MXPA04003186A - Composiciones de meningococo coadyuvantes. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a una combinacion de oligonucleotidos de CpG y microparticulas de polimero que es un adyuvante extremadamente efectivo par antigenos de Neisserial. La invencion, por lo tanto proporciona una composicion que comprende (a) un antigeno de Neisserial; (b) un oligonucleotido de CpG; y (c) una microparticula de polimero biodegradable.

Description

COMPOSICIONES ADYUVADAS DE MENINGOCOCO CAMPO DE LA INVENCION La invención se refiere a vacunas, más particularmente a aquellas contra Neisseria meníngitidis .

ANTECEDENTES DE LA TECNICA Se han reportado las secuencias de genoma para serogrupos A [1] y B [2,3] de Neisseria meníngitidis (meningococo) . La secuencia del serogrupo B se ha estudiado para identificar los antígenos de vacuna [por ejemplo, referencias 4 a 9] , y antígenos candidatos se han manipulado para mejorar la expresión heteróloga [referencias 10 a 12] . Los antígenos generalmente requieren la co-administración de adyuvantes para aumentar su inmunogenicidad en vacunas [13] . Se ha usado el adyuvante de Freund para el serogrupo B de meningococo [9] , y la vacuna autorizada MenjugateMR contra el serogrupo C utiliza hidróxido de aluminio [14] . El mejoramiento de la actividad bactericida de antígenos de Neisseria también se ha reportado usando adyuvantes de oligonucleótido que contienen porciones de CpG [15] . Un objeto de la invención es proporcionar adyuvantes adicionales y mejorados para antígenos de Neisserial . Ref. 155294 DESCRIPCION DE LA INVENCION Se ha encontrado que una combinación de oligonucleótidos de CpG y micropartículas de polímero es un adyuvante extremadamente efectivo para antígenos de Neisserial, con la combinación que da mucho mejores resultados que cualquiera de los componentes individuales. Por lo tanto, la invención proporciona una composición que comprende: (a) un antígeno de Neisserial; (b) un oligonucleótido de CpG; y (c) una micropartícula de polímero biodegradable .

El Antígeno de Neisserial El antígeno de Neisserial puede ser un antígeno de proteína, ácido nucleico que codifica un antígeno de proteína, o un antígeno de sacárido. El antígeno preferiblemente produce una respuesta inmune protectora o bactericida (por ejemplo, respuesta de anticuerpos) en un mamífero receptor. El antígeno se puede derivar de cualquier especie de Neisseria incluyendo N. gonorrhoeae, N. lactamica y N.meningitidis . Preferiblemente es un antígeno de N.meningitidis y puede ser de cualquier serogrupo . Donde el antígeno es del serogrupo B, es preferido usar un antígeno de proteína; donde es del serogrupo A, C, W135 o Y entonces es preferido usar un antígeno de sacárido. Donde se usan antígenos de sacárido, estos típicamente serán derivados del polisacárido capsular bacteriano (por ejemplo, oligosacáridos , tales como aquellos obtenidos por hidrólisis) , y típicamente se conjugarán a proteínas portadoras (por ejemplo, a CRMi97) . Los antígenos de proteína preferidos derivados del serogrupo B de N. eningitidis son: • una proteína descrita en alguna de las referencias 4, 5, 6, 7, 8 ó 9 (en particular la 446 hasta las SEC ID (es decir, 2, 4, 6, 890, 892) descritas en la referencia 4, la 45 hasta las SEC ID (es decir, 2, 4, 6, 88, 90) descritas en la referencia 5 y la 1674 hasta las SEC ID 2-3020, hasta las SEC ID 3040-3114, y todas las SEC ID 3115-3241, descritas en la referencia 6) ; • una proteína que comprende un fragmento inmunogénico de una o más de las proteínas descritas en alguna de las referencias 4, 5, 6, 7, 8 Ó 9. • una proteína que comprende una secuencia que tiene identidad de secuencia (preferiblemente mayor que 50% por ejemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más) para una o más de las proteínas descritas en alguna de las referencias 4, 5, 6, 7, 8 ó 9. • una proteína descrita en alguna de las referencias 10, 11 ó 12. • una proteína que comprende una secuencia que tiene identidad de secuencia (preferiblemente mayor que 50% por ejemplo 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más) para una o más de las proteínas descritas en alguna de las referencias 10, 11 ó 12. Un antígeno de proteína particularmente preferido del serogrupo B de N.meningitidis es la proteína '287' . Esta proteína se puede usar en una forma tipo silvestre [por ejemplo, GenBank acceso gi: 7228690; los alineamientos de formas polimórficas de 287 se muestran en las figuras 5 y 15 de la referencia 8] pero los derivados de la proteína de tipo silvestre se pueden usar. Por ejemplo, las proteínas que tienen 50% o más identidad de secuencia (por ejemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, o más) para gi: 7228690 se pueden usar. Se pueden usar las proteínas que comprenden variantes de truncamiento o supresión de la proteína, tales como las formas truncadas N-terminal descritas en las referencias 10 a 12 G287' en particular, en la cual el N-termíno de la proteína hasta los seis residuos de glicina incluidos se suprimen) . Las proteínas de fusión que comprenden tales secuencias de 287 se pueden usar. Todas estas formas de 287, y más particularmente aquellas las cuales retienen la inmunogenicidad de las proteínas 287 tipo silvestre, caen dentro del significado de '287' como se usa en la presente. Otro antígeno de proteína particularmente preferido del serogrupo B de N.m iingitidis es la proteína 961', también conocida como 4NadA' [16] . Esta proteína se puede usar en una forma tipo silvestre [por ejemplo, GenBank acceso gi: 7227256; los alelos de 961 se describen en la referencia 17] pero los derivados de la proteína tipo silvestre se pueden usar. Por ejemplo, se pueden usar las proteínas que tienen 50% o más identidad de secuencia (por ejemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más) para gi:7227256. Las proteínas que comprenden variantes de truncamiento o supresión de la proteína se pueden usar, tales como aquellas descritas en las referencias 10 a 12 ('916c' en particular, las cuales carecen de anclaje de membrana C-terminal) . Las proteínas de fusión que comprenden tales secuencias de 961 se pueden usar. Todas estas formas de 961 y particularmente aquellas las cuales retienen la inmunogenicidad de las proteínas 961 tipo silvestre, caen dentro del significado de '961' o 'NadA' como se usa en la presente. Otros antígenos de proteína preferidos son proteína '741' y proteína ,ORF46.1', y proteínas 'ORFl' , '0RF4', xORF25', ¾ORF40', 'ORFSS', ,???1343', '230' , '233', '292', 4594', '687', ?736', 4907', ?919', '936', ¾953', y '983'. Otros antígenos de proteína preferidos son las proteínas híbridas descritas en las referencias 10 a 12, particularmente aquellas que comprenden una o más de: una proteína 287, una proteína 953, una proteína 936 y/o una proteína 741. Los antígenos de proteína se pueden derivar de. cualquier cepa de N.meningitidis. Se prefiere usar antígenos de las cepas 2996, C58, 95N477 y 394/98. Así como variantes de cepa, sustituciones de aminoácido moderadas, sencillas o múltiples se pueden hacer alterando la inmunogenicidad de los antígenos usados de acuerdo con la presente invención. Además o en lugar de los antígenos de proteína, el ácido nucleico que codifica un antígeno de proteína se puede incluir dentro de las composiciones de la invención. El ácido nucleico se expresará in vivo una vez administrado a un mamífero receptor y el antígeno de proteína se producirá. Tal inmunización de ácido nucleico es bien conocida [por ejemplo, referencias 18 a 23 etc.] . El ácido nucleico típicamente será un plásmido de ADN. Un antígeno de sacárido preferido derivado del serogrupo C de N.meningitidis también es el conjugado de oligosacárido usado en MenjugateMR [24, 25], el cual contiene 12 a 22 unidades de monosacárido del polisacárido capsular de serogrupo C. Un antígeno de sacárido preferido derivado del serogrupo A es un oligosacárido en el cual uno o más de los grupos hidroxilo en las unidades de monosacárido constituyente se han remplazado por un grupo de bloqueo [26] .

