MXPA06004334A - Metodos de sintetizacion de polipetidos heteromultimericos en levadura utilizando una estrategia de apareamiento haploide - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona métodos para la síntesis y secreción de proteínas hetero-multiméricas recombinantes en levaduras competentes en el apareamiento. Un primer vector de expresión es transformado en una primera célula haploide;y un segundo vector de expresión es transformado en una segunda célula haploide. Las células haploides transformadas, cada una que sintetiza individualmente un polipéptido no idéntico, son identificadas y luego cruzadas o fusionadas genéticamente. Las cepas diploides resultantes son utilizadas para producir y secretar la proteína hetero-multimérica biológicamente funcional y ensamblada totalmente.

Description

• MÉTODOS DE SINTETIZACION DE POLIPEPTIDOS HETEROMULTIMERICOS EN LEVADURA UTILIZANDO UNA ESTRATEGIA DE APAREAMIENTO HAPLOIDE CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona ~ métodos para la síntesis y secreción de proteínas hetero-multiméricas recombinantes en levaduras competentes en el apareamiento. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La producción de proteínas recombinantes es una actividad esencial para la selección de alto rendimiento, validación funcional, biología estructural, y producción de polipéptidos farmacéuticos. Escherichia coli es un organismo utilizado ampliamente para la expresión de proteínas heterólogas a causa de que el mismo crece fácilmente a una densidad celular elevada sobre substratos económicos, y tiene técnicas genéticas y vectores de expresión bien establecidos. Sin embargo, esto no siempre es suficiente para la producción eficiente de biomoléculas activas. Para que sean biológicamente activas, las cadenas de polipéptidos tienen que plegarse en la estructura tridimensional natural correcta, incluyendo la formación apropiada de enlaces de disulfuro, y pueden requerir además la asociación correcta de cadenas múltiples. Aunque el estado activo de la proteína puede ser favorecido termodinámicamente, la escala de tiempo para el Ref .172152 pliegue puede variar desde milisegundos hasta días. Se introducen barreras cinéticas, por ejemplo, por la necesidad de alineación de subunidades y subdominios . Y particularmente con las proteínas eucarióticas, se deben llevar a cabo reacciones covalentes para que se forme la proteína plegada correctamente . Estos últimos tipos de reacción incluyen la formación de enlaces de disulfuro, la isomerización cis/trans de la cadena de polipéptidos alrededor de los enlaces del péptido de prolina, el procesamiento de pre-proteína y la ligación de grupos prostéticos . Estas limitaciones cinéticas pueden conducir a la acumulación de compuestos intermedios plegados parcialmente que contienen superficies "adhesivas" hidrofóbicas expuestas, que promueven la auto-asociación y la formación de agregados . Los anticuerpos son proteínas tetraméricas, las cuales tienen muchos usos en el diagnóstico clínico y la terapia. Cada tetrámero de anticuerpos está compuesto de dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas. Los anticuerpos humanos o humanizados puros de un tipo específico son difíciles o imposibles de purificar en cantidades suficientes para muchos propósitos a partir de fuentes naturales. Como consecuencia, las compañías ' de biotecnología y farmacéuticas han cambiado a métodos recombinantes a base de ADN para prepararlos a gran escala. La producción de anticuerpos funcionales requiere no solo la síntesis de los dos polipéptidos sino también un número de modificaciones post-traduccionales, incluyendo el procesamiento proteolítico de la secuencia de la señal de secreción N-terminal; el pliegue y el montaje apropiados de los polipéptidos en los tetrámeros; la formación de enlaces de disulfuro; y la glicosilación N-enlazada específica. La totalidad de estos eventos se llevan a cabo en la ruta secretora de las células eucarióticas, un complejo de organelos único para las células eucarióticas. La síntesis recombinante de tales proteínas complejas ha tenido que estar basada en sistemas a base de un cultivo del tejido eucariótico más elevado para el material activo biológicamente. Sin embargo, los sistemas de producción a base de un cultivo del tejido de mamífero son significativamente más costosos y más complicados que los métodos de fermentación microbiana. Además, continúan existiendo cuestiones acerca de los productos terapéuticos producidos utilizando materiales derivados de los subproductos animales. Como un eucariota, Pichia pastoris tiene muchas de las ventajas de los sistemas de expresión eucariótica más elevados tales como el procesamiento de proteínas, el plegado de las proteínas, y la modificación post-traduccional, al mismo tiempo que es fácil de manipular como E. coli o Saccharomyces cerevisiae . La misma es más rápida, más fácil, y menos costosa de utilizar que otros sistemas de expresión eucariótica tales como los cultivos de tejido de baculovirus o mamífero, y generalmente proporciona niveles de expresión más elevados. Como una levadura, la misma comparte las ventajas de las manipulaciones moleculares y genéticas con Saccharomyces . Estas características hacen a la Pichia muy útil con un sistema de expresión de proteínas. Muchas de las técnicas desarrolladas por Saccharomyces pueden ser aplicadas a Pichia . Estas incluyen la transformación por complemento; la alteración genética y el reemplazo de genes. Además, la nomenclatura genética utilizada para Saccharomyces ha sido aplicada a Pichia . También existe un complemento cruzado entre los productos genéticos tanto en Saccharomyces como en Pichia . Varios genes del tipo silvestre de Saccharomyces complementan los genes mutantes comparables en Pichia . La expresión heteróloga en Pichia pastoris puede ser ya sea intracelular o secretada. La secreción requiere la presencia de una secuencia de la señal sobre la proteína expresada para ubicarla como objetivo con respecto a la ruta secretora . Aunque varias secuencias de la señal de secreción diferentes han sido utilizadas exitosamente, incluyendo la señal de secreción natural presente sobre algunas proteínas heterólogas, el éxito ha sido variable. Una ventaja potencial para la secreción de las proteínas heterólogas es que Pichia pastoris secreta niveles muy bajos de proteínas naturales. Esto, combinado con la cantidad muy baja de proteínas en el medio de crecimiento mínimo de Pichia, significa que la proteína heteróloga secretada comprende la vasta mayoría de las proteínas totales en el medio, y sirve como la primera etapa en la purificación de la proteína. Muchas especies de levadura, incluyendo Pichia, son componentes en el apareamiento. Esto hace posible que dos cepas haploides distintas se apareen de manera natural y generen una especie diploide que posee dos copias de cromosomas . Aunque P. pastoris ha sido utilizada exitosamente para la producción de varias proteínas heterólogas, por ejemplo, el antígeno superficial de la hepatitis B (Cregg et . al. (1987) Biol/Technology 5:479), el lisosoma y la invertasa (Digan et al. (1988) Dev. Indust . Micro 29:59; Tschopp et . al. (1987) Biol/Technology 5:1305), el intento de producir otros productos genéticos heterólogos en Pichia, especialmente por secreción, han proporcionado resultados mezclados. En el presente nivel de entendimiento del sistema de expresión de P. pastoris, es impredecible si un gen dado puede ser expresado a un nivel apreciable en esta levadura o si Pichia tolerará la presencia del producto genético recombinante en sus células. Además, es especialmente difícil prever si una proteína particular será secretada por P. pastoris, y si lo es, a que eficiencia. La presente invención proporciona métodos mejorados para la secreción de heteromultímeros heterólogos de la levadura competente para el apareamiento, incluyendo las especies de Pichia . BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se proporcionan métodos para la síntesis y secreción de proteínas heteromultiméricas recombinantes en levaduras competentes para el apareamiento. Las proteínas heteromultiméricas de interés comprenden al menos dos cadenas de polipéptidos no idénticas, por ejemplo cadenas ligera y pesada de anticuerpos, cadenas alfa y beta de MHC; y semejantes. Un vector de expresión es provisto para cada cadena de polipéptidos no idéntica. Cada vector de expresión es transformado en una célula de levadura haploide. En algunas modalidades de la invención, la célula de levadura haploide es marcada genéticamente, en donde la célula de levadura haploide es una de un par complementario. Un primer vector de expresión es transformado en una célula haploide y un segundo vector de expresión es transformado en una segunda célula haploide. En donde las células haploides van a ser apareadas, esto será por medio de fusión genética directa, o un evento semejante es inducido con fusión de esferoplastos . Los niveles de expresión de los polipéptidos no idénticos en las células haploides pueden ser calibrados individualmente, y ajustados por medio de la selección apropiada, el número de copias del vector, la inducción y/o la potencia del promotor y semejantes. En una modalidad de la invención, el promotor en cada vector de expresión es diferente. En otra modalidad de la invención, el mismo promotor es provisto para cada uno. Los promotores pueden ser constitutivos o inducibles . Las células haploides transformadas, cada una que sintetiza individualmente a un polipéptido no idéntico, son identificadas y luego cruzadas o fusionadas genéticamente. Las cepas diploides resultantes son utilizadas para producir y secretar una proteína heteromultimérica, totalmente ensamblada y biológicamente funcional . La metodología diploide permite el apareamiento de subunidades optimizadas para mejorar la generación y secreción del producto de longitud completa. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura ÍA, figura IB, figura 1C, y figura ID muestran la generación de anticuerpos recombinantes de longitud completa, ensamblados. La metodología de detección de inmuno-transferencia fue utilizada para caracterizar las cepas de Pichia haploides originales, cada una produciendo una subunidad del anticuerpo y la cepa diploide objetivo produciendo ambas subunidades que forman el anticuerpo ensamblado totalmente . Las cepas de levadura mostradas en la figura ÍA muestran un cultivo estático de cada una de las cepas representativas, en donde la porción superior es de las cepas haploides distintas que contienen subunidades de cadena ligera (L) y pesada (H) respectivamente; la parte inferior del diploide estable apareado produce ambas subunidades . La figura IB muestra la detección selectiva de la cadena H, la cual es encontrada solamente en el haploide de cadena H original, y el diploide apareado que contiene tanto a H como a L. La figura 1C muestra la detección general de las cadenas de H y L, las cuales establecen que la producción de proteína es activa en las tres cepas. La figura ID muestra la detección selectiva en la cepa diploide del anticuerpo completo ensamblado correctamente, que confirma que solamente el sistema diploide es capaz de generar el anticuerpo ensamblado totalmente. La figura 2 muestra la producción de anticuerpos de longitud total en Pichia pastoris . La expresión heteróloga del anticuerpo de longitud total fue llevada a cabo utilizando una cepa de Pichia pastoris diploide. La proteína del anticuerpo exportada fue aislada del medio acondicionado utilizando la cromatografía de afinidad de la proteína A. Una alícuota de la fracción del pico es mostrada. El estándar de IgG humana fue derivado de la IgG humana, agrupada, purificada.

