MXPA05011741A - Composiciones y metodos que se relacionan con compuestos y objetivos novedosos de los mismos. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a compuestos quimicos novedosos, metodos para su descubrimiento y a su uso terapeutico. En particular, la presente invencion proporciona derivados de benzodiazepina y metodos para utilizar derivados de benzodiazepina como agentes terapeuticos para tratar un numero de condiciones asociadas con la regulacion defectuosa de los procesos de muerte celular programada, autoinmunidad, inflamacion e hiperproliferacion y similares.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS QUE SE RELACIONAN CON COMPUESTOS Y OBJETIVOS NOVEDOSOS DE LOS MISMOS REFERENCIA CRUZADA CON SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud PCT reclama la prioridad de las Solicitud de Patente Norteamericana Serie No. 10/427,212 presentada en Mayo 1, 2003, y también la Solicitud de Patente Norteamericana Serie No. 10/795,535 presentada en Marzo 8, 2004, la cual es una continuación en parte de la Solicitud de Patente Norteamericana Serie No. 10/634,114 presentada en Agosto 4, 2003, la cual es una continuación en parte de la Solicitud de Patente Norteamericana Serie No. 10/427,211 presentada en Mayo 1, 2003. Cada una de las solicitudes anteriormente mencionadas está incorporada específicamente en su totalidad a la presente descripción como referencia. Esta invención fue soportada en parte por las concesiones NIH GM46831 y AI47450. El gobierno de los Estados Unidos de América puede tener derechos sobre esta invención. Campo de la Invención La presente invención se refiere a compuestos químicos novedosos, métodos para su descubrimiento y su uso terapéutico. En particular, la presente invención proporciona derivados de benzodiazepina y compuestos relacionados y métodos para utilizar los derivados de benzodiazepina y los compuestos relacionados como agentes terapéuticos para tratar un número de padecimientos asociados con la regulación deficiente de los procesos de muerte celular programada, autoinmunidad, inflamación, hiperproliferación, y similares. Antecedentes de la Invención Los organismos multicelulares ejercen un control preciso sobre el número de células. Un equilibrio entre la proliferación celular y la muerte celular logra esta homeostasis. La muerte celular ocurre casi en cada tipo de células de vertebrados por medio de la necrosis o a través de una forma de suicidio o de muerte celular conocida como apoptosis. La apoptosis es detonada por una variedad de señales extracelulares e intracelulares que enganchan un mecanismo de muerte programado genéticamente común. Los organismos multicelulares usan apoptosis para dar instrucción a las células dañadas o innecesarias para destruirse ella misma para el bien del organismo. Por lo tanto, el control del proceso apoptótico es muy importante para el desarrollo normal, por ejemplo, el desarrollo fetal de los dedos y los dedos de las manos y los pies que requieren la remoción controlada, por medio de la apoptosis, y los tejidos de interconexión excesivos, como lo hace la formación de la sinapsis neural dentro del cerebro. De un modo similar, la apoptosis controlada es responsable de la caída del recubrimiento interior del útero (el endometrio) al inicio de la menstruación. Aunque la apoptosis juega un rol importante en la escultura del tejido y el mantenimiento de las células normales, también es una defensa principal contra las células e invasores (por ejemplo, virus) que amenazan el bienestar del organismo. De manera poco sorprendente, muchas enfermedades están asociadas con la desregulación de los procesos de la muerte celular. Los modelos experimentales han establecido una relación de causa y efecto entre la regulación apoptótica aberrante y la patogenicidad de diferentes enfermedades neoplásticas, autoinmunológicas y virales. Por ejemplo, en la respuesta inmunológica aportada por las células, las células efectuadoras (es decir, los linfocitos T citotóxicos "CTLs") destruyen la células infectadas por el virus induciendo a las células infectadas para pasar por la apoptosis. El organismo posteriormente depende del proceso apoptotico para destruir las células efectuadoras cuando ellas ya no son necesarias. La autoinmunidad generalmente es evitada mediante la apoptosis que induce la CTLs en cada otra y aún en ellas mismas. Los defectos de este proceso están asociados con una variedad de enfermedades autoinmunológicas, tales como el lupus eritomatoso y la artritis reumatoide. Los organismos multicelulares también utilizan la apoptosis para dar instrucciones a las células con ácidos nucleicos dañados (por ejemplo, ADN) para destruirse ellas mismas antes de convertirse en células cancerosas. Algunos de los virus que ocasionan el cáncer superan esta salvaguarda, volviendo a programar a las células infectadas (transformada) para abortar el proceso apoptótico normal. Por ejemplo, varios virus de papiloma humano (HPVs) han estado implicados en ocasionar el cáncer cervical suprimiendo la remoción apoptótica de las células transformadas y produciendo una proteína (E6) la cual desactiva el promotor de apoptosis p53. De un modo similar, el virus de Epstein-Barr (EBV), el agente causante de la mononucleosis y el linfoma de Burkitt, vuelven a programar las células infectadas para producir proteínas que previenen la remoción apoptótica normal de las células aberrantes, permitiendo de este modo que proliferen las células cancerosas, y que se difundan en todo el organismo. Todavía otros virus manipulan de manera destructiva una maquinaria apoptótica de las células sin dar como resultado directamente el desarrollo de un cáncer. Por ejemplo, la destrucción del sistema inmunológico en los individuos infectados con el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) se considera que progresa a través de las células CD4+T infectadas (aproximadamente 1 en 100,000) enviando instrucciones a las células hermanas no infectadas a pasar por la apoptosis. Algunos cánceres que se originan por medios que no son vírales, también han desarrollado mecanismos para escapar a la destrucción por medio de la apoptosis. Las células del melanoma, por ejemplo, evitan la apoptosis inhibiendo la expresión del gen que codifica el Apaf-1. Otras células cancerosas, especialmente las células cancerosas del pulmón y el colón secretan niveles altos de moléculas señuelo solubles, que inhiben el inicio de la disociación portada por la CTL de las células aberrantes. La regulación deficiente de la maquinaria apoptótica también ha estado implicada en diferentes condiciones degenerativas y enfermedades vasculares. Se puede apreciar que la regulación controlada del proceso apoptótico y su maquinaria celular son vitales para la sobrevivencia de los organismos multicelulares. Generalmente, los cambios bioquímicos que ocurren en una célula que recibe instrucciones para pasar por la apoptosis, ocurren en una procesión ordenada. Sin embargo, como se mostró anteriormente, la regulación desordenada de la apoptosis puede ocasionar serios efectos dañinos en el organismo. Han habido varios intentos para controlar y restaurar la regulación de la maquinaria apoptótica en las células aberrantes (por ejemplo, células cancerosas), por ejemplo, se ha hecho mucho trabajo para desarrollar agentes citotóxicos para destruir las células aberrantes antes de que proliferen. Como tales, los agentes citotóxicos tienen una utilidad ampliamente difundida, tanto en la salud de los humanos como en la de los animales y representan la primera línea de tratamiento para casi todas las formas de cáncer, y para las enfermedades autoinmunológicas hiperproliferativas tales como el lupus eritomatoso y la artritis reumatoide. Muchos agentes citotóxicos en el uso clínico ejercen su efecto dañando el ADN (por ejemplo, el ADN retícula la cis-diaminodicroplatanim (II), mientras que la bleomicina induce la disociación del hilo). El resultado de este daño nuclear, sí es reconocido por los factores similares como el sistema p53, es iniciar la cascada apoptótica que conduce a la muerte de las células dañadas. Sin embargo, los agentes quimioterapéuticos citotóxicos existentes tienen serias desventajas. Por ejemplo, muchos agentes citotóxicos conocidos muestran muy poca discriminación entre las células sanas y las células enfermas. Esta carencia de especificidad, con frecuencia da como resultado efectos laterales severos que pueden limitar la eficacia y/o el resultado en una mortalidad temprana. Además, la administración prolongada de muchos de los agentes citotóxicos existentes, da como resultado la expresión de genes de resistencia (por ejemplo, la familia bcl-2 o las proteínas de resistencia a fármacos múltiples (MDR) que se presentan en la dosificación adicional, ya sea menos efectiva o inútil. Algunos agentes citotóxicos inducen las mutaciones en las células p53 y las proteínas relacionadas. Basados en estas consideraciones, los fármacos citotóxicos ideales solamente deben de matar células enfermas y no ser susceptibles a la quimio-resistencia. Una estrategia para matar selectivamente células enfermas, es desarrollar fármacos que reconozcan selectivamente las moléculas expresadas en las células enfermas. Por lo tanto, los agentes quimioterapéuticos citotóxicos efectivos, reconocerían las moléculas indicadoras de enfermedad e inducirían (por ejemplo, ya sea directa o indirectamente) la muerte de las células enfermas. Aunque han sido identificados los marcadores en algunos tipos de células cancerosas y se han utilizado como blanco para los anticuerpos terapéuticos y moléculas pequeñas, los únicos rasgos para el diagnóstico y la explotación terapéutica, no son conocidos para la mayor parte de los tipos de cáncer. Además, para enfermedades como el lupus, no han sido identificados los objetivos moleculares específicos para el desarrollo de los fármacos. Lo que se necesitan son composiciones mejoradas y métodos para regular los procesos apoptóticos en sujetos que padecen de enfermedades y padecimientos caracterizados por la regulación deficiente de estos procesos (por ejemplo, infecciones vírales, enfermedades autoinmunológicas hiperproliferativas, condiciones inflamatorias crónicas, y cánceres). Sumario de la Invención La presente invención proporciona compuestos novedosos que encuentran uso en el tratamiento de un número de enfermedades y padecimientos, y encuentran uso en la investigación, la selección del compuesto y aplicaciones de diagnóstico. La presente invención también proporciona usos de estos compuestos novedosos, así como el uso de compuestos conocidos que promueven respuestas biológicas particulares (por ejemplo, compuestos que se enlazan a moléculas objetivo particulares y/u ocasionan eventos celulares particulares). Dichos compuestos y usos se describen en toda la presente solicitud y representan una colección diversa de composiciones y aplicaciones. A continuación se describirán ciertas aplicaciones y usos preferidos. La presente invención no está limitada a estas composiciones y usos particulares. La presente invención proporciona un número de composiciones útiles, tal y como se describen en la presente solicitud. Ciertas modalidades preferidas de la presente solicitud comprenden composiciones que incluyen una composición que consiste de la siguiente fórmula: en donde R-? es seleccionado de naftalalanina; fenol; 1 Naftalenol; 2-NaftalenoI; y quinolinas en donde R2 es seleccionado del grupo consistente de: y en donde R-i y R2 incluyen tanto las formas enantioméricas R como S y las mezclas racémicas. Otras modalidades preferidas de la presente invención comprenden composiciones que incluyen una composición que consiste de la siguiente fórmula: en donde Ri es seleccionado de H, alquilo, o alquilo substituido; donde R2 es seleccionado de hidrógeno, un hidroxi, un alcoxi, un halo, un amino, un alquilo inferior, un amino substituido, un acetilamino, un hidroxiamino, un grupo alifático que tiene de 1 a 8 átomos de carbono y de 1 a 20 átomos de hidrógeno, un grupo alifático substituido de tamaño similar, un grupo cicloalifático que consiste de < 10 átomos de carbono, un grupo cicloalifático substituido, un arilo, un heterocíclico; en donde R3 es seleccionado de H, alquilo o alquilo substituido, y en donde cuando mucho un substituyente es un subgrupo hidroxilo; I I dialquilo (todos regioisómeros); CH2(CH2)nCH3. y en donde n = 0-5; en donde Ri, R2.R3 y R incluyen tanto las formas enantioméricas R como S y las mezclas racémicas.

Todavía otras modalidades preferidas de la presente invención comprenden composiciones que incluyen una composición que consiste de la siguiente fórmula: en donde Ri es seleccionado a partir de H, alquilo, o alquilo substituido; en donde R2 es seleccionado de hidrógeno, un hidroxi, un alcoxi, un halo, un amino, un alquilo inferior, un amino substituido, un acetilamino, un hidroxiamino, un grupo alifático que tiene de 1 a 8 átomos de carbono y de 1 a 20 átomos de hidrógeno, un grupo alifático substituido de tamaño similar, un grupo cicloalifático que consiste de < 10 átomos de carbono, un grupo cicloalifático substituido, un arilo, un heterocíclico; en donde R3 es seleccionado de H, alquilo, ó alquilo substituido y en donde cuando mucho un substituyente es un subgrupo hidroxilo; en donde (todos regioisómeros); y en donde n= 0 a 5; y en donde R-i, R2, R3 y R4 incluyen ambas formas enantioméricas R ó S y las mezclas racémicas.

En otras modalidades preferidas, la presente invención proporciona una composición farmacéutica. En dichas modalidades, la presente invención proporciona un compuesto que se enlaza a una proteína que confiere sensibilidad a la oligomicina y un agente (por ejemplo, resveratrol, picetanol, estrógeno, lansoprazol). La presente invención también proporciona métodos y composiciones útiles para regular la muerte de las células. En modalidades preferidas la presente invención proporciona un sujeto y una composición que comprende una fórmula seleccionada del grupo consistente de: ?? ?? en donde R es seleccionado de hidrógeno, un hidroxi, un alcoxi, un halo, un amino, un amino substituido por un alquilo inferior, un acetiiamino, un hidroxiamino, un grupo alifático que tiene de 1 a 8 átomos de carbono y de 1 a 20 átomos de hidrógeno, un grupo alifático substituido de tamaño similar, un grupo cicloalifático que consiste de < 10 átomos de carbono, un grupo cicloalifático substituido, un arilo y un heterocíclico; y dicha composición es administrada al sujeto. Todavía en otras modalidades preferidas, la presente invención proporciona composiciones y métodos para regular la proliferación celular. En dichas modalidades, la presente invención proporciona un sujeto y una composición que comprende una fórmula seleccionada de: O ?? en donde R es seleccionado de hidrógeno, un hidroxi, un alcoxi, un halo, un amino, un amino substituido por un alquilo inferior, un acetilamino, un hidroxiamino, un grupo alifático que tiene de 1 a 8 átomos de carbono y de 1 a 20 átomos de hidrógeno, un grupo alifático substituido de tamaño similar, un grupo cicloalifático que consiste de < 10 átomos de carbono, un grupo cicloalifático substituido, un arilo, y un heterocíclico; y la composición es administrada al sujeto. La presente invención proporciona un número de métodos para influir en la muerte de las células, tejidos y organismos. Ciertas modalidades preferidas de la presente invención comprenden métodos para regular la muerte de las células. En dichas modalidades, la presente invención proporciona células objetivo que tienen mitocondria, y una composición que comprende la fórmula siguiente: en donde R-? comprende un grupo hidrofóbico aromático más grande que benceno; en donde R2 comprende un grupo fenólico hidroxilo y en donde Ri y R2 incluyen ambas formas enantioméricas R ó S y las mezclas racémicas. En modalidades adicionales, las células son expuestas a la composición bajo condiciones de modo que la composición se enlaza a la proteína que confiere la sensibilidad a la oligomicina como para aumentar los niveles de superóxido y alterar los niveles de ATP celular en dichas células. En otras modalidades, las células objetivo son células in vitro. En otras modalidades, las células objetivo son células in vivo. Y todavía en otras modalidades, las células objetivo son células ex vivo. Todavía en otras modalidades, las células objetivo son células cancerosas. En algunas modalidades, las células u objetivos son seleccionados del grupo consistente de células B, células T, y granulocitos. En otras modalidades utilizadas en la regülación de la muerte celular, la presente invención también proporciona las siguientes composiciones: ?? y en donde R1 y R2 incluyen ambas formas enantioméricas R ó S y las mezclas racémicas. En las modalidades preferidas en donde la presente invención regula la muerte celular, la exposición de la composición a las células objetivo da como resultado un aumento en la muerte celular de las células objetivo. La presente invención también proporciona métodos y composiciones para regular la proliferación celular. En dichas modalidades, la presente invención proporciona células objetivo que proliferan que tienen mitocondria, y una composición que comprende la fórmula siguiente: en donde Ri comprende un grupo hidrofóbico aromático más grande que benceno; en donde R2 comprende un grupo fenólico hidroxilo; en donde i y R2 incluyen ambas formas enantioméricas R ó S y las mezclas racémicas; y en donde las células son expuestas a la composición bajo condiciones de modo que la composición se enlaza al complejo de sintasa ATP mitocondrial como para aumentar los niveles de superóxido o alterar los niveles de ATP celular en las células. En las modalidades preferidas, la composición se enlaza a la proteína que confiere sensibilidad a la oligomicina. En algunas modalidades, las células objetivo son células ¡n vitro. En otras modalidades, las células objetivo son células in vivo. Todavía en otras modalidades, las células objetivo son células ex vivo. En otras modalidades, las células objetivo son células cancerosas. Todavía en otras modalidades, las células objetivo son seleccionadas del grupo consistente de células B, células T y granulocitos. Todavía en modalidades adicionales, las células objetivo son células que proliferan. En otras modalidades en donde la presente invención regula la proliferación celular, la presente invención proporciona la composición siguiente: en donde R-i es seleccionado de naftalalanina; fenol; Naftalenol; 2-Naftalenol; ?? Todavía otras modalidades preferidas de la presente invención comprenden composiciones que comprenden la siguiente fórmula (incluyendo los enantiomeros R y S y las mezclas racémicas): en donde R-i, R2, R3, y R son seleccionados del grupo consistente de: hidrógeno; CH3; una cadena alifática saturada o ¡nsaturada, recta o ramificada que tiene por io menos 2 átomos de carbono; una cadena alifática saturada o ¡nsaturada, recta o ramificada que comprende por lo menos 2 átomos de carbono, y que tiene por lo menos un subgrupo hidroxi; una cadena alifática saturada o ¡nsaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y que tiene por lo menos un subgrupo tiol; una cadena alifática saturada o ¡nsaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, en donde la cadena alifática termina con un subgrupo aldehido; una cadena alifática saturada o ¡nsaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y que tiene por lo menos un subgrupo cetona; una cadena alifática saturada o ¡nsaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono; en donde la cadena alifática termina con un subgrupo de ácido carboxílico; una cadena alifática saturada o ¡nsaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y que tiene por lo menos un subgrupo amida; una cadena alifática saturada o ¡nsaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y que tiene por lo menos un grupo acilo; una cadena alifática saturada o ¡nsaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos una porción que contiene nitrógeno (por ejemplo, nitro, nitrilo, etc.); una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo amina; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y que tiene por lo menos un subgrupo éter; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo halógeno; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo nitronio; en donde R5 es seleccionado del grupo consistente de: OH; N02; NR'; OR'; en donde R' es seleccionado del grupo consistente de: una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos un átomo de carbono; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo hidroxilo; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo tiol; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, en donde la cadena alifática termina en un subgrupo aldehido; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo cetona; una cadena alífática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono; en donde la cadena alifática termina con un subgrupo de ácido carboxílico; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo amida; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un grupo acilo; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos una porción que contiene nitrógeno (por ejemplo, nitro, nitrilo, etc.); una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono y tiene por lo menos un subgrupo amina; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y que tiene por lo menos un subgrupo halógeno; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo nitronio; en donde R6 es seleccionado del grupo consistente de: Hidrógeno; N02; CI; F; Br; I; SR'; y NR'2, en donde R' se define como se definió anteriormente para R5; en donde R7 es seleccionado del grupo consistente de: Hidrógeno; una cadena alifática saturada o ¡nsaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono; y en donde R8 es un grupo cíclico alifático mayor que benceno; en donde dicho grupo mayor que el benceno comprende cualquier grupo químico que contiene 7 o más átomos que no son de hidrógeno, y es un grupo arilo o alifático cíclico. En algunas modalidades, R' es cualquier grupo funcional que protege el oxígeno de R5 del metabolismo in vivo, hasta que el compuesto alcanza su objetivo biológico (por ejemplo, la mitocondria). En algunas modalidades, el grupo protector R' es metabolizado en el sitio objetivo, convirtiendo R5 en un grupo hidroxilo. Adicionalmente, en las modalidades preferidas R5 funciona en la interacción con la mitocondria celular (por ejemplo, en la ausencia de R5, el compuesto ha reducido la afinidad de enlace para un componente mitocondrial). En modalidades adicionales, de Ri a R4 funcionan para evitar el metabolismo no deseado de la composición, y en particular, un grupo hidroxilo en R5. Todavía en otras modalidades, de Ri a R4 funcionan para promover el metabolismo mitocondrial celular de la composición. En otras modalidades preferidas, la interacción de la composición con la mitocondria celular comprende el enlace del OSCP. Todavía en modalidades adicionales, el enlace del OSCP ocasiona un aumento en los niveles de superóxido. En otras modalidades preferidas, R5 funciona para regular la proliferación celular, y la regulación de la apoptosis celular. La presente invención también proporciona composiciones y métodos para el tratamiento de vasos comprometidos. Por ejemplo, la presente invención proporciona composiciones y métodos para tratar vasos cardíacos comprometidos. En modalidades preferidas, los vasos comprometidos son un vaso ocluido. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un método para el tratamiento de un vaso comprometido, comprendiendo el proporcionar medios de stent que eluyen el fármaco. En modalidades preferidas, los medios de stent que eluyen el fármaco comprenden una composición farmacéutica de la presente invención. En modalidades preferidas, la composición farmacéutica está recubierta en el medio de stent que eluye el fármaco. En modalidades adicionales, la composición farmacéutica comprende un agente y un excipiente farmacéuticamente aceptable. En modalidades preferidas, el agente comprende cualquiera de las estructuras aquí descritas. Dentro de las composiciones y métodos para el tratamiento de vasos comprometidos en un sujeto que sufre de un vaso comprometido, la presente invención comprende además el tratamiento de dicho sujeto con medios de stent que eluyen el fármaco y la aplicación de la composición farmacéutica en el vaso comprometido. En algunas modalidades, la aplicación de la composición farmacéutica en el vaso comprometido inhibe la restenosis. Todavía en modalidades adicionales, la aplicación de la composición farmacéutica inhibe la diferenciación de la célula del músculo liso, la migración y la proliferación. En otras modalidades, la composición farmacéutica comprende además un agente adhesivo. En algunas modalidades, el agente adhesivo es biodegradable. Todavía en modalidades adicionales, el agente adhesivo es un pegamento de fibrina. En ciertas modalidades, la presente invención proporciona además un método para identificar las composiciones terapéuticas. En algunas modalidades, el método proporciona una muestra que comprende la F-iF0-ATPasa mitocondrial y un inhibidor candidato de FiF0-ATPasa. En modalidades adicionales, la muestra se pone en contacto con el inhibidor. En modalidades adicionales, se mede el kcat/Km de dicha F^o-ATPasa mitocondrial, y las composiciones se enlazan predominantemente a un complejo de substrato FiF0-ATPasa, y no alteran la proporción de kcat/Km de la F^o-ATPasa mitocondrial al momento del enlace de la FiFo-ATPasa mitocondrial, siendo seleccionados como composiciones terapéuticas. En algunas modalidades preferidas, el método comprende además el paso de probar las composiciones seleccionadas en un animal para identificar la toxicidad baja y la capacidad para tratar un padecimiento autoinmunoíogico.

En otras modalidades preferidas, la muestra comprende además la mitocondria. En otras modalidades, la FiF0-ATPasa es una enzima pura. Todavía en modalidades adicionales, la FiF0-ATPasa está localizada en una partícula sub-mitocondrial. En modalidades preferidas adicionales, la proporción de kcat/Km es medida determinando el índice de hidrólisis o síntesis de ATP como una función de la concentración de ATP. Todavía en modalidades adicionales, la proporción de kcat/Km es calculada a partir de Km Vmax y km. En modalidades adicionales preferidas, las composiciones seleccionadas tienen una alta actividad inhibitoria en concentraciones altas del substrato, y una baja actividad en una concentración baja del substrato. En ciertas modalidades, la presente invención proporciona un método para el tratamiento de enfermedades autoinmunológicas. En dichas modalidades, se proporcionan un sujeto y una composición con capacidad para enlazarse a la F-iFo-ATPasa mitocondrial mientras que no se altera la proporción FiFo-ATPasa Kcat/Km, y la composición es administrada al sujeto. Breve Descripción de las Figuras La figura 1 muestra datos que demuestran que el componente OSCP es una proteína de enlace para Bz-423.

La figura 2 es una gráfica que muestra la isotermía de enlace de Bz-423 y la OSCP purificada humana. La figura 3 muestra la regulación del siARN del OSCP. La figura 4 muestra datos que ilustran los perfiles de expresión del gen de las células tratadas por los compuestos de la presente invención. Los datos de un análisis de expresión para los genes activados en la presencia de Bz-423 se presentan en la figura 4A. Los datos de un análisis de expresión para los genes inhibidos en la presencia de Bz-423 se presentan en la figura 4B. Los datos del análisis de expresión de los genes activados en la presencia de Bz-OMe se presenta en la figura 4C. Los datos del análisis de expresión de los genes inhibidos en la presencia de Bz-OMe se presentan en la figura 4D. DEFINICIONES Para facilitar el entendimiento de la presente invención, se definen a continuación un número de términos y frases. Como se usa en la presente invención, el término "benzodiazepina" se refiere a un anillo heterocíclico no aromático de siete miembros fusionado a un anillo fenilo en donde el anillo de siete miembros tiene dos átomos de nitrógeno como parte del anillo heterocíclico. En algunos aspectos, los dos átomos de nitrógeno se encuentran en las posiciones 1 y 4, como se muestran en la estructura general siguiente.

