PROCESO PARA LA PRODUCCION DE L-LISINA QUE USA BACTERIAS CORINEFORMES
Campo de la Invención La invención proporciona un proceso para la producción de L-lisina que usa bacterias corineformes, que son resistentes a los análogos del ácido diaminopimélico, en particular, al ácido 4-hidroxidiaminopiméiico . Antecedentes de la Invención Los L-aminoácidos , en particular la L-lisina, se usan en la medicina humana, en la industria farmacéutica, en la industria de los comestibles, y más particularmente en la nutrición animal . Se sabe de la producción de aminoácidos mediante la fermentación de cepas de bacterias corineformes, en particular, la corynebacterium glutamicum. Tomando en cuenta su gran importancia, se hacen constantemente esfuerzos para mejorar los procesos de producción. Las mejoras del proceso pueden estar relacionadas con las medidas empleadas en la tecnología de la fermentación, tales como por ejemplo, la agitación y el suministro de oxígeno, o la composición del medio nutriente tal como por ejemplo, la concentración de azúcar durante la fermentación, o la preparación para formar el producto mediante por ejemplo, cromatografía de intercambio de iones o las propiedades de desempeño intrínsecas del mismo microorganismo.
REF. : 160250 Para mejorar las propiedades de desempeño de estos microorganismos, se emplean métodos que involucran mutagénesis , selección y elección de imitantes . En esta forma, se obtienen cepas que son resistentes a los antimetabolitos tales como por ejemplo, los análogos de la lisina S- (2-aminoetil) -cisteína, o que son auxotrópicos para regular metabolitos importantes que producen L-aminoácidos . Durante algunos años, los métodos que utilizan tecnología de ADN recombinante, han sido empleados para mejorar las cepas que producen L-aminoácidos de Corynebácterium glutamicum, amplificando los genes de la biosíntesis del aminoácido individual e investigando el efecto en la producción del L-aminoácido . Breve Descripción de la Invención Los inventores han estado involucrados en la invención de nuevos principios para mejorar los procesos de la producción fermentativa de la L-lisina usando la bacteria corineforme . Descripción Detallada de la Invención Cuando se menciona en lo sucesivo a la L-lisina o lisina, se entiende que se incluyen no solo las bases, sino también sales tales como por ejemplo, monoclorhidrato de lisina o sulfato de lisina. La invención proporciona un proceso para la producción fermentativa de la L-lisina que usa una bacteria corineforme que es resistente a los análogos de ácido diaminopimélico, en particular, el ácido 4-h.idroxidiaminopimélico . Los análogos se usan generalmente en concentraciones de > (mayor que/igual a) 3 a < (menor que/igual a) 30 g/1. La invención proporciona también un proceso para la producción fermentativa de L-lisina usando bacterias corineformes que ya producen L-lisina, y que son resistentes a los análogos de ácido diaminopimélico, en particular 4- idroxidiaminopimélico . Esta invención proporciona demás, un proceso para la producción de L-lisina en la cual las siguientes etapas se llevan a cabo: a) fermentación de las bacterias corineformes que producen L-lisina, que son al menos resistentes a los análogos de ácido diaminopimélico, en particular, ácido 4-hidroxidiaminopimélico . b) enriquecimiento de la L-lisina en el medio o en las células bacterianas; y opcionalmente c) aislamiento de la L-lisina o aditivos para alimentos que contienen L-lisina a partir de un caldo de fermentación, de manera que sea > 0 a 100% de los constituyentes a partir del caldo de fermentación y/o a partir de la biomasa que está presente. La invención proporciona además, un proceso para la producción de bacterias corineformes que son resistentes a los análogos de ácido diaminopimélicos , en particular, el ácido -hidroxi-diaminopimélico . Las cepas que se usan, producen L-lisina, preferiblemente antes de resistir al ácido 4-hidroxidiaminopimélico . La expresión de los análogos de ácido diaminopimélico de acuerdo a la presente invención incluye compuestos tales como ácido 4-fluorodiaminopimélico, ácido -hidroxidiaminopimélico, ácido 4-oxodiaminopimélico, o ácido 2 , , 6-triaminopimélico . La presente invención proporciona también bacterias corineformes imitantes que producen L-lisina que son resistentes a uno o más de los análogos de ácido diaminopimélico seleccionados del grupo que comprende ácido 4-fluorodiaminopimélico, ácido 4-hidroxidiaminopimélico, 4-oxodiaminopimélico o ácido 2 , 4 , 6-triaminopimélico . La invención proporciona por otra parte, aditivos para alimentos basados en un caldo de fermentación que contiene L-lisina producido de acuerdo a la invención y sin o solamente las trazas de biomasa y/o constituyentes a partir del caldo de fermentación formado durante la fermentación de los microorganismos que producen la L-lisina. Se comprende que el término "trazas" significa cantidades de > 0% a 5%.