La figura 3 muestra el anticuerpo ensamblado como fue detectado y caracterizado a partir de los sobrenadantes del medio de los subclones de las cepas de Pichia pastoris diploides, las cuales fueron diseñadas para producir el anticuerpo quimérico de ratón/ser humano, de longitud total. Las placas de microtitulación fueron recubiertas con anticuerpos selectivos de Fe anti-humano para capturar el anticuerpo del medio de cultivo. El anticuerpo ensamblado correctamente fue detectado por medio del uso de un (Fab') 2 selectivo, humano, que reconoció las regiones constantes de cadena ligera K y CHI pesada, agrupadas por pares. Las diluciones en serie del medio aclarado fueron aplicadas a la placa. El desarrollo fue por medio de métodos de visualización de ELISA estándares. La detección es selectiva como se muestra por la falta de cualquier señal detectable en el estándar de mlgG. La figura 4 muestra que los anticuerpos recombinantes generados por Pichia tienen las células T de Jurkat que contienen CD3 así como los anticuerpos derivados de mamíferos, tradicionales. Las células T de Jurkat fueron inmovilizadas sobre portaobjetos de vidrio y el teñido fue llevado a cabo utilizando el anticuerpo anti-CD3 generado en las células de levadura y de mamífero. La detección fue efectuada utilizando un anticuerpo secundario de anti-roedor conjugado-biotinilado, y desarrollado con un derivado de HRP- estreptavidina. Las imágenes son el campo representativo del portaobjetos tratado con cada anticuerpo recombinante. El fondo es el control para el desarrollo y se llevó a cabo la ausencia del anticuerpo anti-CD3 primario. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las proteínas heteromultiméricas recombinantes son secretadas de las cepas diploides de levaduras competentes en el apareamiento. Un par de células haploides de levadura marcadas genéticamente son transformadas con vectores de expresión que comprenden las subunidades de la proteína heteromultimérica. Una célula haploide comprende un primer vector de expresión, y una segunda célula haploide comprende un segundo vector de expresión. Opcionalmente, se pueden introducir vectores de expresión adicionales en las células haploides o diploides; o el primer o segundo vectores de expresión pueden comprender secuencias de codificación adicionales; para la síntesis de los heterotrímeros ; heterotetrámeros; etc, los niveles de expresión de los polipéptidos no idénticos pueden ser calibrados individualmente, y ajustados por medio de la selección apropiada, el número de copias del vector, la inducción y/o la potencia del promotor y semejantes. Las células haploides transformadas son fusionadas o cruzadas genéticamente. Las cepas diploides o tetraploides resultantes son utilizadas para producir y secretar la proteína heteromultimérica biológicamente funcional y totalmente ensamblada. El uso de células diploides o tetraploides para la producción de proteínas proporciona beneficios inesperados . Las células se pueden hacer crecer para propósitos de producción, es decir escaladas hacia arriba, y durante períodos prolongados de tiempo, en condiciones que pueden ser perjudiciales para el crecimiento de las células haploides, cuyas condiciones pueden incluir densidad de células elevada; crecimiento en el medio mínimo; crecimiento a temperaturas bajas; crecimiento estable en la ausencia de presión selectiva; y que pueden proporcionar mantenimiento de la integridad de la secuencia genética heteróloga y mantenimiento de la expresión de nivel elevado durante el transcurso del tiempo. Estos beneficios pueden surgir, al menos en parte, de la creación de cepas diploides a partir de dos cepas haploides originales distintas. Tales cepas haploides pueden comprender mutaciones auxotróficas menores numerosas, tales mutaciones son complementadas en el diploide o tetraploide, haciendo posible el crecimiento bajo condiciones altamente selectivas'. Definiciones Se va a entender que esta invención no está limitada a la metodología particular, protocolos, líneas celulares, especies o géneros de mamíferos, y reactivos descritos, porque pueden variar. También se va a entender que la terminología utilizada aquí es para el propósito de descripción solamente de las modalidades particulares, y no está propuesta para limitar el alcance de la presente invención que estará limitada solamente por las reivindicaciones anexas . Cuando se utilicen aquí, las formas singulares "un", "y" ' Y "el" incluyen referencias plurales a menos que el contexto dicte claramente otra cosa. Por consiguiente, por ejemplo, la referencia a "una célula" incluye una pluralidad de tales células y la referencia a "la proteína" incluye la referencia a una o más proteínas y equivalentes de las mismas, conocidas por aquellos expertos en el arte, y etc. La totalidad de los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por un experto con experiencia en el arte al cual esta invención pertenece, a menos que se indique claramente de otra manera . Especies de levadura competentes en el apareamiento . Tales especies de levadura existen en una forma haploide y una forma diploide. Las células diploides, bajo las condiciones apropiadas, pueden proliferar por un número indefinido de generaciones en la forma diploide. Las células diploides también pueden formar esporulados para formar células haploides. Además, el apareamiento secuencial puede conducir a cepas tetraploides a través del apareamiento adicional de los díploides auxotróficos . En una modalidad de la invención, la levadura competente en el apareamiento es un elemento de la familia de las Saccharomycetáceas , que incluye los géneros Arxiozyma, Ascobotryozyma; Ci teromyces; Debaryomyces ; Dekkera; Eremothecium; Issatchenkia; Kazachstania; Kluyveromyces ; Kodamaea; Lodderomyces ; Pachysolen; Pichia; Saccharomyces; Saturnispora; Tetrapisispora; Torulaspora; Williopsis; y Zygo saccharomyc s. El genero Pichia es de interés particular. Pichia comprende un número de especies, incluyendo las especies Pichia pastoris , Pichia methanolica y Hansenula polymorpha (Pichia angusta) . La especie más preferida es Pichia pastoris . Células de levadura haploides : Una célula que tiene una copia única de cada gen de su complemento genómico normal (cromosómico) . Células de levadura diploides : Una célula que tiene dos copias (alelos) de cada gen de su complemento genómico normal, formado típicamente por el proceso de fusión (apareamiento) de dos células haploides. Células de levaduras tetraploides . Una célula que tiene cuatro copias (alelos) de cada gen de su complemento genómico normal, formado típicamente por el proceso de fusión (apareamiento) de dos células haploides. Los tetraploides pueden llevar dos, tres o cuatro casetes diferentes. Tales tetraploides podrían ser obtenidos en S. cerevisiae por el apareamiento selectivo de los diploides heterotálicos a/a y alfa/alfa homozigóticos y en Pichia por el apareamiento secuencial de los haploides para obtener diploides auxotróficos . Por ejemplo, un haploide [met his] puede ser apareado con el haploide [ade his] para obtener el diploide [his]; y un haploide [met arg] puede ser apareado con el haploide [ade arg] para obtener el diploide [arg]; luego el diploide [his] x diploide [arg] para obtener un protótrofo tetraploide . Se entenderá por aquellos expertos en el arte que la referencia a los beneficios y usos de las células diploides también pueden aplicar a las células tetraploides. Apareamiento de la levadura : El proceso por el cual dos células de levadura haploides se fusionan naturalmente para formar una célula de levadura diploide . Meiosis : El proceso por el cual una célula de levadura diploide padece una división reductora para formar cuatro productos de esporas haploides . Cada espora puede germinar entonces y formar una línea celular que crece vegetativamente, haploide. Marcador seleccionable : Un marcador seleccionable es un gen o un fragmento de gen que confiere un fenotipo de crecimiento (característica de crecimiento físico) sobre una célula que recibe ese gen como, por ejemplo a través de un evento de transformación. El marcador seleccionable permite que la célula sobreviva y crezca en un medio de crecimiento selectivo bajo condiciones en las cuales las células que no reciben este gen marcador seleccionable, no pueden crecer. Los genes marcadores seleccionables generalmente están considerados en varios tipos, incluyendo los genes marcadores seleccionables positivos tal como un gen que confiere resistencia sobre una célula a un antibiótico u otro fármaco, a la temperatura cuando dos mutantes ts son cruzados o un mutante ts es transformado; los genes marcadores seleccionables negativos tal como un gen biosintético que confiere sobre una célula la capacidad de crecer en un medio sin un nutriente específico necesario por todas las células que no tienen ese gen biosintético, o