La benzodiazepina puede ser substituida por un grupo ceto (generalmente en la posición 2), o con dos grupos ceto, cada uno en las posiciones 2 y 5. Cuando la benzodiazepina tiene dos grupos ceto, cada uno en la posición 2 y en la posición 5, es la que nos referimos como una benzodiazepina-2,5-diona. Más generalmente, la benzodiazepina es substituida adicionalmente, ya sea en el anillo fenilo de seis miembros, o en el anillo heterocíclico de siete miembros o en ambos anillos por una variedad de substituyentes. Estos substituyentes se describen de una manera más completa en la presente descripción. El término "más grande que benceno" se refiere a cualquier grupo químico que contiene 7 o más átomos que no son de hidrógeno. Como se usa en la presente descripción, el término "alifático substituido" se refiere a un alcano que posee menos de 10 átomos de carbono, en donde por lo menos uno de los átomos alifáticos de hidrógeno ha sido reemplazado por un halógeno, un amino, un hidroxi, un nitro, un tio, una cetona, un aldehido, un éster, una amida, un alifático inferior, un alifático inferior substituido, o un anillo (arilo, arilo substituido, cicloalifático, o cicloalifático substituido, etc.). Los ejemplos de dicha substitución incluyen, pero no están limitados a, 1-cloroetiIo y similares. Como se usa en la presente descripción, el término "arilo substituido" se refiere a un anillo aromático o a un sistema de anillo aromático fusionado que consiste de no más de tres anillos fusionados y por lo menos uno de los cuales es aromático, y en donde por lo menos uno de los átomos de hidrógeno en un carbono del anillo ha sido reemplazado por un halógeno, un amino, un hidroxi, un nitro, un tio, una cetona, un aldehido, un éster, una amida, un alifático inferior, un alifático inferior substituido, o un anillo (arilo, arilo substituido, cicloalifático, o cicloalifático substituido). Los ejemplos de los mismos incluyen, pero no están limitados a, hidroxifenilo y similares. Como se usa en la presente descripción, el término "cicloalifático" se refiere a un cicloalcano que posee menos de 8 átomos de carbono o un sistema de anillo fusionado que consiste de no más de tres anillos cicloalifáticos fusionados. Los ejemplos de los mismos incluyen, pero no están limitados a, decalina y similares. Como se usa en la presente descripción, el término "cicloalifático substituido" se refiere a un cicloalcano que posee menos de 10 átomos de carbono o un sistema de anillo fusionado que consiste de no más de tres anillos fusionados, y en donde por lo menos uno de los átomos alifáticos de hidrógeno ha sido reemplazado por un halógeno, un nitro, un tio, un amino, un hidroxi, una cetona, un aldehido, un éster, una amida, un alifático inferior, un alifático inferior substituido, o un anillo (arilo, arilo substituido, cicloalifático, o cicloalifático substituido). Los ejemplos de los mismos incluyen, pero no están limitados a, 1 -clorodecalilo , biciclo-heptanos, octanos, y nonanos (por ejemplo, nonrbornilo) y similares. Como se usa en la presente descripción, el término "heterocíclico" se refiere a un cicloalcano y/o un sistema de anillo arilo, que posee menos de 8 átomos de carbono, o un sistema de anillo fusionado que consiste de no más de tres anillos fusionados, en donde por lo menos uno de los átomos de carbono del anillo es reemplazado por oxígeno, nitrógeno, o azufre. Los ejemplos de los mismos incluyen, pero no están limitados a, morfolino y similares. Como se usa en la presente descripción, el término "heterocíclico substituido" se refiere a un cicloalcano y/o un sistema de anillo arilo, que posee menos de 8 átomos de carbono, o un sistema de anillo fusionado que consiste de no más de tres anillos fusionados, en donde por lo menos uno de los átomos de carbono del anillo es reemplazado por oxígeno, nitrógeno o azufre, y en donde por lo menos uno de los átomos de hidrógeno alifático ha sido reemplazado por un halógeno, hidroxi, un tío, un nitro, un amino, una cetona, un aldehido, un éster, una amida, un alifático inferior, un alifático inferior substituido, o un anillo (arilo, arilo substituido, cicloalifático, o cicloalifático substituido). Los ejemplos de los mismos incluyen, pero no están limitados a 2-cloropiranilo. Como se usa en la presente descripción, el término "enlazador" se refiere a una cadena que contiene hasta, e incluye ocho átomos contiguos que conectan dos porciones estructurales diferentes en donde dichos átomos son, por ejemplo, átomos de carbono, nitrógeno, oxígeno o azufre. El etilénglicol es un ejemplo no limitativo. Como se usa en la presente descripción, el término "amino substituido por alquilo inferior" se refiere a cualquier unidad de alquilo que contiene hasta, e incluye ocho átomos de carbono, en donde uno de los átomos de hidrógeno alifático es reemplazado por un grupo amino. Los ejemplos de los mismos incluyen, pero no están limitados a, etilamino y similares. Como se usa en la presente descripción, el término "halógeno substituido por alquilo inferior" se refiere a cualquier cadena alquilo que contiene hasta, e incluye ocho átomos de carbono en donde uno de los átomos de hidrógeno alifático es reemplazado por un halógeno. Los ejemplos de los mismos incluyen, pero no están limitados a, cloroetilo y similares. Como se usa en la presente descripción, el término "acetilamino" debe de significar cualquier amino primario o secundario que es acetilado. Los ejemplos de los mismos incluyen, pero no están limitados a, acetamida y similares. El término "derivado" de un compuesto, como se usa en la presente descripción, se refiere a un compuesto modificado químicamente en donde la modificación' química tiene lugar, ya sea en un grupo funcional del compuesto o en el anillo aromático. Los ejemplos no limitativos de los derivados 1,4-benzodiazepina de la presente invención pueden incluir N-acetilo, N-metilo, N-hidroxi y cualquiera de los nitrógenos disponibles del compuesto. Los derivados adicionales pueden incluir aquellos que tienen un grupo trifluorometilo en el anillo fenilo. El término "stent" o "stent que eluye el fármaco", como se usa en la presente descripción, se refiere a cualquier dispositivo el cual cuando es colocado en contacto con un sitio en la pared de un lumen que va a ser tratado, también colocará fibrina en la pared del lumen y la retendrá en la pared del lumen. Estos pueden incluir dispositivos especialmente administrados percutáneamente para tratar las oclusiones de la arteria coronaria y para sellar las disecciones o aneurismas de los vasos esplénicos, carótidos, ilíacos y popliteales. El stent también puede tener elementos estructurales subyacentes poliméricos o metálicos sobre los cuales es aplicada la fibrina o el stent puede ser un compuesto de fibrina intermezclado con un polímero. Por ejemplo, un stent de alambre de metal deformable, tal y como se describe en la Patente Norteamericana No.: 4,886,062, incorporada a la presente descripción como referencia, podría ser recubierto con fibrina como se estableció anteriormente en una o más capas (por ejemplo, polimerización de la fibrina en la estructura de metal mediante la aplicación de una solución de fibrinogen y una solución de una proteína coaguladora de fibrinogen) o provisto con una preforma de fibrina adherida, tal como una película de fibrina que lo rodea. El stent y la fibrina podrían entonces ser colocados en un balón en un extremo distante de un catéter de balón y administrados mediante medios percutáneos convencionales (por ejemplo, como en el procedimiento de angioplastía) al sitio de la restricción o cierre que va a ser tratado, en donde entonces sería expandido en contacto con el lumen del cuerpo inflando el balón. El catéter puede ser retirado entonces, dejando el stent de fibrina de la presente invención en su lugar en el sitio del tratamiento. Por lo tanto, el stent puede proporcionar, tanto una estructura de soporte para el lumen en el sitio de tratamiento, como una estructura que soporta la colocación segura de la fibrina en la pared del lumen. Generalmente, un stent que eluye el fármaco permite una liberación activa de un fármaco particular en el sitio de implementación del stent. Como se usa en la presente descripción, el término "catéter" se refiere generalmente a un tubo utilizado para ganar acceso a una cavidad del cuerpo o vaso sanguíneo. Como se usa en la presente descripción, el término "válvula" o "vaso" se refiere a cualquier lumen dentro de un mamífero. Los ejemplos incluyen, pero no están limitados a, arterias, venas, vasos capilares y lumen biológico. Como se usa en la presente descripción, el término "restenosis" se refiere a cualquier válvula la cual es estrechada. Los ejemplos incluyen, pero no están limitados a, el nuevo cierre de una arteria coronaria o periférica después de un trauma a esa artería ocasionado por los esfuerzos para abrir la porción estenosada de la arteria, tal como por ejemplo, mediante la dilatación de un balón, ablación, aterectomía o tratamiento con láser de la arteria. Como se usa en la presente descripción, "angioplastía" o "terapia de balón" o "angioplastía de balón" o "angioplastía coronaria transluminal percutánea" se refiere a un método para tratar enfermedades de los vasos sanguíneos que comprende el uso de un catéter de balón para agrandar el vaso sanguíneo y por lo tanto, mejorar el flujo de sangre. Como se usa en la presente descripción, "cateterización cardíaca" o "angiograma coronario" se refiere a una prueba utilizada para diagnosticar la enfermedad de la arteria coronaria utilizando un procedimiento de cateterización. Dicho procedimiento puede comprender, por ejemplo, la inyección de un tinte de contraste en las arterias coronarias por medio del catéter, permitiendo la visualización de una arteria estrechada o bloqueada. Como se usa en la presente descripción, el término "sujeto" se refiere a organismos que van a ser tratados mediante los métodos de la presente invención. Dichos organismos de preferencia incluyen, pero no están limitados a, mamíferos (por ejemplo, múridos, simios, equinos, bovinos, porcinos, caninos, felinos, y similares), y más preferentemente incluye humanos. En el contexto de la presente invención, el término "sujeto" generalmente se refiere a un individuo que recibirá o el cual ha recibido tratamiento (por ejemplo, la administración de compuestos de benzodiazepina, y opcionalmente, uno o más de otros agentes) para un padecimiento caracterizado por la desregulación de los procesos apoptoticos. El término, "diagnosticado", como se usa en la presente descripción, se refiere al reconocimiento de una enfermedad por sus signos y síntomas (por ejemplo, resistencia a las terapias convencionales) o al análisis genético, análisis patológico, análisis histológico y similares. Como se usa en la presente descripción, el término "agente anticáncer", o "agente anticáncer convencional" se refiere a cualesquiera compuestos quimioterapéuticos, terapias de radiación e intervenciones quirúrgicas, utilizadas en el tratamiento del cáncer. Como se usa en la presente descripción, el término "in vítro" se refiere a un ambiente artificial y a los procesos o reacciones que ocurren dentro del ambiente artificial. Los ambientes in vitro incluyen, pero no están limitados a, tubos de prueba y cultivos celulares. El término "in vivo" se refiere al ambiente natural (por ejemplo, un animal o una célula) y a procesos o reacciones que ocurren dentro del ambiente natural. Como se usa en la presente descripción, el término "célula huésped" se refiere a cualquier célula eucariótica o procariótica (por ejemplo, células de mamíferos, células de aves, células de anfibios, células de plantas, células de peces y células de insectos), ya sea que estén localizadas in vitro o ¡n vivo. Como se usa en la presente descripción, el término "cultivo celular" se refiere a cualquier cultivo de células in vitro. Las líneas celulares continúas están Incluidas dentro de este término (por ejemplo, con un fenotipo inmortal), los cultivos de células primarias, líneas celulares finitas (por ejemplo, células no transformadas), y cualquier otro tipo de población celular mantenida in vitro, incluyendo oocitos y embriones. En las modalidades preferidas, las "células objetivo" de las composiciones y métodos de la presente invención incluyen, referirse a, pero sin limitarse a, células linfoides o células cancerosas. Las células linfoides incluyen células B, células T y granulocitos. Los granulocitos incluyen eosinófilos y macrófagos. En algunas modalidades, las células objetivo son células cultivadas continuamente o células sin cultivar obtenidas de las biopsias del paciente. El cáncer de las células incluye células de tumores, células neoplásticas, células malignas, células de metástasis, y células hiperplásticas. Las células neoplásticas pueden ser benignas o malignas. Las células neoplásticas son benignas si no invaden o forman metástasis. La célula maligna es una que tiene la posibilidad de invadir y/o formar metástasis. La hiperplasia es una acumulación patológica de células en un tejido u órgano, sin alteración importante en la estructura o función. En una modalidad específica, las células objetivo exhiben el crecimiento o proliferación patológica. Como se usa en la presente descripción, el término "que proliferan patológicamente o células que crecen" se refiere a una población localizada de células que proliferan en un animal, las cuales no son regidas por las limitaciones usuales de crecimiento normal.

Como se usa en la presente descripción,, el término "células objetivo no activadas" se refiere a una célula que está, ya sea en la fase G0, o una en la cual no ha sido aplicado el estímulo. Como se usa en la presente descripción, el término "célula linfoide objetivo activada" se refiere a una célula linfoide que ha sido preparada con un estímulo apropiado para ocasionar una cascada de transducción de señal, o alternativamente, una célula linfoide que no se encuentra en la fase G0. Las células linfoides activadas pueden proliferar, pasar por la activación de la muerte celular inducida, o producir una o más citotóxinas, citocinas, y otras características de las proteínas asociadas con la membrana del tipo de célula (por ejemplo, CD8+ ó CD4 + ). También tienen la capacidad de reconocer y enlazarse a cualquier célula objetivo que muestra un antígeno particular en su superficie, y liberar posteriormente sus moléculas efectuadoras. Como se usa en la presente descripción, el término "célula cancerosa activada" se refiere a una célula cancerosa que ha sido preparada con un estímulo apropiado para ocasionar una transducción de señal. Una célula cancerosa activada puede o no, encontrarse en la fase GG. Un agente de activación es un estímulo que al momento de la interacción con la célula objetivo, da como resultado una cascada de transducción de señal. Los ejemplos de los estímulos de activación incluyen, pero no están limitados a, moléculas pequeñas, energía radiante y moléculas que se enlazan a los receptores de la superficie celular de activación de la célula. Las respuestas inducidas por los estímulos de activación se pueden caracterizar por cambios en, entre otros, el Ca2+ intracelular, superóxido o niveles de radicales hidroxilo; la actividad de las enzimas como las cinasas o las fosfatasas; o la condición de energía de la célula. Para las células cancerosas, los agentes de activación también incluyen oncógenos de transformación. En un aspecto, el agente de activación es cualquier agente que se enlaza al receptor de activación de la superficie celular. Estos pueden ser seleccionados del grupo consistente de un ligando del receptor de célula T, factor de activación de célula B ("BAFF"), un TNF, un ligando Fas (FasL), un ligando CD40, un ligando inductor de proliferación ("APRIL"), una citocina, una quimiocina, una hormona, un aminoácido (por ejemplo, glutamato), un esteroide, un ligando receptor de la célula B, la irradiación gama, la irradiación UV, un agente o condición que mejora el esfuerzo celular, o un anticuerpo que reconoce específicamente y se enlaza a un receptor de activación de la superficie celular (por ejemplo, anti-CD4, ant¡-CD8, anti-CD20, anti-TACI, anti-BC A, receptor anti-TNF, anti-CD40, anti-CD3, anti-CD28, anti-B220, anti-CD38, CD19, y anti-CD21). El BCMA es el receptor del antígeno de maduración de la célula B y el TACI es el activador transmembrana y el interactor CAML. (Gross, A. et al. (2000); Laabi, Y. et al. (1992) y Madry, C. et al. (1998)). Los anticuerpos incluyen anticuerpos monoclonales o policlonales o una mezcla de los mismos. Los ejemplos de ligando de la célula T incluyen, pero no están limitados a, un péptido que se enlaza a una molécula MHC, un complejo HC péptido, o un anticuerpo que reconoce los componentes del receptor de la célula T. Los ejemplos de un ligando de la célula B incluyen, pero no están limitando a, una molécula o anticuerpo que se enlaza a, o reconoce los componentes del receptor de la célula B. Los ejemplos de los reactivos que se enlazan al receptor de activación de superficie celular incluyen, pero no están limitados a, ligandos naturales de estos receptores o anticuerpos originados contra ellos (por ejemplo, anti-CD20). RITUXIN (Genentech, Inc., San Francisco, CA) es un anticuerpo monoclonal quimérico anti-CD20 disponible comercialmente. Los ejemplos de los agentes o condiciones que mejoran el esfuerzo celular incluyen el calor, radiación, esfuerzo oxidativo o el retiro del factor de crecimiento y similares. Los ejemplos de los factores de crecimiento incluyen, pero no están limitados al suero, IL-2, factor de crecimiento derivado de plaquetas ("PDGF"), y similares. Como se usa en la presente descripción, el término "cantidad efectiva" se refiere a la cantidad de un compuesto (por ejemplo, benzodiazepina) suficiente para efectuar los resultados benéficos o deseados. Una cantidad efectiva puede ser administrada en una o más administraciones, aplicaciones o dosificaciones y no está limitada ni se pretende que esté limitada a una formulación particular o ruta de administración. Como se usa en la presente descripción, el término "desregulacion del proceso de muerte celular" se refiere a cualquier aberración en la capacidad de (por ejemplo, predisposición) una célula para pasar por la muerte celular, ya sea por cualquiera de la necrosis o la apoptósis. La desregulación de la muerte celular está asociada con o es inducida por una variedad de condiciones, incluyendo por ejemplo, enfermedades autoinmunológicas (por ejemplo, lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, enfermedad huésped contra injertos, myasthenia gravis, el síndrome de Sjógren, etc.), padecimientos inflamatorios crónicos (por ejemplo, psoriasis, asma y enfermedad de Crohn), enfermedades hiperproliferativas (por ejemplo, tumores, linfomas de células B, linfomas de células T, etc.), infecciones vírales (por ejemplo, herpes, papiloma, VIH) y otros padecimientos, tales como osteo-artritis y aterosclerosis. Deberá observarse que cuando una desregulación es inducida por o está asociada con una infección viral, la infección viral puede o no, ser detectable en el momento que ocurre o es observada la desregulación. Es decir, la desregulación inducida por las enfermedades vírales puede ocurrir aún después de la desaparición de los síntomas de infección viral. Una "enfermedad hiperproliferativa", como se usa en la presente descripción, se refiere a cualquier padecimiento en el cual una población localizada de células que proüferan en un animal no está regida por las limitaciones usuales del crecimiento normal. Los ejemplos de las enfermedades hiperproliferativas incluyen tumores, neoplasmas, linfomas y similares. Un neoplasma se dice que es benigno si no pasa por la invasión o metástasis y maligno si ocurre cualquiera de éstas. Las células metastáticas o de tejido significan que la célula puede invadir y destruir las estructuras corporales vecinas. La hiperplasia es una forma de proliferación celular que comprende un aumento en el número de células en un tejido u órgano, sin una alteración importante en la estructura o función. La metaplasia es una forma de crecimiento celular controlado en la cual un tipo de células diferenciadas completamente substituye otro tipo de células diferenciadas. La metaplasia puede ocurrir en las células del tejido conectivo o del epitelio. Una metaplasia típica comprende un epitelio metaplástico algo desordenado. El crecimiento patológico de las células linfoides activadas, con frecuencia da como resultado una enfermedad autoinmunologica o una condición inflamatoria crónica. Como se usa en la presente descripción, el término "enfermedad autoinmunologica" se refiere a cualquier padecimiento en el cual un organismo produce anticuerpos o células inmunes las cuales reconocen las propias moléculas del organismo, células o tejidos. Los ejemplos no limitativos de las enfermedades autoinmunológicas incluyen la anemia hemolítica autoinmune, la hepatitis autoinmune, la enfermedad de Berger, la nefropatía IgA, Psilosis Celíaca, síndrome de fatiga crónica, enfermedad de Crohn, dermatomiositis, fibromialgia, enfermedad de huésped contra los injertos, enfermedad de Grave, tiroiditis de Hashimoto, púrpura de trombocitopenia idiopática, liquen acuminado, esclerosis múltiple, miastenia grave, psoriasis, fiebre reumática, artritis reumática, esclerodermia, síndrome de Sjogren, lupus eritematoso sistémico, diabetes tipo 1, colitis ulcerativa , vitíligo y similares. Como se usa en la presente descripción, el término "padecimiento inflamatorio crónico" se refiere a una condición en donde son activadas las células inmunológicas del organismo. Dicha condición se caracteriza por una respuesta inflamatoria persistente con una secuela patológica. Esta condición se caracteriza por la infiltración de células mononucleares, la proliferación de fibroblastos y vasos sanguíneos pequeños, el tejido conectivo aumentado y la destrucción del tejido. Los ejemplos de la enfermedad inflamatoria crónica incluyen, pero no están limitados a, la enfermedad de Crohn, la psoriasis, la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, la enfermedad de intestino delgado inflamatorio, la esclerosis múltiple y el asma. Las enfermedades autoinmunológicas tales como la artritis reumatoide y el lupus erltematoso sistémico pueden dar como resultado también una condición Inflamatoria crónica. Como se usa en la presente descripción, el término "coadministración" se refiere a la administración de por lo menos dos agentes (por ejemplo, benzodiazepinas) o terapias a un sujeto. En algunas modalidades la co-administración de dos o más agentes/terapias es concurrente. En otras modalidades, un primer agente/terapia es administrado antes del segundo agente/terapia. Aquellos expertos en la técnica entienden que las formulaciones y/o rutas de administración de los diferentes agentes/terapias usados pueden variar. La dosificación apropiada para la co-administración puede ser determinada fácilmente por un experto en la técnica. En algunas modalidades, cuando los agentes/terapias son co-administrados, los agentes/terapias respectivos son administrados en dosis más bajas de lo apropiado para su administración sola. Por lo tanto, la co-administración es especialmente deseable en modalidades en donde la coadministración de los agentes/terapias disminuye la dosis de un agente conocido requerido potencialmente peligroso, (por ejemplo, tóxico). Como se usa en la presente descripción, el término "tóxico" se refiere a cualesquiera efectos peligrosos o dañinos en una célula o tejido comparados con la misma célula o tejido antes de la administración del tóxico. Como se usa en la presente descripción, el término "composición farmacéutica" se refiere a la combinación de un ingrediente activo con un vehículo, inerte o activo, haciendo la composición especialmente adecuada para el diagnóstico o el uso terapéutico in vivo, in vivo o ex vivo. Como se usa en la presente descripción, el término "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a cualquiera de los vehículos farmacéuticos estándar, tales como la solución salina regulada por fosfato, agua, emulsiones (por ejemplo, tales como emulsiones de aceite/agua o agua/aceite), y varios tipos de agentes de humedecimiento. Las composiciones también pueden incluir estabilizadores y conservadores. Para los ejemplos de vehículos, estabilizadores y adyuvantes. (Consultar la publicación de Martin, Ciencias Farmacéuticas de Remington, 15a Ed., Mack Publ. Co., Easton, PA

[1975]). Como se usa en la presente descripción, el término "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a cualquier sal farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, ácida o básica) de un compuesto de la presente invención la cual, al momento de la administración a un sujeto, tiene una capacidad de proporcionar un compuesto de esta invención o un metabolito activo o residuo del mismo. Como es conocido por aquellos expertos en la técnica, las "sales" de los compuestos de la presente invención pueden ser derivadas de ácidos y bases inorgánicos u orgánicos. Los ejemplos de los ácidos incluyen, pero no están limitados a, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, sulfúrico, nítrico, perclórico, fumárico, maleico, fosfórico, glicólico, láctico, salicílico, succínico, tolueno-p-sulfónico, tartárico, acético, cítrico, metanosulfónico, etanosulfónico, fórmico, benzoico, malónico, naftaIeno-2-sulfónico, ácido bencenosulfónico, y similares. Otros ácidos, tales como el ácido oxálico, aunque no son por ellos mismos farmacéuticamente aceptables, pueden ser empleados en la preparación de las sales útiles como intermediarios para obtener los compuestos de la presente invención y sus sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de las bases incluyen, pero no están limitados a, metales alcalinos (por ejemplo, sodio) hidróxidos, metales de tierra alcalina (por ejemplo, magnesio), hidróxidos, amoníaco y los compuestos de la fórmula NW , en donde W es alquilo C1-4, y similares. Los ejemplos de las sales incluyen, pero no están limitados a, acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, bencenosulfonato, bisulfato, butirato, citrato, canforato, canforsulfonato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, fumarato, flucoheptanoato, glicerofosfato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, clorhidrato, bromhidrato, yodohldrato, 2-hidroxietanosuifonato, lactato, maleato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, oxalato, palmoato, pectinato, persulfato, fenilpropionato, picrato, pivalato, propionato, succínato, tartrato, tiocianato, tosilato, undecanoato, y similares. Otros ejemplos de las sales incluyen aniones de los compuestos de la presente invención compuestos en un catión adecuado tal como Na+, NH4+, y NW4+ (en donde W es un grupo alquilo Ci-4), y similares. Para uso terapéutico, las sales de los compuestos de la presente invención están contempladas como que son farmacéuticamente aceptables. Sin embargo, las sales de ácidos y bases que no son farmacéuticamente aceptables también pueden encontrar uso, por ejemplo, en la preparación o purificación de un compuesto farmacéuticamente aceptable. Como se usa en la presente descripción, los términos "soportes de fase sólida" o "soportes sólidos", como se usan en su sentido más amplio para referirse a un número de soportes que están disponibles y que son conocidos para aquellos expertos en la técnica. Los soportes de fase sólida incluyen, pero no están limitados a, gels de sílice, resinas, películas plásticas derivadas, cuentas de vidrio, algodón, cuentas de plástico, gels de alúmina y similares. Como se usa en la presente descripción, los "soportes sólidos" también incluyen matrices que presentan el antígeno sintético, células, liposomas, y similares. Un soporte de fase sólida adecuado puede ser seleccionado en base al uso final deseado y la adaptabilidad para diferentes protocolos. Por ejemplo, los soportes de fase sólida de síntesis de péptidos, se pueden referir a resinas tales como poliestireno (por ejemplo, resina PAM obtenida de Bachem, Inc, Península Laboratories etc.) resina POLIHIPE) (obtenida en Aminotech, Canadá), resina de poliamida (obtenida en Península Laboratories) resina de poliestireno injertada con polietilénglicol (TENTAGEL, Rapp Polimere, Tubingen, Alemania) o resina de polidimetilacrilamida (obtenida en Milligen/Biosearch, California). Como se usa en la presente descripción, el término "patógeno" se refiere a un agente biológico que ocasiona una condición de enfermedad (por ejemplo, infección cáncer, etc.) en un huésped. Los "patógenos" incluyen pero no están limitados a virus, bacterias, archaea, hongos, protozoarios, micoplasma, priones y organismos parasíticos. El término "bacterias" y "bacteria" se refiere a todos los organismos procarióticos incluyendo aquellos que se encuentran dentro de toda la fila del Reino Procariote. Se pretende que el término comprenda todos los microorganismos considerados que son bacterias que incluyen Micoplasma, Chlamydia, Actinomyces, Streptomyces y Rickettsia. Todas las formas de las bacterias están incluidas dentro de esta definición, incluyendo cocos, bacilos, espiroquetas, esferoflastos, protoplastos, etc. También están incluidos dentro de este término los organismos procarióticos los cuales son gram positivos o gram negativos. "Gram negativo" y "gram positivo" se refieren a los patrones de tinción con el proceso de tinción-gram, los cuales son bien conocidos en la técnica, (ver por ejemplo, la publicación de Finegold y Martin, en Diagnostic Microbioligy, 6 a Ed., CV Mosby St. Louis, páginas 13 a 15

[1982]). Las "bacterias gram positivas" son bacterias que retienen el tinte primario utilizado en la tinción gram ocasionando que las células teñidas aparezcan de azul oscuro a morado bajo el microscopio. Las "bacterias gram negativas" no retienen el tinte primario utilizado en la tinción gram, pero son teñidos por el contratinte. Por lo tanto, las bacterias gram negativas aparecen en rojo. Como se usa en la presente descripción, el término "microorganismo" se refiere a cualquier especie o microorganismo, incluyendo pero sin limitarse a, bacterias, archaea, hongos, protozoarios, micoplasma y organismos parasíticos. La presente invención contempla que un número de microorganismos comprendidos en los mismos, también serán patogénicos para un sujeto. Como se usa en la presente descripción, el término "hongos" es utilizado con referencia a organismos eucarióticos, tales como mohos y levaduras, incluyendo los hongos dimórficos. Como se usa en la presente descripción, el término "virus" se refiere a agentes infecciosos instantáneos, los cuales con ciertas excepciones, no se observan con la luz del microscopio, carecen de metabolismo independiente y pueden duplicarse solamente dentro de una célula huésped viva. Las partículas individuales (por ejemplo, viriones) generalmente consisten de ácido nucleico y una concha o recubrimiento de proteína; algunos viriones también tienen una membrana que contiene un lípido. El término "virus" comprende todos los tipos de virus, incluyendo virus animales, de plantas, fagos y otros virus. El término "muestra" como se usa en la presente descripción es utilizado en su sentido más amplio. Una muestra que se sospecha que indica un padecimiento caracterizado por la desregulación en la función apoptotica puede comprender una célula, tejido o fluidos, cromosomas aislados de una célula, (por ejemplo, un cromosoma disperso de la metafase) el ADN genómico (en solución o enlazado a un soporte sólido, tal como para el análisis Southern blot), el ARN (en solución enlazado a un soporte sólido, tal como para el análisis Northern blot ), el cADN (en solución o enlazado a un soporte sólido) y similares. Una muestra que se sospecha que contiene una proteína puede comprender una célula, una porción de un tejido, un extracto que contiene una o más proteínas y similares. Como se usa en la presente descripción, los términos "purificado" o "purificar" se refieren a la remoción de los componentes no deseados de una muestra. Como se usa en la presente descripción, el término "substancialmente purificado" se refiere a moléculas que son por lo menos 60% libres preferentemente 75% libres y más preferentemente 90% libres, o más, libres de otros componentes con los cuales están asociadas generalmente. Como se usa en la presente descripción, el término "proteína de enlace del antígeno" se refiere a proteínas las cuales se enlazan a un antígeno específico. Las "proteínas de enlace del antígeno" incluyen pero no están limitadas a, inmunoglobulinas, incluyendo anticuerpos policlonales, monoclonales, quiméricos, de cadena sencilla y humanizados, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2 y librerías de expresión Fab. Varios procedimientos conocidos en la técnica son utilizados para la producción de anticuerpos policlonales. Para la producción del anticuerpo, varios animales huésped pueden ser inmunizados mediante la inyección con el péptido correspondiente al epítope deseado, incluyendo pero sin limitarse a conejos, ratones, ratas, ovejas, cabras. En una modalidad preferida, el péptido es conjugado a un portador inmunogénico (por ejemplo, toxoide de difteria, albúmina de suero bovino (BSA), o hemocianina de hormona de penetración magnética [KLH]). Se utilizan varios adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie huésped, incluyendo pero sin limitarse a, adyuvantes de Freund (completos e incompletos), gels minerales, tal como hidróxido de aluminio, substancias activas de la superficie, tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianinas de hormonas de penetración magnética, dinitrofenol, y los adyuvantes humanos potencialmente útiles, tales como BCG (Bacile Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Para la preparación de anticuerpos monoclonales, se puede utilizar cualquier técnica que proporcione la producción de las moléculas del anticuerpo mediante líneas celulares continuas en cultivo (ver por ejemplo, la publicación de Harlow y Lañe en Antibodies: "Un Manual de Laboratorio ("A Laboratory Manual",) Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor, NY). Estos incluyen, pero no están limitados a, la técnica de hibridoma originalmente desarrollada por (Kohler y Milstein; Kohler y ilstein, Nature, 256: páginas 495-497

[1975]), así como, la técnica de trioma, la técnica de hibrinoma de célula B humana (ver por ejemplo, la publicación de Kozbor et al., en Immunol. Today, 4 página 72

[1983]), y la técnica de hibridoma EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (ver la publicación de Colé et al., en Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc. páginas 77 a 96

[1985]). De acuerdo con la presente invención, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de cadena sencilla (Patente Norteamericana 4, 946,778; incorporada a la presente descripción como referencia) puede ser adaptada para producir anticuerpos de cadena sencilla específicos, según se desea. Una modalidad adicional de la presente invención utiliza técnicas conocidas en el arte para la construcción de librerías de expresión Fab (Huse et al., Science 246 páginas 1275 a 1281