Los antígenos de olig &acárido adicionales de los serogrupos A, 135 y Y se dese||_jíen en la referencia 27. La composición de la invención puede comprender más de un antígeno de Neisserial. Donde se incluyen sacáridos de ambos serogrupos A y C de N.meningitidis, es preferido que la relación (p/p) de sacárido MeriA: sacárido MenC sea mayor que (por ejemplo, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 o mayor) . La composición de la invención preferiblemente es una composición inmunogénica o vacuna. Tales composiciones comprenden una cantidad inmunológicamente efectiva del antígeno. Por 'cantidad inmunológicamente efectiva', se entiende que la administración a un individuo de una composición de la invención que comprende esta cantidad de antígeno (ya sea en una dosis única o como parte de una serie) es efectiva para que se presente una respuesta inmune terapéutica o profiláctica. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y condición física del individuo a ser tratado, edad, el grupo taxonómico del individuo a ser tratado (por ejemplo, primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmune del individuo a anticuerpos sintetizados, el grado de protección deseada, la formulación de la vacuna, la valoración del médico tratante de la situación médica, y otros factores relevantes. La cantidad puede caer en un intervalo relativamente amplio que se puede determinar a través de los ensayos de rutina. Los antígenos típicamente estarán presentes a una concentración de al menos 1 ug/ml cada uno . El tratamiento de dosificación puede ser un programa de una dosis única o una dosis múltiple (por ejemplo, incluyendo dosis estimulantes) .

El oligonucleótido de CpG Los oligonucleótidos de CpG son conocidos para el uso como adyuvantes de vacuna [por ejemplo, referencia 28] e inducen las respuestas inmunes Thl , fuertes. Son útiles como adyuvantes parenterales y mucosales [29] . El oligonucleótido de CpG usado de acuerdo con la presente invención es un ácido nucleico el cual incluye al menos un dinucleótido de CG, es decir, un nucleótido de citosina seguido por un nucleótido de guanosina. El oligonucleótido puede contener dinucleotidos de CG múltiples. Una secuencia de CG en el oligonucleótido se puede flanquear por dos purinas en el lado 5' y dos pirimidinas en el lado 3', es decir RRCGYY. Los nucleótidos de citosina en el oligonucleótido de CpG pueden ser metilados, pero se prefiere que los mismos deban ser no metilados. Los nucleótidos de citosina y guanosina preferiblemente son desoxinucleótidos y el ácido nucleico es preferiblemente ADN. Para mejorar la resistencia a nucleasa, el oligonucleótido puede comprender una estructura modificada, tal como una éfetructura de fosforotíoato . Como una alternativa a usar ADM, es posible usar APN (ácido péptido nucleico). Además, los oligonucleótídos pueden comprender sustituciones de las porciones de azúcar y las porciones a base de nitrogenados. El oligonucleótido preferiblemente comprende entre aproximadamente 6 y aproximadamente 100 nucleótidos, más preferiblemente entre aproximadamente 8 y aproximadamente 50 nucleótidos, muy preferiblemente entre aproximadamente 10 y aproximadamente 40 nucleótidos. Los oligonucleótídos que comprenden al menos un dinucleótido de CG se pueden preparar convenientemente usando síntesis de oligonucleótido convencional. Los ejemplos de adyuvantes de oligonucleótido de CpG se encuentran en las referencias 30 a 55.

