COMPUESTOS DE TIENILO Campo de la Invención Esta invención se refiere a nuevas aminas heterocíclicas espiroazabicíclicas o sales farmacéuticamente aceptables de las mismas, procesos para prepararlas, composiciones farmacéuticas que las contienen y su uso en terapia . Antecedentes de la Invención El uso de compuestos los cuales enlazan a receptores de acetilcolina nicotínicos para el tratamiento de un intervalo de trastornos que involucran función colinergica reducida tal como mal de Alzheimer, trastornos cognitivos y de atención, ansiedad, depresión, suspensión del hábito de fumar, neuroprotección, esquizofrenia, analgesia, síndrome de Tourette, y mal de Parkinson, se discute en McDonald et al., (1995) "Nicotinic Acetylcholine Receptors : Molecular Biology, Chemistry and Pharmacology" , Capítulo 5 en Annual Reports in Medicinal Chemistry, vol . 30, pp. 41-50, Academic Press Inc., San Diego, CA; y en Williams et al., (1994) "Neuronal Nicotinic Acetylcholine Receptors," Drug News & Perspectives , vol. 7, pp. 205-223. Descripción Detallada de la Invención Esta invención comprende compuestos que son ligandos potentes para receptores de acetilcolina nicotínicos (nAChR' s) .
Ref. 159392 Los compuestos de la invención son aquellos de acuerdo con la fórmula I :
y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, en donde Ar se selecciona de un tiofeno, benzo [b] tiofeno o benzo [c] tiofeno 2- ó 3 -enlazado, sustituido con 0, l, 2 ó 3 sustituyentes independientemente seleccionados en cada caso de alquilo de Ci-4, alcoxi de Ci-4, alquilo halogenado de Ci-4, alquilo oxigenado de Ci_4, alquenilo de C2-4, alquinilo de C2-4, halógeno, -CN, -N02, - (CH2) NNR1R2 , n es 0 , 1 , ó 2 ; R1 y R2 se seleccionan independientemente en cada caso de hidrógeno o alquilo de Ci-4; R es un sustituyente seleccionado de hidrógeno, alquilo de C1-4, alquilo halogenado de Ci-4, alquilo oxigenado de Ci_4, o halógeno. Los compuestos particulares de la invención son aquellos en donde R es hidrógeno y Ar es un tiofeno 2-, ó 3- enlazado que tiene 0 ó 1 sustituyente seleccionado de metilo, etilo, o halógeno. Los compuestos particulares de la invención incluyen : (2'R) -5' - (tiofen-2-il) espiro [1-azabiciclo [2.2.2] octano-3,2' (3?) -furo [2 , 3 -b] piridina] ; (2 'R) -5' - (tiofen-3 -il) espiro [1-azabiciclo [2.2.2] octano-3,2' (3?) -furo [2, 3 -b] piridina] ; (2 'R) -5' - (benzo [b] tiofen-2 -il) espiro [1-azabiciclo [2.2.2] -octano-3 , 2 ' (3 ?) -furo [2 , 3-b] piridina] ; (2 'R) -5' - (benzo [b] tiofen-3-il) espiro [1-azabiciclo [2.2.2]-octano-3 , 2 ' (3 ' H) -furo [2 , 3 -b] piridina] ; (2 'R) -5' - (5 -metiltiofen-2-il) espiro [1-azabiciclo [2.2.2]-octano-3,2' (3?) -furo [2 , 3 -b] piridina] ; (2 ' R) -5 ' - (4-metiltiofen-2-il) espiro [1-azabiciclo [2.2.2]-octano-3,2' (3?) -furo [2 , 3 -b] piridina] ; (2 'R) -5' - (5-clorotiofen-2-il) espiro [1-azabiciclo [2.2.2] -octano-3, 2' (3?) -furo [2 , 3 -b] piridina] ; (2 ' R) -5 ' - (5-clorotiofen-3-il) espiro [1-azabiciclo [2.2.2] -octano-3 , 2 ' (3 ?) -furo [2 , 3-b] piridina] ; Otros compuestos particulares de la invención incluyen : (2'R) -5' - (5-fluorotiofen-2-il) espiro [1-azabiciclo [2.2.2]-octano-3,2' (3?) -furo [2 , 3 -b] piridina] ; (2 ' R) -5 ' - (5-bromotiofen-2-il) espiro [1-azabiciclo [2.2.2] -octano-3, 2' (3?) -furo [2 , 3 -b] piridina] ; (2'R) -5' - (5-fluorotiofen-3-il)espiro[l-azabiciclo[2.2.2] -octano-3, 2' (3?) -furo [2 , 3 -b] piridina] ; (2'R) -5' - (5-bromotiofen-3-il) espiro [1-azabiciclo [2.2.2]-octano-3, 2' (3?) -furo [2 , 3 -b] piridina] (2 ' R) -4- {espiro [1-azabiciclo [2.2.2] octano-3 , 2 ' (3 ?) - furo [2,3-b] iridin-5 ' -il } tiofen-2 -carbonitrilo ; (2 ' R) -5- {espiro [1-azabiciclo [2.2.2] octano-3 , 2 ' (3 ?) -furo [2,3-b] piridin-5 ' -il }tiofen-2 -carbonitrilo . En otro aspecto la invención se refiere a compuestos de acuerdo con la fórmula I y su uso en terapia y composiciones que los contienen. En un aspecto adicional la invención se refiere a compuestos de acuerdo con la fórmula I en donde uno o más de los átomos se etiqueta con un radioisótopo del mismo elemento. En una forma particular de este aspecto de la invención el compuesto de la fórmula I se etiqueta con tritio. En un aspecto particular la invención se refiere al uso de compuestos de acuerdo con la fórmula I para la terapia de enfermedades mediadas a través de la acción de receptores de acetilcolina nicotinicos. Un aspecto más particular de la invención se refiere al uso de compuestos de la fórmula I para la terapia de enfermedades mediadas a través de la acción de receptores de acetilcolina nicotinicos OÍ7. Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un compuesto como se describió anteriormente, y un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable. Otro aspecto de la invención se refiere a la composición farmacéutica anterior para el uso en el tratamiento o profilaxis de condiciones o enfermedades humanas en las cuales la activación del receptor nicotínico OÍ7 es beneficiosa. Otro aspecto de la invención se refiere a la composición farmacéutica anterior para el uso en el tratamiento o profilaxis de trastornos psicóticos o trastornos de deficiencia intelectual. Otro aspecto de la invención se refiere a la composición farmacéutica anterior para el uso en el tratamiento o profilaxis de mal de Alzheimer, déficit de aprendizaje, déficit de conocimiento, déficit de atención, pérdida de memoria, Trastorno de Hiperactividad por Déficit de Atención, ansiedad, esquizofrenia, o mal de Parkinson por manía o maníaco depresión, enfermedad de Huntington, síndrome de Tourette, trastornos neurodegenerativos en los cuales existe pérdida de sinapsis colinérgica, síndrome de cambio de horario, suspensión del hábito de fumar, adición de nicotina incluyendo aquella resultante de la exposición a productos que contienen nicotina, ansia, dolor, y colitis ulcerativa. Otro aspecto de la invención se refiere a un uso de un compuesto como se describió anteriormente en la manufactura de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de condiciones o enfermedades humanas en las cuales la activación del receptor nicotínico OÍ7 es beneficiosa.
