MXPA05003974A - Un metodo de modulacion de la actividad celular epitelial mediante la modulacion de los niveles funcionales de la esfingosina cinasa. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se relaciona en general con un metodo de modulacion de las caracteristicas funcionales de celulas endoteliales y con agentes utiles en el mismo. Mas particularmente, la presente invencion se relaciona con un metodo de modulacion de los fenotipos proinflamatorios y angiogenicos de las celulas endoteliales mediante la modulacion de los niveles funcionales de la esfingosina cinasa intracelular. El metodo de la presente invencion es util, inter alia, en relacion al tratamiento y/o profilaxis de condiciones, las cuales se caracterizan por un funcionamiento de la celula endotelial inadecuado y pueden incluir condiciones tales como injerto vascular, transplante de organos o cicatrizacion de heridas o condiciones las cuales se caracterizan por un fenotipo inflamatorio o angiogenico aberrante de las celulas endoteliales. Ademas, el metodo de la presente invencion facilita el desarrollo de agentes, tales como, poblaciones de celulas endoteliales manipuladas de manera funcional, para una gama de usos terapeuticos y/o profilacticos.

Description

UN METODO DE MODULACION DE LA ACTIVIDAD CELULAR EPITELIAL MEDIANTE LA MODULACION DE LOS NIVELES FUNCIONALES DE LA ESFINGOSINA CINASA CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona, de manera general, con un método de modulación de las características funcionales de células endoteliales y con agentes útiles para la misma. De manera más particular, la presente invención se relaciona con un método de modulación de fenotipos'' proinflamatorios y angiogénicos de células endoteliales vasculares modulando los niveles funcionales de es enfingosina cinasa intracelular. El método de la presente invención es útil, inter alia, en relación con el tratamiento y/o profilaxis de las condiciones que se caracterizan por un funcionamiento inadecuado de las células endoteliales y puede incluir condiciones como el injerto vascular, transplante de órganos o cicatrización de heridas o condiciones que se caractericen por un fenotipo inflamatorio o angiogénico aberrante de las células endoteliales. Además, el "método de la presente invención facilita el desarrollo de agentes, como poblaciones de células endoteliales manipuladas funcionalmente, para una gama de usos terapéuticos y/o profilácticos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Los detalles bibliográficos de las publicaciones referidas por el autor en esta especificación son recolectadas alfabéticamente al final de la descripción. La referencia a cualquier técnica anterior en esta especificación no es, ni deberá tomarse, como reconocimiento o cualquier forma de sugerencia que la técnica anterior forma parte del conocimiento general común . La sobrevivencia y proliferación de células depende de un suministro adecuado de oxígeno y nutrientes y ¦ la remoción de toxinas. La angiogénesis es el nombre dado al desarrollo de nuevos capilares a partir de vasos sanguíneos preexistentes. Para que las células endoteliales estimuladas formen un nuevo vaso sanguíneo, deben proliferar, migrar e invadir el te ido circundante. En mamíferos adultos, la vasculatura es estática, excepto durante el ciclo fisiológico de la reproducción o en el caso de la cicatrización de heridas. Además, requerimientos adicionales en términos de oxígeno y nutrientes usualmente darán como resultado el brote de nuevos capilares a partir de vasos existentes. Se piensa que la hipervascularización local es el resultado de la liberación, por los tejidos, de medios solubles que han inducido el cambio del fenotipo estático de las células endoteliales al activo, para que las células endoteliales sean capaces de responder a señales mitogénicas . La liberación de factores del crecimiento mitogénicos permite la activación de los receptores que señalan la migración, proliferación y diferenciación celular en nuevos capilares y por lo tanto cambio el fenotipo activado a un fenotipo angiogénico. Existe actualmente la necesidad de desarrollar método para facilitar la angiogenesis, como en el contexto de vascularización de injertos o cicatrización de heridas. En términos del trabajo con y manipulación de células endoteliales, existen ciertas limitaciones funcionales inherentes como los requerimientos para las señales antiapoptóticas mediadas por unión y propagación celular para mantener la disponibilidad celular endotelial . Además, la activación de las diferencias entre las células endoteliales generalmente da como resultado la pérdida del marcador CD34 de las células hematoprogenitoras . Esto altera irreversiblemente el fenotipo de las células endoteliales activadas. A la luz del interés significativo en promover la angiogenesis en ambiente tantos in vitro como in vivo, existe la necesidad de desarrollar medios para facilitar el mantenimiento óptimo de los fenotipos de las células endoteliales y promover el crecimiento óptimo de las células endoteliales. En el trabajo que condujo a la presente invención, se ha determinado que la sobreexpresion del gen humano de la esfingosina cinasa en células endoteliales humanas da como resultado una mejor proliferación y supervivencia celular de las células endoteliales en relación a las celular normales. Además, se ha determinado que la sobreexpresión de la esfingosina cinasa mantiene el fenotipo hematoprogenitor de las células endoteliales, de acuerdo a lo caracterizado por la expresión del CD 34, a pesar de la inducción de la proliferación de células endoteliales. Más aún, la sobreexpresión de la esfingosina cinasa induce los fenotipos inflamatorio y angiogénico de las células endoteliales. En consecuencia, ahora se proporcionan medios para facilitar la manipulación terapéutica de la proliferación y diferenciación de células endoteliales sobre la base de la modulación de los niveles intracelulares de la esfingosina cinasa.

LA INVENCION A través de esta especificación y las siguientes reivindicaciones, a menos que el contexto requiera otra cosa, la palabra "comprenden", y/o variaciones como "comprende" o "que comprende" , deberá entenderse que implica la inclusión de un entero o paso o grupo establecido de enteros o pasos pero no la exclusión de ningún otro entero o paso o grupo de enteros o pasos . Un aspecto de la presente invención está dirigido a un método de modulación de una o más características funcionales de células endoteliales , el método comprende modular el nivel funcional de la enfingosina cinasa donde la inducción de la sobreexpresion en el nivel de esfingosina cinasa modula una o más de las características funcionales de la célula endotelial. En otro aspecto se proporciona un método para modular una o más características funcionales de células endoteliales vasculares, el método comprende modular el nivel funcional de la esfingosina cinasa donde la inducción de la sobreexpresion del nivel de esfingosina cinasa modula una o más de las características funcionales de las células endoteliales vasculares. En otro aspecto más se proporciona un método para modular una o más características funcionales de células endoteliales CD34+, el método comprende modular el nivel funcional de la esfingosina cinasa, donde la inducción de la sobreexpresion del nivel de esfingosina cinasa modula una o más de las características funcionales de la célula endotelial CD34+. La presente invención también proporciona un método para modular una o más características funcionales de células endoteliales, el método comprende modular el nivel funcional de la esfingosina cinasa donde la sobrerregulacion del nivel de esfingosina cinasa modula una o más características funcionales de las células endoteliales en relación a las características funcionales normales de las células endoteliales. Preferiblemente, las células endoteliales son células endoteliales vasculares. En otro aspecto más se proporciona un método de modulación de la proliferación de células endoteliales vasculares, el método comprende modular el nivel funcional de esfingosina cinasa donde la inducción de la sobreexpresión del nivel de esfingosina cinasa mejora la proliferación de las células endoteliales en relación a la proliferación normal de células endoteliales. En otro aspecto más se proporciona un método de modulación de la viabilidad de células endoteliales vasculares, el método comprende modular el nivel funcional de enfingosina cinasa donde la inducción de la sobreexpresión del nivel de esfingosina cinasa mejora la viabilidad de las células endoteliales vasculares en relación a la viabilidad normal de las células endoteliales . En otro aspecto más se proporciona un método de modulación del fenotipo progenitor de células endoteliales CD34+, el método comprende modular el nivel funcional de enfingosina cinasa donde la inducción de la sobreexpresion del nivel de esfingosina cinasa mantiene el fenotipo progenitor de células endoteliales CD34+. Un aspecto más de la presente invención está dirigido "a un método para modular una o más características funcionales de células endoteliales en un mamífero, el método comprende modular el nivel funcional de esfingosina cinasa, donde la inducción de la sobreexpresion del nivel de esfingosina cinasa modula uno o más de las características funcionales de las células endoteliales. En otro aspecto más el método está dirigido a la modulación de una o más características funcionales de células endoteliales vasculares en un mamífero, el método comprende modular el nivel funcional de esfingosina cinasa en el mamífero, donde la inducción de la sobreexpresion del nivel de esfingosina cinasa modula una o más características funcionales de las células endoteliales. La presente invención también proporciona un método para modular una o más características funcionales de células endoteliales, el método comprende modular el nivel funcional de esfingosina cinasa donde la sobrerregulacion del nivel de esfingosina cinasa modula una o más de las características funcionales de las células endoteliales en relación a las características funcionales normales de células endoteliales.

En otro aspecto más se proporciona un método para modular la proliferación de células endoteliales vasculares en un mamífero, el método comprende modular el nivel funcional de la esfingosina cinasa en el mamífero donde la inducción de la sobreexpresión del nivel de la esfingosina cinasa mejora la proliferación de las células endoteliales en relación a la proliferación normal de las células endoteliales . En otro aspecto aún más, se proporciona un método para modular la viabilidad de células endoteliales vasculares en un mamífero, el método comprende modular el nivel funcional de esfingosina cinasa en el mamífero, donde la inducción de la sobreexpresión del nivel de esfingosina • cinasa mejora la viabilidad de las células endoteliales vasculares en relación a la viabilidad normal de las células endoteliales. En otro aspecto más se proporciona un método para modular el fenotipo progenitor de células endoteliales CD34+ en un mamífero, el método comprende modular el nivel funcional de la esfingosina cinasa en el mamífero, donde la inducción de la sobreexpresión del nivel de esfingosina cinasa mantiene el fenotipo progenitor de las células endoteliales CD34+. Otro aspecto de la presente invención contempla un método para tratamiento y/o profilaxis de una condición caracterizada por un funcionamiento aberrante o en otras circunstancias indeseables de las células endoteliales en un mamífero, el método comprende modular el nivel funcional de esfingosina cinasa en el mamífero, donde la inducción de la sobreexpresión del nivel de esfingosina cinasa modula una o más características funcionales de las células endoteliales . Otro aspecto más de la presente invención proporciona un método para el tratamiento y/o profilaxis de una condición caracterizada por el funcionamiento aberrante, o en otras circunstancias indeseable, de las células endoteliales vasculares en un mamífero, el método comprende modular el nivel funcional de esfingosina cinasa en el mamífero, donde la inducción de la sobreexpresión del nivel de esfingosina cinasa modula una o más características funcionales de las células endoteliales. En otro aspecto más se proporciona un método para el tratamiento y/o profilaxis de una condición caracterizada por el funcionamiento aberrante, o en otras circunstancias indeseable, de células endoteliales vasculares en un mamífero, el método comprende administrar al mamífero una cantidad efectiva de un agente durante un tiempo bajo condiciones suficientes para modular el nivel funcional de la esfingosina cinasa. Otro aspecto de la presente invención se relaciona con el uso de un agente capaz de modular el nivel funcional de la esfingosina cinasa en la elaboración de un medicamento para la modulación de una o más características funcionales de células endoteliales en un mamífero, en donde la inducción de la sobreexpresión del nivel de esfingosina cinasa modula una o más de las características funcionales de las células endoteliales. En otro aspecto, la presente invención se relaciona con el uso de esfingosina cinasa o un ácido nucleico que codifica para la esfingosina cinasa para la elaboración de un medicamento para la modulación de una o más características funcionales en células endoteliales en un mamífero, donde la inducción de la sobreexpresión del nivel de esfingosina cinasa modula una o más de las características funcionales de las células endoteliales. En otro aspecto más, la presente invención contempla una composición farmacéutica que comprende el agente modulador como se definió aquí anteriormente y uno o más excipientes y/o diluentes farmacéuticamente aceptables. Otro aspecto más de la presente invención está dirigido a un método para generar células endoteliales, células endoteliales las cuales se caracterizan por la modulación de una o más características funcionales en relación a las características funcionales normales de las células endoteliales, el método comprende inducir la sobreexpresión del nivel funcional de esfingosina cinasa en las células. Otro aspecto más de la presente invención está dirigido a células endoteliales las cuales son generadas de acuerdo con los métodos definidos aquí . Otro aspecto más de la presente invención está dirigido al uso de células endoteliales desarrolladas de acuerdo con el método definido aquí en el tratamiento y/o profilaxis de condiciones caracterizadas por un funcionamiento inadecuado de las células endoteliales.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una imagen que muestra la sobrevivencia de HUVEC que sobreexpresa el SK o EV de acuerdo a lo reflejado por la densidad óptica, en ausencia de FCS (a) y en ausencia de FCS y la unión de la matriz extracelular (b) . (a) muestra los datos reunidos de 43 observaciones derivadas de 9 experimentos separados, (b) muestra los datos reunidos de 10 observaciones de dos experimentos separados, normalizados al día 0 = 1. *p<0.001 comparado con el vector correspondiente al Día 0. Las barras representan intervalos de confianza del 95%. (c) muestra (por electroinmunotransferencia Western) la expresión de ciclina DI y ciclina E en células que sobreexpresan SK y control (EV) bajo condiciones básales (24 horas en medio basal endotelial suplementado con 0.5% de FCS sin factores de crecimiento) y en respuesta a 24 horas de estimulación con factores del crecimiento) . Se indica el control de carga Flt-1 ( EGF-RI ) . La Figura 2 es una imagen que muestra una tinción DAPI efectuada sobre células que sobreexpresan SK y control (EV) en un medio de cultivo suplementado con 20% de FCS (a) o medio libre de suero (b) . Las células apoptóticas muestran una tinción nuclear intensa de DAPI . La Figura 3 es una representación gráfica de la actividad de la caspasa 3 en células que sobreexpresan SK y EV control, medida bajo condiciones de cultivo básales (a), o después de 24 horas de privación de suero (b) . La Figura muestra los datos reunidos de 5 líneas células endotaliales separadas, normalizadas a EV = 1 (a) o EV = 10 (b) . *p<0.5 comparado con EV. Las barras representan intervalos de confianza de 95%. La Figura 4 es una imagen que muestra la electroinmunotransferencia Western de la fosforilación de Akt (p-Akt) en células que sobreexpresen SK y control, bajo condiciones básales y en respuesta 6 horas de privación de suero (SF) . La Figura Xb muestra los datos reunidos de cinco líneas de células endoteliales separadas, *p0.05 SK comparada con EV en condiciones de suero libre. Las barras representan la SEM.

La Figura 5 es una representación gráfica del efecto de inhibir la vía de PI-3K con LY294002 (LY) 10 mM, o la vía de MAPK con U0126 (UO) 20 mM o PD98059 (PD) 20 mM sobre la sobrevivencia celular de HUVEC que sobreexpresan SK (puntos densos) o EV (puntos difusos) . Se indica un control de vehículo de concentración equivalente de DMSO . La Figura muestra los datos reunidos de 8 observaciones de dos experimentos separados, ajustados al día 0=1. Las barras representan intervalos de confianza del 95%. *p<0.001 comparada con las células no tratadas correspondientes que sobreexpresan SK o EV al día 2. La Figura 6 es una imagen que muestra el efecto de la sobreexpresion de SK sobre PECAM-l. La expresión de la superficie célula de PECAM-l de acuerdo a lo indicado por la intensidad de fluorescencia media (MFI) en células que sobreexpresan SK y EV control es indicada en (a) . La figura muestra los datos reunidos de tres experimentos separados, normalizados a EV. *p<0.001 SK comparada con EV. Las barras representan intervalos de confianza de 95%. (b) muestra una electroinmunotrasnferencia Western para PECAM-l y la expresión de b-catenina en esas células, (c) muestra la fosforilación de PECAM-l en células que sobreexpresan SK y control (EV) . (d) muestra la expresión en la superficie celular de cadherina de EV y representa los datos reunidos de tres experimentos separados.