La micropartícula de polímero biodegradable Las micropartículas de polímero biodegradable se conocen para el uso como adyuvantes de vacuna [por ejemplo, referencia 56] . Son útiles como adyuvantes parenterales y mucosales . Así como también es biodegradable, el polímero usado para hacer las micropartículas generalmente será esterilizable y no tóxico (biocompatible) . Los polímeros biodegradables adecuados son fácilmente comercialmente disponibles e incluyen aquellos derivados de ácido polihidroxibutírico; policaprolactona; poliortoéste polianhidruro; poli (hidroxibutirato) ; y un poli (a-hidroxi ácido) . Los polímeros preferidos se forman de uno o más poli (a-hidroxi ácido) por ejemplo poli (L-lactida) , poli(D,L-lactida) , copolímeros de D, L-lactida y glicólido (tal como poli (D, L-lactida-co-glicólido) , o un copolímero de D,L-lactida y caprolactona . Son preferidas las micropartículas formadas de poli (D, L-lactida-co-glicólido) (XPLG'). Estos polímeros están disponibles en una variedad de pesos moleculares, y el peso molecular apropiado para un antígeno dado se puede determinar fácilmente. Para un poli (L-lactida) , un peso molecular adecuado estará en el orden de aproximadamente 2000 a 250,000. Para PLG, los pesos moleculares adecuados generalmente variarán de aproximadamente 10,000 a aproximadamente 200,000, preferiblemente de aproximadamente 15,000 a aproximadamente 150,000, y muy preferiblemente de aproximadamente 50,000 a aproximadamente 100,000. Para micropartículas de PLG, se puede usar una variedad de relaciones de lactida : glicólido y la relación es grandemente una materia de elección, dependiendo en parte del antígeno co-administrado y la proporción de degradación deseada. Por ejemplo, un polímero de PLG 50:50, que contiene 50% de D, L-Lactida y 50% de glicólido, proporcionará una rápida reabsorción de copolímero mientras que el PLG 75:25 se degrada más lentamente, y 85:15 y 90:10, aún más lentamente, debido al componente lactida incrementado. Una relación adecuada de lactida : glicólido fácilmente se determina con base en la naturaleza del antígeno y trastorno en cuestión. Además, las mezclas de micropartículas con relaciones de lactida : glicólido variantes encontrarán uso en las formulaciones para lograr las cinéticas de liberación deseadas para un antígeno dado y para proporcionar tanto una respuesta inmune primaria como secundaria. La proporción de degradación de las micropartículas de la presente invención también se puede controlar por tales factores como peso molecular del polímero y cristalinidad del polímero. El término 'micropartícula' como se usa en la presente, se refiere a una partícula de aproximadamente 100 mm a aproximadamente 150 µp? de diámetro, más preferiblemente de aproximadamente 200 mm a aproximadamente 30 µ?a de diámetro, y muy preferiblemente de aproximadamente 500 nm a aproximadamente 10 µ?t? de diámetro. Preferiblemente, la micropartícula será de un diámetro que permite la administración parenteral sin obstruir las agujas y capilares. El tamaño de micropartícula fácilmente se determina por técnicas bien conocidas en la técnica, tal como espectroscopia de correlación de fotones, dif actometría de láser y/o microscopio <¾e electrones de exploración. El término 'micropartícula' incluye 'nanopartículas' [57] dentro de su alcance. Las micropartículas preferidas son microesferas, aunque también se pueden usar partículas laminares [58] . Las micropartículas se pueden preparar usando cualquiera de los diversos métodos bien conocidos en la técnica [por ejemplo, referencia 59] . Por ejemplo, las técnicas de evaporación de solvente/emulsión, doble [por ejemplo, referencias 60 y 61] se pueden usar para formar las micropartículas. Estas técnicas involucran la formación de una emulsión primaria que consiste de gotitas de solución polimérica que contiene el antígeno (si el antígeno será atrapado en la micropartícula) , que posteriormente se mezcla con una fase acuosa continua que contiene un estabilizante/tensioactivo de partícula. Más particularmente, un sistema de evaporación de solvente agua-en-aceite-en-agua (a/a/a) se puede usar para formar las micropartículas, como se describe en las referencias 62, 63 y 64. En esta técnica, el polímero particular se combina con un solvente orgánico, tal como acetato de etilo, cloruro de dimetilo (también llamado cloruro de metileno y diclorometano) , ácetonitrilo, acetona, cloroformo, y similares. El polímero se proporcionará en aproximadamente una solución 2-15%, en solvente orgánico. Una cantidad aproximadamente igual de una solución de antígeno (por ejemplo, en agua) se adiciona y la solución de polímero/antígeno se emulsiona usando, por ejemplo, un homogenizador . La emulsión luego se combina con un volumen mayor de una solución acuosa de un estabilizante de emulsión tal como alcohol polivinílico (APV) o polivinil pirrolidona. El estabilizante de emulsión típicamente se proporciona en aproximadamente una solución 2-15%, más típicamente aproximadamente una solución 4-10%. La mezcla luego se homogeniza para producir una emulsión doble a/a/a estable. Los solventes orgánicos luego se evaporan. Los parámetros de formulación se pueden manipular para permitir la preparación de micropartículas pequeñas (<5 µ?p) y grandes (>30 µt?) [por ejemplo, 63, 65] . Por ejemplo, la agitación reducida resulta en micropartículas grandes, cuando se da un incremento en el volumen de fase interna. Las partículas pequeñas se producen, por bajos volúmenes de fase acuosa con altas concentraciones de APV. Las micropartículas también se pueden formar usando coacervación y deshidratación por aspersión [por ejemplo, referencias 66, 67 y 68] ; técnicas de revestimiento de suspensión en aire, tal como revestimiento de evaporación y revestimiento de Wurster [69, 70] ; congelación iónica [71] . Previo al uso de las micropartículas, el contenido de antígeno generalmente se determina de modo que una cantidad apropiada de las micropartículas se puede suministrar al sujeto para producir una respuesta intítuae adecuada . El contenido de antígeno de las micropartículas se puede determinar de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica, tal como rompiendo las micropartículas y extrayendo el antígeno atrapado. Por ejemplo, las micropartículas se pueden disolver en cloruro de dimetilo y la proteína se extrae en agua destilada [por ejemplo, referencias 72, 73, 74] . Alternativamente, las micropartículas se pueden dispersar en NaOH 0.1M que contiene 5% (p/v) de SDS . La muestra se agita, se centrifuga y el sobrenadante se somete a ensayo para el antígeno usando un ensayo apropiado [75] . El antígeno y/o los oligonucleótidos de CpG se pueden ubicar dentro o sobre las micropartículas. El entrampe generalmente se logrará teniendo el antígeno/oligonucleótido presente durante la formación de las micropartículas, mientras que la adsorción de superficie se logra agregando antígeno/oligonucleótido a las micropartículas pre-formadas . Un método para adsorber antígeno/oligonucleótido sobre micropartículas preparadas es como sigue. Las micropartículas se rehidratan y dispersan en una suspensión esencialmente monomérica de micropartículas usando detergentes catiónicos o aniónicos dializables. Los detergentes útiles incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de las diversas N-metilglucamidas (conocidas como MEGAs) , tal como heptanoil-N-metilglucamida (MEGA-7) , octanoil-N-metilglucaraida (MEGA- 8 ) , nonanoil-N-metilglucamida (MEGA- 9) , y decanoil-N-metil-glucamida (MEGA- 10) ; ácido cólico; colato de sodio; ácido desoxicólico; desoxicolato de sodio; ácido taurocólico; taurocolato de sodio; ácido taurodesoxicólico; taurodesoxicolato de sodio; 3 - [ (3 -colamidopropil) dimetilamonio] -1-propan-sulfonato (CHAPS) ; N-octilglucósido; 3- [ (3-colamidopropil) dimetilamonio] -2-hidroxi- 1-propan-sulfonato (CHAPSO) ; N-dodecil-N,N-dimetil-3-amonio-l-propan-sulfonato (ZWITTERGENT 3-12); ?,?-bis- (3-D-gluconeamidopropil) -desoxicolamida (DEOXY-BIGCHAP) ; monolaurato de sucrosa,- ácido glicocólico/glicocolato de sodio; laurosarcosina (sal de sodio) ; ácido glicodesoxicólico/glicodesoxicolato de sodio; sulfato de dodecil sodio (SDS) ; y bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB) ; bromuro de dodeciltrimetilamonio; bromuro de hexadeciltrimetilamonio; bromuro de tetradeciltrimetilamonio; bromuro de bencil dimetildodecilamonio ; cloruro de bencil dimetilhexadecilamonio; bromuro de bencil dimetiltetradecilamonio . Los detergentes anteriores están disponibles comercialmente . Los diversos lípidos catiónicos conocidos en la técnica también se pueden usar como detergentes [76, 77] . La mezcla de micropartícula/detergente luego, se muele físicamente, por ejemplo usando un mortero y pistilo cerámico, hasta que se forma una pasta aguada suave. Un amortiguador acuoso apropiado, tal como solución salina amortiguada con fosfato (SAF) o solución salina amortiguada con Tris, luego se adiciona y la mezcla resultante se somete a sonicación o se homogeniza hasta que las micropartículas se suspenden completamente. El antígeno/oligonucleótido luego se adiciona a la suspensión de micropartícula y el sistema se dializa para remover el detergente. Las micropartículas de polímero y el sistema de detergente preferiblemente se eligen de modo que el antígeno/oligonucleótido se adsorberá a la superficie de micropartícula mientras aún se mantiene la actividad. Las micropartículas resultantes que contienen antígeno/oligonucleótido adsorbido en la superficie se pueden lavar libremente de antígeno/oligonucleótido no enlazado y almacenar como una suspensión en una formulación amortiguadora apropiada, o liofilizar con los excipientes apropiados, como se describe adicionalmente más adelante.