La invención proporciona además, aditivos para alimentos basados en el caldo de fermentación, caracterizada porque a) contienen L-lisina producida de acuerdo a la invención, y b) contienen la biomasa y/o constituyentes del caldo de fermentación en una cantidad de 90% a 100% que se forma durante la fermentación de los microorganismos que producen L-lisina . Los microorganismos que se proporcionan a partir de la presente invención, pueden producir aminoácidos de glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas, almidón, celulosa o a partir de glicerol y etanol . Estos microorganismos pueden ser representativos de las bacterias corineforme, en particular del género Corynebacterxum. Entre el género Corynebacterium, debe mencionarse en particular la especie Corynebacterium glutamicum, la cual se conoce por los especialistas en este campo por su capacidad para producir L-aminoácidos . Las cepas adecuadas del género Corynebacterium, en particular, las especies Corynebacterium glutamicum, se encuentran en particular las siguientes cepas del tipo silvestre conocidas Corynebacterium glutamicum ATCC13032 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806 Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870 Corynebacterium melassecol ATCC17965 Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539 Brevibacterium flavum ATCC14067 Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 y Brevibacterium di aricatum ATCC14020 y mutantes que producen L-aminoácidos y/o cepas producidas por las mismas, tales como por ejemplo, las cepas que producen L-lisina Corynebacterium glutamicumFER -P 1709 Brevibacterium flavum FERM-P 1708 Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712 Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463 Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 Corynebacterium glutamicum ATCC 21513 Corynebacterium glutamicum ATCC 21544 Corynebacterium glutamicum ATCC 21543 Corynebacterium glutamicum DSM 4697 y Corynebacterium glutamicum DSM 5715. Se ha encontrado que la bacteria corineforme que es resistente a los análogos de ácido di minopimélico, en particular al ácido 4-hidroxidiaminopimélico, producen L-lisina de una forma mejorada. Con objeto de producir la bacteria corineforme de acuerdo a la invención que es resistente al ácido 4-hidroxidiaminopimelico, se usan métodos de mutagénesis descritos en el arte previo. Para la mutagénesis, se pueden emplear procesos de mutagénesis in vivo convencionales usando sustancias mutagénicas tales como por ejemplo, N-metil-N' -nitro-N-nitrosoguanidina o luz ultravioleta (Miller, J. H.: A Short Course in Bacterial Genetics. A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1992) . La bacteria corineforme que es resistente al ácido 4-hidroxidiaminopimélico puede identificarse mediante colocación en placas con un medio nutriente que contiene ácido 4 -hidroxidiaminopimélico . Las concentraciones finales de ca. 5 a 15 g/1, por ejemplo, ca. 10 g/1 de ácido 4-hidroxidiamino-pimélico en el medio nutriente son particularmente adecuadas para este propósito. A esta concentración, los mutantes resistentes al ácido 4-hidroxidiaminopimélico pueden distinguirse a partir de las cepas precursoras inalteradas mediante un crecimiento tardío. Después de la selección, los mutantes al ácido 4-hidroxidiaminopimélico exhiben una producción de L-lisina mej orada . Además, puede ser ventajoso para la producción de L-lisina, además de la resistencia al ácido 4- idroxidiaminopimélico, mejorar, en particular, sobreexpresar, una o más enzimas de la trayectoria de biosíntesis respectiva, glicólisis, anaplerosis, ciclo del ácido cítrico, ciclo de la pentosa fosfato, exportación de aminoácidos y opcionalmente , proteínas reguladoras. En general, se prefiere el uso de genes. Se entiende que las expresiones "genes endógenos" o "secuencias de nucleótidos endógenas" significan los genes o secuencias de nucleótidos presentes en la población de una especie. Las expresiones "mejorar" y "para mejorar" describen en este contexto, el incremento de la actividad intracelular de una o más enzimas o proteínas en un microorganismo que se codifica por el ADN correspondiente, mediante por ejemplo, el incremento en el número de copias del gen o genes, que emplean un promotor fuerte o un gen que codifica a una enzima correspondiente o proteína que tiene una actividad elevada y, opcionalmente, combinar estas mediciones. Por medio de esta mejora, en particular las medidas de sobreexpresión, la actividad o concentración de la proteína correspondiente se eleva generalmente al menos 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% ó 500%, hasta 1000% ó 2000%, referidos para la actividad o concentración de la proteína de tipo silvestre y/o la actividad o concentración de la proteína en los microorganismos de partida.
