MXPA05013606A

MXPA05013606A - Secrecion mejorada de neublastina

Info

Publication number: MXPA05013606A
Application number: MXPA/A/2005/013606A
Authority: MX
Inventors: Lars U Wahlberg; Nborg Mette Gr; Philip Kusk; E Jens Torn; Nels E Pederson; William P Sisk
Original assignee: Biogen Idec Ma Inc; Groenborg Mette; Philip Kusk; Nsgene A/S; Nels E Pederson; William P Sisk; Tornoee Jens; Lars U Wahlberg
Priority date: 2003-06-10
Filing date: 2005-12-09
Publication date: 2006-10-17

Abstract

La presente invención se refiere a métodos y composiciones para producir un polipéptido de neublastina asícomo a la administración local de neublastina a regiones específicas del sistema nervios incluyendo el sistema nervioso central y el ojo por ejemplo mediante terapia génica;el polipéptido de neublastina biológicamente activo se produce a partir de una construcción que no codifica la pro-región de neublastina que se presenta de manera natural, por ejemplo una construcción que comprende unácido nucleico con una secuencia promotora operativamente asociada a una secuencia nucleotídica que codifica un péptido señal y un polipéptido de neublastina, en donde dicha secuencia nucleotídica no codifica una pro-región de neublastina.

Description

SECRECIÓN MEJORADA DE NEUBLASTINA Todas las referencias citadas en la presente solicitud se incorporan en la presente invención como referencia en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a métodos y composiciones para producir un polipéptido de neublastina así como a la administración local de neublastina a regiones específicas del sistema nervioso incluyendo el sistema nervioso central y el ojo por ejemplo mediante terapia génica. La invención incluye la administración de neublastina a partir de células transducidas o transfectadas encapsuladas dentro de una macrocápsula con una membrana semipermeable. La invención se refiere adicionalmente a células de mamífero capaces de producir neublastina en cantidades incrementadas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las células tienen formas para dirigir a la síntesis de proteínas de novo hacia diversos compartimentos de las células y al espacio extracelular. Los péptidos señal se describen en la parte codificante del ADN cromosomal y se sintetizan como parte de la proteína mediante el aparato ribosomal. Los péptidos señal elaboran el N-terminal y ocasionan que los polipéptidos recientemente sintetizados se dirijan hacia el retículo endoplásmico rugoso. En la presente invención, el péptido señal se escinde a partir del polipéptido y la proteína madura se secreta hacia los alrededores. Por lo tanto, el péptido señal permanece dentro de la célula. La pro-parte de la proteína se escinde a partir de la parte madura de la proteína y termina fuera de la célula. Para algunos factores neurotróficos, por ejemplo NGF, la pro-parte de la proteína es bioactiva como un neuropéptido. En terapia génica en donde el gen insertado codifica para una proteína la cual va a ser secretada, se necesitará colocar una secuencia señal en frente de la proteína madura para asegurar su procesamiento adecuado a través del retículo endoplásmico rugoso y el aparato de Golgi. La primera elección es casi invariablemente la secuencia señal nativa de la proteína en cuestión, debido a que generalmente se desea que la proteína se secrete y/o procese en la misma forma como ésta se secreta y/o procesa por la célula nativa. Para algunos usos también se desea que la cantidad de proteína expresada sea la misma que en la célula nativa. Además, uno no puede excluir la posibilidad de que la secuencia señal escindida desempeñe un papel en el metabolismo de la célula. Finalmente un experto en la técnica podría elegir utilizar la parte de la pre-pro-proteína para asegurar el procesamiento y plegamiento correcto de la proteína madura.

En muchos casos ha resultado que las células transducidas y transfectadas in vivo las cuales se supone que secretan un factor terapéutico no secretan el factor terapéutico en cantidades terapéuticamente adecuadas y por tiempo suficiente. Este también puede ser un problema en la terapia génica ex vivo en donde las células son transfectadas o transducidas fuera de cuerpo e insertadas dentro del paciente después de la modificación genética. La técnica precedente no provee mucha información con respecto al acoplamiento del péptido señal con proteínas heterólogas en los mamíferos. Para la expresión heteróloga de proteínas de mamífero en hongos o levaduras, es una práctica común el reemplazar el péptido señal de mamífero con uno que es funcional en las especies productoras.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método para producir un polipéptido de neublastina biológicamente activo, que comprende cultivar una célula que comprende un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia promotora operativamente asociada a una secuencia nucleotídica que codifica un péptido señal y un polipéptido de neublastina, en donde dicha secuencia nucleotídica no codifica una pro-región de neublastina. El pre pro polipéptido nativo de humano de neublastina es de 220 aminoácidos de longitud (figura 17A) (SEQ ID NO: 10). El péptido señal de neublastina consiste de 39 aminoácidos, iniciando con metionina en la posición 1 y terminando con alanina en la posición 39 (figura 17B). El prodominio de neublastina más largo de longitud total consiste de 69 aminoácidos, iniciando con serina en la posición 40 y terminando con arginina en la posición 107 (figura 17C). Un polipéptido maduro de neublastina consiste de los 113 aminoácidos C terminales, iniciando con alanina en la posición 108 y terminando con glicina en la posición 220. La pre-pro-Neublastina contiene varios sitios posibles de escisión del pro-péptido y la expresión de pre-pro-Neublastina en células de mamífero resulta en la secreción de una variedad de formas posibles de péptidos maduros, que consisten de los aminoácidos 140, 113, 107, y 104 C-terminales. Para cada una de estas formas maduras, existe un pro-dominio correspondiente elaborado de los aminoácidos a partir de la posición 40, a la posición que precede el primer residuo en el péptido maduro. La presente invención provee una solución al problema de ausencia casi completa de secreción del factor neurotrófico, incluyendo neublastina, frecuentemente experimentada después de la transducción de células de mamífero con vectores virales tanto in vivo como in vitro. También se observó el fenómeno para vectores de expresión basados en plásmido. Por algunas razones desconocidas las células de mamífero frecuentemente se bloquean para la secreción del factor neurotrófico codificado por el vector. Una explicación posible podría ser que el procesamiento correcto de las proteínas secretadas es específico de la célula. Esto representa un problema severo en el uso de terapia génica por vector viral. Actualmente, la terapia génica por vector viral se considera el método más preferido (si no el único relevante) para terapia génica in vivo o ex vivo debido a que los vectores virales aseguran la integración estable dentro de la célula transducida. La invención se provee para la expresión eficiente de una neublastina madura de humano, o una truncación biológicamente activa de una neublastina madura de humano, por ejemplo, un polipéptido secretado de neublastina, como una pre proteína, en lugar de como una pre pro proteína. Una pre proteína de neublastina de conformidad con la invención generalmente comprende dos componentes: un polipéptido secretado de neublastina (como se definió anteriormente), y una secuencia señal heteróloga. Además los presentes inventores han mostrado que mediante el reemplazo del péptido señal nativo de neublastina con un péptido señal alternativo a partir de otras proteínas, tales como a partir de la región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina, la secreción de neublastina se mejora adicionalmente, especialmente a partir de las células transducidas. Además los presentes inventores han mostrado que mediante la remoción de la secuencia nucleotídica que codifica la pro-región a partir de la secuencia nucleotídica que codifica el péptido señal así como el polipéptido de neublastina, es posible entonces expresar y tener una mayor cantidad de neublastina secretada, que si se incluyera la pro-región.

Se ha encontrado que aunque la pro-región es necesaria para que se plieguen correctamente muchas proteínas, es posible producir un polipéptido de neublastina biológicamente activo sin una pro-región. En un aspecto adicional la invención se refiere a la secuencia nucleotídica que codifica el péptido señal y el polipéptido de neublastina, el vector de expresión que comprende la secuencia nucleotídica, una composición farmacéutica que comprende el vector de conformidad con la invención y uno o más adyuvantes, excipientes, vehículos y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables. La composición farmacéutica se puede utilizar para terapia génica in vivo y ex vivo. En un aspecto adicional la invención se refiere a una célula hospedera aislada transducida o transfectada con el vector de conformidad con la invención. Dichas células hospederas genéticamente modificadas han resultado que producen cantidades inesperadamente elevadas de neublastina en comparación con las células transducidas o transfectadas con vectores que codifican neublastina con su secuencia señal nativa. Por lo tanto estas células hospederas transducidas o transfectadas constituyen una fuente prometedora de células productoras para la producción a escala industrial de neublastina. Las células que secretan neublastina también se pueden utilizar para transplante dentro de sujetos mamíferos como una fuente de neublastina. Una aplicación particular es la terapia génica ex vivo.

En un aspecto adicional la invención se refiere a una línea celular empaquetadora capaz de producir una partícula de vector infeccioso, dicha partícula de vector que comprende un genoma retroviralmente derivado que comprende una LTR retroviral 5', un sitio de unión a ARNt, una señal de empaquetamiento, un promotor operativamente asociado a una polisecuencia nucleotídica que codifica la proteína de fusión que comprende neublastina y un péptido señal de inmunoglobulina, un origen de, la síntesis de la segunda cadena de ADN y una LTR 3' retroviral. Estas líneas celulares empaquetadoras se pueden utilizar para la producción de vectores virales de conformidad con la invención. Estas también se pueden utilizar para la terapia génica in vivo cuando son encapsuladas y transplantadas al SNC. En un aspecto adicional, la invención se refiere a un mamífero transgénico no humano que comprende al menos una célula que se transduce o transfecta con el vector de conformidad con la invención. Dichos animales que sobre-expresan neublastina se pueden utilizar para perfilamiento génico y en la secreción y desarrollo de fármacos. Preferiblemente la célula transducida o transfectada tiene el genotipo del animal individual, por ejemplo no es un transplante alogenéico o xenogenéico. En un aspecto adicional, la invención se refiere a un dispositivo implantable para cultivo celular, el dispositivo que comprende: una membrana semipermeable que permite la difusión de un factor neurotrófico a través de ésta; y al menos una célula hospedera aislada de conformidad con la invención. Estas cápsulas se pueden utilizar para la administración local de neublastina después del transplante dentro del sistema nervioso central. La administración localizada y prolongada del factor de crecimiento es un método de administración preferido para el tratamiento de numerosos trastornos del SNC, incluyendo pero no limitados a enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, accidente cerebrovascular, y esclerosis amiotrófica lateral (ALS). Las cápsulas se pueden utiliza de manera similar para administración local y prolongada de neublastina para trastornos periféricos incluyendo pero no limitados a neuropatía y dolor neuropático. Las indicaciones adicionales incluyen trastornos oculares. Las cápsulas de esta invención se proveen para la administración de partículas virales a un sitio deseado en un paciente utilizando un método capsular. La encapsulación de las líneas celulares que producen el vector permite la administración continua de la partícula viral al sitio blanco, en oposición a una infusión particular. Además, es posible la terapia repetida, con probabilidad reducida de ataque inmune. Las cápsulas que tienen poros lo suficientemente grandes para permitir el paso de partículas virales liberadas a partir de las células empaquetadoras, aún así previenen el paso de la célula hospedera hacia la cápsula.

Este método capsular incrementa la seguridad y control de la terapia debido a que los dispositivos se pueden retirar fácilmente (terminando el tratamiento de transducción) o explantando y reimplantando (modificando el tratamiento). Además, se reduce la oportunidad de infección debido a que el dispositivo capsular no se abre o externaliza. Finalmente, debido a que la encapsulación previene que las células empaquetadoras migren dentro del paciente, y prolongada la viabilidad de las células empaquetadoras después del implante, probablemente son necesarias menos células para esta terapia. Esto puede ser ventajoso en la disminución adicional de una reacción inmune en el paciente. En un aspecto adicional la invención se refiere al uso del vector de conformidad con la invención como un medicamento. En incluso un aspecto adicional la invención se refiere al uso del vector de conformidad con la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno del sistema nervioso. En otro aspecto la invención se refiere al uso del vector de conformidad con la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno del SNC. Además, la invención se refiere a un método para el tratamiento de una enfermedad del sistema nervioso, dicho método comprendiendo la administración a un individuo que necesita del mismo de: una cantidad terapéuticamente efectiva del vector de la invención; o una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica que comprende el vector. De conformidad con este aspecto de la invención se proveen métodos mejorados de terapia génica in vivo para el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso. Como se evidencia por los ejemplos anexos, la transducción con los vectores virales de la presente invención resulta en secreción no observada hasta la fecha de la neublastina codificada y como una consecuencia del efecto terapéutico mejorado. En incluso un aspecto adicional la invención se refiere a un método para el tratamiento de una enfermedad del sistema nervioso, dicho método comprendiendo el transplante a un individuo que necesita del mismo de: - una cantidad terapéuticamente efectiva de las células transducidas de la invención; o - un dispositivo implantable de conformidad con la invención o Este aspecto provee otra manera para el tratamiento de trastornos del sistema nervioso basados en terapia génica ex vivo e implante de células terapéuticas capaces de secretar cantidades incrementadas de neublastina. El método actualmente preferido para la producción a gran escala de neublastina es la expresión heteróloga en E. coli, lisis subsecuente, extracción, purificación, replegamiento y opcionalmente escisión de la proteína. Un método alternativo el cual se utiliza para la producción de cantidades para escala de investigación incluye el cultivo de una célula productora de mamífero tales como células CHO que secretan correctamente, procesan y pliegan neublastina dentro del medio de cultivo, a partir del cual ésta se puede aislar de manera relativamente fácil. Las células de mamífero de la presente invención producen neublastina en cantidades superiores que las vistas anteriormente para las células de mamífero y, por lo tanto representan una fuente mejorada de células para la producción de neublastina bioactiva, la cual es neublastina procesada correctamente y plegada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1 : Alineamiento de las secuencias de IgSP a partir de diversos mamíferos. Figura 2: Mapa del vector de la construcción del vector lentiviral pHsC.IgSP.hNBN.W utilizada para los experimentos de transducción en el ejemplo 2. Figura 3: Mapa del vector del pNS1n.1gSP.hNBN. La misma secuencia de IgSP-NBN como de pHsC.IgSP.hNBN.W entre los sitio de restricción BamH y Xhol utilizados en el ejemplo 1. Figuras 4A a 4C: Determinación de la actividad NBN en el ELISA RetL3 (muestras duplicadas). (Fig. 4A) Actividades de NBN en los sobrenadantes celulares se determinaron utilizando Artemina recombinante de ratón producida en E. coli (mART) como estándar, (Fig. 4B) Análisis de los sobrenadantes a partir de las células transfectadas, (Fig. 4C) Análisis de los sobrenadantes a partir de las células transducidas. Figuras 5A a 5B: Análisis Western blot con el anticuerpo anti-NBN #378. (Fig. 5A) Análisis de afinidad de GFR[alfa]3 purificado NBN a partir de células CHO-NBN16 (CHO-NBN) y 20 ng de NBN recombinante de rata (rNBN) (Fig. 5B) Análisis de sobrenadantes a partir de ARPE-19 transfectadas o transducidas con construcciones de expresión IgSP-NBN y dos clonas celulares de CHO que sobre-expresan de manera estable NBN a partir de la construcción de tipo silvestre (CHO-NBN25c y CHO-NBN16). Las flechas indican la posición de los monómeros glicosilados y no glicosilados de neublastina después de la reducción por el anticuerpo #378. Figuras 6A a 6B: Predicción del péptido señal de escisión por la señal. Para explicación véase el ejemplo 4. Figuras 7A a 7B: La figura 7A muestra el plásmido pHs C.hNBN.W y la figura 7B muestra el plásmido pHsCXW. Para explicación véase el ejemplo 6. Figuras 8A a 8C: La figura 8A muestra el NBN liberado relativo al medio condicionado y las figuras 8B y 8C muestran NBN en diferentes líneas celulares, véase también el ejemplo 7. La figura 9 ilustra la secuencia de los 104 aminoácidos carboxi (C) terminales del polipéptido de neublastina nativa de humano (SEQ ID NO: 19) y la secuencia de ADN correspondiente que codifica los 104 aminoácidos C terminales de la neublastina nativa de humano (SEQ ID NO: 58) alineada con un gen sintético que codifica los 104 aminoácidos C terminales de la neublastina nativa de humano optimizada para la expresión en célula CHO (SEQ ID NO: 59). Los nucleótidos en el gen sintético que han sido cambiados a partir de la secuencia nativa están indicados (*). La figura 10 ilustra la secuencia de neublastina dentro del plásmido pNBN026-35 (SEQ ID NO: 60). Inmediatamente corriente arriba de la secuencia presentada se encuentra un dinucleótido "CT" que contribuye a un sitio de restricción Xhol. Inmediatamente cascada abajo se encuentra un sitio de restricción BamHI. La figura 11 ilustra la secuencia de ADN (SEQ ID NO: 61) y de aminoácidos (SEQ ID NO: 62) de los 104 aminoácidos C terminales de neublastina fusionados a una secuencia señal sintética. La secuencia señal está subrayada. La figura 12 ilustra la secuencia de ADN (SEQ ID NO: 63) y de aminoácidos (SEQ ID NO: 64) de los 104 aminoácidos C terminales de neublastina fusionados a una secuencia señal de neublastina. La secuencia señal está subrayada. La figura 13A ilustra la secuencia de ADN (SEQ ID NO: 65) y de aminoácidos (SEQ ID NO: 66) de los 104 aminoácidos C terminales de neublastina fusionados a una secuencia señal de albúmina. La secuencia señal está subrayada. La figura 13B ilustra la secuencia de ADN (SEQ ID NO: 69) y de aminoácidos (SEQ ID NO: 70) de los 104 aminoácidos C terminales de neublastina fusionados a una secuencia señal modificada de albúmina. La secuencia señal está subrayada. La figura 14 ilustra la secuencia de ADN (SEQ ID NO: 67) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 68) de los 104 aminoácidos C terminales de neublastina fusionados a una secuencia señal de hormona de crecimiento de humano. La secuencia señal, la cual contiene un intrón, está subrayada. Las figuras 15A a 15B ilustran los resultados del espectrómetro de masas de neublastina secretada a partir de las células CHO utilizando la secuencia señal de albúmina (Fig. 15A) o la secuencia señal de hormona de crecimiento de humano (Fig. 15B) (Fig. 15C). Los picos en 11 ,156 y 11 ,157 daltones corresponden a un fragmento C terminal de neublastina de 104 aminoácidos. Los picos en 11,084 y 11 ,085 daltones corresponden a un fagmento C terminal de neublastina de 103 aminoácidos. La figura 15A ilustra la neublastina desglicosilada a partir de la secreción dirigida por albúmina. La figura 15B ilustra la neublastina desglicosilada a partir de la secreción dirigida de la hormona de crecimiento de humano. La figura 15C ilustra neublastina a partir de la secreción dirigida por la hormona de crecimiento de humano. Los picos con masas más grandes corresponden a la presencia de diversas glicoformas. La figura 16 ilustra los resultados del ensayo KIRA que demuestran la actividad de neublastina recombinantemente producida en células CHO.

La figura 17A ilustra la secuencia de aminoácidos de neublastina de longitud total incluyendo la proteína madura, el pro-dominio y el péptido señal (SEQ ID NO: 10). La figura 17B ilustra la secuencia de aminoácidos del péptido señal de neublastina nativa de longitud total. La figura 17C ilustra la secuencia de aminoácidos del pro-dominio de neublastina de longitud total.

Definiciones "Aminoácidos C terminales", como se utiliza en la presente invención, significa una serie de aminoácidos contiguos en una cadena polipeptídica más distal a partir del amino (N) terminal del polipéptido. "Pro-región de neublastina" significa una región que comprende al menos aminoácidos que corresponden a los aminoácidos -41 a -11 de SEQ ID NO: 10, 11 , 12. "Prepropolipéptido de neublastina," (SEQ ID NO: 10) como se utiliza en la presente invención, significa un polipéptido que consiste de neublastina madura de humano, por ejemplo, los 113 aminoácidos C terminales de neublastina (aminoácidos 108 a 220 de SEQ ID NO: 10), la longitud total del pro-dominio de neublastina de humano, por ejemplo, los 68 aminoácidos proximales al N terminus de la neublastina madura (aminoácidos 40 a 107 de SEQ ID NO: 10), y el péptido señal de neublastina de humano, por ejemplo, los 39 aminoácidos proximales al N terminal del pro-dominio de neublastina (aminoácidos 1 a 39 de SEQ ID NO: 10).

Péptido señal - péptido señal eucarióntico. Un péptido señal eucarióntico es un péptido presente sobre las proteínas que se destinan ya sea para que sean secretadas o para que sean componentes de la membrana. Esta es usualmente N-terminal a la proteína. En el presente contexto, todos los péptidos señal identificados en SignalP (versión 2.0 o preferiblemente versión 3.0) se consideran un péptido señal. "Péptido señal de neublastina funcional", como se utiliza en la presente invención, significa los primeros 39 aminoácidos de SEQ ID NO: 10 o cualquier porción de la misma que afecta la secreción de la neublastina madura a partir de una célula. "Secuencia señal de neublastina funcional" significa una secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido señal de neublastina funcional. Un péptido señal de mamífero es un péptido señal derivado a partir de una proteína de mamífero secretada a través del ER. El polipéptido de neublastina maduro de humano como se utiliza en la presente invención significa los 113 aminoácidos C-terminales de neublastina nativa de humano, por ejemplo aminoácidos 108-220 de SEQ ID No. 10 El polipéptido maduro de ratón de neublastina como se utiliza en la presente invención significa los 113 aminoácidos C-terminales de neublastina nativa de ratón, por ejemplo aminoácidos 112-224 de SEQ ID No. 11 El polipéptido de neublastina madura de rata como se utiliza en la presente invención significa los 113 aminoácidos C-terminales de neublastina nativa de rata, por ejemplo aminoácidos 112-224 de SEQ ID No. 12 El polipéptido de neublastina como se utiliza en la presente invención significa un polipéptido que comprende los 99-140 aminoácidos C-terminales de Neublastina nativa de humano, los 99-144 aminoácidos C-terminales de Neublastina nativa de rata o de ratón. Más preferiblemente un polipéptido de neublastina comprende los 99-113 aminoácidos C-terminales de neublastina nativa de humano, los 99-113 aminoácidos C-terminales de neublastina nativa de rata, o los 99-113 aminoácidos C-terminales de neublastina de ratón, cada una con hasta 15 sustituciones de aminoácidos en la secuencia nativa. En ciertos contextos se entenderá que "polipéptido secretado de neublastina" significa un polipéptido a ser secretado en oposición a uno que ya ha sido secretado. El polipéptido secretado de neublastina no contiene una pro-región de neublastina. El prodominio de neublastina funcional es un péptido localizado entre el péptido señal y el péptido maduro, dicho propéptido se escinde a partir del péptido maduro mediante furina después de la escisión del péptido señal. Bioactividad: capacidad de unirse cuando se dimeriza junto con GFRa3 a RET e induce dimerización y autofosforilación de RET. Medido con ensayos de Elisa Kira o Elisa RET L3.

"Heterólogo", como se utiliza cuando se refiere a una secuencia de ácido nucleico o una secuencia de aminoácidos, significa una secuencia que se origina a partir de una fuente externa a la célula hospedera particular, o, si es a partir de la misma célula hospedera, se modifica a partir de su forma original. Péptido señal heterólogo - un péptido señal que no está operativamente asociado de manera natural a un polipéptido de neublastina.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a un método para la producción de un polipéptido de neublastina en donde la secuencia nucleotídica que codifica el polipéptido de neublastina no codifica una pro-región. En el presente contexto una pro-región comprende al menos los aminoácidos -41 a -11 de SEQ. ID. NO.: 10, 11 ó 12. Más preferiblemente la pro-región comprende al menos los aminoácidos -41 a -1 de cualesquiera de SEQ. ID. NO.: 10, 11 ó 12. Más preferiblemente la pro-región comprende al menos los aminoácidos -41 a 10 de cualesquiera de SEQ. ID. NO.: 10, 11 o 12, más preferiblemente comprende el pro-dominio de las secuencias, que corresponden a los aminoácidos -41 a 27 de SEQ ID NO: 10, o aminoácidos -41 a 31 de SEQ ID NO: 11 , o de SEQ ID NO: 12.