un gen biosintético mutagenizado que confiere sobre una célula la incapacidad de crecer por las células que no tienen el gen del tipo silvestre; y semejantes. Los marcadores adecuados incluyen pero no están limitados a: ZEO; G418; HIS 5; LYS3; METÍ; MET3a; ADE1; ADE3 ; URA3 ; y semejantes. Vector de expresión : Aquellas especies de ADN contienen elementos que facilitan la manipulación para la expresión de un proteína extraña dentro de la célula hospedera objetivo. Convenientemente, la manipulación de las secuencias y la producción de ADN para la transformación es efectuada primero en un elemento hospedero bacteriano, por ejemplo E. coli , y usualmente los vectores que incluirán las secuencias para facilitar tales manipulaciones, incluyendo un origen bacteriano de replicación y un marcador de selección bacteriano, apropiado. Los marcadores seleccionados codifican las proteínas necesarias para la supervivencia o crecimiento de las células hospederas transformadas que crecieron en un medio de cultivo selectivo. Las células hospederas no i transformadas con el vector que contiene el gen de selección, no sobrevivirán en el medio de cultivo . Los genes de selección típicos codifican las proteínas que: (a) confieren resistencia a los antibióticos u otras toxinas, (b) complementan las deficiencias auxotróficas, o (c) suministran los nutrientes críticos no disponibles del medio complejo. Los vectores de expresión para su uso en los métodos de la invención incluirán además, secuencias específicas de levadura, incluyendo un marcador del fármaco o auxotrófico seleccionable para identificar las cepas de levadura transformadas. Un marcador del fármaco puede ser utilizado además para amplificar el número de copias del vector en una célula hospedera de levadura. La secuencia de codificación de polipéptidos de interés está enlazada operativamente a secuencias reguladoras transcripcionales y traduccionales que proporcionan la expresión del polipéptido en las células de levadura. Estos componentes del vector pueden incluir, pero no están limitados a, uno o más de los siguientes: un elemento mej orador, un promotor, y una secuencia de terminación de la transcripción. Las secuencias para la secreción del polipéptido pueden ser incluidas, por ejemplo, una secuencia de la señal, y semejantes. Un origen de replicación de la levadura es opcional, porque los vectores de expresión son integrados frecuentemente en el genoma de la levadura. En una modalidad de la invención, el polipéptido de interés es enlazado operativamente, o fusionado, a las secuencias que proporcionan la secreción optimizada del polipéptido de las células diploides de levadura. Los ácidos nucleicos están "enlazados operativamente" cuando son colocados en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos . Por ejemplo, el ADN para una secuencia de la señal está enlazado operativamente al ADN para un polipéptido si el mismo es expresado como una pre-proteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o mej orador está enlazado operativamente a una secuencia de codificación si el mismo afecta la transcripción de la secuencia. En general, "enlazado operativamente" significa que las secuencias de ADN que están enlazadas son contiguas, y, en el caso de un elemento delantero de secreción, contiguo y en fase de lectura. Sin embargo, los mej oradores no tienen que estar contiguos. El enlace es efectuado por ligadura en los sitios de restricción convenientes o alternativamente por medio de un método familiar de PCR/recombinación para aquellos expertos en el arte (GateWayR Technology; Invitrogen, Carlsbad California) . Si tales sitios no existen, los adaptadores de oligonucleótidos sintéticos o enlazadores son utilizados de acuerdo con la práctica convencional. Los promotores son secuencias no traducidas localizadas corriente arriba (5') con respecto al codón de inicio de un gen estructural (generalmente dentro de aproximadamente 100 hasta 1000 bp) , que controlan la transcripción y la traducción de la secuencia de ácidos nucleicos particulares a los cuales las mismas están enlazadas operativamente. Tales promotores están considerados dentro de varias clases: promotores inducibles, constitutivos, y represibles que incrementan los niveles de transcripción en respuesta a la ausencia de un represor. Los promotores inducibles pueden iniciar niveles incrementados de transcripción desde el ADN bajo su control, en respuesta a algún cambio en las condiciones del cultivo, por ejemplo, en la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en la temperatura. El fragmento del promotor de levadura también puede servir como el sitio para la recombinación e integración homologa del vector de expresión en el mismo sitio en el genoma de levadura; alternativamente, un marcador seleccionable es utilizado como el sitio para la recombinación homologa. La transformación de Pichia es descrita en Cregg et . al. (1985) Mol. Cell. Biol .5 : 3376-3385. Los ejemplos de los promotores adecuados de Pichia incluyen el promotor A0X1 (Cregg et . al. (1989) Mol . Cell .

Biol. 9:1316-1323); el promotor de ICL (Menendez et . al. (2003) Yeast 20 (13) : 1097-108) ; el promotor de la gliceraldehído-3 -fosfato deshidrogenasa (GAP) (Waterham et . al. (1997) Gene 186 (1) : 37-44) ; y el promotor de FLD1 (Shen et. al. (1998) Gene 216 (1) : 93-102) . El promotor GAP es un promotor constitutivo fuerte y los promotores AOX y FLD1 son inducibles . Los polipéptidos de interés pueden ser producidos recombinantemente no solo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, por ejemplo una secuencia de la señal u otro polipéptido que tenga un sitio de segmentación específico en la terminación N de la proteína madura o polipéptido. En general, la secuencia de la señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte de la secuencia de codificación del polipéptido que es insertada en el vector. La secuencia de la señal heteróloga seleccionada preferentemente es una que es reconocida y procesada por medio de una de las rutas estándares disponibles dentro de la célula hospedera. La señal pre-pro del factor alfa de S. cerevisiae ha probado que va a ser efectiva en la secreción de una variedad de proteínas recombinantes de P. pastoris . Las señales de secreción de interés también incluyen secuencias de la señal de mamíferos, las cuales pueden ser heterólogas con respecto a la proteína que es secretada, o pueden ser una secuencia natural para la proteína que es secretada. Las secuencias de la señal incluyen secuencias de pre-péptidos, en algunos casos pueden incluir secuencias de pro-péptidos . Muchas de tales secuencias de la señal ya son conocidas en el arte, incluyendo las secuencias de la señal encontradas sobre cadenas de inmunoglobulina, por ejemplo, la secuencia de pre-protoxina K28, PHA-E, FACE, MCP-1 humano, secuencias de la señal de la albúmina del suero humano, cadena pesada de Ig humana, cadena ligera de Ig humana, y semejantes. Por ejemplo, véase Hashimoto et . al. Protein Eng 11(2) 75 (1998); y Kobayashi et . al. Therapeutic Apheresis 2(4)257 (1998). La transcripción puede ser incrementada insertando una secuencia activadora transcripcional en el vector. Estos activadores son elementos de actuación cis del ADN, usualmente de manera aproximada desde 10 hasta 300 bp, que actúan sobre un promotor para incrementar su transcripción. Los mejoradores transcripcionales son relativamente independientes de la orientación y la posición, habiéndose encontrado 5' y 3' con respecto a la unidad de transcripción, dentro de un intrón, así como dentro de la propia secuencia de codificación. El mej orador puede ser empalmado en el vector de expresión en una posición 5' o 3' con respecto a la secuencia de codificación, pero está localizado preferentemente en un sitio 5' desde el promotor. Los vectores de expresión utilizados en las células hospederas eucarióticas también pueden contener secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Tales secuencias están disponibles comúnmente desde 3' hasta el codón de terminación de la traducción, en regiones no traducidas de los ADNs o cADNs eucarióticos o virales . Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida de ARNm. La construcción de los vectores adecuados que contienen uno o más de los componentes listados anteriormente, emplea técnicas de ligación o métodos de recombinación/PCR estándares . Los plásmidos aislados o los fragmentos de ADN son segmentados, adaptados, y re-ligados en la forma deseada para generar los plásmidos requeridos o por medio de métodos de recombinación. Para el análisis para confirmar las secuencias correctas en los plásmidos construidos, las mezclas de ligación son utilizadas para transformar las células hospederas, y los transformantes exitosos seleccionados por la resistencia a los antibióticos (por ejemplo, ampicilina o zeocina) en donde sea apropiado.