La Figura 7 es una representación gráfica que muestra la permeabilidad (normalizada al tiempo =0) de células que sobreexpresan SK y EV a FITC-dextran, a través de diferentes puntos en el tiempo, bajo condiciones básales (a) o en respuesta a la estimulación con trombina (0.2 unidades/ml) (b) . (b) muestra una comparación de la permeabilidad de EV y SK en respuesta al tratamiento con trombina, *p<0.001 SK comparada con EV bajo condiciones básales a través de todos los puntos en el tiempo. La Figura muestra los datos reunidos de 7 observaciones de 3 experimentos separados . Las barras representan intervalos de confianza del 95%. La Figura 8 es una representación gráfica del efecto de alterar la señalización de PECAM-1 sobre la sobrevivencia celular de HUVEC que sobreexpresan los SK (puntos densos) o EV control (puntos dispersos) en suspensión (a) en condiciones libres de suero (b) . Se muestra el efecto sobre la sobrevivencia celular de 20 mg/ml de anticuerpo anti-PCAM-1 policlonal de conejo (RP) , 20 mg/ml de suero de conejo normal (NRS) , y un anticuerpo monoclonal dirigido a cadherina de VE (55-7H1) a 20 mg/ml. La figura muestra los datos reunidos de 10 observaciones de dos experimentos separados, normalizados al día 0=1. Las barras representan intervalos de confianza del 95%. *p<0.001 comparada con el vector no tratado del Día 2.

La Figura 9 es una representación gráfica del efecto de la señalización de PECAM-1 sobre la activación de la vía de PI-3K/Akt en células que sobreexpresan SK (puntos densos) y EV (puntos dispersos) . (a) muestra una electroinmunotransferencia Western que mide la Akt (p-Akt) fosforilada y Akt en condiciones b sales después de 6 horas de privación de suero. Se muestra el efecto de 20 mg/ml de anticuerpo anti-PECAM policlonal de conejo (RP) , y 20 mg/ml de suero de conejo normal (NRS) . (b) muestra los datos reunidos de la cuantificación de Akt fosforilada de cuatro experimentos separados efectuados como en (a) . Las barras representan una DEM. *p<0.05 de SK no tratada contra EV no tratada en condiciones libre de suero, y SK tratada con RP en comparación con la SK no tratada en condiciones libres de suero. La Figura 10 es una representación gráfica del efecto de inhibir GPCR con toxina de pertusis (50 ng/ml) sobre la sobrevivencia celular en HUVEC que sobreexpresan SK (puntos densos) o EV (puntos dispersos) . (a) muestra los datos reunidos de ocho observaciones de dos experimentos separados, normalizados al día 0=1. *p<0.05 comparada con SK no tratada al día 2. Las barras representan intervalos de confianza de 95%. (b) muestra los datos reunidos de 6 observaciones de dos experimentos separados, las barras representan la SEM. *p<0.05 comparada con SK no tratada.

La Figura 11 es una representación gráfica que demuestra la expresión de moléculas de adhesión basal (a,b) y estimuladas con TNFa (c-f) para células que sobreexpresan S , G82D y control (EV) lograda por la infección con retrovirus (a,c,e) o adenovirus (b,d,f) . La expresión de VCAM-1 se da en a-d, la expresión de Selectina E en e,f. Los resultado se normalizaron a EV=1 para la expresión basal y EV=10 para la estimulada, y las barras representan intervalos de confianza del 95%. Las Figuras a-f muestran los datos reunidos de 3,6,4,5,4 y 6 experimentos separados, respectivamente, usando diferentes aislados de células endoteliales . *p<0.05 comparada con' EV. La Figura 12 es una representación gráfica que demuestra la respuesta de VCAM-1 (a) y selectina E (b) a dosis muy bajas de estimulación con TNFo: (0.004 ng/ml) durante cuatro horas en células infectadas con adenovirus. La Figura muestra los datos de un solo experimento que es representativo de dos experimentos separados en los cuales se observó la misma tendencia. La Figura 13 es una representación gráfica que demuestra el efecto de 18 horas de tratamiento con 50 mg/ml de toxina pertussi (PTx) sobre la expresión basal (a,b) y estimulada con TNFa (c,d) VCAM-1 (a,c) y Selectina E (b,d), de acuerdo a lo reflejado por la intensidad de la fluorescencia media (MFI) en células que sobreexpresan SK y control (EV) . La Figura muestra los datos de un solo experimento que es representativo de los experimentos separados usando diferentes aislados de células endoteliales . La Figura 14 es unza representación gráfica que demuestra la respuesta de la molécula de adhesión a la estimulación con S1P 5 ? durante cuatro horas en células que sobreexpresan SK y EV. La expresión de VCAM-l se muestra en (a) y la expresión de Selectina E en (b) . La Figura muestra los datos reunidos de dos experimentos separados, y las barras representan la DEM. *p<0.05 comparada con el vector no tratado por la Prueba t de Student . La Figura 15 es una imagen (a una amplif cación de 80X) de la adhesión de neutrofilos a células endoteliales que sobreexpresan EV (a,d) SK (b,c) y G28D (c,f) en el estado basal (a-c) y cuando se estimularon durante cuatro horas con 0.04 ng/mL de TNFa (d-f) . La flecha blanca indica un neutrofilo adherente. La Figura muestra los resultado de un experimento que es representativo de dos experimentos separados. La Figura 16 es una representación gráfica del número de neutrofilos adherentes por 100 células endoteliales, de acuerdo a lo determinado a partir de los datos reunidos de diez campos microscópicos separados obtenidos de dos experimentos separados . Las barras representan la SEM. *p<0.05 comparada con la EV correspondiente. **p<0.001 comparada con la EV correspondiente por la prueba t de Student . La Figura 17 es una imagen de la formación de un tubo por células que sobreexpresan SK y control (EV) en Matrigel a 30 minutos (A) y a una hora (B) .

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención es predicada, en parte, sobre la determinación de que las características funcionales de las células endoteliales pueden ser moduladas, en relación a las células endoteliales normales, por la sobreexpresión de esfingosina cinasa. Específicamente, se ha determinado que la sobreexpresión de esfingosina cinasa facilita una mejor proliferación celular y sobrevivencia celular en ausencia de señales antiapoptóticas normales. Además, en el grado en el que el método de la presente invención sea aplicado a células endoteliales que expresan CD34, las propiedades endoteliales, como progenitoras , pueden ser mantenidas a pesar de aparición de proliferación. Más aún, la sobreexpresión de la esfingosina cinasa por células endoteliales induce el fenotipo proinflamatorio y angiogénico de las células endoteliales. En consecuencia, el método de la presente invención permite ahora el diseño racional de método terapéuticos y/o profilácticos para tratar condiciones caracterizadas por un f ncionamiento adecuado de las células endoteliales o para facilitar de otro modo la expansión endotelial ya sea in vitro o in vivo. Las determinaciones detalladas aquí también facilitan el desarrollo de agentes celulares y no celulares para usarse en el contexto del tratamiento de las condiciones detalladas anteriormente y, de otro modo, sembrar y/o expandir una población de células endoteliales. En consecuencia, un aspecto de la presente invención está dirigida a un método para modular una o más características funcionales de células endoteliales, el método comprende modular el nivel funcional de la esfingosina cinasa, donde la inducción de la sobreexpresión del nivel de esfingosina cinasa modula una o más de las características funcionales de las células endoteliales. Con referencia a las "células endoteliales" deberá comprenderse como una referencia a las células endoteliales que revisten los vasos' sanguíneos, linfáticos u otras cavidades serosas como cavidades llenas con fluido. La frase "células endoteliales" deberá ser comprendida como una referencia a células que exhiben una o más de la morfología, fenotipo y/o actividad funcional de células endoteliales y también como referencia a mutantes y variantes de las mismas. Las "variantes" incluyen, pero no se limitan a, células que exhiben algunas pero no todas las características morfológicas o fenotípicas o actividades funcionales de células endoteliales en cualquier etapa de diferenciación del desarrollo. Las "imitantes" incluyen, pero no se limitan, a células endoteliales que han sido modificadas de manera natural o no natural como células que sean genéticamente modificadas. También deberá comprenderse que las células endoteliales de la presente invención pueden estar en cualquier etapa de diferenciación del desarrollo. En consecuencia, las células pueden ser inmaduras y por lo tanto funcionalmente incompetentes en ausencia de diferenciación adicional, como células progenitoras CD34+. A este respecto, no obstante deberá comprenderse que las células altamente inmaduras, como las células diferenciadas, las cuales- tienen la capacidad de diferenciarse a células endoteliales, satisfacerán la definición de "células endoteliales" como se utiliza aquí debido a su capacidad para diferenciarse en células endoteliales bajo condiciones apropiadas. Preferiblemente, las células endoteliales objetivo son células endoteliales vasculares y de manera aún más preferible células endoteliales CD34+. En consecuencia, se proporciona, de manera más particular, un método para modular- una o más características funcionales de células endoteliales vasculares, el método comprende modular el nivel funcional de la esfingosina cinasa donde la inducción de la sobreexpresión del nivel de esfingosina cinasa modula una o más de las características funcionales de las células endoteliales vasculares. De manera aú más particular, se proporciona el método de modulación de una o más características funcionales de células endoteliales CD34+, el método comprende modular el nivel funcional de esfingosina cinasa, donde la inducción de sobreexpresión del nivel de esfingosina cinasa modula una o más de las características funcionales de las células endoteliales CD34+. La referencia a "características funcionales" de las células endoteliales deberá ser comprendida como una referencia a cualquiera de una o más de las características funcionales que una célula endotelial es capaz de exhibir. Estas incluyen, por ejemplo, la proliferación, diferenciación, emigración, mantenimiento de la viabilidad en una estado pasivo o activo, expresión de la molécula en la superficie celular, sensibilización a la estimulación con citosina, modulación de los efectos proinflamatorios de citocinas, capacidad modulada para unirse a neutrofilos y fenotipo inflamatorio y/o angiogénico modulado. En el contexto de la presente invención, se ha determinado que la sobreexpresion de la esfingosina cinasa intracelular puede inhibir la modulación de una o más características funcionales de las células endoteliales . A este respecto, se ha determinado que además de modular la gama y grado normal de características funcionales de las células endoteliales, la modulación objetivo se extiende a inducir características funcionales que generalmente no son introducidas bajo condiciones fisiológicas normales como las características proliferativas y de sobrevivencia celular y diferenciación alterada (esta última forma de modulación es referida aquí como modulación de las características funcionales de las células endoteliales "en relación a las características funcionales normales de las células endoteliales"). "Normal" significa . una característica o. gama de características que son exhibidas por células que expresan niveles fisiológicamente normales de esfingosina cinasa. A este respecto, deberá comprenderse que los niveles fisiológicamente normales de esfingosina cinasa serán iguales a un intervalo de niveles dependiendo de si la célula endotelial dada está en un estado de reposo o activada. En consecuencia, la gama de características funcionales que una célula endotelial pueda desarrollar será usualmente definido por el estado de diferenciación de la célula endotelial y el nivel de expresión de la esfingosina cinasa. Sin limitar la presente invención a ninguna teoría o modo de acción, donde son expresados niveles fisiológicamente normales de esfingosina cinasa, una célula endotelial vascular puede exhibir una o más características incluyendo, pero sin limitarse a: (i) el mantenimiento de un estado viable pero de reposo (ii) la capacidad de diferenciarse bajo condiciones estimuladoras apropiadas (por ejemplo, maduración del estado progenitor CD34+ a un fenotipo de célula endotelial más madura) (iii) la capacidad de proliferar (iv) el mantenimiento de la viabilidad en un estado activado (v) la capacidad de para modular la expresión de moléculas de la superficie celular, como la expresión de moléculas de adhesión (por ejemplo, como un indicador de la maduración o estado de activación) (vi) la capacidad de responder a la estimulación con citocina (vii) la capacidad de unirse a neutrofilos (viii) la capacidad de diferenciarse a un fenotipo proinflamatorio y/o angiogénico. La presente invención está dirigida a modular esas características funcionales que pueden ser observadas bajo condiciones fisiológicas normales. Deberá comprenderse, sin embargo, que bajo condiciones fisiológicas normales existen ciertas limitaciones funcionales inherentes a las cuales las células endoteliales están sometidas. Por ejemplo, para mantener la viabilidad, las células endoteliales vasculares requieren exposición a ciertas señales antiapoptóticas como aquellas que son generadas como resultado de la unión celular y propagación celular endotelial vascular normal. En consecuencia, en ausencia de esas señales - como puede ocurrir donde las células crezcan in vitro en suspensión -ocurrirá una apoptósis indeseable. En otro ejemplo, donde las células endoteliales inmaduras, con reposo expresan el marcador hematoprogenz or de la superficie celular CD34, la estimulación e inducción de la proliferación de las células endoteliales (por ejemplo, para facilitar la angiogénesis) da como resultado la pérdida de expresión de CD34, y por definición, el desarrollo de un fenotipo irreversible y más maduro. En ciertas circunstancias, como cuando se siembran para expandir la población de células endoteliales CD34+, esto puede probar ser desventajoso puesto que las señales que inician la proliferación también conducen a maduración fenotipica. En consecuencia, en una modalidad preferida, las características funcionales objetivo son cualquiera de una o más de las características funcionales detalladas en: (i) a (viii) , anteriores. Como se detallo aquí anteriormente, también se ha determinado que la sobreexpresión de esfingosina cinasa en células endoteliales pueden dar como resultado la inducción de características funcionales que no sean observadas generalmente cuando la esfingosina cinasa sea expresada en el intervalo normal. En consecuencia, la referencia a la "modulación" de las características funcionales de una célula endotelial "en relación a" las características normales de células endoteliales deberá comprenderse con el significado de que la sobreexpresión de los niveles de esfingosina cinasa da como resultado la inducción de una o más características que generalmente no son observadas en el contexto de las células que expresan esfingosina cinasa en el intervalo normal. Deberá comprenderse, sin embargo, que las características objetivo pueden reemplazar totalmente una gama de características funcionales normales de una célula endotelial o una o más de esas características pueden ser expresadas junto con una o más características normales. Sin limitar la presente invención de ninguna manera, los ejemplos de características que pueden ser inducidos en células endoteliales que sobreexpresan niveles de esfingosina cinasa incluyen, pero no se limitan a: - características proliterativas mejoradas tanto en términos de un incremento de la velocidad/grado de proliferación y el requerimiento de condiciones ambientales/condiciones de cultivo celular únicamente mínimas bajo las cuales puede ocurrir la proliferación (aquí posteriormente referida como "proliferación mej orada" ) . - viabilidad celular mejorada. Esto puede ocurrir al nivel de desregulación de la apoptósis o prevención de la muerte celular inducida de otro modo. Por ejemplo, sobrevivencia celular bajo condiciones de tensión (como la remoción de suplementos de cultivo tisular en el ambiente in vitro) es facilitada como lo es la desregulación de la apoptósis que normalmente ocurriría en ausencia de las señales antiapoptóticas que son proporcionadas como resultado del acoplamiento del receptor de integrina durante la unión de la matriz y propagación celular. Este-es particularmente relevante, por ejemplo, donde se requiere que las poblaciones de cultivo celular in vitro sean mantenidas en suspensión (aquí referida como "viabilidad mejorada") . vías de diferenciación cambiadas. En particular, donde el marcador de la superficie celular ematoprogenitor CD4 es desregulado tras la estimulación de la proliferación del progenitor de células endoteliales o la proliferación de células endoteliales CD34+ en reposo, la sobreexpresión de esfingosina cinasa da como resultado la conservación de la expresión de CD34 y el fenotipo progenitor de esas células a. pesar de la aparición de proliferación/expansión (aquí referida como "mantenimiento del fenotipo progenitor de las células endoteliales CD34+") . La modulación de las características funcionales objetivo es por lo tanto, preferiblemente: (i) la proliferación mejorada: (ii) viabilidad mejorada; y/o (iii) mantenimiento del fenotipo progenitor de células endoteliales CD34+. En consecuencia, la presente invención también proporciona un método para modular una o más características funcionales de células endoteliales, el método comprende modular el nivel funcional de esfingosina cinasa, donde la sobrerregulacion del nivel de esfingosina cinasa modula una o más de las características funcionales de las células endoteliales en relación a las características funcionales normales de las células endoteliales . Preferiblemente, las células endoteliales son células endoteliales vasculares.