Otro aspecto de la invención se refiere a un uso de un compuesto como se describió anteriormente en la manufactura de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de trastornos psicóticos o trastornos de deficiencia intelectual . Otro aspecto de la invención se refiere al uso anterior, en donde la condición o trastorno es mal de Alzheimer, déficit de aprendizaje, déficit de conocimiento, déficit de atención, pérdida de memoria, Trastorno de Hiperactividad por Déficit de Atención. Otro aspecto de la invención se refiere al uso anterior, en donde el trastorno es ansiedad, esquizofrenia, o manía o maníaco depresión. Otro aspecto de la invención se refiere al uso anterior, en donde el trastorno es mal de Parkinson, enfermedad de Huntington, síndrome de Tourette, o trastornos neurodegenerativos en los cuales existe pérdida de sinapsis colinérgica . Otro aspecto de la invención se refiere al uso de un compuesto como se describió anteriormente en la manufactura de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de síndrome de cambio de horario, suspensión del hábito de fumar, adicción de nicotina incluyendo aquella que resulta de la exposición a productos que contienen nicotina, ansia, dolor, y colitis ulcerativa.
Otro aspecto de la invención se refiere a un método de tratamiento o profilaxis de condiciones o enfermedades humanas en las cuales la activación del receptor nicotínico al es beneficiosa, el cual comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto como se describió anteriormente. Otro aspecto de la invención se refiere a un método de tratamiento o profilaxis de trastornos psicóticos o trastornos de deficiencia intelectual, el cual comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto como se describió anteriormente . Otro aspecto de la invención se refiere al método anterior, en donde el trastorno es mal de Alzheimer, déficit de aprendizaje, déficit de conocimiento, déficit de atención, pérdida de memoria, o Trastorno de Hiperactividad por Déficit de Atención. Otro aspecto de la invención se refiere al método anterior, en donde el trastorno es mal de Parkinson, enfermedad de Huntington, síndrome de Tourette, o trastornos neurodegenerativos en los cuales existe pérdida de sinapsis colinérgica . Otro aspecto de la invención se refiere al método anterior, en donde el trastorno es ansiedad, esquizofrenia, o manía o maníaco depresión. Otro aspecto de la invención se refiere a un método de tratamiento o profilaxis de síndrome de cambio de horario, suspensión del hábito de fumar, adición de nicotina, ansia, dolor, y colitis ulcerativa, el cual comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto como se describió anteriormente. Un aspecto adicional de la invención se refiere a una composición farmacéutica para tratamiento o prevención de una condición o trastorno como se ejemplifica posteriormente que surge de disfunción de neurotransmisión de receptor de acetilcolina nicotínico en un mamífero, preferiblemente un humano, que comprende una cantidad de un compuesto de la fórmula I, un enantiómero del mismo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, efectiva en el tratamiento o prevención de tal trastorno o condición y un portador farmacéuticamente aceptable, inerte. Para los usos mencionados anteriormente la dosificación administrada variará, desde luego, con el compuesto empleado, el modo de administración y el tratamiento deseado. Sin embargo, en general, los resultados satisfactorios se obtienen cuando los compuestos de la invención se administran a una dosificación diaria de aproximadamente 0.1 mg a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal del animal. Tales dosis se pueden dar en dosis divididas 1 a 4 veces al día o en forma de liberación sostenida. Para el hombre, la dosis diaria total está en el intervalo de 5 mg a 1400 mg, más preferiblemente de 10 mg a 100 mg, y las formas de dosificación unitarias adecuadas para la administración oral comprenden de 2 mg a 1400 mg del compuesto mezclado con un portador o diluyente farmacéutico, sólido o líquido. Los compuestos de la fórmula I, o un enantiómero de los mismos, y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, se pueden usar solos o en la forma de preparaciones medicinales apropiadas para la administración enteral o parenteral . De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que incluye preferiblemente menos de 80% y más preferiblemente menos de 50% en peso de un compuesto de la invención en mezcla con un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable, inerte. Los ejemplos de diluyentes y portadores son: - para tabletas y grageas: lactosa, almidón, talco, ácido esteárico; - para cápsulas: ácido tartárico o lactosa,- - para soluciones inyectables: agua, alcoholes, glicerina, aceites vegetales; - para supositorios: ceras y aceites endurecidos o naturales . También se proporciona un proceso para la preparación de tal composición farmacéutica el cual comprende mezclar los ingredientes. Un aspecto adicional de la invención es el uso de un compuesto de acuerdo con la invención, un enantiómero del mismo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la manufactura de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de una de las enfermedades o condiciones mencionadas posteriormente; y un método de tratamiento o profilaxis de una de las enfermedades o condiciones mencionadas anteriormente, el cual comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de acuerdo con la invención, o un enantiómero del mismo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, a un paciente. Los compuestos de acuerdo con la invención son agonistas de receptores de acetilcolina nicotínicos . Mientras que no se limita por teoría, se cree que los agonistas del subtipo al nAChR (receptor de acetilcolina nicotínico) deberán ser útiles en el tratamiento o profilaxis de trastornos psicóticos y trastornos de deficiencia intelectual, y tienen ventajas sobre compuestos los cuales son o también son agonistas del subtipo a4 nAChR. Por lo tanto, los compuestos los cuales son selectivos para el subtipo al nAChR son preferidos. Los compuestos de la invención se indican como preparaciones farmacéuticas, en particular en el tratamiento o profilaxis de trastornos psicóticos y trastornos de deficiencia intelectual. Los ejemplos de trastornos psicóticos incluyen, esquizofrenia, manía y maníaco depresión, y ansiedad. Los ejemplos de trastornos de deficiencia intelectual incluyen mal de Alzheimer, déficit de aprendizaje, déficit de conocimiento, déficit de atención, pérdida de memoria, y Trastorno de Hiperactividad por Déficit de Atención. Los compuestos de la invención también pueden ser útiles como analgésicos en el tratamiento