Así, para la producción de L-lisina, además de la resistencia a los análogos de ácido diaminopimélicos , en particular uno o más de los genes seleccionados del siguiente grupo pueden ser mejorados, en particular sobreexpresados : el gen lysC que codifica para una aspartato cinasa resistente a una retroalimentación (No. de acceso P26512, EP-B-0387527, EP-A-0699759 , WO 00/633388), El gen dapA que codifica para la dihidrodipicolinato sintasa (EP-B 0 197 335) , el gen gap que codifica para la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (Eikmanns (1992). Journal of Bacteriology 174 : 6076-6086) , simultáneamente, el gen pyc que codifica para piruvato carboxilasa (DE-A-198 31 609, EP-A-1108790) , el gen zwf que codifica para la deshidrogenasa de glucosa-6-fosfato (JP-A-09224661 , EP-A-1108790), simultáneamente, el gen lysE que codifica para la proteína que exporta lisina (DE-A-195 48 222) , el gen zwal que codifica para la proteína Zwal (DE:
19959328.0, DSM 13115), el gen lysA que codifica para la descarboxilasa del ácido diaminopimélico (No. de acceso X07563), el gen sigC que codifica para factor C sigma (DE: 10043332.4, DSM14375) , el gen tpi que codifica para la triosa fosfato isomerasa (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:6075-6086) y el gen pgk que codifica para 3-fosfoglicerato cinasa (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086). Además, puede ser ventajoso para la producción de L-lisina, además de la resistencia del ácido 4- idroxidiamino pimélico, simultáneamente atenuar, en particular reducir la expresión, de uno o más de los genes seleccionados del siguiente grupo: el gen pck que codifica para fosfoenol piruvato carboxicinasa (DE 199 50 409.1, DSM 13047), el gen pgi que codifica para la glucosa-6-fosfato isomerasa (US 09/396,478, DSM 12969), el gen poxB que codifica para la pivurato oxidasa (DE:1995 1975.7, DSM 13114), el gen deaD que codifica ADN helicasa (DE: 10047865.4, DS 14464) , el gen citE que codifica para la citrato liasa (PCT/EP01/00797, DSM13981) , el gen menE que codifica para ácido. O-succinilbenzoico
CoA-ligasa (DE: 10046624.9, DSM14080) , el gen mikE17 que codifica para mikE17 regulador de la transcripción (DE: 10047867.0, DSM14143) y el gen z a2 que codifica para la proteína Zwa2 (DE: 19959327.2, DSM 13113) .