En una modalidad preferida se proporciona un método para modular la proliferación de células endoteliales vasculares, el método comprende modular el nivel funcional de esfingosinas cinasa, donde la inducción de la sobreexpresion del nivel de esfingosinas cinasa mejora la proliferación de las células endoteliales en relación a la proliferación normal de las células endoteliales . En otra modalidad se proporciona un método para modular la viabilidad endotelial -vascular, el método comprende modular el nivel funcional de la esfingosina cinasa donde la inducción de la sobreexpresion del nivel de esfingosina cinasa mejora la viabilidad de las células endoteliales vasculares en relación a la viabilidad normal de las células endoteliales. En otra modalidad preferida más se proporciona un método para modular el fenotipo progenitor de las células endoteliales CD34+, el método comprende modular el nivel funcional de esfingosina cinasa donde la inducción de la sobreexpresion del nivel de esfingosina cinasa mantiene el fenotipo progenitor de células endoteliales CD34+. De acuerdo con esas modalidades preferidas, de manera más preferida la modulación es la sobrerregulación de las características funcionales objetivo. La referencia a la "esfingosina cinasa" deberá comprenderse como una referencia a todas las formas de esta proteína y a derivados funcionales, homólogos, análogos, equivalentes químicos o miméticos de las mismas. Esto incluye, por ejemplo, cualesquier isoformos que surjan del empalme alternativo del ARNm de la esfíngosina cinasa objetivo o mutantes funcionales o variantes polimórficas de esas proteínas . Como se detalló aquí anteriormente, se ha determinado que la inducción de niveles de esfingosina cinasa intracelular que sean más altos que los niveles básales que son observados en células endoteliales inactivadas o no estimuladas dan como resultado la inducción de características funcionales únicas. En consecuencia, la referencia al "nivel funcional" de la esfingosina cinasa deberá ser comprendido como una referencia al nivel de actividad de esfingosina cinasa que está presente en cualquier célula dada en oposición a la concentración de esfingosina cinasa, per se. Aunque un incremento en la concentración intracelular de esfingosina cinasa generalmente se relacionará con un incremento en el nivel de actividad funcional de esfingosina cinasa que es observada en una célula, el experto en la técnica también comprenderá que incrementos en el nivel de actividad pueden ser logrados por otros medios al de simplemente incrementar las concentraciones intracelular absolutas de esfingosina cinasa. Por ejemplo, pueden utilizarse formas de esfingosina cinasa que exhiban una vida media incrementada o que de otro modo exhiban una actividad mejorada. La referencia a "sobreexpresar" el nivel de esfingosina cinasa objetivo deberá comprenderse, por lo tanto, como una referencia a la sobrerregulación de la esfingosina cinasa intracelular a un nivel funcional efectivo que sea mayor que el expresado bajo condiciones fisiológicas normales para una célula endotelial dada o a la sobrerregulación de los niveles de esfingosina cinasa a cualquier nivel de f ncionalidad pero donde ese evento de sobrerregulación sea uno que sea efectuado artificialmente más que ser un incremento que haya ocurrido en la célula objetivo debido a los efectos de la fisiología natural. En consecuencia, esta última forma de sobrerregulación puede correlacionarse con la sobrerregulación de la esfingosina cinasa a niveles que caigan dentro del intervalo fisiológico normal pero que sean mayores que los niveles de preestimulacion. Los medios por los cuales se lograda la sobrerregulación pueden ser medios artificiales que busquen imitar una vía fisiológica - introduciendo por ejemplo una hormona u otra molécula estimuladora. En consecuencia, el término "que expresa" no pretende limitarse a la noción de la transcripción y traducción del . gen de la esfingosina cinasa. En su lugar, como se discute con mayor detalle aquí posteriormente, es una referencia a un resultado, que es el establecimiento de un nivel funcional mayor y efectivo de esfingosina cinasa que el encontrado bajo condiciones fisiológicas normales en una célula endotelial en un punto particular en el tiempo (es decir, como se detalló aquí anteriormente, incluye incrementos que no ocurren de manera natural en el nivel de esfingosina cinasa, aún donde aquellos incrementos pueden caer dentro del incremento fisiológico normal que uno pueda observar) . La referencia al nivel funcional objetivo es un nivel "efectivo" deberá comprenderse como un nivel de sobreexpresión que logra la modulación de una o más características funcionales de una célula endotelial en relación a una célula endotelial normal. Sin limitar la presente invención a ninguna teoría o modo de acción, se ha determinado de diferentes niveles de sobreexpresión de esfingosina cinasa inducirán cambios celulares específicos y distintos. La referencia a la "modulación" en el contexto de las características funcionales de las células endoteliales deberá comprenderse como una referencia a una inducción de características funcionales como se detalló aquí anteriormente. En el contexto del nivel funcional de la esfingosina cinasa, la referencia a la "modulación" deberá comprenderse como una referencia a la sobrerregulación o desregulación del nivel funcional de esfingosina cinasa. La determinación del nivel óptimo específico (es decir el "nivel efectivo") al cual la esfingosina cinasa deberá ser sobre o desregulada para lograr el cambio fenotípico deseado por cualquier tipo de células endotelial dada es materia de procedimientos de rutina. El experto en la técnica estará familiarizado con los métodos para determinar ese nivel . En una modalidad la presente invención está dirigida a la sobrerregulacion del nivel funcional de esfingosina cinasa como un medio para introducir características funcionales únicas a una población de células endoteliales. Sin embargo, deberá no obstante comprenderse que existen circunstancias en las cuales es deseable desregular el nivel funcional de esfingosina cinasa para obviar la expresión de esas características. Por ejemplo, puede ' buscarse sobreregular el nivel funcional de esfingosina cinasa en el contexto de una población definida de células endoteliales durante un periodo de tiempo suficiente para lograr un objetivo particular. Sin embargo, una vez que el objetivo ha sido logrado probablemente se buscaría desregular el nivel funcional intracelular de la esfingosina cinasa, de un grado que no sea transitorio, de modo que ya no se sobreexprese y las células endoteliales objetivo tomen por lo tanto un fenotipo normal. En otro ejemplo, pueden identificarse ciertas condiciones de enfermedad que sean el efecto caracterizadas por una sobreexpresión del nivel funcional de esfingosinas cinasa, por ejemplo debido al impacto de mutaciones genéticas. En esa situación, puede observarse una proliferación descontrolada de células endoteliales (angiogénesis) que conduciría a la formación de un tumor. Donde existe esa situación, puede buscarse desregular el nivel funcional de esfingosina cinasa como un medio para reestablecer un perfil fenotípico normal a las células endoteliales en cuestión. En otro ejemplo, la desregulación de los niveles de esfingosina cinasa en condiciones inflamatorias puede ser deseable donde la inflamación objetivo se debe a la ocurrencia de un fenotipo inflamatorio de las células endoteliales. En un ejemplo particularmente relevante, la artritis reumatoide se caracteriza por el desarrollo de un fenotipo de célula endotelial angiogénico e inflamatorio. En consecuencia, la desregulacióin de los niveles de esfingocina cinasa y las células endoteliales serían deseables donde un tratamiento terapéutico. La presente invención está dirigida a la sobrerregulación del nivel funcional de esfingosina cinasa para introducir propiedades fenotípicas únicas a la población de células endoteliales y desregular un estado inducido de manera natural o no natural de sobreexpresión de esfingosina cinasa.

Como se detalló anteriormente, la referencia a la "modulación" del nivel funcional de esfingosina cinasa es una referencia a la sobrerregulación y desregulación de esos niveles . Esa modulación puede ser lograda por cualesquier medios adecuados e incluye: (i) Modular los niveles absolutos de la forma activa o inactiva de la esfingosina cinasa (por ejemplo incrementando o hacer disminuir las concentraciones de esfingosina cinasa intracelular) de modo que esté disponible más o menos esfingosina cinasa para la activación y/o interacción con los objetivos corriente abajo . (ii) Agonizar o antagonizar esfingosina cinasa de modo que la efectividad funcional de cualquier molécula de esfingosina cinasa dacia se incremente o disminuya. Por ejemplo, el incremento de la vida media de la esfingosina cinasa puede lograr un incremento en el nivel total de actividad de esfingosina cinasa sin realmente necesitar un incremento en la concentración intracelular absoluta de esfingosina cinasa. De manera similar, el antagonismo parcial de la esfingosina cinasa, por ejemplo acoplando la esfingosina cinasa a una molécula que introduzca algún impedimento ¦ estérico en relación a la unión de la esfingosina cinasa a sus objetivos corriente abajo, puede actuar para reducir, aunque no necesariamente eliminar, la efectividad de la señalización de la esfingosina cinasa. En consecuencia, esto puede proporcionar medios para desregular el funcionamiento de la esfingosina cinasa sin necesariamente desregular la concentración absoluta de la esfingosina cinasa. En términos de lograr la sobre o desregulación del funcionamiento de la esfingosina cinasa, los medios para lograr este objetivo serán bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a: (i) Introducir en una célula una molécula de ácido nucleico que codifique para esfingosina cinasa o un equivalente funcional, derivado o análogo de la misma para sobrerregular la capacidad de la célula para expresar esfingosina cinasa. (ii) Introducir en una célula una molécula proteinácea o no proteinácea que module la regulación transcripcional y/o traslacional de un gen, donde este gen puede ser un gen de esfingosina cinasa o una porción funcional del mismo o algún otro gen que module directa o indirectamente la expresión del gen de la esfingosina cinasa . (iii) Introducir en una célula el producto de expresión de la esfingosina cinasa (en forma activa o inactiva), o un derivado funcional, homólogo, análogo, equivalente o mimético del mismo. (iv) Introducir una molécula proteinácea o no proteinácea que funciona como un antagonista al producto de expresión de esfingosina cinasa. (v) Introducir una molécula proteinácea o no proteinácea que funciona como un agonista de un producto de expresión de esfingosina cinasa. Las moléculas proteináceas descritas anteriormente pueden ser derivadas de cualquier fuente como fuentes naturales, recombinantes o sintéticas e incluyen proteínas de fusión o moléculas que han sido identificadas después, por ejemplo, separar productos naturales. La referencia a moléculas no proteináceas puede ser, por ejemplo, una referencia a una molécula de ácido nucleico o puede ser una molécula derivada de fuentes naturales, como, por ejemplo separación de productos naturales, o puede ser una molécula sintetizada químicamente. La presente invención contempla análogos del producto de expresión de esfingosina cinasa o moléculas pequeñas capaces de actuar como agonistas o antagonistas. Los agonistas químicos pueden no necesariamente ser derivados del producto de la expresión de esfingosina cinasa pero pueden compartir ciertas similitudes conformacionales . De manera alternativa, los agonistas químicos pueden ser diseñados específicamente para satisfacer ciertas propiedades fisicoquímicas . Los antagonistas pueden ser cualquier compuesto capaz de bloquear, inhibir o prevenir de otro modo que la esfingosina cinasa lleve a cabo su función biológica normal, como moléculas que prevenga su activación o también prevengan su funcionamiento corriente debajo de la esfingosina cinasa activada. Los antagonistas incluyen anticuerpos monoclonales y ácidos nucleicos antisentido que previenen la transcripción o traducción de genes o AKNm de esfingosina cinasa en células de mamífero. La modulación de la expresión también puede ser lograda usando antigenos, ARNm, ribosomas , ADNzimas, aptámeros de ARN, anticuerpos o moléculas adecuadas para usarse en la cosupresión. Las moléculas proteináceas y no proteinácesas referidas en los puntos (i) - (v) , anteriormente, son referidas colectivamente aquí como "agentes moduladores" . La separación de los agentes moduladores definida aquí anteriormente puede ser lograda por cualquiera de varios métodos adecuados incluyendo, pero sin limitarse de ninguna manera a, poner en contacto una célula que comprenda un gen de esfingosina cinasa o equivalente funcional del mismo o derivado del mismo y separar por la modulación de la producción o la actividad funcional de la proteína esfingosina cinasa, modulación de la expresión de una molécula de ácido nucleico que codifique para esfingosina cinasa o la modulación de la actividad o expresión del objetivo celular de la esfingosina cinasa corriente abajo. La detección de esa modulación puede ser lograda utilizando técnicas como la electroinmunotransferencia Western, ensayos de desviación de la movilidad electorforética y/o la lectura de reporteros de la actividad de esfingosina cinasa como las luciferasas, CAT y similares. Deberá comprenderse que el gen de esfingosina cinasa o equivalente funcional o derivado del mismo puede encontrarse de manera natural en la célula que sea el objeto de la prueba o pudo haber sido transfectado en una célula anfitriona para propósitos de prueba. Además, el gen natural no transfectado . puede ser expresado constitutivamente, proporcionando por lo tanto un modelo útil para, inter alia, separar agentes que desrregulen la actividad de la esfingosina cinasa, a niveles de ácido nucleico o producto de expresión, o el gen puede requerir activación - proporcionando por lo tanto un modelo útil para, inter alia separar agentes que sobrerregulen la expresión de la esfingosina cinasa. Además, en el grado en que una molécula de ácido nucleico de esfingosina cinasa sea transfectada en una célula, esa molécula puede comprender todo el gen de esfingosina cinasa o puede comprender únicamente una porción del gen como la porción que regule la expresión del producto de la esfingosina cinasa. Por ejemplo, la región promotora de la esfingosina cinasa puede ser transfectada en la célula que sea el objeto de la prueba. A este respecto, donde únicamente es utilizado el promotor, la detección de la modulación de la actividad del promotor puede ser lograda, por ejemplo, ligando el promotor a un gen reportero. Por ejemplo, el promotor puede ser ligado a la lucaferasa o un reportero de CAT, la modulación de la expresión del gen la cual puede ser detectada vía la modulación de la intensidad de la fluorescencia o actividad del reportero CAT, respectivamente. En otro ejemplo, el objeto de la detección podría ser un objetivo regular de esfingosina cinasa corriente abajo, en lugar de la esfingosina cinasa en sí. Otros ejemplos más incluyen sitios de unión de esfingosina cinasa ligados a un reportero mínimo. Por ejemplo, en la modulación de la actividad de la esfingosina cinasa puede ser detectada seleccionado o separando la modulación de la actividad funcional en una célula endotelial. Esto es un ejemplo de un sistema indirecto donde la modulación de la expresión de la esfingosina cinasa, per se, no es el objeto de la detección. En su lugar, se verifica la modulación de las moléculas cuya esfingosina cinasa regula la expresión. Esos métodos proporcionan un mecanismo para efectuar una separación con un alto rendimiento de agentes moduladores putativos como los agentes proteináceos o no proteináceos que comprenden bibliotecas sintéticas combinadas, químicas y naturales. Esos método también facilitarán la detección de agentes que se unen a la molécula de ácido nucleico de esfingosina cinasa o el producto de expresión en sí o que modulan la expresión de una molécula corriente arriba, molécula corriente arriba la cual posteriormente modula la expresión de esfingosina cinasa o la actividad del producto de la expresión. En consecuencia, esos métodos proporcionan un mecanismo para detectar agentes que modulan directa o indirectamente la expresión y/o actividad de la esfingosina cinasa. Los agentes que son utilizados de acuerdo con el método de la presente invención pueden tomar cualquier forma adecuada. Por ejemplo, los agentes proteináceos pueden estar glicosilados o no glicosilados , fosforilados o desfororilados en varios grados, y/o pueden contener una gama de otras moléculas usadas, ligadas, unidas o asociadas de otro modo con proteínas como aminoácidos, lípidos, carbohidratos u otros péptidos, polipéptidos o proteínas. De manera similar, las moléculas no proteinaceas objetivo también pueden tomar cualquier forma adecuada. Ambos agentes proteinaceas y no proteináceos aquí descritos pueden estar ligados, unidos o asociados de otro modo con cualesquier otras moléculas proteinaceas o no proteináceas . Por ejemplo, en una modalidad de la presente invención, el agente está asociado con una molécula que permite su dirección a una región localizada. La molécula proteinacea o no proteinacea objetivo puede actuar directa o indirectamente para modular la expresión de la esfingosina cinasa o la actividad del producto de la expresión de la esfingosina cinasa. La molécula actúa directamente si se asocia con la molécula de ácido nucleico de esfingosina cinasa o el producto de expresión para modular la expresión o actividad, respectivamente. La molécula actúa indirectamente si se asocia con una molécula diferente a la molécula de ácido nucleico de esfingosina cinasa o el producto de expresión de molécula diferente la cual modula directa o indirectamente la expresión o actividad de la molécula de acudo nucleido de esfingosina cinasa o producto de expresión, respectivamente. En consecuencia, el método de la presente invención abarca la regulación de la actividad de la expresión de la molécula de ácido nucleico de esfingosina cinasa o producto de expresión vía la inducción de una cascada de pasos reguladores. El término "expresión" en este contexto se refiere a la transcripción y traducción de una molécula de ácido nucleico. La referencia al "producto de expresión" es una referencia al producto producido a partir de la transcripción y traducción de una molécula de ácido nucleico. Los "derivados" de las moléculas aquí descritas (por ejemplo esfingosina cinasa u otros agentes proteináceos o no proteináceos) incluyen fragmentos, partes, porciones o variantes de fuentes naturales o no naturales. Las fuentes no naturales incluyen, por ejemplo, fuentes recombinantes o sintéticas. "Fuentes recombinantes" significa que la fuente celular de la cual la molécula objetivo se cosechó ha sido alterada genéticamente. Esto puede ocurrir, por ejemplo, para incrementar o mejorar de otro modo la velocidad y volumen de producción por esa fuente celular particular. Las partes o fragmentos incluyen por ejemplo, regiones activas de la molécula. Los derivados pueden ser derivados de la inserción, supresión o sustitución de aminoácidos . Los derivados de la inserción de aminoácidos incluyen fusiones amino y/o carboxilo terminales así como inserciones intrasecuencia de un solo o múltiples aminoácidos. Las variantes de la secuencia de aminoácidos por inserción son aquellas en las cuales se introdujo uno o más aminoácidos residuales en un sitio predeterminado en la proteína aunque también es posible la inserción aleatoria con la separación adecuada del producto resultante. Las variantes de supresión se caracterizan por la remoción de uno o más aminoácidos de la secuencia. Las variantes de aminoácidos por sustitución son aquellas en las cuales al menos un residuo en una secuencia ha sido removido y se insertó un residuo diferente en su lugar. Las adiciones a secuencias de aminoácidos incluyen fusiones con otros péptidos, polipéptidos y proteínas, como se detalló anteriormente . Los derivados también incluyen fragmentos que tienen epítopes o partes particulares de toda la proteína fusionadas a péptidos, polipéptidos u otras moléculas protienaceas o no proteinaceas . Por ejemplo, la esfingosina cinasa o un derivado de la misma puede ser fusionada a una molécula para facilitar su entrada en una célula. Los análogos de las moléculas contempladas aquí incluyen, pero no se limitan a, modificación a las cadenas laterales, incorporación de aminoácidos no naturales y/o sus derivados durante la síntesis del pép ido, polipéptido o proteína y el uso de reticuladores y otros método que impongan restricciones conformaciones sobre las moléculas proteinaceas o sus análogos. Los derivados de secuencias de ácido nucleico que pueden ser utilizados de acuerdo con el método de la presente invención pueden igualmente ser derivados de una sola o múltiples sustituciones, supresiones y/o adiciones nucleotídicas, incluyendo la fusión con otras moléculas de ácido nucleico. Los derivados de moléculas de ácido nucleico utilizados en la presente invención incluyen oligonucleótidos , cebadores de PCR, molécula antisentido, moléculas adecuadas para usarse en la cosupresión y fusión de moléculas de ácido nucleico. Los derivados de secuencias de ácido nucleico también incluyen variantes degeneradas. Deberá comprenderse que una "variante" de la esfingosina cinasa significa moléculas que exhiben al menos alguna de las actividades funcionales de la forma de esfingosina cinasa que es una variante. Una variación puede tomar cualquier forma y puede ocurrir de manera natural o no natural . Una molécula mutante es una que exhibe una actividad funcional modificada. Un "homologo" significa que la molécula es derivada de una especie diferente a la que está siendo tratada de acuerdo con el método de la presente invención. Esto puede ocurrir, por ejemplo, donde se determina una especie diferente a la que está siendo tratada produce una forma de esfingosina cinasa que exhibe características funcionales similares y adecuadas a la de la esfingosina cinasa que es producida naturalmente por el sujeto que está siendo sometido a tratamiento. Los equivalentes químicos y funcionales deberán ser comprendidos como moléculas que exhiben cualquiera de una' o más de las actividades funcionales de la molécula objetivo, equivalentes funcionales los cuales pueden ser derivados de cualquier fuente como si fuera sintetizados químicamente o identificados vía proceso de separación como una separación de productos naturales. Por ejemplo, los equivalentes químicos o funcionales pueden ser diseñados y/o identificados utilizando métodos bien conocidos como separación de alto rendimiento o química combinatoria de bibliotecas recombinantes o después de la separación de productos naturales . Por ejemplo, pueden ser separadas bibliotecas que contengan moléculas orgánicas pequeñas, donde sean usadas moléculas orgánicas que tengan un gran número de sustituciones de grupos originales específicas. Un esquema sintético general puede seguir los métodos publicados (por ejemplo, Bunin BA, et al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 91: 4708-4712; DeWitt SH, et al. (1993) Proc. líati. Acad. Sci. USA, 90:6909-6913). De manera breve, en cada paso sintético sucesivo, se agrega uno de una pluralidad de sustituyentes seleccionados, diferentes, a cada uno de un subconjunto seleccionado de tubos en un arreglo, con la selección de los subconjuntos de tubos siendo tal que genere todas las permutaciones posibles de los diferentes sustituyentes empleados para producir la biblioteca. Una estrategia de permutación adecuada se expone en la Patente Estadounidense No. 5,763,263. Actualmente existe un interés amplio en usar bibliotecas combinadas de moléculas orgánicas aleatorias para buscar componentes biológicamente activos (véase por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 5,763,263). Los ligandos descubiertos por la separación de bibliotecas de este tipo pueden ser útiles para imitar o bloquear ligandos naturales o interferir con los ligandos naturales de un objetivo biológico. En el presente contexto, por ejemplo, pueden ser usados como punto de partida para desarrollar análogos de esfingosina cinasa que exhiban propiedades como efectos farmacológicos más potentes. La esfingosina cinasa o una parte funcional de la misma puede, de acuerdo a la presente invención, ser usada en bibliotecas combinadas formadas por varios métodos sintéticos en fase sólida o fase en solución (véase por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 5,763,263 y referencias citadas ahí). Mediante el uso de técnicas, como la que se describe en la Patente Estadounidense No. 5,753,187, pueden ser separados de manera rutinaria millones de nuevos compuestos químicos y/o biológicos en menos de unas cuantas semanas. De un gran número de compuestos identificados, únicamente aquellos que exhiben "una actividad biológica apropiada son analizados adicionalmente . Con respecto a los métodos de separación de bibliotecas con un alto rendimiento, los compuestos de bibliotecas oligoméricas o de moléculas pequeñas capaces de interactuar específicamente con un agente biológico seleccionado, como una biomolécula, un complejo macromolecular o célula, son separados utilizando un dispositivo de biblioteca combinada que es elegido fácilmente por un experto en la técnica de la gama de método bien conocidos, como aquellos descritos anteriormente. En ese método, cada miembro de la biblioteca es separado por su capacidad para interactuar específicamente con el agente seleccionado. En la práctica del método, un agente biológico es llevado a tubos que contienen el compuesto y se deja interactuar con el compuesto de la biblioteca individual en cada tubo. La interacción es diseñada para producir una señal detectable que pueda ser .usada para verificar la presencia de la interacción deseada. Preferiblemente, el agente biológico está presente en una solución acuosa y las condiciones adicionales son adaptadas dependiendo de la interacción deseada. La detección puede ser efectuada por ejemplo por cualquier método funcional o no funcional bien conocido para la detección de sustancias. Además de separar las moléculas que imitan la actividad de la esfingosina cinasa, también puede ser deseable identificar y utilizar moléculas que funcionen de manera agonista o antagonista a la esfingosina cinasa para sobre o desregular la actividad funcional de la esfingosina cinasa en relación a la modulación del crecimiento de las células endoteliales . El uso de esas moléculas es descrito con mayor detalle más adelante. En el grado que la molécula objetivo sea proteinacea, puede ser derivada, por ejemplo, de fuentes naturales o recombinantes incluyendo proteínas de fusión y siguiendo, por ejemplo, los métodos de separación descritos anteriormente. La molécula no proteinacea puede ser, por ejemplo, una molécula química o sintética que también haya sido identificada o generada de acuerdo con la metodología identificada anteriormente. En consecuencia, la presente invención contempla el uso de análogos químicos de la esfingosina cinasa capaces de actuar como agonistas o antagonistas. Los agonistas químicos pueden no necesariamente ser derivados de esfingosina cinasa pero pueden compartir ciertas similitudes conformacionales . De manera alternativa, los agonistas químicos pueden ser diseñados específicamente para imitar ciertas propiedades fisicoquímicas de la esfingosina cinasa. Los antagonistas pueden ser cualquier i compuestos capaz de bloquear, inhibir o prevenir de otro modo que la esfingosina cinasa lleve a cabo sus funcionales biológicas normales. Los antagonistas incluyen anticuerpos monoclonales específicos para la esfingosina cinasa o partes de esfingosina cinasa. Los análogos de la esfingosina cinasa o agentes agonistas o antagonistas de la esfingosina cinasa contemplados aquí incluyen, pero no se limitan a modificaciones a las cadenas laterales, incorporar los aminoácidos y/o derivados no naturales durante la síntesis del péptido, polipéptido o protelna y el uso de reticulantes y otros métodos que impongan restricciones conformacionales sobre los análogos. La forma específica en la cual toma lugar esas modificaciones dependerá de si la molécula objetivo es proteinacea o no proteinacea. La naturales y/o idoneidad de una modificación particular puede ser determinada de manera rutinaria por el experto en la técnica. Por ejemplo, los ejemplos de modificaciones de la cadena lateral contemplados por la presente invención incluyen modificaciones de grupos amino como por alguilación reductiva por reacción con aldehido seguida por la reducción de NaBH4, amidación con metiacetimidato, acilación con anhídrido acético; carbamoilación de grupos amino con cianatos; trinitorbencilación de grupos amino con ácido 2 , , 6-trinitribencesulfónico (TNBS) ; acilación de grupos amino con anhídrido succínico y anhídrido tetrahidroftálico; y piridoxilación de lisina con piridoxal-5-fosfato seguida por reducción con NaBH . El grupo guanidina de residuo de arginina puede ser modificado por la formación de productos de condensación heterocíclicos con reactivos como la 2,3-butandiona, fenilglioxal y glioxal.