La combinación de antígeno/CpG/micropartícula Varias relaciones físicas son posibles entre los tres componentes básicos de las composiciones de la invención. Esto surge debido a que las micropartículas tienen un volumen interno y una superficie, cualquiera de los cuales se puede usar para localizar el antígeno y/o oligonucleótido , deítangenCpG. Por consiguiente, el antígeno puede estar atrapado dentro de las micropartículas, se puede adsorber en micropartículas , o puede estar en mezcla simple con las micropartículas sin entrampe o adsorción. Se prefiere la adsorción . De manera similar, el oligonucleótido de CpG puede estar atrapado dentro de las micropartículas, se puede adsorber en micropartículas, o puede estar en mezcla simple con las micropartículas. La adsorción se puede lograr usando detergentes tal como CTAB. El oligonucleótido de CpG y el antígeno pueden tener ambos la misma relación física con las micropartículas entre si, o pueden ser diferentes. Igualmente, el oligonucleótido de CpG y el antígeno se pueden adsorber sobre la misma micropartícula o el oligonucleótido de CpG y el antígeno se pueden adsorber sobre micropartículas diferentes. Todas las combinaciones posibles están incluidas dentro de la presente invención: Oligonucleótido de CpG Atrapado Adsorbido Mezclado Atrapado Sí Sí Sí 0 Adsorbido Sí Sí Sí mezclado Sí Sí Sí Las composiciones de la invención pueden incluir mezclas de las anteriores, por ejemplo algunas micropartículas dentro de la composición tienen antígeno atrapado y algunas tienen antígeno adsorbido.