de dolor (incluyendo dolor crónico) y en el tratamiento o profilaxis de mal de Parkinson, enfermedad de Huntington, síndrome de Tourette, y trastornos neurodegenerativos en los cuales existe pérdida de sinapsis colinérgica. Los compuestos adicionalmente se pueden indicar para el tratamiento o profilaxis de síndrome de cambio de horario, para el uso en la inducción de la suspensión del hábito de fumar, ansia, y para el tratamiento o profilaxis de adicción de nicotina (incluyendo aquella resultante de la exposición a productos que contienen nicotina) . También se cree que los compuestos de acuerdo con la invención son útiles en el tratamiento y profilaxis de colitis ulcerativa. Como se usa en la presente, el término "alquilo de Ci_4" se refiere a un grupo alquilo de Ci-4 de cadena recta, ramificada o cíclica. Como se usa en la presente, el término "alquilo halogenado de Ci-4" se refiere a un grupo alquilo de Ci-4 sustituido con 1, 2, ó 3 átomos de halógeno. Como se usa en la presente, el término "alquilo oxigenado de Ci_4" se refiere a un grupo hidroxialquilo de Ci- o alcoxialquilo de Ci-4. Métodos de Preparación Los compuestos de la fórmula I se pueden preparar de acuerdo con los métodos conocidos por personas expertas en la técnica de la química orgánica sintética. Los métodos los cuales se pueden usar para la síntesis de compuestos de la fórmula I incluyen el método resumido en el esquema de reacción 1. A menos que se señale de otra forma Ar y R en el esquema de reacción 1 son como se definieron anteriormente para la fórmula I .
Esquema de reacción 1 Los compuestos de la fórmula I se pueden preparar a partir de los compuestos de la fórmula II en donde X representa un sustituyente OS02CF3 o halógeno por la reacción con un compuesto organometálico apropiado de la fórmula III en la presencia de un solvente y catalizador organometálico adecuado. Los compuestos adecuados de la fórmula III incluyen ácidos borónicos, en los cuales M representa B(0H)2í esteres de ácido borónico, en los cuales M representa B(OY)2, donde Y representa un grupo alquilo o arilo acíclico o cíclico adecuado, y compuestos de organoestaño , en los cuales M representa un grupo trialquilestanilo adecuado, por ejemplo trimetilestanilo o tri -n-butilestanilo . Los catalizadores organometálicos adecuados incluyen complejos de paladio (0) , por ejemplo tetraquis (trifenilfosfina) paladio (0) o una combinación de tris (dibencilidenacetona) dipaladio (0) y un ligando de triarilarsina o triarilfosfina adecuado, por ejemplo trifenilfosfina, tri (o-tolil ) fosfina o trifenilarsina . Los solventes adecuados incluyen solventes de éter inertes, por ejemplo 1 , 2 -dimetoxietano, tetrahidrofurano , o 1,4-dioxano, o alcoholes, tal como etanol, o mezclas de los mismos. Si el compuesto de la fórmula III es un ácido borónico, se prefiere la presencia de una base adecuada además de los otros reactivos. Las bases adecuadas incluyen carbonato de sodio, carbonato de cesio, e hidróxido de bario. La reacción se realiza a una temperatura de 0-120°C, y preferiblemente a una temperatura de 60-120°C. Ciertos compuestos de la fórmula II en donde X representa halógeno se pueden preparar a partir de los compuestos de la fórmula II en donde X representa hidrógeno por la reacción con un agente de halogenación adecuado en un solvente adecuado . Los agentes de halogenación adecuados incluyen bromo. Los solventes adecuados incluyen ácido acético. La reacción preferiblemente se realiza a una temperatura de 0-50°C, y más preferiblemente a una temperatura de 0-25°C. Los compuestos de la fórmula II se pueden preparar por los métodos descritos en la solicitud WO99/03859. Los compuestos de la fórmula II en donde X representa OS02CF3 se pueden preparar a partir de los compuestos de la fórmula II en donde X representa OH por la reacción con anhídrido trifluorometansulfónico u otro agente de trifluorometansulfonilación en la presencia de una base y un solvente adecuado. Las bases adecuadas incluyen piridina, y 2 , 6-di-t-butilpiridina . La reacción preferiblemente se realiza a una temperatura de -78 a 120°C, y más preferiblemente a una temperatura de -78 a 0°C. Los compuestos de la fórmula III son comercialmente disponibles, se describen en la literatura de química orgánica sintética, o se pueden preparar por métodos conocidos por un experto en la técnica de química orgánica sintética. Por ejemplo, los compuestos de la fórmula III en la cual M representa B(OH)2 se pueden preparar a partir de compuestos aromáticos adecuados que tienen grupos hidrógeno o halógeno, vía la conversión a los compuestos aril-litio o arilmagnesio correspondientes seguido por la reacción con trialquilborato e hidrólisis subsiguiente del éster de borato resultante. De manera similar, los compuestos aromáticos adecuados que tienen grupos hidrógeno o halógeno se pueden convertir a compuestos de la fórmula III en la cual M representa un grupo trialquilestanilo vía la conversión a los compuestos aril -litio o arilmagnesio correspondientes seguido por la reacción con un haluro de trialquilestanilo apropiado. La formación del compuesto aril-litio o arilmagnesio se realiza en un solvente inerte adecuado, por ejemplo, tetrahidrofurano. Alternativamente, los compuestos aromáticos adecuados que tienen halógeno o OS02CF3 se pueden convertir a compuestos de la fórmula III en la cual M representa B(0H)2 vía la reacción con bis (pinacolato) diboro y un catalizador organometálico, seguido por hidrólisis del éster de borato resultante, o a compuestos de la fórmula III en la cual NI representa un grupo trialquilestanilo vía la reacción con el bis (trialquilestaño) apropiado en la presencia de un catalizador organometálico adecuado. La reacción se realiza en un solvente inerte adecuado, por ejemplo tetrahidrofurano, y el catalizador organometálico adecuado incluye, por ejemplo tetraquis (trifenilfosfina) . La reacción se realiza a una temperatura de aproximadamente 0°C a aproximadamente 150°C, de forma preferible aproximadamente 20°C a aproximadamente 100°C. Para los procedimientos típicos que efectúan tales conversiones, véase, por ejemplo, Organic Syntheses, 1963, Coll. Vol. 4, 68; J. Org. Chem. 1995, 60, 7508. Una síntesis alternativa de los compuestos de la fórmula I se resume en el esquema de reacción 2. A menos que se señale de otra forma Ar, R, M y X en el esquema de reacción 2 son como se definieron anteriormente para el esquema de reacción 1, y Ar y R son como se definen en la fórmula I . Las condiciones para efectuar la preparación descrita en el esquema de reacción 2 podrán ser similares a aquellas bajo las cuales las preparaciones descritas en el esquema de reacción 1 se podrán realizar con los grupos M y X correspondientes .