Péptidos señal El vector de expresión de conformidad con la invención comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia promotora capaz de cultivar una célula transducida con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia promotora capaz de dirigir la expresión de una secuencia nucleotídica que codifica un péptido señal operativamente asociado a un polipéptido de neublastina, en donde dicha secuencia nucleotídica no codifica una pro-región de un polipéptido de neublastina. Durante el proceso de secreción, el péptido señal de la pre-proteína de neublastina se escinde por la célula hospedera productora del polipéptido de neublastina. Aunque el sitio de escisión se define generalmente, un experto en la técnica apreciará que puede existir variabilidad en el sitio de escisión del péptido señal. Por consiguiente, las modalidades que tienen cierta ambigüedad con respecto al sitio exacto de escisión se encuentran dentro del alcance de la invención. El péptido señal puede ser cualquier péptido señal functional, tales como un péptido señal heterólogo, tales como un péptido señal de mamífero. El péptido señal puede ser a partir de cualesquiera especies adecuadas, tales como de humano, ratón, rata, mono, cerdo, perro, gato, vaca o caballo. El péptido señal está asociado al polipéptido de neublastina, y preferiblemente se fusiona directamente a dicho polipéptido de neublastina, tales como el extremo C-terminal del péptido señal que se fusiona al extremo N-terminal del polipéptido de neublastina. Como se evidencia por los ejemplos anexos, el uso de este péptido señal en general resulta en una secreción mejorada de neublastina tanto in vitro como in vivo. Los resultados fueron reproductibles tanto con células transducidas con lentivirus (in vivo e in vitro) como con células transfectadas con plásmido (¡n vitro). Las células producen la proteína madura como una proteína biológicamente activa cuando el gen del péptido señal se fusiona directamente al gen codificado para la proteína madura (por ejemplo excluyendo la pro parte). Los inventores han descubierto que no solamente el péptido señal de neublastina nativa funciona como un péptido señal, sino que también los péptidos señal heterólogos son útiles y frecuentemente proveen un rendimiento mayor que el péptido señal nativo. El péptido señal heterólogo se puede seleccionar a partir del grupo que consiste de un péptido señal del factor de crecimiento, un péptido señal de hormona, un péptido señal de citocina y un péptido señal de inmunoglobulina. Por lo tanto, los ejemplos de péptidos señal son péptidos señal seleccionados a partir del grupo que consiste de péptidos señal de TGF, péptidos señal de GDF, péptidos señal de IGF, péptidos señal de BMP, péptidos señal de neurotrofina, péptido señal de PDGF y péptido señal de EGF, los péptidos señal se seleccionan a partir de un péptido señal de hormona, dicha hormona siendo seleccionada a partir del grupo que consiste de hormona de crecimiento, insulina, -ADH, LH, FSH, ACTH, MSH, TSH, T3, T4, y DHEA, o un péptido señal de interleucina. En una modalidad, el péptido señal se selecciona a partir del grupo que consiste de péptido señal de neurturina, péptido señal de GDNF, péptido señal de persefina, y péptido señal de NGF. En otra modalidad, el péptido señal se selecciona a partir del grupo que consiste de péptido señal de albúmina, péptido señal modificado de albúmina, y péptido señal de hormona de crecimiento, tales como un péptido señal seleccionado a partir del grupo que consiste de péptido señal de albúmina de rata, péptido señal modificado de albúmina de rata, y péptido señal de hormona de crecimiento de humano, tales como péptido señal de albúmina de rata y péptido señal de hormona de crecimiento de humano. Por lo tanto, en algunas modalidades, el polipéptido secretado de neublastina se fusiona a un péptido señal nativo de albúmina de rata. Esto se ejemplifica por SEQ ID NO: 66. En otras modalidades, el polipéptido secretado de neublastina se asocia a una secuencia señal modificada de albúmina de rata. Esto se ejemplifica por SEQ ID NO: 70. En otras modalidades, el polipéptido secretado de neublastina se fusiona a una secuencia señal de la hormona de crecimiento de humano. Esto se ejemplifica por SEQ ID NO: 68. En incluso otra modalidad, el péptido señal es un péptido señal de inmunoglobulina, tales como el péptido señal de la cadena pesada de la inmunoglobulina. En particular, un péptido señal de inmunoglobulina puede ser un péptido señal seleccionado a partir del grupo que consiste de IgSP de ratón (SEQ ID NO 4), IgSP de rata (SEQ ID NO 6), IgSP de porcino (SEQ ID NO 5), IgSP de simio (SEQ ID NO 2 ó 3), IgSP de humano (SEQ ID NO 1), tales como IgSP de ratón (SEQ ID NO 4) o IgSP de humano (SEQ ID NO 1). El péptido señal de ¡nmunoglobulina (IgSP) es un péptido pequeño de 19 aminoácidos conocido a partir de un grupo grande de mamíferos. Las secuencias a partir de humano, mono rhesus, tití, rata, ratón y cerdo se alinean en la figura 1. El porcentaje de identidad de secuencia en comparación con IgSP de humano varia de 21 (cerdo) a 68 (tití) por ciento. Esta variación relativamente grande indica que la secuencia específica se puede alterar hasta un grado importante sin cambiar sustancialmente la función biológica del péptido señal. También se ha observado que existe una reactividad cruzada de especie como se evidencia por los ejemplos anexos. Estos se pueden llevar a cabo con el IgSP de ratón el cual fue funcional en rata (experimentos in vivo) y en líneas celulares de humano (líneas ARPE-19). Preferiblemente el IgSP es de origen de ratón o de humano debido a que el IgSP de ratón se sabe que funciona en el ratón, rata y seres humanos. Para uso en los seres humanos, el IgSP preferiblemente es de origen de humano con el objeto de reducir el riesgo de cualquier efecto lateral cruzado de las especies. En otra modalidad el péptido señal es un péptido señal de neublastina nativa tal como un péptido señal de neublastina nativa de humano. En este contexto la última construcción del péptido señal de neublastina nativa y un polipéptido de neublastina se denomina delta-proneublastina. En incluso otra modalidad, el péptido señal es un péptido señal sintético, tales como el péptido señal que tiene la secuencia aminoácidos de AA1-AA38 de SEQ ID NO 62.

(MetSerTrpAlaTrpAlaAlaCysProProCysProThrAlaLeuGlyLeuGlyGlySerAlaLeu TrpProThrLeuAlaAlaLeuAlaLeuLeuSerSerValAlaGluAla) Neublastina Los polipéptidos de neublastina son proteínas, las cuales promueve la supervivencia, mantienen la diferenciación fenotípica, previenen la degeneración, promueven la regeneración, y restablecen la actividad de las células neuronales y tejidos. La neublastina (inicialmente descrita, por ejemplo, en WO 00/01815) alternativamente ha sido referida como "artemina" (véase, por ejemplo, WO 00/18799) y "enovina" (véase, por ejemplo, WO 00/04050). La neublastina ha sido clasificada como un miembro distante de la superfamilia TGF-ß (Massague, et al,. 1994, Trends in Cell Biology, 4: 172-178) y es un miembro de la familia del ligando neurotrófico del factor derivado de línea de célula glial ("GDNF"; WO 93/06116), en la familia la cual incluye GDNF, persefina ("PSP"; Milbrandt et al., 1998, Neuron 20: 245253) y neurturina ("NTN"; WO 97/08196). Los ligandos de la subfamilia GDNF tienen en común su capacidad para inducir la señalización a través del receptor de tirosina cinasa RET. Estos tres ligandos de la subfamilia GDNF difieren en sus afinidades relativas para una familia de receptores neurotróficos, los receptores GFR [alfa]. La neublastina actúa preferiblemente a través del complejo GFR [alfa] 3-RET. Baudet et al., Deveiopment, 127, pp. 4335-44 (2000); Baloh et al., Neuron, 21, pp. 1291-1302 (1998); Airaksinen et al., Mol. Cell. Neuroscience, 13, pp. 313-325 (1999). Una comparación de secuencia de aminoácidos de neublastina (SEQ ID NO: 10) con los miembros de la subfamilia GDNF Neurturina, Persefina y GDNF se muestra en el cuadro 1. Los polipéptidos de neublastina útiles en esta invención preferiblemente mantienen la característica de la subfamilia GDNF, por ejemplo los residuos de aminoácidos subrayados en el cuadro 1.

CUADRO 1 Comparación de secuencia de aminoácidos de neublastina con respecto a Persefina. Neurturina, y GDNF Neurt.iiir?a-.ßtal Neublastina Persefina-total GDNF_HUMANO-total Neurturina-total HeublastiiL. Persefina-total GDNF_HUr.IAN0-total Neurtuiina-t tal Neuhlastiiia Persefina-total GDNFJHUr.lANG-total Heumnii.o-toi.il Neub.astina Persefina -tota I GDNF HUMANO-total * indica las posiciones que tienen un residuo particular, completamente conservado. : indica que uno de los siguientes grupos "fuertes" está completamente conservado:- STA, NEQK, NHQK, NDEQ, QHRK, MILV, MILF, HY, FYW. . indica que uno de los siguientes grupos "débiles" está completamente conservado: -CSA, ATV, SAG, STNK, STPA, SGND, SNDEQK, NDEQHK, NEQHRK.VLIM, HFY. A partir del alineamiento de la secuencia de aminoácidos mostrado en el cuadro 1, se puede observar que la neublastina tiene siete residuos de cisteína en las ubicaciones que están conservadas dentro de la superfamilia de TGF-[beta]. Basándose en este alineamiento de secuencia, se mostró que la neublastina es un miembro de la subfamilia GDNF de factores neurotróficos (LGLG-FR(Y/F)CSGSC-QxCCRP-SAxxCGC, la característica de la superfamilia GDNF, está subrayada el cuadro 1). Los polipéptidos de neublastina útiles en la presente invención se pueden proveer en cualquier forma bioactiva, incluyendo la forma de pre-proteínas, proteínas maduras, proteínas glicosiladas, proteínas fosforiladas, formas truncadas, o cualquier otra proteína pos-traduccionalmente modificada. Se asume que una neublastina bioactiva se encuentra en la forma dimerizada a partir de cada variante NBN, debido a que la formación de dímero se requiere para la actividad. Se observa poca actividad o no se observa actividad en un polipéptido monomérico de NBN. Un polipéptido bioactivo de neublastina incluye un polipéptido dimerizado que, en la presencia de un cofactor (tales como GFR[alfa]3 o RET), se une a GFR[alfa]3 o a un complejo de GFR[alfa]3 y RET, induce la dimerización de RET, y la autofosforilación de RET. Por consiguiente, un "polipéptido de neublastina", como se utiliza en la presente invención, es un polipéptido el cual posee actividad neurotrófica (por ejemplo, como se describe en WO 00/01815). Los polipéptidos de neublastina producidos mediante los métodos de esta invención exhiben al menos una actividad biológica de neublastina nativa. La actividad biológica para propósitos de esta invención se puede determinar mediante cualquier método adecuado. Un polipéptido de neublastina biológicamente activo es un polipéptido que, cuando se dimeriza, se puede unir, junto con GFRa3, a RET e induce dimerización de RET y autofosforilación. (Véase por ejemplo Sanicola et al., 1997, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 94: 6238). Se puede utilizar cualquier método para la determinación de la unión del receptor y autofosforilación del receptor para evaluar la actividad biológica del polipéptido de neublastina producido mediante los métodos de la invención. Por ejemplo, el ensayo KIRA (ELISA) descrito en el ejemplo 17 se puede utilizar para evaluar la actividad biológica de la neublastina. (Véase también, Sadick et al., 1996, Anal. Biochem., 235 (2): 207). La neublastina es una forma bioactiva que también se puede detectar utilizando el ensayo ELISA de RetL3 descrito en el ejemplo 1. La neublastina sin función biológica no será detectada por el ensayo de ELISA de RetL3. Las siguientes secuencias de longitud total representan la pre-pro neublastina de tipo silvestre con péptido señal de tipo silvestre. Después de la transducción o transfección dentro de células de mamífero las neublastinas maduras resultantes solamente se secretan en cantidades muy pequeñas. El péptido señal nativo de neublastina de humano, de ratón y de rata se representa por los primeros 39 aminoácidos. --AA-80-AA140 de SEQ ID NO: 10 (prepro "tipo silvestre" de humano), -AA.80-AA144 de SEQ ID No. 11 (de prepro de ratón), — AA-80 de SEQ ID NO: 12 (prepro de rata), El polipéptido de neubiastina secretado de conformidad con la invención puede variar en longitud. Aunque el polipéptido de neublastina maduro de humano normalmente consiste de los 113 aminoácidos C terminales de pre proneublastina, no todos los 113 aminoácidos se requieren para lograr una actividad biológica útil de neublastina. La truncación amino terminal es permisible. Por lo tanto, el polipéptido secretado de neublastina corresponde a los 99-113 aminoácidos C terminales de neublastina nativa de humano, por ejemplo, su longitud puede ser de 99, 100, 101 , 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111 , 112, o 113 aminoácidos. La selección de la longitud exacta del polipéptido de neublastina a ser secretado es una elección designada, la cual se puede elaborar por un experto en la técnica. Un polipéptido secretado de neublastina de humano que consiste de los 104 aminoácidos C terminales de neublastina nativa de humano se ejemplifica en los ejemplos de trabajo provistos a continuación. Además para variar en longitud, el polipéptido de neublastina secretado de humano puede variar en secuencia. Las siguientes secuencias de aminoácidos de neublastina "de tipo silvestre" ("aa" o "AA") son ejemplares de aquellas que son útiles en los métodos y composiciones de esta invención: -AA.-AAuo de SEQ ID NO: 10 (140AA maduro; en lo sucesivo "140NBN"), ~AA25-AAi4o de SEQ ID NO: 10 (116AA maduro; en lo sucesivo "116NBN"), -AA28-AAi40 de SEQ ID NO: 10 (113AA maduro (SEQ ID No. 14); en lo sucesivo "113NBN"), --AA AA144 de SEQ ID NO: 11 (144 AA de ratón maduro), -AArAA de SEQ ID NO: 12 (-144 AA maduro de rata), - Péptidos con una secuencia C-terminal establecida en AAw- A140 de SEQ ID No. 10, más preferiblemente AA76-AA140 de SEQ ID NO. 10, y la cual retiene los 7 residuos de Cys característicos de la familia GDNF y de la superfamilia TGF-beta. En una modalidad, el polipéptido preferido de neublastina contiene (siete) cisteínas conservadas como en SEQ ID NO. 10 en las posiciones 43, 70, 74, 107, 108, 136 y 138. Estos siete residuos de cisteína conservados se conocen dentro de la superfamilia TGF para formar tres enlaces disulfuro intramonoméricos (contemplados, por ejemplo, en SEQ ID No. 10 entre los residuos de cisteína 43-108, 70-136, y 74-138) y un enlace disulfuro intermonomérico (contemplado, por ejemplo, en SEQ ID NO. 10 entre los residuos de cisteína 107-107), los cuales junto con la región extendida de cadena beta constituye el motivo estructural conservado para la superfamilia TGF-[beta]. Véase, por ejemplo, Daopin et al., Proteins 1993, 17: 176-192. Preferiblemente el polipéptido de neublastina es una de las formas maduras de la proteína de tipo silvestre. Actualmente se cree que la ausencia de la pro-región es importante para elevados niveles de secreción en células de mamífero genéticamente modificadas.

Los polipéptidos de neublastina útiles en la presente invención también incluyen formas truncadas de la molécula de neublastina de longitud total. En dichas moléculas truncadas, uno o más aminoácidos han sido deletados a partir del N-terminal o el C-terminal, preferiblemente el N-terminal. El péptido truncado de neublastina se puede obtener mediante la provisión de un polipéptido maduro de neublastina y poner en contacto el polipéptido maduro de neublastina con al menos una proteasa bajo condiciones adecuadas para producir el péptido truncado de neublastina. Preferiblemente, al menos una proteasa es una exoproteasa, y que contiene el polipéptido maduro de neublastina resulta en la formación de un producto de digestión de exopeptidasa del polipéptido de neublastina que se puede digerir adicionalmente con una dipeptidil peptidasa. Más preferiblemente de conformidad con la presente invención la proteína codificada por los vectores de expresión es la forma truncada y no necesita procesamiento adicional. Los polipéptidos truncados de neublastina descritos en la presente invención preferiblemente incluyen una secuencia de polipéptido que abarca los siete residuos de cisteína conservados en la secuencia madura de neublastina. En ciertas modalidades preferidas, el polipéptido truncado de neublastina incluye al menos los 85 aminoácidos carboxi terminales de polipéptido maduro 113NBN de neublastina. En modalidades más preferidas el polipéptido truncado de neublastina incluye al menos los 98 aminoácidos carboxi terminales 113 NBN de madura de humano.

Una forma truncada incluye los 97 aminoácidos a partir de los primeros a los últimos siete residuos de cisteína de neublastina madura. Esto corresponde a los aminoácidos no 2 a 97 de SEQ ID No 20. Otras variantes de neublastina incluyen las formas truncadas de NBN. Los ejemplo de estas incluyen: (i) la secuencia polipeptídica 112AA diseñada en la presente invención como NBN 112, la cual posee los 112 aminoácidos carboxi terminales de un polipéptido maduro de neublastina, por ejemplo, aminoácidos 29-140 de SEQ ID NO. 10. (ii) la secuencia del polipéptido 111 AA designada en la presente invención como NBN111 , la cual posee los 111 aminoácidos carboxi terminales de un polipéptido maduro de neublastina, por ejemplo, aminoácidos 30-140 de SEQ ID NO. 10. (iii) la secuencia del polipéptido 110 AA designada en la presente invención como NBN110, la cual posee los 110 aminoácidos carboxi terminales de un polipéptido maduro de neublastina, por ejemplo, aminoácidos 31-140 de SEQ ID NO. 10. (iv) la secuencia del polipéptido 109 AA diseñada en la presente invención como NBN109, la cual posee los 109 aminoácidos carboxi terminales de un polipéptido maduro de neublastina, por ejemplo, aminoácidos 32-140 de SEQ ID NO. 10. (v) la secuencia del polipéptido 108AA designada en la presente invención como NBN108, la cual posee los 108 aminoácidos carboxi terminales de un polipéptido maduro de neublastina, por ejemplo, aminoácidos 33-140 de SEQ ID NO. 10. (vi) la secuencia del polipéptido 107AA designada en la presente invención como NBN 107, la cual posee los 107 aminoácidos carboxi terminales de un polipéptido maduro de neublastina, por ejemplo, aminoácidos 34-140 de SEQ ID NO. 10. (vii) la secuencia del polipéptido 106AA designada en la presente invención como NBN 106, la cual posee los 106 aminoácidos carboxi terminales de un polipéptido maduro de neublastina, por ejemplo, aminoácidos 35-140 de SEQ ID NO. 10. (viü) la secuencia del polipéptido 105AA designada en la presente invención como NBN105, la cual posee los 105 aminoácidos carboxi terminales de un polipéptido maduro de neublastina, por ejemplo, aminoácidos 36-140 de SEQ ID NO. 10. (ix) la secuencia del polipéptido 104AA diseñada en la presente invención como NBN 104, la cual posee los 104 aminoácidos carboxi terminales de un polipéptido maduro de neublastina, por ejemplo, aminoácidos 37-140 de SEQ ID NO. 10 (también se establece como SEQ ID No. 19). (x) la secuencia del polipéptido 103AA designada en la presente invención como NBN 103, la cual posee los 103 aminoácidos carboxi terminales de un polipéptido maduro de neublastina, por ejemplo, aminoácidos 38-140 de SEQ ID NO. 10. (xi) la secuencia del polipéptido 102AA diseñada en la presente invención como NBN 102, la cual posee los 102 aminoácidos carboxi terminales de un polipéptido maduro de neublastina, por ejemplo, aminoácidos 39-140 de SEQ ID NO. 10. (xii) la secuencia del polipéptido 101AA designada en la presente invención como NBN101 , la cual posee los 101 aminoácidos carboxi terminales de un polipéptido maduro de neublastina, por ejemplo, aminoácidos 40-140 de SEQ ID NO. 10. (xiii) la secuencia del polipéptido 100AA designada en la presente invención como NBN100, la cual posee los 100 aminoácidos carboxi terminales de un polipéptido maduro de neublastina, por ejemplo, aminoácidos 41-140 de SEQ ID NO. 10. (xiv) la secuencia del polipéptido 99AA designada en la presente invención como NBN99, la cual posee los 99 aminoácidos carboxi terminales de un polipéptido maduro de neublastina, por ejemplo, aminoácidos 42-140 de SEQ ID NO. 10 (también se establece como SEQ ID No. 20). Se entiende que las formas truncadas de neublastina descritas en la presente invención (por ejemplo, las formas 112AA hasta 99AA) tienen actividad neurotrófica. En las modalidades más preferidas, el polipéptido truncado de neublastina es los aminoácidos 99 aa, 100 aa, 101 aa, 102 aa, 103 aa, 104 aa, 105 aa, 106 aa, 107 aa, 108 aa, 109 aa, 110 aa, 111 aa ó 112 aa carboxi terminales del polipéptido 113 AA maduro de neublastina (por ejemplo, NBN99, NBN100, NBN101 , NBN102, NBN103, NBN104, NBN105, NBN106, NBN107, NBN108, NBN109, NBN110, NBN111 o NBN112, respectivamente). Las secuencias también se pueden encontrar en los polipéptidos de neublastina de ratón y de rata como los carboxi terminales 99 aa, 100 aa, 101 aa, 102 aa, 103 aa, 104 aa, 105 aa, 106 aa, 107 aa, 108 aa, 109 aa, 110 aa, 111 aa ó 112 aa, respectivamente, en la SEQ ID No. 11 y 12. Estos ejemplos más preferidos de formas truncadas de NBN son bioactivos (referido como "los polipéptido de neublastina truncados bioactivos") puesto que se ha demostrado que tienen actividad neurotrófica. Como se estableció anteriormente, la dimerización de NBN se requiere para la bioactividad, se observó una poca actividad o no se observó actividad con el polipéptido NBN monomérico. Las formas truncadas de las neublastinas de ratón y de rata también se contemplan. Estas pueden consistir en los aminoácidos C-terminales 99, 100, 101 , 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111 , 112, 113, 114, 115, ó 116 de SEQ ID No 16 (ratón) o pueden consistir de los aminoácidos C-terminales 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111 ó 112 de SEQ ID No 18 (rata). Por lo tanto, la invención abarca un polipéptido de neublastina seleccionado a partir del grupo que consiste de NBN maduro seleccionado a partir de neublastina que tiene una secuencia identificada como los aminoácidos 1-140 de SEQ ID No 10, o aminoácidos 1-144 de SEQ ID No 11 ó 12, SEQ ID No 13, 14, 15, 16, 17 ó 18, NBN N-terminalmente truncada, NBN mutada, o NBN mutada y N-truncada, tales como un NBN maduro seleccionada a partir del grupo que consiste de neublastina que tiene una secuencia de identidad de SEQ ID No 13, 14, 15, 16, 16, 17, ó 18), más particularmente un polipéptido de neublastina seleccionado a partir del grupo que consiste de neublastina N-terminalmente truncada con los 106, 104, 102 ó 99 aminoácidos C-terminales de SEQ ID NO 10 o un polipéptido de neublastina seleccionado a partir del grupo que consiste de los 116 aminoácidos C-terminales de neublastina de humano, los 113 aminoácidos C-terminales de neublastina de humano, los aminoácidos 104 C-terminales de neublastina de humano, y los 116 aminoácidos C-terminal de neublastina de humano, un polipéptido de neubiastina que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No 19 o un polipéptido de neublastina que contiene los 99 aminoácidos de SEQ ID NO 20. Los NBNs útiles en esta invención también incluyen aquellos polipéptido de NBN que tienen una secuencia de aminoácidos con similitud o identidad sustancial con respecto a los diversos polipéptídos de "neublastina" prepro, pro, maduro y truncada anteriormente establecidos. Preferiblemente, el polipéptido de neublastina se utiliza como al menos 70%, más preferiblemente 85%, incluso más preferiblemente 90%, o incluso más preferiblemente 95% de identidad o de similitud al péptido maduro del polipéptido de neublastina en la SEQ ID NO. 10-23. Más preferiblemente el polipéptido de neublastina utilizado como al menos 99% de similitud o de identidad con respecto a los péptidos maduros de los polipéptidos de neublastina en SEQ ID No. 10-23. El grado en el cual un polipéptido candidato comparte homología con un polipéptido de neublastina de la invención se determina como el grado de similitud o de identidad entre dos secuencias de aminoácidos. Un alto nivel de identidad de secuencia indica la probabilidad de que la primera secuencia sea derivada a partir de la segunda secuencia. La identidad de secuencia de aminoácidos requiere secuencias idénticas de aminoácidos entre dos secuencias alineadas. Por lo tanto, una secuencia candidato que comparte 70% de identidad de aminoácidos con una secuencia de referencia, requiere que, después del alineamiento, 70% de los aminoácidos en la secuencia candidato son idénticos a los aminoácidos correspondientes en la secuencia de referencia. La identidad se determina mediante análisis por computadora, tales como, sin limitaciones, el programa del alineamiento por computadora ClustalX (Thompson JD, Gibson TJ, Plewniak F, Jeanmougin F, & Higgins DG: "The ClustalX Windows interface: flexible strategies for múltiple sequence alignment aided by quality analysis tools"; Nucleic Acids Res. 1997, 25 (24): 4876-82), y los parámetros por omisión sugeridos en la presente invención. Utilizando este programa, la parte madura de un polipéptido codificado por una secuencia de ADN análogo de la invención exhibe un grado de identidad de al menos 70%, más preferiblemente de incluso el 85%. Más preferiblemente 90%, o incluso más preferiblemente 95%, más preferiblemente al menos 99% con las secuencias de aminoácidos presentadas en la presente invención como SEQ ID NO: 10 (NBN de humano), SEQ ID NOS: 11 y 12 (NBN de roedor). Se conocen otras herramientas para alineamiento, tales como el algoritmo dinámico de programación descrito en Needleman et al., J. Mol. Biol. 48:443 (1970), y el programa Aügn, un paquete de software comercial producido por DNAstar, Inc. las técnicas de los cuales se incorporan como referencia en la presente invención. Una vez que se realiza el alineamiento entre la secuencia candidato y la secuencia de referencia y se redefine, se calcula una evaluación para la homología porcentual. Los aminoácidos individuales de cada secuencia se comparan secuencialmente de conformidad con su similitud entre sí. Los factores de similitud incluyen tamaño similar, forma y carga electroquímica. Un método particularmente preferido de similitudes determinantes de aminoácidos es la matriz PAM250 descrita en Dayhoff et al., Atlas of protein sequence and structure 345-352 (1978 & Supp.), incorporado como referencia en la presente invención. Una evaluación similar se calcula inicialmente como la suma de las evaluaciones de similitud en pares de aminoácidos alineados. Las inserciones y deleciones se ignoran para los propósitos de homología porcentual e identidad. Por consiguiente, las sanciones por espacio no se utiliza en este cálculo. La evaluación sin modificación se normaliza entonces mediante la división de ésta por la media geométrica de las evaluaciones del compuesto candidato y los siete esqueletos de cisteína de los polipéptidos de neublastina.