[1989]) para permitir la identificación rápida y fácil de los fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada. Los fragmentos de anticuerpos que contienen el idiotipo (región de enlace al antígeno) de la molécula del anticuerpo pueden ser generados mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, dichos fragmentos incluyen pero no están limitados a: el fragmento F(ab')2 que puede ser producido mediante la digestión de pepsina de una molécula de anticuerpo; los fragmentos Fab' que pueden ser generados reduciendo los puentes de disulfuro de un fragmento F(ab') y los fragmentos Fab que puedan ser generados tratando una molécula de anticuerpo con papaina y un agente de reducción. Los genes que codifican las proteínas de enlace al antígeno pueden ser aisladas mediante métodos conocidos en la técnica. En la producción de anticuerpos, la selección del anticuerpo deseado se puede realizar mediante técnicas conocidas en el arte (por ejemplo, radioinmunoensayo, ensayo de ELISA (ensayo inmunoabsorbente enlazado a la enzima), inmunoensayos de "emparedado", inmunoensayos inmunoradiométricos, reacciones de precipitina de difusión de gel, ensayos de inmunodifusión, inmunoensayos In situ (utilizando por ejemplo, oro coloidal y marcadores de enzima o radioisótopo), Western Blots, reacciones de precipitación, ensayos de aglutinación (por ejemplo, ensayos de aglutinación de gel, ensayos de hemaglutinación, etc.), ensayos de fijación de complemento, ensayo de inmunofluorecencia, ensayos de proteína A y ensayos de inmunoelectroforesis, etc.). Como se usa en la presente descripción, el término "inmunoglobulina" o "anticuerpos" se refiere a proteínas que se enlazan a un antígeno específico. Las inmunoglobulinas incluyen pero no están limitadas a, policlonales, monoclonales, quiméricas y anticuerpos inmunizados, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2 y las inmunoglobulinas incluyen las siguientes clases: inmunoglobulinas IgG, IgA, IgM, lgD,lbE, e inmunoglobulinas secretadas (slg). Las inmunoglobulinas generalmente comprenden dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras. Sin embargo, el término "anticuerpo" y "inmunoglobulina" también comprende anticuerpos de cadena sencilla y anticuerpos de dos cadenas. El termino "epítope" como se usa en la presente descripción se refiere a esa porción del antígeno que se pone en contacto con una ¡nmunoglobiulina particular. Cuando una proteína o fragmento de una proteína es utilizado para inmunizar un animal huésped, numerosas regiones de la proteína pueden inducir la producción de anticuerpos, los cuales se enlazan específicamente a una región determinada o estructura tridimensional en la proteína; estas regiones o estructuras es a las que nos referimos como "determinantes antigénicos". Un determinante antigénico puede competir con un antígeno intacto (por ejemplo, el "inmunogén" Utilizado para promover la respuesta inmunoiógica), por el enlace a un anticuerpo. Los términos "enlace específico" o "que se enlaza específicamente" cuando son utilizados con referencia a la interacción de un anticuerpo y una proteína o péptidos significa que la interacción depende de la presencia de una estructura particular (por ejemplo, el determinante antigénico o epítope) de la proteína; en otras palabras, el anticuerpo está reconociendo y enlazándose a una estructura específica de proteínas, en vez de a las proteínas en general. Por ejemplo, si un anticuerpo es específico para el epítope "A ", la presencia de una proteína que contiene el epítope A (o libre, o sin marcar A) en una reacción que contiene el epítope "A" marcado y el anticuerpo reducirá la cantidad del epítope A marcado enlazada al anticuerpo. Como se usa en la presente descripción los términos "de enlace no específico" y "enlace al fondo" cuando se usan con referencia a la interacción de un anticuerpo y una proteína o péptido, se refieren a una interacción que no depende de la presencia de una estructura particular (por ejemplo, el anticuerpo se está enlazando a las proteínas en general, en vez de a una estructura particular, tal como un epítope). Como se usa en la presente descripción, el término "que modula " se refiere a la actividad de un compuesto (por ejemplo, compuesto de benzodiazepina) para afectar (por ejemplo, promover o retardar) un aspecto de la función celular, incluyendo pero sin limitarse a, crecimiento celular, proliferación, apoptosis y similar. Como se usa en la presente descripción el término "que compite por el enlace" como se usa haciendo referencia a una primera molécula (por ejemplo, un primer derivado de benzodiazepina) con una actividad que se enlaza al mismo substrato (por ejemplo, la proteína que confiere sensibilidad a la oligomicina en la sintasa ATP mitocondrial) y como lo hace una segunda molécula (por ejemplo, un segundo derivado de benzodiazepina u otra molécula que se enlaza a la proteína que confiere sensibilidad a la oligomicina en la sintasa ATP mitocondrial, etc.). La eficacia (es decir, la cinética y termodinámica) de enlace de la primera molécula puede ser la misma, o mayor o menor que la eficiencia del substrato que se enlaza a la segunda molécula. Por ejemplo, la constante de enlace de equilibrio (HD) para el enlace a un substrato puede ser diferente para las dos moléculas. Como se usa en la presente descripción la frase "instrucciones para la administración del compuesto a un sujeto", y los equivalentes gramaticales de la misma, incluyen instrucciones para utilizar las composiciones contenidas en un equipo para tratamiento de padecimientos caracterizados por ia desregulación de los procesos apoptóticos en una célula o tejido (por ejemplo, que proporcionan la dosis, rutas de administración, árboles de decisión para los médicos que efectúan el tratamiento para correlacionar las características específicas del paciente con los cursos de acción terapéutica). El término también se refiere específicamente a instrucciones para utilizar las composiciones contenidas en el equipo para tratar enfermedades autoinmunológicas (por ejemplo, lupus eritomatoso sistémico, artritis reumatoide, enfermedad del huésped contra el injerto, miastenia gravis, el síndrome de Sjogren, etc.), padecimientos inflamatorios crónicos (por ejemplo psoriasis, asma y enfermedad de Crohn, enfermedades hiperproliferativas (por ejemplo, tumores, linfomas de la célula B, linfomas de la célula T, etc.). infecciones virales (por ejempl.o el virus del herpes, virus del papiloma, VIH) y otros padecimientos, tales como osteo-artitris y aterosclerosis y similares. El término "compuestos de prueba" se refiere a cualquier entidad química, farmacéutica, fármaco y similar, que puede ser utilizado para tratar o prevenir un padecimiento, enfermedad o condición de la función corporal, o que altera de otro modo, la condición fisiológica o celular de una muestra (por ejemplo, el nivel de desregulación de apoptosis en una célula o tejido). Los compuestos de prueba contienen, tanto compuestos terapéuticos conocidos como potenciales. Se puede que un compuesto de prueba es terapéutico utilizando los métodos de selección de la presente invención. Un "compuesto terapéutico conocido" se refiere a un compuesto terapéutico que ha mostrado (por ejemplo, a través de ensayos con animales o en experiencias anteriores con la administración a humanos) que es efectivo en dicho tratamiento o prevención. En las modalidades preferidas, los "compuestos de prueba" son agentes que regulan la apoptosis en las células. Como se usa en la presente descripción, el término "tercera parte" se refiere a cualquier entidad comprometida en la venta, almacenamiento, distribución y oferta para venta de un compuesto de prueba contemplado para la administración, un compuesto para tratar padecimientos caracterizados por la desregulación de los procesos apoptóticos. Descripción General de la Invención Como una clase de fármacos, los compuestos de benzodiazepina han sido estudiados ampliamente y reportados como medicamentos efectivos para el tratamiento de un número de enfermedades. Ver por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 4,076823, 4,110,337, 4,495,101, 4,751,223, y 5,776,946, incorporada cada una en su totalidad a la presente descripción como referencia, reportan que ciertos compuestos de benzodiazepina, son efectivos como analgésicos y agentes antinflamatorios. De un modo similar, la Patente Norteamericana No. 5,324,726 y la Patente Norteamericana No. 5,597,915, incorporada cada una en su totalidad como referencia, reportan que ciertos compuestos de benzodiazepina son antagonistas de la colecistocinina y gastrina y por lo tanto, podrían ser útiles para tratar ciertas enfermedades gastrointestinales.

Otros compuestos de benzodiazepina han sido estudiados como inhibidores de la elastasa de neutrófilos humanos en el tratamiento de padecimientos portados por elastasa de neutrófilos humanos, tales como la isquemia al miocardio, síndrome de choque séptico, entre otros (ver por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,861,380 incorporada en su totalidad a la presente descripción como referencia). La Patente Norteamericana No. 5,041,438, incorporada en su totalidad a la presente descripción como referencia, reporta que ciertos compuestos de benzodiazepina son útiles como agentes anti-retrovirales. No obstante la atención que han conducido los compuestos de benzodiazepina, se podrá apreciar por la descripción siguiente, que la presente invención proporciona compuestos de benzodiazepina novedosos y compuestos relacionados y métodos para utilizar los compuestos novedosos, así como compuestos conocidos, para el tratamiento de una variedad de enfermedades. Es conocido que los compuestos de benzodiazepina se enlazan a los receptores de benzodiazepina en el sistema nervioso central (SNC), y por lo tanto, han sido utilizados para tratar varias enfermedades de SNC incluyendo la ansiedad y la epilepsia. Los receptores periféricos de benzodiazepina también han sido identificados, cuyos receptores pueden también estar presentes incidentalmente en el SNC. La presente invención demuestra que las benzodiazepinas y los compuestos relacionados tienen propiedades pro-apoptóticas y citotóxicas útiles en el tratamiento del crecimiento de células transformadas en el cultivo de tejidos. La ruta de acción de estos compuestos no es a través de los receptores de benzodiazepina anteriormente identificados. Los experimentos realizados durante el desarrollo de la presente invención han identificado objetivos biológicos novedosos de los compuestos de benzodiazepina y. compuestos relacionados (algunos de los cuales están relacionados con su capacidad para enlazarse a las moléculas celulares objetivo, en vez de a su homología con la estructura química general de los compuestos de benzodiazepina). En particular, la presente invención proporciona compuestos que interactúan, directa o indirectamente, con proteínas mitocondriales particulares para promover los efectos biológicos deseados. Por lo tanto, en algunas modalidades, la presente invención proporciona un número de compuestos novedosos y compuestos conocidos anteriormente dirigidos contra los objetivos celulares novedosos para lograr los resultados biológicos deseados. En otras modalidades, la presente invención proporciona métodos para utilizar dichos compuestos para regular los procesos biológicos. La presente invención también proporciona métodos de selección de fármacos para identificar y optimizar los compuestos. La presente invención proporciona además marcadores de diagnóstico para identificar enfermedades y padecimientos, para monitorear regímenes de tratamiento y/o para identificar cursos de acción terapéutica óptimos. Estas y otras utilidades de investigación y terapéutica, se describen más adelante. Descripción Detallada de la Invención La presente invención proporciona compuestos químicos novedosos, métodos para su descubrimiento, y su uso terapéutico. En particular, la presente invención proporciona derivados de benzodiazepina y compuestos relacionados y métodos para utilizar los derivados de benzodiazepina y compuestos relacionados como agentes terapéuticos para tratar un número de padecimientos asociados con la regulación deficiente de los procesos de la muerte celular programada, auto inmunidad, inflamación e hiperproliferación y similares. Las composiciones y métodos de ejemplo de la presente invención se describen con mayor detalle en las siguientes secciones: I. Reguladores de la Muerte Celular; II.

Reguladores de Crecimiento y Proliferación Celular; III.

Análisis de Expresión de las Células Tratadas; IV.

Compuestos de Ejemplo; V. Composiciones Farmacéuticas, Formulaciones y Rutas de Administración de Ejemplo y Consideraciones de Dosificación; VI. Selección de Fármacos; VII. Aplicaciones Terapéuticas; y VIII. Inhibidores de ATPasa y Métodos para identificar Inhibidores Terapéuticos. La practica de la presente invención emplea, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de química orgánica, farmacología, biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), biología celular, bioquímica e inmunología, los cuales se encuentra dentro de los conocimientos de los expertos en la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la literatura, tal como por ejemplo, en "Clonación Molecular: un manual de laboratorio" ("Molecular Cloning: A Laboratory Manual") segunda edición (Sambrook et al., 1989); "Síntesis de Oligonucleóticos" ("Oligonocleotide Syntesis") (M:J: Gait, ed., 1984; "Cultivo de Células de Animales" ("Animal Cell Culture") (R:l: Fresney, ed., 1987); la serie "Métodos de Enzimología" ("Methods in Enzymology") (Academic Press, Inc.); "Manual de Inmunología Experimental" ("Handbook of Experimental Immunology") (D.M.Weir & C.C. Blackwell, eds.); "Vectores de Transferencia de Genes para Células de Mamífero" ("Gene Transfer Vectors for Mammilian Cells") (J.M. Miller & M. P. Calos, eds., 1987); "Protocolos Actuales en Biología Molecular" ("Current Protocols in Molecular Biology") (F.M. Ausubel et al., eds, 1987, y actualizaciones periódicas); "PCR: la Reacción de la Cadena de Polimerasa" (Mullís et al., eds., 1994); "Protocolos Actuales en Inmunología" ("Current Protocols ¡n Immunology") (J. E. Coligan et al., eds., 1991), estando cada una de las cuales incorporada en su totalidad a la presente descripción como referencia. I. Reguladores de Muerte Celular En las modalidades preferidas, la presente invención regula la apoptósis a través de la exposición de las células a los compuestos. El efecto de los compuestos puede ser medido detectando cualquier número de cambios celulares. La muerte celular puede ser ensayada, tal y como aquí se describe y en la técnica. En las modalidades preferidas, las líneas celulares son mantenidas bajo condiciones de cultivo celular apropiadas (por ejemplo, gas (C02), temperatura y medios) por un período de tiempo apropiado para lograr la proliferación exponencial sin restricciones que dependen de la densidad. El número de células y/o la viabilidad son medidos utilizando técnicas estándar, tales como la hemo-citometría/exclusión de azul tripano, o el ensayo de conversión de tinte TT. Alternativamente, la célula puede ser analizada para la expresión de genes o productos de genes asociados con las aberraciones de la apoptósis o necrosis. En las modalidades preferidas, exponiendo los compuestos de la presente invención a las células se induce la apoptósis. En algunas modalidades, la presente invención ocasiona un aumento inicial en los niveles ROS celulares (por ejemplo, 02"). En modalidades adicionales, la exposición de los compuestos de la presente invención a una célula ocasiona un aumento en los niveles de 02" celular. Todavía en modalidades adicionales, el aumento en los niveles de 02" celular resultantes de los compuestos de la presente invención se puede detectar con un agente sensible al redox que reacciona específicamente con el 02' (por ejemplo, dihiroetedio (DHE)). En otras modalidades, el aumento de los niveles de Q2~ celular resultante de los compuestos de la presente invención disminuye después de un período de tiempo (por ejemplo, 10 minutos). En otras modalidades, el aumento de los niveles de 02" celular resultante de los compuestos de la presente invención disminuye después de un período de tiempo y aumenta nuevamente en un tiempo posterior (por ejemplo, 10 horas). En modalidades adicionales, los niveles aumentados de 02" celular resultantes de los compuestos de la presente invención disminuyen en 1 hora y aumentan nuevamente después de 4 horas. En las modalidades preferidas, un aumento temprano en los niveles de 02~ celular, seguido por una disminución en los niveles de 02" celular, seguido por otro aumento en los niveles de 02" celular, resultante de los compuestos de la presente invención, es debido a los diferentes procesos celulares (por ejemplo, mecanismos celulares bimodales). En algunas modalidades, la presente invención ocasiona el colapso del ??,? mitocondrial de las células. En las modalidades preferidas, un colapso del ??™ mitocondrial de la células resultante de la presente invención, se puede detectar con una sonda potenciométrica selectiva de la mitocondria (por ejemplo, DiOC6). En modalidades adicionales, el colapso de un ??,t, mitocondrial de la célula resultante de la presente invención, ocurre después de un aumento inicial en los niveles de 02" celular. En algunas modalidades, la presente invención hace posible la activación de caspasa. En otras modalidades la presente invención ocasiona la liberación del citocroma c de la mitocondria. En modalidades adicionales, la presente invención altera los niveles del citocroma c cistólico. Todavía en otras modalidades, los niveles alterados de citocroma c cistólico resultantes de la presente invención se pueden detectar con fracciones citosólicas de inmunotinción. En modalidades preferidas, los niveles disminuidos de citocroma c cistólico resultante de la presente invención se pueden detectar después de un período de tiempo (por ejemplo, 10 horas). En modalidades adicionales preferidas, los niveles disminuidos de citocroma c cistólico resultante de la presente invención, se pueden detectar después de 5 horas. En otras modalidades, la presente invención ocasiona la abertura del poro PT mitocondrial. En modalidades preferidas, la liberación celular del citocroma c resultante de la presente invención es consistente como un colapso del ??,t, mitocondrial. Todavía en otras modalidades preferidas, la presente invención ocasiona un aumento en los niveles de O2" celular después de un colapso del ??™ mitocondrial y una liberación del citocroma c. Todavía en modalidades preferidas, una elevación en los niveles de 02~ celular es ocasionado por un colapso del ??,t, mitocondrial y la liberación de citocromas c resultante de la presente invención. En otras modalidades, la presente invención ocasiona la activación de caspasa celular. En modalidades preferidas, la activación de caspasa resultanje de la presente invención se puede medir con un substrato fluorescente sensible a la pan-caspasa (por ejemplo, FAM-VAD-fmk). Todavía en modalidades particulares, la activación de caspasa resultante de la presente invención rastrea un colapso del ??„? mitocondrial. Todavía en otras modalidades, la presente invención ocasiona una aparición ADN hipodiploide. En modalidades preferidas, una aparición del ADN hipodiploide resultante de la presente invención es demorada ligeramente con respecto a la activación de caspasa. En algunas modalidades, el objetivo molecular para la presente invención es encontrado dentro de la mitocondria.

En modalidades adicionales, el objetivo molecular de la presente invención comprende la ATPasa mitocondrial. La primera fuente del ROS celular incluye enzimas redox y la cadena respiratoria mitocondrial (en lo sucesivo MRC). En modalidades preferidas, los inhibidores de oxidasa de citocroma c (complejo IV de RMC) (por ejemplo, NaN3) impiden que la presente invención dependa del aumento de los niveles de ROS celular. En otras modalidades preferidas, el componente de complejo III de reductasa de ubiquinol-citocroma c de los inhibidores de MRC (por ejemplo, FK506) impide que la presente invención sea dependiente de un aumento en los niveles de ROS. En algunas modalidades, un aumento en los niveles de ROS celular debido a los compuestos de la presente invención, es el resultado del enlace de los compuestos de la presente invención a un objetivo dentro de la mitocondria. En modalidades preferidas, los compuestos de la presente invención oxidan el diacetato de 2',T-diclorodihidrofluorescina para DCF (en lo sucesivo DCF). El DCF es una especie activa de redox que tiene la capacidad de generar ROS. En modalidades adicionales, el índice de producción de DCF resultante de la presente invención aumenta después de un período de tiempo. La antimicina A genera el 02" inhibiendo la reductasa de citocroma c-ubiquinol. En las modalidades preferidas, la presente invención aumenta el índice de producción de ROS de una manera equivalente a la antimicina A. En modalidades adicionales, la presente invención aumenta el índice de producción de ROS de una manera equivalente a la antimicina A, bajo condiciones aeróbicas que soportan la respiración de la condición 3. En modalidades adicionales, los compuestos de la presente invención no son enviados directamente al poro del MPT. En modalidades adicionales, los compuestos de la presente invención no generan un ROS substancial en la fracción S15 subcelular (por ejemplo, citosol; microsomas).

Todavía en modalidades adicionales, los compuestos de ia presente invención no estimulan el ROS si la mitocondria se encuentra en respiración de la condición 4. Los complejos del I al III de RC son fuentes principales del ROS dentro de la mitocondria. En las modalidades preferidas, la fuente primaria de un aumento en los niveles de ROS celular resultantes de los emanados dependientes de la presente invención de estos complejos como resultado de la inhibición de la FiFo-ATPasa mitocondrial. Indudablemente, todavía en modalidades adicionales, la presente invención inhibe la actividad de la ATPasa mitocondrial de partículas sub-mitocondriales bovinas (en lo sucesivo SMPs). En modalidades particularmente preferidas, los compuestos de la presente invención se enlazan al componente OSCP de la F-|Fo-ATPasa mitocondrial. En algunas modalidades, los compuestos de la presente invención tienen la estructura: o su enantiómero; en donde, es alifático o arilo; R2 es alifático, arilo, -NH2, -HC(=0)-R5, o una porción que participa en la formación del enlace de hidrógeno, en donde R5 es arilo, heterocíclico, -R6-NH-C( = 0)-R7 ó -R6-C(=0)-NH-R7, en donde R6 es un enlazador alifático de 1 a 6 átomos de carbono y R7 es alifático, arilo, o heterocíclico; y cada uno de R3 y R4 son independientemente hidrógeno, hidroxi, alcoxi, halo, amino, amino substituido por alquilo inferior, acilamino, hidroxiamino, un grupo alifático que tiene de 1 a 8 átomos de carbono y de 1 a 20 átomos de hidrógeno, arilo o heteroarilo; o una sal, profármaco o derivado farmacéuticamente aceptable del mismo. En algunas modalidades preferidas, en donde R3 es un grupo hidroxilo, una o más posiciones adicionales del anillo que contiene R3 incluyen un grupo químico (por ejemplo, una cadena alquilo) que protege el grupo hidroxilo del metabolismo in vivo. En ciertas modalidades, los compuestos de la presente invención pueden tener un grupo hidroxilo en la posición C'4 y un anillo aromático. En las modalidades preferidas, los compuestos de la presente invención ocasionan un aumento en los niveles de ROS celular como resultado de un grupo hidroxilo en la posición C'4 y un anillo aromático. En modalidades adicionales, la potencia de la presente invención en los ensayos basados en las células se correlaciona con los experimentos de inhibición de ATPasa utilizando SMPs. Indudablemente, en las modalidades preferidas, la presente invención inhibe de manera importante la actividad de la ATPasa mitocondrial en comparación con las concentraciones citotóxicas (80 µ?) de las benzodiazepinas generales, y los ligandos PBR (por ejemplo, PK11195 y 4-clorodiazepam) que no inhiben de manera importante la actividad de la ATPasa mitocondrial. Como tales, en las modalidades preferidas, el objetivo molecular de la presente invención es la ATPasa mitocondrial. La oligomicina es un producto macrólido natural que se enlaza a la FiF0-ATPasa mitocondrial, que induce una condición de transición de 3 a 4, y como resultado, genera el ROS (por ejemplo, 02"). En las modalidades preferidas, la presente invención se enlaza al componente OSCP de la F-|F0-ATPasa mitocondrial. En ciertas modalidades, los ensayos de selección de la presente Invención permiten la detección de los asociados de enlace del OSCP. El OSCP es una proteína intrínsecamente fluorescente. En ciertas modalidades, la trituración de una solución de compuestos de prueba de la presente invención en una muestra de E. Coli sobre-expresada con OSCP da como resultado la extinción de la fluorescencia intrínseca de la OSCP. En otras modalidades, pueden ser utilizados compuestos de prueba fluorescentes o radioactivos para dirigir ios ensayos de enlace. En otras modalidades, se pueden conducir experimentos de enlace de competencia. En este tipo de ensayo, los compuestos de prueba son evaluados por su capacidad para competir con el Bz-423 para enlazarse al OSCP. En algunas modalidades, los compuestos de la presente invención ocasionan un aumento disminuido de los niveles de ROS celular y una apoptosis reducida en las células, a través de la regulación del gen OSCP (por ejemplo, alterando la expresión del gen OSCP). En modalidades adicionales, la presente invención funciona alterando los movimientos moleculares del motor de la ATPasa. II. Reguladores de Proliferación Celular y Crecimiento Celular En ciertas modalidades, los compuestos y métodos de la presente invención ocasionan una disminución en la proliferación celular. En otras modalidades, los compuestos y métodos de la presente invención ocasionan la disminución de la proliferación y la apoptosis celular. Por ejemplo, los ensayos de citotoxicidad de cultivos celulares realizados durante el desarrollo de la presente invención, demostraron que los compuestos y métodos de la presente invención previenen el crecimiento celular después de un período prolongado en cultivo (por ejemplo, 3 días). III. Análisis de Expresión de las Células Tratadas Durante el desarrollo de la presente invención, se generó un perfil de expresión para identificar aquellos genes que se expresaban de manera diferencial en las células tratadas y sin tratar. El perfil proporciona una huella de la expresión del gen de la célula inducida por los compuestos de la presente invención. La huella identifica los genes que son activados y desactivados en respuesta a los compuestos de la presente invención e identifica dichos genes como marcadores de diagnóstico para la selección de fármacos, y para el monitoreo de los efectos terapéuticos de los compuestos. Los genes también proporcionan objetivos para la regulación para imitar los efectos de los compuestos de la presente invención. Los datos de un análisis de expresión de los genes activados en la presencia de Bz-423 se presentan en la figura 4A. Los datos de un análisis de expresión para los genes desactivados en la presencia de Bz-423 se presentan en la figura 4B. Los datos de un análisis de expresión de los genes activados en la presencia de Bz-OMe se presentan en la figura 4C. Los datos del análisis de expresión de los genes desactivados en la presencia de Bz-OMe se presentan en la figura 4D. Por ejemplo, un análisis del perfil de expresión proporciona una antizima de descarboxilasa de ornitina 1 (OAZ1) como un agente terapéutico novedoso. La OAZ1 es una proteína reguladora importante que controla la síntesis y el transporte en las células de las poiiaminas, incluyendo la putrescina, espermidina y espermina. La síntesis de las poiiaminas en las células comprende varios pasos enzimáticos, sin embargo, la descarboxilasa de ornitina es la enzima que regula principalmente este proceso. Inhibiendo el transportador de poliamina localizado en la membrana del plasma y enviando al objetivo la descarboxilasa de ornitina para la degradación proteolítica, la OAZ1 reduce los niveles de poliamina en las células. Las poiiaminas son esenciales para la sobrevivencia y el crecimiento de las células. Una acumulación anormal de poiiaminas contribuye a la inducción de un tumor, el crecimiento del cáncer y metástasis. Los inhibidores de la biosíntesis de poliamina y específicamente, una molécula identificada como difluorometilornitina (DFMO), se usan en los ensayos clínicos para confirmar su potencial anticarcinogénico y terapéutico. En modalidades preferidas de la presente invención, la OAZ1 es inducida a un nivel 16 veces arriba del nivel de las células de control en las células tratadas con los compuestos de la presente invención. Cualquier método, directo o indirecto, para inducir niveles de OAZ1 está contemplado por la presente invención (por ejemplo, tratamiento con compuestos de la presente invención, terapia genética, etc.). El OAZ1 es un regulador importante para el metabolismo de poliamina y funciona para disminuir los niveles de poliamina actuando como un inhibidor de la descarboxiiasa de ornitina (ODC), una enzima mitocondrial que controla el paso del índice de limitación de la biosíntesis de poliamina. Después de la inhibición con la antizima, se envía al ODC para la degradación del proteosoma. Las poliaminas están involucradas íntimamente con la estabilidad celular y se requieren para la proliferación celular. Inhibiendo la síntesis de la poliamina se suprime la proliferación. Como tal, todavía en las modalidades adicionales, la expresión del ODC o la actividad es disminuida (por ejemplo, utilizando siARN, olinucleótidos antisentido, terapia genética, inhibidores conocidos o identificados posteriormente, los compuestos de la presente invención, etc.), para promover el efecto biológico deseado.

