos de las posiciones aproximadas 136 a la 140 más hasta 16 residuos de una secuencia de residuos de aminoácidos de HBc desde la posición 141 hasta la 156 unida con enlace peptidico al residuo de la posición aproximada 135 del dominio III (ii) de 0 a 3 residuos de cisteína y (iii) hasta aproximadamente 100 residuos de aminoácidos en una secuencia heteróloga respecto a HBc desde la posición 156 hasta el C-terminal de HBc; esta molécula quimera (i) que contiene no más de 10% de residuos de aminoácidos sustituidos en forma conservativa en la secuencia HBc, (ii) autoensamble en partículas que estén prácticamente libres de unión a ácidos nucleicos tras la expresión en una célula hospedera, y estas partículas siendo más estables tras su formación en comparación con las partículas formadas de una HBc quimera de otro modo idéntica que carezca de residuo o residuos de cisteína N-terminales o en la que un residuo de cisteína N-terminal presente en la molécula quimera se sustituya por otro residuo.

2. La molécula de la proteína HBc quimera recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque uno de los residuos X? ó X?9 de uno de los polipéptido s M2 de SEQ ID NO: 9 es cisteína.

3. La molécula de la proteína HBc quimera recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque los residuos X?7 y X?9 de uno de los polipéptido s M2 de SEQ ID NO: 9 son serina o alanina.

4. La molécula de la proteína HBc quimera recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque los polipéptido s M2 de SEQ ID NO: 9 contienen los residuos X2 hasta X2 .

5. La molécula de la proteína HBc quimera recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque dos de los residuos Xi7 y X19 de uno de los polipéptidos M2 de SEQ ID NO: 9 son cisteína.

6. La molécula de la proteína HBc quimera recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el dominio I consiste prácticamente en la secuencia de HBc desde la posición 2 hasta la posición 75.

7. La molécula de la proteína HBc quimera recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el dominio 7 contiene cero' residuos de cisteína.

8. La molécula de la proteína HBc quimera recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el dominio IV esta libre de ' la secuencia heteróloga para la HBc en la posición 156 respecto al C-terminal .

9. La molécula de la proteína HBc quimera recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el dominio IV incluye una secuencia de aproximadamente 9 residuos de aminoácidos de la desde la posición del residuo 141 hasta la posición aproximada 149 unida con enlace peptídico al residuo 140.

10. La molécula de la proteína HBc quimera recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el dominio I incluye un residuo de cisteína N-terminal .

11. La molécula de la proteína HBc quimera recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque dominio IV incluye un residuo de cisteína C-terminal.

12. La molécula de la proteína HBc quimera recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el dominio 1 incluye tres de las secuencias polipeptídicas M2.

13. La molécula de la proteína HBc quimera recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque dominio I incluye dos de los polipéptidos' M2.

14. La molécula de la proteina HBc quimera recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque dominio II contiene los residuos de aminoácidos de la secuencia de HBc desde la posición 76 hasta la 85.

15. La molécula de la proteina HBc quimera recombinante de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque uno de los residuos Xi7 o Xig de uno de los polipéptidos M2 de SEQ ID NO: 9 es cisteína.

16. La molécula de la proteína HBc quimera recombinante de conformidad con la reivindicación 9, que tiene una longitud de aproximadamente 170 a aproximadamente*" 215 residuos .