La media geométrica es la raíz cuadrada del producto de estas evaluaciones.

La evaluación normalizada sin modificación es la homología porcentual. Como se mencionó anteriormente, los polipéptidos de neublastina de la invención incluyen polipéptidos variantes. En el contexto de esta invención, el término "polipéptido variante" incluye un polipéptido (o proteína) que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere del péptido maduro presentado como parte de SEQ ID NO. 10, 13, 14, 19, 20, 21 , 22, o 23 (NBN de humano), o SEQ ID No. 11 , 12, 15-18 (NBN de roedor), en uno o más posiciones del aminoácido. Dichos polipéptidos variantes incluyen los polipéptidos modificados anteriormente descritos, así como sustituciones conservativas, variantes de procesamiento, isoformas, análogos a partir de otras especies, y polimorfismos. Como se define en la presente invención, el término "sustituciones conservativas" denota el reemplazo de un residuo de aminoácidos por otro residuo, biológicamente similar. Típicamente, la similitud biológica, como se refirió anteriormente, refleja las sustituciones en la secuencia tipo silvestre con aminoácidos conservados. Los sustitutos para un aminoácido en la secuencia del polipéptido de neublastina se pueden seleccionar a partir de otros miembros de la clase a la cual pertenece el aminoácido (véase el cuadro 1). Además, diversos aminoácidos se sustituyen comúnmente con aminoácidos neutros, por ejemplo, alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano, y metionina. (Véase por ejemplo MacLennan et al., 1998, Acta Physiol. Scand. Suppl., 643: 55-67; Sasaki et al., 1998, Adv. Biophys., 35: 1-24). Las sustituciones múltiples se encuentran dentro del alcance de la invención; no obstante, todos los polipéptidos de neublastina de la invención deben poseer al menos una actividad de neublastina nativa como se describe a continuación en la sección C, véase también el siguiente cuadro: Por ejemplo, uno podría esperar que las sustituciones conservativas de aminoácidos tengan un efecto pequeño o no tengan efecto sobre la actividad biológica, particularmente si representan menos del 10% del número total de residuos en el polipéptido o proteína. Preferiblemente, las sustituciones conservativas de aminoácidos representan cambios en menos del 5% del polipéptido o proteína, más preferiblemente menos del 2%-del polipéptido o proteína. El polipéptido de neublastina en una modalidad comprende hasta 15 sustituciones de aminoácidos, tales como hasta 12 sustituciones de aminoácidos, tales como hasta 10 sustituciones de aminoácidos, tales como hasta 8 sustituciones de aminoácidos, tales como hasta 5 sustituciones de aminoácidos. Por ejemplo, cuando se calculan de conformidad, por ejemplo, con 113NBN de humano, la mayoría de las sustituciones conservativas preferidas podría representar menos de tres sustituciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos madura de tipo silvestre. En una modalidad particularmente preferida, existe una sustitución particular de aminoácido en la secuencia madura, en donde tanto los aminoácidos sustituidos como reemplazados son no cíclicos. Otros ejemplos de sustituciones particularmente conservativas incluyen la sustitución de un residuo hidrófobo por otro, tales como isoleucina, valina, leucina o metionina, o la sustitución de un residuo polar por otro, tales como la sustitución de arginina por lisina, ácido glutámico por ácido aspártico, o glutamina por asparagina, y los similares. El término sustitución conservativa también incluye el uso de un residuo de aminoácido sustituido en lugar de un residuo de aminoácido parental no sustituido con la condición de que los anticuerpos generados al polipéptido sustituido también inmuno-reaccionen con el polipéptido no sustituido.

Las modificaciones de estas secuencias primarias de aminoácidos pueden resultar en proteínas, las cuales tienen actividad equivalente sustancial en comparación con el polipéptido contraparte no modificado, y por lo tanto se pueden considerar análogos funcionales de las proteínas parentales. Dichas modificaciones pueden ser a propósito, por ejemplo como mediante mutagénesis sitio dirigida, o se pueden presentar de manera espontánea, e incluyen variantes de procesamiento, isoformas, homólogos a partir de otras especies, y polimorfismos. Dichos análogos funcionales también se contemplan de conformidad con la invención. A continuación se muestra un alineamiento de 99 aminoácidos C-terminales a partir de humanos, ratones y ratas: CLUSTAL W (1.82) alineamiento múltiple de secuencia Ratón piSQSCCRP-R?E&VSFMDTOS'^ Rata p?SQPCCEPTRYEaVS KDVpSTW TTOH SATA^ Humano SQKCBeT^?EW5 ?p3V3JSTWR TOR SATACßC-_ Preferiblemente las sustituciones se llevan a cabo en las posiciones que no se conservan marcadas con "no asterisco", "." O ":". Otros posiciones preferidas para sustitución se denotan con "%". Además, las modificaciones de la secuencia primaria de aminoácidos pueden resultar en proteínas, las cuales no retienen la actividad biológica de la proteína parental, incluyendo formas dominantes negativas, etc. Una proteína dominante negativa puede interferir con la proteína de tipo silvestre mediante unión a, o de otra manera agentes reguladores de secuestro, tales como componentes corriente arriba o componentes corriente abajo, que normalmente interactúan funcionalmente con el polipéptido. Dichas formas dominantes negativas también que contemplan de conformidad con la invención. Las formas biológicamente activas de neublastina truncada se conocen a partir de WO 02/072826 (NsGene y Biogen). Las moléculas truncadas y mutadas de neublastina también se conocen a partir de WO 02/060929 (Biogen), especialmente neublastina mutada que comprende una secuencia de aminoácidos derivada partir de los aminoácidos 8-113 de SEQ ID No. 14, en donde el variante polipéptido de neublastina incluye una o más de las sustituciones de aminoácidos seleccionadas a partir del grupo que consiste de: un aminoácido diferente a la arginina en la posición 14 en la secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido variante, un aminoácido diferente a la arginina en la posición 39 en la secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido variante, un aminoácido diferente a la arginina en la posición 68 de dicho polipéptido variante, y un aminoácido diferente a la asparagina en la posición 95 de dicho polipéptido variante, por ejemplo a un residuo de lisina, en donde las posiciones de dichos aminoácidos están numeradas de conformidad con la secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 10. Las formas mutadas pueden ser truncadas como se describió anteriormente o incluyen la longitud total de la proteína madura (aminoácidos 1-113 de SEQ ID NO 14). Preferiblemente el aminoácido en la posición 14, 39 o 68 es una lisina.

Escisión del péptido señal Antes de decidir sobre una forma de neublastina specífica para incorporarla dentro de una construcción de expresión, la probabilidad de la escisión del péptido señal, tal como Igsp se puede monitorear utilizando las herramientas de predicción del estado de la técnica. Una de dichas herramientas preferidas para predicción es el software Sig-nalP disponible en el servidor SignalPWWW (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/), o preferiblemente, la versión más nueva 3.0 disponible a partir del mismo servidor (http://www.cbs.dtu. dk/services/SignalP-3.0/). El servidor SignalP WWW proveerá tres evaluaciones entre 0 y 1 para cada posición en su secuencia: Evaluación C (evaluación del sitio de escisión sin modificación) La evaluación de salida a partir de las redes experimentadas para reconocer el sitio de escisións contra otras posiciones de la secuencia. Experimentadas para ser: elevadas en la posición +1 (inmediatamente después del sitio de escisión) bajo en todas las otras posiciones. Evaluación S (evaluación del péptido señal) La evaluación de la salida a partir de las redes se experimentadas para reconocer el péptido señal contra posiciones de péptido no señal. Experimentadas para ser: alta en todas las posiciones antes del sitio de escisión en las 30 posiciones después del sitio de escisión y baja en los N-terminales de las proteínas no secretoras. Evaluación Y (evaluación del sitio de escisión combinado) La predicción de la ubicación del sitio de escisión se optimiza mediante la observación donde los cambios de la evaluación C es elevada y la evaluación S a partir de un valor alto a un valor bajo. La evaluación Y se formaliza mediante la combinación de la altura de la evaluación C con la pendiente de la evaluación S. Específicamente, la evaluación Y es un promedio geométrico entre la evaluación C y un derivado homogéneo de la evaluación S (por ejemplo, la diferencia entre la evaluación media S sobre las posiciones d antes y las posiciones d después de la posición actual, en donde d varía con el conjunto de red elegido). Las tres evaluaciones son el promedio de cinco redes experimentadas en diferentes particiones de los datos. Para cada secuencia, SignalP reportará los valores máximos C-, S-, y Y, y la evaluación media S entre el sitio de escisión N-terminal y el sitio de escisión pronosticado. Estos valores se utilizan para distinguir entre péptidos señal y no péptidos señal. Si se pronostica que su secuencia tiene un péptido señal, se pronostica que el sitio de escisión se encuentra inmediatamente antes de la posición con la evaluación Y máxima. Para un péptido señal típico, las evaluaciones C- y Y- estarán elevadas en la posición +1 , mientras que la evaluación S estará elevada antes del sitio de escisión y baja después. Para la comparación se puede comparar la predicción con la escisión pronosticada del péptido señal de neublastina de tipo silvestre (escisión entre los aminoácidos no 39 y 40 de pre-pro NBN). Las neublastinas preferidas son aquellas que tienen una escisión pronosticada entre el péptido señal y la neublastina ya sea en el programa SignalP-NN o en el programa SignalP-HMM. Estos incluyen pero no se limitan a NBN113, NBN106, NBN104, NBN102, y NBN99. Particularmente preferidas son las neublastinas que tienen un péptido señal pronosticado en esta posición en ambos SignalP-NN y SignalP-HMM. Estos incluyen NBN113 y NBN99. La versión más novedosa (3.0) también incluye una evaluación novedosa D o Dmax (evaluación de discriminación) que describe el "péptido señal" que se sabe que correlaciona con el nivel de secreción utilizando dicho péptido señal con la proteína en cuestión. Se prefiere que un péptido señal que se utiliza en la presente invención exhiba un valor Dmax de al menos 0.5, tales como al menos 0.6, such al menos 0.7, tales como al menos 0.8, con el polipéptido de neublastina seleccionado.

Referencias: Henrik Nielsen, Jacob Engelbrecht, S0ren Brunak y Gunnar von Heijne: Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Protein Engineering, 10, 1-6 (1997). Para el modelo de salida SignalP-HMM: Henrik Nielsen y Anders Krogh: Prediction of signal peptides and signal anchors by a hidden Markov model. En Proceedings of the Sixth International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology (ISMB 6), AMI Press, Menlo Park, California, pp. 122-130 (1998). La predicción mejorada de péptidos señal-Sig-nalP 3.0. Jannick Dyrl0v Bendtsen, Henrik Nielsen, Gunnar von Heijne y Soren Brunak. JMB (2004). Prediction of signal peptides and signal anchors by a hidden Markov model. Henrik Nielsen y Anders Krogh. Proceedings de the Sixth International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology (ISMB 6), AAAI Press, Menlo Park, California, pp. 122-130,1998.

Uso médico y métodos de tratamiento En un aspecto la invención se refiere al uso del vector de conformidad con la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno del sistema nervioso. El trastorno del sistema nervioso puede ser un trastorno del sistema nervioso periférico o del sistema nervioso central. La neublastina es útil para el tratamiento de un defecto en una neurona, incluyendo sin limitación neuronas lesionadas y neuronas traumatizadas. Los nervios periféricos que experimentan trauma incluyen, pero no se limitan a, nervios de la médula o de la médula espinal. La neublastina es útil en el tratamiento de trastornos del CNS, tales como una enfermedad neurodegenerativa, por ejemplo, daño neuronal isquémico cerebral; neuropatía, por ejemplo, neuropatía periférica, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntignton, esclerosis amiotrófica lateral (ALS). La neublastina se contempla adicionalmente para uso en el tratamiento de memoria alterada, por ejemplo, alteración de memoria asociada con dementia. La neublastina también se conoce como un candidato terapéutico para el tratamiento de neuropatías periféricas, tales como dolor neuropático en un mamífero. El dolor neuropático puede estar asociado con daño nervioso inducido por toxina, daño nervioso inducido por patógeno, daño nervioso inducido por trauma, daño nervioso inducido por fármaco, neuropatía idiopática, neuropatía diabética, daño nervioso inducido por inflamación, o neurodegeneración. La neublastina también se puede utilizar para el tratamiento de la neuropatía periférica en un mamífero. La neuropatía periférica puede incluir el grupo que consiste de neuropatía inducida por trauma, neuropatías inducidas por agentes virales, neuropatías inducidas por quimioterapia, neuropatías inducidas por toxina, neuropatías inducidas por fármaco, neuropatías inducidas por deficiencia de vitaminas; neuropatías idiopáticas; y neuropatías diabéticas. Los métodos y composiciones para el tratamiento del dolor neuropático utilizando neublastina se describen en WO 02/078730 (Biogen).

Preferiblemente, la neublastina se utiliza para el tratamiento de un trastorno seleccionado a partir del grupo que consiste de neuropatía periférica incluyendo dolor neuropático, lesión de médula espinal, avulsión de la raíz espinal, tic doloroso, causalgia, heridas corneales y retinopatías. De conformidad con una mortalidad preferida de la invención la enfermedad neurodegenerativa a ser tratada es la enfermedad de Parkinson. Se sabe que la neublastina incrementa la supervivencia de las neuronas dopaminérgicas (WO 00/01815 NsGene; Baloh et al 1998 Neuron 21: 1291-1302). Los vectores, cápsulas, y composiciones de la presente invención también se pueden utilizar para el tratamiento de enfermedades oculares, tales como retinitis pigmentosa, degeneración macular, glaucoma, y retinopatía diabética. La neublastina también se pueden utilizar en ei tratamiento de heridas y úlceras corneales (EP1 223 966 Biopharm). Las enfermedades del sistema nervioso se pueden tratar mediante la administración a un individuo que necesita del mismo de una cantidad terapéuticamente efectiva del vector de la invención; o una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica de la invención. También se proveen coordenadas estereotáxicas para las funciones del cerebro a ser transducidas a o dentro de las cuales se envían a células desnudas transplantadas o células encapsuladas (cuadro II): CUADRO II En el cuadro precedente: las dimensiones medial-lateral son con respecto a la línea media del cerebro; las dimensiones anterior-posterior son con respecto al punto medio entre la comisura anterior y la comisura posterior con una indicación negativa de la dirección posterior; las dimensiones dorsal-ventral son con respecto a una línea que conecta los puntos medios de las comisiones anterior y posterior con la clasificación negativa siendo ventral a dicha línea; todas las dimensiones son en centímetros; y Gpe significa segmento externo del globo pálido; Gpi significa segmento interno del globo pálido; Snr significa sustancia nigra de pars reticulata, S-TN significa núcleo subtalámico; NBM significa núcleo basal de meynert; y caudado significa el núcleo caudado. En lugar de la transducción in vivo, las enfermedades del sistema nervioso se pueden tratar mediante transplante a un individuo que necesita del mismo de: i. una cantidad terapéuticamente efectiva de células transducidas o transfectadas de conformidad con la invención; o ¡i. un dispositivo implantable que comprende células transducidas o transfectadas. Preferiblemente el transplante comprende células o dispositivos ¡mplantables. Dicho transplante puede comprender un transplante autólogo, un transplante alogenéico o un transplante xenogenéico.

Tejido blanco para el tratamiento de trastornos de degenerativos en el sistema nervioso central Un parámetro importante es la selección de un tejido blanco adecuado. Una región del cerebro se selecciona por su respuesta retenida a los factores neurotróficos. El direccionamiento de un érea se pueden lograr mediante la administración de una unidad de dosis de un vector de terapia química como se describió en la presente invención o mediante el implante de células desnudas o células encapsuladas de conformidad con la invención. En humanos, las neuronas del SNC las cuales retienen capacidad de responder a los factores neurotróficos hacia la adultez incluyen las neuronas colinérgicas del cerebro anterior basal, las neuronas corticales entorhinales, las neuronas del tálamo, las neuronas del locus coeruleus, las neuronas sensibles espinales y las neuronas motoras espinales.

Un registro inicial, tal como un registro por MRI, se puede llevar a cabo en el paciente para determinar la ubicación precisa del sitio de tratamiento. Por ejemplo, en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson, los ganglios básales, incluyendo substancia nigra, son sitios de tratamiento. Probablemente las áreas afectadas del cerebro serán de un tamaño de tal manera que la selección de 5 o menos sitios de administración será adecuada para el restablecimiento del número clínicamente significativo de neuronas dopaminérgicas. Se puede aplicar el mismo número de sitios para administración fuera del cerebro. Para terapia génica in vivo, la administración puede ser sistémica o local. Mediante administración sistémica se pretende la administración de un vector de terapia química intramuscularmente, subcutáneamente, o intraperitonealmente administrado, el cual resultará en la liberación continua de la neublastinas al sistema circulatorio. Para terapia génica in vivo, se seleccionan los sitios específicos para la administración del gen in vivo, tales como un agrupamiento en un área de pérdida neuronal o terminal. Dichas áreas se pueden identificar clínicamente utilizando numerosas técnicas conocidas, incluyendo formación de imagen por resonancia magnética (MRI) y biopsia. En humanos, se preferirán los métodos no invasivos, in vivo para formación de imagen tales como MRI. Se identificaron once áreas de pérdida neuronal o terminal, los sitios de administración se seleccionan para distribución estereotáxica de manera que cada unidad de dosis de neublastina se administra dentro del cerebro o médula espinal en, o dentro de 500 µm a partir de, una célula blanco, y no más de aproximadamente 10 mm a partir de otro sitios de administración. Dentro del cerebro, se puede administrar el vector de terapia génica al parénquima o a los ventrículos. Dentro del ojo, se puede administrar el vector de terapia génica al vitreo, el espacio subretinal y a la cápsula sub-tenar. Para el tratamiento de la neuropatía periférica incluyendo dolor neuropático, se puede administrar un vector para terapia génica a un área del cuerpo implicada en la transmisión de la sensación de dolor. Dicha área puede incluir la médula espinal y la administración intratecal. En una modalidad, el vector se administra intramuscularmente, subcutáneamente, o intraperitonealmente. En otra modalidad, el vector o composición se administra a un área del cuerpo implicada en la transmisión de la sensación de dolor. En una tercera modalidad, el vector o composición se administra intratecalmente o a la médula espinal. En una cuarta modalidad, el vector se administra al cerebro, incluyendo el parénquima, y los ventrículos. En la quinta modalidad, el vector se administra en el ojo, incluyendo el vitreo, espacio subretinal, y cápsula sub-tenar.

Requerimientos de dosis y protocolo de administración para terapia génica in vivo Un parámetro adicionalmente importante es la dosificación de la neublastina a ser administrada dentro del tejido blanco. A este respecto, "unidad de dosis" se refiere generalmente a la concentración de neublastina/ml de composición de neublastina. Para los vectores virales, la concentración de neublastina se define mediante el número de partículas virales/ml de composición de neurotrófica. De manera óptima, para la administración de neublastina utilizando un vector de expresión viral, cada unidad de dosis de neublastina comprenderá 2.5 a 25 µL de una composición de neublastina, en donde la composición incluye un vector de expresión viral en un fluido farmacéuticamente aceptable y prove de 1010 hasta 1015 neublastinas que contienen partículas virales por mi de composición de neublastina. Dichos títulos altos son particularmente útiles para virus adeno-asociados. Para lentivirus, el título normalmente es menor, tales como de 108 a 1010 unidades transductoras por mi (TU/ml), determinado como se describe en el ejemplo 2. La composición de neublastina se administra en cada sitio celular para administración en el tejido blanco mediante microinyección, infusión, carga menor, electroporación u otros métodos adecuados para administrar directamente la composición de manera directa dentro del sitio de administración al tejido a través de una incisión quirúrgica. La administración se realiza lentamente, tales como durante un periodo de aproximadamente 5-10 minutos (dependiendo del volumen total de la composición de neublastina a ser administrada). Aquellos expertos en la técnicas apreciarán que el método de administración directa empleado por la invención obvia un factor de riesgo limitante asociados con terapia génica in vivo; para entender, el potencial para la transducción de células no blanco con el vector que portan la neublastina que codifica el transgene. En la invención, la administración se dirige y los sitios de administración son elegidos de manera que la difusión de la neublastina secretada se lleva a cabo en una región controlada y predeterminada del cerebro para optimizar el contacto con las neuronas blanco, a la vez que se minimiza el contacto con las células no blanco.