La expresión de la antizima 1 es regulada de manera transcripcional y en el nivel post-transcripcional. La regulación post-transcripcional juega un rol particularmente importante en la regulación de este producto del gen y ocurre por un cambio de la estructura de traducción único que depende de cualquiera de los polimanos (a través de un anillo de retroalimentación negativa), o agmantina, otro metabolito de arginina. Los niveles de actividad ODC pueden ser obtenidos cuantificando la conversión de ornitina a putrescina utilizando 3H-ornitina. En algunas modalidades, el tratamiento de las células con los compuestos de la presente invención reduce de manera importante la actividad del ODC de un modo que depende de la dosis. Todavía en modalidades adicionales, una reducción de la actividad del ODC es paralela a una disminución de los niveles de proteína ODC medidas bajo condiciones similares. Las células previamente incubadas con MnTBAP disminuyen los niveles de ROS. En algunas modalidades, las células previamente incubadas con MnTBAP que son expuestas a los compuestos de la presente invención, muestran una inhibición invertida del ODC. En modalidades preferidas, las células tratadas con altos niveles (por ejemplo, >10 µ?) de los compuestos de la presente invención generan cantidades suficientes de ROS que no son destoxificadas por los antioxidantes celulares, y dan como resultado la apoptosis dentro de un período de tiempo corto (por ejemplo, 18 horas). En modalidades preferidas, las células tratadas con niveles más bajos (por ejemplo, <10 µ?) de los compuestos de la presente invención inducen una respuesta reducida de ROS que es insuficiente para detonar la apoptosis, pero tiene la capacidad de inhibir el ODC o bloquear de otro modo la proliferación celular. En otras modalidades, un derivado de los compuestos de la presente invención en las cuales el hidroxilo fenólico es reemplazado por CI ó OCH3 es mínimamente citotóxico, y genera una respuesta pequeña de ROS en las células, ya que se enlaza menos estrechamente al OSCP, e inhibe la actividad del ODC. Todavía en modalidades adicionales, las células tratadas con un derivado de los compuestos de la presente invención en los cuales el hidroxilo fenólico es reemplazado por Cl experimentan la proliferación reducida a un grado similar del de los compuestos no modificados. Como tal, en las modalidades preferidas, los efectos antiproliferativos son obtenidos utilizando derivados químicos de los compuestos de la presente invención que bloquean la proliferación sin inducir la apoptosis. En respuesta al estímulo antigénico o mitogénico, los portadores de proteína que secretan los linfocitos, uno de los cuales es denominado el factor inhibitorio de migración (MIF) por su capacidad para evitar la migración de los macrófagos in vitro. El MIF puede ser un agente anti-tumor. Además, la capacidad del MIF para evitar la migración de los macrófagos puede ser explotada en el tratamiento de heridas. El MIF puede alterar la respuesta inmunológica a diferentes antígenos. El MIF se enlaza a los sistemas de destoxificación inmunológicos y químicos. El MIF fue inducido aproximadamente 10 veces por el Bz-423. Por lo tanto, la presente invención contempla el uso del MIF como un objetivo de los compuestos de la presente invención. La profilina es inducida a niveles altos en las células tratadas con la presente invención. La profilina se enlaza a los monómeros de actina e interactúa con varias proteínas y fosfoinosituros, enlazando las trayectorias de señalización al cito-esqueleto. La profilina puede secuestrar los monómeros de actina, aumenta el intercambio de ATP por ADP en actina, y aumenta el índice de rotación de filamento de actina. Una comparación entre diferentes líneas celulares de cáncer tumorigénico y diferentes con líneas no tumorigénicas muestra consistentemente niveles más bajos de profilina 1 en las células del tumor. La transfección del cADN de profilina 1 en las células de cáncer de mama CAL51 aumentó el nivel de profilina 1, y tuvo un efecto prominente en el crecimiento de las células y suprimió la tumorigenicidad de los clones de las células sobre-expresadas en los ratones naturales. Por lo tanto, la inducción de la profilina 1 (por ejemplo, por los compuestos de la presente invención o de otro modo) puede suprimir la tumorigénesis de las células cancerosas. El factor regulador del interferón 4 (IRF-4) es inducido en niveles más altos que el normal en las células tratadas con los compuestos de la presente invención. El IRF-4 es un miembro restringido de linfoide/mieloide de la familia del factor de transcripción IRF que juega un rol esencial en la homeostasis y la función de los linfocitos maduros. La expresión del IRF-4 es regulada haciendo reposar las células T primarias inducidas de manera transitoria en el mARN y los niveles de la proteína después de la activación de los estímulos, tales como la reticulación del TCR o tratamiento con éster de forbol y yonoforo de calcio (P A/yonomicina). La expresión estable del IRF-4 en las células de Jurkat conduce a una mejora fuerte en la síntesis de la interleucina (IL)-2, IL-4, IL-10, y IL- 3. El IRF-4 representa uno de los componentes específicos del linfoide que controla la capacidad de los linfocitos T para producir una adaptación distintiva de citocinas. En las células pro-B transformadas con Abelson, la expresión introducida del IRF-4 es suficiente para inducir la transcripción Igk de la línea germinal. La acción de los compuestos de la presente invención para inducir el IRF-4 puede tomarse en cuenta por sus efectos en las enfermedades auto-inmunológicas en los procesos dominantes de la célula B y la célula T, así como por su capacidad para influir en la sobrevivencia de los clones neoplásticos de las células B. En modalidades preferidas, la proteína reguladora de la muerte de células GRIM19 es inducida en niveles más altos que el normal en las células tratadas con los compuestos de la presente invención. Es conocida la importancia de la trayectoria del interferón (IFN) en la supresión del crecimiento celular. Los estudios han mostrado que una combinación de IFN y el ácido retinoico todo-trans, inhibe el crecimiento de las células in vitro e in vivo de una manera más potente que cualquier agente solo. Los genes específicos que juegan un rol en la muerte celular inducida por IFN/RA fueron identificados mediante un método de bloqueo antisentido, y denominado los genes de GRIM. El GRI 19 es un gen asociado con la muerte de las células novedoso que no está incluido en categoría alguna de genes mortales conocidos. Este gen codifica una proteína 144-aa que se localiza en el núcleo. La sobre-expresión del GRIM19 mejora la actividad de la caspasa-9 y la muerte apoptótica de las células en respuesta al tratamiento con IFN/RA. El GRIM19 está localizado en la región 19p13.2 del cromosoma humano esencial para la supresión del tumor de la próstata, significando que la proteína puede ser un supresor novedoso del tumor. La inducción del GRIM19 por los compuestos de la presente invención puede dar como resultado efectos antitumor.

IV. Compuestos de Ejemplo Los compuestos de ejemplo de la presente invención se proporcionan a continuación. o su enantiómero; en el cual, Ri es alifático o arüo; R2 es alifático, arilo, -NH2, -NHC(=0)-R5, o una porción que participa en el enlace de hidrógeno, en donde R5 es arilo, heterocíclico, -R6-NH-C( = 0)-R7 ó -R6-C( = 0)-NH-R7, en donde R6 es un enlazador alifático de 1 a 6 átomos de carbono y R es alifático, arilo, o heterocíclico, cada uno de R3 y R4 es independientemente un hidroxi, alcoxi, halo, amino, amino substituido por alquilo inferior, acetilamino, hidroxiamino, un grupo alifático que tiene de 1 a 8 átomos de carbono y de 1 a 20 átomos de hidrógeno, arilo o heterocíclico; o una sal, profármaco o derivado farmacéuticamente aceptable del mismo.

En las estructuras anteriores, R i es un grupo hidrocarbilo de 1 a 20 átomos de carbono y 1 a 20 átomos de hidrógeno. De preferencia, Ri tiene de 1 a 15 átomos de carbono, y más preferentemente tiene de 1 a 12 átomos de carbono. Preferentemente, R-i tiene de 1 a 12 átomos de hidrógeno, y más preferentemente de 1 a 10 átomos de hidrógeno. Por lo tanto, Ri puede ser un grupo alifático o un grupo arilo. El término "alifático" representa los grupos generalmente conocidos como alquilo, alquenilo, alquinilo, alicíclico. El término "arilo" como se usa en la presente descripción representa un solo anillo aromático, tal como un anillo fenilo, o dos o más anillos aromáticos que son conectados entre ellos (por ejemplo, bisfenilo) o fusionados juntos (por ejemplo, naftaleno o antraceno). El grupo arilo puede ser substituido opcionalmente por un grupo alifático inferior (por ejemplo, alquilo C1-C4, alquenilo, alquinilo o alicíclico C3-C6). Adicionalmente, los grupos alifáticos y arilo pueden ser substituidos además por uno o más grupos funcionales tales como -NH2, -NHCOCH3, -OH, alcoxi inferior (Ci-C ), halo (-F, -Cl, -Br, ó I). Se prefiere que R-i sea principalmente una porción no polar. En las estructuras anteriores, R2 puede ser alifático, arilo, -NH2, -NHC( = 0)-R5, o una porción que participa en el enlace del hidrógeno, en donde R5 es arilo, heterocíclico, R6- NH-C( = 0)-R7 ó -R6-C( = 0)-NH-R7, en donde RB es un enlazador alifático de 1 a 6 átomos de carbono y R7 es un alifático, arilo o heterocíclico. Los términos "alifático" y "arilo" son tal y como se definieron anteriormente. Los términos "una porción que participa en el enlace del hidrógeno" como se usan en la presente descripción representan un grupo que puede aceptar o donar un protón para formar de este modo un enlace de hidrógeno. Algunos ejemplos no limitativos específicos de las porciones que participan en el enlace de hidrógeno incluyen un flúor, o un grupo que contiene oxígeno y contiene nitrógeno que es bien conocido en la técnica. Algunos ejemplos de los grupos que contienen oxígeno que participan en el enlace del hidrógeno incluyen: hidroxi, alcoxi inferior, carbonilo inferior, carboxiio inferior, éteres inferiores y grupos fenólicos. El calificativo "inferior" tal y como se usa en la presente descripción se refiere a grupos alifáticos inferiores (C-|-C4) a los cuales es enlazado el grupo funcional respectivo que contiene oxígeno. Por lo tanto, por ejemplo, el término "carbonilo inferior" se refiere entre otros, a formaldehído, acetaldehído. Algunos ejemplos no limitativos de los grupos que contienen nitrógeno que participan en la formación del enlace de hidrógeno incluyen grupos amino y amido. Adicionalmente, los grupos que contienen, tanto un átomo de oxígeno como de nitrógeno también pueden participar en la formación del enlace de hidrógeno. Los ejemplos de dichos grupos incluyen nitro, N-hidroxi y grupos nitrosos. También es posible que el receptor de enlace de hidrógeno en la presente invención pueda ser el electrón ? o un anillo aromático. Sin embargo, los participantes del enlace de hidrógeno de la presente invención no incluyen aquellos grupos que contienen átomos de metal, tales como boro. Además, los enlaces de hidrógeno formados dentro del alcance de la práctica de la presente invención no incluyen aquellos formados entre dos hidrógenos, conocidos como "enlaces dihidrógeno". (Ver por ejemplo, la publicación de R.H. Crabtree, en Science, 282: páginas 2000 a 2001

[1998], para una descripción adicional de dichos enlaces dihidrógeno). El término "heterocíclico" representa, por ejemplo, un anillo aromático de 3 a 6 miembros o no aromático que contiene uno o más heteroátomos. Los heteroátomos pueden ser el mismo o diferentes entre ellos. De preferencia, por lo menos uno de los heteroátomos es nitrógeno. Otros heteroátomos que pueden estar presentes en el anillo heterocíclico incluyen oxígeno y azufre. Los anillos heterocíclicos aromáticos y no aromáticos son bien conocidos en la técnica. Algunos ejemplos no limitativos de los anillos heterocíclicos aromáticos incluyen piridina, pirimidina, indol, purina, quinolina e isoquinolina. Los ejemplos no limitativos de los compuestos heterocíclicos no aromáticos incluyen piperidina, piperazina, morfolina, pirrolidina y pirazolidina. Los ejemplos de los anillos heterocíclicos que contienen oxígeno incluyen pero no están limitados a furano, oxirano, 2H-pirano, 4H-pirano, 2H-cromeno, y benzofurano. Los ejemplos de los anillos heterocíclicos que contienen azufre, incluyen pero no están limitados a, tiofeno, benzotiofeno y paratiazina. Los ejemplos de los anillos que contienen nitrógeno incluyen pero no están limitados a, pirrol, pirrolidina, pirazol, pirazolidina, imidazol, imidazolina, imidazolidina, piridina, piperidina, pirazina, piperazina, pirimidina, indol, purina, bencimidazol, quinolina, isoquinolina, triazol y triazina. Los ejemplos de los anillos heterocíclicos que contienen dos heteroátomos diferentes incluyen, pero no están limitados a, fenotiazina, morfolina, paratiazina, oxazina, oxazol, tiazina y tiazol. El anillo heterocíclico es substituido adicionalmente de manera opcional por uno o más grupos seleccionados de grupos alifáticos, nitro, acetilo (por ejemplo, -C(=0)-CH3), o grupos arilo. Cada uno de R3 y R4 pueden ser independientemente un hidroxi, alcoxi, halo, amino o amino substituido (tal como amino substituido por alquilo inferior, o acetilamino o hidroxiamino), o un grupo alifático que tiene de 1 a 8 átomos de carbono y de 1 a 20 átomos de hidrógeno. Cuando cada uno de R3 y R4 es un grupo alifático, puede ser substituido además por uno o más grupos funcionales, tales como un hidroxi, alcoxi, halo, amino o grupos amino substituidos como se describieron anteriormente. El término "alifático" es tal y como se describió anteriormente. Alternativamente, cada uno de R3 y R4 puede ser hidrógeno. Es bien conocido que existen muchas 1,4-benzodiazepinas como isómeros ópticos debido a la quiralidad introducida en el anillo heterocíclico en una porción de la posición C3. Los isómeros ópticos son algunas veces descritos como isómeros L- ó D- en la literatura. Alternativamente, a los isómeros también nos podemos referir como enantiomorfos R- y S-. Por razones de simplicidad, a estos isómeros nos referimos como enantiomorfos o enantiómeros. Los compuestos de 1 ,4-benzodiazepina descritos en esta descripción incluyen sus formas enantioméricas, así como las mezclas racémicas. Por lo tanto, el uso de "benzodiazepina o sus enantiómeros" en la presente descripción, se refiere a la benzodiazepina tal y como se describió o ¡lustró, incluyendo todos sus enantiomorfos, así como sus mezclas racémicas. Por la descripción anterior, se podrá apreciar que muchos ejemplos específicos son representados por las fórmulas genéricas representadas anteriormente. Por lo tanto, en un ejemplo, Ri es alifático, R2 es alifátlco, mientras que en otro ejemplo, R1 es arilo y R2 es una porción que participa en la formación del enlace de hidrógeno. Alternativamente, R-i puede ser alifático, y R2 puede ser un grupo -NHC( = 0)-R5, o una porción que participa en el enlace de hidrógeno, en donde R5 es arilo, heterocíclico, -R6-N H-C(=0)-R7 ó -R6-C(=0)-NH-R7, en donde R6 es un enlazador alifático de 1 a 6 átomos de carbono y R7 es un alifático, arilo, o heterocíclico. Una variedad de sub-combinaciones que surgen de seleccionar un grupo particular en cada posición de substituyente es posible y todas dichas combinaciones se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Además, deberá quedar entendido que muchos rangos numéricos proporcionados en esta descripción deben ser interpretados como un rango flexible que contempla cualquier sub-rango posible dentro de este rango. Por ejemplo, ia descripción de un grupo que tiene el rango de 1 a 10 átomos de carbono, también contemplaría un grupo que posee un sub-rango de, por ejemplo, 1 a 3, 1 a 5, 1 a 8 ó 2 a 3, 2 a 5, 2 a 8, 3 a 4, 3 a 5, 3 a 7, 3 a 9, 3 a 10, etc., átomos de carbono. Por lo tanto, el rango de 1 a 10 deberá ser entendido que representa los límites exteriores del rango dentro del cual están claramente contemplados muchos sub-rangos. Los ejemplos adicionales que contemplan rangos en otros contextos pueden ser encontrados en toda esta descripción, en donde dichos rangos incluyen sub-rangos análogos dentro de los mismos. Algunos ejemplos específicos de los compuestos de benzodiazepina de la presente invención incluyen: en donde R2 es y dimetilfenilo (todos isómeros) y ditrifiuorometilo (todos isómeros). También están contemplados los siguientes compuestos: La presente invención también proporciona un compuesto Bz-423.

El Bz-423 difiere de las benzodiazepinas en el uso clínico por la presencia de un substituyente hidrofóbico en la posición C-3. Esta substitución presenta el enlace a un receptor periférico de benzodiazepina lábil ("PBR") (Ka ca. 1 µ?), y evita el enlace con el receptor central de benzodiazepina, de modo que el Bz-423 no es un sedante. En algunas modalidades R2 es cualquier grupo químico que permite que el compuesto se enlace al OSCP. En algunas de dichas modalidades, R2 comprende un grupo aromático hidrofóbico. En algunas modalidades preferidas R2 comprende un grupo aromático hidrofóbico más grande que benceno (por ejemplo, un anillo de benceno con substituyentes que no son hidrógeno, una porción que tiene dos o más anillos aromáticos, una porción con 7 o más átomos de carbono, etc.).

Algunos derivados específicos de benzodiazepina de »resente invención incluyen los siguientes: dialquilo (todo regioisómeros) metilo (todo regioisómeros) R1 = H, alquilo, o alquilo substituido R3 = H, alquilo, o alquilo substituido R4 = H, alquilo, o alquilo substituido la estequiometrla es R, S, o racémica R2 es seleccionado de hidrógeno, un hidroxi, un alcoxi, un halo, un amino, un amino substituido por un alquilo inferior, un acetilamino. un hidroxiamino, un grupo alifático que tiene de 1 a 8 átomos de carbono y de 1 a 20 átomos de hidrógeno un grupo alifático substituido de R4 tamaño similar, un grupo cicloalifátíco que consiste de < 10 átomos de carbono, un grupo cicloalifátíco substituido, un arilo y un heterociclico 25 25 ?? 104 (CH2)nC(CH3)3 (CH2)nCH(CH3)2 CH2(CH2)nCH3 n = 0-5 n = 0-5 n = 0-5 25 R1 = H, alquilo, o alquilo substituido R3 = H, alquilo, o alquilo substituido R4 = H, alquilo, o alquilo substituido la estequiometría es R, S, o racémica R2 es seleccionado de hidrógeno, un hidroxi, un alcoxi, un halo, un amino, un amino substituido por un alquilo inferior, un acetilamino, un hidroxiamino, un grupo alifático que tiene de 1 a 8 átomos de carbono y de 1 a 20 átomos de hidrógeno un grupo alifático substituido de tamaño similar, un grupo cicloalifático que consiste de < 10 átomos de carbono, un grupo cicloalifático substituido, un arilo y un heterociclico 25 R1 = H, alquilo, o alquilo substituido R3 = H, alquilo, o alquilo substituido R4 = H, alquilo, o alquilo substituido la estequiometría es R, S, o racémica R2 es seleccionado de hidrógeno, un hidroxi, un alcoxi, un halo, un amino, un amino substituido por un alquilo inferior, un acetilamino, un hidroxiamino, un grupo alifático que tiene de 1 a 8 átomos de carbono y de 1 a 20 átomos de hidrógeno un grupo alifático substituido de tamaño similar, un grupo cicloalifático que consiste de < 10 átomos de carbono, un grupo cicloalifático substituido, un arilo y un heterocíclico dialquilo (todo regioisómeros) metilo (todo regioisómeros) R1 = H, alquilo, o alquilo substituido R3 = H, alquilo, o alquilo substituido la estequiometria ss R, S, o racémica R2 es seleccionado de hidrógeno, un hidroxi, un alcoxi, un halo, un amino, un amino substituido por un alquilo inferior, un acetilamino, un hidroxiamino, un grupo alifático que tiene de 1 a 8 átomos de carbono y de 1 a 20 átomos de hidrógeno un grupo alifático substituido de tamaño similar, un grupo cicloalifático que consiste de < 10 átomos de carbono, un grupo cicloalifático substituido, un arilo y un heterociclico 2)nCH3 ioisómeros) 1 = H, alquilo, o alquilo substituido R3 = H, alquilo, o alquilo substituido la estequiometría es R, S, o racémica R2 es seleccionado de hidrógeno, un hidroxi. un alcoxi, un halo, un amino, un amino substituido por un alquilo inferior, un acetilamino, un hidroxiamino, un grupo alifático que tiene de 1 a 8 átomos de carbono y de 1 a 20 átomos de hidrógeno un grupo alifático substituido de tamaño similar, un grupo cicloalifático que consiste de < 10 átomos de carbono, un grupo cicloalifático substituido, un arilo y un heterociclico dialquilo (todo regioisómeras) en donde Ri es H o hidroxi Cada uno de R2 a R6 puede ser el mismo* o diferente y es seleccionado del grupo de hidrógeno, un hidroxi, un alcoxi, un halo, un amino, un amino substituido por alquilo inferior, un acetilamino, un hidroxiamino, un grupo alifático que tiene de 1 a 8 átomos de carbono y de 1 a 20 átomos de hidrógeno, un grupo alifático substituido de tamaño similar, un grupo cicloalifático que consiste de < 10 átomos de carbono, un grupo cicloalifático substituido, un arilo y un heterocíclico Cada uno de Ri a Río puede ser el mismo o diferente y seleccionado de hidrógeno, un hidroxi, un alcoxi, un halo, un amino, un amino substituido por un alquilo inferior, un acetilamino, un hidroxiamino, un grupo alifático que tiene de 1 a 8 átomos de carbono y de 1 a 20 átomos de hidrógeno, un grupo alifático substituido de tamaño similar, un grupo cicloalifático que consiste de < 10 átomos de carbono, un grupo cicloalifático substituido, un arilo, y un heterocíclico.

Cada uno de Ri a R pueden ser el mismo o diferente y son seleccionados de hidrógeno, un hidroxi, un alcoxi, un halo, un amino, un amino substituido por un alquilo inferior, un acetilamino, un hidroxiamino, un grupo alifático que tiene de 1 a 8 átomos de carbono y de 1 a 20 átomos de hidrógeno, un grupo alifático substituido de tamaño similar, un grupo cicloalifático que consiste de < 10 átomos de carbono, un grupo cicloalifático substituido, un arilo, y un heterocíclico.

Cada uno de R-i a Río puede ser el mismo o diferente y es seleccionado del grupo de hidrógeno, un hidroxi, un alcoxi, un halo, un amino, un amino substituido por un alquilo inferior, un acetilamino, un hidroxiamino, un grupo alifáíico que tiene de 1 a 8 átomos de carbono y de 1 a 20 átomos de hidrógeno, un grupo alifático substituido de tamaño similar, un grupo cicloalifático que consiste de < 10 átomos de carbono, un grupo cicloalifático substituido, un arilo, y un heterocíclico.

Cada uno de Ri a R10 puede ser el mismo o diferente y es seleccionado del grupo de hidrógeno, un hidroxi, un alcoxi, un halo, un amino, un amino substituido por un alquilo inferior, un acetilamino, un hidroxiamino, un grupo alifático que tiene de 1 a 8 átomos de carbono y de 1 a 20 átomos de hidrógeno, un grupo alifático substituido de tamaño similar, un grupo cicloalifático que consiste de < 10 átomos de carbono, un grupo cicloalifático substituido, un arilo, y un heterocíclico.

Cada uno de R a R6 puede ser el mismo o diferente y es seleccionado de hidrógeno, un hidroxi, un alcoxi, un halo, un amino, un amino substituido por un alquilo inferior, un acetilamlno, un hidroxiamino, un grupo alifático que tiene de 1 a 8 átomos de carbono y de 1 a 20 átomos de hidrógeno, un grupo alifático substituido de tamaño similar, un grupo cicloalifático que consiste de < 10 átomos de carbono, un grupo cicloalifático substituido, un arilo, y un heterocíclico. 1 = H, alquilo, o alquilo substituido R4 = H, alquilo, o alquilo substituido la estequiometría es R, S, o racémica R2 es seleccionado de hidrógeno, un hidroxi. un alcoxi. un halo, un amino. un amino substituido por un alquilo inferior, un acetilamino, un hidroxiamino, un grupo alifático que tiene de 1 a 8 átomos de carbono y de 1 a 20 átomos de hidrógeno un grupo alifático substituido de tamaño similar, un grupo cicloalifático que R2 consiste de < 10 átomos de carbono, un grupo cicloalifático substituido, un arilo y un heterociclico 2)nCH3 dialquilo (todo regioisómeros) ?? y quinolinas. Una composición que comprende la siguiente fórmula: La estereoquímica de todos los derivados incorporados en la presente invención es R, S, o racémica. Los ejemplos adicionales de derivados específicos de benzodiazepina de la presente invención incluyen lo siguiente: Una composición, que comprende la siguiente fórmula: Una composición que comprende la siguiente fórmula: consistente de: hidrógeno CH3; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono y que tiene por lo menos un subgrupo hidroxi; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono que tiene por lo menos un subgrupo tiol; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, en donde la cadena alifática termina en un subgrupo aldehido; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono y tiene por lo menos un subgrupo cetona; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono; en donde la cadena alifática termina con un subgrupo de ácido carboxílico; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono y tiene por lo menos un subgrupo amida; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono y tiene por lo menos un grupo acilo; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono y tiene por lo menos una porción que contiene nitrógeno (por ejemplo, nitro, nitrilo, etc.); una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono y tiene por lo menos un subgrupo amina; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono y tiene por lo menos un subgrupo éter; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono y tiene por lo menos un subgrupo halógeno; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono y tiene por lo menos un subgrupo nitronio; en donde R5 es seleccionado del grupo consistente de: OH; N02; NR'; OR; en donde R' es seleccionado del grupo consistente de: una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 1 átomo de carbono, una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono y tiene por lo menos un subgrupo hidroxilo; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono y tiene por lo menos un subgrupo tiol; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono en donde la cadena alifática termina con un subgrupo aldehido; una cadena alifática saturada o insaturada recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono y tiene por lo menos un subgrupo cetona; una cadena alifática saturada o insaturada recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, en donde la cadena alifática termina con un subgrupo de ácido carboxílico; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono y tiene por lo menos un subgrupo amida; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono y tiene por lo menos un grupo acilo; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono y tiene por lo menos una porción que tiene nitrógeno (por ejemplo, nitro, nitrilo, etc.); una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono y tiene por lo menos un subgrupo amina; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono y tiene por lo menos un subgrupo halógeno; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono y tiene por lo menos un subgrupo nitronio; en donde R6 es seleccionado del grupo consistente de: hidrógeno; N02; C1; F; Br; I; SR' y NR'2; en donde R' es tal y como se definió anteriormente en R5; en donde R7 es seleccionado del grupo consistente de: hidrógeno; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono y en donde R8 es un grupo cíclico alifático más grande que benceno; en donde dicho grupo más grande que benceno comprende cualquier grupo químico que contiene 7 ó más átomos que no son de hidrógeno; y es un grupo cíclico arilo o alifático. En algunas modalidades, R' es cualquier grupo funcional que protege el oxígeno de R5 del metabolismo in vivo, hasta que el compuesto alcanza su objetivo biológico (por ejemplo, la mitocondria). El grupo protector R' es metabolizado en el sitio del objetivo, convirtiendo R5 en un grupo hidroxilo. En resumen, el número más grande de compuestos de benzodiazepina y compuestos relacionados se presentan en la presente descripción. Cualquiera o más de estos compuestos pueden ser utilizados para tratar una variedad de enfermedades de resgulación relacionadas con la muerte celular, tal y como se describe en cualquier parte en la presente descripción. Los compuestos anteriormente descritos también pueden ser utilizados en ensayos de selección de fármacos y otros métodos de diagnóstico. V. Composiciones farmacéuticas, formulaciones y rutas de administración de ejemplo y consideraciones de dosificación Las modalidades de ejemplo de diferentes medicamentos contemplados y con composiciones farmacéuticas se proporcionan a continuación. A. Preparación de Medicamentos Los compuestos de la presente invención son útiles en la preparación de medicamentos para tratar una variedad de padecimientos asociados con la desregulación de la muerte celular, el crecimiento aberrante de las células y la hiperproliferación. Además, los compuestos también son útiles para preparar medicamentos para el tratamiento de otras enfermedades, en donde la efectividad de los compuestos es conocida o pronosticada. Dichas enfermedades incluyen pero no están limitadas a, enfermedades neurológicas (por ejemplo, epilepsia) o neuromusculares. Los métodos y técnicas para preparar los medicamentos de un compuesto son bien conocidos en la técnica. Las formulaciones farmacéuticas de ejemplo y la ruta de administración se describen a continuación. Un experto en la técnica apreciará que cualquiera o más de los compuestos aquí descritos, incluyendo las muchas modalidades específicas, son preparados aplicando procedimientos en fabricación farmacéutica estándar. Dichos medicamentos pueden ser administrados al sujeto utilizando métodos de administración que son bien conocidos en la técnica farmacéutica. B. Composiciones y formulación farmacéutica de ejemplo En algunas modalidades de la presente invención, las composiciones son administradas solas, mientras que en otras modalidades, las composiciones están presentes preferentemente en una formulación farmacéutica que comprende por lo menos un agente/ingrediente activo (por ejemplo, derivado de benzodiazepina), tal y como se describió anteriormente, junto con un soporte sólido o alternativamente, junto con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables y opcionalmente otros agentes terapéuticos. Cada vehículo debe de ser "aceptable" en el sentido de que sea compatible con los otros ingredientes de la formulación y no perjudiciales para el sujeto. Las formulaciones contempladas incluyen aquellas adecuadas para la administración oral, rectal, nasal, tópica (incluyendo transdérmica, bucal y sublingual), vaginal, parenteral (incluyendo inyecciones subcutáneas, intramusculares, intravenosas e intradérmicas) y para la administración pulmonar. En algunas modalidades, las formulaciones son presentadas de manera conveniente en formas de dosificación unitaria y son preparadas por cualquier método conocido en la técnica de la farmacia. Dichos métodos incluyen el paso de poner en asociación el ingrediente activo con el vehículo, el cual constituye uno o más ingredientes accesorios. En general, las formulaciones son preparadas poniendo en asociación íntima y de manera uniforme (por ejemplo, mezclando) el ingrediente activo, con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos o ambos, y dándole forma al producto luego, de ser necesario. Las formulaciones de la presente invención adecuadas para la administración oral pueden ser presentadas como unidades separadas, tales como cápsulas, pildoras o tabletas en donde cada una contiene preferentemente una cantidad previamente determinada del ingrediente activo; en la forma de un polvo o gránulo; como una solución o suspensión en un líquido acuoso o no acuoso; o como una emulsión líquida de aceite en agua o una emulsión líquida de agua en aceite. En otras modalidades, el ingrediente activo es presentado en la forma de un bolo, electuario, o pasta, etc. En algunas modalidades, las tabletas comprenden por lo menos un ingrediente activo y opcionalmente uno o más vehículos/agentes accesorios y se hacen comprimiendo y moldeando los agentes respectivos. En las modalidades preferidas, las tabletas comprimidas son preparadas comprimiendo en una máquina adecuada el ingrediente activo en una forma de flujo libre, tal como un polvo o gránulos, opcionalmente mezclados con un enlazador (por ejemplo, povidona, gelatina, hidroxipropilmetil celulosa), un lubricante, un diluyente inerte, un conservador, un desintegrador (por ejemplo, glicolato de almidón sódico, povidona reticulada, carboximetil celulosa sódica reticulada), un agente de superficie o un agente de dispersión. Las tabletas moldeadas se hacen moldeando en una máquina adecuada la mezcla de los compuestos pulverizados (por ejemplo, el ingrediente activo), humedecido con un diluyente líquido inerte. Las tabletas pueden ser recubiertas o marcadas opcionalmente, y pueden ser formuladas para proporcionar la liberación lenta o controlada del ingrediente activo en la misma, utilizando, por ejemplo, hidroxipropilmetil celulosa en proporciones variables para proporcionar un perfil de liberación deseado. Las tabletas pueden estar provistas opcionalmente con un recubrimiento entérico, para proporcionar la liberación en partes del intestino delgado, en vez de en el estómago. Las formulaciones adecuadas para la administración tópica en la boca incluyen grageas que comprenden el ingrediente activo y una base con sabor, generalmente sacarosa y acacia o goma tragacanto; pastillas que comprenden el ingrediente activo en una base inerte, tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y acacia; y en lavados bucales que comprenden el ingrediente activo en un vehículo líquido adecuado. Las composiciones farmacéuticas para la administración tópica de acuerdo con la presente invención, son formuladas opcionalmente en la forma de ungüentos, cremas, suspensiones, lociones, polvos, soluciones, pastas, gel, rocíos, aerosoles o aceites. En modalidades alternativas, las formulaciones tópicas incluyen parches o aditamentos, tales como vendas o yesos adhesivos impregnados con el ingrediente activo, y opcionalmente uno o más excipientes o diluyentes. En las modalidades preferidas, las formulaciones tópicas incluyen un compuesto que mejora la absorción o penetración del agente activo a través de la piel u otras áreas afectadas. Los ejemplos de dichos mejoradores de penetración dérmica incluyen dimetilsulfóxido (DMSO) y análogos relacionados. Si se desea, la fase acuosa de una base de crema incluye, por ejemplo, al menos el 30% p/p de alcohol polihídrico, por ejemplo, un alcohol que tiene dos o más grupos hidroxilo, tales como propilénglicol, butano- ,3-diol, manitol, sorbitol, glicerol y polietilénglicol y mezclas de los mismos. En algunas modalidades, las emulsiones de fase aceitosa de la presente invención son constituidas a partir de ingredientes conocidos y de una manera conocida. Esta fase generalmente comprende un emuisificador solo (conocido de otro modo como un emulgente) y también es deseable en algunas modalidades que esta fase comprenda además una mezcla de por lo menos un emuisificador como una grasa o un aceite, o con ambos una grasa y un aceite. De preferencia, se incluye un emuisificador hidrofílico junto con un emuisificador lipofílico como para actuar como un estabilizador. En algunas modalidades también se prefiere incluir, tanto un aceite como una grasa. Juntos, el emuisificador con o sin el estabilizador forman la cera denominada de emulsificación, y la cera junto con el aceite y/o grasa forman la denominada base de ungüento de emulsificación, la cual forma la fase dispersada aceitosa de las formulaciones de crema. Los emulgentes y estabilizadores de emulsión adecuados para utilizarlos en la formulación de la presente invención incluyen Tween 60, Span 80, alcohol cetostearílíco, alcohol miristílíco, monoesterato de glicerol y sulfato laurilo de sodio. La selección de los aceites o grasas adecuados para la formulación está basada en el logro de las propiedades deseadas (por ejemplo, propiedades cosméticas), ya que la solubilidad del agente/compuesto activo más probable en los aceites que son utilizados en formulaciones de emulsión farmacéutica muy bajos. Por lo tanto, las cremas deben de ser preferentemente no grasosas, no manchar y productos que se pueden lavar con una consistencia adecuada para evitar la filtración de los tubos u otros contenedores. Puedfen utilizarse ásteres alquilo y básicos o monobásicos, de cadena recta o ramificada, tales como di-isoaditpato, isocetil estearato, diéster de propilénglicol de ácidos grasos de coco, isopropil miristato, oleato decílo, palmitato isopropilo, estearato butílico, palmitato 2-etilhexilo o una mezcla de ásteres de cadena ramificada conocida como Crodamol CAP, siendo preferidos los últimos tres ásteres. Estos pueden ser utilizados solos o en combinación dependiendo de las propiedades requeridas. Alternativamente, se pueden utilizar líquidos de punto de fusión alta, tal como parafina suave blanca y/o parafina líquida u otros aceites minerales. Las formulaciones adecuadas para la administración tópica a los ojos también incluyen gotas para los ojos en donde el ingrediente activo es disuelto suspendido en un vehículo adecuado, especialmente un solvente acuoso para el agente. Las formulaciones para la administración rectal pueden ser presentadas en la forma de supositorios con una base adecuada que comprende, por ejemplo, manteca de cacao o un salicilato. Las formulaciones adecuadas para la administración vaginal pueden ser presentadas como óvulos, cremas, gels, pastas, espumas o formulaciones de rocío que contienen en adición al agente dichos vehículos que son conocidos como apropiados en la técnica. Las formulaciones adecuadas para la administración nasal, en donde el vehículo es un sólido, incluyen polvos gruesos que tienen un tamaño de partícula, por ejemplo, en un rango de aproximadamente 20 hasta aproximadamente 500 mieras, los cuales son administrados de una manera en la cual se toman a la hora de la aspiración, por ejemplo, mediante la inhalación rápida (por ejemplo, forzada) a través del pasaje nasal de un contenedor de polvo sostenido cercano a la nariz. Otras formulaciones adecuadas en donde el vehículo es un líquido para la administración, incluyen pero no están limitados a, rocíos nasales, gotas o aerosoles mediante un nebulizador, e incluyen soluciones acuosas o aceitosas de los agentes. Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral incluyen soluciones de inyección estéril acuosa y no acuosa isotónica, las cuales pueden contener antioxidantes, reguladores, bacterioestatos insolubles, los cuales presentan una formulación isotónica con la sangre del paciente pretendido; y las soluciones acuosas y no acuosas estériles, las cuales pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes y liposomas u otros sistemas de microparticulado que están diseñados para enviar el compuesto al objetivo de los componentes de la sangre o uno o más órganos. En algunas modalidades, las formulaciones son presentadas/formuladas en contenedores sellados de dosis unitarias o dosis múltiples, por ejemplo, ampolletas y frascos y pueden ser almacenados en una condición secada por congelación (liofilizada) que requieren solamente la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo, agua para inyecciones, inmediatamente antes de utilizarlos. Las soluciones de inyección extemporáneas y las suspensiones pueden ser preparadas a partir de polvos estériles, gránulos y tabletas del tipo anteriormente descrito.