El término "atenuación" describe en esta conexión, la reducción o extinción de la actividad intracelular de una o más enzimas (proteínas) en un microorganismo que se codifica por el ADN correspondiente, usando por ejemplo, un promotor débil o un gen o alelo que codifica a una enzima correspondiente con una actividad reducida o que inactiva al gen correspondiente o enzima (proteína) , y opcionalmente combinar estas mediciones . Por medio de estas mediciones de atenuación, la actividad o concentración de la proteína correspondiente se reduce generalmente de 0 a 75%, de 0 a 50%, de 0 a 25%, de 0 a 10% ó de 0 a 5% de la actividad o concentración de la proteína del tipo silvestre, y/o la actividad o concentración de la proteína en el microorganismo inicial . Finalmente, puede ser ventajoso también para la producción de L-lisina, además de la resistencia al ácido 4-hidroxi-diaminopimélico, extinguir las reacciones secundarias indeseables (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms" , en: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academia Press, London, U , 1982) . Los microorganismos producidos de acuerdo a la invención se abarcan también en la invención y pueden cultivarse continuamente o discontinuamente en un proceso por lotes (cultivo por lotes) o en un proceso de retroalimentación (proceso de alimentación) o proceso de retroalimentación repetido (proceso de alimentación repetitivo) con el propósito de producir la L-lisina. Un resumen de los métodos de cultivo conocidos se describe en el libro de texto de Chmiel (Bioprozesstechnik 1. ' Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991) ) o en el libro de texto de Storhas (Bioreaktoren und peiphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994) ) . El medio de cultivo que va a usarse debe satisfacer en forma adecuada los requerimientos de las cepas respectivas . Las descripciones del medio de cultivo para varios microorganismos se contienen en el manual "Manual of Methods for General Bacteriology" de la Sociedad Americana de Bacteriología (Washington D.C., USA, 1981). Como fuente de carbono, pueden usarse azúcares y carbohidratos tales como por ejemplo, glucosa, sacarosa, lactosa, fructuosa, maltosa, melazas, almidón y celulosa, aceites y grasas tales como por ejemplo, aceite de fríjol de soya, aceite de girasol, aceite de cacahuate y aceite de coco, ácidos grasos tales como por ejemplo, ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoléico, alcoholes tales como por ejemplo, glicerol y etanol y ácidos orgánicos tales como por ejemplo, ácido acético. Estas sustancias pueden usarse individualmente o como una mezcla.
Como una fuente de nitrógeno, pueden usarse compuestos que contienen nitrógeno orgánico tales como peptonas, extracto de levadura, extracto de carne, extracto de malta, extracto soluble de maíz, harina de fríjol de soya y urea, compuestos inorgánicos tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio. Las fuentes de nitrógeno pueden usarse individualmente como una mezcla. Como fuente de fósforo, puede usarse ácido fosfórico, fosfato ácido de potasio o fosfato ácido de dipotasio o las sales que contienen sodio correspondientes. El medio de cultivo debe contener además, sales metálicas tales como por ejemplo, sulfato de magnesio o sulfato de hierro, que son necesarios para el crecimiento. Finalmente, los promotores de crecimiento esenciales tales como aminoácidos y vitaminas pueden usarse además, para las sustancias antes mencionadas. Aparte de estos, pueden añadirse precursores adecuados al medio de cultivo. Las sustancias de partida antes mencionadas pueden añadirse al cultivo en la forma de un lote sencillo o pueden alimentarse en forma apropiada durante el cultivo. Con objeto de regular el pH de los compuestos básicos del cultivo se usan hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoníaco o agua de amoníaco o compuestos ácidos tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico como sea apropiado. Para controlar la formación de espuma, pueden usarse agentes antíespuraantes tales como por ejemplo, esteres de poliglicol de ácidos grasos. Para mantener la estabilidad de los plásmidos, pueden añadirse al medio, sustancias que actúan selectivamente por ejemplo, antibióticos. Para mantener las condiciones aeróbicas, oxígeno o mezclas de gas que contienen oxigeno se alimentan en el cultivo. La temperatura del cultivo es normalmente de 20°C a 45°C, y preferiblemente a 25°C a 40°C. El cultivo se continúa hasta que se ha formado la cantidad máxima del producto deseado. Este objetivo se logra normalmente dentro de 10 a ISO horas. Los métodos