Vectores para terapia génica De manera amplia, la terapia génica busca transferir material genético novedoso a las células de un paciente resultando en beneficio terapéutico al paciente. Dichos beneficios incluyen tratamiento o profilaxis de un amplio intervalo de enfermedades, trastornos y otras condiciones. Los métodos de terapia génica ex vivo implican la modificación del células aisladas, las cuales son entonces infusionadas, injertadas o transplantadas de otra manera dentro del paciente. Véase, por ejemplo, Patentes de E.U.A. Nos. 4,868,116, 5, 399,346 y 5,460,959. La terapia génica in vivo busca direccionar directamente al tejido del paciente hospedero in vivo. Los virus útiles como vectores de transferencia de genes incluyen papovavirus, adenovirus, virus de vaccinia, virus adeno-asociados, herpesvirus, y retrovirus. Los retroviruses adecuados incluyen el grupo que consiste de VIH, SIV, FIV, EIAV, MoMLV.

Los virus preferidos para el tratamiento de trastornos del sistema nervioso son lentivirus y virus adeno-asociados. Ambos tipos de virus pueden integrarse dentro del genoma sin divisiones celulares, y ambos tipos pueden ser evaluados en estudios animales pre-clínicos para indicaciones del sistema nervioso, en particular del sistema nervioso central. Los métodos para la preparación de AAV se describen en la técnica, por ejemplo US 5,677,158. US 6,309,634 y US 6,683,058 describen ejemplos de administración de AAV al sistema nervioso central. Los tipos especiales y preferidos de retrovirus incluyen los lentivirus las cuales se pueden transducir en una célula e integrar dentro de su genoma sin división celular. Por lo tanto preferiblemente el vector es una partícula de lentivirus defectuosa en replicación. Dichas partículas de lentivivus se pueden producir a partir de un vector lentiviral que comprende una LTR lentiviral 5', un sitio de unión a ARNt, una señal de empaquetamiento, un promotor operativamente unido a una señal polinulceotídica que codifica dicha proteína de fusión, un origen de síntesis de la segunda cadena de ADN y una LTR lentiviral 3'. Los métodos para preparación y administración in vivo de lentivirus a células neuronales se describen en US 20020037281 (métodos para la transducción de células neuronales utilizando vectores lentivirales). Los retrovectores virales son los vectores más comúnmente utilizados en los ensayos clínicos en humano, puesto que éstos portan 7-8 kb lo cual es más que muchos otros vectores virales y puesto que éstos tienen la capacidad de infectar células y tienen su material genético establemente integrado dentro de la célula hospedera con alta eficiencia. Véase, por ejemplo, WO 95/30761; WO 95/24929. La familia oncovirinae require al menos una ronda de proliferación en célula blanco para transferencia e integración de las secuencias de ácidos nucleicos exógenos dentro del paciente. Los retrovectores virales se integran al azar en el genoma del paciente. Se han descrito dos clases de partículas retrovirales; ecotrópicas, las cuales pueden infectar células de ratón efectivamente, y amfotrópicos, los cuales pueden infectar a las células de muchas especies. Una tercera clase incluye retrovirus xenotróficos los cuales pueden infectar a las células de otras especies diferentes a las especies que produjeron el virus. Su capacidad para integrarse solamente dentro del genoma de células en división ha hecho a los retrovirus atractivos para la elaboración de linajes celulares en estudios de desarrollo y para la administración de los genes terapéuticos o suicidas a cánceres o tumores. Estos vectores pueden ser particularmente útiles en el sistema nervioso central, en donde existe una carencia relativa de división celular en pacientes adultos. Para uso en pacientes humanos, los vectores retrovirales deben ser defectuosos en replicación. Esto previene la generación adicional de partículas retrovirales infecciosas en el tejido blanco en lugar del vector defectuoso en replicación que se vuelve un transgén "cautivo" estable incorporado dentro del genoma de la célula blanco. Típicamente en los vectores defectuosos en replicación, los genes gag, env, y pol han sido deletados (junto con la mayoría del resto del genoma viral). El ADN heterólogo se inserta en lugar de los genes virales deletados. Los genes heterólogos pueden estar bajo el control del promotor heterólogos endógeno, otro promotor heterólogo activo en las célula blanco, o la LTR retroviral 5' (la LTR viral es activa en diversos tejidos). Típicamente, los vectores retrovirales tienen una capacidad de transgene de aproximadamente 7-8 kb. Los vectores retrovirales defectuosos en replicación requieren la condición de las proteínas virales necesarias para la replicación y el ensamblaje en trans, a partir de, por ejemplo, líneas celulares empaquetadoras diseñadas. Es importante que las células empaquetadoras no liberen el virus competente en replicación y/o el virus auxiliar. Esto se ha logrado mediante expresión de proteínas virales a partir de ARN que carece de la señal ?, y la expresión de los genes gag/pol y el gen env a partir de las unidades transcripcionales separadas. Además, en algunas líneas celulares empaquetadoras, las LTR' 5' se han reemplazado con promotores no virales que controlan la expresión de estos genes y se han añadido señales de poliadenilación. Estos diseños minimizan la posibilidad de recombinación que lleva a la producción de vectores competentes en replicación, o virus auxiliares. Véase, por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 4,861 ,719 incorporada en la presente invención como referencia. La invención se refiere adicionalmente a una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de neublastina y una secuencia señal. El péptido señal y el polipéptido de neublastina son como se describieron anteriormente. Por consiguiente, en algunas modalidades, la construcción de ácido nucleico codifica una secuencia que consiste de los 113 C codones terminales del pre pro polipéptido de neublastina. En ciertas modalidades, el ácido nucleico codifica una secuencia que consiste en los 104 codones C terminales de la pre pro polipéptido de neublastina. La secuencia del ácido nucleico puede comprender un péptido señal heterólogo, tal como una secuencia señal de albúmina, por ejemplo, una secuencia señal de albúmina de rata, y comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 65. En algunas modalidades, la construcción de ácido nucleico codifica una secuencia señal modificada de albúmina, por ejemplo, una secuencia señal de albúmina de rata. Una modalidad ejemplar es una construcción de ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 69. En otras modalidades, la construcción de ácido nucleico codifica una secuencia señal de la hormona de crecimiento de humano. Una modalidad ejemplar es una construcción de ácido nucleico que comprende SEQ ID NO: 67. La secuencia señal de hormona de crecimiento de humano puede comprender un intrón. En la modalidad específica de la invención, la construcción de ácido nucleico contiene una secuencia de ácido nucleico optimizada para la expresión en una célula hospedera transfectada. La optimización del uso del codón puede ser ventajosa mediante la provisión de un rendimiento incrementado de polipéptido, o eficiencia mejorada de transcripción o traducción. Una modalidad ejemplar de una construcción optimizada de ácido nucleico de la invención se establece en SEQ ID NO: 59. Debido a la degeneración conocida del código genético, en donde más de un codón puede codificar el mismo aminoácido, una secuencia de DNA puede variar a partir de lo que se muestra en SEQ ID NOS: 65, 67, o 69 y aún así codificar un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos correspondiente de SEQ ID NOS: 66, 68, o 70 respectivamente. Dichas secuencias variantes de ADN pueden resultar a partir de mutaciones silenciosas (por ejemplo que ocurren durante la amplificación por PCR), o pueden ser el producto de mutagénesis intencionada de una secuencia nativa, por ejemplo, optimización del codón. La construcción de ácido nucleico puede ser un vector. Los ejemplos de vectores plasmídicos adecuados incluyen pero no se limitan a pFRT/lac Zeo, pFRT/dhfr-1 , (Invitrogen, Carlsbad, CA) pUC, pGEM y pGEX (Pharmacia, Peapack, NJ). Otros vectores adecuados incluyen vectores virales (por ejemplo retrovirus defectuosos en replicación, adenovirus y virus adeno-asociados), los cuales sirven para funciones equivalentes.

Vectores de expresión Los vectores de expresión pueden incluir una o más secuencias reguladoras operativamente asociadas a la secuencia del ácido nucleico a ser expresado. Los ejemplos de secuencias reguladoras incluyen promotores, potenciadores, y señales de poliadenilación. Dichas secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel, 1990 Methods Enzymol., 185: 3. Las secuencias reguladoras incluyen aquellas las cuales dirigen la expresión constitutiva de una secuencia nucleotídica en muchos tipos de células hospederas y aquellas que dirigen la expresión de la secuencia nucleotídica solamente en ciertas células hospederas (por ejemplo secuencias reguladoras específicas del tejido). Se apreciará por aquellos expertos en la técnica que el diseño del vector de expresión dependerá de dichos factores tales como la elección de las células hospederas a ser transformadas, el nivel de expresión de proteína deseada, y los similares. Los vectores de expresión de la invención se pueden introducir dentro de células hospederas para producir así proteínas o péptidos. La construcción de vectores para expresión recombinante de neublastina para uso en la invención se puede lograr utilizando técnicas convencionales que no requieren explicación detallada a un experto en la técnica. No obstante, para revisión, aquellos expertos en la técnica podrían desear consulta el Maniatis et al., en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (NY 1982). Brevemente, la construcción de vectores de expresión recombinantes emplea técnicas de ligación estándar. Para análisis para confirmar las secuencias correctas en los vectores construidos, las mezclas de ligación se pueden utilizar para transfectar/transducir una célula hospedera y se pueden seleccionar células genéticamente alteradas de manera exitosa mediante la resistencia a antibióticos cuando sea apropiado.

Los vectores a partir de las células transfectadas/transducidas se preparan, analizan mediante restricción y/o se secuencian mediante, por ejemplo, el método de Messing, et al. (Nucleic Acids Res., 9: 309-, 1981), el método de Maxam, et al. (Methods in Enzymology, 65: 499, 1980), el método dideoxi de Sanger, u otros métodos adecuados los cuales se conocerán por aquellos expertos en la técnica. La separación por tamaño de los fragmentos escindidos se lleva a cabo utilizando electroforesis convencional en gel como se describe, por ejemplo, por Maniatis, et al. (Molecular Cloning, pp. 133-134, 1982). Los elementos de expresión empleados en la invención pueden variar en su fuerza y especificidades. Dependiendo del sistema hospedero/vector utilizado, se puede utilizar cualquiera de numerosos elementos adecuados para transcripción y traducción, incluyendo promotores constitutivos e inducibles, en el vector de expresión. Cuando la clonación se va a llevar a cabo en sistemas de células de mamífero, se pueden utilizar los promotores derivados a partir del genoma de células de mamífero (por ejemplo promotor de metalotioneína) o a partir de virus de mamífero (por ejemplo el promotor de CMV, el promotor tardío de adenovirus, el promotor del virus de vaccinia 7.5 K); cuando se generan líneas celulares que contienen múltiples copias del producto de expresión, los vectores basados en SV40-, BPV- y EBV-70 se pueden utilizar con un marcador de selección apropiado. La expresión de un gen se controla en los niveles de transcripción, traducción o pos-traducción. El inicio de transcripción es un evento temprano y crítico en la expresión génica. Esto depende de las secuencias de promotor y del potenciador y se influye por factores celulares específicos que interaccionan con estas secuencias. La unidad transcripcional de muchos genes procariónticos consiste del promotor y en algunos casos de elementos potenciadores o reguladores (Banerji et al., Cell 27: 299 (1981); Corden et al., Science 209: 1406 (1980); y Breathnach y Chambón, Ann. Rev. Biochem. 50: 349 (1981)). Para los retroviruses, los elementos control implicados en la replicación del genoma retroviral residen en el repetido terminar largo (LTR) (Weiss et al., eds., The molecular biology of tumor viruses: RNA tumor viruses, Cold Spring Harbor Laboratory, (NY 1982) ). Las LTRs del virus de la leucemia de Moloney de murino (MLV) y el virus de sarcoma de Rous (RSV) contienen secuencias promotoras y potenciadoras (Jolly et al., Nucleic Acids Res. 11: 1855 (1983); Capecchi et al., En: Enhancer and eukaryotic gene expression, Gulzman y Shenk, eds., pp. 101-102, Cold Spring Harbor Laboratories (NY 1991). Otros promotores potentes incluyen aquellos derivados a partir de citomegalovirus (CMV) y otros promotores virales de tipo silvestre. También se han descrito las regiones promotoras y potenciadoras de numerosos promotores no virales (Schmidt et al., Nature 314: 285 (1985); Rossi y deCrombrugghe, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84: 5590-5594 (1987)). Los métodos para el mantenimiento y la expresión incrementada de transgenes en células quiescentes incluye el uso de promotores incluyendo los promotores de colágena tipo I (1 y 2) (Prockop y Kivirikko, N. Eng. J. Med. 311 :376 (1984); Smith y Niles, Biochem. 19: 1820 (1980); de Wet et al., J. Biol. Chem., 258: 14385 (1983)), SV40 y LTR. En células hospederas de mamífero, se pueden utilizar numerosos sistemas de expresión basados en virus. En los casos en donde se utiliza un adenovirus como un vector de expresión, una secuencia codificante se puede ligar a un complejo para control de la transcripción/traducción de adenovirus, por ejemplo, el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Este gen quimérico se puede insertar entonces dentro del genoma de adenovirus mediante recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma viral (por ejemplo región E1 o E3) resultará en un virus recombinante que es viable y capaz de expresar un péptido en hospederos infectados (véase por ejemplo Logan & Shenk, 1984, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81: 3655). Alternativamente, se puede utilizar el promotor de vaccinia 7.5 K (véase, por ejemplo, Mackett et al., 1982, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 79: 7415; Mackett et al., 1984, J. Virol., 49: 857; Panicali et al., 1982, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 79: 4927). De conformidad con una modalidad de la invención, el promotor es un promotor constitutivo seleccionado a partir del grupo que consiste de: promotor de ubiquitina, promotor de CMV, promotor de JeT, promotor de SV40, y promotor del factor de elongación 1 alfa (EF1-alfa). Los ejemplos de promotores inducibles/represibles incluyen: Tet-On, Tet-Off, promotor inducible por rapamicina, Mx Además para utilizar promotores virales y no virales para dirigir la expresión del transgen, se puede utilizar una secuencia potenciadora que incrementa el nivel de expresión del transgen. Los potenciadores pueden incrementar la actividad transcripcional no solamente de su gen nativo sino que también de algunos genes externos (Armelor, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 70: 2702 (1973)). Por ejemplo, en la presente invención las secuencias potenciadas de colágena se utilizan con el promotor de colágena 2 (I) para incrementar la expresión del transgen. Además, el elemento potenciador encontrado en los virus SV40 se puede utilizar para incrementar la expresión del transgen. Esta secuencia potenciadora consiste de un repetido de 72 bases de pares como se describe por Gruss et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78: 943 (1981); Benoist y Chambón, Nature 290: 304 (1981), y Fromm y Berg, J. Mol. Appl. Genetics, 1: 457 (1982), todos los cuales se incorporan como referencia en la presente invención. Esta secuencia repetida puede incrementar la transcripción de muchos genes virales y celulares diferentes cuando se presenta en series con diversos promotores (Moreau et al., Nucleic Acids Res. 9: 6047 (1981). La expresión del transgen también que puede incrementar para una expresión estable a largo plazo utilizando citocinas para modular la actividad del promotor. Se ha reportado que diversas citocinas modulan la expresión del transgene a partir de la colágena 2 (I) y de los promotores LTR (Chua et al., Connective Tissue Res., 25: 161-170 (1990); Elias et al., Annals N. Y. Acad. Sci. , 580: 233-244 (1990)); Seliger et al., J. Immunol. 141 : 2138- 2144 (1988) y Seliger et al., J. Virology 62: 619-621 (1988)). Por ejemplo, el factor de crecimiento transformante (TOF), interleucina (IL)-I, e interferón (INF) sub-regulan la expresión de transgenes dirigidos mediante diversos promotores tales como LTR. El factor de necrosis tumoral (TNF) y TGF 1 sobre-regulan, y se pueden utilizar para controlar, la expresión de los transgenes dirigidos por un promotor. Otras citocinas que pueden probar ser útiles incluyen factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF) y factor de crecimiento epidérmico (EGF). El promotor de colágena con la secuencia potenciadora de la colágena (Coll (E)) también se puede utilizar para incrementar la expresión del transgene mediante la supresión adicional de cualquier respuesta inmune al vector la cual se puede generar en un cerebro tratado sin importar su estado ¡nmunoprotegido. Además, los agentes anti-inflamatorios incluyendo esferoides, por ejemplo dexametasona, se pueden administrar al hospedero tratado inmediatamente después de la composición para administración del vector y se continúa, preferiblemente, hasta que disminuye cualquier respuesta inflamatoria mediada por ésta. Un agente inmunosupresor tal como ciclosporina también se puede administrar para reducir la producción interferones, los cuales subregulan al promotor de LTR y al promotor-potenciador de Coll (E), y reduce la expresión del transgene. El vector puede comprender secuencias adicionales tales como una secuencia codificante para la proteína que codifica la proteína recombinante Cre, y las secuencias LoxP. Una manera adicional para asegurar la expresión temporal de la neublastina es a través del uso del sistema Cre-LoxP el cual resulta en la escisión de parte de la secuencia de ADN insertado después de la administración de la Cre-recombinasa a las células (Daewoong et al, Nature Biotechnology 19: 929-933) o mediante la incorporación de un gen codificante para la recombinasa dentro de la construcción viral (Pluck, Int J Exp Path, 77: 269-278). La incorporación de un gen para la recombinasa en la construcción viral junto con los sitios LoxP y un gen estructural (una neublastina en el presente caso) frecuentemente resulta en la expresión del gen estructural por un periodo de aproximadamente cinco días. Los vectores utilizados en los métodos de la invención también pueden incluir una secuencia de ácido nucleico que codifica el marcador estable que se puede utilizar para identificar células hospederas exitosamente transformadas. Los marcadores de selección adecuados para uso en células de mamífero cultivadas incluyen genes que confieren resistencia a los fármacos, tales como neomicina, higromicina, y metotrexato. El marcador de selección puede ser marcador de selección amplificable. Un marcador de selección amplificable es el gen DHFR. Otro marcador amplificable y adecuado es el ADNc de DHFRr (Simonsen y Levinson, 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) 80: 2495). Los marcadores de selección adicionales se revisan por Thilly (Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, MA). Los marcadores de selección adecuados se pueden elegir mediante cualquier persona experta en la técnica. Los marcadores de selección se pueden introducir dentro de las células hospedera en el mismo vector que la pre-secuencia de neublastina, o como parte de un vector separado. El marcador de selección y la secuencia neublastina pueden estar bajo el control de diferentes promotores o el mismo promotor, el último arreglo produciendo un mensajero dicistrónico. Las construcciones de este tipo se conocen en la técnica (véase por ejemplo Patente de E.U.A. No. 4,713,339). Los vectores de expresión utilizados en los métodos de la invención también pueden codificar marcas que purifican el polipéptido recombinantemente producido de neublastina. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, vector pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO J., 2: 1791) en el cual las secuencias codificantes del polipéptido de neublastina descritas en la presente invención se pueden ligar dentro del vector en marco con la región codificante lac z de manera que se produce una proteína híbrida; los vectores pGEX también pueden ser utilizados para expresar el polipéptido de neublastina con una marca de glutationa S-transferasa (GST). Estas proteínas usualmente son solubles se pueden purificar fácilmente a partir de las células mediante la adsorción a lechos de glutationa-agarosa seguido por elución en la presencia de glutationa libre. Los vectores incluyen sitios de escisión (thrombina o factor Xa proteasa o PreScission Protease™ (Pharmacia, Peapack, N. J.)) para la remoción fácil de la marca después de la purificación. Se conocen en la técnica diversas marcas de fusión, por ejemplo, marcas de histidina, marcas para proteína de unión a maltosa.

Preparaciones farmacéuticas para terapia génica Para formar una composición de neublastina para uso en la invención; los vectores virales de expresión que codifican la neublastina se pueden colocar en una suspensión, solución o emulsión farmacéuticamente aceptable. Los medios adecuados incluyen solución salina y preparaciones de liposomas. Más específicamente, los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden incluir soluciones acuosas estériles de soluciones, suspensiones, y emulsiones no acuosas. Los ejemplos de solventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y esteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo solución salina y medio con pH regulado. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, Ringer lactado o aceites fijados. Los vehículos intravenosos incluyen surtidores de fluidos y nutrientes, surtidores de electrolito (tales como aquellos basados en dextrosa de Ringer), y los similares. También pueden estar presentes conservadores y otros aditivos tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes que no causan afección, y gases inertes y los similares. Además, una composición de transgenes de neublastina puede ser liofilizada utilizando métodos bien reconocidos en la técnica, para la reconstitución subsecuente y uso de conformidad con la invención. Un sistema de dispersión coloidal también se puede utilizar para la administración del gen blanco. Los sistemas de dispersión coloidal incluyen complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, lechos, y sistemas basados en lípido incluyendo emulsiones aceite en agua, micelas, micelas mezcladas, y liposomas. Los liposomas son vesículas con membrana artificiales los cuales son útiles como vehículos para administración in vitro y in vivo. Se ha mostrado que las vesículas unilamelares grandes (LUV), las cuales tienen intervalo de tamaño de 0.2-4.0 um pueden encapsular un porcentaje sustancial de un regulador de pH acuoso que contiene macromoleculares grandes.EI ARN, ADN y viriones intactos se pueden encapsular dentro del interior acuoso y se pueden administrar a las células en una forma biológicamente activa (Fraley, et al., Trends Biochem. Sci. , 6: 77,1981). Además para las células de mamífero, los liposomas han sido utilizados para la administración de transgenes operativamente codificantes en células vegetales, levaduras y células bacterianas. Con el objeto de que un liposoma sea un vehículo eficiente de transferencia del gen, se deben presentar las siguientes características characteristics: (1) encapsulación de los genes que codifican la neublastina a una alta eficiencia a la vez que no se complemente su actividad biológica; (2) unión preferencial y sustancial a una célula blanco en comparación con células no blanco; (3) administración de los contenidos acuosos de la vesícula al citoplasma de la célula blanco con una alta eficiencia; y (4) expresión precisa y efectiva de información genética (Mannino, et al., Biotechniques, 6: 682, 1988). La composición del liposoma usualmente es una combinación de fosfolípidos, particularmente fosfolípido con una alta temperatura de transición de fase, usualmente en combinación con esferoides, especialmente colesterol. También se pueden utilizar otros fosfolípidos u otros lípidos. Las características físicas de los liposomas dependen del pH, fuerza iónica, y la presencia de cationes divalentes. Los ejemplos de lípidos útiles en la producción de liposomas incluyen compuestos de fosfatidilo, tales como fosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, esfingolípidos, cerebrósidos, y gangliósidos. Particularmente útiles son los diacilfosfatidilglicero.es, en donde la porción lipídica contiene de 14-18 átomos de carbono, particularmente de 16-18 átomos de carbono, y está saturada. Los fosfolípidos ilustrativos incluyen fosfatidilcolina de huevo, dipalmitoilfosfatidilcolina y diestearoilfosfatidilcolina. En direccionamiento de los liposomas se puede clasificar basándose en factores anatómicos y mecánicos. La clasificación anatómica se basa en el nivel de selectividad, por ejemplo, específica de órgano, específica de célula, y específica de organelo. El direccionamiento mecánico se puede distinguir basándose en si es pasivo o activo. El direccionamiento pasivo utiliza la tendencia natural de los liposomas para distribuirse en las células del sistema reticulo-endotelial (RES) en órganos los cuales contienen capilares sinusoidales. Por otra parte, el direccionamiento activo, implica la alteración del liposoma mediante acoplamiento del liposoma a un ligando específico tales como un anticuerpo monoclonal, azúcar, glicolípido, o proteína, o mediante el cambio en la composición o tamaño del liposoma con el objeto de lograr el direccionamiento a los órganos y tipos celulares diferentes a los sitios de localización que se presentan de manera natural. La superficie del sistema de administración de direccionamiento del gen se puede modificar una variedad de formas. En el caso de un sistema de administración liposomal dirigido, los grupos lipidíeos se pueden incorporar dentro de la bicapa lipídica del liposoma con el objeto de mantener el ligando para direccionamiento en asociación estable con la bicapa liposomal. Se pueden utilizar diversos grupos de enlace para unir las cadenas lipídicas al ligando para direccionamiento. Un ejemplo adicional de un sistema de administración incluye el transplante en el área terapéutica de una composición de células empaquetadoras capaces de producir partículas del vector como se describe en la presente invención. Los métodos para encapsulación y transplante de dichas células se conocen en la técnica, en particular a partir de WO 97/44065 (Citoterapéuticas). Mediante la selección de una línea celular empaquetadora capaz de producir partículas lentivirales, se obtiene la transducción de células que no se encuentran en división en el área terapéutica. Mediante el uso de las partículas retrovirales capaces de transducir solamente las células que llevan a cabo división, la transducción se restringe a las células diferenciadas de-novo en el área terapéutica.