Composiciones farmacéuticas Para el uso farmacéutico, las composiciones de la invención generalmente comprenderán un vehículo farmacéuticamente aceptable. Esto produce una composición farmacéutica de la invención. Un vehículo farmacéuticamente aceptable puede ser cualquier sustancia que no induce por si misma la producción de anticuerpos dañinos al paciente que recibe la composición, y el cual se puede administrar sin toxicidad indebida. Los vehículos adecuados pueden ser macromoléculas grandes, lentamente metabolizadas tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos , ácidos poliglicólicos , aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácido, y partículas de virus inactivo. Tales vehículos son bien conocidos por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica. Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden incluir líquidos tales como agua, solución salina, glicerol y etanol . Las sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias amortiguadoras de pH, y similares, también pueden estar presentes en tales vehículos. Los liposomas son vehículos adecuados. Una discusión completa de vehículos farmacéuticos está disponible en la referencia 78. Las composiciones de la invención se pueden preparar de varias formas. Por ejemplo, las composiciones se pueden preparar como inyectables, ya sea como soluciones líquidas o suspensiones. Las formas sólidas adecuadas para la solución, o suspensión en vehículos líquidos previo a la inyección también se pueden preparar. La composición se puede preparar para la administración tópica, por ejemplo como un ungüento, crema o polvo. La composición se prepara para la administración oral, por ejemplo como una tableta o cápsula, o como un jarabe (opcionalmente con sabor) . La composición se puede preparar para la administración pulmonar, por ejemplo como un inhalador, usando un polvo fino o un pulverizador. La composición se puede preparar como un supositorio o pesario. La composición se puede preparar para la administración nasal, aural u ocular, por ejemplo como gotas, como un pulverizador, o como un polvo [por ejemplo, 79] . La composición farmacéutica preferiblemente es estéril. Preferiblemente está libre de pirógenos. Preferiblemente está amortiguada, por ejemplo entre pH 6 y pH 8, generalmente alrededor de pH 7. La composición farmacéutica se puede liofilxzar. La invención también proporciona un dispositivo de suministro que contiene una composición farmacéutica de la invención. El dispositivo, por ejemplo, puede ser una jeringa. ? Tratamientos médicos y usos Las composiciones de la invención se pueden usar terapéuticamente (es decir, para tratar una infección de Neisserial existente) o profilácticamente (es decir, para prevenir infección futura de Neisserial) . La invención proporciona una composición de la invención para el uso como un medicamento. La invención también proporciona un método para producir una respuesta de anticuerpos en un mamífero, que comprende administrar una composición farmacéutica de la invención al mamífero. La respuesta de anticuerpos preferiblemente es una respuesta de IgA o IgG y preferiblemente es bactericida. La invención también proporciona un método para tratar un mamífero que sufre de una enfermedad y/o infección de Neisserial, que comprende administrar al paciente una composición farmacéutica de la invención. La invención también proporciona un método para proteger un mamífero contra una enfermedad y/o infección de Neisserial, que comprende administrar al mamífero una composición farmacéutica de la invención. La invención también proporciona el uso de (a) un antígeno de Neisserial, (b) un oligonucleótido de CpG, y (c) una micropartícula de polímero biodegradable, en la elaboración de un medicamento para prevenir o tratar la enfermedad y/o infección en un mamífero. El mamífero preferiblemente es un humano. El humano puede ser un adulto o, preferiblemente, un niño. Las composiciones de la invención particularmente son útiles para inmunizar a niños y adolescentes. Los usos y métodos de la invención son particularmente útiles para tratar/proteger contra infecciones de N.meningitidis . Los usos y métodos son particularmente útiles para prevenir/tratar enfermedades incluyendo meningitis bacteriana. La eficacia del tratamiento terapéutico se puede probar verificando la infección de Neisserial después de la administración de la composición de la invención. La eficacia del tratamiento profiláctico se puede probar verificando las respuestas inmunes anti-Neisseria después de la administración de la composición. Las composiciones de la invención generalmente se administrarán directamente a un paciente. El suministro directo se puede realizar por inyección parenteral (por ejemplo, subcutáneamente, intraperitonealmente , intravenosamente, intramuscularmente, o al espacio intersticial de un tejido), o por administración rectal, oral, vaginal, nasal, aural, o pulmonar. Se prefiere ' inyección o administración intranasal . El tratamiento de dosificación puede ser un programa de dosis única o un p ogr ma de dosis múltiples.