Los plásmidos de los transformantes son preparados, analizados por digestión de la endonucleasa de restricción y/o secuenciados . Como una alternativa a la restricción y ligación de los fragmentos, se pueden utilizar métodos de recombinación basados en los sitios att y en las enzimas de recombinación para insertar las secuencias de ADN en un vector. Tales métodos son descritos, por ejemplo, por Landy (1989) Ann. Rev. Biochem. 58:913-949; y ya son conocidos por aquellos expertos en el arte. Tales métodos utilizan la recombinación del ADN intermolecular que es mediada por una mezcla de proteínas de recombinación codificadas lambda y E. coli . La recombinación ocurre entre los sitios de fijación específicos (att) sobre las moléculas de ADN de interacción. Para una descripción de los sitios att véase Weisberg and Landy (1983) Site-Specific Recombination in Phage Lambda, in Lambda II, Weisberg, ed. (Cold Spring Harbor, NY. Cold Spring Harbor Press), pp. 211-250. Los segmentos de ADN que flanquean los sitios de recombinación son cambiados, tal como después de la recombinación, los sitios att son secuencias híbridas comprendidas de secuencias donadas por cada vector original . La recombinación puede ocurrir entre los ADNs de cualquier topología. los sitios att pueden ser introducidos en una secuencia de interés por la ligación de la secuencia de interés en un vector apropiado; la generación de un producto de PCR que contiene los sitios de att B por medio del uso de cebadores específicos; generando una biblioteca de ADNc clonada en un vector apropiado que contiene los sitios att; y semejantes. Plegado, como se utiliza aquí, se refiere a la estructura tridimensional de polipéptidos y proteínas, en donde las interacciones entre los residuos de aminoácidos actúan para estabilizar la estructura. Aunque las interacciones no covalentes son importantes en la determinación de la estructura, usualmente las proteínas de interés tendrán enlaces de disulfuro covalentes intra y/o intermoleculares formados por dos residuos de cisteína. Para las proteínas que están presentes de manera natural y los polipéptidos o derivados, y las variantes de los mismos, el plegado apropiado es típicamente el arreglo que conduce a una actividad biológica óptima, y puede ser verificado convenientemente por ensayos de actividad, por ejemplo la aglutinación del ligando, la actividad enzimática, etc. En algunos casos, por ejemplo en donde el producto deseado es de origen sintético, los ensayos basados en la actividad biológica serán menos significativos. El plegado apropiado de tales moléculas puede ser determinado con base a las propiedades físicas, consideraciones energéticas, estudios de modelación, y semejantes.

El elemento hospedero de expresión puede ser modificado además por la introducción de secuencias que codifican una o más enzimas que mejoran el plegado y la formación de enlaces de disulfuro, es decir, foldasas, chaperoninas , etc. Tales secuencias pueden ser expresadas constitutiva o induciblemente en la célula hospedera de levadura, utilizando vectores, marcadores, etc., como se sabe en el arte. Preferentemente, las secuencias, incluyendo los elementos reguladores transcripcionales suficientes para la configuración deseada de la expresión, son integradas establemente en el genoma de levadura por medio de una metodología objetivo. Por ejemplo, el PDI eucariótico no solamente es un catalizador eficiente de la oxidación de la cisteína de la proteína y de la isomerización del enlace de disulfuro, sino que también exhibe actividad de chaperón. La co-expresión de PDI puede facilitar la producción de proteínas activas que tienen enlaces de disulfuro múltiples. También es de interés la expresión de BIP (proteína de aglutinación de la cadena pesada de inmunoglobulina); ciclofilina; y semejantes. En una modalidad de la invención, cada una de las cepas originales haploides expresa una enzima de plegado distinta, por ejemplo, una cepa puede expresar BIP, y la otra cepa puede expresar PDI . Los términos "proteína deseada" o "proteína objetivo" son utilizados aquí intercambiablemente y se refieren en general a cualquier proteína secretada que tiene 2 o más cadenas de polipéptidos no idénticas, en donde tales cadenas son sintetizadas independientemente, es decir que no resultan de la segmentación post-traduccional de una cadena de polipéptido única. Los polipéptidos son heterólogos, es decir, extraños para la levadura. Preferentemente, los polipéptidos de mamíferos, es decir los polipéptidos codificados en un genoma de mamífero, son utilizados. En una modalidad preferida, la proteína es un anticuerpo. El término "anticuerpo" está propuesto para incluir cualquier estructura molecular que contiene una cadena de polipéptido, con una forma específica que se ajusta a, y que reconoce un epítopo, en donde una o más interacciones de aglutinación no covalentes estabilizan el complejo entre la estructura molecular y el epítopo. La molécula del anticuerpo del arquetipo es la inmunoglobulina, y todos los tipos de inmunoglobulinas, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, etc., de todas las fuentes, por ejemplo, de ser humano, roedor, conejo, vaca, oveja, cerdo, perro, otros mamíferos, pollos, otras aves, etc., se considera que son "anticuerpos". Numerosas secuencias de codificación de anticuerpos han sido descritas, y otras pueden ser formuladas por los métodos bien conocidos en el arte . Por ejemplo, los anticuerpos o fragmentos de aglutinación del antígeno pueden ser producidos por ingeniería genética. En esta técnica, como con otros métodos, las células que producen los anticuerpos son sensibilizadas hasta el antígeno o inmunógeno deseado. El ARN mensajero aislado de las células que producen anticuerpos, es utilizado como un molde para fabricar el ADNc utilizando la amplificación por PCR. Una biblioteca de vectores, cada una conteniendo un gen de cadena pesada y un gen de cadena ligera que retienen la especificidad del antígeno inicial, es producida por la inserción de secciones apropiadas del ADNc de inmunoglobulina amplificada en los vectores de expresión. Una biblioteca de combinaciones es construida combinando la biblioteca del gen de cadena pesada con la biblioteca del gen de cadena ligera. Esto conduce a una biblioteca de clones que co-expresan una cadena pesada y una ligera (que se asemeja al fragmento de Fab o al fragmento de aglutinación del antígeno de una molécula de anticuerpo) . Los vectores que llevan estos genes son co-transfectados en una célula hospedera. Cuando la síntesis del gen del anticuerpo es inducida en el elemento hospedero transfectado, las proteínas de la cadena ligera y pesada se autoensamblan para producir anticuerpos activos que puedan ser detectados por selección con el antígeno o inmunógeno . Las secuencias de codificación de los anticuerpos de interés incluyen aquellos codificados por las secuencias naturales, así como los ácidos nucleicos que, en virtud de la degeneración del código genético, no son idénticos en la secuencia a los ácidos nucleicos descritos, y variantes de los mismos . Varios polipéptidos pueden incluir substituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos (aa) . Las substituciones de aminoácidos pueden ser substituciones de aminoácidos conservadoras o substituciones para eliminar los aminoácidos no esenciales, tales como para alterar un sitio de glicosilación, o para minimizar el plegado erróneo por la substitución o deleción de uno o más residuos de cisteína que no son necesarios para la función. Las variantes pueden ser diseñadas para que retengan o tengan una actividad biológica mejorada de una región particular de la proteína (por ejemplo, un dominio funcional, residuos de aminoácidos catalíticos) . Las variantes también incluyen los fragmentos de los polipéptidos descritos aquí, particularmente los fragmentos activos biológicamente y/o los fragmentos que corresponden a los dominios funcionales . Las técnicas para la mutagénesis in vitro de los genes clonados ya son conocidas. También están incluidos en la invención objeto los polipéptidos que han sido modificados utilizando técnicas biológicas moleculares, ordinarias, para mejorar su resistencia a la degradación proteolítica o para optimizar las propiedades de solubilidad o para hacerlos más adecuados como un agente terapéutico.