El grupo carboxilo puede ser modificado por activación con carbodiimida vía la formación de O-acilisourea seguida por una derivación posterior, por ejemplo, a una amida correspondiente. Los grupos sulfhidrilo pueden ser modificados por métodos como la carboximetilación con ácido yodoacético o yodoacetamida; oxidación con ácido perfórmico a ácido cistéico, formación de disulfuros mezclados con otros compuestos de tiol; reacción con maleimida, anhídrido maléico u otra maleimida sustituida; formación de derivados mercuriales usando 4-cloromercuribenzoato, ácido 4-mercurifenilsufónico, cloruro de fenilmercurio, 2-cloromerciri-4-nitrofenoil y otros mercuriales ; carbamoiíación con cianato a pH alcalino. Los residuos de triptofano pueden ser modificados, por ejemplo, por oxidación con N-bromosuccinimida o alquilación del anillo de indol con bromuro de 2-hídroxí-5-nitrobencilo o haluros de sulfonilo. Los residuos de tirosina por otro lado, pueden ser alterados por nitración con tetranitrometano para formar el derivado de 3 -nitropirosina . La modificación del anillo imidazol de un residuo de histidina puede ser lograda por alquilación con derivados de ácido yodoacético o N-carboetoxilación con dietilpirocarbonato .

Los ejemplos de incorporación de aminoácidos y derivados no naturales durante la síntesis de proteina incluyen, pero no se limitan a, el uso de norleucina, ácido 4-aminobutírico, ácido 4-amino-3-hidroxi-5-fenilpentanóico, ácido 6-aminohexanóico, t-butilglicina, norvalina, fenilglicina, ornitina, sarcosina, ácido 4-amino-3-hidroxi-6-metilhetpanóico, 2-tienilalanina y/o isómeros D de aminoácidos. Una lista de aminoácidos no naturales contemplados aquí se muestra en la Tabla 1.