Componentes adicionales Las composiciones de la invención pueden incluir adyuvantes además de las micropartículas de polímero y oligonucleótidos de CpG. Los adyuvantes adicionales preferidos incluyen, pero no se limitan a: (A) compuestos de aluminio (por ejemplo, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, hidroxifosfato de aluminio, oxihidróxido, ortofosfato, sulfato, etc. [por ejemplo, véase capítulos 8 y 9 de la referencia 13] ) , o mezclas de diferentes compuestos de aluminio, con los compuestos tomando cualquier forma adecuada (por ejemplo, gel , cristalina, amorfa, etc.), y con la adsorción siendo preferida; (B) MF59 (5% Squaleno, 0.5% T een 80, y 0.5% Span 85, formulado en partículas submicrométricas usando un microfluidizante) [véase Capítulo 10 de 13; también véase referencia 80]; (C) liposomas [véase Capítulos 13 y 14 de referencia 13] ; (D) ISCOMs [véase Capítulo 23 de referencia 13] , los cuales pueden estar libres de detergente adicional [81] ; (E) SAF, que contiene 10% Squaleno, 0.4% Tween 80, 5% de pluronic-polímero de bloque L121, y thr-MDP, ya sea microfluidizado en una emulsión submicrométrica o sometido a vórtice para generar uñ$. emulsión de tamaño de partícula grande [véase Capítulo 12 de referencia 13] ; (F) sistema de adyuvante Ribi" (RAS) , (Ribi Immunochem) que contiene 2% Squaleno, 0.2% Tween 80, y uno o más componentes de pared celular bacterianos del grupo que consiste de monofosforil lípido A (MFL) , dimicolato de trehalosa (DMT) y esqueleto de pared celular (EPC) , preferiblemente MFL + EPC (DetoxMR) ; (G) adyuvantes de saponina, tal como QuilA o QS21 [véase Capítulo 22 de referencia 13] , también conocido como StimulonMR [82] ; (H) quitosan [por ejemplo 83] ; (I) adyuvante de Freund completo (AFC) y adyuvante de Freund incompleto (AFI) ; (J) citosinas, tales como interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, etc.), interferones (por ejemplo interferón-?) , factor que estimula la colonia de macrofagos, factor de necrosis de tumor, etc. [véase Capítulos 27 y 28 de referencia 13] ; (K) monofosforil lípido A (MFL) o MFL 3-0-desacilado (3dMFL) [por ejemplo, capítulo 21 de referencia 13] ; (L) combinaciones de 3dMFL con, por ejemplo, QS21 y/o emulsiones aceite en agua [84] ,· (M) un éter de polioxietileno o un éster de polioxietileno [85] ; (N) un tensioactivo de éster de polioxietilen sorbitan en combinación con un octoxinol [86] o un tensioactivo de éster o éter de polioxietilen alquilo en combinación con al menos un tensioactivo no iónico ional tal como octoxínol [87] ; (N) una partícula de sal de m< [88] ; (0) una saponina y una emulsión aceite en agua [89] ; (P) una saponina (por ejemplo, QS21) + 3dMFL + IL-12 (opcionalá*Éfcte + un esterol) [90] ; (Q) enterotoxina termolábil de E.coli ( nLT" ) , o mutantes desintoxicados de la misa, tales como los mutantes K63 o R72 [por ejemplo, Capítulo 5 de referencia 91] ; (R) toxina de cólera ("TC"), o mutantes desintoxicados de la misma [por ejemplo, Capítulo 5 de referencia 91] ; (S) AR de doble hebra y (T) otras sustancias que actúan como agentes de inmunoestimulación para mejorar la efectividad de la composición [por ejemplo, véase Capítulo 7 de referencia 13] . Alumbre (especialmente hidróxido y/o fosfato de aluminio) y MF59 son adyuvantes adicionalmente preferidos para la inmunización parenteral . Las toxinas mutantes son adyuvantes mucosales preferidos. Los péptidos de muramilo incluyen N-acetil-muramil- L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP) , N-acetil-no muramil-L-alanil-D-isoglutamina (no-MDP) , N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2- (1' -2' -dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi) -etilamina MTP-PE) , etc. Así como los antígenos de Neisseríal, la composición puede comprender componentes antigénícos adicionales. Los antígenos los cuales se pueden incluir en la composición de la invención incluyen: antígenos de Helicotiacter pylori tal' confo CafA t¾-;f 95], VacA [96, 97], NAP [98, 99, HopX [por ejemplo, 101], HopY [por ej Silo, 101], y/o ureasa. una preparación de vesf íía de membrana externa (VME) del serogrupo B de N.meningitidis, tales como aquellas descritas en las referencias 102, 103, 104, 105, etc. un antígeno de sacárido de Streptococcus pneumoniae [por ejemplo, 106, 107, 108] . un antígeno de virus de hepatitis A, tal como virus inactivado [por ejemplo, 109, 110] . un antígeno de virus de hepatitis B, tales como los antígenos de superficie y/o núcleo [por ejemplo, 110, 111] . un antígeno de virus de hepatitis C [por ejemplo 112] . un antígeno de Bordetella pertussis, tal como holotoxina de tos ferina (PT) y hemaglutinina filamentosa (FHA) de B.pertussis, opcionalmente también en combinación con pertactina y/o aglutinogenos 2 y 3 [por ejemplo, referencias 113 y 114] . un antígeno de difteria, tal como un toxoide de difteria [por ejemplo, capítulo 3 de referencia 115] , por ejemplo el mutante CRM197 [por ejemplo, 116] . un antígeno de tétanos, tal como un toxoide de tétanos [por ejemplo, capítulo 4 de referencia 115] . un antígeno de sacárido de Haemophilus influenzae B (por ej emplo, 23] . un antígeno de Chlamydia pneumoniae [por ejemplo, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123]. un antígeno de Chlamydia tracho atis [por ejemplo, 124] . un antígeno de Porphyro onas gingivalis [por ejemplo, 125] . polio antígenos [por ejemplo, 126, 127] tal como IPV u OPV. antígenos de la rabia [por ejemplo, 128] tal como virus inactivado liofilizado [por ejemplo, 129, RabAvertMR] . antígenos de sarampión, paperas y/o rubéola [por ejemplo, capítulos 9, 10 y 11 de referencia 115] . antígenos de virus de influenza [por ejemplo, capítulo 19 de referencia 115] , tales como las proteínas de superficie de hemaglutinina y/o neuraminidasa . antígenos de un parmixovirus tal como virus sincitial respiratorio (VSR [130, 131]) y/o virus de parainfluenza (VPI3 [132] ) . un antígeno de Moraxella catarrhalis [por ejemplo, 133] . un antígeno de Streptococcus agalactiae (grupo B de estreptococo) [por ejemplo, 134, 135]. un antígeno de Streptococcus pyogenes (grupo A de estreptococo) [por ejemplo, 135, 136, 137]. un antígeno de Staphylococcus aureus [por ejemplo, 138] . un antígeno de Bacillus anthracis [por ejemplo, 139, 140' 141] ' un antígeno de un virus de la familia flaviviridae (género flavivirus) , tal como de virus de fiebre amarilla, virus japonés dé la encefalitis, cuatro serotipos de virus de Dengue, virus de encefalitis de las garrapatas, virus del Nilo occidental, un antígeno de pestivirus, tal como de virus de fiebre porcina clásica, virus de diarrea viral bovina, y/o virus de enfermedad marginal. un antígeno de parvovirus, por ejemplo de parvovirus B19. una proteína de prión (por ejemplo, la proteína de prión CJD) . una proteína amiloide, tal como un peptido beta [142] . un antígeno de cáncer, tales como aquellos listados en la Tabla 1 de referencia 143 o en las tablas 3 y 4 de referencia 144. La composición puede comprender uno o más de estos antígenos adicionales. Los antígenos de proteína tóxicos se pueden desintoxicar donde sea necesario (por ejemplo, desintoxicación de toxina de tos ferina por medios químicos y/o genéticos [114] ) . Donde un antígeno de difteria se incluye en la composición es preferido también incluir antígeno de tétanos y antígenos de tos ferina. De manera similar, donde un antígeno de tétanos se incluye se prefiere también incluir antígenos de difteria y tos ferina. De manera similar, donde un antígeno de tos ferina se incluye se prefiere también incluir antígenos de difteria y tétanos. Los antígenos preferiblemente se adsorben en una sal de aluminio. Los antígenos en la composición típicamente estarán presentes a una concentración de al menos 1 µg/ml cada uno. En general, la concentración de cualquier antígeno dado será suficiente para producir una respuesta inmune contra este antígeno . Como una alternativa a usar antígenos de proteínas en la composición de la invención, el ácido nucleico que codifica el antígeno se puede usar. Los componentes de proteína de las composiciones de la invención, por consiguiente, se pueden remplazar por ácido nucleico (preferiblemente ADN, por ejemplo en la forma de un plásmido) que codifica la proteína.