IV
Esquema de reacción 2 Los compuestos de la fórmula IV en la cual M representa B(OH)2 se pueden preparar a partir de compuestos de la fórmula II en la cual X es halógeno, vía la conversión a los compuestos aril-litio o arilmagnesio correspondientes seguido por la reacción con un trialquilborato e hidrólisis subsiguiente del éster de borato resultante. De manera similar, los compuestos de la fórmula IV en la cual M representa SnR33 y R3 representa un grupo alquilo de Ci-C6 se pueden preparar a partir de los compuestos de la fórmula II en la cual X es halógeno, vía la conversión a los compuestos aril-litio o arilmagnesio correspondientes seguido por la reacción con un haluro de trialquilestanilo apropiado. La formación del compuesto aril -litio o arilmagnesio se realiza en un solvente inerte adecuado, por ejemplo, tetrahidrofurano, y alternativamente los compuestos de la fórmula IV en la cual M representa B(OH)2 se pueden preparar a partir de compuestos de la fórmula II en la cual X representa halógeno o OS02CF3 vía la reacción con bis (pinacolato) diboro y un catalizador organometálico, seguido por hidrólisis del éster de borato resultante, y los compuestos de la fórmula IV en la cual M representa SnR33 y R3 representa un grupo alquilo de Ci_e se pueden preparar a partir de compuestos de la fórmula II en la cual X representa halógeno o 0S02CF3 vía la reacción con bis ( trialquilestaño) R33SnSnR33 apropiado en la presencia de un catalizador organometálico adecuado. La reacción se realiza en un solvente inerte adecuado, por ejemplo tetrahidrofurano, y el catalizador organometálico adecuado incluye, por ejemplo tetraquis (trifenilfosfina) . La reacción se realiza a una temperatura de aproximadamente 0°C a aproximadamente 150°C, preferiblemente de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 100 °C. Para los procedimientos típicos que efectúan tales conversiones, véase, por ejemplo, Organic Syntheses, 1963, Coll. Vol. 4, 68; J. Org. Chem. 1995, 60, 7508. Por lo tanto, un aspecto adicional de la invención se refiere a intermediarios. Tales intermediarios son útiles en la síntesis de compuestos de la fórmula I, y otros compuestos que enlazan receptores de acetilcolina nicotínicos. Los intermediarios particularmente útiles son compuestos de la fórmula IV posterior:
IV en donde : M representa B(OH)2, B(OR3)2 o SnR33; R es un sustituyente seleccionado de hidrógeno, alquilo de C1-4, alquilo halogenado de Ci-4, alquilo oxigenado de Ci-4, o halógeno ; R3 representa un grupo alquilo de C -6 . Los compuestos particulares que son intermediarios útiles incluyen: (2'R) -5' -trimetilestanil-espiro [1-azabiciclo [2.2.2] octano-3,2' (3?) -furo[2,3-b]piridina] . Se apreciará por un experto en la técnica que ciertos sustituyentes aromáticos opcionales en los compuestos de la invención se pueden introducir empleando reacciones de sustitución aromática, o transformaciones de grupo funcional para modificar un sustituyente existente, o una combinación de las mismas. Tales reacciones se pueden efectuar ya sea previo o inmediatamente después de los procesos mencionados anteriormente, y se incluyen como parte del aspecto de proceso de la invención. Los reactivos y condiciones de reacción para tales procedimientos son conocidos en la técnica. Los ejemplos específicos de procedimientos los cuales se pueden emplear incluyen, pero no se limitan a, funcionalización electrofílica de un anillo aromático, por ejemplo vía nitración, halogenación o acilación; transformación de un grupo nitro a un grupo amino, por ejemplo vía reducción, tal como por hidrogenación catalítica; acilación, alquilación, sulfonilacion de un grupo amino o hidroxilo; reemplazo de un grupo amino por otro grupo funcional vía conversión a una sal de diazonio intermedia seguido por sustitución nucleofílica o radical libre de la sal de diazonio; o reemplazo de un halógeno por otro grupo funcional, por ejemplo vía reacciones de sustitución nucleofílica u organometálicamente catalizada. Donde sea necesario, hidroxi, amino u otros grupos reactivos se pueden proteger usando un grupo protector como se describe en el texto estándar "Protecting groups in Organic Synthesis", 3a edición (1999) de Greene and uts. Las reacciones descritas anteriormente, a menos que se señale de otra forma, usualmente se conducen a una presión de aproximadamente una (1.03328 kg/cm2) a aproximadamente tres atmósferas (3.09984 kg/cm2), preferiblemente a presión ambiente (aproximadamente una atmósfera (1.03328 kg/cm2)). A menos que se establezca de otra forma, las reacciones descritas anteriormente se conducen bajo una atmósfera inerte, preferiblemente bajo una atmósfera de nitrógeno . Los compuestos de la invención e intermediarios se pueden aislar de sus mezclas de reacción por técnicas estándar. Las sales de adición de ácido de los compuestos de la fórmula I las cuales se pueden mencionar incluyen sales de ácidos minerales, por ejemplo las sales de clorhidrato y bromhidrato ; y las sales formadas con ácidos orgánicos