Las formulaciones de dosificación unitaria preferidas son aquellas que contienen una dosis diaria o unidad, subdosis diaria, tal y como se ha mencionado en la presente descripción, o una fracción apropiada de la misma, de un agente. Deberá quedar entendido que además de los ingredientes mencionados particularmente con anterioridad, las formulaciones de la presente invención pueden incluir otros agentes convencionales en la técnica que se refieren al tipo de formulación en cuestión, por ejemplo, aquellos adecuados para la administración oral pueden incluir agentes tales como edulcorantes, espesantes y agentes saborizantes. También se pretende que los agentes, composiciones y métodos de la presente invención sean combinados con otras composiciones y terapias adecuadas. Todavía otras formulaciones incluyen opcionalmente aditivos de alimentos (edulcorantes adecuados, saborizantes, colorantes, etc.), fitonutrientes (por ejemplo, aceite de semilla de linasa), minerales (por ejemplo, Ca, Fe, K, etc.), vitaminas y otras composiciones afectables (por ejemplo, ácido linoleico conjugado) extensores y estabilizadores, etc. C. Rutas de administración y consideraciones de dosificación de ejemplo Son conocidos varios sistemas de administración y pueden ser utilizados para administrar agentes terapéuticos (por ejemplo, derivados de benzodiazepina) de la presente invención, por ejemplo, la encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, endocitosis portados por el receptor y similares. Los métodos de administración incluyen, pero no están limitados a, rutas, intra-arterial , intra-muscular, intravenosa, intranasal y oral. En modalidades específicas, puede ser deseable administrar las composiciones farmacéuticas de la presente invención localmente en el área que necesita el tratamiento; esto puede ser logrado por ejemplo, pero no a modo de limitación, mediante una infusión local durante la cirugía, inyección, o por medio de un catéter. Los agentes identificados en la presente descripción son efectivos para su propósito pretendido y pueden ser administrados a sujetos o individuos susceptibles a, o en riesgo de desarrollar el crecimiento patológico de las células objetivo y los padecimientos correlacionados con esto. Cuando el agente es administrado a un sujeto, tal como un ratón, una rata o un paciente humano, el agente puede ser agregado a un vehículo farmacéuticamente aceptable y administrado de manera sistémica o tópica al sujeto. Para determinar los pacientes que pueden ser tratados de manera benéfica, se elimina una muestra del tejido del paciente y las células son probadas por determinar la sensibilidad al agente. Las cantidades terapéuticas son determinadas empíricamente y varían con la patología que está siendo tratada, el sujeto que está siendo tratado y la eficacia y toxicidad del agente. Cuando son administradas a un animal, el método es útil para confirmar además la eficacia del agente. Un ejemplo de un modelo de animal es, el MLR/Mpl-lpr/lpr("MLR-lpr") (disponible en Jackson Laboratories, Bal Harbor, Maine). El ratón MLR-lpr desarrolla enfermedades autoinmunológicas sistémicas. Alternativamente, se pueden desarrollar otros modelos de animales, induciendo el crecimiento de un tumor, por ejemplo, mediante la inoculación subcutánea del ratón al natural con aproximadamente 105 hasta aproximadamente 109 células hiperproliferativas cancerosas u objetivo como aquí se definen. Cuando es establecido el tumor, los compuestos aquí descritos son administrados, mediante una inyección subcutánea alrededor del tumor. También se hacen mediciones del tumor para determinar la reducción del tamaño del tumor en dos dimensiones utilizando calibradores venier dos veces a la semana. También se pueden emplear otros modelos de animales, según sea apropiado. Dichos modelos de animales para las enfermedades y padecimientos anteriormente descritos, son bien conocidos en la técnica. En algunas modalidades, la administración in vivo es efectuada en una sola dosis, de manera continua o intermitente durante el curso del tratamiento. Los métodos para determinar los medios más efectivos y la dosificación de administración son bien conocidos para aquellos expertos en la técnica y varían con la composición deseada para la terapia, propósito de la terapia, la célula objetivo que está siendo tratada y el sujeto que está siendo tratado. Las administraciones solas o múltiples se llevan a cabo con niveles de dosificación y patrones que son seleccionados por los médicos que efectúan el tratamiento. Las formulaciones de dosificación adecuadas y los métodos de administración de los agentes son determinados fácilmente por aquellos expertos en la técnica. Preferentemente, los compuestos son administrados en una dosificación de aproximadamente 0.01 mg/kg hasta aproximadamente 200 mg/kg, más preferentemente de aproximadamente 0.1 mg/kg hasta aproximadamente 100 m / g, y aún más preferentemente de aproximadamente 0.5 mg/kg hasta aproximadamente 50 mg/kg. Cuando los compuestos aquí descritos son co-administrados con otro agente (por ejemplo, con agentes de sensibilización), la cantidad efectiva puede ser menor que cuando el agente es utilizado solo. Las composiciones farmacéuticas pueden ser administradas oralmente, intranasalmente, parenteralmente o por medio de terapias de inhalación, y pueden tomar la forma de tabletas, pildoras, gránulos, cápsulas, ampolletas, supositorios o aerosol. Ellas también pueden tomar la forma de suspensiones, soluciones y emulsiones del ingrediente activo en diluyentes acuosos o no acuosos, jarabes, granulados o polvos de un agente de la presente invención. Las composiciones farmacéuticas también pueden contener otros compuestos activos farmacéuticamente o una pluralidad dé compuestos de la presente invención. Más particularmente, un agente de la presente invención al que también nos referimos en esta descripción como el ingrediente activo, puede ser administrado para la terapia por cualquier ruta adecuada, incluyendo pero sin limitarse a, la ruta oral, rectal, nasal, tópica (incluyendo pero sin limitarse a, transdérmica, aerosol, bucal y sublingual), vaginal, parenteral (incluyendo pero sin limitarse a, subcutánea, intramuscular, intravenosa e intradérmica) y pulmonar. También deberá apreciarse que la ruta preferida varía en la condición y la edad del recipiente, y la enfermedad que está siendo tratada. De una manera ideal, el agente puede ser administrado para lograr concentraciones pico del ingrediente activo en los sitios de la enfermedad. Esto se puede lograr, por ejemplo, mediante la inyección intravenosa del agente, opcionalmente solución salina, o administrado oralmente, por ejemplo, en la forma de una tableta, cápsula o jarabe que contiene el ingrediente activo.

Los niveles en la sangre deseados del agente pueden ser mantenidos mediante una infusión continua para proporcionar una cantidad terapéutica del ingrediente activo dentro del tejido enfermo. El uso de combinaciones operativas está contemplado para proporcionar combinaciones terapéuticas que requieren una dosificación total más baja de cada componente de cada agente antiviral, componente que puede ser requerido cuando cada compuesto terapéutico individual o fármaco es utilizado solo, reduciendo de este modo los efectos adversos. D. Rutas de co-administración y consideraciones de dosificación La presente invención también incluye métodos que comprenden la co-administración de los compuestos aquí descritos con uno o más agentes activos adicionales. Indudablemente, un aspecto adicional de la presente invención es proporcionar métodos para mejorar las terapias de la técnica anterior y/o composiciones farmacéuticas mediante la co-administración de un compuesto de la presente invención. En los procedimientos de coadministración, los agentes pueden ser administrados concurrentemente o consecutivamente. En una modalidad, los compuestos aquí descritos son administrados antes que otros agentes activos. Las formulaciones farmacéuticas y los medios de administración pueden ser cualquiera de aquellos descritos anteriormente. Además, los dos o más agentes químicos co-administrados, agentes biológicos o de radiación, pueden ser administrados cada uno, utilizando modalidades diferentes o formulaciones diferentes. El agente o agentes que van a ser co-administrados dependen del tipo del padecimiento que está siendo tratado. Por ejemplo, cuando la condición que está siendo tratada es cáncer, el agente adicional puede ser un agente quimioterapéutico o radiación. Cuando la condición que está siendo tratada es una enfermedad autoinmunológica, el agente adicional puede ser un inmunosupresor o un agente anti-inflamatorio. Cuando el padecimiento que está siendo tratado es inflamación crónica, el agente adicional puede ser un agente anti-inflamatorio. Los agentes adicionales que van a ser co-administrados, tales como los compuestos anticáncer, inmunosupresores, anti-inflamatorios, puede ser cualquiera de los agentes bien conocidos en la técnica, incluyendo pero sin limitarse a, aquellos que están actualmente en uso clínico. La determinación del tipo apropiado de dosificación del tratamiento de radiación también se encuentra dentro del conocimiento de los expertos en la técnica o puede ser determinada con una facilidad relativa. El tratamiento de los diferentes padecimientos asociados con la apoptosis anormal, generalmente está limitado por los siguientes dos factores principales: (1) el desarrollo de resistencia a la droga y (2) la toxicidad de los agentes terapéuticos conocidos. Por ejemplo, se ha mostrado que en algunos cánceres, la resistencia a los químicos y la terapia de radiación, está asociadas con la inhibición de la apoptosis. Algunos agentes terapéuticos tienen efectos laterales dañinos, incluyen la linfotoxicidad no específica, la toxicidad renal y de la médula espinal. Los métodos aquí descritos solucionan ambos de estos problemas. La resistencia a los fármacos, en donde son requeridas dosificaciones crecientes para lograr el beneficio terapéutico, es superada mediante la co-administración de los compuestos aquí descritos con el agente conocido. Los compuestos aquí descritos parecen sensibilizar las células objetivo para los agentes conocidos (y viceversa), y por consiguiente, se necesita menos de estos agentes para lograr el beneficio terapéutico. La función de sensibilización de los compuestos reclamados también soluciona los problemas asociados con los efectos tóxicos de los terapéuticos conocidos. En los casos en donde el agente conocido es tóxico, es deseable limitar las dosificaciones administradas en todos los casos, y particularmente, en aquellos casos en donde se ha aumentado la resistencia a la dosis requerida del fármaco. Cuando los compuestos reclamados son co-administrados con agentes conocidos, ellos reducen la dosis requerida, la cual a la vez, reduce los efectos dañinos. Además, debido a que los compuestos reclamados son por ellos mismos, tanto efectivos como no tóxicos en dosis grandes, la co-administración más proporcional de estos compuestos que los agentes terapéuticos tóxicos conocidos lograrán los efectos deseados mientras que se minimizan los efectos tóxicos. VI. Selección de fármaco En las modalidades preferidas de la presente invención, los compuestos de la invención y otros compuestos potencialmente útiles, son seleccionados por su afinidad de enlace a la porción de la proteína que confiere la sensibilidad a la oligomicina (OSCP) del complejo de sintasa ATP mitocondrial. En las modalidades particularmente preferidas, los compuestos son seleccionados para utilizarlos en los métodos de la presente invención, midiendo su afinidad de enlace con la proteína OSCP recombinante. Son conocidas en la técnica un número de selecciones adecuadas para medir la afinidad de enlace en los fármacos y otras moléculas pequeñas a los receptores. En algunas modalidades, las selecciones de afinidad de enlace son realizadas en sistemas in vitro. En otras modalidades, estas selecciones se realizan en sistemas in vivo o ex vivo. Aunque en algunas modalidades la cuantificación del nivel intracelular del ATP después de la administración de los compuestos de la presente invención proporcionan la indicación de la eficacia de los métodos, las modalidades preferidas de la presente invención no requieren la cuantificación del nivel intracelular del ATP o el pH. Las modalidades adicionales están enfocadas a los niveles de medición (por ejemplo, intracelular) del superóxido en las células y/o tejidos para medir la efectividad de los métodos y compuestos particulares contemplados de la presente invención. En este aspecto, aquellos expertos en la técnica apreciarán y podrán proporcionar un número de ensayos y métodos útiles para medir los niveles de superóxido en las células y/o tejidos. En algunas modalidades, están contempladas metodologías de selección virtual basadas en la estructura para pronosticar la afinidad de enlace de los compuestos de la presente invención con el OSCP. Cualquier ensayo adecuado que permita la medición del límite de enlace o la afinidad de una benzodiazepina u otro compuesto con el OSCP puede ser utilizado. Los ejemplos incluyen, pero no están limitados a, el enlace de competencia utilizando Bz-423, la resonancia de plasma de superficie (SPR) y los ensayos de radio-inmunoprecipitación (Lowman et al., J. Biol. Chem. 266: página 10982 [991]). Las técnicas de resonancia de Plasmon de Superficie comprenden una superficie recubierta con una película delgada de un metal conductor, tal como oro, plata, cromo o aluminio en el cual las ondas electromagnéticas denominadas Plasmones de Superficie pueden ser inducidas por un rayo de luz incidente en la interfase de vidrio de metal en un ángulo específico denominado el ángulo de resonancia de Plasmón de Superficie. La regulación del índice refractivo de la región ínterfacial entre la solución y la superficie de metal después del enlace de las macromoléculas capturadas ocasiona un cambio en el ángulo SPR, el cual puede ser medido, ya sea directamente o el cual ocasiona que la cantidad de luz reflejada desde el lado inferior de la superficie de metal cambie. Dichos cambios pueden estar relacionados directamente con la masa u otras propiedades ópticas del enlace de las moléculas a la superficie del aparato SPR. Se han descrito varios sistemas de biosensores basados en dichos principios, (por ejemplo, ver el documento WO 90/05305). También existen varios biosensores SPR que se consiguen comercialmente (por ejemplo, BiaCore, Uppsala, Suecia). En algunas modalidades, los compuestos son seleccionados en cultivos celulares o in vivo (por ejemplo, mamíferos no humanos o humanos) por su capacidad para regular la actividad de la sintasa ATP mitocondrial. Se puede utilizar cualquier ensayo adecuado, incluyendo pero sin limitarse a ensayos de proliferación celular (que se consiguen comercialmente en Promega, Madison, Wl y Strangene, La Jolla, CA), y ensayos de dimerización, basados en las células (ver por ejemplo, la publicación de Fuh et al., en Science, 256: páginas 1677

[1992]; y la de Colosi et al., en J. Biol. Chem., 268: página 12617

[1993]. Los formatos de ensayos adicionales que encuentran uso con la' presente invención, incluyen pero no están limitados a, ensayos para medir el ATP celular y los niveles de superóxido celular. La presente invención también proporciona métodos para modificar y derivar las composiciones de la presente invención para aumentar las propiedades deseables (por ejemplo, la afinidad de enlace, actividad y similares) o para minimizar las propiedades no deseadas (por ejemplo, la reatividad no específica, toxicidad y similares). Los principios de la derivación clínica son bien entendidos. En algunas modalidades, se utilizan métodos de diseño iterativo y síntesis química para producir una librería de compuestos descendientes derivados de un compuesto de origen. En otras modalidades, se utilizan métodos de diseño racional para predecir y modelar las interacciones del receptor-ligando in silico antes de confirmar los resultados mediante la experimentación de rutina. VII. Aplicación Terapéutica A. Aplicación Terapéutica General En las modalidades particularmente preferidas, las composiciones (por ejemplo, derivados de benzodiazepina), de la presente invención proporcionan beneficios terapéuticos a pacientes que sufren de cualquiera o más de un número de padecimientos, (por ejemplo, enfermedades caracterizadas por la desregulación de los procesos de necrosis y/o apoptosis en una célula objetivo, enfermedades caracterizadas por el crecimiento aberrante de las células y/o la hiperproliferación, etc.), regulando (por ejemplo, inhibiendo o promoviendo) la actividad de los complejos de sintasa ATP mitocondrial (a la que nos referimos como la F0Fi ATPasa mitocondrial) en células y tejidos afectados. En modalidades adicionales preferidas, las composiciones de la presente invención son utilizadas para tratar condiciones inflamatorias crónicas/inmunológicas (por ejemplo, psoriasis). Aún en modalidades adicionales, las composiciones de la presente invención son utilizadas en conjunto con una terapia de estenosis para tratar los vasos comprometidos (por ejemplo, ocluidos). En modalidades particularmente preferidas, las composiciones de la presente invención inhiben la actividad del complejo de sintasa ATP mitocondrial enlazando una sub-unidad específica de este complejo de proteína de sub-unidades múltiples. Aunque la presente invención no está limitada a cualquier mecanismo particular, ni a cualquier entendimiento de la acción de los agentes que están siendo administrados, en algunas modalidades, las composiciones de la presente invención se enlazan a la porción de la proteína que confiere sensibilidad a la oligomicina (OSCP) del complejo de sintasa ATP mitocondrial. De un modo similar, además está contemplado que cuando las composiciones de la presente invención se enlazan al OSCP, el efecto inicial es la inhibición general del complejo de sintasa ATP mitocondrial, y que la consecuencia descendente del enlace es un cambio en el nivel de ATP o pH y la producción de las especies de oxígeno reactivo (por ejemplo, 02-). Todavía en otras modalidades preferidas, la presente invención no está limitada a mecanismo particular alguno, ni a entendimiento alguno de la acción de los agentes que están siendo administrados, está contemplado que la generación de radicales libres da como resultado final la exterminación de la célula. Todavía en otras modalidades, aunque la presente invención no está limitada a mecanismo particular alguno, ni a entendimiento alguno de la acción de los agentes que están siendo administrados, está contemplado que la inhibición del complejo de sintasa ATP mitocondrial utilizando las composiciones y métodos de la presente invención, proporciona la inhibición terapéuticamente útil de la proliferación células. Por consiguiente, los métodos preferidos incorporados en la presente invención, proporcionan beneficios terapéuticos a los pacientes, proporcionando compuestos de la presente invención que regulan (por ejemplo, inhibiendo o promoviendo) la actividad con los complejos de sintasa ATP mitocondrial en las células o tejidos afectados, mediante el enlace de la porción de proteína que confiere sensibilidad a la oligomicina (OSCP) del complejo de sintasa ATP mitocondrial. Es importante saber, que el OSCP por sí mismo no tiene actividad biológica. Por lo tanto, en un sentido amplio, las modalidades preferidas de la presente invención están enfocadas al descubrimiento de muchas enfermedades caracterizadas por la desregulación de los procesos de necrosis y/o apoptosis en una célula o tejido, o enfermedades caracterizadas por el crecimiento y/o proliferación aberrante de las células, etc., que pueden ser tratadas regulando la actividad del complejo de sintasa ATP mitocondrial incluyendo, pero sin limitarse a, mediante el enlace al componente de proteína que confiere sensibilidad a la oligomicina (OSCP) de las mismas. La presente invención no pretende estar limitada, sin embargo, a la práctica de las composiciones y métodos aquí descritos explícitamente. Indudablemente, aquellos expertos en la técnica apreciarán que el número de compuestos adicionales no mencionados específicamente en esta descripción (por ejemplo, derivados que no son de benzodiazepina) son adecuados para utilizarlos en los métodos aquí descritos de regulación de la actividad de la sintasa ATP mitocondrial. Por lo tanto, la presente invención contempla específicamente cualquier número de compuestos adecuados conocidos actualmente en la técnica, o que se desarrollarán en el futuro, que pueden encontrar uso opcionalmente en los métodos de la presente invención. Por ejemplo, los compuestos incluyen pero sin limitarse a, oligomicina, osamicina, citovaricina, apoptolidina, bafilomicina, resveratrol, piceatanol y diciclohexilcarboimida (DCCD) y similares, encuentran usos en los métodos de la presente invención. Sin embargo, la presente invención no pretende ser limitada a los métodos o compuestos especificados anteriormente. En una modalidad, los compuestos potencialmente útiles en la presente invención pueden ser seleccionados de aquellos adecuados como se describen en la literatura científica. (Ver por ejemplo, las publicaciones de K.B. Wallace y A. A. Starkov, en Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 40: páginas 353 a 388

[2000]; y A.R. Solomon et al., en Proc. Nat. Acad. Sci. E.U.A., 97(26): páginas 14766 a 14771

[2000]. En algunas modalidades, son seleccionados los compuestos potencialmente útiles en la presente invención contra las líneas celulares de cáncer (NCI-60) del Instituto Nacional de Cáncer para su eficacia. (Ver por ejemplo, las publicaciones de A. Monks et al., en J. Nati. Cancers Inst., 83: páginas 757 a 766

