INTRODUCCION: En los últimos años se ha perfeccionado la técnica quirúrgica de trasplante corneal, lo que permite pronosticar los resultados con mayor seguridad. Algunos de los casos más favorecidos por este tipo de técnica son: opacidades secundarias a traumatismos, queratocono, úlceras, queratitis intersticial, quemaduras térmicas o químicas poco intensas, degeneraciones corneales y leucomas rodeados por tejido corneal sano. Este procedimiento proporciona mejor calidad de vida para los pacientes. El objetivo primordial del almacenamiento corneal es el mantenimiento de la viabilidad endotelial desde la obtención del tejido donador hasta que es transplantado. Está demostrado que la probabilidad de supervivencia del injerto es proporcional al número de células endoteliales existentes en la cornea trasplantada. Para que un transplante sea exitoso, la función adecuada de cuando menos un 50% de las células endoteliales se considera indispensable. El endotelio normal del adulto posee normalmente 500,000 células que constituyen un mosaico regular de células hexagonales adyacentes. La celularidad endotelial depende de la edad del individuo, debido a la pérdida irrecuperable de células endoteliales que acontece a lo largo de la vida, y que ha sido estimada por Weekers en 8.3 células por año. Barahona y Marcos cuantifican la densidad celular media del endotelio corneal en individuos adultos entre 2,000 y 4,000 células/mm2. Teniendo en cuenta estos valores, resulta necesario proceder a un análisis de la córnea donante para determinar si posee la calidad suficiente para poder ser sometida a un procedimiento de conservación y posteriormente a un trasplante. La pérdida de células endoteliales en una córnea sometida a transplante depende de los siguientes factores: edad del donante, tiempo transcurrido entre la muerte del mismo y la cirugía, medio de conservación, tiempo de almacenamiento y técnica quirúrgica. Además de la habitual valoración de los antecedentes de patología ocular y sistemática del donante, así como la valoración biomicroscópica del globo ocular y técnica de microscopía especular para determinar la densidad celular media, incluso podría teñirse con azul de Trypan para observación de microscopio óptico según el medio de Sperling , con la finalidad de realizar una valoración del estado funcional de las células endoteliales. Las células endoteliales dañadas muestran un núcleo teñido con azul de Trypan, mientras que las células sanas carecen por completo de tinción nuclear. Se consideran criterios de exclusión para el uso de córneas para trasplante la existencia de una densidad endotelial central media inferior a 1,500 células/mm2 , así como la presencia de un porcentaje de células lesionadas superior al 20%. Un punto importante en los factores mencionados es la selección del medio de conservación. Por tal motivo el objetivo de este trabajo es valorar un medio de conservación nacional para preservar el tejido corneal dentro de las primeras 100 horas. El medio de preservación corneal es un líquido de cultivo enriquecido a baja temperatura
(+4°C), en el cual se debe introducir la córnea extraída del donante, con un margen escleral de Imm, en condiciones estériles. Es un medio de conservación a corto plazo ya que permite mantener el endotelio corneal viable por 100 horas, dada su irregenerabilidad es importante mantener nutridas las células para evitar edema y degeneración hasta antes de la implantación del injerto en el individuo receptor. Este medio de preservación corneal puede ser útil para preservar otros tejidos susceptibles de donación como son: tejido cardiaco, riñon, páncreas, injertos de piel, pulmón, hueso, etc. Se comparó la viabilidad endotelial de córneas de conejo, conservadas en tres medios diferentes durante 48, 72 y 96 horas valoradas mediante la tinción con azul de tripano, microscopía de luz y microscopía electrónica.
MATERIAL Y METODOS.