TABLA 1 Aminoácidos no Código Aminoácido no Código convencionales convencional acido a- Abu L-N-metilalanina Nmala aminobutírico a-amino-a- Mgabu L-N-metilarginina Nmarg metilbutirato aminociclopropan- Cpro L-N-metilasparagina Nmasn carboxilato ácido Aib ácido L-N- Nmasp aminoisobutírico metilaspártico ainonorbornil- Norb L-N-metilcisteína Nmcys carboxilato ciclohexilalaniña Chexa L-N-metilglutamina Nmgln Aminoácidos no Código Aminoácido no Código convencionales convencional ciclopentilalanina ' Cpen ácido L-N- Nmglu metilglutámico D-alanina Dal L-N-metilhistidina Nmhis D-arginina Darg L-N-metilisoleucina Nmilc ácido D-aspártico Dasp L-N-metilleucina Nmleu L-N-metillisina Nmlys D-cisteína Dcys L-N-metilmetionina Nmmet D-glutamina Dgln L-N-metilnorleucina Nmnle L-N-metilnorvalina Nmnva ácido D-glutámico Dglu L-N-metilornitina Nraorn D-histidina Dhis L-N- Nmphe metilfenilalanina D-isoleucina Dile L-N-metilprolina Nmpro D-leucina Dleu L-N-metilserina Nmser D-lisina Dlys L-N-metiltreonina Nmthr D-metionina Dmet L-N-metiltriptófano Nmtrp D-ornitina Dorn L-N-metiltirosina Nmtyr D-fenilalanina Dphe L-N-metilvalina Nmval D-prolina Dpro L-N- Nmetg metiletilglicina D-serina Dser L-N-raetil-t- Nmtbug butilglicina D-treonina Dthr L-norle cina Nle Aminoácidos no Código Aminoácido no Código convencionales convencional D-triptófano Dtrp L-norvalina Nva D-tirosina Dtyr ot-metil- Maib aminoisobutirato D-valina Dval -metil- Mgabu aminobutirato D-a-metilalaniña Dmala -metilciclohexil- Mchexa alanina D- -metilarginina Dmarg -metilciclo- Mcpen pentilalanina D-oc- Dmasn a-metil- - Manap metilasparagina naftil lanina D-cc- Dmasp a-metilpenicilamina pen metilaspartato D-oc-metilcisteina Dmcys N- (4-aminobutil) Nglu glicínico D-oc- Dmgln N- (2-aminoetil) Naeg metilglutamina glicina) D-oc- Dmhis N- (3-aminopropil) Norn metilhistidina glicina D- - Dmile N-amino-a- Nmaabu metilisoleucina metilbutirato D-a-metilleucina Dmleu oc-naftilalanina Anap Aminoácidos no Código Aminoácido no Código convencionales convencional D- -metillisina Dmlys N-bencilglicina Nphe D-ot- Dmmet N- (2- Ngln metilmetionina carbamiletil) glicina D- -metilornitina Dmorn N- Nasn (carbamilmetil) glicina) D-a- Dmphe N- (2- Nglu metilfenilalanina carboxietil) glicina) D-a-metilprolina Dmpro N- (carboximetil ) glicina Nasp D- -metilserina Dmser N-ciclobutilglicina Ncbut D- -metiltreonina Dmthr N-cicloheptilglicina Nchep D-oc- Dmtrp N-ciclohexilglicina Nchex metiltriptófano D-a-metiltirosina Dmty N-ciclodecilglicina Ncdec D-ot-metilvalina Dmval N-ciclododecilglicina Ncdod D-N-metilalanina Dnmala N-ciclooctilglicina Ncoct D-N-metilarginina Dnmarg N-ciclopropilglicina Ncpro D-N-metilaspa- Dnmasn N-cicloundecilglicina Ncund ragina D-N- Dnmasp N- (2 , 2 -difeniletil) Nbhm metilaspartato glicina D-N-metilcisteína Dnmcys N- (3 , 3-difenilpropil) Nbhe Aminoácidos no Código Aminoácido no Código convencionales convencional D-N-metilglutamina Dnmgln N- (3-guanidinopropil) Narg glicina D-N-metilglutamato Dnmglu N- (1-hidroxietil) Nthr glicina D-N-metilhistidina Dnmhis N- (hidroxietil) ) Nser glicina D-N-metiliso- Dnmile N- (imidazoliletil) ) Nhis leucina glicina D-N-metilleucina Dnmleu N- (3-indoliletil) Nhtrp glicina D-N-metillisina Dnmlys N-metil-?- Nmgabu aminobutirato N-metilciclohexil- Nmchexa D-N-metilmetionina Dnmmet alaniña D-N-metilornitina Dnmorn N-metilciclopentil- Nmcpen alaniña N-metilglicina Nala N-metilfenilalanina Dnmphe N-metilaminoiso- Nmaib D-N-metilprolina Dnmpro butirato N- (1-metilpropil) Nile D-N-metilserina Dnmser glicina Aminoácidos no Código Aminoácido no Código convencionales convencional N- (2-metilpropil) Nleu D-N-metiltreonina Dnmthr glicina D-N- Dnmtrp N- (1-metiletil) glicina) Nval metiltriptófano D-N-metiltirosina Dnmtyr N-metila-naftilalanina Nmanap D-N-metilvalina Dnmval N-metilpenicilamina Nmpen ácido ?- Gabu N- (p-hidroxifenil) Nhtyr arainobutírico glicina L-t-butilglicina Tbug N- (tiometil) glicina Ncys L-etilglicina Etg Penicilamina Pcn L- Hphe L- -metilalanina Mala homofenilalaniña L-oc-metilarginina Marg L- -metilasparagina Masn L-ct- Masp L-a-metil-t- Ntbug metilaspartato butilglicina L-a-metilcisteína Mcys L-metiletilglicina Metg L-a-metilglutamina Mgln L-a-metilglutamato Mglu L- -metilhistidina Mhis L-a-metilhomo- Mhphe fenilalanina L-a- Mile N-(2- Nmet metilisoleucina metiltioetil) glicina L- -metilleucina Mleu L-oc-metillisina lys Aminoácidos no Código Aminoácido no Código convencionales convencional L-oc- Nmet L-a-raetilnorleucina Mnle metilmetionina L-ot- nva L-a-metilornitina Morn metilnorvalina L-a-metilprolina Mpro L-oc- Mphe L-a-metiltreonina Mthr metilfenxlalanina L-a-metilserina Mser L-a-metiltirosina Mtyr L-a- Mtrp L-N- Nmhphe metiltriptófano metilhomofenxlalanina L-a-metilvalina Mval N-(N-(3,3- Nnbhc difenilpropil) carbamilmetil) glicina N- (N- (2,2-di-feniletil) carbamilmetil) glicina 1-carboxi-l- (2 , difenil-etilamino) ciclopropano Pueden ser usados reticulantes,; por ejemplo, para estabilizar conformaciones 3D, usando reticulantes homobifuncionales como los imido ésteres bif ncionales que tengan grupos separadores (CH2)n con n=l a n=6 , glutaraldehldo , N-hidroxisuccinimido ésteres y reactivos heterobifuncionales que usualmente contengan una porción reactiva con amino como la N-hidroxisuccinimida y una porción que reaccione con otro grupo específico. El método de la presente invención contempla la modulación del funcionamiento de las células endoteliales tanto in vi tro como in vivo. Aunque el método preferido es tratar a un individuo in vivo, no obstante deberá comprenderse que puede ser deseable que el método de la invención sea aplicado en un ambiente in vitro. Por ejemplo, puede buscarse iniciar la angiogénesis induciendo la proliferación de las células endoteliales de acuerdo con el método de la presente invención en un injerto donador antes de su introducción en un anfitrión. En otro ejemplo, puede buscarse expandir poblaciones de células endoteliales en cultivo antes de su introducción localizada a un sujeto que esté bajo tratamiento. En otro ejemplo más, el método de la presente invención puede ser utilizado para crear líneas celulares. En consecuencia, otro aspecto de la presente invención est · dirigido a un método para modular una o más características funcionales de células endoteliales en un mamífero, el método comprende modular el nivel funcional de la esfingosina cinasa, donde la inducción de la sobreexpresión del nivel de la esfingosina cinasa modula una o más de las características funcionales de las células endoteliales . De manera más particular, el método está dirigido a la modulación de una o más características funcionales de células endoteliales vasculares en un mamífero, el método comprende modular el nivel funcional de la esfingosina cinsa en el mamífero, donde la inducción de la sobreexpresión del nivel de esfingosina cinasa modula una o más de las características funcionales de las células endoteliales . De manera aún más particular, las células endoteliales vasculares son células endoteliales CD34+. Preferiblemente, las características funcionales son una o más de : (i) el mantenimiento de un estado viable pero de reposo (ii) la capacidad de diferenciarse bajo condiciones estimuladoras apropiadas (por ejemplo, maduración del estado progenitor CD34+ a un fenotipo de célula endotelial más madura) (iii) la capacidad de proliferar (iv) el mantenimiento de la viabilidad en un estado activado (v) la capacidad de para modular la expresión de moléculas de la superficie celular, como la expresión de moléculas de adhesión (por ejemplo, como un indicador de la maduración o estado de activación) (vi) la capacidad de responder a la estimulación con citocina (vii) la capacidad de unirse a neutrófilos (viii) la capacidad de diferenciarse a un fenotipo proinflamatorio y/o angiogénico. La presente invención también proporciona un método para modular una o más características funcionales de células endoteliales , el método comprende modular el nivel funcional de esfingosina cinasa donde la sobrerregulación del nivel de esfingosina cinasa modula una o más de las características funcionales de las células endoteliales en relación a las características funcionales de las células endoteliales. En una modalidad preferida, se proporciona un método para modular la proliferación de células endoteliales vasculares en un mamífero, el método comprende modular el nivel funcional de la esfingosina cinasa en el mamífero, donde la inducción de la sobreexpresion del nivel de la esfingosina cinasa mejora la proliferación de las células endoteliales en relación a la proliferación normal de las células endoteliales . En otra modalidad preferida, se proporciona el método para modular la viabilidad de células endoteliales vasculares en un mamífero, el método comprende modular el nivel funcional de la esfingosina cinasa en el mamífero, donde la inducción de la sobreexpresion del nivel de la esfingosina cinasa mejora la 'viabilidad de las células endoteliales vasculares en relación a la viabilidad normal de las células endoteliales. En otra modalidad preferida más, se proporciona un método para modular el fenotipo progenitor de células endoteliales CD34'+, en un mamífero, el método comprende modular el nivel funcional de la esfingosina cinasa en un mamífero, donde la inducción de la sobreexpresion del nivel de esfingosina cinasa mantiene el fenotipo progenitor de células endoteliales CD34+. Un aspecto más de la presente invención se relaciona con el uso de la invención en relación al tratamiento y/o profilaxis de condiciones de enfermedad u otras condiciones indeseables. Sin limitar la presente invención a ninguna teoría o modo de acción, el desarrollo de la metodología que facilita la mejoría de la proliferación de las células endoteliales, la viabilidad y mantenimiento del fenotipo de las células endoteliales CD34+ progenitoras y la modulación de los fenotipos inflamatorio y angiogénico de las células endoteliales proporciona medios para expandir rápida y eficientemente poblaciones de células endoteliales in vitro o in vivo. Por ejemplo, el hecho de que la viabilidad de esas células puedan ser mejoradas hace la invención particularmente útil en situaciones donde puedan estar presentes factores ambientales ideales. A este respecto, los inventores han desarrollado aqui medios para generar poblaciones particularmente robustas de células endoteliales. En modalidades particularmente preferidas, el método de la presente invención puede ser utilizado para establecer injertos vasculares, para inducir o sembrar la vascularización de injertos de tejidos u órganos para inducir la vascularización de regiones desvascularizadas como regiones de deposición de placa amiloide. En otro ejemplo, el método de la presente invención podría ser utilizado para proporcionar fármacos al sistema vascular vía células endoteliales que puedan requerir las características fenotípicas inducidas por la sobreexpresión de esfingosina cinasa para proporcionar las condiciones de sobrevivencia y maduración deseadas. Además, mantener poblaciones de células endoteliales inmaduras puede ser útil en el grado en que esas células se requieren para facilitar su estimulación y diferenciación junto con un linaje celular particular, aún un linaje celular no vascular para la diferenciación de células de músculo. La sobreexpresión de esfingosina cinasa seria útil en este contexto puesto que podrían ser mantenidas poblaciones de células endoteliales proliferantes inmaduras en una forma efectiva. Más aún, la desregulación de fenotipo inflamatorio y/o angiogénico en condiciones inflamatorias como la artritis reumatoide sería deseable. La presente invención por lo tanto contempla un método para el tratamiento y/o profilaxis de una condición caracterizada por el funcionamiento aberrante o en otras circunstancias indeseables de las células endoteliales en un mamífero, el método comprende modular el nivel funcional de esfingosina cinasa en el mamífero, donde la inducción de la sobreexpresión del nivel de esfingosina cinasa sobrerregula una o más características funcionales de las células endoteliales. Con referencia al "funcionamiento aberrante o en otras circunstancias indeseable , de las células endoteliales" deberá comprenderse como una referencia a un funcionamiento subactivo de las células endoteliales, funcionamiento superactivo de las células endoteliales, en relación al funcionamiento fisiológicamente normal que es inapropiado y que es demasiado bajo o a la ausencia de funcionamiento. A este respecto, la referencia al "funcionamiento" deberá comprenderse como una referencia a cualquiera de una o más de las características funcionales normales como se definió aquí anteriormente . La referencia al "funcionamiento inadecuado" deberá comprenderse también que incluye la referencia a la presencia de un número insuficiente de células progenitoras para diferenciarse a lo largo de la vía de las células endoteliales. Por ejemplo, en ciertas situaciones, como la cicatrización de heridas y trasplante de tejido/órganos, pueden existir niveles muy bajos de células progenitoras CD34+ disponibles para diferenciarse a lo largo de la vía de las células endoteliales. El método de la presente invención proporciona medios no solo para generar la expansión de los progenitores de células endoteliales, sino también medios para mantener la población de esas células progenitoras, a pesar de -la aparición de proliferación. De manera más particular, la presente invención proporciona un método para el tratamiento y/o profilaxis de una condición caracterizada por funcionamiento aberrante o en otras circunstancias indeseable de las células endoteliales vasculares en un mamífero, el método comprende modular el nivel funcional de esfingosina cinasa en el mamífero, donde la inducción de la sobreexpresión del nivel de esfingosina cinasa sobrerregula una o más de las características funcionales de las células endoteliales. Preferiblemente la condición es el injerto vascular, reparación de heridas, trasplante de tejidos/órganos o la reparación de tejido desvascularizado y la modulación de la esfingosina cinasa es la sobrerregulación. En una modalidad más preferida, la característica funcional sobrerregulada es una o más de la proliferación mejorada de células endoteliales, viabilidad mejorada de las células endoteliales, y/o mantenimiento del fenotipo progenitor de células endoteliales CD34+. En otra modalidad preferida, la condición es una condición inflamatoria y la modulación de la esfingosina cinasa es la desregulación. De manera más preferible, la característica funcional desrregulable es la desregulación del fenotipo inflamatorio y/o angiogénico de las células endoteliales . En otra modalidad preferida más, la condición se caracteriza por la angiogenesis indeseable y la modulación de la esfingosina cinasa es la desregulación. De manera más preferible, las características funcionales desrreguladas es el fenotipo angiogénico de las células endoteliales y la condición es un tumor. En una modalidad más preferida, se proporciona el método para el tratamiento y/o profilaxis de una condición caracterizada por el funcionamiento aberrante o en otras circunstancias indeseable de las células endoteliales vasculares en una mamífero, el método comprende administrar al mamífero una cantidad efectiva de un agente durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para modular el nivel funcional de la esfingosina cinasa . La referencia al "agente" deberá comprenderse que tiene el mismo significado que se definió aquí anteriormente. Sin embargo, en el contexto de este aspecto de la presente invención la referencia a "agente" también deberá comprenderse como una referencia en una población de células endoteliales que han sido tratadas de acuerdo con el método de la presente invención. Por ejemplo, el tratamiento profiláctico o terapéutico de una condición caracterizada por un funcionamiento inadecuado de las células endoteliales vasculares puede ser logrado introduciendo al paciente una población de células endoteliales que exhiba una o más de las características funcionales mejoradas que sean obtenibles de acuerdo con el método de la presente invención. Por ejemplo, una población de progenitoras de células endoteliales CD34+ tratadas de manera adecuada pueden ser introducidas en un sitio que requiera revascularización como un sitio de reparación de heridas o un sitio de vascularización anormal (como ocurriría donde se depositen placas amiloides) . Una "cantidad efectiva" significa una cantidad necesaria al menos parcialmente para lograr la respuesta deseada, o retrasar la aparición o inhibir el progreso o detener en conjunto, la aparición o progreso de la condición particular que esté siendo tratada. La cantidad varía dependiendo de la salud y condición física del individuo a ser tratado, el grupo taxonómico del individuo a ser tratado, el grado de protección deseado, la formulación de la composición, la evaluación de la situación médica y otros factores relevantes . Se espera que la cantidad caiga en un intervalo relativamente amplio que pueda ser determinada a través de ensayos de rutina. La referencia aquí al "tratamiento" y "profilaxis" se considera en su contexto más amplio. El término "tratamiento" no necesariamente implica que un sujeto sea tratado hasta su recuperación total. De manera similar, "profilaxis" no necesariamente significa que el sujeto eventualmente no contraiga una condición de enfermedad. En consecuencia, el tratamiento y profilaxis incluyen el alivio de los síntomas de una condición particular o prevención o de otro modo reducción del riesgo de desarrollar una condición particular. El término "profilaxis" puede ser considerado como la reducción de la severidad o aparición de una condición particular. El "tratamiento" también puede reducir la severidad de una condición existente. La presente invención contempla además una combinación de terapias, como la administración del agente modulador junto con otras moléculas proteináceas y no proteináceas que faciliten el resultado terapéutico o profiláctico deseado. La administración de moléculas de la presente invención descritas aquí anteriormente [aquí referidas colectivamente como "agente modulador"] , en forma de una composición farmacéutica, puede ser efectuada por cualesquier medios convenientes. El agente modulador de la composición farmacéutica se contempló para exhibir actividad terapéutica cuando se administre una cantidad que dependa del caso particular. La variación depende, por ejemplo, del humano o. animal y el agente modulador elegido. Puede ser aplicable un amplio intervalo de dosis. Considerando a un paciente, por ejemplo, puede administrase de aproximadamente 0.1 mg hasta aproximadamente 1 mg de agente modulador por kilogramo de peso corporal por día. Los regímenes de dosis pueden ser ajustados para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, pueden ser administradas varias dosis divididas diario, semanal , mensualmente u otros intervalos de tiempo adecuados o la dosis puede ser reducida proporcionalmente de acuerdo a lo indicado por las exigencias de la situación. El agente modulador puede ser administrado en una forma conveniente, como por las rutas oral, intravenosa (si es soluble en agua), intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intradérmica o supositorio o implante (por ejemplo usando moléculas de liberación lenta). El agente modulador puede ser administrado en forma de sales no tóxicas farmacéuticamente aceptables, como sales de adición de ácido o complejos de metal, por ejemplo con zinc, hierro o similares (los cuales son considerados como sales para propósitos de esta aplicación) . Ilustrativas de esas sales de adición de ácidos son el clorhidrato, bromhidrato, sulfato, fosfato, maleato, acetato, citrato, benzoato, succinato, malato, ascorbato, tartrato y similares. Si el ingrediente activo va ser administrado en forma de tableta, la tableta puede contener un aglutinante como tragacanto, almidón de maíz o gelatina, un agente desintegrante, como el ácido algínico; y un lubricante, como el estearato de magnesio. Las rutas de administración incluyen, pero no se limitan a, respiratoria, intratraqueal , nasofaríngea, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intracraneal, intradérmica, intramuscular, infraocular, intratecal, intracerebral , intranasal, infusión, oral, rectal, vía un parche e implante de goteo IV. Preferiblemente, la ruta de administración es oral . De acuerdo con esos métodos, el agente definido de acuerdo con la presente invención puede ser coadministrado con uno o más de otros componentes o moléculas. "Coadministrado" significa la administración simultánea en la misma formulación o en dos formulaciones diferentes via la misma o diferentes rutas o la administración secuencial por la misma o diferentes rutas. Por ejemplo, la esfingosina cinasa objetivo puede ser administrada junto con un agente agonista para mejorar sus efectos. De manera alternativa, en el caso de un trasplante de órgano o tejido, la esfingosina cinasa puede ser administrada junto con fármacos inmunosupresores . La administración "secuencial" significa con una diferencia de tiempo de segundos, minutos, horas o días entre la administración de los dos tipos de moléculas. Esas moléculas pueden ser administradas en cualquier orden. Otro aspecto de la presente invención se relaciona con el uso de un agente capaz de modular un nivel funcional de la esfingosina cinasa en la elaboración de un medicamento para la modulación de una o más características funcionales de células endoteliales en un mamífero, donde la inducción de la sobreexpresion del nivel de esfingosina cinasa modula una o más de las características funcionales de las células endoteliales. En otro aspecto, la presente invención se relaciona con el uso de esfingosina cinasa o ácido nucleico que codifique para la esfingosina cinasa en la elaboración de un medicamento para la modulación de una o más características funcionales de células endoteliales en un mamífero, donde la inducción de la sobreexpresión del nivel de la esfingosina cinasa modula una o más de las características funcionales de las células endoteliales. De acuerdo a esas modalidades preferidas, las células endoteliales objetivo son preferiblemente células endoteliales vasculares y de manera aún más preferible, células endoteliales vasculares CD34+. De manera aún más preferida, el medicamento es usado para tratar una condición caracterizada por un funcionamiento aberrante o en otras circunstancias indeseables de las células endoteliales como se describió aquí anteriormente . El término "mamífero" y "sujeto" como se usa aquí incluye humanos, primates, animales de ganado doméstico (por ejemplo ovejas, cerdos, ganado bovino, caballos, burros) , animales de prueba de laboratorio (por e emplo ratones, conejos, ratas, cobayos) , animales de compañía (por ejemplo perros, gatos) y animales de presa (por ejemplo zorros, canguros, venados) . Preferiblemente, el mamífero es humano o un animal de prueba de laboratorio. De manera más preferible, el mamífero es un humano. En otro aspecto aún más, la presente invención contempla una composición farmacéutica que comprende el agente modulador como se definió aquí anteriormente y uno o más excipientes y/o diluentes f rmacéuticamente aceptables. Los agentes son referidos como los ingredientes activos. Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (donde son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación " extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles o pueden estar en forma de una crema u otra forma adecuada para aplicación tópica. Pueden ser estables bajo las condiciones de elaboración y almacenamiento y deben preservarse contra la acción contaminante de microorganismos como bacterias y hongos. El excipiente puede ser un solvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilen glicol y polietilen glicol liquido, y similares) , mezclas adecuadas de los mismos, y aceites vegetales. La fluidez apropiada puede ser mantenida, por ejemplo, durante el uso de un recubrimiento como la licitina, por el mantenimiento de un tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y mediante el uso de tensoactivos . La prevención de la acción de los microorganismos puede ser llevada a cabo por varios agentes antibacterianos y antimicóticos , por ejemplo, parabenos, clorobutanol , fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede ser llevada a cabo mediante el uso de composiciones de agentes que retrasen la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Las soluciones inyectables estériles son preparadas incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en el solvente apropiado con varios de los otros ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguida por . esterilización por filtración. De manera general, las dispersiones son preparadas incorporando los diferentes ingredientes - activos esterilizados en un vehículo estéril que contenga el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son secado al vacío y la técnica de secado por congelamiento o liofilizacion la cual produce un polvo de ingrediente activo más el ingrediente adicional deseado de la solución previamente esterilizada por filtración de la misma. Cuando los ingredientes activos sean protegidos de manera adecuada pueden ser administrados oralmente, por ejemplo, con un diluente inerte o con un excipiente comestible asimilable, o pueden ser encerrados en una cápsula de gelatina dura o blanda, o pueden ser comprimidos en tabletas, o pueden ser incorporados directamente en el alimento de la dieta. Para administración terapéutica oral, el compuesto activo puede ser incorporado en excipientes y usado en forma de tabletas ingeribles, tabletas bucales, trociscos, cápsulas, elíxires, suspensiones, jarabes, obleas y similares. Esas composiciones y preparaciones deberán contener al menos 1% en peso de compuesto activo. El porcentaje de las composiciones y preparaciones puede, por supuesto, variar y puede convenientemente ser de entre aproximadamente 5 hasta aproximadamente 80% del peso de la unidad. La cantidad de compuesto activo en esas composiciones terapéuticamente útiles es tal que se obtendrá una dosis adecuada. Las composiciones o preparaciones preferidas de acuerdo a la presente invención son preparadas de modo que una forma unitaria de dosis oral contenga entre aproximadamente 0.1 µg y 2000 mg del compuesto activo. Las tabletas, trociscos, pildoras, cápsulas y similares también pueden contener los componentes que se listaron aquí anteriormente: un aglutinante como goma, acacia, almidón de maíz o gelatina; excipientes como fosfasto dicálcico,- un agente desintegrante como almidón de maíz, almidón de papa, ácido algínico y similares; un lubricante como el estearato de magnesio; y puede ser agregado un agente edulcorante como la sucrosa, lactosa o sacarina o un agente saborizante como la menta piperita, aceite de gaoteria, o sabor cereza. Cuando la forma unitaria de dosificación es una cápsula, puede contener, además de los materiales del tipo anterior, un excipiente líquido. Pueden estar presentes varios otros materiales como recubrimientos o para modificar de otro modo la forma física de la unidad de dosificación. Por ejemplo, las tabletas, pildoras o cápsulas pueden ser recubiertas con selladora, azúcar o ambas. Un jarabe o elíxir puede contener el compuesto activo, sucrosa como agente edulcorante, metil y propilparabenos como preservativos, un tinte y saborizante como el sabor cereza o naranja. Por supuesto, cualquier material usado en la preparación de cualquier forma de unidad de dosificación deberá ser farmacéuticamente puro y sustancialmente no tóxico en las cantidades empleadas. Además, los compuestos activos pueden ser incorporados en preparaciones y formulaciones de liberación sostenida. La composición farmacéutica también puede comprender moléculas genéticas como un vector capaz de transferir células objetivo donde el vector contenga una molécula de ácido nucleico que codifique para la esfingosina cinasa o a un agente modulador como se definió aquí anteriormente. El vector puede, por ejemplo, ser un vector viral. La composición farmacéutica también puede comprender poblaciones de células endoteliales que hayan sido tratadas de acuerdo con el método de la presente invención. Otro aspecto más de la presente invención está dirigido a un método para generar una célula endotelial, célula endotelial la cual se caracteriza por la modulación de una o más características funcionales en relación a las características funcionales de la célula endotelial, el método comprende inducir la sobreexpresión del nivel funcional de esfingosina cinasa en la célula . Otro aspecto más de la presente invención está dirigido a células endoteliales las cuales son generadas de acuerdo con los métodos definidos aquí. Otro aspecto de la presente invención está dirigido al uso de células endoteliales desarrolladas de acuerdo con el método definido aquí en el tratamiento y/o profilaxis de condiciones caracterizadas por el funcionamiento inadecuado de células endoteliales. Las características adicionales de la presente invención son descritas de manera más completa en las siguientes figuras y ejemplos no limitantes.