Definiciones El término "comprende" significa "incluye" así como "consiste", por ejemplo, una composición que "comprende" X puede consistir exclusivamente de X o puede incluir algo adicional, por ejemplo X + Y.

Las referenciá¾ a un porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácido significa que, cuando se alinean, estos porcentajes de aminoácido son los mismos comparando las dos secuencias. Esta alineación y la homología de porcentaje o identidad de secuencia se puede determinar usando programas de software conocidos en la técnica, por ejemplo aquellos descritos en la sección 7.7.18 de la referencia 145. Una alineación preferida se determina por el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman usando una búsqueda de separación afín con una sanción abierta de separación de 12 y una sanción de extensión de separación de 2, matriz BLOSUM de 62. El algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman se enseña en la referencia 146.

MODOS PARA REALIZAR LA INVENCION Cebado parenteral y estimulación mucosal con antígeno dé serogrupo B de Neisseria meningitidis La referencia 6 describe una proteína del serogrupo B de N. eningitidis llamada '287' . Las referencias 10 a 12 describen formas de mejorar su expresión. Una forma involucra suprimir el N-termino de la proteína hasta los seis residuos de glicina repetidos incluidos. Esta proteína es referida como ? G287 ' . Los ratones se cebaron y estimularon con antígeno MenB de G287 de cepa 2996, formulado administración (IM) por adsorción micropartículas de PLG, con o sin oligonucleótido de CpG (también adsorbido en las micropartículas) . Una formulación adicional para la administración intranasal (IN) utilizó adyuvante LT-K63. Los ratones recibieron ya sea 3 dosis IM o 2 IM luego 2 dosis IN (dosis en el: día 0; día 28; día 84; y opcionalmente, día 98) .

Por consiguiente, la inclusión de títulos de anticuerpos mejorados por oligonucleótido de CpG contra MenB de proteína 287 intramuscularmente administrada (grupos de comparación 1 y 2) . Los títulos se podrán mejorar remplazando una tercera dosis intramuscular con dos dosis intranasales (grupos de comparación 1 y 3) . El mejoramiento de CpG también se observa en el régimen intramuscular/intranasal (grupos de comparación 3 y 4) .

Comparación de adyuvantes para MenB de proteína 287 La G287 se formuló con varios adyuvantes administró a ratones. S¾§ alararon los sueros de los ratones usando el ensayo de anticuerpo bactericida (ABC) y los títulos fueron como sigue: El oligonucleótido de CpG solamente así fue ligeramente efectivo como un adyuvante, casi comparable a alumbre. Las micropartículas de PLG fueron más efectivas que ambos alumbre y CpG, pero no tan efectivas como el adyuvante de Freund. En contraste marcado, sin embargo, la mezcla de CpG y PLG igualó la adyuvanticidad del adyuvante de Freund en la etapa de post- segunda inmunización y excedió la post-tercera inmunización del adyuvante de Freund. El mejoramiento de la adyuvanticidad de PLG usando CpG también se observó en un estudio separado (02-0279) : Efecto de la adsorción en la adyuvanticidad Se estudió el efecto de adsorción adyuvanticidad. La sobre micropartículas de o se mezcló simplemente con las partículas. Las inmunizaciones se realizaron en los días 0, 21 y 35 y los títulos se valoraron en los días 35 y 49. Los resultados fueron como sigue: La adyuvanticidad de CpG y mezclas de micropartícula para G287 es así óptima cuando el antxgeno se adsorbe en micropartículas. La referencia 6 describe una proteína del serogrupo B de N.meningitidis llamada '961' (ahora conocida como 'NadA' [16,17]) . Las referencias 10 a 12 describen formas de mejorar la expresión de NadA. Una forma involucra la supresión de C-termino de la proteína para remover su anclaje de membrana (es decir, remover los aminoácidos 351-405 para la cepa 2996), así como la remoción natural de su péptido guía. Esta proteína es referida como ? 961c' . El efecto de adsorción en la adyuvanticidad de PLG cuando se co-administra con CpG se estudió para 961c, como se describió anteriormente para 287: Formulación ABC Título de anticuerpo 2 semanas después de la dosis 3 961 adsorbida en PLG (SDS) 2048 20661 961+PLG (sin adsorción) 256 1706 287 adsorbida en PLG 4096 63057 287 adsorbida en PLG+961 soluble 4096 287:86052/961:1924 287 adsorbida en PLG+961 8192 287:107142;961:11717 adsorbida en PLG 287 (no adsorbida) +961 (no 1024 287:1266;961:145 adsorbida) +PLG 'blanco' 287 (adsorbida) +961 (adsorbida) 8192 287:78176/961:20876 + PLG 'blanco' Como para G287, por lo tanto, la adyuvanticidad de CpG y mezclas de micropartículas para 961c es óptima cuando el antígeno se adsorbe en micropartículas. Esto es cierto para el antígeno solo y el antígeno cuando se combina con G287. Tanto para G287 como 961c, por lo tanto, solas y combinadas, la mejor adyuvanticidad para mezclas de PLG y CpG se observa cuando los antígenos se adsorben sobre las micropartículas de PLG.

PLG, CpG, alumbre y MF59 Varias combinaciones de PLG, CpG y alumbre se probaron para la proteína G287, expresada como un producto etiquetado con Hís. Los títulos bactericidas de suero después de tres inmunizaciones fueron como sigue: Se realizaron experimentos similares sultados fueron como sigue : Por consiguiente, MF59 y alumbre pueden mejorar adicionalmente la eficacia de mezclas de CpG/PLG, la adsorción de CpG en micropartículas de PLG no es necesaria para la adyuvanticidad, pero la adsorción de antígeno en micropartículas de nuevo se observa que es óptima.