Métodos para la administración de composiciones de vector para terapia génica Siguiendo el protocolo definido por la invención, se puede lograr la administración directa de una composición de neublastina mediante métodos familiares a aquellos expertos en la técnica, incluyendo microinyección a través de una incisión quirúrgica (véase, por ejemplo, Capecchi, Cell, 22: 479-488 (1980)); electroporación (véase, por ejemplo, Andreason y Evans, Biotechniques, 6: 650-660 (1988)); infusión, formación de complejos químicos con una molécula direccionadora o co-precipitante (por ejemplo, liposoma, calcio), y bombardeo de micropartículas al tejido blanco (Tang, et al., Nature, 356: 152-154 (1992)).

Encapsulación de células La terapia de célula encapsulada se basa en el concepto de aislamiento de células a partir del sistema inmune del hospedero recipiente al circundar a la células con un material semipermeable biocompatible antes del implante en el hospedero. La invención incluye un dispositivo en el cual las células están encapsuladas en una cápsula inmuno aislante. Una "cápsula inmuno aislante" significa que la cápsula, después del implante en un hospedero recipiente, minimiza los efectos deletéreos del sistema inmune del hospedero sobre las células en el núcleo del dispositivo. Las células son inmunoaisladas a partir del hospedero mediante el englobamiento en cápsulas poliméricas implantables formadas mediante una membrana microporosa. Este método previene el contacto célula-célula entre los tejidos del hospedero y los tejidos implantados, eliminando el reconocimiento del antígeno a través de la presentación directa. Las membranas utilizadas también se pueden modificar en un extremo para controlar la difusión de las moléculas, tales como anticuerpo y complemento, basándose en su peso molecular (Lysaght et al., 56 J. Cell Biochem. 196 (1996), Colton, 14 Trends Biotechnol. 158 (1996)). Utilizando las técnicas de encapsulación, las células se pueden transplantar dentro de un hospedero sin rechazo inmune, ya sea con o sin el uso de fármacos inmunosupresores. Las cápsulas poliméricas biocompatibles útiles usualmente contienen un núcleo que contiene a las células, ya sea suspendida en un medio líquido o inmovilizadas en una matriz inmovilizante, y una región alrededor o periférica de matriz o membrana con permeación selectiva ("cubierta") que no contiene células aisladas, que es biocompatible, y que es adecuada para proteger a las células en el núcleo del ataque inmunológico detrimental. La encapsulación oculta a los elementos del sistema inmune de entrar a la cápsula, por lo tanto protegiendo a las células encapsuladas de la destrucción immune. La naturaleza semipermeable de la membrana de la cápsula también permite que la molécula biológicamente activa de interés se difunda fácilmente a partir de ia cápsula hacia el tejido hospedero circundante. La cápsula puede estar elaborada a partir de un material biocompatible. Un "material biocompatible" es un material que, después de su implante en un hospedero, no induce una respuesta detrimental por parte del hospedero adecuada para resultar en el rechazo de la cápsula o para volverla a ésta inoperable, por ejemplo a través de la degradación. El material biocompatible es relativamente impermeable a moléculas grandes, tales como componentes del sistema inmune del hospedero, pero es permeable a las moléculas pequeñas, tales como insulina, factores de crecimiento, y nutrientes, a la vez que se permite que se remueva el desecho metabólico. Una variedad de materiales biocompatibles son adecuados para la administración de factores de crecimiento mediante la composición de la invención. Se conocen numerosos materiales biocompatibles, que tienen diversas morfologías de superficie externa y otras características mecánicas y estructurales. Preferiblemente la cápsula de esta invención será similar a aquellas descritas por las Solicitudes de Patente Internacional PCT WO 92/19195 o WO 95/05452, incorporadas como referencias; o Patentes de E.U.A. Nos. 5,639,275; 5,653,975; 4,892,538; 5,156,844; 5,283,187; o Patente de E.U.A. No. 5,550,050, incorporadas en la presente invención como referencias. Dichas cápsulas permiten el paso de los metabolitos, nutrientes y sustancias terapéuticas a la vez que se minimizan los efectos detrimentales del sistema inmune del hospedero. Los componentes del material biocompatible pueden incluir una membrana semipermeable en los alrededores y la estructura base interna para soporte de la célula. Preferiblemente, las células genéticamente alteradas se siembran sobre la estructura base, la cual se encapsulada por la membrana con permeación selectiva. La estructura base filamentosa para soporte de la célula puede ser elaborada a partir de cualquier material biocompatible seleccionado a partir del grupo que consiste de acrílico, poliéster, polietileno, polipropileno poliacetonitrilo, polietileno teraftalato, nylon, poliamidas, poliuretanos, polibutéster, seda, algodón, quitina, carbón, o metales biocompatibles. También, las estructuras unidas con fibras se pueden utilizar para el implante celular (Patente de E.U.A. No. 5,512,600, incorporada como referencia). Los polímeros biodegradables incluyen aquellos que comprenden poli(ácid láctico) PLA, poli(ácido láctico-coglicólico) PLGA, y poli(ácido glicólico) PGA y sus equivalentes. Las estructuras base en espuma han sido utilizadas para proveer superficies sobre las cuales las células trasplantadas se pueden adherir (Solicitud de Patente Internacional PCT Ser. No. 98/05304, incorporada como referencia). Los tubos con mallas tejidas han sido utilizados como injertos vasculares (Solicitud de Patente Internacional PCT WO 99/52573, incorporada como referencia). Adicionalmente, ei núcleo puede estar compuesto de una matriz inmovilizante formada a partir de un hidrogel, el cual estabiliza la posición de las células. Un hidrogel es una red 3-dimensional de polímeros hidrófilos entrecruzados en la forma de un gel, sustancialmente compuesto de agua.

Diversos polímeros y mezclas de polímeros se pueden utilizar para elaborar la membrana semipermeable circundante, incluyendo poliacrilatos (incluyendo copolímeros de acrílico), polivinilidenos, copolímeros de cloruro de polivinilo, poliuretanos, poliestirenos, poli-amidas, acetatos de celulosa, nitratos de celulosa, polisulfonas (incluyendo poliéther sulfonas), polifosfacenos, poliacrilonitrilos, poli(acrilonitrilo/cloruro de covinilo), así como derivados, copolímeros y mezclas de los mismos. Preferiblemente, la membrana semipermeable circundante es una membrana de fibra con orificios semipermeable biocompatible. Dichas membrana y métodos para elaborarlas se describen en las Patentes de E.U.A. Nos. 5,284,761 y 5,158,881 , incorporadas como referencias. La membrana semipermeable circundante se forma a partir de una fibra con orificios del poliéther sulfona, tales como aquellas descritas por la Patente de E.U.A. No. 4,976,859 o Patente de E.U.A. No. 4,968,733, incorporadas como referencias. Un material alterno para membrana semi permeable circundante es poli(acrilonitrilo/cloruro de covinilo). La cápsula puede ser de cualquier configuración apropiada para el mantenimiento de la actividad biológica y provee acceso para la administración del producto o función, incluyendo por ejemplo, de forma cilindrica, rectangular, en forma del disco, en forma de parche, ovoide, estrellada, o esférica. Además, la cápsula puede estar enrollada o cubierta con una estructura semejante a malla o anidada. Si la cápsula se va a retirar después de que se implanta, no se prefieren las configuraciones que tienden a dirigir la migración de las cápsulas a partir del sitio de implante, tales como cápsulas esféricas lo suficientemente pequeñas para viajar en los vasos sanguíneos del hospedero recipiente. Ciertas formas, tales como rectángulos, parches, discos, cilindros, y láminas planas ofrecen una integridad estructural mayor y se prefieren cuando se va a llevar a cabo el retiro. Cuando se utiliza en las macrocápsulas, preferiblemente entre 103 y 108 células son encapsuladas, más preferiblementelO5 a 107 células son encapsuladas en cada dispositivo. La dosificación se puede controlar mediante implante de un número pequeño o mayor de cápsulas, preferiblemente entre 1 y 10 cápsulas por paciente. La estructura base se puede revestir con moléculas de la matriz extracelular (ECM). Los ejemplos adecuados de moléculas de la matriz extracelular incluyen, por ejemplo, colágena, laminina, y fíbronectina. La superficie de la estructura base también se puede modificar mediante el tratamiento con irradiación del plasma para impartir una carga para mejorar la adhesión de las células. Se puede utilizar cualquier método adecuado para sellado de las cápsulas, incluyendo el uso de polímeros agresivos o formación de rizos, formación de nudos y sellado mediante calor. Además, también se puede utilizar cualquier método de sellado "en seco" adecuado, como se describe, por ejemplo, en la Patente de E.U.A. No. 5,653,687, incorporada como referencia. Los dispositivos para células encapsuladas se implantan de conformidad con las técnicas conocidas. Se contemplan muchos sitios para implante para los dispositivos y métodos de esta invención. Estos sitios para implante incluyen, pero no se limitan a, el sistema nervioso central, incluyendo el cerebro; médula espinal (véase, Patentes de E.U.A. Nos. 5,106,627,5, 156,844, y 5,554,148, incorporadas como referencias), implante intratecal, y los humores acuosos y vitreos del ojo (véase, Solicitud de Patente Internacional PCT WO 97/34586, incorporada como referencia), el espacio subretinal, y la cápsula subtenar. En el cerebro, los dispositivos se pueden implantar en el parénquima y los ventrículos. Para administración sistémica, el implante puede ser intramuscular, subcutáneo, o intraperitoneal. La línea celular ARPE-19 es una línea celular con una plataforma superior para tecnología de administración basada en células encapsuladas y también es útil para tecnología de administración basada en células no encapsuladas. La línea celular ARPE-19 es resistente (por ejemplo, la línea celular es viable bajo condiciones severas, tales como implante en el sistema nervioso central o el ambiente intra-ocular). Las líneas ARPE-19 se pueden modificar genéticamente para secretar una sustancia de interés terapéutico. Las líneas ARPE-19 tienen una extensión de vida relativamente larga. Las líneas ARPE-19 son de origen de humano. Además, las líneas ARPE-19 encapsuladas tienen una buena viabilidad en dispositivo in vivo. Las líneas ARPE-19 pueden administrar una cantidad eficiente de factor de crecimiento. Las líneas ARPE-19 producen una reacción inmune del hospedero insignificante. Además, las líneas ARPE-19 no son tumorigénicas.

Los métodos y aparatos para implante de cápsulas dentro del SNC se describen en US 5,487,739. En un aspecto la invención se refiere a una cápsula biocompatible que comprende: un núcleo que comprende células empaquetadoras vivas que secretan un vector viral para la infección de una célula blanco, en donde el vector viral es un vector de conformidad con la invención; y una cubierta externa que circunda a dicho núcleo, dicha cubierta que comprende un material biocompatible permeable, dicho material que tiene una porosidad seleccionada para permitir el paso de vectores retrovirales de 100 nm de diámetro a través de este, permitiendo la liberación de dicho vector viral a partir de dicha cápsula. Preferiblemente, el núcleo adicionalmente comprende una matriz, las células empaquetadoras son inmovilizadas por la matriz. De conformidad con una modalidad, la cubierta comprende un hidrogel o material termoplástico. Los ejemplos de células adecuadas para líneas celulares empaquetadoras incluyen HEK293, NIH3T3, PG13, y líneas ARPE-19. Las células preferidas incluyen las células PG13 y 3T3. Los métodos y dispositivos para la encapsulación de células empaquetadoras se describen en US 6,027,721 incorporada en la presente invención como referencia en su totalidad.

Células hospederas Las construcciones de ácido nucleico de la invención se pueden utilizar para producir el polipéptido de neublastina. Las células eucariónticas se pueden transfectar con una construcción de ácido nucleico el cual codifica un polipéptido recombinantes de neubiastina operativamente asociado a una secuencia señal heteróloga. Los métodos para elaborar construcciones de ácido nucleico y para transfectar células con las construcciones se conocen en la técnica. (Véase por ejemplo, Ausubel et al., eds., 1988, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates & Wiley-Interscience: New York; Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, NY). Por ejemplo, las células se pueden transfectar utilizando electroporación, precipitación en fosfato de calcio, o infección con un vector viral. En algunas modalidades, la célula hospedera transformada es una célula de mamífero, por ejemplo, una célula CHO, una célula COS, una célula HeLa, o una célula NIH 3T3. Las células hospederas transformadas se cultivan en un medio de crecimiento apropiado y bajo condiciones de tal manera que el polipéptido secretado de neublastina se expresa y secreta a partir de la célula. Un medio de crecimiento apropiado es un medio que contiene nutrientes requeridos para el crecimiento de las células. Los nutrientes requeridos para el crecimiento de la célula pueden incluir una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, aminoácidos esenciales, vitaminas, minerales y factores de crecimiento.

Opcionalmente, el medio puede contener suero de ternera bovino o suero de ternera fetal. En medio de crecimiento se puede diseñar para seleccionar a las células que contienen la construcción de ácido nucleico. Esto se puede realizar, por ejemplo, mediante selección del fármaco o deficiencia en un nutriente esencial el cual es complementado por marcador de selección sobre la construcción de ácido nucleico o co-transfectado con la construcción de ácido nucleico. Las células de mamífero cultivadas algunas veces se crecen en medio que contiene suero o medio libre de suero comercialmente disponible (por ejemplo MEM, DMEM) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los factores a ser considerados en la selección de un medio apropiado para la línea celular particular utilizada se conocen en la técnica. Por lo tanto, en un aspecto la invención se refiere a células hospederas aisladas transducidas o transfectadas con el vector de conformidad con la invención. Preferiblemente estas células son células hospederas de mamífero debido a que son capaces de secretar y procesar la neublastina codificada correctamente. Las especies preferidas incluyen el grupo que consiste de roedor (ratón, rata), conejo, perro, gato, cerdo, mono, ser humano. Los ejemplos de cultivos primarios y líneas celulares que son buenos candidatos para la transducción con los vectores de la presente invención incluyen el grupo que consiste de CHO, HEK293, COS, PC12, HiB5, RN33b, células neuronales, células fetales, líneas celulares RPE, ARPE-19, fibroblastos inmortalizados de humano, C2C12, HeLa, HepG2, células estriatales, neuronas, astrocitos, interneuronas. Un tipo preferido de línea celular para la encapsulación y para la terapia de célula desnuda son las células retínales epiteliales pigmentarias (células RPE). La fuente de células RPE es mediante el aislamiento de célula primaria a partir de la retina de mamífero. Los protocolos para cosechar células RPE están bien definidos (Li y Turner, 1988, Exp. Eye Res. 47: 911-917; López et al., 1989, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 30: 586-588) y se consideran como una metodología de rutina. En la mayoría de los reportes publicados del cotransplante de célula RPE, las células se derivan a partir de la rata (Li y Tumer, 1988; López et al., 1989). Preferiblemente, las células RPE son derivadas de humanos. Además para aislar las células RPE primarias, se puede utilizar el cultivo de líneas celulares RPE de humano en la práctica de la invención. Para transducción in vivo, el grupo preferido de células hospederas incluye células estriatales, neuronas, astrocitos e ¡nterneuronas. Para terapia génica ex vivo, el grupo preferido de células incluye células neuronales, células precursora neuronales, células progenitoras neuronales, células madre y células fetales. Las células madre y células precursoras neuronales tienen la ventaja de que éstas se pueden integrar dentro del tejido y migrar. Para la encapsulación y para el implante de células desnudas las células preferidas incluyendo células retínales epiteliales pigmentarias, incluyendo líneas ARPE-19; fibroblastos inmortalizados de humano; y astrocitos inmortalizados de humano. Particularmente preferidas son las células ARPE-19 En otra modalidad la línea celular terapéutica se selecciona a partir del grupo que consiste de: líneas celulares de fibroblasto de humano, líneas celulares de astrocito de humano, líneas celulares mesencefálicas de humano, y líneas celulares endoteliales de humano, preferiblemente inmortalizadas con TERT, SV40T o vmyc. El método para generar líneas celulares inmortalizadas de astrocito de humano se ha descrito previamente (Price TN, Burke JF, Mayne LV. A novel human astrocyte cell line (A735) with astrocyte-specific neurotransmitter function. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 1999 Mayo; 35 (5) 279-88.). Este protocolo se puede utilizar para generar líneas celulares de astrocito. Las siguientes tres modificaciones de ese protocolo preferiblemente se realizan para generar líneas celulares adicionales de astrocito de humano. El tejido cerebral fetal de humano que se diseca a partir de fetos de 5-12 semanas de edad se puede utilizar en lugar de tejido de 12-16 semanas de edad. La inmortalización del gen v-myc, o TERT (telomerasa) se puede utilizar en lugar del antígeno SV40 T. La transferencia del gen retroviral se puede utilizar en lugar de la transfección con plásmidos.

El polipéptido de neublastina también se puede expresar en un animal transgénico, tales como un roedor, vaca, cerdo, oveja o cabra. Un animal transgénico es un animal no humano que ha incorporado un gen externo dentro de su genoma de tal manera que el gen externo pasa de padre a su descendencia. Los genes exógenos se pueden introducir dentro de embriones de una sola célula (Brinster et al,. 1985, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 82: 4438). Los métodos para la producción de animales transgénicos se conocen en la técnica, (Wagner et al., 1981, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78: 6376; McKnight et al., 1983, Cell 34: 335; Brinster et al., 1983, Nature 306: 332; Ritchie et al., 1984, Nature 312: 517; Baldassarre et al., 2003, Theriogenology 59: 831 ; Robl et al., 2003, Theriogenology 59: 107; Malassagne et al., 2003, Xenotransplantation 10 (3): 267).

Producción in vitro de neublastina En un aspecto separado la invención se refiere a células de mamífero, tales como las células anteriormente definidas, capaces de secretar un polipéptido de neublastina en cantidades en exceso de 500 ng/106 células/24 horas, más preferiblemente en exceso de 600 ng/106 células/24 horas, más preferiblemente en exceso de 700 ng/106 células/24 horas, más preferiblemente en exceso de 800 ng/106 células/24 horas, más preferiblemente en exceso de 900 ng/106 células/24 horas, tales como en exceso de 1000 ng/106 células/24 horas.

Preferiblemente la neublastina secretada es biológicamente activa como se determina mediante el ensayo ELISA de RetL3 descrito en el ejemplo 1. Esto obvia la necesidad de glicosilación, escisión y re-plegamiento. Las células hospederas preferidas se seleccionan a partir del grupo que consiste de CHO, HEK293 COS, PC12, HiB5, RN33b, C2C12, HeLa, HepG2, y líneas ARPE-19. Más preferiblemente el grupo consiste de CHO, HEK293, COS, y ARPE-19. La neublastina o un equivalente funcional de la misma se puede producir mediante el cultivo de esta células y la recuperación de la neublastina a partir del medio de cultivo sin la necesidad de replegar o glicosilar la proteína. La expresión se puede incrementar incluso adicionalmente mediante la inclusión de elementos potenciadores tales como WPRE (US 6,136,597).

Matriz de soporte para las células productoras de neublastina La presente invención comprende adicíonalmente el cultivo de células productoras de neublastina ¡n vitro sobre una matriz de soporte antes del implante dentro del sistema nervioso de mamífero. La preadhesión de las células a los microvehículos antes del implante se diseña para mejorar la viabilidad a largo plazo de las células transplantadas y provee un beneficio funcional a largo plazo.

Para incrementar la viabilidad a largo plazo de las células transplantadas, por ejemplo, células transplantadas que secretan neublastina, las células a ser transplantadas se pueden unir in vitro a una matriz de soporte antes del transplante. Los materiales a partir de los cuales se puede comprender la matriz de soporte incluyen aquellos materiales a los cuales las células se adhieren después de la incubación in vitro, y sobre los cuales las células pueden crecer, y los cuales se pueden implantar dentro del cuerpo de un mamífero sin producir una reacción tóxica, o una reacción inflamatoria la cual podría destruir a las células implantadas o de otra manera interferir con su actividad biológica o terapéutica. Dichos materiales pueden ser sustancias químicas sintéticas o naturales, o sustancias que tienen un origen biológico. Los materiales de la matriz incluyen, pero no se limitan a, vidrio y otros óxidos de silicón, poliestireno, polipropileno, polietileno, fluoruro dé polivinilideno, poliuretano, polialginato, polisulfona, alcohol polivinílico, polímeros de acrilonitrilo, poliacrilamida, policarbonato, polipentent, nylon, amilasas, gelatina natural y modificada y colágena natural y codificada, polisacáridos naturales y modificados, incluyendo dextranos y celulosas (por ejemplo, nitrocelulosa), agar, y magnetita. Se puede utilizar cualquier material reabsorbible o no reabsorbible. También los materiales de matriz extracelular pretendidos, los cuales se conocen bien en la técnica. Los materiales de matriz extracelular se pueden obtener comercialmente, o se pueden preparar mediante células en crecimiento las cuales secretan dicha matriz, removiendo las células secretoras, y permitiendo que la células las cuales van a ser transplantadas interactúen con y se adhieran a la matriz. En materia de matriz sobre el cual las células implantadas van a crecer, o con el cual se mezclan las células, puede ser un producto nativo de las células RPE. Por lo tanto, por ejemplo, el material de matrix puede ser matriz extracelular o material de membrana basal, el cual se produce y secreta por las células RPE a ser implantadas. Para mejorar la adición celular, supervivencia y función, la matriz sólida se puede revestir opcionalmente en su superficie externa con factores conocidos en la técnica que promueven la adición celular, crecimiento o supervivencia. Dichos factores incluyen las moléculas de adición celular, la matriz extracelular, tales como, por ejemplo, fibronectina, laminina, colágena, elastina, glicosaminoglicanos, o proteoglicanos o factores de crecimiento. Alternativamente, si la matriz sólida a la cual las células implantadas se unen esta construida de material poroso, el factor o factores promotores de crecimiento o de supervivencia se pueden incorporar dentro del material de matriz, a partir del cual éstas se pueden liberar lentamente después del implante in vivo. Cuando se unen al soporte de conformidad con la presente invención, la células utilizadas para transplante generalmente se encuentran sobre la "superficie externa" del soporte. El soporte puede ser sólido o poroso. No obstante, incluso en un soporte poroso, las células se encuentran en contacto directo con el medio externo sin una membrana que intervenga u otra barrera. Por lo tanto, de conformidad con la presente invención, se considera que la células se encuentran sobre la "superficie externa" del soporte incluso cuando la superficie a la cual se adhieren se puede encontrar en la forma de pliegues internos o convoluciones del material de soporte poroso las cuales no se encuentran en el exterior de la partícula o del glóbulo mismo. Preferiblemente la configuración del soporte es esférica, como en un glóbulo, pero puede ser cilindrica, elíptica, una lámina plana o tira, en forma de aguja o de espiga, y las similares. Una forma preferida de matriz de soporte es un glóbulo del vidrio. Otro glóbulo preferido es un glóbulo de poliestireno. El tamaño de los glóbulos puede tener un intervalo de aproximadamente 10 um a 1 mm en diámetro, preferiblemente de aproximadamente 90 um a aproximadamente 150 um. Para una descripción de los diversos glóbulos microvehículos, véase, por ejemplo, isher Biotech Source 87-88, Fisher Scientific Co., 1987, pp. 72-75; Sigma Cell Culture catalog, Sigma Chemical Co., St, Louis, 1991, pp.162-163 ; Ventrex Product catalog, Ventrex Laboratories, 1989; estas referencias se incorporan en la presente invención como referencias. El límite superior del tamaño de los glóbulos se puede indicar por la estimulación de los glóbulos de las reacciones no deseadas por el hospedero, el cual puede interferir con la función de las células transplantadas o puede ocasionar daños al tejido circundante. El límite superior del tamaño de los glóbulos también se puede indicar mediante el método de administración. Dichas limitaciones se determinan fácilmente por un experto en la técnica.