Los anticuerpos quiméricos se pueden hacer por medios recombinantes, combinando las regiones de la cadena ligera y pesada (VK y VH) , variables, obtenidas de las células que producen anticuerpos de una especie con las regiones de la cadena ligera y pesada, constantes, de la otra. Típicamente, los anticuerpos quiméricos utilizan regiones variables de roedor o de conejo y regiones constantes del ser humano para producir un anticuerpo con dominios predominantemente humanos. La producción de tales anticuerpos quiméricos es bien conocida en el arte, y puede ser lograda por medios estándares (como se describe, por ejemplo, en la patente U.S. No. 5,624,659, incorporada totalmente aquí para referencia) . Los anticuerpos humanizados están diseñados para contener dominios de inmunoglobulina aún más semejantes a los humanos, e incorporar solamente las regiones de determinación de la complementariedad del anticuerpo derivado del animal. Esto es efectuado examinando cuidadosamente la secuencia de los bucles hiper-variables de las regiones variables del anticuerpo monoclonal, y adaptándolos a la estructura de las cadenas del anticuerpo humano. Aunque es de confrontación compleja, el proceso es directo en la práctica. Véase, por ejemplo, la patente U.S. No. 6,187,287, incorporada totalmente aquí para referencia. Además de las inmunoglobulinas completas (o sus contrapartes recombinantes) , los fragmentos de inmunoglobulina que comprenden el sitio de aglutinación del epítopo (por ejemplo, Fab', F(ab') , u otros fragmentos) pueden ser sintetizados. El "fragmento", o inmunoglobulinas mínimas pueden ser diseñadas utilizando técnicas de inmunoglobulina recombinante. Por ejemplo, las inmunoglobulinas de "Fv" para su uso en la presente invención pueden ser producidas sintetizando una región de cadena ligera variable y una región de cadena pesada variable. Las combinaciones de los anticuerpos también son de interés, por ejemplo diabodies, que comprenden dos especificidades de Fv distintas . Las inmunoglobulinas pueden ser modificadas post-traduccionalmente, por ejemplo, para agregar enlazadores químicos, porciones detectables, tales como tintes fluorescentes, enzimas, substratos, porciones quimioluminescentes y semejantes, o porciones de aglutinación específicas, tales como estreptavidina, avidina, o biotina, y semejantes puedan ser utilizados en los métodos y composiciones de la presente invención. Métodos de síntesis de polipéptidos Las células de levadura haploides competentes en el apareamiento, transformadas, proporcionan un método genético que hace posible la agrupación por pares de subunidades de una proteína deseada. Las cepas de levaduras haploides son transformadas con cada uno de dos vectores de expresión, un primer vector para dirigir la síntesis de una cadena de polipéptidos y un segundo vector para dirigir la síntesis de una segunda cadena de polipéptidos no idéntica. Las dos cepas haploides son apareadas para proporcionar un elemento hospedero diploide en donde se puede obtener una producción de proteínas objetivo optimizadas. Opcionalmente, se proporciona (n) secuencia (s) de codificación no idéntica (s) adicional (es) . Tales secuencias pueden estar presentes sobre vectores de expresión adicionales o en el primer o el segundo vectores de expresión. Como se sabe en el arte, la secuencia de codificación múltiple puede ser expresada independientemente a partir de promotores individuales; o pueden ser expresada de manera coordinada por medio de la inclusión de un "sitio de entrada del ribosoma interno" o "IRES", el cual es un elemento que promueve la entrada del ribosoma interno directo al codón de inicio, tal como ATG, de un cistrón (una región de codificación de la proteína) , por lo cual conduce a la traducción independiente de cap del gen. Los elementos de IRES funcionales en la levadura son descritos por Thompson et. al. (2001) P.N.A.S. 98:12866-12868. En una modalidad de la invención, las secuencias del anticuerpo son producidas en combinación con una cadena secretoria J, la cual proporciona la estabilidad mejorada de IgA (véanse las patentes U.S. Nos. 5,959,177; y 5,202,422). Las dos cepas de levadura haploide son cada una auxotróficas, y requieren el suplemento del medio para el crecimiento de las células haploides.. El par de auxótropos son complementarios, de tal modo que el producto diploide crecerá en la ausencia de los suplementos requeridos para las células haploides. Muchos de tales marcadores genéticos son conocidos en la levadura, incluyendo los requerimientos para los aminoácidos (por ejemplo met, lys, his, arg, etc . ) , nucleósidos (por ejemplo ura3 , adl, etc. ) ; y semejantes. Los marcadores de aminoácidos pueden ser preferidos para los métodos de la invención. Las dos células haploides transformadas pueden ser cruzadas genéticamente y las cepas diploides que surgen de este apareamiento, seleccionadas por sus requerimientos nutritivos híbridos. Alternativamente, las poblaciones de las dos cepas haploides transformadas son tratadas con esferoplastos y fusionadas, y la progenia diploide regenerada y seleccionada. Por cualquier método, las cepas diploides pueden ser identificadas y se hacen crecer selectivamente a causa de que, a diferencia de sus padres haploides, las mismas no tienen los mismos requerimientos nutritivos. Por ejemplo, las células diploides se pueden hacer crecer en un medio mínimo. La estrategia de síntesis diploide tiene ciertas ventajas. Las cepas diploides tienen el potencial para producir niveles mejorados de la proteína heteróloga a través del complemento más amplio hasta las mutaciones subyacentes, lo cual puede tener un impacto en la producción y/o secreción de la proteína recombinante. En una modalidad de la invención, cada una de las cepas haploides es transformada con una biblioteca de polipéptidos, por ejemplo una biblioteca de cadenas ligera y pesada de los anticuerpos . Las células haploides transformadas que sintetizan los polipéptidos son apareadas con las células haploides complementarias . Las células diploides resultantes con seleccionadas por la proteína funcional . Las células diploides proporcionan un medio para conjuntar de manera rápida, conveniente y económica, un gran número de combinaciones de polipéptidos para la prueba funcional . Esta tecnología es especialmente aplicable para la generación de productos de proteína heterodimérica, en donde los niveles de síntesis de subunidades, optimizados, son críticos para la expresión y secreción de proteínas funcionales . En otra modalidad de la invención, la relación del nivel de expresión de las dos subunidades es regulada para maximizar la generación del producto. Los niveles de la proteína de la subunidad del heterodimero se han mostrado previamente que tienen un impacto en la generación del producto final (Simmons LC, J Immunol . Methods. mayo del 2002 1;263 (1-2) : 133-47) . La regulación puede ser lograda previo a la etapa de apareamiento por la selección para un marcador presente sobre el vector de expresión. Incrementando establemente el número de copias del vector, se puede incrementar el nivel de expresión. En algunos casos, puede ser deseable incrementar el nivel de una cadena con relación a la otra, para alcanzar una proporción balanceada entre las subunidades del polipéptido. Los marcadores de resistencia de antibióticos son útiles para este propósito, por ejemplo el marcador de resistencia de zeocina, el marcador de resistencia de G418, etc., y proporcionan un medio de enriquecimiento para las cepas que contienen copias integradas múltiples de un vector de expresión en una cepa, por la selección de transformantes que son resistentes a niveles más elevados de zeocina o G418. La relación apropiada, por ejemplo 1:1; 1:2; etc., de los genes de la subunidad puede ser importante para la producción eficiente de la proteína. Aún cuando el mismo promotor es utilizado para transcribir ambas subunidades, muchos otros factores contribuyen al nivel final de proteína expresada y por lo tanto, pueden ser útiles para incrementar el número de copias de un gen codificado con relación al otro. Alternativamente, las cepas diploides que producen niveles más elevados de un polipéptido, con relación a las cepas del vector de una sola copia, son creadas apareando dos cepas haploides, ambas de copia, las cuales tienen copias múltiples de los vectores de expresión. Las células hospederas son transformadas con los vectores de expresión descritos anteriormente, apareadas para formar cepas diploides, y cultivadas en un medio nutriente convencional modificado cuando sea apropiado para incluir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas . Un número de medios adecuados mínimos para el crecimiento de la levadura ya son conocidos en el arte . Cualquiera de estos medios puede ser suplementado cuando sea necesario con sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio, y fosfato) , amortiguadores (tal como HEPES) , nucleósidos (tales como adenosina y timidina) , antibióticos, elementos de traza, y glucosa o una fuente de energía equivalente . También se pueden incluir cualesquiera otros suplementos necesarios a las concentraciones apropiadas que podrían ser conocidas por aquellos expertos en el arte. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, el pH y semejantes, son aquellas utilizadas previamente con la célula hospedera seleccionada para la expresión, y serán evidentes para el artesano con experiencia ordinaria. Las proteínas secretadas son recuperadas del medio de cultivo. Un inhibidor de la proteasa, tal como un fluoruro de fenilmetil sulfonilo flúor (PMFS) , puede ser útil para inhibir la degradación proteolítica durante la purificación, y los antibióticos pueden ser incluidos para prevenir el crecimiento de contaminantes adventicios. La composición puede ser concentrada, filtrada, dializada, etc., utilizando los métodos conocidos en el arte . Las células diploides de la invención se hacen crecer para propósitos de producción. Tales propósitos de producción incluyen deseablemente el crecimiento en un medio mínimo, tal medio carece de aminoácidos pre-formados y otras biomoléculas complejas, por ejemplo un medio que comprende amoniaco como una fuente de nitrógeno, y glucosa como una fuente de energía y carbón, y sales como una fuente de fosfato, calcio y semejantes. Preferentemente tal medio de producción carece de agentes selectivos tales como los antibióticos, aminoácidos, purinas, pirimidinas, etc. Las células diploides se pueden hacer crecer hasta una densidad celular elevada, por ejemplo, al menos aproximadamente 50 g/1; más usualmente al menos aproximadamente 100 g/1; y puede ser de al menos de aproximadamente 300, aproximadamente 400, aproximadamente 500 g/1 o mayor. En una modalidad de la invención, el crecimiento de las células objeto para los propósitos de producción es efectuado a temperaturas bajas, tales temperaturas pueden ser reducidas durante la fase logarítmica, durante la fase estacionaria, o ambas. El término "temperatura baja" se refiere a temperaturas de al menos aproximadamente 15 °C, más usualmente al menos aproximadamente 17 °C, y puede ser .de aproximadamente 20 °C, y usualmente no es mayor que aproximadamente 25 °C, más usualmente no mayor que aproximadamente 22 °C. La temperatura de crecimiento puede tener un impacto en la producción de las proteínas secretadas de longitud completa en los cultivos de producción, y la reducción de la temperatura de crecimiento del cultivo puede mejorar fuertemente el rendimiento del producto intacto. La temperatura reducida parece que ayuda al tráfico intracelular a través del pliegue y las rutas de procesamiento post-traduccionales, utilizadas por el elemento hospedero para generar el producto objetivo, en compañía de la reducción de la degradación de la proteasa celular. Los métodos de la invención proporcionan la expresión de una proteína activa, secretada, particularmente anticuerpos activos, secretados, en donde "anticuerpos activos", como se utiliza aquí, se refiere a un multímero plegado correctamente de al menos dos cadenas agrupadas por parejas apropiadamente, que se aglutinan exactamente a su antígeno análogo. Los niveles de expresión de la proteína activa son usualmente de al menos aproximadamente 50 mg/litro del cultivo, más usualmente de al menos aproximadamente 100 mg/litro, preferentemente al menos aproximadamente 500 mg/litro, y pueden ser de 1000 mg/litro o mayor.

Los métodos de la invención pueden proporcionar una estabilidad incrementada del elemento hospedero y de las secuencias de codificación heterólogas durante la producción. La estabilidad es evidenciada, por ejemplo, por el mantenimiento de niveles elevados de expresión del tiempo, en donde el inicio del nivel de expresión es reducido en no más de aproximadamente 20 %, usualmente no más de 10 %, y puede ser reducido en no más de aproximadamente 5 % durante aproximadamente 20 dobleces, 50 dobleces, 100 dobleces o más. La estabilidad de la cepa también proporciona el mantenimiento de la integridad de la secuencia del gen heterólogo durante el transcurso del tiempo, en donde la secuencia de la codificación activa de la secuencia y los elementos reguladores transcripcionales requeridos, son mantenidos en al menos aproximadamente 99 % de las células diploides, usualmente en al menos aproximadamente 99.9 % de las células diploides, y preferentemente en al menos aproximadamente 99.99 % de las células diploides durante aproximadamente 20 dobleces, 50 dobleces, 100 dobleces, o un número mayor. De manera preferente, substancialmente todas las células diploides mantienen la secuencia de la secuencia de codificación activa y los elementos reguladores transcripcionales requeridos. Se va a entender que esta invención no está limitada a la metodología particular, protocolos, líneas celulares, especies o géneros de animales, construcciones, y reactivos descritos, porque ellos pueden variar por supuesto. También se va a entender que la terminología utilizada aquí es con el propósito de describir solamente las modalidades particulares, y no está propuesta para limitar el alcance de la presente invención, la cual estará limitada solamente por las reivindicaciones anexas . A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el mismo significado como el entendido comúnmente por una persona de experiencia ordinaria en el arte a la cual pertenece esta invención. Aunque cualesquiera métodos, dispositivos y materiales semejantes o equivalentes a aquellos descritos aquí pueden ser utilizados en la práctica o prueba de la invención, los métodos, dispositivos y materiales preferidos serán descritos ahora. Todas las publicaciones mencionadas aquí son incorporadas para referencia con el propósito de descripción y que describen, por ejemplo, las líneas celulares, construcciones y metodologías que son descritas en las publicaciones, que podrían ser utilizadas con relación a la invención descrita actualmente. Las publicaciones descritas anteriormente y en todo el texto son provistas solamente para su descripción previo a la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada aquí va a ser interpretado como una aceptación de que los inventores no están facultados para anteponer tal descripción en virtud de la invención previa. Los siguientes ejemplos son descritos para proporcionar a aquellas personas con experiencia ordinaria en el arte, una descripción y referencia completa de como fabricar y utilizar la invención objeto, y no está propuesta para limitar el alcance de lo que es considerado como la invención. Se han hecho esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los números utilizados (por ejemplo cantidades, temperatura, concentraciones, etc.), pero algunos errores experimentales y desviaciones deben ser permitidos . A menos que se indique de otra manera, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio, la temperatura está en grados centígrados; y la presión está en o cerca de la atmosférica. Sección experimental Ejemplo 1 Para demostrar la eficacia del método de producción de anticuerpos diploides, se prepararon los siguientes reactivos. Genes de anticuerpos : Los genes que fueron clonados y construidos dirigieron la síntesis de las tres formas de un anticuerpo monoclonal de ratón humanizado quimérico 0KT3. Las fuentes de las regiones variables para su uso en estas construcciones pueden ser encontradas en Genbank. Número de acceso A22261; cadena pesada de OKT3 de ratón (solicitud de patente internacional WO 9109967-A 3, 11 de julio de 1991) .