tales como sales de formiato, acetato, maleato, benzoato, tartrato, y fumarato. Las sales de adición de ácido de los compuestos de la fórmula I se pueden formar haciendo reaccionar la base libre o una sal, enantiómero o derivado protegido del mismo, con uno o más equivalentes del ácido apropiado. La reacción se puede realizar en un solvente o medio en el cual la sal es insoluble o en un solvente en el cual la sal es soluble, por ejemplo, agua, dioxano, etanol, tetrahidrofurano o éter dietílico, o una mezcla de solventes, que se puede remover en vacío o por secado por congelamiento. La reacción puede ser un proceso metatético o se puede realizar en una resina de intercambio de iones . Los compuestos de la fórmula I existen en formas tautoméricas o enantioméricas , todas las cuales se incluyen dentro del alcance de la invención. Los diversos isómeros ópticos se pueden aislar por separación de una mezcla racémica de los compuestos usando técnicas convencionales, por ejemplo cristalización fraccional, o CLAR quiral . Alternativamente, los enantiómeros individuales se pueden hacer por reacción de materiales de partida ópticamente activos apropiados bajo condiciones de reacción las cuales no originarán racemización. Farmacología La actividad farmacológica de los compuestos de la invención se puede medir usando las pruebas descritas posteriormente: Prueba A - Ensayo de afinidad a subtipo ct7 nAChR Enlace de [125I] -a-Bungarotoxina (BTX) a membranas del hipocampo de rata. Los hipocampos de rata se homogenizaron en 20 volúmenes de amortiguador de homogenización frío (AH: concentraciones de constituyentes (mM) : tris (hidroximetil) aminometano 50; MgCl2 1; NaCl 120; KCl 5: pH 7.4) . El homogenado se centrifugó por 5 minutos a lOOOg, el sobrenadante se conservó y la pelotilla se re-extrajo. Los sobrenadantes combinados se centrifugaron por 20 minutos a 12000 g, se lavaron, y resuspendieron en AH. Las membranas (30-80 µg) se incubaron con 5nM de [125I] a-???, 1 mg/ml de ASB (albúmina de suero bovino) , fármaco de prueba, y ya sea CaCl2 2 mM o EGTA [etilenglicol-bis ( ß-aminoetiléter) ] 0.5 mM por 2 horas a 21°C, y luego se filtraron y lavaron 4 veces sobre filtros de fibra de vidrio Whatman (espesor C) usando una recolector de células Brandel. El pretratamiento de los filtros por 3 horas con 1% BSA/0.01% PEI (pol ietilenimina) en agua fue crítico para blancos de filtro bajos (0.07% de conteos totales por minuto) . El enlace no específico se describió por (-) -nicotina 100 µ?, y el enlace específico fue típicamente 75%. Prueba B - Ensayo de afinidad al subtipo ot4 nAChR Enlace de [3H] - (-) -nicotina. Usando un procedimiento modificado de Martino-Barro s y Kellar (Mol Pharm (1987) 31:169-174), se homogenizó cerebro de rata (corteza e hipocampo) como en el ensayo de enlace de [125I]a-BTX, se centrifugó por 20 minutos a 12,000 x g, se lavó dos veces, y luego se resuspendió en AH que contiene fluorofosfato de diisopropilo 100 µ?. Después de 20 minutos a 4°C, las membranas (aproximadamente 0.5 mg) se incubaron con [3H] -(-) -nicotina 3 nM, fármaco de prueba, atropina 1 µ?, y ya sea CaCl2 2 mM o EGTA 0.5 mM por 1 h a 4°C, y luego se filtraron sobre filtros de fibra de vidrio Whatman (espesor C) (pretratados por 1 h con 0.5% de PEI) usando un recolector de células Brandel. El enlace no específico se describió por carbacol 100 µ?, y el enlace específico fue típicamente 84%. Análisis de datos de enlace para Pruebas A y B Los valores IC50 y coeficientes pseudo Hill (nH) se calcularon usando el programa de ajuste de curva no lineal ALLFIT (DeLean A, Munson P J and Rodbard D (1977) Am. J.
Physiol . , 235 :E97-E102) . Las curvas de saturación se fijaron a un modelo de un sitio, usando el programa de regresión no lineal ENZFITTER (Leatherbarrow, R. J. (1987) ) , produciendo valores KD de 1.67 y 1.70 nM para los ligandos [125I] -a-BTX y [3H] -(-) -nicotina respectivamente. Los valores Ki se estimaron usando la ecuación general de Cheng-Prusoff : Ki- [ICS0] / ( (2+ ( [ligando] / [KD] n) l/n-1) donde un valor de n=l se utilizó cada vez que nH<i.5 y un valor de n=2 se utilizó cuando nH 1.5. Las muestras se sometieron a ensayo por triplicado y típicamente fueron + 5%. Los valores Ki se determinaron usando 6 o más concentraciones de fármaco. Los compuestos de la invención son compuestos con afinidades de enlace (Ki) de menos de 1000 nM ya sea en la Prueba A o Prueba B, indicando que se espera que tengan actividad terapéutica útil. Los compuestos de la invención tienen la ventaja que los mismos pueden ser menos tóxicos, ser más eficaces, ser de acción más prolongada, tener un intervalo más amplio de actividad, ser más potentes, producir pocos efectos laterales, y son más fácilmente absorbidos o tienen otras propiedades farmacológicas útiles. Ejemplos Los reactivos comerciales se utilizaron sin purificación adicional. Se utilizó n-butil-litio como una solución en hexano. Los espectros de masa se registraron usando un sistema CLAR-EM que emplea un CLAR HP-1100 y un