Polipéptido de neublastina La invención se refiere adicionalmente a un polipéptido de neublastina que comprende un péptido señal y un polipéptido de neublastina, en donde el polipéptido carece de una pro-región de neublastina, tales como un polipéptido de neublastina fusionado a un péptido señal. En particular, el péptido señal se asocia a través de su C-terminal al N-terminal del polipéptido de neublastina a través de un enlace peptídico. El péptido señal y el polipéptido de neublastina son como se definieron anteriormente.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Transfección In vitro con la construcción IqSP-NBN Construcción de Construcciones IgSP-NBN IgSP.NBN se generó mediante la sobreposición de PCR. En el primer paso de amplificación, el fragmento maduro de NBN se amplificó mediante PCR a partir del vector pUbilz.NBN.BamHI utilizando los iniciadores NBNs-igSP.FIap (d'-GGTGAATTCGGCTGGGGGCCCGGGCAGCC-S') y NBNas+Xhol (5'-TATACTCGAGCGAGCCCTCAGCCCAGGCA-3'). En una segunda reacción de PCR, la secuencia IgSP se amplificó a partir del vector pNUT-IgSP-CNTF (ref. US 6,361,741) utilizando los iniciadores IgSPKozakls+BamHI (5'- TATAGGATCCGCCACCATGAAATGCAGCTGGGTTATC-3') y IgSPas-NBN. Flap (5'-GGCCCCCAGCCGAATTCACCCCTGTAGAAAG-3'). En el tercer paso los productos del paso 1 y 2 se combinaron en una reacción final de PCR que genera IgSP-NBN mediante el uso de cantidades iguales de los productos como moldes con los iniciadores IgSPKo-zakls+BamHI y NBNas+Xhol. Para generar un vector de expresión basado en plásmido el fragmento resultante se clonó en pNS1n se digirió con BamHI/Xhol. En este vector, la secuencia IgSP-NBN se colocó bajo el control transcripcional del promotor de CMV (véase la figura 3). Además, el vector contiene el gen Neo que confiere resistencia a G418 cuando se expresa en células de mamífero.

Estudios de transfección transitoria ARPE-19 es una línea celular retinal epitelial pigmentaria de humano (Dunn et al. 1996) que se crece en DMEM/Nutrient Mix F-12 con Glutamax (Invitrogen, Dinamarca) suplementado con 10% de suero bovino fetal (Sigma-Aldrich, Dinamarca) a 37°C y 5% de CO2. Las células se pasaron aproximadamente dos veces a la semana mediante tripsinización y se sembraron de nuevo (relación de división 1 :5). Las células se sembraron en placas de 6 pozos (Corning Costar, Biotech Line, Dinamarca) a una densidad de 105 células/pozo para estudios de transfección. Al siguiente día, la células se transfectaron con 3 ug de plásmido/pozo en pozos por duplicado utilizando Fugened (Roche, Alemania) de conformidad con las especificaciones del fabricante. La actividad de NBN presente en los sobrenadantes celulares recolectados a los 3 días después de la transfección se ensayó en un ELISA RetL3.

ELISA RetL3 El ELISA RetL3 detecta la unión de un conjugado Ret-AP a un complejo de NBN unido al receptor GFRa3 específico de NBN. Este ensayo solamente detectará las moléculas NBN que están funcionalmente activas. Brevemente, una placa de 96-pozos (B & W Isoplate HB, Perkin Elmer, Dinamarca) se revistió con 100 ul de 1ug/ml de cabra anti Fe de humano (Jackson Immunoresearch Laboratories, TriChem, Dinamarca) en NaHCO3 50 mM (pH=9.6) por 16 horas a 4°C. Después de lavar en PBS/0.05 % de Tween 20 (PBST), los pozos se bloquearon en 0.2% de l-Block (Tropix, Applied Biosystems, Dinamarca) en PBST por 1 hora a temperatura ambiente, seguido por un lavado breve en PBST. Los sobrenadantes celulares o la Artemina recombinante de ratón (R & D systems, RU) se diluyeron en DMEM/10% de FCS y subsecuentemente se incubaron en los pozos con 1 ug/ml de proteína de fusión GFRa3/Fc (R & D Systems, RU) en medio condicionado RET-AP (Biogen, EUA) por 1.5 horas a temperatura ambiente. Luego los pozos se lavaron primero en PBST y luego en regulador de pH AP (Tris 200 mM (pH=9.8), MgCI2 10 mM) seguido por 30 minutos de incubación con 10% de potenciador Sapphire (Tropix, Applied Biosystems, Dinamarca) y 2% de CSPD (Tropix, Applied Biosystems, Dinamarca) en regulador de pH AP. Se determinó la luminiscencia mediante el uso del contador Microbeta Trilux (Perkin Elmer, Dinamarca).

Resultados (figura 4B) Las actividades de NBN de 25.3-33.8 ng/ml se detectaron mediante el uso del ELISA RetL3 en. sobrenadantes recolectados a partir de las líneas ARPE-19 transitoriamente transfectadas con la construcción pNS1 n-IgSP. NBN. En contraste, aproximadamente se detectó una disminución de 5-veces en la actividad de NBN (4. 4-6.4 ng/ml) en las células ARPE-19 transitoriamente transfectadas con una construcción de expresión de (prepro) NBN de tipo silvestre (pUbhz.hNBN) incluida en el mismo experimento. Se detectó una actividad muy baja o prácticamente indetectable de NBN en los sobrenadantes celulares de ARPE-19 transitoriamente transfectadas con una construcción de expresión EGFP (pNS1z-EGFP) que confirma la especificidad del ensayo. Estos resultados indican que el uso de una construcción quimérica IgSP-NBN lleva a una liberación superior de NBN maduro a partir de las células de mamífero capaces de unirse y activar el complejo receptor específico de NBN en comparación con la liberación de NBN utilizando una construcción de (prepro) NBN de tipo silvestre.

EJEMPLO 2 Transducción In vitro con la construcción IgSP-NBN Generación de una construcción lentiviral IgSP-NBN y soluciones de almacenamiento de virus Para generar una construcción lentiviral, pNS1n-lgSP-NBN se digirió con BamHI-Xhol y el fragmento IgSP-hNBN de PCR (como se describe en el ejemplo 1) se ligó dentro de pHsCXW digerido con BamHI/Xhol resultó en pHsCXW.IgSP.NBNw (figura 3). pHsCXW es un derivado de una construcción de transferencia lentiviral auto-inactivadora, pHR'-SIN 18 incluyendo un elemento WPRE (Dull et al., J. Virol., 72 (11): 8463-71 (1998); Zufferey et al., J.Virol, 72 (12): 9873-80 (1998): Zufferey et al. J.virol., 73 (4): 2886-92 (1999)) generado mediante el reemplazo de una gran parte no viral de la construcción de transferencia con la estructura base de pUC19. A la secuencia de pHsCXW se puede tener acceso a través de GenBank ID: AY468486. LV-sC defectuoso en replicación. Las partículas virales IgSP.NBN.W se generan mediante la co-transfección de pHsC.IgSP.NBN.W con pMD.G (VSV-G vector pseudo-tipificador) y pBR8.91 (vector para empaquetamiento) (Zufferey et al., Nat. Biotech. , 15: 871-75 (1997)) en las células 293T que proveen las proteínas virales requeridas para la transfección. Brevemente, las células 293T cultivadas en DMEM con 4.5 g/l glucosa y glutamax (Life Technologies, 32430-027) suplementarias con 10 % de FCS (Life Technologies, 10099-141) se siembran en botellas T75 (2x106 células/botella) el día antes de la transfección. Para cada botella T75 las células se transfectan con 5 ug de pMD.G, 15 ug de pBR8.91 y 20 ug de vector de transferencia utilizando Lipofectamina+ siguiendo las instrucciones del fabricante. El sobrenadante celular que contiene virus se recolecta a los 2-3 días después de la transfección, se filtra y esteriliza a través de un filtro de 0.45 m de acetato de celulosa o polisulfónico y se concentra mediante ultracentrifugación a 50,000xg por 90 minutos a 4°C. Después de una segunda ronda de ultracentrifugación, el concentrado de virus se suspende en DMEM, se alícuota y se almacena a -80°C. Para determinar el título viral, se ensaya la actividad de transcriptasa reversa (RT) (Cepko y Pear, Current Protocols in Molecular Biology, 9.13. 5-6, suplemento 36) y unidades transductoras (TU)/ml calculadas a partir de la actividad RT determinada utilizando un lentivirus EGFP con actividad transductoras conocida como referencia.

Estudios de transducción Las células ARPE-19 se transdujeron con vectores de expresión NBN. Brevemente, las células se sembraron en placas de 6 pozos (Corning Costar, Biotech Line, Dinamarca) a una densidad de 105 células/pozo. Al siguiente día, 2x105 TU de virus se añadió por pozo (duplicados) junto con 5 ug/ml polybrene por 4 horas. El medio se cambió y los cultivos se incubaron por 3 días. Luego los sobrenadantes recolectaron para ELISA RetL3 como se describe en el ejemplo 2.

Resultados (figura 4C). Las actividades de NBN de 39 ng/ml se detectaron mediante el uso del ELISA RetL3 en sobrenadantes recolectados a partir de las líneas ARPE-19 transducidas con el virus LV-sC. IgSP. NBN. W. En contraste, se detectó muy poca actividad o actividad casi ¡ndetectable de NBN en las líneas ARPE-19 transducidas con con un lentivirus que contiene el lentivirus de tipo silvestre (prepro) NBNcDNA (LV-sC-NBN. W) o un lentivirus control EGFP (LV-sCEW). Estos resultados indican que, en contraste con una construcción viral que contiene el NBNcDNA de tipo silvestre (prepro), el uso de una construcción viral quimérica IgSP-NBN permite una elevada liberación de NBN maduro a partir de las células de mamífero capaces de unirse y activar el complejo receptor específico de NBN.

EJEMPLO 3 Análisis de la proteína NBN expresada a partir de las construcciones IgSP-NBN Análisis de Western blot de los sobrenadantes celulares NBN presentes en los sobrenadantes celulares a partir de cultivos celulares transfectados o transducidos se concentró mediante unión por afinidad a GFRa3-lg antes del análisis Western blot. Brevemente, 4 pozos de una placa Nunc MaxiSorp se revistieron con 300 ul de cabra anti Fe de humano ug/ml (Jackson Immunoresearch Laboratories, TriChem, Dinamarca) en NaHC03 50 mM (pH=9.6) por 16 horas a 4°C. Los pozos se bloquearon con 400 ul 1 % de BSA en PBS por 1 hora a temperatura ambiente, seguido por 3 lavados en PBST. Luego se añadieron 300 ul/pozo de proteína de fusión GFR 3/Fc 11 ug/ml (R & D Systems, RU) y la placa se incubó por 1 hora a temperatura ambiente para maximizar la unión. Posteriormente los pozos se vaciaron y se lavaron de nuevo 3 veces con PBST. Se recolectaron 300 ul del sobrenadante a partir de los cultivos de células transfectadas o transducidas y luego se añadieron a cada uno de los 4 pozos y se incubaron por al menos 3 horas con agitación suave a temperatura ambiente. Posteriormente los pozos se lavaron dos veces en PBST. Se añadieron 20 ul de regulador de pH no reductor para muestra (2% de SDS, Tris 0.4 M (pH=8.0) al primer pozo y la placa se agitó rápidamente por 5 minutos para eluir las proteínas unidas. El contenido se transfirió al siguiente pozo y el procedimiento se repitió para eluir las proteínas unidas en los pozos remanentes. Después de la adición de DTT a 10 mM, las muestras se calentaron a 96°C por 5 minutos y se analizaron mediante SDS PAGE en un gel de poliacrilamida al 15 % utilizando el sistema MultiPhorll de conformidad con las recomendaciones del fabricante (Amersham Pharmacia, Dinamarca). Las proteínas se sometieron a blot a las membranas de PVDF (BioRad, Dinamarca) que se ¡nmunotiñeron utilizando un anticuerpo policlonal anti-NBN de conejo (#378) como el anticuerpo detector. Las membranas se desarrollaron utilizando el sistema ECL+ (Amersham Pharmacia, Dinamarca) y se sometieron a exposición de la película.

Resultados El #378 es un anticuerpo policlonal de conejo generado en contra de un péptido derivado de NBN(ALRPPPGSRPVSQPC). Como se observa en la figura 5A una banda particular de un peso molecular entre 7.2 y 18.5 kDa se reconoce en las muestras reducidas (+DTT) que contienen NBN recombinante de rata purificado producido en E. coli que corresponde a los NBN113 monoméricos no glicosilados. Una banda del mismo PM además de diversas bandas adicionales se reconocen en las muestras reducidas a partir de las clonas estables CHO-NBN mediante transfección con NBN wt (prepro). Las identidades de numerosas de estas bandas han sido determinadas en estudios previos utilizando desglicosilación y secuenciación N-terminal. Una banda con un peso molecular ligeramente inferior representa una versión más pequeña y no glicosilada del NBN maduro (NBN104). Además una banda muy ancha con un PM aparente de aproximadamente 21 kDa representa versiones glicosiladas de NBN113 y NBN104. Las bandas de PM superiores representan pro-NBN (glicosiladas) observadas ocasionalmente en las muestras purificadas por afinidad de GFRa3. Como se observa en la figura 5B, la banda doble de PM entre 6.4 y 21.3 kDa que corresponde a NBN113 y NBN104 no glicosiladas se detecta en dos clonas estables de células CHO-NBN. La misma banda doble también se detecta en ARPE-19 transducidas o transfectadas con las construcciones de expresión IgSP-NBN. Además, una banda doble de PM cercano a 21 kDa que corresponde a los NBN113 y NBN104 glicosilados se observa en todas las muestras analizadas. Estos resultados indican que el procesamiento y la modificación postraduccional son similares cuando se expresa a partir de construcciones NBN y IgSP-NBN wt (prepro).

EJEMPLO 4 Secuencias de construcciones virales quimérica IgSP-NBN y predicción de péptido señal .

IgSP-NBN-secuencia nucleotídica presente en la construcción ATGAAATGCAGCTGGGTTATCTTCTTCCTGATGGCAGTGGTTACAGGTAA GGGGCTCCCAAGTCCCAAACTTGAGGGTCCATAAACTCTGTGACAGTGG CAATCACTTTGCCTTTCTTTCTACAGGGGTGAATTCGGCTGGGGGCCCGG GCAGCCGCGCTCGGGCAGCGGGGGCGCGGGGCTGCCGCCTGCGCTCG CAGCTGGTGCCGGTGCGCGCGCTCGGCCTGGGCCACCGCTCCGACGAG CTGGTGCGTTTCCGCTTCTGCAGCGGCTCCTGCCGCCGCGCGCGCTCTC CACACGACCTCAGCCTGGCCAGCCTACTGGGCGCCGGGGCCCTGCGAC CGCCCCCGGGCTCCCGGCCCGTCAGCCAGCCCTGCTGCCGACCCACGC GCTACGAAGCGGTCTCCTTCATGGACGTCAACAGCACCTGGAGAACCGT GGACCGCCTCTCCGCCACCGCCTGCGGCTGCCTGGGCTGA (SEQ ID NO 7) IgSP-NBN es una construcción de fusión con el péptido señal a partir de un gen de inmunoglobulina fusionado directamente a NBN maduro (113). El IgSP-NBN contiene un intrón Predicción Intrón-exón mediante NetGene (servidor CBSrDTU): -longitud: 473 lutdeñl?das 13 .4% *, i C, 32.2% <3, lß . S% _ , 0.01 _, S8 , 4 G+O s?üß donante de pra esnuníeiilo. metería iliießla M______ ,,_,_.*_____ ,_.-,^__. _.«.—-_._• jpos 5 " -*>3 ' ^ase cadena confían;). exén ítmó.. 47 2 0_ 00 ??'©í?®i?!'ai_i_*G5S»í--_l_G_ 243 0 + £?3A.C_%GC?GA TGC5S_?_C sifíos <kn?<!iiles <le ¡Xoees.tiNÍtíHTß, ciiifeiM vs-.?.etne??l0 sí « |rf#<ikcí<tn«« «F*- s.tl» clßctame por swif.)». <l«l M»I! ?1 J5 * ->3 * f.líie CAdeiut COEíf?.lItZ-l ¡5X01. Étlil?it 1 Secuencia nucleotídica de transcrito procesado: ATGAAATGCAGCTGGGTTATCTTCTTCCTGATGGCAGTGGTTACAGGGGT GAATTCGGCTGGGGGCCCGGGCAGCCGCGCTCGGGCAGCGGGGGCGC GGGGCTGCCGCCTGCGCTCGCAGCTGGTGCCGGTGCGCGCGCTCGGC CTGGGCCACCGCTCCGACGAGCTGGTGCGTTTCCGCTTCTGCAGCGGCT CCTGCCGCCGCGCGCGCTCTCCACACGACCTCAGCCTGGCCAGCCTACT GGGCGCCGGGGCCCTGCGACCGCCCCCGGGCTCCCGGCCCGTCAGCC AGCCCTGCTGCCGACCCACGCGCTACGAAGCGGTCTCCTTCATGGACGT CAACAGCACCTGGAGAACCGTGGACCGCCTCTCCGCCACCGCCTGCGG CTGCCTGGGCTGA (SEQ ID NO 8) Traducción de transcrito procesado: MKCSWVIFFLMAWTGVNSAGGPGSRARAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGH RSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRP TRYEAVSFMDVNSTWRTV DRLSATACGCLG (SEQ ID NO 9) La proteína de fusión traducida se pronostica que contenga un péptido señal de 19 aminoácidos, el cual se escinde a partir de la secuencia de NBN maduro (113) utilizando Signal P (disponible en el servidor CBS DTU en www.cbs.dtu.dk). (Identificación de péptidos procariónticos y eucariónticos y predicción de su sitio de escisión. H. Nielsen, J. Engelbrecht, S. Brunak, G. von Hejne, proteína Engineering 10,1-6, 1997.) Resultado SignalP-NN (véase figura 6A): Resultado SignalP-HMM (Véase la figura 6B): Predicción: péptido señal Probabilidad de péptido señal: 0.999 Probabilidad de señal de anclaje: 0.000 Probabilidad máxima de sitio de escisión: 0.660 entre las posición 19 y 20 Utilizando redes neurales (NN) y modelos ocultos de Markov (HMM) experimentados en eucariontes EJEMPLO S Predicción de las posiciones para los péptidos señal La predicción de sitio de escisión cuando Igsp se fusiona a un polipéptido de neublastina de diversas longitudes se muestra a continuación utilizando el programa signal P 2.0 anteriormente identificado.

IgSP: (19) MKCSWVIFFLMAWTGVNS Formas maduras de NBN: (113)AGGPGSR(106)AR(104)AA(102)GAR(99) GCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAG ALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFM- DVNSTWRTVDRLSATACGCLG EJEMPLO 6 Clonación de deltapro-NBN dentro de pHsCXW: Deltapro-NBN (SEQ. ID. NO: 82) se generó mediante la superposición PCR en los tres pasos de amplificación: 1) la secuencia líder relativamente larga de 117 pb (por ejemplo péptido señal de 39 aminoácidos ) de preproNBN con 5'BamHI/Kozak en exceso y 10 bases superpuestas hacia 3' al NBN maduro (143 pb); 2) NBN maduro con 10 bases hacia 5' de NBN secuencia líder superpuesta y Xhol 3' (362 bpb); 3) los productos de los pasos 1 y 2 se combinaron en una reacción de PCR final que generó ?pro-NBN (492 pb). La primera reacción de PCR (NBN líder): Iniciadores utilizados: BamHI+Kozak+hNBNsp, 5'- TATAGGATCCGCCACCATGGAACTTGGACTTGGAGG-3' hNBNsp3*-matNBN FLAP como, 5'- GGCCCCCAGCGGCCTCTGCGACGCTGCTCA-3' Plásmido pHsC.hNBN.W (véase el mapa del plásmido en la figura 7A) se utilizó como un molde para la reacción de PCR, la cual se realizó utilizando polimerasa Pfu-turbo. Condiciones de PCR: 94°C 3 minutos 94°C 30 segundos 55°C 30 segundos 35 ciclos 72°C 1 minuto 72°C 5 minutos La segunda reacción de PCR (maduro NBN): Iniciadores utilizados: hNBNsp3'FLAP-matNBN s, 5'-CGCAGAGGCCGCTGGGGGCCCGGGCAGC-3' NBNas+Xhol, 5'-TATACTCGAGCGAGCCCTCAGCCCAGGCA-3' Plásmido pHsC.hNBN.W (véase el mapa del plásmido en la figura 7A) se utilizó como molde para la reacción de PCR, la cual se realizó utilizando la polimerasa Pfu-turbo. Condiciones de PCR: 94°C 3 minutos 94°C 30 segundos 65°C 30 segundos 35 ciclos 72°C 1 minuto 72°C 5 minutos La tercera reacción de PCR (deltapro-NBN): Iniciadores utilizados: BamHI+Kozak+hNBNsp, d'-TATAGGATCCGCCACCATGGAACTTGGACTTGGAGG-S'NBNas+Xhol. d'-TATACTCGAGCGAGCCCTCAGCCCAGGCA-S' Los fragmentos de PCR a partir de dos primeras reacciones de PCR (NBN líder y NBN maduro ambos a una dilución de 1: 10 se utilizaron como molde para la tercera reacción de PCR, la cual se llevó a cabo utilizando polimerasa Pfu-turbo, y el mismo perfil de PCR como en el primer estudio de PCR. El fragmento de PCR a partir de la tercera reacción de PCR se cortó con BamHI y Xhol y se clonó entre los sitios BamHI y Xhol en pHsCXW (véase el mapa del plásmido en la figura 7B).

EJEMPLO 7 Transfección In vitro con las construcciones IgSP-NBN y con las construcciones deltaproNBN en diferentes líneas celulares Se comparó la secreción de NBN después de la transfección transitoria con diferentes construcciones de NBN, incluyendo NBN wt pre-pro, delta-pro NBN y IgSP-NBN. Las transfecciones transitorias se llevaron a cabo en células ARPE-19, HEK293, CHO y H¡B5.

Líneas celulares Las líneas ARPE-19 se cultivaron como se describe en el ejemplo 1. Las células HiB5 (Renfranz et al.1991), HEK293 y CHO se crecieron en DMEM (Invitrogen, Dinamarca) con 10% de suero bovino fetal (Invitrogen, Dinamarca), y medio las células CHO se suplementación adicionalmente con 20 mg/l de L-prolina. Las células ARPE-19, HEK293 y CHO se crecieron a 37°C y las células HiB5 a 33°C en 5% de CO2. Las células se pasaron aproximadamente dos veces a la semana mediante tripsinización y se sembraron nuevamente (relación de división 1 : 5).