EJEMPLO 1 LOS NIVELES INTRACELULA ES ELEVADOS DE ENFIGOSINA CINASA AUMENTAN LA SOBREVIVENCIA CELULAR A TRAVES DE LA REGULACION DIRIGIDA DE PECAM-1 MATERIALES Y METODOS Transfección de HÜVEC Se aislaron y cultivaron HUVEC como se describió anteriormente (Lit in M, Clark K. , Moack L, Purze J, Berndt M, Albelda S et al. (1997) J Cell Biol 139 (1) :219-228) , con medio suplementado con 50 g/ml de suplemento de crecimiento endotelial (Coll borative Research, M7A, EUA) y 50 g/ml de heparina (Sigma, St Louis, Missouri, EUA) .

Producción y generación de adenovirus de HUVEC que sobreexpresan SK Se usó el sistema AdEasy para producir adenovirus recombinante que contiene SK (o vector vacio, EV) de acuerdo al manual del sistema AdEas ^ Vector Qbiogene Versión 1.4 (http://vrww.qbiogene.com/products/adenovirus/ adeasy. shtml) . Se cultivaron células 293 en matraces de 25 era2 en medio de Eagle modificado de Dulbecco completo (CSL Biosciences, Parkville Australia) con un contenido del 10% de suero de carnero fetal (FCS) . El virus fue amplificado en células 293 y purificado sobre un gradiente de cloruro de cesio con centrifugación. El titulo viral fue determinado usando el método de TCIDS0 de acuerdo al protocolo del fabricante. La transfección transitoria de HUVEC se logró por infección con preparaciones adenovirales de SK o EV usando unidades formadoras de placa (ufp) /célula equivalente las cuales produjeron un nivel similar de expresión de GFP. Las células fueron usadas para ensayos funcionales 24-72 horas después de la transfección. La sobreexpresión de SK fue confirmada con electroinmunotransferencia Western y ensayo de actividad de SK.

Electroinmunotransferencia Western La electroforeésis sobre gel de SDS-poliacrilamida se efectuó de acuerdo a lo descrito (Pistón SM, Moretti PA, Zeból JR, Xia P, Gamble JR, Vadas A et al. (2000) J Biol Chem: 275 (43) :33945-33950) sobre lisados celulares usando geles de acrilamida al 12%. Las proteínas fueron transferidas a membranas de PVDF, bloqueadas en 5% de leche baja en grasa en PBS con 0.1% de Tween 20 durante una hora, e incubadas durante la noche a 4°C con anticuerpo anti-FLAG de ratón M2 (Sigma, St Louis, MO) , anti-fosfo-Akt pollclonal de conejo (Cell Signaling Technology) , anti-Akt policlonal de conejo (Cell Signaling Technology) , anti-fosfotirosina (Cell Signaling Technology) , o durante una hora a temperatura ambiente con anti-ciclina DI o ciclina E de ratón (Santa Cruz Biotechnology) o anticuerpo monoclonal de ratón dirigido a PECAM-1 (51-6F6) producido en The Hanson Institute, Adelaide, Australia. La membrana fue incubada con anti-IgG de ratón o an i-IgG de conejo conjugada con peroxidasa de rábano (Pierce) y los inmunocomplej os fueron detectados usando quimioluminiscencia aumentada (Amersham Pharmacia Biotech) .

Actividad de SK La actividad de SK fue determinada como se describió anteriormente (Xia P, Gamble JR, Rye KA, Wang L, Hii CS, Cockerill P et al. (1998) Proc Nati, Acad Sci EUA; 95 (24) : 14196-14201) . De manera breve, se usaron D-eritrosfingosina y [-32P]ATP como sustratos y ¡se incubaron con lisados de células completas. Los lípidos marcados fueron extraídos y resueltos por CCF (cromatografía en capa fina) . Los puntos radioactivos fueron cuantificados por el sistema Phosphoimage .

Clasificación de Células Activadas por Fluorescencia (FACS) El análisis citométrico de flujo de la expresión en · la superficie celular de PECAM-1 y VE-Cadherina se efectuó como se describió anteriormente (Xia P, Gamble JR, Rye KA, Wang L, Hii CS, Cockerill P et al. (1998) supra) usando 10 g/ml de anticuerpos primarios monoclonales de ratón para PECAM-1 (51-6F6) o VE-Cadherina (55-7H1) generados en nuestro laboratorio (Gamble JR, Khew-Goodall Y. Vadas MA. (1993) J Immunol; 150 (10) :4494-4503) . El anticuerpo secundario usado fue conjugado de anti-IgG de ratón de cabra R-ficoeritrina, (Southerns Biotech Birmingham, AL, EUA) . La intensidad de la fluorescencia media se determinó usando un citómetro de flujo Coulter Epics Profile XL. El análisis por FACS de la expresión en la superficie celular de CD34 se efectuó incubando IxlO6 células con 10 L de anti-CD34, Acm anti-humano de ratón conjugado con R-ficoeritrina (R-PE) (BD Pharmingen, San Diego, CA) durante 30 minutos a temperatura ambiente, y entonces se determinó la intensidad de la fluorescencia media .

Medición de la Actividad de la Caspasa 3 Se prepararon lisados celulares como se describió (Laemmli RU. (1970) Nature : 227 (259) : 680-685) , usando amortiguador de lisis de caspasa 3 (10% de NP-40, Tris-HCl 1M, EDTA 1M) . Se colocaron 10 L de lisado sobre una bandeja de 96 pozos. Se mezclaron 10 mi de amortiguador de caspasa 3 (12 g/L de Hepes, 100 g/L de sucrosa, 1 g/L de Chaps, pH 7.4) con 15.45 mg de DL-Ditiotreitol , (Sigma, St Louis, EUA) y 10 L de sustrato de DEVD-AFC 2.5 mM (Calbiochem-Novabiochem, Darmstadt, Alemania) . Esta mezcla (200 L) fue agregada a cada pozo e incubada durante 5 horas . La fluorescencia fue medida con un lector de placas de pozos (longitudes de onda de excitación y emisión de 385 nm y 460 nm) y normalizada para la concentración de proteína.

Tinción inmunofluorescente de células apoptoticas Se sembraron células en portaobjetos LabTek recubiertos con fibronectina a 6xl04 células por pozo en un medio que comprendía varias concentraciones de FCS y se incubaron a 37°C durante 24 horas. Las células fueron incubadas a 37°C con 150 L de DAPI-Metanol (Roche, Manheim, Alemania) durante 15 minutos y entonces se lavaron con metanol . Las células apoptoticas fueron visualizadas por microscopía inmunofluorescente con tinción muy brillante, con núcleos fragmentados, mientras que las células vivas tuvieron núcleos intactos y una tinción menos intensa. Se calculó el porcentaje de células apoptoticas en campos consecutivos .

Permeabilidad celular Se sembraron células endoteliales en transpozos de '3.0 m recubiertos con fibronectina a lOxlO4 células por pozo, con 600 L de medio de cultivo agregados al fondo del transpozo. Se agregó FITCdextran (500 g/mL) a cada transpozo y entonces se recolectaron 20 L de medios del fondo de cada transpozo a puntos en el tiempo predeterminados y se distribuyeron en una bandeja microtituladora de 96 pozos que contenía 60 L de medio libre de suero por pozo. La fluorescencia fue determinada usando un lector de placas de pozos, usando longitudes de ondas de excitación y emisión de 485 nm y 530 nm.

Sobreviencia celular Las células endoteliales fueron cultivadas en bandejas microtituladoras de 96 -pozos recubiertas con gelatina a 3xl03 células por pozo en medio libre de suero. Se usó MTS (Promega, WI, EUA) para medir; la viabilidad celular. La densidad óptica fue medida a 490 nm en el Día 0, Día 1, Día 2 y Día 3.

Suspensión Celular Se cultivaron células como anteriormente, en un cultivo sin tejido, bandejas microtituladoras de 96 pozos sin adhesivo recubiertas con seroalbúmina bovina al 1% a 8xl03 células por pozo en medio libre de suero. La densidad óptica fue determinada como anteriormente usando MTS al Día 0, Día 1, Día 2 y Día 3.

RESULTADOS Sobreexpresión de actividad de SK aumentada SK Para -determinar el efecto de la función de las células endoteliales de la sobreexpresión de SK, se infectaron HUVEC con adenovirus que contienen SK a 1 ufp/célula. La infección de HUVEC con 1 ufp/célula dio como resultado un incremento de 5.17 (95% CI 4.86-5.51) veces en la actividad de SK sobre el control, lo cual fue estadísticamente significativo (p 0.001).

La sobreexpresión de enfingosina exnasa mejora la sobrevivencia celular y sobrevivencia en suspensión La sobrevivencia celular se midió en medio libre de suero suplementado con ECG y en bandejas de cultivos sin tejidos, sin adhesivo, recubiertas con seroalbúmina bovina al 1% bajo condiciones de cultivo libres de suero. Las células que sobreexpresan SK mostraron mejor sobrevivencia en condiciones libres de suero (Figura la) y cuando crecieron en suspensión (Figura Ib) , en comparación con las células control. Veinticuatro horas después del cultivo, las células que sobreexpresan SK tuvieron un incremento en número. Aún 48 horas después del cultivo, la mayoría de las células que sobreexpresan SK sobrevivieron bajo condiciones SF o en condiciones no adherentes, en comparación con las células control. En contraste, los números de células en células EV se mantuvieron durante 24 horas, pero cayeron rápidamente después. Las células que sobreexpresan SK fueron visualizadas por microscopía al formar agregados en suspensión, los cuales fueron más extensos que aquellos formados por las células control. La medición de las ciclinas E y D no mostró cambio en los niveles entre células que sobreexpresan SK en comparación con las células EV (Figura le) , sugiriendo de este modo que la alteración en el número observado en las células que sobreexpresan SK puede deberse a un efecto antiapoptótico .

La sobreexpresion de SK confiere resistencia a la apoptósis inducida por la privación de suero La resistencia a la apoptósis"; inducida por privación de suero en células que sobreexpresan SK fue confirmada efectuando una tinción DAPI bajo! condiciones básales y 24 horas' después de la privación de suero. La Figura 2 muestra que bajo condiciones básales no hubo diferencia en el número de células apoptóticas entre .las células que sobreexpresan SK y las control. Con la privación de suero, las células control respondieron con un gran incremento en el número de células apoptóticas, mientras que entre las células que sobreexpresan SK, hubo un número despreciable de células apoptóticas. Los resultados de la tinción DAPI fueron confirmados midiendo la actividad de caspasa 3 bajo condiciones básales y en respuesta a 24 horas de privación de suero. La sobreexpresion de SK mostró reducir significativamente la actividad basal de la caspasa 3 (Figura 3a) y conferir resistencia adicional a la activación de caspasa 3 inducida por la privación de suero (Figura 3b) .