[1991]; y K.D. Paull et al., J. Nati. Cáncer Inst., 81: páginas 1088 a 1092

[1989]). Las selecciones adicionales seleccionan de manera adecuada (por ejemplo, modelos de enfermedad de auto-inmunidad, etc.) se encuentran dentro de las habilidades de la técnica. En un aspecto, los derivados (por ejemplo, sales, análogos, estereoisómeros farmacéuticamente aceptables y similares) de los compuestos de ejemplo u otros compuestos adecuados también están contemplados como útiles en los métodos de la presente invención. En otras modalidades preferidas, las composiciones de la presente invención son utilizadas en conjunto con terapia de estenosis para tratar vasos comprometidos (por ejemplo, ocluidos). En modalidades adicionales, las composiciones de la presente invención son utilizadas en conjunto con la terapia de estenosis para tratar los vasos cardíacos comprometidos. La estenosis de los vasos es un padecimiento que se desarrolla cuando un vaso llega a quedar estrechado (por ejemplo, la válvula de la aorta. Por ejemplo, la estenosis de la válvula de la aorta es un padecimiento del corazón que se desarrolla cuando la válvula entra en la cámara inferior izquierda (ventrículo izquierdo) del corazón y el vaso sanguíneo mayor denominado la arteria, llega a quedar estrechado. Este estrechamiento (por ejemplo, estenosis) crea un espacio demasiado pequeño para que la sangre fluya al cuerpo. Generalmente, el ventrículo izquierdo bombea sangre rica en oxígeno al cuerpo a través de la aorta, la cual se ramifica en un sistema de arterias en todo el cuerpo. Cuando el corazón bombea, las 3 aletas y las hojitas de la válvula de la aorta se abren, de modo que permiten que la sangre fluya desde el ventrículo dentro de la aorta. Entre los latidos del corazón, las aletas se cierran para formar un sello estrecho, de modo que la sangre no se filtre hacia atrás a través de la válvula. Si la válvula de la aorta está dañada, se llega a quedar más estrecha (estenosada), y el flujo de sangre puede ser reducido a órganos en el cuerpo, incluyendo el corazón mismo. La perspectiva de largo plazo para las personas con estenosis de válvula de la aorta es pobre una vez que los síntomas se desarrollan. Las personas con estenosis de la válvula de la aorta sin tratar que desarrollan síntomas de falla cardíaca generalmente tienen una expectativa de vida de 3 años o menos. Existen varios tipos de tratamiento para tratar las válvulas comprometidas (por ejemplo, la dilatación de balón, ablación, la aterectomía y el tratamiento por láser). Un tipo de tratamiento para los vasos cardíacos comprometidos es la angioplastía. La angioplastía comprende insertar un tubo con punta de balón o un catéter en una arteria angosta o bloqueada en un intento para abrirla. Inflando o desinflando el balón varias veces, los médicos generalmente pueden ensanchar la arteria. Una limitación común de la angioplastía o procedimientos de expansión de la válvula es la restenosis. La restenosis es el nuevo cierre de una arteria coronaria o periférica después del trauma de la arteria ocasionado por los esfuerzos para abrir la porción estenosada de la arteria, tal como por ejemplo, mediante la dilatación de balón, ablación, aterectomía o tratamiento por láser de la arteria. Para estos procedimientos de angioplastía, la restenosis ocurre en un índice de aproximadamente el 20% al 50%, dependiendo de la definición, la localización del vaso, la longitud de la lesión y un número de otras variables morfológicas y clínicas. Se considera que la restenosis es una reacción de curación natural para la lesión en la pared arterial que es ocasionada por los procedimientos de angioplastía. La reacción de curación comienza con el mecanismo trombótico en el sitio de la lesión. El resultado final de los pasos complejos del proceso de curación puede ser la hiperplasia íntima, la migración no controlada y la proliferación de las células del músculo liso medial, combinados con su producción de matriz extracelular, hasta que la arteria se vuelve a estenosar u ocluir. En un intento para prevenir la restenosis, se han implantado de manera permanente en los vasos coronarios o periféricos stents intravasculares metálicos. El stent es generalmente insertado por un catéter dentro del lumen vascular y se dice que se expande en contacto con la porción enferma de la pared arterial, proporcionando de este modo, un soporte mecánico para el lumen. Sin embargo, se ha descubierto que la restenosis todavía puede ocurrir con dichos stents en su lugar. También, el stent mismo puede ocasionar una trombosis local no deseada. Para resolver el problema de la trombosis, las personas que reciben los stents también reciben un tratamiento sistémico extenso con fármacos anticoagulantes y antiplaquetas. Para resolver el problema de la restenosis, se ha propuesto proporcionar stents que son sembrados en las células del endotelio (Dichek, D. A. et al, "Siembra de Stents Intravasculares en Células Endoteliales Diseñados Genéticamente" (Seeding of Intravascular Stents With Genetically Engineered Endothelial Cells); Circulation 1989; 80: páginas 1347 a 1353). En ese experimento, las células endoteliales de oveja que han pasado por la transferencia genética portada por el retrovirus para, ya sea la galactosidasa beta de las bacterias o el activador del plasminogen del tipo de tejido humano fueron sembrados en stents de acero inoxidable y se cultivaron hasta que los stents estaban cubiertos. Por lo tanto, las células podían ser administradas a la pared vascular en donde podrían proporcionar las proteínas terapéuticas. También han sido propuestos otros métodos para proporcionar substancias terapéuticas a la pared vascular por medio de los stents, tales como en la Solicitud de Patente Internacional WO 91/12779 "Prótesis Intraluminal que Eluye el Fármaco" y la Solicitud de Patente Internacional WO 90/13332 "Stent con Administración Sostenida del Fármaco". En esas solicitudes se sugirió que se podrían suministrar agentes antiplaquetas, agentes anticoagulantes, agentes antimicrobianos, agentes anti-inflamatorios, agentes antimetabólicos y otros fármacos de los stents para reducir la incidencia de la restenosis. Además, también se podrían utilizar otros agentes vaso-reactivos, tales como agentes de liberación de óxido nítrico. Una causa adicional de la restenosis es la sobreproliferación del tejido tratado. En las modalidades preferidas, las propiedades antiproliferativas de la presente invención inhiben la restenosis. Los stents que eluyen el fármaco son bien conocidos en la técnica (ver por ejemplo, la Patenten Norteamericana No. 5,697,967; la Patente Norteamericana No. 5,599,352; y la Patente Norteamericana No. 5,591,227; están incorporadas cada una de ellas a la presente descripción como referencia). En las modalidades preferidas, las composiciones de la presente invención son eluídas de los stents que eluyen el fármaco en el tratamiento de los vasos comprometidos (por ejemplo, ocluidos). En modalidades adicionales, las composiciones de la presente invención son eluídas de los stents que eluyen el fármaco en el tratamiento de los vasos cardíacos comprometidos. Aquellos expertos en la técnica de la preparación de compuestos y formulaciones farmacéuticas apreciarán que cuando se seleccionan compuestos opcionales para utilizarlos en los métodos aquí descritos, las condiciones de adaptabilidad incluyen, pero no están limitadas a, la toxicidad, seguridad, eficacia, disponibilidad y costo de los compuestos particulares. B. Aplicación Terapéutica para Enfermedades Autoinmunológicas y ia Enfermedad Inflamatoria Crónica Las enfermedades autoinmunológicas y las enfermedades inflamatorias crónicas con frecuencia son el resultado de la regulación disfuncional de la proliferación celular y/o la regulación de la apoptosis celular. La mitocondria realiza un papel clave en el control y ejecución de la apoptosis celular. El poro de transición de permeabilidad mitocondrial (MPTP) es un poro que expande las membranas mitocondriales interiores y exteriores y funcionan en la regulación de partículas proapoptóticas. La abertura transitoria del MPTP da como resultado la liberación del citocroma c y el factor que induce la apoptosis del espacio intermembrana mitocondrial, dando como resultado la apoptosis celular. 153 La proteína que confiere sensibilidad a la oligomicina (OSCP) es una subunidad de la F0Fi sintasa ATP mitocondrial/ATPasa y las funciones en el acoplamiento del gradiente de protones en el sector F0 de la enzima en la membrana mitocondrial. En modalidades preferidas, los compuestos de la presente invención se enlazan al OSCP, aumentan los niveles de superóxido y citocroma c, aumentan la apoptosis celular, e inhiben una proliferación celular. El translocalizador del nucleótido de adenina (ANT) es una proteína de 30kDa que expande la membrana mitocondrial interior y es central para el poro de transición de permeabilidad mitocondrial (MPTP). La oxidación del tiol o los agentes de alquilación son activadores poderosos del MPTP que actúan modificando una o más de las tres cisteinas que no están acopladas al lado de la matriz del ANT. 4-(N-(S-glutationilacetil)amino) fenilarsenóxido, 154 inhibe el ANT. Los compuestos y métodos de la presente invención son útiles en el tratamiento de las enfermedades autoinmunológicas y las enfermedades inflamatorias crónicas. En dichas modalidades, la presente invención proporciona a un sujeto que sufre de una enfermedad autoinmunologica y/o una enfermedad inflamatoria crónica, y una composición que comprende la siguiente fórmula: 155 en donde R-?, R2, R3, y R4 son seleccionados del grupo consistente de: hidrógeno; CH3; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y que tiene por lo menos un subgrupo hidroxi; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo tiol; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, en donde la cadena alifática termina con un subgrupo aldehido; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por io menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo cetona; una cadena alifática saturada o insaturada, 156 recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono; en donde la cadena alifática termina con un subgrupo de ácido carboxílico; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo amida; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un grupo acilo; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos una porción que contiene nitrógeno (por ejemplo, nitro, nitriio, etc.); una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo amina; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo éter; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo halógeno; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo nitronio; en donde R5 es seleccionado del grupo consistente de: OH; N02; NR'; OR'; en donde R' es seleccionado del grupo consistente de: una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos un 157 átomo de carbono; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo hidroxilo; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo tiol; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, en donde la cadena alifática termina con un subgrupo aldehido; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo cetona; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono; en donde la cadena alifática termina con un subgrupo de ácido carboxilico; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo amida; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un grupo acilo; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos una porción que contiene nitrógeno (por ejemplo, nitro, nitrilo, etc.); una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos 158 un subgrupo amina; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo halógeno; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo nitronio; en donde R6 es seleccionado del grupo consistente de: Hidrógeno; N02; Cl; F; Br; I; SR1; y NR'2; en donde R' es definido, tal y como se describió anteriormente en R5; en donde R7 es seleccionado del grupo consistente de: Hidrógeno; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono; y en donde R8 es un grupo cíclico alifático más grande que benceno; en donde dicho grupo más grande que benceno comprende cualquier grupo químico que contiene 7 o más átomos que no son de hidrógeno, y es un grupo arilo o cíclico alifático. En algunas modalidades, R' es un grupo funcional que protege el oxígeno de R5 del metabolismo in vivo, hasta que el compuesto alcanza su objetivo biológico (por ejemplo, la mitocondria). En algunas modalidades, el grupo protector R' es metabolizado en el sitio objetivo, convirtiendo R5 en un grupo hidroxilo. VIII. Inhibidores de ATPasa Y Métodos Para Identificar Inhibidores Terapéuticos La presente invención proporciona compuestos que 159 tienen como objetivo la F-iF0-ATPasa. Además, la presente invención proporciona compuestos que tienen como objetivo la F-iFo-ATPasa como un tratamiento para las enfermedades inmunológicas, y en particular, compuestos con baja toxicidad. La presente invención además proporciona métodos para identificar compuestos que tienen como objetivo la F^o-ATPasa. Adicionalmente, la presente invención proporciona aplicaciones terapéuticas para compuestos que tienen como objetivo la FíFo-ATPasa. La mayor parte del ATP dentro de las células eucarióticas es sintetizado mediante la FiF0-ATPasa mitocondrial (ver por ejemplo, las publicaciones de C.T. Gregory et al., en J. Immunol., 139: páginas 313 a 318

[1987]; J. P. Portanova et al., Mol. Immunol., 32: páginas 117 a 135

[1987]; M. J. Shlomchik et al., Nat Rev. Immunol., 1: páginas 147 a 153

[2001]; cada una de ellas incorporada en su totalidad a la presente descripción como referencia). Aunque la FíFo-ATPasa sintetiza e hidroliza el ATP, durante las condiciones fisiológicas normales, la FiF0-ATPasa solamente sintetiza el ATP (ver por ejemplo, la publicación de Nagyvary J, et al., en Biochem. Educ. 1999; 27: páginas 193 a 199; incorporada en su totalidad a la presente descripción como referencia). La F-iF0-ATPasa está compuesta de tres dominios principales: F0, F-¡ y el estator periférico. El Fi es una porción de la enzima que contiene los sitios catalíticos y 160 que está localizada en la matriz (ver por ejemplo, la publicación de Boyer, PD, en Annu Rev Biochem. 1997; 66: páginas 717 a 749; incorporada en su totalidad a la presente descripción como referencia). Este dominio es altamente conservado y tiene la composición de la subunidad a3ß3?de. La marca de la estructura de rayos-X del Ft bovino reveló que la a3ß3 forma un cilindro hexagonal y que la subunidad ? se encuentra en el centro del cilindro. La F0 está localizada dentro de la membrana interior mitocondrial y contiene un canal de protones. La translocalización de ios protones del espacio de la membrana interior dentro de la matriz proporciona la energía para realizar la síntesis del ATP. El estator periférico está compuesto de varias proteínas que física y f uncionalmente se enlaza el F0 con el F-i. El estator transmite cambios de conformación de F0 en el dominio catalítico que regula la síntesis del ATP (ver por ejemplo, Cross RL, Biochim Biophys Acta 2000; 1458: páginas 270 a 275; incorporada en su totalidad en la presente descripción como referencia). Los inhibidores de FiF0-ATPasa mitocondrial son herramientas invaluables para el estudio mecánico de la FiF0-ATPasa (ver por ejemplo, la publicación de James AM, et al., en J Biomed Sci 2002; 9: páginas 475 a 487; incorporada en su totalidad a la presente descripción como referencia). Debido que los inhibidores de FiFo-ATPasa con frecuencia 161 son citotóxicos, ellos han sido explorados como fármacos para el cáncer y otras enfermedades hiperproliferativas. Los macrólidos (por ejemplo, oligomicina y apoptolidina) son inhibidores no competitivos de la FiF0-ATPasa (ver por ejemplo, las publicaciones de Salomón AR, et al., en PNAS 2000; 97: páginas 14766 a 14771; Salomón AR, et al., Chem Biol 2001; 8: páginas 71 a 80; incorporados en su totalidad a la presente descripción como referencia). Los macrólidos se enlazan al F0 el cual bloquea el flujo de protones a través del canal resultante en la inhibición de la F^o-ATPasa. Los macrólidos son potentes (por ejemplo, el IC50 de la oligomicina = 10n ) y conducen a disminuciones grandes en [ATP]. Como tales, los macrólidos tienen un índice terapéutico inaceptablemente estrecho, y son altamente tóxicos (por ejemplo, el LD50 de la oligomicina en los roedores es de dos dosis diarias de 0.5 mg/kg) (ver por ejemplo, la publicación de Kramar R, et al., en Agents & Actions 1984, .15: páginas 660 a 663; incorporadas en su totalidad a la presente descripción como referencia). Otros inhibidores de FíFo-ATPasa incluyen el Bz-423, el cual se enlaza al OSCP en Fi (como se describió anteriormente). El Bz-423 tiene un K¡ ~9 µ?. En las células que están respirando activamente (conocidas como condición de respiración 3), la inhibición de la FnFo-ATPasa bloquea la respiración y coloca la mitocondria 162 en una condición de reposo (conocida como la condición 4). En la condición 4, el MRC es reducido en relación con la condición 3, lo cual favorece la reducción de 02 a 02" en el complejo III (ver por ejemplo, la publicación de N. Zamzami et al., en J. Exp. Med., 181: páginas 1661 a 1672

[1995]; incorporadas en su totalidad a la presente descripción como referencia). Por ejemplo, tratando las células, ya sea con oligomicina o con Bz-423 nos conduce a una elevación de 02" intracelular como una consecuencia de la inhibición del complejo V. En el caso de la oligomicina, las células suplementadas con ATP se protegen contra la muerte mientras que los antioxidantes no lo hacen, indicando que la muerte de las células es el resultado de la caída en el ATP. (ver por ejemplo, las publicaciones de Zhang JG, et al., en Arch Biochem Biophys 2001; 393: páginas 87 a 96; cConkey DJ, et al. El cambio del ATP en la apoptosis. En: Nieminen La, ed. Mitochondria in pathogenesis. New York: Plenum, 2001: páginas 265 a 277; cada una de ellas incorporadas en su totalidad como referencia a la presente descripción). La muerte celular inducida por Bz-423 es bloqueada por los antioxidantes y no afectada por la suplementación de las células con ATP, indicando que el Bz-423 se engancha a la respuesta de la muerte dependiente del ROS (ver por ejemplo, la publicación de N. B. Blatt, et al., en J. Clin. Invest., 2002, 110, página 1123; incorporada en su totalidad a 163 la presente descripción como referencia). Como tales, los inhibidores de F-iFo-ATPasa son ya sea tóxicos ( por ejemplo, oligomicina) o terapéuticos (por ejemplo, Bz-423). La presente invención proporciona un método para distinguir los inhibidores tóxicos de F-|F0-ATPasa de los inhibidores de FíFo-ATPasa terapéuticos. Los inhibidores de FiF0-ATPasa con potencial terapéutico (por ejemplo, el Bz-423) presentan un modo novedoso de inhibición. Específicamente los inhibidores de F^o-ATPasa con propiedades benéficas, tales como el Bz-423 son inhibidores no competitivos que solamente se enlazan a los complejos de substrato de enzimas en concentraciones altas del substrato y no alteran la proporción kcat/ m. Este conocimiento forma la base para identificar y distinguir los inhibidores de F^Fo-ATPasa con potencial terapéutico de los compuestos tóxicos.

La presente invención proporciona compuestos que se envían a la FiF0-ATPasa como un tratamiento para la enfermedad autoinmunológica. En particular, la presente invención proporciona métodos para identificar compuestos que se envían a la F-|F0-ATPasa mientras que no alteren la proporción kCat/K,n. Adicionalmente, la presente invención proporciona aplicaciones terapéuticas para los compuestos que se envían a la FiFo-ATPasa. A. Compuestos que Inhiben la ATPasa La presente invención proporciona compuestos que 164 inhiben la F-f F0-ATPasa. En algunas modalidades, los compuestos que no se enlazan a la F^o-ATPasa libre, sino más bien se enlazan a un complejo del substrato F^o-ATPasa. Los compuestos muestran una actividad máxima en concentración alta del substrato y una actividad mínima (por ejemplo, inhibiendo la FTFo-ATPasa) en una concentración baja del substrato. En las modalidades preferidas, los compuestos no alteran la proporción kcat/ m de la F1F0-ATPasa. Las propiedades de los inhibidores de F-|F0-ATPasa de la presente invención se encuentran en contraste con la oligomicina, la cual es un inhibidor de FiF0-ATPasa que es agudamente tóxico y letal. La oligomicina es un inhibidor no competitivo, el cual se enlaza tanto a la F^o-ATPasa libre como a los complejos de substrato de FiFo-ATPasa y alteran la proporción kcat/ m. Los compuestos de la presente invención que inhiben la F^o-ATPasa mientras no alteran la proporción kcat m, en algunas modalidades, tienen una estructura anteriormente descrita. Sin embargo, los compuestos de otras estructuras que son identificados como inhibidores terapéuticos por los métodos de la presente invención, también están comprendidos en la misma. B. Identificación de Inhibidores de ATPasa La presente invención proporciona métodos de identificación (por ejemplo, selección) de compuestos útiles 165 en el tratamiento de enfermedades autoinmunológicas. La presente invención no está limitada a un tipo de compuesto particular. En modalidades preferidas, los compuestos de la presente invención incluyen, pero no están limitados a, composiciones farmacéuticas, moléculas pequeñas, anticuerpos, moléculas grandes, moléculas sintéticas, polipéptidos sintéticos, polinucleótidos sintéticos, ácidos nucleicos sintéticos, aptámeros, polipéptidos, ácidos nucleicos y polinucleótidos. La presente invención no está limitada a un método particular de identificación de compuestos útiles en el tratamiento de enfermedades autoinmunológicas. En las modalidades de la presente invención, los compuestos útiles para el tratamiento de enfermedades autoinmunológicas son identificados como que poseen una capacidad para inhibir una FiFo-ATPasa mientras no alteran la proporción kcat/Km. C. Aplicaciones Terapéuticas con Inhibidores de FiF0-ATPasa La presente invención proporciona métodos de tratamiento de enfermedades (por ejemplo, enfermedades neurodegenerativas, enfermedad de Alzheimer, la lesión por la reprofusión de la isquemia, enfermedades neuromotoras, linfoma que no es de Hodgkin, leucemia linfocítica, leucemia de la célula T cutánea, una enfermedad autoinmunológica, cáncer, tumores sólidos, linfomas y leucemias). La presente 166 invención no está limitada a una forma de tratamiento particular. En las modalidades preferidas, el tratamiento incluye, pero no está limitado a, el alivio de los síntomas, la prevención de síntomas, la prevención de la enfermedad y el alivio de la enfermedad. La presente invención proporciona métodos de tratamiento de enfermedades autoinmunológicas que se pueden aplicar dentro de establecimientos in vivo, in vi tro, y/o ex vivo. En algunas modalidades, la presente invención trata las enfermedades autoinmunológicas a través de la inhibición de las células objetivo. La presente invención no está limitada a una forma particular de inhibición celular. En las modalidades preferidas, la inhibición celular incluye, pero no está limitada a, la prevención de crecimiento celular, la prevención de la proliferación celular y la muerte celular. En modalidades preferidas, la inhibición de una célula objetivo se realiza a través de poner en contacto la célula objetivo con un inhibidor de FiF0-ATPasa de la presente invención. En modalidades adicionales, la inhibición de la célula objetivo es realizada a través del envío al objetivo de la FiF0-ATPasa con un inhibidor de F-|F0-ATPasa de la presente invención. La presente invención no está limitada a un inhibidor particular de F^o-ATPasa. En modalidades preferidas, el inhibidor de F-iFo-ATPasa posee la capacidad de inhibir una F-|F0-ATPasa mientras que no altera la proporción kCat/ m. En modalidades 167 preferidas adicionales, el inhibidor de F-]F0-ATPasa es Bz-423 u otro compuesto aquí descrito. La presente invención proporciona además métodos para inhibir selectivamente la patología de las células objetivo en un sujeto que necesita la terapia. La presente invención no está limitada a un método particular de inhibición de la patología de la célula objetivo. En modalidades preferidas, la patología de la célula objetivo es inhibida a través de la administración de una cantidad efectiva de un compuesto de la presente invención. La presente invención no está limitada a un compuesto particular. En modalidades preferidas, el compuesto es un inhibidor de F-iF0-ATPasa. En modalidades preferidas adicionales, el compuesto inhibe la FiFo-ATPasa mientras que no altera la proporción koat/ m. EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se proporcionan para demostrar e ilustrar adicionalmente ciertas modalidades preferidas de la presente invención y no deberán ser interpretados como que limitan el alcance de la misma. Ejemplo 1 Preparación de Compuestos Los compuestos de benzodiazepina son preparados utilizando, ya sea los métodos sintéticos de combinación de fase soluble o fase sólida, así como en una base individual a partir de técnicas bien establecidas. Ver por ejemplo, las 168 publicaciones de Boojamra, C.G. et al., (1996); Bunin, B.A. et al., (1994); Stevens, S.Y. et al., (1996); Gordon, E.M. et al., (1994); y las Patentes Norteamericanas Nos. 4,110,337 y 4,076,823, los cuales están incorporados todos a la presente descripción como referencia. Las siguientes metodologías generales se proporcionan para ilustración. Preparación de compuestos de 1 ,4-benzodiazepina-2- ona Los métodos sintéticos de fase sólida mejorados para la preparación de una variedad de derivados de 1,4-benzodiazepina-2-ona con rendimientos generales muy altos han sido reportados en la literatura, (ver por ejemplo, la publicación de Bunin y Ellman, en J. Am. Chem. Soc, 114: páginas 10997 a 10998

[1992]). Utilizando estos métodos mejorados, la 1 ,4-benzodiazepina-2-ona es construida en un soporte sólido a partir de tres componentes separados: 2-aminobenzofenonas, a-aminoácidos y (opcionalmente) agentes de alquilación. Las 2-aminobenzofenonas preferidas incluyen las 2-aminobenzofenonas substituidas, por ejemplo, 2-aminobenzofenonas substituidas hidroxi-halo, y halo-, hidroxi-tales como 4-halo-4'-hidroxi-2-aminobenzofenonas. Una 2-aminobenzofenona substituida preferida es 4-cloro-4'-hidroxi-2-aminobenzofenona. Los a-aminoácidos preferidos incluyen los 20 a-aminoácidos comunes que ocurren de manera 169 natural, así como estructuras que limitan los a-aminoácidos, tales como omofenilalanina, homotirosina y tiroxina. Los agentes de alquilación incluyen tanto electrófilos activados como desactivados, de los cuales una amplia variedad son bien conocidos en la técnica. Los agentes de alquilación preferidos incluyen los electrófilos activados de p-bromobencil bromuro y t-butil-bromoacetato. En el primer paso de dicha síntesis, el derivado de 2-aminobenzofenona es adherido a un soporte sólido, tal como un soporte sólido de poliestireno, a través de, ya sea el grupo funcional hidroxi o ácido carboxílico, utilizando métodos bien conocidos y empleando un enlazador de disociación de ácido, tal como el que se consigue comercialmente como ácido [4-(hidroximetil)fenoxi]acético, para producir las 2-aminobenzofenona soportadas. (ver por ejemplo, la publicación de Sheppard y Willians, en Intl. J. Peptide Protein Res., 20: páginas 451 a 454

[1982]). El grupo 2-amino de las aminobenzofenonas de preferencia es protegido antes de la reacción con un reactivo de enlace, por ejemplo, mediante la reacción con FMOC-CI (9-fluorenilmetil cloroformato) para producir el grupo amino 2'-NHFMOC protegido. En el segundo paso, el grupo 2-amino protegido es desprotegido (por ejemplo, el grupo -NHFMOC puede ser desprotegido mediante el tratamiento con piperidina en dimetilformamida (DMF) y la 2-aminobenzofenona 170 desprotegida es acoplada entonces por medio de un enlace amida a un a-aminoácido (el grupo amino del cual ha sido protegido por el mismo, por ejemplo, como un grupo NHFMOC) para producir el intermediario. Se utilizan métodos estándar de activación utilizados para la síntesis de péptido de fase sólida (tales como el uso de carboiimidas e hidroxibenzotriazol o ásteres activos de pentafluorofenilo) para facilitar el acoplamiento. Sin embargo, el método de activación preferido emplea el tratamiento de la 2-aminobenzofenona con una solución de cloruro de metileno del fluoruro de aminoácido a-?-FMOC en la presencia del limpiador de ácido de 4-metil-2,6-di-ter-butilpiridina que produce el acoplamiento completo por medio de un enlace amida. Se ha descubierto que el método preferido de acoplamiento es efectivo aún para derivados de aminobenzofenona no reactivos produciendo esencialmente el acoplamiento completo para los derivados que poseen, tanto substituyentes de desactivación 4-cloro, como 3-carboxi. En el tercer paso, el grupo amino protegido (el cual se originó con el aminoácido) es el primero que se desprotege (por ejemplo, el -NHFMOC puede ser convertido en -NH2 con piperidina en DMF) y los Bz-423s desprotegidos se hacen reaccionar con ácido, por ejemplo, ácido acético al 5% en DMF a una temperatura de 60°C, para producir el derivado soportado de 1 ,4-benzodiazepina. Se ha reportado el ciclo 171 completo utilizando este método para una variedad de derivados de 2-aminobenzofenona con propiedades electrónicas y estéricas que difieren ampliamente. En un cuarto paso opcional, el derivado de 1,4-benzodiazepina es alquilado mediante la reacción con un agente de alquilación adecuado y una base, para producir la ,4-benzodiazepina completamente derivada soportada. Los métodos de alquilación estándar, por ejemplo, se utiliza un exceso de base fuerte tal como LDA (litio diisopropilamida) o NaH, sin embargo, dichos métodos pueden resultar en una desprotonación no deseada de otras funcionalidades ácidas y la sobrealquilacion. Las bases preferidas, las cuales pueden evitar la sobrealquilacion de los derivados de benzodiazepina (por ejemplo, aquellas con funcionalidades éster y carbamato), son aquellas las cuales son lo suficientemente básicas para desprotonar completamente el grupo funcional aniluro, pero no lo suficientemente básicas para desprotonar los grupos funcionales amida, carbamato o éster. Un ejemplo de dicha base es 5-(feniImetil)-2-oxaxolidinona litiada, la cual se hace reaccionar con la 1 ,4-benzodiazepina en tetrahidrofurano (THF) a una temperatura de -78°C. Después de la desprotonación, se agrega un agente de alquilación adecuado, tal y como se describió anteriormente. En el paso final, la 1,4 benzodiazepina completamente derivada es disociada del soporte sólido. Esto es logrado 172 (junto con la remoción concomitante de los grupos protectores lábiles al ácido), por ejemplo, mediante la exposición a un ácido adecuado, tal como una mezcla de ácido trifluoroacético, agua y dimetilsulfóxido (85:5:10, en volumen). Alternativamente, las benzodiazepinas anteriores son preparadas en una fase soluble. La metodología sintética fue subrayada por Gordon et al., en J. ed. Chem., 37: páginas 1386 a 1401

[1994]), la cual está incorporada a la presente descripción como referencia. Brevemente la metodología comprende la trans-imidación de la resina de aminoácido con ¡minas de 2-aminobenzofenona substituidas apropiadamente para formar ¡minas enlazadas a resina. Estas ¡minas son cicladas y atadas mediante procedimientos similares a aquellos de la síntesis de fase sólida descritos anteriormente. La pureza general de las benzodiazepinas preparadas utilizando la metodología anterior es de aproximadamente el 90% o más alta. Preparación de 1 ,4-benzodiazepina-2,5-dionas Ha sido reportado detalladamente un método general para la síntesis de fase sólida de las 1 ,4-benzodiazepina-2,5-dionas C.J. Boojamra et al., en J. Org. Chem., 62: páginas 1240 a 1256

[1996]). Este método es utilizado para preparar los compuestos de la presente invención. Por ejemplo, una resina errifield, un (clorometil) poliestireno es derivado mediante la alquilación con sodio de 173 4-hidroxi-2,6-dimetoxibenzaIdehído para producir un aldehido enlazado a la resina. Entonces se enlaza un éster a-amino al soporte derivado mediante aminación reductiva utilizando NaBH(OAc)3 en 1% de ácido acético en DMF. Esta aminación reductiva da como resultado la formación de la amina secundaria enlazada a la resina. La amina secundaria es acilada con una amplia variedad de ácidos antranílicos desprotegidos que dan como resultado una amina terciaria enlazadas al soporte. La acilación se logra mejor realizando la reacción de acoplamiento en la presencia de una carbodiimida y la sal de clorhidrato de una amina terciaria. Un buen agente de acoplamiento es el clorhidrato de 1 -etil-8-[8-(dimetilamino)propil] carbodiimida. La reacción generalmente se realiza en la presencia de 1-metil-2-pirrolidinona anhidra. Los procedimientos de acoplamiento son repetidos generalmente una vez más para asegurar la acilación completa. El ciclado del derivado acilo es realizado a través de la lactamación catalizada por la base a través de la formación del anión de aniluro, el cual reaccionaría con un alquilhaluro para la introducción simultánea del substituyente en la posición- en el nitrógeno del anillo heterocíclico de la benzodiazepina. La sal de litio de acetaniluro es una buena base para catalizar la reacción. Por lo tanto, los Bz-423s se hacen reaccionar con acetaniluro de litio en DMF/THF (1:1) 174 durante 30 horas seguido por la reacción con un agente de alquilación apropiado que proporciona la benzodiazepina enlazada al soporte completamente derivada. Los compuestos son disociados del soporte en un buen rendimiento y alta pureza utilizando TFA/DMS/H20 (90:5:5). Algunos ejemplos de los materiales de partida del éster a-amino, agentes de alquilación y derivados de ácido antranílico que son utilizados en la presente invención se encuentran en la lista de Boojamra (1996), mencionado anteriormente, en el 1246. Los reactivos adicionales son fácilmente determinados y ya sea que se obtienen comercialmente, o se preparan fácilmente por un experto en la técnica para llegar a los substituyentes novedosos descritos en la presente invención. Por ejemplo, a partir de la publicación Boojamra, mencionado anteriormente, se da uno cuenta que: los agentes de alquilación proporcionan los substituyentes los materiales de partida de éster a-amino proporcionan los substituyentes R2, y el ácido antranílico proporciona los substituyentes R4. Utilizando estos materiales de partida que son substituidos de manera correcta, se llega a la 1,4-benzodiazepina-2,5-diona deseada. El substituyente R3 es obtenido mediante la substitución apropiada de la amina del material de partida de éster a-amino. Sí se llega a convertir en problema la población estérica, el substituyente R3 es 175 enlazado a través de métodos convencionales después de que es aislada la 1 ,4-benzodiazepina-2,5-diona. Ejemplo 2 Quiralidad Deberá reconocerse que muchas de las benzodiazepinas de la presente invención existen como isómeros ópticos debido a la quiralidad en donde el estereocentro es introducido por el a-aminoácido y sus materiales de partida éster. El procedimiento general descrito anteriormente conserva la quiralidad del a-aminoácido o los materiales de partida éster. En muchos casos, es deseable dicha conservación de la quiralidad. Sin embargo, cuando el isómero óptico deseado del a-aminoácido del material de partida no está disponible o es costoso, se produce la mezcla racémica la cual es separada en isómeros ópticos correspondientes y el enantiómero de benzodiazepina deseado es aislado. Por ejemplo, en el caso de los compuestos 2,5-diona, Boojamra, mencionado anteriormente, describe que la racemización completa es lograda mediante el equilibrio previo de la sal de clorhidrato del material de partida de éster a-amino enantioméricamente puro con 0.3 equivalentes de i-Pr2EtN y el aldehido enlazado a la resina durante 6 horas antes de la adición de NaBH(OAc)3. El resto del procedimiento descrito anteriormente descrito sigue siendo el 176 mismo. Se emplearon pasos similares, de ser necesarios, también en el caso de los compuestos 1 ,4-benzodiazepina-2-diona. Los métodos para preparar las benzodiazepinas individuales son bien conocidos en la técnica (Ver por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 3,415,814; 3,384,635; y 3,261,828, las cuales están incorporadas a la presente descripción como referencia), seleccionando de manera apropiada los materiales de partida substituidos y cualquiera de los métodos descritos anteriormente, se preparan con relativa facilidad las benzodiazepinas de la presente invención. Ejemplo 3 Reactivos El Bz-423 es sintetizado tal y como se describió anteriormente. El FK506 obtenido de Fujisawa (Osaka, Japón). El A/-benzoilcarbonil-Val-Ala-Asp-fluorometilcetona (z-VAD) es obtenido en Enzyme Systems (Livermore, CA). El dihidroetidio (DHE) y el yoduro de 3,3'-dihexiloxacarbocianina (DiOCe(3)) son obtenidos en Molecular Probes (Eugene, OR). El FAM-VAD-fmk es obtenido en Intergen (Purchase, NJ). El manganeso (III) meso-tetrakis(4-ácido benzoico)porfirin (MnTBAP) es comprado en Alexis Biochemicals (San Diego, CA). Las benzodiazepinas son sintetizadas tal y como se describieron (Ver la publicación en B.A. Bunin et al., en Proc. 177 Nati. Acad. Sci. E.U.A., 91: páginas 4708-4712