Espectrómetro de Masa Micromass LCZ que usa APCI como la técnica de ionización, un sistema CLAR-EM que emplea un CLAR HP-1100 y un detector selectivo de masa serie HP-1100 que usa APCI como la técnica de ionización, o un sistema CG-EM que emplea un cromatógrafo de gas HP-6890 y un detector selectivo de masa HP-5973 que emplea ionización de impacto de electrones, y se reportaron como m/z para el ion molecular de origen. La temperatura ambiente se refiere a 20-25°C. 5'-bromoespiro [1-azabiciclo [2.2.2] octano-3 , 2 ' (3 ' H) -furo [2,3-b]piridina] y otros precursores se prepararon como se describe en la solicitud de patente internacional WO 99/03859. Las formas radioetiquetadas de los compuestos de los ejemplos son útiles en una selección para el descubrimiento de nuevos compuestos medicinales los cuales enlazan y modulan la actividad, vía agonismo, agonismo parcial, o antagonismo, del receptor de acetilcolina nicotínico «7. Tales compuestos radioetiquetados se sintetizan ya sea incorporando materiales de partida radioetiquetados o, en el caso de tritio, intercambio de hidrógeno para tritio por métodos conocidos. Los métodos conocidos incluyen (1) halogenación electrofílica, seguido por reducción del halógeno en la presencia de una fuente de tritio, por ejemplo, por hidrogenación con gas tritio en la presencia de un catalizador de paladio, o (2) intercambio de hidrógeno por tritio realizado en la presencia de gas tritio y un catalizador organometálico adecuado (por ejemplo, paladio) . Ejemplo 1 (2 ' R) -5 ' - (tiofen-2-il) espiro [1-azabiciclo [2.2.2] octano-3,2' (3 ' H) - furo [2 , 3 -b] piridina]
Se colocaron (2 ' R) -5' -bromoespiro [1-azabiciclo- [2.2.2] octano-3, 2 ' (3 ?) -furo [2, 3 -b] piridina] (162 mg, 0.55 mmol) , ácido 2 -tiofenborónico (0.39 g, 0.84 mmol) , tetraquis (trifenilfosfina)paladio (0) (42 mg, 0.036 mmol), y carbonato de sodio (0.38 g, 3.6 mmol) en un tubo bajo nitrógeno. Se adicionaron agua (1 mi) , etanol (1 mi) y tetrahidrofurano (4 mi) . La mezcla luego se calentó a 70°C y se agitó bajo nitrógeno por 24 h. La mezcla luego se evaporó bajo vacío y el residuo de la evaporación se dividió entre hidróxido de sodio acuoso, diluido y cloroformo, las capas se separaron, y la capa acuosa se extrajo adicionalmente con cloroformo. El extracto de cloroformo se secó (sulfato de magnesio), se filtró y se evaporó. El residuo se purificó por CLAR de fase inversa en una columna C18 Waters Novapak-HR usando un gradiente de 0-70% acetonitrilo/agua (cada solvente contiene 0.1% de ácido trifluoroacético como un amortiguador) como el eluyente . Las fracciones que contienen producto se evaporaron, luego el residuo se disolvió en metanol . Se adicionó ácido clorhídrico concentrado en exceso, y la solución se evaporó para producir la sal de diclorhidrato del compuesto del título (117 mg) como un sólido incoloro; m/z 299 (100%, MH+) . Ejemplo 2 (2'R) -5' - (tiofen-3-il) espiro [l-azabiciclo [2.2.2] octano-3,2' 13?) -furo [2,3 -b] piridina]
Se preparó por un método análogo a aquel descrito para la preparación del ejemplo 1 a partir de (2 ' R) -5 ' -bromo-espiro [l-azabiciclo [2.2.2] octano-3 , 2 ' (3 ?) -furo [2,3-b] iridina] y ácido 3-tiofenborónico. La sal de clorhidrato del compuesto del título fue como un sólido incoloro; m/z 299 (100%, MH+) . Ejemplo 3 (2'R) -5' - (benzo [b] tiofen-2-il) espiro [1-azabiciclo [2.2.2] octano-3 , 2 ' (3 ' H) -furo [2 , 3 -b] piridina]
Se preparó por un método análogo a aquel descrito para la preparación del ejemplo 1 a partir de (2 ' R) -5 ' -bromo-espiro [1-azabiciclo [2.2.2] octano-3 , 2 ' (3 ?) -furo [2,3-blpiridina] y ácido benzo [b] tiofen-2 -borónico . El compuesto se purificó por cromatografía instantánea usando un gradiente de metanol amoniacal en cloroformo y se obtuvo como un sólido pálido; m/z 349 (100%, MH+) . Ejemplo 4 (2 'R) -5 ' - (benzo [b] tiofen-3 -il ) espiro [1-azabiciclo [2.2.2]-octano-3,2/ (3?) -furo [2 , 3-b] piridina]
Se preparó por un método análogo a aquel descrito para la preparación del ejemplo 1 a partir de (2 ' R) -5 ' -bromo-espiro [1-azabiciclo [2.2.2] octano-3 , 2' (3 ?) -furo [2,3-b] piridina] y ácido benzo [b] tiofen-3 -borónico . El compuesto se purificó por cromatografía instantánea usando un gradiente de metanol amoniacal en cloroformo y se obtuvo como un sólido pálido; m/z 349 (100%, MH+) . Ejemplo 5 (2 'R) -5' - ( 5 -metiltiofen-2 -il) espiro [1-azabiciclo [2.2.2]-octano-3 , 2 ' (3 ?) -furo [2 , 3-b] piridina]
Se preparó por un método análogo a aquel descrito para la preparación del ejemplo 1 a partir de (2'R) -5' -bromo-espiro [1-azabiciclo [2.2.2] octano-3 , 2 ' (3 ?) -furo [2 , 3-b] piridina] y ácido 5-metiltiofen-2-borónico. El compuesto se purificó por cromatografía instantánea usando un gradiente de metanol amoniacal en cloroformo y se obtuvo como un sólido pálido; m/z 313 (100%, MH+) . Ejemplo 6 (2 'R) -5' - (4-metiltiofen-2-il) espiro [1-azabiciclo [2.2.2]-octano-3,2, (3?) -furo [2 , 3 -b] iridina]