17. Una molécula híbrida de la proteína del núcleo del virus de hepatitis B (HBc) recombinante con una secuencia de aproximadamente 150 a aproximadamente 235 residuos de aminoácidos que contiene 4 unidos con enlaces peptídicos desde el N-terminal, que se denominan dominios I, II, III y IV, en donde: (a) el dominio I contiene (i) aproximadamente 95 a aproximadamente 140 residuos de aminoácidos cuya secuencia incluye al menos la secuencia de los residuos de la posición 4 hasta aproximadamente la posición 75 de HBc, (ii) 1 a 3 residuos de cisteína, presentes en una posición en la molécula híbrida de aproximadamente 1 a aproximadamente 55 en relación con el N-terminal de HBc de SEQ ID NO: 1 [residuo o residuos de cisteína N-terminales], uno o más residuos de cisteina N-terminales estando presentes dentro de una secuencia que no sea la de la secuencia prenúcleo de HBc, y (iii) incluye 2 a 4 secuencias de aproximadamente 6 a aproximadamente 24 residuos del polipéptido M2 de influenza A de SEQ ID NO: 9 que esta unido con enlace peptídico a o dentro de aproximadamente 15 residuos de N-terminal de la secuencia de HBc, (b) dominio II contiene aproximadamente cero a aproximadamente 60 residuos de aminoácidos unidos con enlaces peptídicos al residuo aproximado 75 de la cual: (i) cero a toda la secuencia de HBc esta presente desde la posición 76 hasta la 85, y (ii) una secuencia optativa de 6 a aproximadamente 48 residuos que constituyen una o más repeticiones de 6 a aproximadamente 24 residuos de un polipéptido M2 de influenza A de SEQ ID NO: 9. (c) dominio III consiste principalmente en la secuencia de HBc desde la posición aproximada 86 hasta la posición aproximada 135; y d) El dominio IV contiene (i) los residuos de las posiciones aproximadas 136 a la 140 más hasta 16 residuos de una secuencia de residuos de aminoácidos de HBc desde la posición 141 hasta la 156 unida con enlace peptídico al residuo de la posición 135 del dominio III, (ii) 0 ó 1 residuo de cisteína y (iii) hasta aproximadamente 50 residuos de aminoácidos en una secuencia heteróloga respecto a HBc desde la posición 156 hasta el C-terminal de HBc; esta molécula quimera (i) que contiene no más de 10% de residuos de aminoácidos sustituidos en forma conservativa en la secuencia HBc, (ii) autoensamble en partículas que estén prácticamente libres de unión a ácidos nucleicos tras la expresión en una célula hospedera, y estas partículas siendo más estables tras su formación en comparación con las partículas formadas de una HBc quimera de otro modo idéntica que carezca de residuo o residuos de cisteína N-terminales o en la que un residuo de cisteína N-terminal presente en la molécula quimera se sustituya por otro residuo.

18. La molécula de la proteína HBc quimera recombinante de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque el dominio IV contiene una secuencia de aproximadamente 9 residuos de aminoácidos de la secuencia de HBc desde la posición de un residuo 141 hasta la posición aproximadamente 149 unida con enlace peptidico al residuo 140.

19. La molécula de la proteína HBc quimera recombinante de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque el dominio I incluye un residuo de cisteína N-terminal.

20. La molécula de la proteína HBc quimera recombinante de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque dominio IV incluye un residuo de cisteína C-terminal.

21. La molécula de la proteina HBc quimera recombinante de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque el dominio I incluye tres de las secuencias polipeptidicas M2.

22. La molécula de la proteína HBc quimera recombinante de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque dominio I incluye dos de los polipéptidos M2.

23. La molécula de la proteíná HBc quimera recombinante de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque los polipéptido s M2 de SEQ ID NO: 9 contienen los residuos Xs hasta X24.

24. La molécula de la proteína HBc quimera recombinante de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque el dominio II contiene los residuos de aminoácidos de la secuencia de HBc desde la posición 76 hasta 85.

25. La molécula de la proteína HBc quimera recombinante de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque el dominio II contiene los residuos de aminoácidos de la secuencia de HBc desde la posición 76 hasta la 85 que además contiene 6 a aproximadamente 23 residuos del polipéptido M2 de influenza A de SEQ ID NO: 9;

26. La molécula de la proteina HBc quimera recombinante de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque uno de los residuos X?7 y Xig del polipéptido M2 de SEQ ID NO: 9 es cisteína.

27. La molécula de la proteína HBc quimera recombinante de conformidad con la reivindicación 17, que tiene una longitud de aproximadamente 170 a aproximadamente 215 residuos .

28. Partículas compuestas de moléculas híbridas recombinantes de la proteina del núcleo del virus de hepatitis B (HBc) de conformidad con la reivindicación 1.

29. Las partículas compuestas de las moléculas híbridas recombinantes de la proteína del núcleo del virus de hepatitis B (HBc) de conformidad con la reivindicación 28 que contiene los 19 residuos C-terminales del polipéptido M2 de influenza A de SEQ ID NO: 9.

30. Las partículas compuestas de las moléculas híbridas recombinantes de la proteína del núcleo del virus de hepatitis B (HBc) de conformidad con la reivindicación 17.

31. Las partículas compuestas de las moléculas híbridas recombinantes de la proteína del núcleo del virus de hepatitis B (HBc) de conformidad con la reivindicación 30 que contienen los 19 residuos C-terminales del polipéptido M2 de influenza A de SEQ ID NO: 9.