La sobreexpresion de SK activa la vía de PI- 3K/Akt Los factores de sobrevivencia como el factor de crecimiento y la unión a la matriz extracelular tienen influencia sobre la sobrevivencia celular a través de un número de vías las cuales incluyen la víá= de PI-3 /Akt. Para determinar si esta vía está implicada en el incremento déla sobrevivencia inducido por la sobreexpresion de SK, se evaluó la fosforilación de Akt. Bajo condiciones básales no hubo una diferencia significativa en el porcentaje de AKT fosforilado (p-Akt) en células que sobreexpresan SK comparadas con las control (p=0.47), como se muestra en la Figura 4 (a) . Una reducción en la fosforilación de Akt en respuesta a la privación de suero fue observada en células EV. Las células que sobreexpresan SK sin embargo respondieron a la tensión de privación de suero con un incremento adicional en la fosforilación de Akt. De este modo, en condiciones libres de suero, las células que sobreexpresan SK tuvieron una fosforilación significativamente mayor de Akt que las control, sugiriendo la activación de esta vía. Esto fue confirmado y cuantificado por los programas y sistemas de programación ImageQuant en cinco lineas de células endoteliales separadas (Figura 4 (b) ) .

La vía de la cinasa PI-3 media la sobrevivencia celular inducida por SK La PI-3K es un regulador corriente arriba conocida de la activación de Akt, y de este modo se investigó el efecto de la inhibición de PI-3K (con LY294002) sobre la sobrevivencia celular mediada por SK. La sobrevivencia celular inducida por SK fue abolida en presencia de LY294002 pero no en presencia de dos inhibidores de la vía de MAPK, U0126 o PD98059 (Figura 5) . Mientras que LY294002, U0126 y PD98059 redujeron todos significativamente la sobrevivencia celular de células control, las células que sobreexpresan SK respondieron a LY294002 con una sobrevivencia celular reducida pero no a U0126 o PD98059. Esto indica que la sobrevivencia celular inducida por SK es mediada a través de la vía de PI-3K y que' la vía de MAPK no está implicada. Esto contrasta con la sobrevivencia celular mediada por S1P la cual implica las vías de MAPK y PI-3K/Akt.

La esfingosina cinasa induce la expresión y desfosforilación de PECAM-1 La sobreexpresión de SK incrementó significativamente la expresión en la superficie celular de PECAM-1 en comparación con los controles de acuerdo a lo medido por citometría de flujo (Figura 6a) . Esto fue confirmado por electroinmunotransferencia Western (Figura 6b) . La estimulación de HUVEC normales con S1P exógeno no induce la expresión de PECAM-1. Sin embargo no hubo cambio en otra proteina de unión, la catenina (Figura 6b) y una reducción pequeña en la cadherina VE (Figura 6d) . En células endoteliales PECAM-1 · se fosforiló sobre los residuos de tirosina, y la fosforilación es un método de regulación de PECAM-1. En consecuencia la fosforilación de PECAM-1 fue medida por electroinmunotransferencia Western. La expresión alentada de esfingosina cinasa redujo significativamente la fosforilación de PECAM-1 (Figura 6c) . En tres líneas celulares endoteliales separadas, la reducción del porcentaje doblado medio en la proporción de PECAM-1 que se fosforiló para células que sobreexpresan SK comparado con el' control fue 48% (95% CI 28-63%), p-0.054. La PECAM-1 también está implicada en mediación de interacciones célula-célula importantes para el control de la permeabilidad de uniones. Consistente con un incremento en la expresión de PECAM-1 y una disminución en la fosforilación de PECAM-1, las células que sobreexpresan SK mostraron una menor permeabilidad basal que las células control (Figura 7a) , aunque respondieron normalmente a los estimuladores de la permeabilidad conocidos, la trombina (Figura 7b) .

La sobrevivencia inducida por SK es mediada por PECAM-l A la luz de los cambios en la expresión y regulación de PECAM-l se probó PECAM-l por su responsabilidad en la sobrevivencia de células endoteliales inducida por SK tanto en suspensión como ?en condiciones libres de suero. El anticuerpo anti-PECAM-1 policlonal de conejo, redujo significativamente la sobrevivencia de células que sobreexpresan SK tanto en condiciones libres de suero como en suspensión, mientras que el suero de conejo normal no tuvo efecto sobre las células que sobreexpresan SK o las células control (Figuras 8a, b) . Un anticuerpo monoclonal murino dirigido a VE-cadherina (55-7H1) no tuvo efecto sobre la reducción de la sobrevivencia de las células que sobreexpresan SK (p=0.61) o células control (p=0.69) . Esto indica que la capacidad inducida por SK para sobrevivir en suspensión es mediada por PECAM-l y no a través de otra molécula de unión, VE cadherina.

SK señala a través de PECAM-l activar la vía de la PI-3cinasa La Akt total y activa (Akt fosforilada) fueron medidas por electroinmunotransferencia Western bajo condiciones básales, en respuesta a la privación de suero durante seis horas. Los resultados se muestran en la Figura 9(a), con la cuantificación mostrada en la Figura 9(b). Nuevamente se demostró la activación mediada por SK de la vía de Akt en respuesta a la privación de suero. El anticuerpo anti-PECAM-1 de conejo policlonal (pero no el suero de conejo normal) redujo los niveles de control, el incremento inducido por tensión en la fosforilación de Akt para células que sobreexpresan SK, pero no tuvo efecto en las células control.

La sobrevivencia celular mediada por SK no es mediada por la SlP que actúa sobre GPCR El efecto corriente abajo de la SK, SlP, media la sobrevivencia celular a través de receptores de EDG (un miembro de los receptores acoplados a la proteína G sensible a la toxina de pertussis) . Para determinar si es posible que la sobreexpresión de SK conduzca a un incremento de la secreción de SlP que actúa entonces exógenamente, o si SK en sí es liberada con generación extracelular de SlP. Se examinó el efecto de la inhibición de GPCR con toxina de pertussis sobre la sobrevivencia celular. La sobrevivencia celular mediada por SK no fue inhibida en presencia de toxina de pertussis (Figura 10) , consistente con un sitio de acción intracelular de S1P. S1P agregada exógenamente no tuvo efecto sobre el nivel de la expresión de PECAM-1 o su estado de fosforilación (no se muestran los datos) , sugiriendo además que la activación de EDG no está implicada en los cambios mediados por PECAM-1 en la sobrevivencia celular.

EJEMPLO 2 ESFINGOSINA CINASA COMO UN OBJETIVO NOVEDOSO PARA LA MODULACION DE LA INFLAMACION Y ANGIOGENESIS METODOS Cultivo de HUVEC Las HUVEC fueron aisladas y cultivadas como se describió anteriormente (Litwin M, et al. (1997) supra) , con medio suplementado con 50 µg/ml de suplemento de crecimiento de células endoteliales (Collaborative Research, MA, EUA) y 50 µg/ml de heparina (Sigma, St Louis, Missouri, EUA) .

Producción de Adenovirus y generación de líneas celulares transitorias Se usó el sistema AdEasy para producir adenovirus recombinante que contenía SK, G82D, o vector vacío (EV) de acuerdo al manual del sistema AdEasy"11 Vector Qbiogene Versión 1.4 (http:www.qbiogene.com/products/adenovirus/ adeasy . shtml) . Se cultivaron 293 células en medio de Eagle modificado de Dulbecco (CSL Biosciences, Parkville, Australia) . El virus fue amplificado en células 293 y purificado sobre gradiente de cloruro de cesio con centrifugación. El título viral fue determinado usando el método de TCID50 de acuerdo al protocolo del f bricante . La transfección transitoria de HUVEC fue lograda por infección con preparaciones adenovirales de SK o EV usando unidades formadoras de placas (pfu) equivalentes/célula) las cuales produjeron un nivel similar de expresión de GFP'.

Producción de retrovirus y generación de líneas celulares estables Se clonó SK marcada con epítope FLAG, G82D (Pistón S , et al. (2000) supra) o sin plásmido recombinante (EV) en el vector Pruf eo (Zannettino AC, Rayner JR. Ashman LK, Gonda TJ, Simmons PJ. (1996) J Immunol; 156 (2) : 611-620) . La producción retroviral se efectuó con transfección con fosfato de calcio de PrufNeo-SK, PrufNeo-G82D o PrufNeo-EV en células Bing. El sobrenadante retroviral fue recolectado a las 48 horas. Las lineas celulares estables fueron generadas infectando HUVEC con sobrenadante retroviral, seguido por la selección con G418 (Promega, Madison, WI , EUA) a las 48 horas. La sobreexpresión de SK fue confirmada con electroinmunotransferencia Western y ensayo de actividad SK.

Electroinmunotransferencia Western La electorforesis sobre gel de SDS-poliacrilamida se efectuó de acuerdo a lo descrito (Laemmli U. (1970) supra) sobre Usados celulares usando geles de acrilamida al 12%. Las proteínas fueron transferidas a membranas de PVDF, bloqueadas en 5% de leche baja en grasa en PBS con 0.1% de T een 20 durante una hora, e incubadas durante la noche a 4°C con anticuerpo anti-FLAG M2 (Sigma, St Louis, Missouri, EUA) . La membrana fue incubada con anti-IgG de ratón conjugada con peroxidasa de rábano (Pierce) y los inmunocomplejos fueron detectados usando quimioluminiscencia aumentada (Amersham Pharmacia Biotech) . La actividad de SK fue determinada como se describió anteriormente (11) . De manera breve, se usaron D-eritro-es'fingosina y [y-32P]ATP como sustratos, los cuales fueron incubados con lisados en células completas. Los lipidos marcados fueron extraídos y resueltos por CCF . Los puntos radiactivos fueron cuantificados por el sistema Phosphoimage .

Clasificación de Células Activadas por Fluorescencia (FAC3) El análisis citométrico de flujo de la expresión en la superficie celular de E-Selectina y VCAM-1 se efectuó como se describió anteriormente (11) usando 10 9/p?1 de anticuerpos primarios monoclonales de ratón para E-Selectina (49-1B11) o VCAM-1 (51-10C9) generadas en nuestro laboratorio (Gamble JR, Khew-Goodall Y. Vadas MA. (1993) supra) . Los anticuerpos secundarios usados fueron anti-fluoresceína de ratón-isocianato, o células que expresan GFP, conjugado de anti-IgG de ratón de cabra R-ficoeritrina, (Southerns Biotech Birmingham, AL, EUA) . La intensidad de la fluorescencia media se determinó usando un citómetro de flujo Coulter Epics Profile XL.

Formación del tubo en Matrigel Una bandeja de microtitulación de 96 pozos fue recubierta con Matrigel Basemont Membrane Matrix (Beckton Dickinson Labware, Bedford, MA, EUA) . Las células endoteliales fueron preparadas a una concentración de 3x1 O5 célülas/ml en medio HUVE y se agregaron 140 µ? a cada pozo.

Las células fueron visualizadas a intervalos regulares por microscopía para observar la formación de tubos .

Ensayo de adhesión de neutrófilos Se sembraron HUVEC en portaobjetos Lab-Tek recubiertos con fibronectina a 3xl04 células por pozo y se incubaron a 37°C durante 24 horas. Las células fueron lavadas y entonces se agregaron neutrofilos a cada pozo a lxlO5 células por pozo. Las células fueron incubadas a 37°C durante 30 minutos, y entonces cualesquier neutrofilos no adherentes fueron removidos lavando tres veces. Las células endoteliales fueron fijadas con metanol. El número de neutrofilos adherentes en campos consecutivos fue determinado por microscopía.

Análisis estadístico Se usó la prueba t de Student ¦ para datos paramétricos , y valores de p menores de 0.05 fueron considerados significativos. La prueba de significancia para las relaciones se efectuó por regresión tipo ANOVA usando la Statistica Versión 6.1 (Statsoft, Inc.). Las mediciones resultante fueron todas transformadas logarítmicamente lo cual aseguró que los valores predichos fueran siempre positivos y permitió la interpretación del análisis como el cambio doble medio en relación a una línea base elegida. La mayoría de los análisis se efectuaron por regresión lineal normal y los valores de p reportados fueron determinados por la prueba t con grados de libertad apropiados. Los efectos medios (µ) , en relación a una base específica, y sus errores estándar asociado (s.e.) fueron determinados por contrastes lineales apropiados de los coeficientes de regresión. Para los análisis de los datos resultantes transformados logarítmicamente, se obtuvieron intervalos de confianza (CI) de 95% para muestras grandes aproximadas usando la fórmula: µ +/- 1.93*s.e. El cambio doble medio (en relación a la base específica) con un CI aproximado de 95%, se obtuvieron entonces por retrotransformación (es decir, exponenciación) .

RESULTADOS La sobreexpresion de SK incrementa la actividad de SK Para determinar el efecto de la función de las células endoteliales de la sobreexpresion de SK, se infectaron HUVEC con retrovirus que contenían SK o adenovirus que contienen SK a 1 ufp/célula. Este nivel de infección con adenovirus fue seleccionado puesto que dio como resultado niveles similares de actividad de SK como la estimulación de TNFa de SK endógena en células endoteliales (12) , y niveles similares de actividad de SK como los logrados con la liberación del gen mediada por . el retrovirus .

La sobreexpresion de SK altera la expresión de moléculas de adhesión en HUVEC Para determinar si la sobreexpresion de SK da como resultado cambios en el fenotipo endógeno de células endoteliales , investigamos la expresión de moléculas de adhesión sobre esas células infectadas . La sobreexpresión de SK mediada por retrovirus sobrerreguló la expresión de VCAM-1 basal (Figura lia) . La sobreexpresión de SK mediada de manera adenoviral dio como resultado un incremento similar en la expresión de VCAM-1 (p=0.052) como se muestra en la Figura 11b. Esto no alcanzó un significado estadístico, puesto que los intervalos de confianza usados fueron intervalos de confianza de muestra grandes, y no se ajustaron para los grados de libertad. El significado estadístico fue logrado por el análisis de los datos como una diferencia media (p=0.04) o mediante el uso de una prueba no paramétrica. En contraste con VCAM-1, la expresión de E Selectina basal no fue alterada en células que sobreexpresan SK generadas por transfeccion mediada de manera retroviral (n=4, p=0.44) o adenoviral (n=3, p=0.71). Puesto que la sobreexpresión de SK indujo niveles básales de VCAM-1 a continuación buscamos determinar si esas células exhibieron una respuesta alterada a la estimulación con TNFa. Las HUVEC que sobreexpresan SK fueron estimuladas con TNFa durante cuatro horas y se determinó la expresión de moléculas de adhesión. La sobreexpresión de SK lograda con la liberación mediada de manera retroviral o adenoviral aumentó significativamente la sobrerregulación de la expresión de VCAM-1 inducida por TNFa normal (Figura 11c, d) . De manera interesante, las células que sobreexpresan SK también mostraron un aumento en la respuesta de la E-Selectina después de la estimulación con TNFa (Figura lie, f) aunque la expresión de E Selectina basal no se alteró. La sobreexpresión de SK negativa dominante (G82D) inhibió significativamente la inducción de VCAM-1 y E-Selectina en respuesta al TNFa en comparación con EV (Figuras 11c, e respectivamente) . Cuando las células fueron estimuladas con dosis submínimas de TNFa que no sobrerregularon VCAM-1 o E Selectina en el control, se, . indujeron niveles significativos de moléculas de adhesión en células que sobreexpresan SK (Figuras 12a, b) . La inducción de la expresión de VCAM-1 por TNFa en células que sobreexpresan SK fue de 4.42 (95% de CI 1.51-12.94) veces mayor que las células EV (p<0.05) en tres experimentos separados. En dos líneas células endoteliales separadas, la inducción de la expresión de E-selectina por TNFa fue 1.7 y 3.1 veces mayor que" en células que sobreexpresan SK en comparación con las células EV. La inducción de E-Selectina sobre células endoteliales por TNFa alcanza un pico a las 4-6 horas y declina a niveles casi básales a las 18-24 horas (Gamble JR. Khe -Goodall Y, Vadas, MA. (1993) supra; Gamble JR, Harían JM, Klebanoff SJ, Vadas MA. (1985) Proc. Nati. Acad.