[1994]). Los otros reactivos fueron obtenidos en Sigma (St. Louis, MO). Ejemplo 4 Animales y administración de fármacos Los ratones hembra NZB/W (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) son distribuidos de manera aleatoria en grupos de tratamiento y control. Los ratones de control reciben vehículo (50 pL de DMSO acuoso) y los ratones de tratamiento reciben Bz-423 disuelto en vehículo (60 mg/kg) a través de inyecciones intraperitoneales. La sangre periférica es obtenida de las venas de la cola para la preparación del suero. Las muestras del bazo y el riñon son conservadas, ya sea en formalina regulada al 10% mediante la congelación en OCT. Una sección adicional del bazo de cada animal es reservada para la preparación de suspensiones de células simples. Ejemplo 5 Esplenocitos, líneas celulares y condiciones principales de los cultivos Los esplenocitos principales son obtenidos de los ratones de 6 meses de edad mediante la interrupción mecánica de los bazos con lisis isotónica de células de glóbulos rojos. Las fracciones ricas en célula B son preparadas mediante la selección negativa utilizando la clasificación magnética de células, microcuentas recubiertas 178 con CD4, CD8a y CD11b (Miltenyi Biotec, Auburn, California). La línea de Ramos es comprada de ATCC (Monassis, Georgia). Las células son mantenidas en RPMI y suplementado con suero fetal bovino inactivado con calor al 10% (FBS), penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 pg/ml) y L-glutamina (290 pg/ml). Los medios de las células primarias también contienen 2-mercaptoetanol (50 µ?). Todos los estudios in vivo son realizados con D SO al 0.5% y FBS al 2%. Los experimentos in vitro son realizados en medios que contienen FBS al 2%. Los compuestos orgánicos son disueltos en medios que contienen DMSO al 0.5%. Ejemplo 6 Histología Las secciones de riñon fijadas con formalina fueron teñidas con hematoxilina y eosina (H&E) y la deposición del complejo inmunológico glomerular es detectado mediante la inmunofluorescencia directa utilizando el tejido congelado teñido con IgG anti-ratón cabra conjugado con FITC (Southern Biotechnology, Birmingham, AL). Las secciones son analizadas de un modo ciego por nefritis y la deposición de IgG utilizando una escala de 0-4+. El grado de hiperplasia linfoide es calificada en una escala de 0-4+ utilizando secciones del bazo teñidas con H&E. Para utilizar las células B, las secciones son teñidas con anti-B220-biotinilado (Pharmingen; 1 pg/mL) seguido por estreptavidina-Alexa 594 179 (Molecular Probes; 5 pg/mL). Las secciones del bazo congeladas son analizadas con las células positivas TUNEL utilizando un equipo de Detección de Muerte Celular in situ (Roche) y son evaluadas utilizando una escala 0-4+. Ejemplo 7 Tinción de TUNEL Las secciones del bazo congeladas son analizadas utilizando el equipo de Detección de Muerte Celular In situ (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN). Las secciones son evaluadas de manera ciega y asignadas y se les asigna una calificación (0-4 + ) en base a la cantidad de tinción positiva de TUNEL. Las células B son identificadas tiñéndolas con anti-B220-biotinilado (Pharmingen, San Diego, CA; 1 pg/mL, 1 hora, a 22°C) seguido por estreptavidina-Alexa 594 (Molecular Probes, Eugene, Oregon; 5 pg/mL, 1 hora, 22°C). Ejemplo 8 Análisis de flujo citométrico de células del bazo de los animales tratados Los marcadores de superficie son detectados (15 m, 4°C) con anti-Thi 1.2 conjugado-fluorescente (Pharmingen, 1 pg/mL) y/o anti-B220 (Pharmingen, 1 pg/mL). Para detectar la serina fosfatidilo de la membrana exterior, las células son incubadas con Annexina V conjugada con FITC y yoduro de propidio (Pl) de acuerdo con los protocolos del fabricante 180 (Roche Molecular Biochemicals). La detección de las células positivas de TUNEL mediante la citometría de flujo utilizan el equipo APO-BRDU (Pharmingen). El superóxido y el MPT son evaluados mediante la incubación de las células durante 30 minutos a una temperatura de 27 grados C, con 10 µ? de dihidroetidio y 2 µ? con yoduro de 3,3'-dihexiloxacarbocianina (DIOC6(3)) (Molecular Probes). Se utiliza yoduro de propidio para determinar la viabilidad y contenido de ADN. Las muestras son analizadas en un citómetro de flujo FACSCalibur (Becton Dickinson, San Diego, CA). Ejemplo 9 Estímulo de la célula B Las células de Ramos son activadas con IgM anti-humano Fab2 de cabra soluble (Southern Biotechnology Associates, 1 µg ml y/o purificados con CD40 anti-humano (Pharmingen, clon 5C3, 2.5 µ?/?t??). Las células B de ratón son activadas por afinidad con el IgM anti-ratón cabra purificado (ICN, Aurora, Ohio; 20 g/ml) inmovilizado en los depósitos de cultivo y/o CD40 anti-ratón purificado soluble (Pharmingen, clon HM40-3, 2.5 pg/ml). El LPS es utilizado en una cantidad de 10 pg/ml. El Bz423 es agregado a los cultivos inmediatamente después de que se aplican los estímulos. Los inhibidores son agregados 30 minutos antes al Bz-423. 181 Ejemplo 10 Análisis estadístico El análisis estadístico es realizado utilizando s? paquete de software SPSS. La importancia estadística es evaluada utilizando una prueba U de Mann-Whitney y la correlación entre las variables es evaluada mediante un ANOVA de dos vías. Todos los valores p reportados son de una cola y los datos son presentados como el promedio ± SEM. Ejemplo 11 Detección de la muerte celular y ADN hipodiploide La viabilidad de la célula es evaluada tiñéndola con yoduro de propidio (Pl, 1 pg/mL). La fluorescencia del Pl es medida utilizando un citómetro de flujo FACScalibur (Becton Dickinson, San Diego, CA). La medición del ADN hipodiploide es realizada después de la incubación de las células en una solución de marcado de ADN (50 pg/mL de Pl en PBS que contiene el 0.2% de Tritón y 10 pg/mL de ARNsa A) durante la noche a una temperatura de 4°C. Los datos son analizados utilizando el software CelIQuest excluyendo los agregados. Ejemplo 12 Detección del 02',Vm, y la activación de caspasa Para detectar el 02", las células son incubadas con DHE (10 µ?) durante 30 minutos a una temperatura de 37°C y analizados mediante la citometría de flujo para medir la fluorescencia de etidio. El análisis de flujo del potencial de 182 transmembrana mitocondrial (?p es realizado mediante el marcado de las células DiOC6(3) (20 nM) durante 15 minutos a una temperatura de 37°C. Un control positivo para la interrupción del ?,,, es establecido utilizando cianuro carbonilo de m-clorofenilhidrazona (CCCP, 50 µ?). Los ensayos de activación de caspasa se realizan con FAM-VAD-fluorometilcetona. El procesamiento del substrato es evaluado mediante citometría de flujo. Ejemplo 13 División subcelular y detección del citocroma c Las células de Ramos (250 x 106 células/muestra) son tratadas con Bz-423 (10 µ?) o vehículo durante un período de 1 a 5 horas. Las células son granuladas, se vuelven a suspender en regulador (68 mM de sacarosa, 220 mM manitol, 10 mM HEPES-NaOH, pH 7.4, 10 mM KCI, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 10 pg/mL leupeptin, 10 pg/mL de aprotinina, 1 mM PMSF), incubado en hielo durante 10 minutos yes homogeneizado. El homogenato es centrifugado dos veces durante 5 minutos a una temperatura de 4°C (800g) para granular los núcleos y los desechos, durante 15 minutos a una temperatura de 4°C (16,000g) para granular la mitocondria. El sobrenadante es concentrado, sometido a electroforesis en gel SDS-PAGE al 12% y transferidos a membranas ECL Hybond (Amersham, Piscataway, NJ). Después del bloqueo (el PBS contiene leche seca al 5% y 183 0.1% de Tween), las membranas son muestreadas con un anticuerpo monoclonal anti-citocroma c (Pharmingen, San Diego, CA; 2 pg/mL) seguido por un conjugado secundario de peroxidasa de rábano antl-ratón secundaria con la detección de la quimioluminiscencia (Amersham). Ejemplo 14 Producción de ROS en la mitocondria aislada Se dejaron en ayunas ratas macho Long Evans durante la noche y fueron sacrificadas mediante la decapitación. Las muestras del hígado fueron homogeneizadas en un regulador A helado (250 mM de sacarosa, 10 mM Tris, 0.1 mM EGTA, pH 7.4) y los núcleos y los desechos celulares fueron granulados (10 min, 830g, 4°C). Las mitocondrias son recolectadas mediante centrifugación (10 min, 15,000g, 4°C), y el sobrenadante es recolectado como la fracción S15. El gránulo mitoncondrial es lavado tres veces con regulador B (250 mM de sacarosa, 10 mM Tris, pH 7.4) y se vuelve a suspender en regulador B en una cantidad de 20 a 30 mg/mL. La mitoncondria es diluida (0.5 mg/mL) en regulador C (200 mM sacarosa, 10 mM Tris, pH 7.4, 1 mM KH2P0 , 10 µ? EGTA, 2.5 µ? rotenona, 5 mM succinato) con un contenido de diacetato de 2',7'-diclorodihidrofluorescina (DCFH-DA, 1 µ?). Para las mediciones de la condición 3, se incluyó ADP (2 mM) en el regulador y antes de la adición del Bz-423, se permite que la mitocondria se cargue durante 2 minutos. Para inducir 184 la condición 4, se agrega oligomicina (10 µ?) al regulador C. La oxidación del DCFH en 2',7'-diclorofluorescina (DCF) es monitoreada a una temperatura de 37°C con espectrofluorímetro (?T?: 503 nm; Aem: 522 nm). Para detectar los efectos sobre el 02" y delta ?™, de la mitocondria son incubadas durante 15 minutos a una temperatura de 37°C en regulador C con vehículo, Bz-423, ó CCCP que contiene DHE (5 µ?) o DIOC6(3) (20 nM), y las alícuotas son removidos para el análisis mediante un microscopio de fluorescencia. E j e m p I o 15 Análisis de flujo citométrico de los esplenocitos Los esplenocitos son preparados mediante la interrupción mecánica y las células de glóbulos rojos removidos mediante lisis isotónica. Las células son teñidas a una temperatura de 4°C, con anti-Thy 1.2 conjugados fluorescente (Pharmingen; 1 g/mL) y/o anti-B220 (Pharmingen; 1 pg/mL) durante 15 minutos. Para detectar la serina fosfatidilo de la membrana exterior, las células son incubadas con Anexina V conjugada FITC y Pl (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN; 1 pg/mL). Ejemplo 16 Determinación ¡n vivo de ROS. Los vasos son removidos de los ratones NZB/W de 4 meses de edad tratados con Bz-423 o vehículo y congelado en OCT. La producción de ROS es medido utilizando 185 manganeso (II) 3,3,9-diamlnobencidina como lo describen E.D. Kerver et al. (See, E.D. Kerver et al., en Histochem. J., 29: páginas 229 a 237

[1997]). Ejemplo 17 Títulos de IgG, BUN y proteinuría Los títulos de anti-DNA y IgG son determinados mediante un ensayo de ELISA, tal y como lo describen P.C. Swanson et al. (ver por ejemplo, la publicación de P.C. Swanson et al., en Biochemistry, 35: páginas 1624 a 1633

[1996]). El BUN del suero es medido por el laboratorio clínico del Hospital de la Universidad de Michigan. La proteinuría es monitoreada utilizando ChemStrip 6 (Boehringer Mannheim). Ejemplo 18 Estudios de benzodiazepina Los estudios de benzodiazepina en animales se describen en la Publicación de Patente Norteamericana No. 20010016583, publicada en Agosto 23, 2001, incorporada en su totalidad a la presente descripción como referencia. Ejemplo 19 Portadores de apoptosis inducida por Bz-423 Para caracterizar el mecanismo de la muerte involucrado por el Bz-423, se midieron el ROS intracelular ??™ liberación de citocroma c, activación de caspasa y la fragmentación de ADN con el paso del tiempo (los resultados presentados son para las células B, pero caracterizan la respuesta en muchos 186 tipos de células diferentes). El primer evento detectado después de la exposición al Bz-423 es un aumento en la fracción de células que se tiñen con dihiroetedio (DHE), un agente sensible al redox que reacciona específicamente con el 02\ Los niveles de 02~ disminuyeron después de un máximo temprano de 1 hora y luego aumentaron nuevamente después de 4 horas de tratamiento continuo. El patrón bimodal señalado para el mecanismo celular que limita el 02~ y sugirió que la máxima de O2' "temprana" y "tardía" fue el resultado de diferentes procesos. El colapso de ??,? fue detectado utilizando DiOC6(3), una muestra potenciométrica selectiva de la mitocondria. El cambio de gradiente comenzó después de la respuesta temprana de 02" y fue observada en >90% de las células durante 5 horas. La liberación del citocroma c de la mitocondria, un paso clave que hace posible la activación de la caspasa, fue estudiada mediante las fracciones citosólicas de inmunotinción. Los niveles de citocroma c citosólico arriba de las cantidades en las células tratadas con vehículo fueron detectados durante 5 horas. Esta liberación fue coincidente con la interrupción del ????, y juntos, estos resultados fueron consistentes con la abertura del poro PT. Indudablemente, el aumento tardío en 02" rastreado con el colapso de ??p, y la 187 liberación del citocroma c, sugiriendo que la elevación secundaria en el 02" es el resultado de estos procesos. La activación de caspasa fue medida mediante el procesamiento de un substrato FAM-VAD-fmk fluorescente sensible a la pan-caspasa. La activación de caspasa rastreada con ???, mientras que la aparición del ADN hipodiploide fue ligeramente demorado con respecto a la activación de caspasa. Colectivamente, estos resultados indicaron que el Bz-423 induce a una trayectoria apoptótica dependiente de la mitocondria. Ejemplo 20 Envío directo del Bz-423 de la mitocondria Debido a que el 02" temprano precedió otros eventos celulares, fue posible que este ROS tuviera un rol regulatorio. En las células que no son de fagocitos, enzimas de redox, junto con el RMC, son la fuente primaria del ROS. Los inhibidores de estos sistemas fueron probados por su habilidad para regular el 02~ inducido por Bz-423 con el objeto de determinar la base para esta respuesta. De estos reactivos solamente el NaN3, el cual actúa principalmente en la oxidasa del citocroma c (complejo IV de la cadena respiratoria mitocondrial, el MRC), y cantidades mícromolares de FK506, las cuales bloquean la formación de O2" mediante un componente del complejo III de reductasa de ubiquinol-citocromas c del RMC, regulado por Bz-423. Estos 188 descrubrimientos sugirieron que la mitocondria es la fuente del 02" inducido por Bz-423 y que un componente del RMC está involucrado en la respuesta. Aunque la inhibición por FK506 puede resultar del enlace a cualquiera de la calcineurina o las proteínas de enlace FK506, los productos naturales que se enlazan estrechamente a estas proteínas (rapamicina y ciclosporina A, respectivamente) no disminuyen la respuesta del 02" al Bz-423. La producción de 02" por Bz-423 puede resultar del enlace a una proteína dentro de la mitocondria o un objetivo en otro compartimento que señala la mitocondria para generar ROS. Para distinguir entre estas alternativas, fueron probadas la mitocondria del hígado de ratas aislado por producción de ROS monitoreando la oxidación del diacetato de2'7'-diclorodihidrofluorescina para la de 2'T-diclorofiuorescina en la presencia y ausencia de Bz-423. En este ensayo, la cantidad de producción de DCF aumentó después de un período de tiempo durante el cual los equivalentes reductores endógenos fueron consumidos y las porciones de acetato de la muestra fueron hidrolizadas para producir 2'7'-diclorodihidrofluorescina, las especies activas de redox. Bajo el soporte de condiciones aeróbicas de respiración de condición 3, tanto la antimlcina A, la cual genera el O2" mediante la inhibición de la reductasa de ubiquinol-citocroma c, y el Bz-423 aumentaron la cantidad de 189 producción de ROS casi dos veces después de la fase de inducción, basado este aumento en la comparación de las pendientes de cada curva para el control. No se observó hinchazón, demostrando que el Bz-423 no se dirige directamente al objetivo del poro MPT. Ni el Bz-423 ni la antimicina A generaron un ROS substancial en la fracción S15 subcelular (citosol y microsomas), y el Bz-423 no estimula el ROS si la mitocondria se encuentra en la condición 4, aunque la antimicina A es activa bajo estas condiciones. Juntos, estos experimentos demuestran que la mitocondria contiene un objetivo molecular para el Bz-423 y que se requiere una condición de respiración 3 para la respuesta de 02". Ejemplo 21 El ROS inducido por Bz-423 viene de la mitocondria Los complejos I y lil de RMC son la fuente principal del ROS dentro de la mitocondria. La evidencia presentada anteriormente sugiere que el ROS inducido por Bz-423 viene de la mitocondria. Para probar esta hipótesis, fue desactivada la función del RMC de las células resultantes que fueron desactivadas para ROS en respuesta al Bz-423. Los complejos del I al IV en el RMC son codificados parcialmente por el ADN mitocondrial (mtADN). El cultivo celular durante períodos de tiempo prolongados en la presencia de bromuro de etidio removieron el mtADN, sugiriendo que no se producen las proteínas que codificaron el mtADN, y no ocurre 190 el transporte de electrones junto con el RMC (las células descartan el mtADN y las proteínas asociadas denominadas frecuentemente como células p°). Debido a que el bromuro de etidio es tóxico para las células de Ramos, estos experimentos se realizaron con células de Namalwa B, otra línea celular B madura. El tratamiento de las células p° Namalwa con Bz-423 no dio como resultado una respuesta del ROS, como fue observada en las células p+ de Ramos y Namalwa. Debido a que el ROS temprano es crítico para la apoptosis inducida por el Bz-423, los resultados detectados con las células p° Namalwa predecirían de una manera aparente que estas células serían protegidas de los efectos tóxicos del Bz-423. Sin embargo, después de 6 horas, fue detonado el MPT y las células p"° Namalwa padecieron de apoptosis en respuesta Bz-423. En las células p+, el bombeo de protones por el MRC mantenido en el gradiente ATm mitocondrial. Debido a que el RMC funcional no está presente en las células p°, el A m es soportado por el complejo V (la FíFo-ATPasa) que funciona como una ATPasa (cancelación de las subunidades 6 y b en las células p° que eliminan la actividad de sintasa de esta enzima). En este caso, la inhibición del complejo V de ATPasa ocasionaría el colapso del gradiente y la muerte celular subsecuente. 191 Ejemplo 22 El Bz-423 envía el objetivo de la FiF0-ATPasa mitocondrial La oligomicina, un producto macrólido natural que se enlaza a la F-iF0-ATPasa mitocondrial induce una condición de transición de 3 a 4 y genera 02~ igual que el Bz-423. Basados en estas similitudes, es posible que la FíFo-ATPasa sea también el objetivo molecular para el Bz-423. Para probar está hipótesis, se examinó el efecto del BZ-423 en la actividad de la ATPasa en partículas submitocondriales (SMPs). Indudablemente, el Bz-423 inhibió la actividad de la ATPasa mitocondrial del SMPs bovino con un ED 50 ca. 5 µ?. >40 derivados de Bz-423 fueron desarrollados para determinar los elementos en este agente novedoso requeridos para la actividad biológica. La evaluación de estos compuestos en los ensayos completos de la apoptosis celular revelaron que un grupo hidroxilo en la posición C'4 y un anillo aromático del tamaño de la porción naptilo fueron útiles. La potencia de estos análogos en los ensayos basados en las células se correlacionaron con los valores ED50 en los experimentos de inhibición de ATPasa utilizando los SMPs. Estas observaciones indicaron que la ATPasa mitocondrial es el objetivo molecular del Bz-423. En concentraciones en donde estos derivados son citotóxicos (80 µ?), otras benzodiazepinas y ligandos PBR (por ejemplo, PK11195 y 4- 192 clorodiazepam) no inhiben de manera importante la actividad de la ATPasa mitocondrial, sugiriendo que el objetivo molecular del Bz-423 es diferente del objetivo molecular de estos otros compuestos. Ejemplo 23 El Bz-423 enlaza al OSCP Como parte de un grupo temprano de los estudios en los mecanismos del Bz-423, se sintetizó un análogo biotinilado reemplazando el grupo N-metilo por un hexilamino enlazador al cual se enlazó de manera covalente biotina (esta modificación no altera la actividad del Bz-423). Esta molécula fue utilizada para probar una librería de muestra del cADNs (Invitrogen) de cáncer de mama humano, que es expresada como proteína de fusión en la punta del fago T7. Después de los métodos de selección descritos por Austin y colaboradores, utilizando la versión biotinilada de KF506 para identificar nuevas proteínas de enlace al FK506, el componente OSCP de la F-iFo-ATPasa mitocondrial fue identificado como la proteína de enlace para el Bz-423 (figura 1). Para determinar si el Bz-423 realmente se enlaza al OSCP y la afinidad de la interacción, se sobreexpresó en el OSCP humano de E. coli. Triturando una solución de Bz-423 en OSCP se tuvo como resultado la extinción de la fluorescencia intrínseca de la proteína y se produjo un Kd de 193 200 ± 40 nM (figura 2). El enlace de varios análogos de Bz-423 también fue medido y se descubrió que su afinidad con el OSCP era paralela a su potencia, tanto en los ensayos de citotoxicidad de la célula completa, como en los experimentos de inhibición del ATPasa utilizando el SMP. Estos datos proporcionaron una evidencia de que el Bz-423 se enlaza al OSCP en la ATPasa mitocondrial. El Bz-423 es el único inhibidor conocido de la ATPasa que funciona a través del enlace al OSCP. Debido a que el OSCP no contiene el sitio de enlace de ATP y no comprende el canal de protones, es posible que el Bz-423 funcione alterando el movimiento molecular del motor ATPasa. Ejemplo 24 Las eliminaciones de ARNi del OSCP protegen contra la muerte celular inducida por el Bz-423 Para complementar la identificación del objetivo químico y bioquímico y los estudios de validación descritos anteriormente, se realizaron experimentos para desactivar el OSCP en las células completas. Removiendo el OSCP de la ATPasa se cancela la función \n vitro de las sintasas sin alterar la actividad hidrolítica de la enzima. En la levadura, las eliminaciones de OSCP no son letales; en estas células, la hidrólisis del ATP proporciona el potencial químico para soportar el ??p, manteniendo de este modo la integridad mitocondrial. Debido a que el OSCP de la levadura tiene una 194 homología de secuencia limitada para la proteína de mamífero (-30%), estos experimentos se realizaron en líneas celulares · de origen humano. Debido a que el OSCP es codificado nuclear, la interferencia de ARN (ARNi), se empleó una técnica que puede lograr silenciar el gen después de la transcripción, para desactivar esta proteína. Para estos experimentos, las células HEK 293 fueron transfectadas con cada una de las tres moléculas de ARN de interferencia pequeña sintetizadas químicamente (siARN) específicas para la secuencia OSCP utilizando oligofectamina. Estas células son transfectadas de una manera altamente eficiente (90%) por la oligofectamina. La expresión del OSCP fue analizada por inmunotinción en las horas 24, 48, 72 y 96 posteriores a la transfección. El silenciamiento máximo de la expresión del OSCP (64%) ocurrió en la hora 72 después de la transfección (figura 3). Las células HEK 293 transfectadas con siARN de OSCP tuvieron una Bz-ROS reducida y apoptosis en respuesta al Bz-423 en relación con las células transfectadas con una secuencia de control revuelta de siARN. Estos resultados indicaron que el siARN es efectivo para reducir el OSCP y sugirieron que la señalización de la muerte celular portada por el Bz-423 comprende el OSCP. Ejemplo 25 Efecto del Bz-423 en la proliferación celular 195 De manera similar a la mayor parte de las 1,4-benzodiazepinas, el Bz-423 se enlaza de manera fuerte a la albúmina de suero bovino (BSA) que reduce la concentración efectiva del fármaco libre en solución. Por ejemplo, en los medios de cultivo de tejido que contienen el 10% (v/v) de suero fetal bovino (FBS), ca 99% del fármaco es enlazado al BSA. Por lo tanto, los ensayos de citotoxicidad del cultivo celular se realizaron en medios con el 2% de FBS para reducir el enlace al BSA y aumentar la porción libre [Bz-423]. Bajo estas condiciones, la curva de respuesta a la dosis es bastante afilada y existe un rango de concentración limitado en el cual el Bz-423 es solamente parcialmente efectivo. Debido a que se sabe que algunas benzodiazepinas tienen propiedades antiproliferativas, el efecto del Bz-423 en concentraciones de < ED50 fueron analizadas y se observó cuidadosamente que además de inducir la apoptosis, el Bz-423 previene el crecimiento celular después de 3 días en cultivo. En estas condiciones bajas de suero, los efectos citotóxicos y antiproliferativos se traslaparon haciendo difícil estudiar cada efecto independientemente. Sin embargo, aumentando el [BSA] o aumentando el FBS al 10%, la curva de respuesta a la dosis fue aplanada (y aumentó la citotoxicidad ED50) y el Bz-423 indujo la citotoxicidad lo cual podría ser distinguido claramente de los efectos en la proliferación. En cantidades más bajas del fármaco (por 196 ejemplo, 10-25 µ?), el Bz-423 tuvo una citotoxicidad mínima mientras que en concentraciones de > 20 µ? solamente se observó la apoptosis (la trayectoria de muerte descrita anteriormente incluye la respuesta ROS bimodal y también se observó en el medio que contiene FBS al 10%). Aunque las cantidades más altas del fármaco también pueden bloquear la proliferación, causaron la apoptosis bastante antes de que los efectos en la proliferación pudieran ser observados. Las curvas de respuesta a la dosis fueron similares en los experimentos en donde se agregó BSA al medio que contiene FBS al 2% para simular un medio que contiene FBS al 10%, lo cual demostró que la ant-proliferación y la citotoxicidad no fueron afectadas por otros constituyentes del suero. Para confirmar que la disminución en el número celular en relación con las células de control después de 3 días de tratamiento, se debe a la proliferación disminuida y no a la muerte celular equilibrada por la proliferación y además se estudiaron la cuenta de células y las divisiones de células. El PKH-67 es una muestra fluorescente que se enlaza de manera irreversible a las membranas celulares y al momento de la división de las células es dividida igualmente entre las células descendientes, haciendo posible cuantificar la división celular por medio de citometría de flujo. Las células de Ramos teñidas con PKH67 y tratadas con Bz-423 tuvieron menos divisiones celulares en concentraciones sub- 197 citotóxicas, lo cual confirmó que la disminución en el número de células fue debida a los efectos antiproliferativos y no a la muerte celular. Para determinar si el Bz-423 indujo la antiproliferación que fue específica para las células de Ramos, el conteo de células y los experimentos del ciclo de células se hicieron en otras líneas celulares B y líneas celulares derivadas de tumores sólidos. Como se puede observar en la tabla 3, los efectos en el bloqueo de la proliferación no fueron únicos para las células linfoides, lo cual sugirió un objetivo común a los tipos de tejido múltiples, que portaron el bloqueo en la proliferación. Tabla 3. ED50 (µ?) para antiproliferación de células tratadas durante 72 horas en medios con 10% de FBS. Las células para el estudio incluyeron células de Ramos y clones transfectados para sobreexpresar el Bcl-2 y el Bcl-xL, las células de ovario nulas p53 (SKOV3); células de la línea del neuroblastoma (IMR-32, Lan-1, SHEP-1); y líneas celulares B malignas.