Secreción de NBN después de la transfección transitoria Las células se sembraron en placas de 6 pozos (Corning Costar, Biotech Líne, Dinamarca) a una densidad de aproximadamente 105 células/pozo. Al siguiente día, las células se transfectaron con pHsC.hNBN.W, pHsC.IgSP.hNBN.W y pHsC.deltapro-hNBN.W, respectivamente. Las líneas celulares ARPE-19 se transfectaron en pozos por triplicado utilizando Fugene6 como se describe en el ejemplo 1 , mientras que las otras tres líneas celulares se transfectaron utilizando 2 ug del plásmido/pozo en pozos por triplicado utilizando Lipofectamine Plus (Invitrogen, Dinamarca) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Al siguiente día, se añadió medio fresco a los pozos, y las células se incubaron por 24 horas adicionales antes de recolectar el medio condicionado. Se aseguró una transfección eficiente adecuada mediante la evaluación de la expresión de EGFP en pozos transfectado en paralelo con pHsC.EGFP.W. la actividad de unión de NBN en medio condicionado se midió utilizando el ELISA RetL3, como se describe en el ejemplo 1. El ELISA RetL3 detecta la unión de un conjugado Ret-AP a un complejo de NBN unido al receptor GFRa3 específico de NBN. Los valores se calcularon como ng NBN/ml/24 horas y ngNBN/105 células/24 horas y se ajustaron para la liberación relativa de NBN con valores a partir de las células transfectadas con la construcción wt NBN establecida en 1. Los datos en las figuras 8A a 8C representan estos tres cálculos y se expresan como media ± SEM (n=3). En la Fig. 8A, *indica una diferencia significativa a partir de las células transfectadas con la construcción wt NBN (P < 0.05, ANOVA de un sentido, método LSD de Fisher) Resultados Como se muestra en el cuadro a continuación y en la figura 8A, las líneas celulares evaluadas en el cuadro muestran un incremento en la liberación de NBN cuando se utiliza la construcción deltapro-NBN, en comparación con la construcción wt NBN (9-17 veces mayor en cuanto a la liberación de NBN, dependiendo de la línea celular). Cuando se llevó a cabo transfección de las cuatro líneas celulares con la construcción pHsC.lgSP.hNBN, la secreción de NBN mejoró adicionalmente (28-91 veces mayor con respecto a la liberación de NBN en comparación con wt NBN). Se detectó actividad muy baja o no detectable de NBN en los sobrenadante celulares a partir de la línea celular ARPE-19 transitoriamente transfectada con la construcción de expresión EGFP (pHs.C.EGFP.W) que confirma la especificidad del ensayo.

La figura 8B muestra concentraciones de NBN en medio condicionado (24 horas) a partir de líneas celulares transitoriamente transfectadas. La concentración mayor (1240 ± 54 ng NBN/ml) se encontró en el medio condicionado a partir de las células HEK293 transfectadas con la construcción IgSP-NBN. La figura 8C muestra la liberación de NBN por 105 células por 24 horas. Las líneas celulares ARPE-19 transfectadas con IgSP-NBN muestran la liberación más elevada de NBN (133 ± 35ng/105 células/24 horas). Los presentes resultados indican que el uso de una construcción quimérica IgSP-NBN y de la construcción deltapro NBN con el objeto de incrementar la secreción de NBN maduro a partir de las células de mamífero es aplicable en diferentes tipos celulares.

EJEMPLO 8 Predicción utilizando SiqnalP3.0 Predicción de las posiciones para los péptidos señal utilizando la versión 3.0. Las predicciones se llevaron a cabo en deltapro NBNs y IgSP-NBNs de las siguientes secuencias. Moléculas NBN quiméricas con NBN-SP (deltapro NBNs): NBN-SP (SEQ ID NO: 24) MELGLGGLSTLSHCPWPRRQPALWPTLAALALLSSVAEA deltaproNBN140 (SEQ ID NO: 25) MELGLGGLSTLSHCPWPRRQPALWPTLAALALLSSVAEAPPP QPSRPAPPPPAPPSALPRGGRAARAGGPGSRARAAGARGCRLRSQLVPVR ALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVS QPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLG deltaproNBN113 (SEQ ID NO: 26) MELGLGGLSTLSHCPWPRRQPALWPTLAALALLSSVAEAAGGPGSRARAAG ARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLG AGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLG deltaproNB 106 (SEQ ID NO: 27) MELGLGGLSTLSHCPWPRRQPALWPTLAALALLSSVAEAARAAGARGCRLR SQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPP PGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLG deltaproNBN104 (SEQ ID NO: 28) MELGLGGLSTLSHCPWPRRQPALWPTLAALALLSSVAEAAAGARGCRLRSQ LVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPG SRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLG deltaproNBN102 (SEQ ID NO: 29) MELGLGGLSTLSHCPWPRRQPALWPTLAALALLSSVAEAGARGCRLRSQLV PVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSR PVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLG deltaproNBN99 (SEQ ID NO: 30) MELGLGGLSTLSHCPWPRRQPALWPTLAALALLSSVAEAGCRLRSQLVPVR ALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVS QPCCRPTRYEAVSFMDV- NSTWRTVDRLSATACGCLG Moléculas quiméricas NBN con IqSP (lqSP-NBNs): IgSP (SEQ XB TBOs 4) c3?i_afiíit?mpoay3??^^ IffCT-M?MXXa (SBQ ?D WO» 32) X -OT-tffiHS'S (SEQ SD NO: 36) NKSWV__PPI_-?VVTgWl^ Moléculas quiméricas NBN con albúmina de rata SP (AlbSP-NBNs): MbSP CBEQ IB MOi 37) 3flffll?TOE__J___iI_ra^ _&__¿.S£~-_lI!91-3 ÍS1Q: ID KO? 39) :__bSP-___S_Q6 Í_E_ ?D ISOí 40} AÜ^ RSgißLO- SÉQ. IB JKDí 41) ¡®gH¥_&&í^&^ gtH__L«S_ier_^ b.SF-_JB?3Í)2 CSBQ ÍD MO; 42} 3?±?SI?-E?BÍf_.9 CßEQ ID HO* 43} !Pa¡WI!EI3£_^ Moléculas quiméricas NBN con albúmina de rata SP modificada (ModAlbSP-NBNs'): Moaaitesi1 ÍSEQ m no? U) WBWV____j___?P__?SlA??A Hoa_l_£P-4!BN__3 {SBQ ID WQs 46} ¥o_Sa _P»__H10_ ÍSEQ ID BOs "4"?) 3_a^?^_:?_?__^ HP&g_S6_4_¥iI__^EF_S^ H aAl?sSP-?T5@9 (gSQ ID K<?. SO) lX_gL__I¿-Q_£!_I_-F^ Moléculas quiméricas NBN con hormona de crecimiento de humano SP (GHSP-NBNs): G_BB-_?K_140 (SEQ 10 WO: 52} GHSP-?BHlia {SEQ ID HOs 53 J __l_8HffiIH[&I^^ GHSE-UBHlOff (SEQ ?D HO; S_} _HSP-???Ü_l-4 SEQ SP W3? 55 G&CERi ¡?s?'J;ra^ GHSF-HEH O= (SEQ 335 HOí S6J G£CTRffl _E_^S ^ SHSP-MHHSS ÍSE_ I» MO. S?J 1¡S?-GSi*F5t.l_-lU^ B?R_EQD_SZA_I£bGMAI?IFe Q^^ Las predicciones del péptido señal se muestran a continuación en los cuadros: Predicciones del péptido señal para las proteínas con péptido señal NBN1 (deltapro) p Valores límite 0.48 0.43 0.32 0.5 1MELGLGGLSTLSHCPWRRRQPALWPTLAALALLSSVAEA 39 aminoácidos * Por debajo de los valores límite Predicciones del péptido señal para las proteínas con IgSP s Valores límite 0.48 0.43 0.32 0.5 2MKCSWVIFFLMAWTGVNS - 19 aminoácidos * Por debajo de los valores límite Predicciones del péptido señal para las proteínas con ModAlbSP Valores límite 0.48 0.43 0.32 0.5 3MKWVTFLLLLFISGSAFS- 18 aminoácidos * Por debajo de los valores límite Predicciones del péptido señal para las proteínas con AlbSP3 00 Valores límite 0.48 0.43 0.32 0.5 3MKWVTFLLLLFISGSAFS - 18 aminoácidos * Por debajo de los valores límite Predicciones del péptido señal para las proteínas con GHSP5 \D Valores límite 0.48 0.43 0.32 0.5 5MATGSRTSLLLAFGLLCLSWLQEGSA- 26 aminoácidos * Por debajo de los valores límite EJEMPLO 9 Optimización de la secuencia del gen de neublastina La secuencia del gen de la neublastina nativa de humano se examinó para uso de codón para optimizar la expresión de la neublastina de humano en células CHO. Los codones más frecuentemente utilizados en las células CHO se analizaron basándose en los datos actuales a 2002 utilizando un método conocido en la técnica (Nakamura et al., 1999, Nucleic Acids Res., 27(1): 292). El uso de codón para Crícetulus gríseus yace en lo presentado en el cuadro a continuación.

CUADRO Frecuencia de uso de codón en Cricetulus normalizado por 1,000 codones i .®\ wm ?s.3 ís&r) ocu 16. o tiyr) OWJ 2.7 ccys? war B.S (ti_w) OÜC 22.2 íSß_J ? ú 17.2 (_y j tttC 15,1 ÍC?$) 'GC 10.0 fte ) OIB 6.0 (Ser) ÜCft 19,2 í***. ___. ß-.B (***) usa. !_,$ hm) w& 14*_ (ser) üC<3 3.5 {***. v 0,5 íue l DGG 13.3 { _íl> COT 13.3 í*r_) CCU 17.5 {His} C¡UJ S.S {a ) CGU 5.7 (Leu) CüC ie„_ ' í_ro) CCC 1?,? tHiß) C_C 12.7 farff) CSC ff.S {Lel> OÍ& 7.5 {Pro) CCH 15,4 i_ltt> Cftfc 10,4 ttegí OSR. 7,0 (Leu) _0_ 3S.& _£r_) CCT 4.1 faiaj CAS 33,2 f&r } C T 10. fXla} &UB 17*5 í?fcr) ACU 14. S lüuaa) Mü 17.7 CSßr) ÜGU 11.5 tile) «JC 25.5 í_ r) &GC 21,2 í&a_. A_C 21,1 fSsr) £GC 15.5 file} ¿Cffi. 6.6 iT?i ) ACÁ.15,6 ftiyß) ASA.24.5 íí rgr) Aß? Í 5 (Ußt} AOS 2_.4 &CG 4.4 t_y«i JUU339.1 (arffl !ftGß _.$ (Val) GOTJ 11.3 .Ala.) GCÜ 22.5 {Agqp} GAU 23.3 íGly) GGÜ 13.2 (Val} G__ 16.0 (Ais..} GCC 26, S (Aap S&C 37, ß ÍG_y) GSC 22,1 <va > GV& ß.o .ais.) sc& s.7 isl ) QÜA 27.8 (ßiy) <_ is.s {V l} Gü¡320. & {Alai GCG 4.3 iGl í SAS 40.7 (ßly) GGG 13.5 La secuencia nucleotídica nativa de humano que codifica el fragmento de 104 aminoácidos C terminales (Roseblad et al., 2000, Mol. Cell Neurosci. 15 (2): 199; Baloh et al., Neuron 21: 1291) y la secuencia nucleotídica del gen sintético se alinean en en la figura 9 con los nucleótidos cambiados indicados. Las dos secuencias fueron 83.33% idénticas.

EJEMPLO 10 Clonación del gen de neublastina Un codón 100 (300 nucleótidos) hacia 3' que forma el gen de neublastina se sintetizó y clonó en un plásmido de expresión para facilitar la inserción de diversas secuencia de péptido señal asociadas con los codones 5' de neublastina. La forma de codón 100 del gen de neublastina se ensambló mediante la combinación de 40 pmol de oligonucleótidos KD3-464 hasta KD3-469 (cuadro 2) en 200 uL de regulador de pH (KCI 10 mM, (NH4)2SO4 10 mM, Tris-CI 20 mM, MgSO4 2 mM, 0.1% de TritonX-100, pH 8.8) que contenía la polimerasa Deep Vent (New England BioLabs, Beverly, MA). Los contenidos se calentaron a 95°C por 4 minutos y se sometieron a ciclo veinte veces como sigue: 95°C por 1 minuto, 60°C por 30 segundos, y 72°C por 1 minuto, seguido por una extensión a 72°C por cuatro minutos. Los extremos se prepararon mediante digestión secuencial con Salí y Nhel. El fragmento de 330 pares de bases, el cual incluyó una región no codificantede 30 pares de bases que flanquea el gen de neublastina, se purificó en gel y se ligó dentro de! plásmido pFRT/dhfr-1 (un derivado de pcDNA/FRT (Invitrogen, Carlsbad, CA) con el gen de higromicina reemplazado por gen de dihidrofolato reductasa) que ha sido purificada en gel y digerida con Nhel y Xhol. El plásmido resultante se nombró pNBN026-35. La secuencia de neublastina dentro de pNBN026-35 se presenta en la figura 10.

El cuadro a continuación identifica los oligonucleótidos utilizados en PCR y el ensamblaje de la secuencia sintética para generar el péptido señal de los genes de fusión de neublastina. Todas las secuencias se indican en la orientación 5' a 3".

CUADRO EJEMPLO 11 Construction de la fusión péptido señal-neublastina Fueron evaluadas las secuencias de que codifican cuatro diferentes péptidos señal. Estas incluyeron las secuencias señal para neublastina, albúmina de rata, y ia hormona de crecimiento de humano. Adicionalmente, una secuencia señal sintética resultó a partir de la mutación con cambios en ambos marcos durante la amplificación por PCR para generar el péptido señal de neublastina. Las fusiones se sintetizaron utilizando ya sea el ensamblaje del oligonucleótido o PCR. Los fragmentos de ADN se ligaron dentro de pNBN026. La secuencia relevante de ADN de cada una de las cuatro moléculas descritas se confirmó mediante análisis de secuencia de ADN. La secuencia señal sintética se sintetizó mediante amplificación por PCR utilizando los oligonucleótidos KD3-487, KD3479, KD3-480, KD3- 481, y KD3-482 (cuadro) y polimerasa puReTaq (Pharmacia, Peapack, NJ,).

Las condiciones de PCR incluyeron calentamiento de la reacción a 95°C por 4 minutos y luego la realización del ciclo veinte veces a 95°C por 1 minuto, 60°C por 30 segundos, 72°C por 1 minuto, seguido por una extensión a 72°C por cuatro minutos. Los extremos se prepararon mediante digestión con Pstl y Xhol. El fragmento de 330 pares de bases se purificó en gel y se ligó dentro del plásmido pNBN026 que también se purificó en gel y se digirió con Pstl y Xhol. El plásmido resultante se nombró pNBN030. Se presentaron dos mutaciones espontáneas en el marco que no fueron pronosticadas o codificadas por los oligonucleótidos las cuales se compensaron entre sí y se mantuvo a la proteína traducida en marco. Las secuencias de ADN y de proteína se muestran en la figura 11. La secuencia señal de neublastina se sintetizó mediante amplificación por PCR con los oligonucleótidos KD3-513 y KD3-514 (cuadro). La polimerasa utilizada fue puReTaq (Pharmacia, Peapack, NJ,). Las condiciones de PCR incluyeron calentamiento a 95°C por 4 minutos y realización en ciclo por tres veces a 95°C por 1 minuto, 60°C por 30 segundos, 72°C por 1 minuto, seguido por una extensión a 72°C por cuatro minutos. Los extremos se prepararon mediante digestión con Nhel y Xhol. El fragmento de 330 pares de bases se purificó en gel y se ligó dentro del plásmido pNBN030 que fue purificado en gel y digerido con Nhel y Xhol. El plásmido resultante se nombró pNBN038. Las secuencias de ADN y de proteína se muestran en la figura 12. La secuencia señal de albúmina se sintetizó mediante amplificación por PCR con los oligonucleótidos KD3-487, KD3-471 , y KD3-472 (cuadro). La polimerasa utilizada fue puReTaq (Pharmacia, Peapack, NJ). Las condiciones de PCR incluyeron calentamiento a 95°C por 4 minutos y formación en ciclo veinte veces a 95°C por 1 minuto, 60°C por 30 segundos, 72°C por 1 minuto, seguido por una extensión a 72°C por cuatro minutos. Los extremos se prepararon mediante digestión con Pstl y Xhol. El fragmento de 330 pares de bases se purificó mediante gel y se ligó dentro del plásmido pNBN026 que fue purificado en gel y digerido con Pstl y Xhol. El plásmido resultante se nombró pNBN029. Las secuencias de ADN y de proteína se muestran en la figura 13. La secuencia señal de hormona de crecimiento de humano se sintetizó mediante amplificación por PCR a partir del plásmido pV30 (un plásmido basado en pUC que contiene la copia genómica die extremo 5' del gen de la hormona de crecimiento de humano) con los oligonucleótidos KD3-487, KD3-477, y KD3-485 (cuadro 2). La polimerasa utilizada fue puReTaq (Pharmacia, Peapack, NJ,). Las condiciones de PCR incluyeron calentamiento a 95°C por 4 minutos y formación en un ciclo veinte veces a 95°C por 1 minuto, 60°C por 30 segundos, 72°C por 1 minuto, seguido por una extensión a 72°C por cuatro minutos Los extremos se prepararon mediante digestión con Pstl y Xhol. El fragmento de 330 pares de bases se purificó en gel y se ligó dentro del plásmido pNBN026 que fue purificado en gel y digerido con Pstl y Xhol. El plásmido resultante se nombró pNBN031. Las secuencias de ADN y de proteína se muestran en la figura 14.

EJEMPLO 12 Transfecciones de la célula CHO Las células CHO-DG44 se transformaron previamente con las secuencias de ADN que contenían el blanco para recombinación Flp (frt) (células A1). Esta línea celular hospedera A1 no contiene el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) y por lo tanto esta DHFR-menos. Cada uno de los plásmidos descritos codifica el gen DHFR, el gen de fusión de neublastina, más el inicio frt. El plásmido pOG44 codifica el gen de la recombinasa Flp. La cotransfección de estos plásmidos dentro de las células A1 resulta en la inserción de una copia particular de los genes de fusión de péptido señal-neublastina y DHFR dentro del cromosoma. Las células A1 fueron electroporadas con el plásmido de interés más el plásmido pOG44 bajo condiciones consistentes con aquella descritas por el fabricante (por ejemplo 0.4 mm cubeta, 280 volts, 950 microFaradios) (BioRad, Hercules, California). Las células transformadas que expresan DHFR se seleccionaron por su capacidad para crecer en medio mínimo esencial-alfa alfa -menos sin nucleótidos (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado con 10% de suero bovino fetal dializado (Hyclone, Logan, UT). Aproximadamente dos semanas después, las colonias se aislaron y se expandieron en recipientes más grandes en el mismo medio de selección. Los cultivos celulares fueron cambiados a medio libre de suero y se analizaron.

EJEMPLO 13 Análisis de las líneas celulares transfectadas Las líneas celulares candidato se seleccionaron por su capacidad para expresar neublastina. Las alícuotas de la suspensión de cultivos celulares se centrifugaron para separar las células a partir del medio condicionado. El medio condicionado se removió a partir del concentrado celular y tanto el medio como el concentrado celular se procesaron para electroforesis reductora y desnaturalizante en geles de poliacrilamida al 16% como se describe generalmente (Ausubel et al., anteriormente mencionado). Después de término de la electroforesis, las proteínas se sometieron a blot sobre una membrana PVDF y se ensayaron con antisuero policlonal de conejo generado en contra de neublastina. El complejo anticuerpo-neublastina se detectó mediante el uso de un antisuero policlonal anti-conejo de cabra conjugado con peroxidasas de rábano (BioRad, Hercules, California). La proteína expresada parte de los plásmidos que codifican los péptidos señal de la neublastina, sintética, albúmina, y hormona de crecimiento de humano cada uno expresó neublastina inmunorreactiva en la fracción de concentrado de células. No obstante, solamente los péptidos señal de la albúmina y de la hormona de crecimiento de humano, expresaron niveles detectable de neublastina en medio condicionado. La movilidad electroforética de todos los polipéptidos expresados de neublastinas fue consistente con una forma de neublastina de 11 kD, de 104-aminoácidos.

EJEMPLO 14 Secuencia de neublastina producida en células CHO La neublastina se purificó a partir de medio condicionado utilizando una columna de inmunoafinidad, generalmente como se describió (Ausubel et al., anteriormente mencionado). La secuencia amino terminal se determinó a partir de la proteína purificada de las líneas celulares que contenían los péptidos señal de la albúmina y de la hormona de crecimiento. La neublastina se aplicó sobre un filtro micro TFA (Applied Biosystems, Foster City, CA) y se sometió a degradación química automatizada de Edman. La secuenciación amino terminal se llevó a cabo el un secuenciador ABI Procise 494. Los aminoácidos PTH resultantes se separaron utilizando un sistema de microgradiente ABI 140C equipado con una columna PTH C18 de fase reversa y se analizó utilizando un detector de absorbancia ABI 7785A. Para ambas construcciones, la secuencia de proteína primaria empezó con el primer residuo del fragmento de 104-aminoácidos C terminales de neublastina de longitud total (por ejemplo alanina). La preparación de neublastina expresada con el péptido señal de la hormona de crecimiento también incluyó un fragmento C terminal de neublastina de 103 aminoácidos que carecía del residuo amino terminal de alanina. Los 103 aminoácidos a partir de la neublastina empezaron con una alanina. En ambos casos, el péptido señal funcionó como se anticipaba, por ejemplo, el polipéptido de neublastina se secretó a partir de la célula y el péptido señal se escindió por la célula.

EJEMPLO 15 Espectrometría de masas de neublastina recombinante La neublastina purificada a partir del medio condicionado de las líneas celulares que contenían las construcciones que codifica los péptidos señal de albúmina y de hormona de crecimiento se analizaron mediante espectrometría de masas intacta en un espectrómetro de masas ZMD (Waters, Milord, MA) como se describe generalmente por el fabricante. Para ambas construcciones, el pico principal de las muestras desglicosiladas corresponde a 104-aminoácidos del polipéptido de neubiastina (figuras 15A a 15B). Estos dos péptidos señal funcionaron como se anticipaba, por ejemplo, el polipéptido de neublastina se secretó a partir de la célula y el péptido señal se escindió por la célula. Adicionalmente, la neublastina glicosilada se secretó a partir de células transfectadas con las construcciones que codifican los péptidos señal de la neublastina y de la hormona de crecimiento contenida en diversas glicoformas.

EJEMPLO 16 Detección de la actividad de neublastina en medio partir de células CHO transfectadas con construcciones que codifican la neublastina y la secuencia señal heteróloga La actividad biológica se ensayó utilizando un ELISA de activación de receptor de cinasa (KIRA). El método se ha descrito previamente (Sadick et al., 1996, Anal. Biochem., 1996.235 (2): 207. Brevemente, las células NB41A3-mRL3, una línea celular de neuroblastoma adherente de murino la cual expresa Ret y GFRa3, se sembró a 2 x105 células por pozo en placas de 24 pozos en medio eagle modificado por Dulbecco (DMEM), suplementado con 10% de suero bovino fetal, y se cultivaron por 18 horas a 37°C y 5% de C02. Las células se lavaron con PBS, y se trataron con diluciones seriales de neublastina en 0.25 mL de DMEM por 10 minutos a 37°C y 5% de C02. Cada muestra se analizó por duplicado. Las células se lavaron con 1 mL de PBS, y se usaron por 1 hora a 4°C con 0.30 mL de Tris HCl 10 mM, pH 8.0, 0.5% de Nonidet P40, 0.2% de deoxi-coiato de sodio, NaF 50 mM, Na3V04 0.1 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM a la vez que las placas se agitaban suavemente. Los lisados se agitaron adicionalmente mediante pipeteo repetido y 0.25 mL de la muestra se transfirieron a una placa ELISA de 96 pozos que había sido revestida con 5 ug/mL de mAb anti-Ret (AA.GE7.3) (Upstate Biotechnology, Waltham, MA) en regulador de pH de carbonato 50 mM, pH 9.6 a 4°C por 18 horas y luego se bloqueó a temperatura ambiente por una hora con regulador de pH para bloqueo (Tris HCl 20 mM pH 7.5, NaCI 150 mM, 0.1% de Tween-20 (TBST) que contenía 1 % de suero normal de ratón y 3% de albúmina de suero de bovino). Después de 2 horas de incubación a temperatura ambiente, los pozos se lavaron 6 veces con TBST. La placa se lavó de nuevo antes de la adición de diclorhidrato de 3,3',5,5'-tetrametilbenc¡dina. Después de la producción de color por la reacción, los valores de absorbancia se leyeron a 450 nm a partir de los pozos tratados con lisado o solamente con regulador de pH para lisis, y la señal corregida con el nivel de fondo se gráfico como una función de la concentración del ligamento utilizado para la estimulación. Se evaluó una serie de diluciones de medio condicionado, y la neublastina funcional se detectó con un perfil similar a aquel previamente demostrado para el lote de neublastina expresada, purificada, y replegada a partir de E. coli (figura 16).