Sci. EUA 82 (24) : 8667-8671) . Para determinar si la sobreexpresion de SK alteró este curso temporal, las células infectadas por retrovirus que contienen SK o EV fueron tratadas con TNFa a 0.5 ng/mL durante 18 horas, y se midió la expresión de la superficie celular de E-selectina. Los resultados representativos se muestran en la Tabla 2. En cuatro de esas líneas hubo un incremento de 2.01 (95% CI 1.14-3.53) veces en la expresión de E-selectina a las 18 horas después de la estimulación con TNFa en células que sobreexpresan SK en comparación con las células EV (p=0.11) . La sobreexpresion de G82D dio como resultado una inhibición significativa de esta respuesta ' (incremento doble medio sobre el control de 0.44, 95% CI 0.25-0.92, p=0.014) . Se obtuvieron resultado similares con la transferencia de gen mediada por adenovirus . La liberación retroviral y adenoviral de SK generó fenotipos similares en EC, a diferencia de la expresión mejorada de las moléculas de adhesión y respuesta alterada de TNFa. Sin embargo, el sistema adenoviral permitió que se generara rápidamente un gran número de células y por lo tanto este método fue usado para experimentos futuros .

Los efectos de la sobreexpresion intracelular de SK no son mediados a través de receptores de S1P El receptor EDG es responsable de la sobrerregulación de las moléculas de adhesión inducida por S1P es conocido por ser sensible a la toxina de pertussis, consistente con el hecho de ser un receptor acoplado a la proteína G. Para investigar si los resultados podrían ser explicados por la secreción de S1P que actúa nuevamente sobre el receptor EDG, las células fueron tratadas con toxina de pertussis (50 ng/ml) y se midió la expresión de moléculas de adhesión. La toxina de pertussis no inhibió la expresión de VCAM-1 o E Selectina basal o inducida por TNF en células que sobreexpresan SK o EV (F-igura 13) . En realidad, hubo un aumento de la expresión de moléculas de adhesión observada con el tratamiento con1 toxina de pertussis usando dos aislados de células endoteliales separados. Para determinar si el aumento de la respuesta de la molécula de adhesión inducida por TNFa en células que sobreexpresan SK se debió a la acción de S1P sobre receptores de EDG, las células fueron pretratadas con toxina de pertussis (50 ng/ml) durante 18 horas y entonces estimuladas con TNFa (0.5 ng/ml) durante cuatro horas en presencia de toxina de pertussis. Se midió la expresión de moléculas de adhesión en esas células. En dos líneas de células endoteliales separadas, el pretratamiento con toxina de pertussis no alteró la expresión de VCAM-1 o E Selectina inducida por TNFa en células control o en células que sobreexpresan SK (Figuras 13c, d) . Para delinear mejor los efectos intracelulares contra los mediados por el receptor de EDG de S1P se estimularon células que sobreexpresan SK con S1P exógeno (5 µ?) durante 4 horas. Ambas células que sobreexpresan SK y EV respondieron a S1P agregada exogenamente sobrerregulando la expresión de VCAM-1 y E Selectina, sugiriendo que el receptor de EDG estaba aún operando normalmente como se muestra en la Figura 14. Fue de interés que la respuesta de la E Selectina a la estimulación con S1P fue 1.75 (95% CI 1. -2.18 ) -veces mayor en las células que sobreexpresan SK en comparación con el control (p<0.001), sugiriendo que la sobreexpresión de SK sensibiliza las células a S1P. Aunque la' toxina de pertussis no inhibió el aumento de la respuesta de las moléculas de adhesión inducidas por TNFa en las células que sobreexpresan SK, el pretratamiento con la toxina de pertussis inhibió la respuesta a la estimulación exógena con S1P en ambas células que sobreexpresan SK y EV, para proporcionar un soporte adicional para un papel intracelular de SK.

SK mejora la adhesión de los neutrófilos a las células endotelíales Para determinar si la alteración en la expresión de moléculas de adhesión resultante de la sobreexpresión intracelular de SK tenía consecuencias funcionales, se midió la adhesión de neutrófilos a células endoteliales . En el estado basal, las células que sobreexpresan SK mostraron una adhesión de neutrófilo significativa, lo cual contrasta con las células control que no se unen a los neutrófilos (Figuras 15a, b) . La estimulación de células endoteliales con una dosis b a de TMFa (0.04 ng/ml) dio como resultado una adhesión mínima de neutrófilos en células control (Figura 15d) , pero una adhesión significativamente mayor a células que sobreexpresan SK (Figura 15e) . Consistente con un papel para SK en la medición de la adhesión de PMN, las células endoteliales que sobreexpresan la SK negativa dominante, G82D, inhibieron la adhesión de PMN 'en respuesta a la estimulación con TNFoc (Figuras 15c, f) . La cuantificación del número de neutrófilos unidos por 100 células endoteliales se muestra en la Figura 16.

SK promueve la formación de tubos La capacidad de las células endoteliales para arreglarse en redes similares a capilares (tubos) es una correlación in vitro de la angiogénesis y la angiogénesis es un elemento característico de muchas enfermedades inflamatorias crónicas . Por lo tanto se buscó determinar si la sobreexpresión de SK también mejora la capacidad de las células endoteliales para formar tubos. Se cultivaron células endoteliales sobre la matriz de membrana basal compleja, Matrigel . Se sembraron números equivalentes de células que sobreexpresan SK y EV, y las células fueron visualizadas como poblaciones celulares únicas. Dentro de los 15 minutos de la siembra, las células que sobreexpresan SK ya habían comenzado la realineación mientras que las células EV permanecieron desorganizadas. A los 30 minutos las células que sobreexpresan SK mostraron una mayor evidencia de alineación tubular en comparación con las células EV (Figura 17a, b) . A la hora de la formación de tubos por las células que sobreexpresan SK estuvo altamente desarrollada en comparación con las células EV (Figuras 17c, d) . A las 18 horas, un tiempo al que la formación del tubo fue completa, ambas células que sobreexpresan SK y EV mostraron un patrón similar de formación de tubo. Esos resultados sugieren que la sobreexpresion de SK estimula la velocidad de formación del tubo.

TABLA 2 Expresión de E Selectina ( FI) Basal TNFa 4 horas TNF a 18 horas EV 0.035 45.0 0.66 SK 0.05 74.8 2.37 La Tabla 2 muestra la expresión de E Selectina basal y estimulada (TNF a 0.5 ng/ml durante 4 ó 18 horas) de acuerdo a lo indicado por la intensidad de la fluorescencia media (MFI) en células infectadas con retrovirus que contienen SK o control (EV) . La tabla muestra los resultados de una sola línea de células endoteliales que es representativa de cuatro líneas de células endoteliales separadas probadas. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que la invención descrita aquí es susceptible a variaciones y modificaciones diferentes a las descritas específicamente. Deberá comprenderse que la invención incluye todas aquellas variaciones y modificaciones. La invención también incluye todos los pasos, características, composiciones y compuestos referidos o indicados en esta especificación, individual o colectivamente, y cualesquiera y todas las combinaciones de cualesquier dos o más de los pasos o características .

BIBLIOGRAFIA: Bunin BA, et al. (1994) Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 91 : 4708-4712. DeWitt SH, et al. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90 : 6909-6913 Gamble J , hew-Goodall Y, Vadas MA. (1S93) J Immunol ; 150 (10) : 4494-4503 Gamble et al, (1993) J Cell Biol 121 : 931-945 Laemmli UK. (1970) Wature ; 227(259) : 680-685 Litwin M, Clark K, Noack L, Furze J, Berndt , Albelda S et al. (1997) J Cell Biol 139 (1) : 219-228 Pitson SM, Moretti PA, Zebol JR, Xia P, ' Gamble JR, Vadas MA et al. (2000) J Biol Chem ; 275 (43) : 33945-33950 Xia P, Gamble JR, Rye KA, Wang L, Hii CS, Cockerill P et al. (1998) Proc Nati Acad Sci USA, 95 (24) . 14196-14201 Zannettino AC, Rayner JR, Ashman LK, Gonda TJ, Simmons PJ. (1996) J Immunol; 156 (2) : 611- 620 (25) Gamble JR, Harían JM, lebanoff SJ, Vadas MA. (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82 (24) : 8667-8671.

Claims (43)

1. REIVINDICACIONES 1. Método para modular una o más características funcionales de células endoteliales de mamífero, el método comprende modular el nivel funcional de esfingosina cinasa donde la inducción de la sobreexpresion del nivel de esfingosina cinasa modula una o más de las características funcionales de las células endoteliales.
2. 2. Método para modular una o más características funcionales de células endoteliales en un mamífero, el método comprende modular el nivel funcional de esfingosina cinasa, donde la inducción de la sobreexpresion del nivel de esfingosina cinasa modula una o más de las características funcionales de las células endoteliales.
3. 3. Método para el tratamiento y/o profilaxis de una condición caracterizada por el funcionamiento aberrante o en otras circunstancias indeseables de las células endoteliales en un mamífero, el método comprende modular el nivel funcional de esfingosina cinasa en el mamífero, donde la inducción de la sobreexpresion del nivel de esfingosina cinasa modula una o más características funcionales de las células endoteliales .
4. 4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la célula endotelial es una célula endotelial vascular.
5. 5. Método según la reivindicación 4 donde la característica funcional de las células - endoteliales es sobrerregulable por la sobreexpresión de la esfingosina cinasa y la característica es una o más de la viabilidad, proliferación, diferenciación, expresión de moléculas de la superficie celular, respuesta a la citocina o proliferación o viabilidad mejoradas.
6. 6. Método según la reivindicación 5, donde la molécula de la superficie celular es una molécula de adhesión.
7. 7. Método según la reivindicación 5 o 6, donde la característica funcional esta sobrerregulada .
8. 8. Método según la reivindicación 4, donde la característica funcional de las células endoteliales es sobrerregulable por la sobreexpresión de la esfingosina " cinasa y la característica es la inducción de un fenotipo proinflamatorio .
9. 9. Método según la reivindicación 8 donde el fenotipo proinflamatorio es desregulado.
10. 10. Método según la reivindicación 4, donde la característica funcional de las células endoteliales es sobrerregulable por la sobreexpresión de la esfingosina cinasa y la característica es la inducción de un fenotipo angiogénico .
11. 11. Método según la reivindicación 10, donde el fenotipo angiogénico es sobrerregulado .
12. 12. Método según la reivindicación 10, donde el fenotipo angiogénico es desregulado.
13. 13. Método según la reivindicación 4 donde la característica funcional de las células endoteliales es sobrerregulable por la sobreexpresión de la esfingosina cinasa y la característica es el mantenimiento del fenotipo progenitor de células endoteliales CD34+.
14. 14. Método según la reivindicación 13 donde el fenotipo progenitor CD34+ es mantenido.
15. 15. Método según la reivindicación 3, donde la condición es el injerto vascular, reparación de heridas, transplante de tejidos u órganos o la reparación de tejido desvascularizado y la característica funcional de las células endoteliales modulada es una o más proliferación * mejorada de las células endoteliales, viabilidad mejorada de las células endoteliales, o mantenimiento del fenotipo progenitor de células endoteliales CD34+'
16. 16. Método según la reivindicación 3, donde la condición es una condición inflamatoria y la característica funcional de las células endoteliales modulada es la desregulación de una o más de un fenotipo inflamatorio o angiogénico de las células endoteliales.
17. 17. Método según la reivindicación 16, donde la condición es artritis reumatoide .
18. 18. Método según la reivindicación 3 donde la condición se caracteriza por la angiogénesis indeseable y la característica funcional de las células endoteliales modulada es la desregulación de un fenotipo angiogénico de las células endoteliales.
19. 19. Método según la reivindicación 18, donde la condición es un tumor.
20. 20. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, 10-11 o 13-15, donde la modulación es la sobrerregulacion de los niveles de esfingosina cinasa y la sobrerregulacion es lograda introduciendo":: en las células endoteliales una molécula de ácido nucleico que codifique para la esfingosina cinasa o equivalente' funcional, derivado u homólogo de la misma o el producto de la expresión de la esfingosina cinasa o derivado funcional, * homólogo, análogo, equivalente o mimético del mismo.
21. 21. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-19 donde la modulación es lograda poniendo en contacto las células endoteliales con una molécula proteinácea o no proteinácea, que modula la regulación transcripcional y/o translacional del gen de la esfingosina cinasa.
22. 22. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, 10-11 o 13-15 donde la modulación es la sobrerregulacion de los niveles de esfingosina cinasa y la sobrerregulacion es lograda poniendo en contacto las células endoteliales con una molécula proteinácea o no proteinácea que funciona como agonista del producto de la expresión de la esfingosina cinasa.
23. 23. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, 8-10, 12-13, o 16-19 donde la modulación es una desregulación de los niveles de esfingosina cinasa y la desregulación es lograda poniendo en contacto las células endoteliales con una molécula protein cea o no proteinácea que funciona como antagonista al producto de la expresión de la esfingosina cinasa.
24. 24. Método -según la reivindicación 23 donde la molécula es una esfingosina cinasa mutante '' la cual se caracteriza por la sustitución .del residuo de glicina en la posición 82 para aspar tato.
25. 25. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde la actividad de la célula endotelial es modulada in vivo.
26. 26. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde la actividad de la célula endotelial es modulada in vitro.
27. 27. Uso de un agente capaz de modular el nivel funcional de esfingosina cinasa en la elaboración de un medicamento para la modulación de una o más características funcionales de células endoteliales en un mamífero, donde la inducción de la sobreexprésion del nivel de esfingosina cinasa modula una o más de las características funcionales de las células endoteliales .
28. 28. Uso según la reivindicación 27 donde el agente es una molécula proteinácea o no proteinácea, la cual modula la regulación transcripcional y/o translacional del gen de la esfingosina cinasa, funciona como un agonista de la actividad de la esfingosina cinasa o funciona como antagonista de la actividad de la esfingosina cinasa .
29. 29. Uso de esfingosina cinasa o un"¡ácido nucleico que codifica para la esfingosina cinasa en la elaboración de un medicamento para la modulación de '¦ una o más características funcionales de las células endoteliales en un mamífero, donde la inducción de la sobreexpresión del nivel de esfingosina cinasa modula una o más de las características funcionales de las células endoteliales.
30. 30. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 27-29, donde la célula endotelial es una célula endotelial vascular.
31. 31. Uso según la reivindicación 30, donde la característica funcional de las células endoteliales es sobrerregulable por la sobreexpresión de la esfingosina cinasa y la característica es una o más de la viabilidad, proliferación, diferenciación, expresión de moléculas de la superficie celular, respuestas de citocina o proliferación o viabilidad mejorada.
32. 32. Uso según la reivindicación 31 donde la molécula de la superficie celular es una molécula de adhesión.
33. 33. Uso según la reivindicación 30 donde la característica funcional de las células endoteliales es sobrerregulable por la sobreexpresión , de la esfingosina cinasa y la característica es la inducción de un fenotipo proinflamatorio .
34. 34. Uso según la' reivindicación-: 30 donde la característica funcional de las células endoteliales es sobrerregulable por la sobreexpresión de la ' esfingosina cinasa y la característica es la inducción de un fenotipo angiogénico .
35. 35. Uso según la reivindicación 30, donde la característica funcional de las células endoteliales es sobrerregulable por la sobreexpresión de la esfingosina cinasa y la característica es el mantenimiento del fenotipo progenitor de células endoteliales CD34+'
36. 36. Uso según la reivindicación 35, donde es mantenido el fenotipo progenitor CD34+.
37. 37. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 27-36 donde el medicamento es usado para tratar una condición caracterizada por el funcionamiento aberrante o en otras circunstancias indeseables de las células endoteliales .
38. 38. Uso según la reivindicación 37, donde la condición es el injerto vascular, reparación de heridas, transplante de tejidos u órganos o la reparación de tejido desvascularizado y la característica funcional de las células endoteliales modulada es una o más de la proliferación mejorada de las células endoteliales, de viabilidad mejorada de las células endoteliales o mantenimiento del fenotipo progenitor de las células endoteliales CD34+. 'í
39. 39. Uso según la reivindicación 37, donde la condición es una condición inflamatoria y la característica funcional de las células endoteliales modulada es la desregulación de una o más de un fenotipo inflamatorio o * angiogénico de las células endoteliales.
40. 40. Uso según la reivindicación 39 donde la condición es la artritis reumatoide.
41. 41. Uso según la reivindicación 37 donde la condición se caracteriza por la angiogénesis indeseable y la 'característica funcional de las células endoteliales modulada es la desregulación del fenotipo angiogénico de las células endoteliales.
42. 42. Uso según la reivindicación 41, donde la condición es un tumor.
43. 43. Composición farmacéutica que comprende el agente modulador y uno o más excipientes y/o diluentes farmacéuticamente aceptables cuando se usa en el método según cualquiera de las reivindicaciones 1-26.