Se preparó por un método análogo a aquel descrito para la preparación del ejemplo 1 a partir de (2 'R) -5' -bromo-espiro [1-azabiciclo [2.2.2] octano-3 , 2' (3 ?) -furo [2,3-b] piridina] y ácido 4-metil-tiofen-2-borónico. El compuesto del título se obtuvo como un sólido incoloro; m/z 313 (MH+) . Ej emplo 7 (2'R) -5' - (5-clorotiofen-2-il)espiro[l-azabiciclo[2.2.2] -octano-3, 2' (3?) -furo [2 , 3 -b] piridina]
Se preparó por un método análogo a aquel descrito para la preparación del ejemplo 1 a partir de (2 ' R) -5 ' -bromo-espiro[l-azabiciclo[2.2.2]octano-3,2' (3 ?) -furo [2 , 3 -b] piridina] y ácido 5-cloro-tiofen-2 -borónico . La sal de diclorhidrato del compuesto del título se aisló como un sólido incoloro; m/z 333 (MH+) . Ej emplo 8 (2 ' R) -5 ' - ( 5 -clorotiofen-3-il) espiro [1-azabiciclo [2.2.2]-octano-3,2, (3?) -furo [2 , 3 -b] piridina]
(a) (2 ' R) -5 ' -trimetilestanilespiro [1-azabiciclo [2.2.2]-octano-3,2' (3?) -furo [2 , 3 -b] piridina] (2'R) -5' -bromoespiro [1-azabiciclo [2.2.2] octano-3,2' (3?) -furo [2 , 3-b] piridina (690 mg, 2.34 mmol) , hexametildiestaño (1.225 g, 0.27 mmol) y tetraquis (trifenilfosfina) paladio (0) (266 mg, 0.027 mmol) se mezclaron con 10 mi de tolueno y se sellaron bajo nitrógeno. La mezcla se agitó y se calentó a 120°C bajo nitrógeno por 4h. La mezcla se dejó enfriar, luego se filtró a través de tierra diatomácea. El filtrado se diluyó con cloroformo, se lavó con bicarbonato de sodio saturado, se secó a través de MgS04, se filtró, y luego el solvente se evaporó. El compuesto se purificó por cromatografía instantánea usando un gradiente de metanol amoniacal en cloroformo para producir el compuesto del subtítulo como un sólido pálido; m/z 377 379 381 (M+) .
(b) 4 -bromo-2 -clorotiofeno Se agitó 3,5-dibromotiofeno (1.74 g, 7.19 mmol) en éter anhidro (15 mi) a -78°C bajo nitrógeno. Se adicionó n-butil-litio (1.6 M, 4.95 mi, 7.91 mmol), y la agitación se continuó a -78°C por 15 minutos. Luego, se adicionó hexacloroetano (1.87 g, 7.91 mmol), y la agitación se continuó por otros 30 minutos. La mezcla de reacción se apagó con cloruro de amonio saturado, se diluyó con éter, se lavó con agua y salmuera, luego se secó a través de MgS0 y se filtró. Luego el solvente se evaporó para producir un aceite café el cual se purificó por cromatografía instantánea usando un gradiente de metanol amoniacal en cloroformo como el eluyente para producir el compuesto del subtítulo como un aceite amarillo claro (1.07 g) ; m/z 196 198 (M+) . (c) (2'R) -5' - (5-clorotiofen-3-il) espiro [1-azabiciclo [2.2.2] -octano- 3 , 2 ' (3 ?) - furo [2.3-b] piridina] Se disolvieron (2'R) -5 ' -trimetilestanilespiro [1-azabiciclo[2.2.2] -octano-3,2' (3 ?) -furo [2 , 3-b] iridina] (140 mg, 0.37 mmol), 3 -bromo-5-cloro-tiofeno (88 mg, 0.44 mmol) y tetraquis (trifenilfosfina) paladio (0) (43 mg, 0.037 mmol) en tolueno (2 mi) y se sellaron bajo nitrógeno. La mezcla se agitó y se calentó a 120°C bajo nitrógeno durante la noche. La mezcla se dejó enfriar, luego se filtró a través de tierra diatomácea. El filtrado se diluyó con cloroformo, se lavó con bicarbonato de sodio saturado, se secó a través de MgS04, se filtró, y luego el solvente se evaporó. El compuesto se purificó por cromatografía instantánea seguido por CLAR de fase inversa en una columna Ci8 Waters Novapak-HR usando un gradiente de 0-65% acetonitrilo/agua (cada solvente contiene 0.1% de ácido trifluoroacético como un amortiguador) como el eluyente. Las colecciones que contienen producto se evaporaron. El residuo se disolvió en metanol, luego se adicionó ácido clorhídrico 1N en exceso, y el solvente se evaporó para producir la sal de diclorhidrato del compuesto del título (35 mg) como un sólido incoloro; m/z 333 335 (MH+) . Ejemplo 9 (2 ' R) - 5- (espiro [1-azabiciclo [2.2.2] octano- 3 , 2 ' (3?) - furo [2,3-b] piridin-5 ' - il } tiofen-2 -carbonitrilo
(a) 5-bromotiofen-2 -carbonitrilo Se disolvió 2 -bromotiofen-5-carboxaldehído (5.00 g,
26.2 mmol) en 150 mi de metanol/diclorometano (1:4 en volumen) . Se adicionaron consecutivamente piridina (4.25 mi, 52.4 mmol) y clorhidrato de hidroxilamina (1.82 g, 26.2 mmol) . La mezcla se agitó a temperatura ambiente, y luego, después de 2h, el solvente se evaporó de la mezcla de reacción. El residuo se disolvió en diclorometano (180 mi) y se adicionó piridina (4.25 mi, 52.4 mmol) . La mezcla se enfrió a 0°C, luego se adicionó dicloruro 31
filtró, y luego el solvente se evaporó. El compuesto se purificó por cromatografía instantánea seguido por CLAR de fase inversa en una columna Ci8 aters Novapak-HR usando un gradiente de 0-65% acetonitrilo/agua (cada solvente contiene 0.1% de ácido trifluoroacético como un amortiguador) como el eluyente . Las colecciones que contienen producto se evaporaron. El residuo se disolvió en metanol, luego se adicionó ácido clorhídrico 1N en exceso, y el solvente se evaporó para producir la sal de diclorhidrato del compuesto del título (35 mg) como un sólido incoloro; m/z 333 335 (MH+) . Ejemplo 9 (2 'R) - 5- {espiro [1-azabiciclo [2.2.2] octano-3 , 2 ' (3?) - furo [2,3-b] piridin-5 ' -il } tiofen-2 -carbonitrilo