Número de acceso A22259; cadena ligera de OKT3 de ratón (solicitud de patente internacional WO 9109967-A 3, 11 de julio de 1991) . Todas las tres formas utilizaron el gen de cadena ligera VKCK idéntica (SEC ID NO : 10) . Para los tres genes de cadena pesada, todos codificaron la región variable de ratón idéntica (Vh) pero fueron diferentes entre sí en la secuencia de aminoácidos de las regiones constantes de cadena pesada humana. La primera construcción se dirigió a la síntesis de una cadena pesada del tipo silvestre, de longitud total (Cr?) , con su sitio de glicosilación N-enlazado normal, presente, (cadena pesada glicosilada de longitud total) (SEC ID NO: 13 y No. 14) . El segundo gen dirigió la síntesis de una cadena pesada no glicosilada creada por la mutación de un nucleótido en la secuencia de manera que la treonina en la posición 301 fue cambiada a la alanina en la secuencia de reconocimiento del sitio de glicosilación (ASN-X-Thr/Ser) (Cadena pesada no glicosilada de longitud completa) (SEC ID NO: 15) . El tercer gen se construyó dirigido a la síntesis de una cadena pesada en la cual la mayoría de la región constante fue delecionada después de la región de unión (cadena pesada de Fab) (SEC ID NO: 16) . Vector- de expresión: El vector contiene los siguientes componentes funcionales: 1) un origen. de duplicación de ColEl mutante, que facilita la duplicación del vector del plásmido en las células de la bacteria Escherichia coli ; 2) un gen Sh ble bacteriano, que confiere resistencia a la zeocina antibiótica y sirve como el marcador seleccionable para las transformaciones tanto de E. coli como P. pastoris; 3) un cásete de expresión compuesto del promotor del gen de la gliceraldehído deshidrogenasa (gen de GAP) , fusionado a las secuencias que codifican la secuencia delantera de secreción pre pro del factor de apareamiento alfa de Saccharomyces cerevisiae, seguido por las secuencias que codifican una señal de terminación transcripcional de P. pastoris a partir del gen de la alcohol oxidasa I (AOX1) de P. pastoris . El gen marcador de resistencia de zeocina proporciona un medio de enriquecimiento para las cepas que contienen copias integradas múltiples de un vector de expresión en una cepa, por la selección de los transformantes que son resistentes a niveles elevados de zeocina. Cepas de P. pastoris : Las cepas auxotróficas utilizadas para este ejemplo son las cepas adel y ura3 de P. pastoris, las cuales requieren suplementación con adenida y uracilo, respectivamente, para el crecimiento. También se han utilizado las cepas metí y lys3 . Aunque dos conjuntos complementarios cualquiera de cepas auxotróficas pueden ser utilizados para la construcción y mantenimiento de las cepas diploides, estas dos cepas son especialmente adecuadas para este método por dos razones. En primer lugar, las mismas crecen más lentamente que las cepas diploides que son el resultado de su apareamiento o fusión. Por consiguiente, si un número pequeño de células adel o ure3 haploides permanecen presentes en un cultivo o surgen por medio de meiosis u otro mecanismo, la cepa diploide debe hacerlos crecer en el cultivo. Lo segundo es que es fácil verificar el estado sexual de estas cepas puesto que las colonias del producto diploide de su apareamiento son de un color blanco o crema normal, mientras que las células de cualesquiera cepas que son mutantes de adel haploides en un • cultivo forman una colonia con un rosa distinto en el color. Además, cualesquiera cepas que son mutantes de ura3 haploides son resistentes al ácido 5-fluoro-orótico del fármaco (FOA) y pueden ser identificadas sensiblemente por la colocación en placas de las muestras de un cultivo de un medio mínimo + placas de uracilo con FOA. De estas placas, solamente las cepas del mutante ura3 que requieren uracilo (presumiblemente haploides) puede crecer y formar colonias. Por consiguiente, con las cepas originales haploides marcadas con adel y ura3 , se puede verificar fácilmente el estado sexual de las cepas diploides que producen anticuerpos, resultantes, (haploides contra diploides) .

Métodos Construcción de vectores de expresión de pGAPZ-alfa para la transcripción de genes de anticuerpos de cadena ligera y pesada . Para la clonación de las regiones variables tanto de cadena ligera como pesada, las células de una línea celular del hibridoma de 0KT3 Cd3 del ratón se hicieron crecer y se extrajo el ARN total. Luego se efectuaron dos reacciones de RT-PCR, una específica para la cadena ligera y otra específica para las secuencias de codificación de la región variable de la cadena pesada y de los genes del anticuerpo de OKT3. Los cebadores empleados para amplificar la región variable de cadena ligera y pesada fueron (SEC ID NO : 1) 5 ' -CCGCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTCAGGTCCAGCTGCAGCAGTC-3 ' y (SEC ID NO: 3) 5'-CCGCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTCAAATTGTTCTCACCCAGTCTCC-3' en compañía de SEC ID NO: 2) 5'-TGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGTGC-3' y SEC ID NO : 4) 5'- GACAGATGGTGCAGCCACAGCCCGG TTTATTTCCAACTTTGTCC-3 'para las regiones variables respectivas . Para los genes de región constante de la cadena ligera y pesada, humanos, un estiramiento 5' del leucocito humano más la biblioteca del ADNc fue comprado de Clontech (HL 5019t) . Dos reacciones de PCR fueron efectuadas sobre esta biblioteca utilizando los cebadores específicos para las regiones constantes de la cadena ligera y pesada, respectivamente (cadena pesada: (SEC ID NO: 6) 5'- GCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCA-3' y la (SEC ID NO: 5) 5'-ATAAGAATGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGGAG-3' para la longitud completa en compañía de la (SEC ID NO: 7) 5'-5. TGCGGCCGCTCATGGGCACGGTGGGCATGTGT-3' para la generación de FAB; cadena ligera: (SEC ID NO: 9) 5'- GGACAAAGTTGGAAATAAACCGGGCTGTGGCTGCACCATCTGTC-3' y SEC ID NO: 8) 5 ' -ATAAGAATGCGGCCGCTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCT-3 ' . Una secuencia de ADN que codifica la región variable 0 de la cadena ligera del ratón fue fusionada en un marco con una secuencia que codifica la región constante de cadena ligera humana (SEC ID NO: 11 y SEC ID NO: 12) . Un fragmento que codifica la construcción de fusión final fue insertado en el vector de expresión pGAPZ-alfa de P. pastoris por medio de 5 la ligación a través de los sitios 5 '-Xhol y 3 ' -Notl en pGAPZ-alfa. La secuencia da ADN que codifica la región variable pesada del ratón fue fusionada en un marco para la codificación de las secuencias de cada una de las tres regiones constantes de la cadena pesada humana. Estos productos de fusión fueron insertados entonces utilizando una estrategia de 5 '-Xhol y 3 ' -Notl semejante en pGAPZ-alfa. (SEC ID NO: 13 y SEC ID NO: 14 para la versión glicosilada; SEC ID NO: 15 para la versión aglicosilada; SEC ID NO: 16 para el fragmento de Fab) . Las secuencias de ADN del gen del anticuerpo apropiado en todos los vectores fueron confirmadas por la secuenciasión directa de ADN previo a un trabajo adicional . Transformación de vectores de expresión en cepas hospederas adel, ura3 , metí y lys3 haploides de P. Pastoris. Todos los métodos utilizados para la transformación de las cepas de P. pastoris haploides y la manipulación genética del ciclo sexual de P. pastoris fueron como se describieron en Higgins, D. R. , y Cregg, J. M. Eds. 1998. Pichia Protocols . Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ. Previo a la transformación, cada vector de expresión fue linearizado dentro de las secuencias promotoras de GAP con Avril para dirigir la integración de los vectores en el sitio del promotor de GAP del genoma de P. pastoris. Las muestras de cada vector fueron transformadas entonces individualmente en cultivos electrocompetentes de las cepas adel, ura3 , metí y lys3 por electroporación y los transformantes exitosos fueron seleccionados sobre placas de YPD zeocina por su resistencia a este antibiótico. Las colonias resultantes fueron seleccionadas, marcadas para establecer colonias únicas sobre las placas de YPD zeocina y luego examinadas para verificar la presencia del injerto del gen del anticuerpo por un ensayo de PCR sobre el ADN genómico extraído de cada cepa para el inserto del gen del anticuerpo apropiado y/o por la capacidad de cada cepa para sintetizar una cadena del anticuerpo por un método de levantamiento/inmunotransferencia de la colonia (Wung et . al. Biotechniques 21 808-812 (1996) . Las cepas adel, metí y lys3 haploides que expresan una de las tres construcciones de cadena pesada, fueron colectadas para las construcciones diploides en compañía de la cepa ura3 haploide que expresa un gen de cadena ligera. Los genes de cadena pesada que expresan el haploide fueron apareados con el ura3 haploide de cadena ligera apropiado para generar la proteína de secreción diploide . Apareamiento de cepas haploides que sintetizan una cadena de anticuerpos única y selección de derivados diploides gue sintetizan los anticuerpos funcionales tetraméricos . Para aparear las cepas haploides de P. pastoris, cada cadena pesada de adel (o met 1 o lys3) que - produce la cepa que va a ser cruzada, fue marcada con rayas a través de una placa rica en YPD y la cepa productora de la cadena ligera de ura 3 fue marcada con una raya a través de una segunda placa de YPD (~10 rayas por placa) . Después de uno o dos días de incubación, a 30 °C, las células de una placa que contiene las cepas de la cadena pesada y una placa que contiene las cepas de cadena ligera de ura3 fueron transferidas a una tela de terciopelo estéril sobre un bloque para la colocación en las placas de las réplicas en una configuración las rayas transversales de modo que cada cepa de cadena pesada contuvo un parche de células mezcladas con cada cepa de cadena' ligera. Las células colocadas en placas con réplicas rayadas transversalmente fueron transferidas entonces a una placa de apareamiento e incubadas a 25 °C para estimular el inicio del apareamiento entre las cepas. Después de dos días, las células sobre las placas de apareamiento fueron transferidas nuevamente a un terciopelo estéril sobre un bloque para la colocación en placas de las réplicas y luego se transfirieron a placas