EJEMPLO 17 Neublastina madura expresada con un péptido señal heterólogo Los oligonucleótidos apropiados se pueden producir de conformidad con el método described en el ejemplo 9, para clonar una secuencia de ADN que codifica la neublastina madura (por ejemplo un fragmento 113 C terminal de neublastina de longitud total). Una secuencia de ADN que codifica el péptido señal a partir de albúmina de rata o de hormona de crecimiento de humano se puede fusionar a la secuencia de ADN que codifica un polipéptido maduro de neublastina, se describe en el ejemplo 10. La secuencia de ADN se puede transfectar dentro de una célula eucarionte, por ejemplo, una célula CHO, para producir una neublastina madura secretada. Todas las referencias citadas en la presente invención se incorporan en la presente invención como referencias en su totalidad. A tal grado que las publicaciones y patentes o solicitudes de patente que se incorporan como referencias contradicen la descripción contenida en la especificación, se pretende que la especificación reemplace y/o sea tomada como precedente sobre cualquier material contradictorio. Se puedan realizar muchas modificaciones y variaciones de esta invención sin apartarse de su espíritu y alcance, como será evidente a aquellos expertos en la técnica. Las modalidades específicas descritas en la presente invención se ofrecen a manera de ejemplo solamente no se pretende que sean limitantes en ningún sentido. Se pretende que la especificación y los ejemplos sean considerados solamente como ejemplares, con un alcance verdadero y espíritu de la invención siendo indicado en las reivindicaciones.

Secuencias SEQ ID NO TIPO DESCRIPCIÓN 1 P lgSP humano 2 P IgSP Mono 3 P IgSP Tití 4 P IgSP Ratón 5 P IgSP Cerdo 6 P IgSP Rata 7 N Secuencia de nucleótidos de IgSP-humano de ratón quimérica Construcción 113 NBN 8 N Transcripción dividida de SEQ ID No 7 9 P Proteína quimérica codificada por SEQ ID No 8 y 7) 10 P pre-pro Neublastina de humano 11 P pre-pro Neublastina de ratón 12 P pre-pro Neublastina de rata 13 P Neublastina de 116 aminoácidos (aa) madura de humano 14 P Neublastina de 113 aa madura de humano 15 P Neublastina de 119 aa madura de ratón 16 P Neublastina de 116 aa madura de ratón 17 P Neublastina de 116 aa madura de rata 18 P Neublastina de 113 aa madura de rata 19 P Neublastina de 104 aa N-truncada de humano 20 P Neublastina de 99 aa N-truncada de humano 21 P Neublastina de 140 aa N-truncada de humano 22 P Neublastina de 106 aa N-truncada de humano 23 P Neublastina de 102 aa N-truncada de humano 24 P NBN-SP de humano 25 P deltaproNBN140 26 P deltaproNBN113 27 P deltaproNBN106 28 P deltaproNB 104 29 P deltaproNBN102 30 P deltaproNBN99 31 P proteína 140NBN de IgSP-humano de ratón quimérica 32 P proteína 113NBN de IgSP-humano de ratón quimérica 33 P proteína 106NBN de IgSP-humano de ratón quimérica 34 P proteína 104NBN de IgSP-humano de ratón quimérica P proteína 102NBN de IgSP-humano de ratón quimérica 36 P proteína 99NBN de IgSP-humano de ratón quimérica 37 P Péptido señal de albúmina de rata 38 P proteína 140NBN de AlbSP -humano de rata quimérica 39 P proteína 113NBN de AlbSP -humano de rata quimérica 40 P proteína 106NBN de AlbSP -humano de rata quimérica 41 P proteína 104NBN de AlbSP -humano de rata quimérica 42 P proteína 102NBN de AlbSP -humano de rata quimérica 43 P proteína 99NBN de AlbSP -humano de rata quimérica 44 P péptido señal modificado de albúmina de rata 45 P proteína 140NBN de ModAlbSP -humano quimérica 46 P proteína 113NBN de ModAlbSP -humano quimérica 47 P proteína 106NBN de ModAlbSP -humano quimérica 48 P proteína 104NBN de ModAlbSP -humano quimérica 49 P proteína 102NBN de ModAlbSP -humano quimérica 50 P proteína 99NBN de ModAlbSP -humano quimérica 51 P Péptido señal de hormona de crecimiento humana 52 P proteína 140NBN de GHSP -humano quimérica 53 P proteína 113NBN de GHSP -humano quimérica 54 P proteína 106NBN de GHSP -humano quimérica 55 P proteína 104NBN de GHSP -humano quimérica 56 P proteína 102NBN de GHSP -humano quimérica 57 P proteína 99NBN de GHSP -human quimérica 58 N Secuencia nucleotídica 104NBN de humano 59 N Secuencia nucleotídica 104NBN sintética 60 N Secuencia de neublastina en el plásmido pNBN026-35 61 N SP quimérico sintético - secuencia nucleotídica 104NBN sintética 62 P SP quimérico sintético - proteína 104NBN sintética 63 N NBNSP quimérico - secuencia nucleotídica 104NBN sintética 64 P NBNSP quimérico - proteína 104NBN sintética 65 N AlbSP quimérico - secuencia nucleotídica 104NBN sintética 66 P AlbSP quimérico - proteína 104NBN sintética 67 N GHSP quimérico con intrón - secuencia nucleotídica 104NBN sintética 68 P GHSP quimérico - proteína 104NBN sintética 69 N ModAlbSP quimérico - secuencia nucleotídica 104NBN sintética 70 P ModAlbSP quimérico - proteína 104NBN sintética 71 N Iniciador KD3-464 72 N Iniciador KD3-465 73 N Iniciador KD3-466 74 N Iniciador KD3-467 75 N Iniciador KD3-468 76 N Iniciador KD3-469 77 N Iniciador KD3-471 78 N Iniciador KD3-472 79 N Iniciador KD3-477 80 N Iniciador KD3-479 81 N Iniciador KD3-480 82 N secuencia nucleotídica deltaproNBN113

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1.- Un método para producir un polipéptido de neublastina biológicamente activo, que comprende cultivar una célula que comprende un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que comprende una secuencia promotora operativamente asociada a una secuencia nucleotídica que codifica un péptido señal y un polipéptido de neublastina, en donde dicha secuencia nucleotídica no codifica una pro-región de neublastina. 2.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el péptido señal es un péptido señal heterólogo. 3.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el péptido señal es un péptido señal de mamífero. 4.- El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque el péptido señal es un péptido señal de humano, un péptido señal de rata, un péptido señal de ratón, un péptido señal de porcino, un péptido señal de simio, un péptido señal de canino, un péptido señal de felino, un péptido señal de bovino, o un péptido señal de equino. 5.- El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque el péptido señal se selecciona a partir del grupo que consiste de un péptido señal del factor de crecimiento, un péptido señal de hormona, un péptido señal de citocina y un péptido señal de inmunoglobulina. 6.- El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque el péptido señal se selecciona a partir del grupo que consiste de péptidos señal de TGFß, péptidos señal de GDF, péptidos señal de IGF, péptidos señal de BMP, péptidos señal de neurotrofina, péptido señal de PDGF y péptido señal de EGF. 7.- El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque el péptido señal se selecciona a partir de un péptido señal de hormona, dicha hormona siendo seleccionada a partir del grupo que consiste de hormona de crecimiento, insulina, ADH, LH, FSH, ACTH, MSH, TSH, T3, T4, y DHEA. 8.- El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque el péptido señal es un péptido señal de interleucina. 9.- El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque el péptido señal se selecciona a partir del grupo que consiste de péptido señal de neurturina, péptido señal de GDNF, péptido señal de persefina, y péptido señal de NGF. 10.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el péptido señal se selecciona a partir del grupo que consiste de péptido señal de albúmina, péptido señal modificado de albúmina, y péptido señal de hormona de crecimiento. 11.- El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque el péptido señal se selecciona a partir del grupo que consiste de péptido señal de albúmina de rata, péptido señal modificado de albúmina de rata, y péptido señal de hormona de crecimiento de humano, tales como péptido señal de albúmina de rata y péptido señal de hormona de crecimiento de humano. 12.- El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque el péptido señal es un péptido señal sintético, tal como un péptido señal que comprende SEQ ID NO: 70. 13.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el péptido señal es un péptido señal de inmunoglobulina. 14.- El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque el péptido señal se selecciona a partir del grupo que consiste de IgSP de ratón (SEQ ID NO 4), IgSP de rata (SEQ ID NO 6), IgSP de porcino (SEQ ID NO 5), IgSP de simio (SEQ ID NO 2 ó 3), IgSP de humano (SEQ ID NO 1). 15.- El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque el IgSP es IgSP de ratón (SEQ ID NO 4). 16.- El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque el IgSP es IgSP de humano (SEQ ID NO 1). 17.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el péptido señal es un péptido señal de Neublastin nativa. 18.- El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque el péptido señal es un péptido señal de Neublastina nativa de humano. 19.- El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque el polipéptido de neublastina se selecciona a partir del grupo que consiste de NBN madura seleccionada a partir de Neublastina que tiene una secuencia identificada como los aminoácidos 1-140 de SEQ ID No 10, o los aminoácidos 1-144 de SEQ ID No 11 ó 12, SEQ ID No 13, 14, 15, 16, 17 ó 18, N-terminalmente truncada NBN, NBN mutada, o NBN mutada y N-truncada. 20.- El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque el polipéptido de neublastina es una NBN madura seleccionada a partir del grupo que consiste de neublastina que tiene una secuencia de identidad de SEQ ID No 13, 14, 15, 16, 17, ó 18). 21.- El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque el polipéptido de neublastina es de 113NBN madura de humano (SEQ ID No 14). 22.- El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes 1-19, caracterizado además porque el polipéptido de neublastina se selecciona a partir del grupo que consiste de los 116 aminoácidos C-terminales de neublastina de humano, los 115 aminoácidos C-terminales de neublastina de humano, los 114 aminoácidos C-terminales de neublastina de humano, los 113 aminoácidos C-terminales de neublastina de humano, los 112 aminoácidos C-terminales de neublastina de humano, ios 111 aminoácidos C-terminales de neublastina de humano, los 110 aminoácidos C-terminales de neublastina de humano, los 109 aminoácidos C-terminales de neublastina de humano, los 108 aminoácidos C-terminales de neublastina de humano, los 107 aminoácidos C-terminales de neublastina de humano, los 106 aminoácidos C-terminales de neublastina de humano, los 105 aminoácidos C-terminales de neublastina de humano, los 104 aminoácidos C-terminales de humano, los 103 aminoácidos C-terminales de neublastina de humano, los 102 aminoácidos C-terminales de neublastina de humano, los 101 aminoácidos C-terminales de neublastina de humano, los 100 aminoácidos C-terminales de humano, y los 99 aminoácidos C-terminales de neublastina de humano. 23.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el polipéptido de neublastina se selecciona a partir del grupo que consiste de neublastina N-terminalmente truncada con los 106, 104, 10 ó 99 aminoácidos C-terminales de SEQ ID NO 10. 24.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el polipéptido de neublastina se selecciona a partir del grupo que consiste de los 116 aminoácidos C-terminales de neublastina de humano, los 113 aminoácidos C-terminales de neublastina de humano, los 104 aminoácidos C-terminales de neublastina de humano, y los 116 aminoácidos C-terminales de neublastin de humano. 25.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la Neublastina N-terminalmente truncada tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No 19. 26.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la Neublastina N-terminalmente truncada contiene los 99 aminoácidos de SEQ ID NO 20. 27.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el polipéptido de neublastina comprende una secuencia de aminoácidos derivada a partir de los aminoácidos 8-113 de SEQ ID No. 14, en donde el polipéptido variante de neublastina incluye una o más de las sustituciones de aminoácidos seleccionadas a partir del grupo que consiste de: un aminoácido diferente a la arginina en la posición 14 en la secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido variante, un aminoácido diferente a la arginina en la posición 39 en la secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido variante, un aminoácido diferente a la arginina en la posición 68 de dicho polipéptido variante, y un aminoácido diferente a la asparagina en la posición 95 de dicho polipéptido variante, en donde las posiciones de dichos aminoácidos están numeradas de conformidad con la secuencia polipeptídica de SEQ ID No. 14. 28.- El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque dicha sustitución en la posición 14, 39, ó 68 es lisina. 29.- El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque el vector es un plásmido. 30.- El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-28, caracterizado además porque el vector es un vector viral. 31.- El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque el vector es un vector de expresión de mamífero. 32.- El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque el vector es una partícula de lentivirus defectuoso en replicación. 33.- El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado además porque dicha partícula de vector se produce a partir de un vector lentiviral que comprende una LTR lentiviral 5', un sitio de unión a ARNt, una señal de empaquetamiento, un promotor operativamente unido a una señal polinulceotídica que codifica dicho péptido señal y dicho péptido de neublastina, un origen de síntesis de la segunda cadena de ADN y una LTR lentiviral 3'. 34.- El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque el vector se selecciona a partir del grupo que consiste de retrovirus, tales como HIV, SIV, FIV, EIAV, AAV, adenovirus, virus de herpes, y MoMLV. 35.- El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque el promotor se selecciona a partir del grupo que consiste de: promotor de ubiquitina, promotor de CMV, promotor de JeT, promotor de SV40, promotor de elongación del factor 1 alfa (EF1-alfa), beta actina de pollo, PGK, y MT-1. 36.- El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado además porque el promotor es un promotor inducible/represible, tales como: Tet-On, Tet-Off, promotor inducible por rapamicina, Mx1 , y RU486. 37.- El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado además porque la célula es una célula hospedera de mamífero. 38.- El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado además porque dicho mamífero se selecciona a partir del grupo que consiste de roedor, conejo, perro, gato, cerdo, mono, ser humano. 39.- El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado además porque dicha célula se selecciona a partir del grupo que consiste de CHO, HEK293, COS, PC12, HiB5, RN33b, células neuronales, células fetales, ARPE-19, células de fibroblasto inmortalizadas, C2C12, HeLa, HepG2, células epiteliales retínales pigmentarias (RPE), células estriatales, neuronas, astrocitos, interneuronas. 40.- El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado además porque la célula es una célula CHO. 41.- Un ácido nucleico que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un péptido señal y un polipéptido de neublastina, en donde dicha secuencia polinucleotídica no codifica una pro-región de neublastina, dicho péptido señal y dicho péptido de neublastina siendo como se define en cualesquiera de las reivindicaciones 1-40. 42.- El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 41 , caracterizado además porque comprende a) la secuencia nucleotídica de SEQ ID NO: 64, 66, ó 68, o b) una secuencia nucleotídica que codifica los polipéptidos de SEQ ID NO: 65, 67, ó 69. 43.- El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 41 ó 42, caracterizado además porque la secuencia nucleotídica ha sido optimizada para la expresión en un hospedero mamífero. 44.- Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico que se define en cualesquiera de las reivindicaciones 41-43. 45.- Una composición farmacéutica que comprende el vector que se define en la reivindicación 44 y uno o más de los adyuvantes, excipientes, vehículos y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables. 46.- Una célula hospedera aislada transducida o transfectada con el vector que se define en la reivindicación 44. 47.- La célula de conformidad con la reivindicación 46, caracterizada además porque la célula es una célula de mamífero. 48.- La célula de mamífero de conformidad con la reivindicación 47, caracterizada además porque la célula es capaz de secretar Neublastina o un equivalente funcional de la misma en cantidades en exceso de 500 ng/106 células/24 horas. 49.- La célula de mamífero de conformidad con la reivindicación 47, caracterizada además porque se selecciona a partir del grupo que consiste de CHO, HEK293 COS, PC12, HiB5, RN33b, células de fibroblasto inmortalizadas, C2C12, HeLa, HepG2, líneas celulares RPE, y líneas ARPE-19. 50.- La célula de mamífero de conformidad con la reivindicación 48, caracterizada además porque se selecciona a partir del grupo que consiste de CHO, HEK 293, COS, y ARPE-19. 51.- La célula de mamífero de conformidad con la reivindicación 47, caracterizada además porque se selecciona a partir del grupo que consiste de células RPE, células neuronales, células precursoras neuronales, células madre, y células fetales. 52.- La célula de mamífero de conformidad con la reivindicación 47, caracterizada además porque se une a una matriz de soporte. 53.- Una línea celular empaquetadora capaz de producir una partícula de vector infeccioso, dicha partícula de vector que comprende un genoma retroviralmente derivado que comprende una LTR retroviral 5', un sitio de unión a ARNt, una señal de empaquetamiento, un promotor operativamente unido a una secuencia polinucleotídica que codifica un péptido señal y un polipéptido de neublastina, en donde dicha secuencia nucleotídica no codifica una pro-región de neublastina y dicho péptido señal y péptido de neublastina siendo como se define en cualesquiera de las reivindicaciones 1-40, y un origen de síntesis de la segunda cadena de ADN, y una LTR retroviral 3'. 54.- La línea celular empaquetadora de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada además porque la partícula del vector es defectuosa en replicación. 55.- La línea celular empaquetadora de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada además porque el genoma es lentiviralmente derivado y las LTRs son lentivirales. 56.- Un mamífero transgénico no humano que comprende al menos una célula que se transduce o transfecta con el vector que se define en la reivindicación 44. 57.- El mamífero de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado además porque la al menos una célula transducida o transfectada comprende el genoma del mamífero. 58.- Un dispositivo implantable para cultivo celular, el dispositivo comprendiendo: i. una membrana semipermeable que permite la difusión de un factor de crecimiento a través de éste; y ii. al menos una célula hospedera aislada como la que se define en la reivindicación 46. 59.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado además porque la membrana semipermeable es inmunoaislante. 60.- El dispositivo dé conformidad con la reivindicación 58, caracterizado además porque la membrana semipermeable es microporosa. 61.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado además porque el dispositivo comprende adicionalmente una matriz dispuesta dentro de la membrana semipermeable. 62.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado además porque el dispositivo comprende adicionalmente un anclaje téter. 63.- El uso del vector que se reclama en la reivindicación 44 o el dispositivo de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 58 a 60 como un medicamento. 64.- El uso del vector que se reclama en la reivindicación 44, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno del sistema nervioso. 65.- El uso que se reclama en la reivindicación 64, en donde el trastorno del sistema nervioso se selecciona a partir del grupo que consiste de neuropatía periférica incluyendo dolor neuropático, lesión de médula espinal, avulsión de la raíz espinal, tic doloroso, y causalgia. 66.- El uso que se reclama en la reivindicación 63, en donde el medicamento es para el tratamiento de una enfermedad ocular, tales como heridas y úlceras corneales, y retinopatías. 67.- El uso del vector de la reivindicación 44, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno del SNC. 68.- El uso que se reclama en la reivindicación 67, en donde el trastorno del SNC es una enfermedad neurodegenerativa. 69.- El uso que se reclama en la reivindicación 64, en donde la enfermedad neurodegenerativa es neuropatía periférica incluyendo dolor neuropático. 70.- Un método para el tratamiento de una enfermedad del sistema nervioso, dicho método comprendiendo la administración a un individuo que necesita del mismo: i. una cantidad terapéuticamente efectiva del vector que se define en la reivindicación 44, o ii. una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica como la que se define en la reivindicación 45. 71.- El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado además porque el vector se administra intramuscularmente, subcutáneamente, o intraperitonealmente. 72.- El método de conformidad con ia reivindicación 70, caracterizado además porque el vector o composición se administra a un área del cuerpo implicada en la transmisión de la sensación de dolor. 73.- El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado además porque el vector o composición se administra intratecalmente o a la médula espinal. 74.- El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado además porque el vector se administra al cerebro, incluyendo el parénquima, y los ventrículos. 75.- El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado además porque el vector se administra en el ojo, incluyendo el vitreo, espacio subretinal, y cápsula sub-tenar. 76.- El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado además porque la enfermedad del sistema nervioso se selecciona a partir del grupo que consiste de neuropatía periférica incluyendo dolor neuropático, lesión de médula espinal, avulsión de la raíz espinal, tic doloroso, causalgia, heridas corneales, y retinopatías. 77.- Un método para el tratamiento de una enfermedad del sistema nervioso, dicho método comprendiendo el transplante a un individuo que necesita del mismo de una cantidad terapéuticamente efectiva de las células de la reivindicación 46. 78.- El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado además porque el transplante comprende un transplante autólogo, un transplante alogenéico o un transplante xenogenéico. 79.- El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado además porque dichas células se administran intratecalmente o a la médula espinal. 80.- El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado además porque las células se administran al cerebro, incluyendo el parénquima, y los ventrículos. 81- El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado además porque las células se administran en el ojo, incluyendo el vitreo, espacio subretinal, y cápsula sub-tenar. 82.- El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado además porque la enfermedad del sistema nervioso se selecciona a partir del grupo que consiste de neuropatía periférica incluyendo dolor neuropático, lesión de médula espinal, avulsión de la raíz espinal, tic doloroso, causalgia, heridas corneales, y retinopatías. 83.- Un método para el tratamiento de una enfermedad del sistema nervioso, dicho método comprendiendo el transplante a un individuo que necesita del mismo de un dispositivo implantable como el que se define en la reivindicación 58. 84.- El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado además porque el transplante comprende un transplante autólogo, un transplante alogenéico o un transplante xenogenéico. 85.- El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque dicho dispositivo se implanta intratecalmente o a la médula espinal. 86.- El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el dispositivo implantado se administra al cerebro, incluyendo el parénquima, y los ventrículos. 87.- El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque el dispositivo implantado se administra en el ojo, incluyendo el vitreo, espacio subretinal, y cápsula sub-tenar. 88.- El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado además porque la enfermedad del sistema nervioso se selecciona a partir del grupo que consiste de neuropatía periférica incluyendo dolor neuropático, lesión de médula espinal, avulsión de la raíz espinal, tic doloroso, causalgia, heridas corneales, y retinopatías. 89.- El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 72-80, para el tratamiento de dolor neuropático que comprende administrar a un individuo que necesita del mismo de una cantidad terapéuticamente efectiva de un vector como el que se define en la reivindicación 44, o una composición de células como la que se define en cualesquiera de las reivindicaciones 46-50, o un dispositivo celular como el que se define en 58. 90.- Un polipéptido de neublastina que comprende un péptido señal y un polipéptido de neublastina, en donde el polipéptido carece de una pro-región de neublastina. _ 91.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 90, caracterizado además porque el polipéptido de neublastina se fusiona al péptido señal. 92.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 91 , caracterizado además porque el péptido señal se asocia a través de su C-terminal al N-terminal del polipéptido de neublastina a través de un enlace peptídico. 93.- El polipéptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes 90-92, caracterizado además porque el péptido señal es un péptido señal heterólogo. 94.- El polipéptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes 90-93, caracterizado además porque el péptido señal es como el que se define en cualesquiera de las reivindicaciones 1-40. 95.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 94, caracterizado además porque el péptido señal se selecciona a partir del grupo de péptidos señal seleccionados a partir de péptido señal nativo de albúmina de rata, péptido señal modificado de albúmina de rata, y péptido señal de hormona de crecimiento de humano. 96.- El polipéptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes 90-94, caracterizado además porque el péptido señal es un péptido señal de Neublastina. 97.- El polipéptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes 90-94, caracterizado además porque el péptido señal es un IgSP.