(a) 5-bromotiofen-2 -carbonitrilo Se disolvió 2-bromotiofen-5-carboxaldehído (5.00 g, 26.2 mmol) en 150 mi de metanol /dielorómetaño (1:4 en volumen) . Se adicionaron consecutivamente piridina (4.25 mi, 52.4 mmol) y clorhidrato de hidroxilamina (1.82 g, 26.2 mmol) . La mezcla se agitó a temperatura ambiente, y luego, después de 2h, el solvente se evaporó de la mezcla de reacción. El residuo se disolvió en diclorometano (180 mi) y se adicionó piridina (4.25 mi, 52.4 mmol) . La mezcla se enfrió a 0°C, luego se adicionó dicloruro 32
fenilfosfónico (10.20 g, 52.4 mmol) . Después, la reacción se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó durante la noche. La mezcla de reacción se lavó con bicarbonato de sodio saturado, agua, y salmuera. La capa orgánica se secó a través de MgS04, y luego el solvente se evaporó. El compuesto se purificó por cromatografía instantánea usando un gradiente de metanol amoniacal en cloroformo para producir el compuesto del título (5.15 g) como un sólido pálido. (b) 5-tri-n-butilestanil-tiofen-2-carbonitrilo Se adicionó n-butil-litio (1.6 M, 640 µ? , 1.60 mmol) a una solución de 5-bromotiofen-2-carbonitrilo (200 mg, 1.06 mmol) en éter anhidro (10 mi) el cual se agitó a -78°C bajo nitrógeno. Después de 5 minutos, se adicionó cloruro de tri-n-butilestanilo (346 mg, 1.60 mmol), luego la solución se dejó calentar a temperatura ambiente, y se agitó por 1 hora. La mezcla se apagó, y se lavó con Mdróxido de sodio 1N, se secó a través de MgS04, y luego el solvente se evaporó para producir un residuo aceitoso café. La purificación por cromatografía instantánea usando un gradiente de metanol amoniacal en cloroformo produjo el compuesto del subtítulo como un aceite amarillo (296 mg) . (c) (2'R) -5-{espiro[l-azabiciclo[2.2.2]octano-3,2' (3?) -furo [2 , 3-b] iridin-5 ' -il }tiofen-2-carbonitrilo Método A Se mezclaron (2 ' R) -5 ' -bromoespiro [1-azabiciclo [2.2.2] octano-3, 2' (3?) -furo [2 , 3-b] piridina] (115 33
mg, 0.39 mmol) , 5-tri-n-butilestanil-tiofen-2-carbonitrilo (180 mg, 0.45 mmol) y tetraquis (trifenilfosfina) aladio (0) (46 mg, 0.04 mmol) con 2 mi de tolueno bajo nitrógeno, luego el tubo se selló y la mezcla se calentó a 120°C por 6 h. La mezcla luego se dejó enfriar, y se filtró a través de celita. El filtrado se diluyó con cloroformo, se lavó con bicarbonato de sodio saturado, se secó a través de MgS04, y luego el solvente se evaporó. La purificación por cromatografía instantánea usando un gradiente de metanol amoniacal en cloroformo produjo el compuesto del título como un sólido pálido (98 mg) ; m/z 324 ( H+) . Método B Se preparó por un método análogo a aquel descrito para la preparación del ejemplo 8 a partir de (2'R)-5'-trimetilestanilespiro [1-azabiciclo [2.2.2] octano-3 , 2 ' (3 ?) -furo [2 , 3 -b] piridina] y 5-bromotiofen-2 -carbonitrilo . Ejemplo 10 (2 f R) -4- (espiro [1-azabiciclo [2.2.2] octano-3, 2 ' (3?) - furo [2,3-b] piridin-5' -il } tiofen-2 -carbonitrilo
¦ (a) 4-bromotiofen-2 -carbonitrilo Se preparó por un método análogo a aquel descrito anteriormente para la preparación de 5-bromotiofen-2 - 34
carbonitrilo a partir de 4-bromotiofen-2-carboxaldehído y se obtuvo como un sólido amarillo pálido. (b) (2 'R) -4- {espiro [1-azabiciclo [2.2.2] octano- 3 , 2 ' (3?) -furo [2 , 3-b] iridin-5' - il } tiofen-2 -carbonitrilo Se preparó por un método análogo a aquel descrito para la preparación del ejemplo 8 a partir de (2'R)-5'-trimetilestanilespiro [1-azabiciclo [2.2.2] octano- 3 , 2 ' (3 ?) -furo [2 , 3-b] iridina] y 4-bromotiofen-2-carbonitrilo. El compuesto del título se aisló como la sal de diclorhidrato la cual fue un sólido incoloro; m/z 324 (MH+) . Ejemplo 11 (2 ' R) -5 ' - (5-metiltiofen-3-il) espiro [1-azabiciclo [2.2.2] -octano- 3, 2 ' (3?) - furo [2 , 3-b] piridina
(a) 2-metil-4-bromotiofeno Se disolvió 2-bromo-5-metiltiofeno (1.20 g, 6.78 mmol) en 10 mi de THF anhidro, y se enfrió a -78°C bajo nitrógeno. Se adicionó diisopril amina de litio (2M, 4.0 mi, 8.13 mmol), y se agitó a -78°C por 30 minutos. Se adicionó metanol (3 mi) , luego la solución se dejó calentar a temperatura ambiente, y se agitó por 1 h. La mezcla se apagó, y se lavó con agua y salmuera, se secó a través de MgS04, y luego el solvente se evaporó para producir un residuo aceitoso café. La purificación por cromatografía instantánea 35
usando un gradiente de metanol amoniacal en cloroformo -produjo el compuesto del subtítulo como un aceite amarillo (1.16 g) .
(b) (2'R) -5' - (5-metiltiofen-3-il) espiro [1-azabiciclo [2.2.2]-octano-3f 2' (3?) -furo [2 , 3-b] piridina Se preparó por un método análogo a aquel descrito para la preparación del ejemplo 8 a partir de (2'R)-5'~ trimetilestanilespiro [1-azabiciclo [2.2.2] octano-3 , 2 ' (3 ?) -furo [2 , 3 -b] iridina] y 2-metil-4-bromotiofeno. El compuesto del título se obtuvo como un sólido incoloro; m/z 313 (MH+) . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la cita invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.