de un medio mínimo. Estas placas fueron incubadas a 30 °C durante tres días para permitir el crecimiento selectivo de colonias de cepas diploides prototróficas . Las colonias que surgen fueron recogidas y marcadas con rayas sobre una segunda placa del medio mínimo para aislar y purificar una colonia única de cada cepa diploide. Las líneas celulares diploides resultantes fueron examinadas entonces para verificar la producción de anticuerpos. Las cepas diploides putativas fueron probadas para demostrar que las mismas fueron diploides y contuvieron ambos vectores de expresión para la producción de anticuerpos . Para verificar que sean diploides, las muestras de una cepa fueron dispersadas sobre placas de apareamiento para estimularlas a reproducirse por medio de meiosis y formar esporas. Los productos de esporas haploides fueron colectados y probados para el fenotipo. Si un porcentaje significativo de los productos de esporas resultantes fueron auxótropos, únicos o dobles, se concluyó que la cepa original debe haber sido diploide . Las cepas diploides fueron examinadas para verificar la presencia de ambos genes de anticuerpos extrayendo el ADN genómico de cada una y utilizando este ADN en las reacciones de PCR específicas para cada gen. Fusión de cepas haploides que sintetizan una cadena de anticuerpos única y selección de derivados diploides que sintetizan los anticuerpos funcionales tetraméricos . Como una alternativa al procedimiento de apareamiento descrito anteriormente, los cultivos individuales de los anticuerpos de una sola cadena que producen cepas de adel y ura3 haploides, fueron tratados con esferoplastos y sus esferoplastos resultantes fueron fusionados utilizando polietilenglicol/CaCl2. Las cepas haploides fusionadas fueron sumergidas entonces en agar que contiene sorbitol 1 M y un medio mínimo para permitir que las cepas diploides regeneren su pared celular y crezcan en colonias visibles. Las colonias resultantes fueron retiradas del agar, marcadas con rayas sobre una placa del medio mínimo, y las placas fueron incubadas durante dos días a 30 °C para generar colonias de células únicas de las líneas celulares diploides. Las líneas celulares diploides putativas, resultantes, fueron examinadas entonces para verificar si son diploides y para verificar la producción de anticuerpos como se describió anteriormente . Purificación y análisis de los anticuerpos . Una cepa diploide para la producción de anticuerpos de longitud completa fue derivada por medio del apareamiento de la cepa 2252 de cadena ligera ura3 y la cepa 2254 de cadena pesada lys3 , utilizando los métodos descritos anteriormente. El medio de cultivo de un frasco de agitación o los cultivos del termentador de las cepas de expresión de P. pastoris diploides fueron colectados y examinados para verificar la presencia de la proteína del anticuerpo por medio de SDS-PAGE e inmunotransferencia, utilizando anticuerpos dirigidos contra las cadenas pesada y ligera de IgG humana, o específicamente contra la cadena pesada de IgG. Los datos son mostrados en la figura 2. Para purificar los anticuerpos secretados por levadura, los medios aclarados de los cultivos que producen anticuerpos se hicieron pasar a través de una columna de proteína A y después del lavado con fosfato de sodio 20 mM, pH 7.0, amortiguador de aglutinación, la proteína unida a la proteína A fue eluida utilizando el amortiguador de glicina HCl 0.1 M, pH 3.0. Las fracciones que contienen la mayoría de la proteína total fueron examinadas por SDS-PAGE sometida a un proceso con azul de Coomasie e inmunotransferencia para la proteína del anticuerpo. Las fracciones también fueron examinadas por medio de un ensayo de ELISA en el cual las placas de microtitulación fueron recubiertas primero con IgG anti-humana de cabra, F(ab')2, Fc? (Jackson Immuno, Cat. No. 109-006-008) . A continuación las placas se hicieron reaccionar con diluciones seleccionadas de levadura hecha de anticuerpos. Finalmente, las placas se hicieron reaccionar con el fragmento F(ab')2 anti-humano, de cabra, conjugado con HRP de IgG F(ab')2 (Jackson Immuno Cat. No. 109-036-097). Las placas fueron desarrolladas entonces con el substrato de TMP (Sigma Chemical) y las reacciones fueron apagadas con HCl 0.5 M. Los resultados fueron cuantificados sobre un lector de placas de microtitulación BioRad a 415 nm. Los datos son ilustrados en la figura 3. Ensayo para verificar la actividad de los anticuerpos . El anticuerpo quimérico derivado de levadura recombinante fue evaluado para verificar su actividad funcional por medio del teñido inmunohistoquímico de las células que contienen el antígeno objetivo. El anticuerpo quimérico reconoce selectivamente el complejo de CD3 encontrado sobre las células T. Las células T de Jurkat fueron empleadas como una fuente del antígeno y el teñido de la superficie celular fue llevado a cabo utilizando los procedimientos descritos en Andersson y Sander (Immunol Lett. enero de 1989 31;20(2): 115-20) o Andersson et . al. (Eur. J. Immunol. Diciembre de 1988; 18 (12) :2081-4) . Las células T de Jurkat fueron inmovilizadas sobre portaobjetos de vidrio, bloqueadas con el suero de bloqueo apropiado y teñidas con el anticuerpo primario recombinante generado por el mamífero y la levadura durante 1 hora. Las muestras inmovilizadas fueron tratadas entonces con el agente de bloqueo de peroxidasa seguido por el teñido con un anticuerpo secundario selectivo de Fe biotinilado, que es específico para cada forma del anticuerpo (anti-ratón para el mamífero y anti-humano para la levadura) . La detección fue efectuada utilizando un sistema HRP-estreptavidina. La formación de imágenes digitales fue efectuada para colectar datos para cada muestra teñida. La señal positiva es detectada en las muestras por medio del teñido oscuro de las células observadas en los paneles para OKT-3 derivado del mamífero y derivado de la levadura. Estos son los datos mostrados en la figura 4. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (21)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Un método para la síntesis de una proteína heteromultimérica secretada, que comprende al menos dos cadenas de polipéptidos de subunidades no idénticas en una célula diploide de levadura, caracterizado porque comprende: transformar una primera célula haploide de levadura con un primer vector de expresión, el vector de expresión comprende una primera subunidad de la proteína, enlazada operativamente a un primer promotor de levadura; transformar una segunda célula haploide de levadura con un segundo vector de expresión, el vector de expresión comprende una segunda subunidad de la proteína, enlazada operativamente a un segundo promotor de levadura; generar una célula diploide a partir de la primera y segunda células haploides de levadura; cultivar la célula diploide bajo condiciones en donde la primera y segunda subunidades son expresadas y secretadas como la proteína multimérica.
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la célula diploide de levadura es de una especie de Pichia .
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la especie de Pichia es seleccionada del grupo que consiste de Pichia pastoris, Pichia methanolica y Pichia angu sta .
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína heteromultimérica es un anticuerpo que comprende al menos una región variable de una cadena ligera y de una cadena pesada.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la proteína heteromultimérica es un anticuerpo que comprende al menos una región variable y una región constante de una cadena pesada y una cadena ligera.
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el primer vector de expresión comprende una biblioteca de secuencias de cadena ligera o de cadena pesada y el segundo vector de expresión comprende una secuencia de cadena ligera o pesada, única.
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el primer vector de expresión comprende una biblioteca de secuencias de cadena ligera y pesada y el segundo vector de expresión comprende una biblioteca de secuencias de cadena ligera o pesada.
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la primera y la segunda células haploides de levadura son auxótrofos complementarios.
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la etapa de generar una célula diploide a partir de la primera y segunda células haploides de levadura, comprende el apareamiento de las células haploides.
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la etapa de generar una célula diploide a partir de la primera y segunda células haploides de levadura, comprende la fusión de esferoplastos de la primera y segunda células haploides.
11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende la etapa de calibrar el nivel de expresión de la primera y segunda subunidades, previo a la generación de la célula diploide.
12. 12. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el primer promotor de levadura y el segundo promotor de levadura son los mismos.
13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el primer promotor de levadura y el segundo promotor de levadura son diferentes .
14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque uno o ambos de los promotores de levadura son promotores constitutivos .
15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque uno o ambos de los promotores de levadura son promotores inducibles.
16. 16. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el promotor es un promotor de GAP.
17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque al menos las cadenas de polipéptidos de subunidades no idénticas comprenden una secuencia de la señal optimizada para la secreción y expresión diploide.
18. 18. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa de cultivo es efectuada en un medio mínimo .
19. 19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el medio mínimo carece de agentes selectivos .
20. 20. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etapa de cultivo es efectuada a una temperatura baja.
21. 21. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína multimérica es secretada por las células diploides a una concentración de al menos aproximadamente 100 mg/litro del cultivo.