Mezclas de antígeno * El efecto de absorción en la adyuvanticidad se estudió para las proteínas G287 y 961c, solas y en combinación. Los títulos de anticuerpo después de tres dosis fueron como sigue: Como para G287, por lo tanto, la adyuvanticidad de CpG y mezclas de micropartículas para la proteína 961c es óptima cuando el antígeno se adsorbe en micropartículas. Combinaciones adicionales de adyuvantes con micropartículas de PLG se probaron para las proteínas G287 y 961c. El CpG fue ya sea soluble o se adsorbió en micropartículas de PLG. Los resultados fueron como sigue: GMT contra Formulación + micropartículas de PLG ABC 287 961 287 (adsorbida en PLG) +961 (adsorbida en PLG) 256 5719 2412 287 (adsorbida en PLG) +961 (adsorbida en PLG) +CpG 512 17553 8627 287 (adsorbida en PLG) +961 (adsorbida en PLG) +CpG 1024 16906 6720 (adsorbida en PLG) 287 (adsorbida en PLG) +961 (adsorbida en PLG) +MF59 64 4636 3969 287 (adsorbida en PLG) +961 (adsorbida en 2048 23642 48446 PLG)+MF59+CpG El trabajo en los grupos de 10 ratones CD-1, usando adsorbido en PLG por dosis IM (días 0, 21 y 35) . Donde estuvo presente CpG, se dio a 10 por dosis. Los títulos de ELISA (GMT) se calcularon como la dilución de suero recíproca dando OD45onm 0.5, y los sueros se probaron para ambos antígenos. Los títulos de actividad bactericida de suero (ABS) se calcularon como " la dilución de suero recíproca que mata el 50% de bacterias objetivo, y los sueros se probaron para actividad contra la cepa 2996 y contra MC58, una cepa heteróloga. Los títulos en el día 49 (2 semanas post-tercera dosis) fueron como sigue: La referencia 12 describe una combinación de tres proteínas las cuales, entre las mismas, incluyen cinco diferentes antígenos de N.meningitidís: (1) 961c2996 ; (2) G287NZ-9532996; y (3) 9362996- G74lMC58. La mezcla de antígeno se aluminio. De acuerdo con presente invención, la mezcla de antígeno es sometida a adyuvante por la adsorción de una micropartícula de polímero biodegradable más un oligonucleótido de CpG. Los títulos después de la tercera dosis fueron como sigue: Comparada con el adyuvante de aluminio usado en la referencia 12, la mezcla de PLG+CpG conduce a títulos de anticuerpo completo inferiores (excepto para la proteína 287) pero, de manera importante, produce títulos bactericidas mayores contra un amplio intervalo de cepas. Por lo tanto, aunque los títulos absolutos fueron inferiores, el adyuvante de la invención en consecuencia ventajosamente desplaza la producción de anticuerpos hacia anticuerpos bactericidas. Se entenderá que la invención se ha descrito por vía de ejemplo solamente y se pueden hacer modificaciones mientras permanezcan dentro del alcance y espíritu de la invención .

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Claims (21)

RgI¥INDIC¾CIONES Habiéndose desc¾fc5 la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Composición inmunogénica caracterizada porque comprende: (a) un antígeno de Neisserial; (b) un oligonucleótido de CpG; y (c) una micropartícula de polímero biodegradable .

2. Composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el antígeno de Neisserial es un antígeno de proteína.

3. Composición de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque el antígeno de Neisserial puede producir una respuesta inmune bactericida en un mamífero receptor contra Neisseria meningitidis.

4. Composición de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el antígeno de Neisserial comprende una proteína de N. meningitidis seleccionada del grupo que consiste de: proteína NadA, o una variante de la misma; proteína 287, o una variante de la misma; proteína 741, o una variante de la misma; proteína 953, o una variante de la misma; y proteína, o una variante de la misma.

5. Composición de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque el oligonucleótido de 6 y aproximadamente 100

6. Composición de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque las micropartículas de polímero biodegradable comprenden un poli (a-hidroxi ácido) .

7. Composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque las micropartículas comprenden poli (D, L-lactida-co-glicólido) .

8. Composición de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque un antígeno de Neisserial se atrapa dentro de las micropartículas.

9. Composición de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque un antígeno de Neisserial se adsorbe en las micropartículas.

10. Composición de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque el oligonucleótido de CpG se atrapa dentro de las micropartículas .

11. Composición de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque el oligonucleótido de CpG se adsorbe en las micropartículas.

12. Composición de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque comprende un adyuvante adicional .

13. Composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque comprende adyuvante MF59.

14. Composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque comprende un adyuvante de sal de aluminio.

15. Composición de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque comprende al menos unos antígenos no Neisserial adicionales.

16. Composición de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizada porque comprende adicionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable.

17. Composición de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque es para el uso como un medicamento.

18. Método para producir una respuesta de anticuerpo en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar al mamífero la composición de conformidad con alguna de las reivindicaciones 1 a 16.

19. Método para tratar un mamífero que sufre de una enfermedad y/o infección de Neisserial, caracterizado porque comprende administrar al paciente la composición de conformidad con alguna de las reivindicaciones 1 a 16.

20. Método para proteger un mamífero contra una enfermedad y/o infección de Neisserial, caracterizado porque comprende administrar al paciente la composición de conformidad con alguna de las reivindicaciones 1 a 16.

21. Uso de (a) un antígeno de Neisserial, (b) un oligonucleótido de CpG, y (c) una micropartícula de polímero biodegradable, en la elaboración de un medicamento para prevenir o tratar la enfermedad y/o infección en un mamífero . RESÜ; DE LA INVENCION La presente invención se refiere a una combinación de oligonucleotidos de CpG y miGaropartículas de polímero que es un adyuvante extremadamente efectivo para antígenos de Neisserial. La invención, por lo tanto, proporciona una composición que comprende (a) un antígeno de Neisserial; (b) un oligonucleótido de CpG; y (c) una micropartícula de polímero biodegradable .