para la determinación de L-lisina se conocen a partir del arte previo. El análisis puede llevarse a cabo como se describe por Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) mediante cromatografía por intercambio de aniones seguida por la derivación de ninhidrina, o mediante HPLC de fase inversa como se describe por Lindroth et al . (Analytical Chemistry (1979) 51:1167-1174) . El proceso de acuerdo a la invención sirve para la producción fermentativa de la L-lisina. La concentración de L-lisina puede ajustarse opcionalmente para el valor deseado mediante la adición de L-lisina . Mediante los procesos descritos, es posible aislar las bacterias corineformes que son resistentes a los análogos de ácido diaminopimélico, en particular el ácido 4-hidroxi-diaminopimélico y para producir L-lisina en una forma mejorada, de acuerdo a los procesos de fermentación descritos . E emplo 1 Separación por exclusión de los clones resistentes al ácido 4-hidroxidiaminopimélico . La cepa Corynebacterium glutamicum DM1725 se produjo mediante la mutagénesis dirigida y no dirigida múltiple, que incluye métodos generados a partir de la ingeniería genética, selección y selección mutante de la C. glutamicum ATCC13032. La cepa es resistente al análogo de lisina S- (2-aminoetil ) -Lcisteína y tiene dos reproducciones completas idénticas del gen LysC que codifica a una aspartato cinasa resistente a la retroalimentación. Las dos reproducciones se localizan en el sitio del gen LysC en el cromosoma. La aspartato cinasa resistente a la retroalimentación es insensible a la inhibición mediante mezclas de lisina (o el análogo de lisina S- (2 -aminoetil ) -L-cisteína, 100 mM) y treonina (10 mM) , pero en contraste a la actividad de la aspartato cinasa en el tipo silvestre se inhibe en una actividad residual hasta del 10%. La cepa es resistente a la estreptomicina. Un cultivo puro de la cepa DM1725 se depositó como DSM 15662 el 6 de Junio de 2003 en la Colección Alemana para los Microorganismos y los cultivos celulares (DSM Brunswick) de acuerdo a la Convención de Budapest . Para la separación por exclusión en colonias que son resistentes al ácido 4-hidroxidiaminopimélico, la cepa DSM 15662 después de la mutagénesis de UV (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Segunda edición, Cold Spring Harbor, New York, 1989) se coloca en placas de agar LB que contienen ácido 4-hidroxidiaminopimélico. Las placas de agar se suministran con 10 g/1 de ácido 4-hidroxidiaminopimélico . El crecimiento de las colonias se observa durante 48 horas. A esta concentración, los mutantes que son resistentes al ácido 4-hidroxidiaminopimélico pueden distinguirse de la cepa precursora inalterada mediante un crecimiento mejorado. En esta forma, se identifica un clon qüe exhibe un crecimiento mucho mejor comparado al DSM 15662. La cepa se identifica como DSM 15662_Hdap_r . Ejemplo 2 Producción de la lisina La cepa C. glutamicum DSM 15662_Hdap_r obtenida en el ejemplo 1 se cultiva en un medio nutriente adecuado para la producción de lisina y se determina el contenido de lisina en el sobrenadante del cultivo. Para este propósito, todas las cepas se incuban primero en placas de agar durante 24 horas a 33°C. Usando este cultivo en placas de agar, el precultivo se inocula (10 mi del medio en un matraz Erlenmeyer de 100 mi) . El medio MM se usa como un medio para el precultivo. El precultivo se incuba durante 24 horas a 33 °C a 240 rpm en un vibrador. Usando este precultivo, el cultivo principal se inocula de modo que la densidad óptica inicial (0D- 660 nm) del cultivo principal es de 0.1 OD. El medio MM se usa también para el cultivo principal . Medio MM
El CSL (licor fermentado de maíz) , MOPS (ácido morfolinopropanosulfónico) y la solución salina se ajustaron con agua y amoniaco a un pH 7 y se trataron en autoclave. Se añadieron el sustrato estéril y las soluciones vitamínicas así como el CaC03 de autoclave seco. El cultivo se realizó en un matraz Erlenmeyer de 100 mi con un volumen de 10 mi equipado con mamparos. El cultivo se lleva a cabo a 33 °C y 80% de humedad atmosférica. Después de 72 horas, el OD se determina mediante la medición de la longitud de onda de 660 nm con un instrumento Biomek 1000 (Beckmann Instruments GMBH, Munich) . La cantidad de la lisina formada se determina mediante cromatografía de intercambio de iones y derivación post-columna con detección de ninhidrina usando un analizador de aminoácidos a partir del Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania) . El resultado del experimento se muestra en la tabla 1 Tabla 1
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.