La preparación del medio de preservación corneal se llevó a cabo de la siguiente manera: Medio 199 se disuelven 14 gr./lt. con sales de Earle's, Bicarbonato de Sodio 220mg 100ml. N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic ácido (HEPES) (5mM) a pH 7.4, se le añade dextran de 70 KDA hasta alcanzar una concentración del 5%, gentamicina 0.02 % w/v ,. ácido L- aspártico (110 mM)., ácido ascórbico 7 mg./lt. La esterilización se realizó por filtración a través de filtros de 0.22 U.M. se prepararon pequeños volúmenes esterilizados en una jeringa de 50 ml..y se conectó a un filtro Swinnex de 47 mm de diámetro. El medio así tratado se distribuyó en viales de 20 mi, previamente esterilizados. A diferencia del Optisol, este último contiene condroitin sulfato 2.5 y dextran 1%. El medio 199 es un medio nutritivo compuesto por: sales inorgánicas, aminoácidos, vitaminas, azúcares y otras substancias. Dextran 70 KDA es un polímero de glucosa, ligeramente ácido que ejerce una alta presión oncótica similar a la de las proteínas plasmáticas y por lo tanto deshidrata el tejido corneal, manteniendo su transparencia. Adición de L- ácido aspártico a una concentración 110 Mm (millimolar ) que es un aminoácido clave del metabolismo intracelular , además de ser un neurotransmisor poderosísimo de todo el Sistema Nervioso Central. Ácido ascórbico que facilita la síntesis de colágena teniendo como base prolina y lisina que ya se encuentran en el medio 199, antioxidante que apoya al sistema redox-intracelular del endotelio (sistema que colabora en el mantenimiento de la barrera endotelial) y . evita la oxdación del gutation intracelular del endotelio, la cual rompe las uniones celulares apicales y expone la membrana de Descemet ocasionando edema severo de la córnea. Los antioxidantes actúan como radicales libres para eliminar sustancias tóxicas que pueden interferir con la función endotelial. Se observó que el almacenamiento de córneas en el medio de preservación corneal, por 100 horas preserva la misma cantidad del glutatioá en el endotelio y la función adecuada del mismo, por lo tanto este tiempo es suficiente para practicar los análisis requeridos, y trámites legales y de localización del receptor del tejido corneal donador para transplante. El antioxidante agregado en el medio de preservación corneal sustituye al antioxidante (más costoso) que contiene el Optisol, dando ventajas porque la producción del medio de preservación corneal es óptima para los requerimientos y es menos costosa, aproximadamente la tercera parte del costo del Optisol que actualmente se importa. Este medio de preservación corneal puede ser útil para preservar otros tejidos susceptibles de donación como son: tejido cardiaco, riñon, páncreas, injertos de piel, pulmón, hueso, etc.
Fueron analizadas 20 córneas divididas de la siguiente manera: ocho se conservaron en Oprtisol, 10 en el medio de preservación corneal y dos en solución salina balanceada, mantenidas a 4°C . En las córneas mantenidas en solución salina balanceada, se observó destrucción de células endoteliales a las 48 horas: Fig. 1 fotomicrografía que muestra corte sagital de córnea de conejo a las 48 horas de preservación en solución salina balanceada. Se observa destrucción severa del endotelio corneal con disminución del número de células e incremento del espacio intercelular y alteración de la forma de la célula. (Hematoxilina y eosina.100X ). Fig.2- A y Fig.2-B Fotomicrografías que muestran adecuada conservación del endotelio corneal a las 96 horas (flechas) de preservación, tanto en medio de preservación corneal, como en Optisol. (Hematoxilina y eosina. 100X). El estudio de microscopía electrónica de transmisión también confirmó que las células estructuralmente se encuentran preservadas hasta las 96 horas tanto en Optisol como en el medio de preservación corneal, en este último a las 105 horas inician cambios en los espacios entre cada célula y que en mayor tiempo se traducirán en aumento franco de los espacios intercelulares por pérdida de células endoteliales. Fig. 3 Electromicrografía de tejido preservado en solución salina balanceada a las 48 horas. Se observan cambios de muerte celular, tales como edema mitocondrial (cabeza de flecha), vacuolas citoplasmáticas y aumento de los espacios intercelulares (flecha). (X40,000 K). Fig. 4 Electromicrografía que muestra conservación de células endoteliales en el medio de preservación corneal, a las 96 horas. Se observa buena viabilidad celular, no hay edema de mitocondrias (cabeza de flecha) ni formación de vacuolas; membrana celular íntegra con preservación de los espacios intercelulares (flecha), conservación del complejo de Golgy y retículo endoplasmico rugoso. (X30,000K). Fig.5 Electromicrografía que muestra preservación de las células endoteliales en el medio de preservación corneal, a las 110 horas . Se observa la conservación de los complejos de unión intercelular sólo en algunos puntos por condensación incipiente del citoplasma de las células. (X 10,000 K).