32. Una vacuna o inoculo compuesto de una cantidad inmunógena eficaz de partículas ínmunógenas de conformidad con la reivindicación 28 disueltos o dispersos en un diluyente aceptado para uso farmacéutico.

33. Una vacuna o inoculo compuesto de una cantidad inmunógena eficaz de partículas ínmunógenas de conformidad con la reivindicación 30 disueltos o dispersos en un diluyente aceptado para uso farmacéutico.

34. La vacuna o inoculo de conformidad con la reivindicación 33 caracterizados porque las partículas de las moléculas de la proteina HBc quimérica recombinante están presentes en tejido de plantas.

35. La vacuna o inoculo de conformidad con la reivindicación 33 que además incluyen un adyuvante.

36. La vacuna o inoculo de conformidad con la reivindicación 35, caracterizados porque el adyuvante es alumbre.

37. La vacuna o inoculo de conformidad con la reivindicación 35, caracterizados porque el adyuvante es una molécula pequeña seleccionada del grupo consistente en un dipéptido muramilo, derivado de 8-oxo- ó 8-sulfo-guanosina sustituido en la posición 7, monofosforil lípido A, sales de aluminio o de calcio.

38. La vacuna o inoculo de conformidad con la reivindicación 35, caracterizados porque el adyuvante es un aceite que se emulsifica con las partículas inmunógenas y el diluyente aceptado para uso farmacéutico.

39. La vacuna o inoculo de conformidad con la reivindicación 38, caracterizados porque la emulsión es una emulsión agua en aceite que tiene una fase acuosa y una fase oleosa.

40. La vacuna o inoculo de conformidad con la reivindicación 38, caracterizados porque la emulsión es una emulsión aceite en agua que tiene una fase acuosa y una fase oleosa.

41. La vacuna o inoculo de conformidad con la reivindicación 40, caracterizados porque la fase oleosa es una emulsión que contiene escualeno.

42. La vacuna o inoculo de conformidad con la reivindicación 38, caracterizados porque la fase oleosa es una emulsión que contiene escualano.

43. La vacuna o inoculo de conformidad con la reivindicación 38, caracterizados porque las fases acuosa u oleosa de la emulsión se emulsifican mediante un agente emulsificador que es un éster de ácido graso de C?2-C24 de sorbitan o manide.

44. La vacuna o inoculo de conformidad con la reivindicación 38, caracterizados porque el agente emulsificador es un éste de ácido graso de Ci2-C24 de anide.

45. La vacuna o inoculo de conformidad con la reivindicación 44, caracterizados porque el ácido graso de Ci2-C24 del éster del ácido graso de C?2-C2 de manide es ácido oléico.

46. Un ácido nucleico que codifica una molécula de proteína HBc recombinante de conformidad con la reivindicación 1, o una variante, análogo o complemento de esta.

47. Un ácido nucleico que codifica una molécula de proteina HBc recombinante de conformidad con la reivindicación 17, o una variante, análogo o complemento de ésta.

48. Una molécula de ácido nucleico recombinante que contiene un vector ligado de manera operante a un segmento de ácido nucleico que define un gen que codifica una molécula de proteína HBc recombinante de conformidad con la reivindicación 1, o una variante, análogo o complemento de esta, y un promotor adecuado para dirigir la expresión del gen de un organismo hospedero compatible.

49. Una molécula de ácido nucleico recombinante que contiene un vector ligado de manera operante a un segmento de ácido nucleico que define un gen que codifica una molécula de proteina HBc recombinante de conformidad con la reivindicación 17, o una variante, análogo o complemento de esta, y un promotor adecuado para dirigir la expresión del gen de un organismo hospedero compatible.

50. Una célula hospedera transformada con una molécula de ácido nucleico recombinante de conformidad con la reivindicación 49.

51. La célula hospedera transformada de conformidad con la reivindicación 50, caracterizada porque la célula hospedera se selecciona del grupo, que consiste en E. coli S. typhi , S. Typhimurium y un híbrido S. typhimurium-E. coli .

52. Una célula hospedera transformada con una molécula de ácido nucleico recombinante de conformidad con la reivindicación 48.

53. La célula hospedera transformada de conformidad con la reivindicación 52, caracterizada porque la célula hospedera se selecciona del grupo que consiste en E. coli S. typhi , S. Typhimurium y un híbrido S. typhimurium-E. coli .'