Ramos Bcl-2 Bcl-XL SKOV3 IMR-32 Lan-1 SHEP-1 CA46 Raji 10.7 11.9 13.7 18.2 18.0 13.7 15.9 13.4 12.9 Ejemplo 26 Células elaboradoras del perfil del gen tratadas con Bz- 423 Los experimentos de la elaboración del perfil del gen 198 fueron realizados para probar el mecanismo por medio del cual el Bz-423 bloquea la proliferación celular. En estudios utilizando ciclohexamida como inhibidor de la síntesis de proteína, se descubrió que la muerte celular inducida por Bz-423 no depende de la nueva síntesis de la proteína. Por lo tanto, los cambios en la expresión del gen fueron más probablemente relevantes sólo para los mecanismos de antiproliferación. Para aumentar la probabilidad de detección de los cambios involucrados en el acoplamiento de respuesta a la señal, en vez de los efectos descendentes, las células fueron perfiladas de manera que fueron tratadas con Bz-423 durante 3 horas. Este es el punto justamente después del máximo de ROS temprano, pero antes de que ocurrieran otros cambios celulares, incluyendo la abertura del poro de permeabilidad de la mitocondria. El descubrimiento de las propiedades pro-apoptóticas, citotóxicas e inhibitorias del crecimiento del Bz-423 contra los tipos de célula patogénicos identificaron el potencial para que esta clase de agentes sean agentes terapéuticos contra enfermedades autoinmunológicas, cánceres y otras enfermedades neoplásticas. La evidencia experimental adicional de un análisis de los cambios en la expresión del gen inducidos por este agente, expandió el entendimiento del mecanismo de la acción de este compuesto y se agregó a la colección de efectos terapéuticos que regula. 199 La prueba in vitro de las células de Ramos para determinar los cambios en la expresión del gen (en el nivel del mARN) inducido por el Bz-423 se realizó cultivando células en una densidad de 500,000 células por mi. El control de solvente (DIVISO, concentración final de 0.1% V/V]), se agregaron a las células Bz-423 o Bz-OMe (10 µ ). Después de 4 horas, las células fueron cosechadas y el ARN preparado utilizando el Reactivo de Trizol (#15596-018, Life Technologies, Rockville, MD) y el RNeasy Maxi Kit (#75162, Qiagen, Valencia, CA) de acuerdo con los protocolos del fabricante. El cADN de hilo sencillo fue sintetizado mediante transcripción inversa utilizando el poli (A) ARN presente en el inicio de la muestra de ARN total. El cADN de un solo hilo fue convertido en cADN de doble hilo y luego se llevó a cabo la transcripción in vitro en la presencia del UTP biotinilado y el CTP para producir un cARN marcado con biotina. El cARN fue fragmentado en la presencia de Mg2+, e hibridado a la adaptación del genoma humano U133A Genechip (Affymetrix). Los resultados de la hibridación fueron cuantificados utilizando un explorador GeneArray y el análisis se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones proporcionados por Affymetrix. La elaboración del perfil de expresión utilizando el ARN aislado de las células tratadas con Bz-423, Bz-OMe, o vehículo de control, se hizo con el chip del gen HGU133A 200 Affymetrix, el cual representa aproximadamente 22,000 genes humanos. Utilizando criterios que incluyen p<0.01, 16 genes son expresados 8 veces o más sobre las células de control. Como se esperaba basados en el objetivo molecular del Bz-423, muchos de estos genes estaban involucrados en la glicólisis. Los datos fueron analizados para detectar los cambios de los genes tratados con Bz de acuerdo con los criterios de que la señal promedio transformada del registro cambió por lo menos cuatro veces en las muestras tratadas, comparadas con el control de vehículo y que el coeficiente de variación para los valores de control (n=4) fue menor del 10%. Estos genes representan objetivos que pueden portar respuestas terapéuticas. Los resultados de la expresión del gen para el Bz-423 y Bz-OMe proporcionan cada uno una huella de información única. La estructura del Bz-OMe es la siguiente: 201 La expresión de algunos genes cambia de un modo similar después de la exposición, tanto al Bz-423 como al Bz-OMe. Por lo tanto, los genes que son regulados comúnmente entre los dos compuestos son particularmente importantes para entender la regulación del gen a través de una clase más general de compuestos. La figura 4 representa datos que muestra los perfiles de expresión del gen de las células tratadas con Bz-423 y Bz-OMe. Ejemplo 27 Efecto del Bz-423 en los niveles de ODC y actividad Para determinar si la actividad del ODC y el metabolismo de poliamina es afectado por Bz-423, como lo sugieren los datos de la elaboración de perfil del ARN, fue medida directamente la actividad del ODC en las células tratadas con Bz-423 en comparación con un vehículo de control. En estos experimentos, la conversión de ornitina en putrescina fue cuantificada utilizando 3H-ornitina. Para las comparaciones, las células de control fueron tratadas con vehículo de control o difluorometilo ornitina (DFMO), un inhibidor potente de la descarboxilasa de ornitina (similar al Bz-423, el DFMO es un agente anti-proliferativo potente). Como se puede observar en la figura 3, el tratamiento de las células durante 4 horas con Bz-423 redujo de manera importante la actividad de ODC de un modo dependiente de la dosis, el cual es consistente entre otras cosas, con un 202 aumento en la antizima 1, como se sugiere en la elaboración del perfil de ARN. La reducción de la actividad de ODC fue paralela mediante la disminución de los niveles de proteína ODC medidos bajo estas condiciones. Como se describió anteriormente, la apoptosis inducida por el Bz-423 fue señalizada por una respuesta ROS que se elevó del complejo III de MRC como resultado de la transición de la condición 3 a la 4. En lo que se vio posteriormente, si la respuesta de ROS, crítica para la apoptosis, también portaba estos efectos en el ODC. Si se requería el ROS para la disminución de la actividad del ODC, también estaría implicada de un modo similar como potencialmente parte de la respuesta antiproliferativa al Bz-423. Para probar esto, las células de Ramos fueron tratadas con Bz-423, DFMO, control de vehículo durante 4 horas. En paralelo, un segundo grupo de células fue previamente incubado con MnTBAP para limitar el ROS y luego cultivadas con Bz-423, DFMO y vehículo de control. El MnTBAP invirtió de manera importante la inhibición del ODC por el Bz-423. Estos datos sugirieron colectivamente la interpretación posible de que el [Bz-423] alto (por ejemplo, >10 µ?) genera cantidades suficientes de ROS que podrían no ser destoxificadas por los anti-oxidantes celulares, y daban como resultado la apoptosis en un período dentro de 18 horas. Menos [Bz-423] indujo una respuesta de ROS 203 proporcionalmente más pequeña que fue insuficiente para detonar la apoptosis. Sin embargo, en este caso el ROS puede tener la capacidad de enlazar el ODC o bloquear de otro modo la proliferación celular. Consistente con esta hipótesis, un compuesto en el cual el hidroxilo fenólico es reemplazado por Cl (designado Bz-CI) fue mínimamente citotóxico (la actividad disminuyó por ca 80% comparado con el Bz-423) y generó una respuesta ROS pequeña en las células, mientras que también se enlazó de una manera menos estrecha al OSCP (Kd ~ 5 µ?). Este compuesto también inhibió la actividad del ODC (figura 3), como era pronosticado por la hipótesis anterior. Debido al rol propuesto y la naturaleza de ROS inducido por Bz-423 para portar el arresto del crecimiento, el Bz-CI fue tratado contra el panel de células de la tabla 2 y se encontró que después de 3 horas redujo la proliferación a un grado similar que el Bz-423, con valores ED50 comparables. Estos resultados demostraron que podrían ser obtenidos efectos antiprollferativos de estos compuestos utilizando análogos químicos de Bz-423 que bloquean la proliferación sin inducir la apoptosis. Ejemplo 28 Estudios de Actividad de la Estructura de las Benzodiazepinas Citotóxicas Novedosas Basados en estas propiedades del Bz-423, se sintetizó 204 un rango de derivados de Bz-423 para probar los elementos estructurales de estos compuestos novedosos importantes para el enlace y la actividad. Reemplazando el grupo N-metilo o cloro por hidrógeno se tuvo poco efecto en la actividad linfotóxica contra las células B de Ramos inmortalizadas o las células T de Jurkat en el cultivo. De un modo similar, ambos enantiómeros de Bz-423 fueron potentes de una manera equivalente, lo cual indica que la interacción entre el Bz-423 y su objetivo molecular comprende dos puntos de enlace. En contraste con estos datos, eliminando una naftalalanina (tabla 1). La presente invención no está limitada a un mecanismo particular y no es necesari o un entendimiento de un mecanismo para practicar la presente invención, sin embargo, está contemplado que la porción o el respaldo de un grupo fenólico hidroxilo con hidrógeno eliminó la actividad citotóxica (tabla 1). Basados en estas observaciones se investigaron los cambios a las posiciones C'3 y C'4. Reemplazando el 1-naftol por 2-naftol se tuvo poco efecto en la muerte celular. De un modo similar, reemplazando la naftilalanina por otros grupos hidrofóbicos de tamaño comparable, se tuvo poco efecto en las propiedades citotóxicas del Bz-423. En contraste, las quinolinas de la 7 a la 9 fueron cada una menos potentes que el Bz-423. La presente invención no está limitada a un mecanismo particular y no es necesario un entendimiento del mecanismo para practicar la presente invención, no obstante, 205 está contemplado que estos datos sugieren una preferencia por un substituyente hidrofóbico dentro del sitio de enlace para el Bz-423. Los substituyentes C3 más pequeños solamente fueron algo menos potentes que el Bz-423, mientras que los compuestos con grupos aromáticos que contienen oxígeno fueron significativamente menos citotóxicos. Estos datos indican claramente que un substituyente aromático hidrofóbico de volumen es útil para una actividad óptima. Tabla 1. Potencia de los derivados de Bz-423. La muerte celular fue evaluada cultivando las células B de Ramos en la presencia de cada compuesto de un modo de respuesta a la dosis. La viabilidad de la célula fue medida después 24 horas de la exclusión del yoduro de propidio utilizando la citometría de flujo. En este ensayo, el EC50 para el PK 1 95, diazepam, y 4-CI-diazepam es de > 80 µ?. 206 aCada valor EC50 fue determinado dos veces por triplicado y tiene un error de ± 5%. Colocando el orto del grupo metilo al hidroxilo (16) no se altera la actividad del Bz-423 mientras que moviendo el hidroxilo a ia posición C'4 (17) se disminuyó la potencia dos veces (tabla 2). En contraste, reemplazando el hidroxilo por 207 cloro o azida, o metilando el fenol se elimina efectivamente la actividad citotóxica del Bz-423. La presente invención no está limitada a un mecanismo particular, y no es necesario el entendimiento del mecanismo para practicar la presente invención, sin embargo, está contemplado que estos datos indican que se requiere un grupo hidroxilo colocado en el carbono C'4 para la actividad óptima, posiblemente haciendo un contacto crítico al momento del enlace al objetivo. Sin embargo, las moléculas que poseen una subestructura fenólica pueden también actuar como portadores alternos de los electrones dentro del MRC. Dichos agentes aceptan un electrón de las enzimas MRC y lo transfieren de vuelta a la cadena en el punto del potencial de reducción más alta. Este tipo "ciclado redox" consume los endógenos reduciendo los equivalentes (por ejemplo, glutationa) junto con los nucleótidos de pirimidina y da como resultado la muerte celular. Para distinguir entre estas alternativas, se determinó cuales de los ciclos redox del Bz-423 en la presencia de partículas sub-mitocondriales, utilizando ensayos de oxidación estándar NADH y NAD(P)H. A diferencia de los controles positivos (doxorubicina y menadiona), el Bz-423 no conduce a la oxidación del substrato lo cual sugiere fuertemente que no hace un ciclo redox. La presente invención no está limitada a mecanismo particular, y no es necesario un entendimiento del mecanismo para practicar la 208 presente invención, no obstante, está contemplado que colectivamente, los datos indican que la actividad disminuida de los compuestos del 18 al 20 es el resultado de remover una interacción que es la portadora del enlace del Bz-423 a su proteína objetivo. Tabla 2. Potencia de derivados de Bz-423. La muerte celular fue evaluada como se describió en la tabla 1. del 16 17 18 19 20 Compuesto 3 6 >80 >80 >80 Las células producen rápidamente el 02~ en respuesta al Bz-423 y bloqueando esta señal se previene la apoptosis (por ejemplo, inhibiendo la reductasa de ubiquinol citocroma c, la cual es la enzima que produce el 02" en respuesta al Bz-423). Para determinar si los derivados de Bz-423 matan las células de una manera análoga al Bz-423 (presumiblemente como resultado del enlace a un objetivo molecular común) se examinó la capacidad del FK506 y cuales cantidades micromolares efectivamente inhiben la reductasa de ubiquinol citocroma c, para proteger contra la muerte celular. La inhibición por el FK506 (« 60%) fue solamente observado para 209 del 3 al 6, 12, 13, 16 y 17 los cuales son los compuestos con la cadena lateral C3 hidrofóbica más grande que el benceno. La muerte celular inducida por cada uno de estos compuestos (incluyendo el Bz-423) también fue inhibida (a ~ 60%) mediante el tratamiento previo de las células con cualquiera de los compuestos 18, 19, ó 20 (en > 40 µ?). Los compuestos 18, 19 y 20 no tuvieron efecto en el bloqueo de la actividad citotóxica (inhibición de =20%) de las otras benzodiazepinas de la lista de la tabla 2. La presente invención no está limitada a un mecanismo particular, y no es necesario el entendimiento del mecanismo para practicar la presente invención, no obstante, está contemplado que estos datos sugieren fuertemente que el Bz-423 junto con los compuestos del 3 al 6, 12, 13, 16 y 17 se enlazan al mismo sitio dentro de la proteína objetivo e inducen la apoptosis a través de un mecanismo común. Los otros compuestos no se enlazan en el sitio e inducen una respuesta de muerte a través de una trayectoria diferente. Ejemplo 29 Medición de la actividad ATPasa La mitocondria fue aislada de los corazones del ganado recientemente sacrificado como se describió anteriormente (ver por ejemplo, el libro de Graham, J.M., "Fraccionamiento y Aislamiento Subcelular de Organelas: Aislamiento de la Mitocondria de los Tejidos y las Células mediante 210 Centrifugación Diferencial" (Subcellular Fractionation and Isolation of Organelles: Isolation of Mitochondria from Tissues and Cells by Differential Centrifugation), en Current Protocols in Cell Biology. 1999, John Wiley & Sons, Inc: New York. páginas 3.3.3 a 3.3.4; incorporado en su totalidad a la presente descripción como referencia). Todos los reguladores contenían 2-mercaptoetanol (5 mM). Las partículas sub-mitocondriales (SMPs) fueron preparadas mediante sonicación de la mitocondria del corazón de las reses de acuerdo con el procedimiento de Walker et al (ver por ejemplo., la publicación de Walker, J.E., et al., en Methods Enzymol, 1995. 260: páginas 163 a 190; incorporada en su totalidad a la presente descripción como referencia) excepto que cada porción de la suspensión mitocondrial fue sonicada tres veces durante 40 segundos, con un intervalo de dos minutos entre las sonicaciones, utilizando un sonicador isonix 3000 con una sonda de titanio de 1.27 cm (0.5 pulgadas) en un ajuste de energía de 8.5. La actividad de la F^o-ATRasa mitocondrial fue medida acoplando la producción de ADP a la oxidación de NADH por medio de la cinasa de piruvato y la reacción de deshidrogenase de lactato y luego monitoreando el índice de oxidación del NADH espectrofotométricamente en 340 nm a una temperatura de 30°C (ver por ejemplo, las publicaciones de cEnery, M.W. et al., en J Biol Chem, 1986. 261(4): páginas 1745 a 1752; y 211 Harris, D.A., en Spectrophotometríc Assays, in Spectrophotometry and Spectrofluorimetry, D.A. Harris, Bashford, C.L., Editor. 1987, IRL Press; cada una incorporada en su totalidad como referencia a la presente descripción). La mezcla de reacción (0.25 ml_ de volumen final) contenía Tris-HCI (100 mM), pH 8.0, ATP (0-2 mM), MgCI2 (2 mM), KCI (50 mM), EDTA (0.2 mM), NADH (0.2 mM), fosfoenolpiruvato (1 mM), cinasa de piruvato (0.5 U) y deshidrogenasa de lactato (0.5 U). Cada muestra contenía SMPs (7 µ9) o F1-ATPasa purificada (0.29 µg) que habían sido previamente incubadas (5 minutos a una temperatura de 30°C) con diferentes concentraciones de Bz-423 (o control de vehículo). Todas las publicaciones y patentes mencionadas en la descripción anterior están incorporadas a la misma como referencia. Aunque la presente invención ha sido descrita en relación con las modalidades específicas preferidas, deberá quedar entendido que la presente invención, tal y como fue reivindicada, no debe de ser limitada indebidamente a dichas modalidades específicas. Indudablemente, resultarán obvias para los expertos en la técnica relevante, modificaciones a las modalidades aquí descritas para llevar a cabo la presente invención, las cuales se pretende que se encuentren dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims (28)

1. 212
2. REIVINDICACIONES 1. Un método para regular la muerte celular, el cual prende: a) proporcionar: i) células objetivo que tienen mitocondria; ii) una composición la cual comprende la siguiente fórmula: incluyendo ambas formas enantioméricas R y S y las mezclas racémicas; en donde R-i, R2, 3 y R son seleccionados del grupo consistente de: hidrógeno; CH3; una cadena aiifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 1 átomo de carbono; una cadena aiifática saturada o insaturada, recta o 213 ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo hidroxi; una cadena alif ática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo tiol; una cadena al ifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, en donde la cadena alifática termina con un subgrupo aldehido; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo cetona; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono; en donde la cadena alifática termina con un subgrupo de ácido carboxílico; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo amida; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un grupo acilo; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos una porción que contiene nitrógeno; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo amina; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 214 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo éter; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo halógeno; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo nitronio; en donde R6 es seleccionado del grupo consistente de: OH; N02; OR'; en donde R' es seleccionado del grupo consistente de: una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos un átomo de carbono; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo hidroxilo; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo tiol; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, en donde la cadena alifática termina con un subgrupo aldehido; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo cetona; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, en donde la cadena alifática termina con 215 un subgrupo de ácido carboxílico; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo amida; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un grupo acilo; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos una porción que contiene nitrógeno; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo amina; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo halógeno; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo nitronio; en donde R6 es seleccionado del grupo consistente de: Hidrógeno; N02; Cl; F; Br; I; SR'; y NR'2; en donde R' es tal y como se definió anteriormente para R5; en donde R7 es seleccionado del grupo consistente de: Hidrógeno; una cadena alifática saturada o insaturada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono; y en donde R8 es un grupo cíclico alifático más grande que benceno; en donde dicho grupo más grande que benceno comprende cualquier grupo químico que contiene 7 o más 216 átomos que no son de hidrógeno; y b) exponer las células a la composición bajo condiciones de modo que la composición se enlaza a la proteína que confiere sensibilidad a la oligomicina como para aumentar los niveles de superóxido, y alterar los niveles de ATP celular en dichas células. 2. El método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque las células objetivo son células in vitro.
3. 3. El método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque las células objetivo son células in vivo.
4. 4. El método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque las células objetivo son células ex vivo.
5. 5. El método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque las células objetivo son células cancerosas.
6. 6. El método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque las células objetivo son seleccionadas del grupo consistente de células B, células T y granulocitos.
7. 7. El método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el agente comprende benzodiazepina o un derivado benzodiona. 217
8. 8. El método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque la composición comprende: en donde R-i es seleccionado del grupo consistente naftalalanina; fenol; 1 -Naftalenol; 2-Naftalenol; I 218 y en donde R-¡ y R2 incluyen ambas formas enantioméricas R 219 ó S y las mezclas racémicas.
9. 9. El método tal y como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el paso de exposición da como resultado un aumento en la muerte celular de las células objetivo.
10. 10. Una composición que comprende la siguiente fórmula: en donde R-i es seleccionado del grupo que consiste de: naftalalanina; fenol; 1 -Naftalenol; 2-Naftalenol; 220 y en donde y R2 incluyen ambas formas enantioméricas R 221 ó S y las mezclas racémlcas.
11. 11. Una composición la cual comprende la siguiente fórmula: en donde Ri es seleccionado del grupo consistente de H, alquilo, o alquilo substituido; en donde R2 es seleccionado del grupo consistente de un hidrógeno, un hidroxi, un alcoxi, un halo, un amino, un alquilo inferior, un amino substituido, un acetilamino, un hidroxiamino, un grupo alifático que tiene de 1 a 8 átomos de carbono y de 1 a 20 átomos de hidrógeno, un grupo alifático substituido de tamaño similar, un grupo alifático que consiste de <10 átomos de carbono, un grupo cicloalifático substituido, un arilo, un heterocíclico; en donde R3 es seleccionado del grupo consistente de H, alquilo, o alquilo substituido, y en donde cuando mucho un substituyente es un subgrupo 222 hidroxilo; en donde R4 es seleccionado del en donde n = 0 - 5; y en donde R ( R2, R3 y 4 incluyen ambas formas enantioméricas R ó S y las mezclas racémicas.
12. 12. Una composición farmacéutica la cual comprende: a) un compuesto que se enlaza a la proteína que 223 confiere sensibilidad a la oligpmicina; y b) un agente seleccionado del siguiente grupo: resveratrol, picetanol, estrógeno y lansoprazol.
13. 13. Un método para regular la muerte celular el cual comprende: a) proporcionar a un sujeto una composición que comprende una fórmula seleccionada del grupo consistente de: 224 en donde R es seleccionado del grupo consistente de un hidrógeno, un hidroxi, un alcoxi, un halo, un amino, un amino substituido por un alquilo inferior, un acetilamino, un hidroxiamino, un grupo alifático que tiene de 1 a 8 átomos de carbono y de 1 a 20 átomos de nitrógeno, un grupo alifático 225 substituido de tamaño similar, un grupo cicloalifático que consiste de <10 átomos de carbono, un grupo cicloalifático substituido, un arilo, y un heterocíclico; y b) administrar dicha composición al sujeto.
14. 14. Un método para regular la proliferación celular el cual comprende: a) proporcionar al sujeto una composición que comprende una fórmula seleccionada del grupo consistente de; 226 en donde R es seleccionado del grupo consistente de un hidrógeno, un hidroxi, un alcoxi, un halo, un amino, un amino substituido por un alquilo inferior, un acetilamino, un hidroxiamino, un grupo alifático que tiene de 1 a 8 átomos de carbono y de 1 a 20 átomos de nitrógeno, un grupo alifático 227 substituido de tamaño similar, un grupo cicloalifático que consiste de <10 átomos de carbono, un grupo cicloalifático substituido, un arilo, y un heterocíclico; y b) administrar dicha composición al sujeto.
15. 15. Una composición que comprende un medio de stent de elución del fármaco; en donde el medio de stent de elución del fármaco comprende una composición farmacéutica; y en donde la composición farmacéutica comprende un agente que comprende la siguiente fórmula: incluyendo ambas formas enantioméricas R y S y las mezclas racémicas; en donde Ri, R2, R3 y son seleccionados del grupo consistente de: hidrógeno; CH3; una cadena alifática saturada o ¡nsaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 1 átomo de 228 carbono; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo hidroxi; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo tío!; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, en donde la cadena alifática termina con un subgrupo aldehido; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo cetona; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono; en donde la cadena alifática termina con un subgrupo de ácido carboxílico; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo amida; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un grupo acilo; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos una porción que contiene nitrógeno; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo amina; una cadena alifática saturada o 229 insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo éter; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo halógeno; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo nitronio; en donde R5 es seleccionado del grupo consistente de: OH; N02; OR'; en donde R' es seleccionado del grupo consistente de: una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos un átomo de carbono; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo hidroxilo; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo tiol; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, en donde la cadena alifática termina con un subgrupo aldehido; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo cetona; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 230 átomos de carbono, en donde la cadena alifática termina con un subgrupo de ácido carboxílico; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo amida; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un grupo acilo; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos una porción que contiene nitrógeno; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo amina; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo halógeno; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo nitronio; en donde F?6 es seleccionado del grupo consistente de: Hidrógeno; NOz; Cl; F; Br; I; SR'; y NR'2; en donde R' es tal y como se definió anteriormente para R5; en donde R7 es seleccionado del grupo consistente de: Hidrógeno; una cadena alifática saturada o insaturada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono; y en donde R8 es un grupo cíclico alifático más grande que benceno; en donde dicho grupo más grande que benceno 231 comprende cualquier grupo químico que contiene 7 o más átomos que no son de hidrógeno, y es un grupo arilo o cíclico alifático.
16. 16. El método del tratamiento de un vaso que comprende la exposición de un vaso de un sujeto a la composición tal y como se describe en la reivindicación 15.
17. 17. El método tal y como se describe en la reivindicación 16, caracterizado porque el vaso es un vaso ocluido.
18. 18. El método tal y como se describe en la reivindicación 17, caracterizado porque el vaso es un vaso cardíaco.
19. 19. Un método para regular la muerte celular, el cual comprende: a) administrar una composición a un sujeto; en donde dicha composición comprende la fórmula siguiente: 232 incluyendo ambas formas enantioméricas R y S y las mezclas racémicas; en donde R-i, R2, R3 y R son seleccionados del grupo consistente de: hidrógeno; CH3; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 1 átomo de carbono; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo hidroxi; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo tiol; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, en donde la cadena alifática termina con un subgrupo aldehido; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo cetona; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono; en donde la cadena alifática termina con un subgrupo de ácido carboxílico; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo amida; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un grupo 233 acilo; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos una porción que contiene nitrógeno; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo amina; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo éter; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo halógeno; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo nitronio; en donde R5 es seleccionado del grupo consistente de: OH; NO2; OR'; en donde R' es seleccionado del grupo consistente de: una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos un átomo de carbono; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo hidroxilo; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo tiol; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada 234 que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, en donde la cadena alifática termina con un subgrupo aldehido; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo cetona; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, en donde la cadena alifática termina con un subgrupo de ácido carboxílico; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo amida; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un grupo acilo; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos una porción que contiene nitrógeno; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo amina; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo halógeno; una cadena alifática saturada o insaturada, recta o ramificada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono, y tiene por lo menos un subgrupo nitronio; en donde R6 es seleccionado del grupo consistente de: Hidrógeno; N02; Cl; F; Br; I; SR'; y NR'2; en donde R' es 235 tal y como se definió anteriormente para R5; en donde R7 es seleccionado del grupo consistente de: Hidrógeno; una cadena alifática saturada o insaturada que tiene por lo menos 2 átomos de carbono; y en donde R8 es un grupo cíclico alifático más grande que benceno; en donde dicho grupo más grande que benceno comprende cualquier grupo químico que contiene 7 o más átomos que no son de hidrógeno; b) administrar dicha composición a dicho sujeto.
20. 20. Un método para identificar composiciones terapéuticas, el cual comprende: a) proporcionar: i) una muestra que comprende la FiF0-ATPasa mitocondrial; y i¡) un inhibidor candidato de F-iF0-ATPasa; y b) poner en contacto el inhibidor con la muestra; c) medir la proporción de kcat/Km de la F-iF0-ATPasa mitocondrial; y d) seleccionar las composiciones que se enlazan predominantemente al complejo de substrato-F-? F0-ATPasa y no alteran la proporción kcat/Km de la FiF0-ATPasa mitocondrial al momento del enlace de la FiF0-ATPasa mitocondrial como composiciones terapéuticas.
21. 21. El método tal y como se describe en la reivindicación 20, caracterizado porque el método comprende 236 además el paso de: e) probar las composiciones seleccionadas en un animal para identificar la baja toxicidad y la capacidad para tratar una enfermedad autoinmunológica.
22. 22. El método tal y como se describe en la reivindicación 20, caracterizada porque la muestra comprende además la mitocondria.
23. 23. El método tal y como se describe en la reivindicación 20, caracterizada porque la F-iF0-ATPasa es una enzima pura.
24. 24. El método tal y como se describe en la reivindicación 20, caracterizado porque dicha FiFo-ATPasa está localizada en una partícula sub-mitocondrial.
25. 25. El método tal y como se describe en la reivindicación 20, caracterizado porque la proporción kcat/Km es medida determinando el índice de la hidrólisis o síntesis de ATP como una función de la concentración de ATP y la concentración del inhibidor.
26. 26. El método tal y como se describe en la reivindicación 20, caracterizado porque la proporción kcat/Km es calculada a partir del Km Vmax, y la concentración de enzima.
27. 27. El método tal y como se describe en la reivindicación 20, caracterizado porque las composiciones seleccionadas tienen una alta actividad inhibitoria en una 237 concentración alta del substrato y baja actividad en concentración baja del substrato.
28. 28. Un método para tratar enfermedades autoinmunológicas, el cual comprende: a) proporcionar a un sujeto una composición, en donde la composición tiene la capacidad de enlazar un complejo de substrato FnFo-ATPasa mitocondrial mientras no altera la proporción de F-iF0-ATPasa; y b) administrar dicha composición al sujeto.